Способ секвенирования экзонов гена HLA-DPA1 и набор синтетических олигонуклеотидов для его реализации Российский патент 2025 года по МПК C12Q1/68 C12Q1/6876 

Изобретение относится к биохимии и молекулярной биологии и позволяет секвенировать экзоны гена HLA-DPA1 методом NGS как для решения задач практической медицины, так и в научно-исследовательских целях.

Гены HLA (Human Leukocyte Antigen), располагающиеся на 6 хромосоме человека, кодируют белки, которые входят в главный комплекс гистосовместимости (МНС) и играют важную роль в регуляции иммунной системы. Гены HLA отличаются огромным полиморфизмом. Например, для гена HLA-DPA1 на сегодня в базе данных IPD-IMGT/HLA Database содержится 373 аллели.

Типирование генов HLA (определение конкретных аллелей), учитывая их роль в регуляции иммунной системы, может иметь самое широкое применение, как в практической медицине, так и для фундаментальной науки. Типирование генов HLA имеет широкое применение в трансплантологии, для оценки совместимости донора и реципиента и снижения вероятности реакции отторжения органов и клеток.

В настоящее время опубликованы работы, описывающих участие генов HLA в развитии многочисленных заболеваний, включая онкологические (меланома, лимфома) и аутоиммунные (ревматоидный артрит, аутоиммунный гепатит) заболевания.

Показано влияние аллелей генов HLA на восприимчивость к многочисленным инфекциям, включая ВИЧ-инфекцию, вирус гепатита В, вирус гепатита С, SARS-CoV-2. Типирование HLA-DPA1 может дать врачам рекомендации по диагностике определенных заболеваний и определению направлений лечения.

В литературных источниках описана ассоциация аллелей генов HLA и индивидуальных реакций на введение иммунобиологических препаратов. Например, на тайваньской популяции было показано, что аллель DPA1*01 ассоциирован с выработкой высокого титра протективных антител анти-HBs на введение вакцины, в то время как DPA1*02 с низким [Wang WC, Lin YS, Chang YF, Yeh CC, Su CT, Wu JS, Su FH. Association of HLA-DPA1, HLA-DPB1, and HLA-DQB1 Alleles With the Long-Term and Booster Immune Responses of Young Adults Vaccinated Against the Hepatitis В Virus as Neonates. Front Immunol. 2021 Aug 18;12:710414. doi: 10.3389/fimmu.2021.710414. PMID: 34484213; PMCID: PMC8416438.].

На китайской популяции Хань было показано, что однонуклеотидный полиморфизм HLA-DPA1 rs3077T может являться маркером спонтанной элиминации вируса гепатита В [An Р, Winkler С, Guan L, O'Brien SJ, Zeng Z; HBV Study Consortium. A common HLA-DPA1 variant is a major determinant of hepatitis В virus clearance in Han Chinese. J Infect Dis. 2011 Apr 1; 203(7):943-7. doi: 10.1093/infdis/jiql54. PMID: 21402545; PMCID: РМС3068033].

Расширение инструментария для типирования генов HLA позволяет более детально изучить молекулярные механизмы регуляции иммунной системы.

В то время как в более ранних работах по типированию генов HLA использовалось преимущественно секвенирование по методу Сэнгера, в настоящее время все чаще используется метод высокопроизводительного секвенирования (NGS). Данный метод стал популярен благодаря одновременному прочтению протяженных участков генома и выявлению большого количества мутаций/полиморфизмов.

Так как полногеномное секвенирование имеет высокую стоимость и прочтение всего генома для исследований, связанных с типированием генов HLA, не требуется, в качестве альтернативы полногеномному секвенированию, при решении ряда задач типирования генов HLA может быть применено так называемое таргетное (или целевое) секвенирование представляющих наибольший интерес участков данных генов. Целевая область фрагментов ДНК гена или области генома направленно амплифицируются, после чего подвергаются секвенированию NGS, таким образом стоимость значительно снижается, время проведения исследования сокращается, а необходимость последующего анализа данных уменьшается. В настоящее время подобные подходы широко используются, например, для секвенирования экзома человека и отдельных генов.

Для того, чтобы идентифицировать ДНК исследуемого образца как содержащую определенные аллели генов HLA, достаточно секвенировать несколько регионов данных генов, включающих экзоны. При таргетном NGS секвенировании целевые регионы ДНК сначала амплифицируются с помощью специальных олигонуклеотидных праймеров, что позволяет изучать их затем избирательно. Далее, как правило, проводится этап лигирования служебных фрагментов олигонуклеотидов (адаптеров) с помощью особых дорогостоящих ферментов, и индексация с детекцией в режиме реального времени с помощью флуоресцентного интеркалирующего красителя.

Из уровня техники известны следующие протоколы и наборы реагентов для секвенирования генов HLA методом NGS:

Набор ScisGo™ HLA v6 Kits компании Scisco Genetics technology (США) [https://sciscogenetics.com/pages/kits.html] позволяет типировать гены HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1/3/4/5, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DPA1, HLA-DPB1. В нем используется технология мультиплексной ПЦР, позволяющая конструировать библиотеку из фрагментов генов HLA с использованием множества пар праймеров и без лигирования адаптеров.

Секвенирование подготовленной библиотеки производится на платформе MiSeq Illumina. Пробоподготовка осуществляется при помощи четырех пулов праймеров.

TruSight™ HLA Sequencing Panel компании Illumina (CIIIA) [https://www.illumina.com/clinical/hla-sequencing.html] позволяет типировать гены HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1/3/4/5, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DPA1, HLA-DPB1. Для данной панели фрагменты ДНК амплифицируются крупными фрагментами, длиной несколько т.п.н. (так называемая, long-range PCR). Далее полученные ампликоны фрагментируются набором Nextera® library preparation (Illumina), индексируются и полученная библиотека секвенируется на платформе Illumina.

Следует отметить сравнительно высокую цену данных коммерческих наборов, а также отсутствие информации об используемых праймерах.

Из уровня техники известен набор для типирования гена HLA-DPA1 [патент CN 111662967, опубликован 15.09.2020, дата подачи заявки 29.06.2020], где набор включает два праймера для амплификации и четыре праймера для секвенирования. Набор может позволяет осуществить полноразмерную амплификацию генов HLA-DPA1, а затем провести двустороннее секвенирование на 2 и 3 экзонах. Недостатком данного набора является возможность амплификации только 2 экзонов гена HLA-DPA1 из 4.

Также известна пара праймеров для амплификации rsnnHLA-DPAl и последующего типирования [патент CN 114540486 опубликован 27.05.2022, дата подачи заявки 28.03.2022]. Результатом амплификации является регион гена HLA-DPA1 длиной 5515 п. н., содержащий все 4 экзона данного гена. Однако последующее секвенирование данного ампликона может представлять определенные сложности. В случае секвенирования NGS, требуются дорогостоящие наборы для фрагментирования ДНК и лигирования адаптеров или же наборы для тагментации ДНК, по типу Nextera® library preparation (Illumina). Секвенирование полученных ампликонов по Сэнгеру требует дополнительных праймеров, значительных временных затрат и в целом модет обладать большей стоимостью, чем секвенирование NGS.

Таким образом, существует потребность в расширении точного диагностического инструментария, позволяющего в короткие сроки и с наименьшими затратами типировать ген HLA-DPA1 для своевременного и адекватного назначения диагностических, терапевтических и профилактических мероприятий, а также для дальнейшего изучения регуляции иммунной системы.

Технический результат заключается в разработке эффективного способа фрагментарного NGS-секвенирования экзонов гена HLA-DPA1 в целях точного определения аллелей данного гена.

Технический результат достигается за счет таргетного (целевого) секвенирования представляющих наибольший интерес гена HLA-DPA1, содержащих экзоны и позволяющих определить аллели данного гена в образце ДНК. За счет применения в заявляемом способе оригинальных синтезированных олигонуклеотидных праймеров, имеющие структуру SEQ ID NO: 1-8, возможна амплификация целевых участков генома, при этом не требуется проводить дорогостоящий этап лигирования адаптеров, используемый в ряде протоколов. Сложность выбора праймеров обусловлена необходимостью обеспечить амплификацию в формате мультиплекса всех аллелей гена HLA-DPA1, при этом требуется не допустить амплификации нецелевых регионов ДНК человека.

Предложенные в изобретении синтетические олигонуклеотидные праймеры для для секвенирования экзонов гена HLA-DPA1 методом NGS имеет следующую структуру: SEQ ID NO: 1-8. При этом олигонуклеотидные праймеры, имеющие структуры SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, выполняют функции прямых праймеров, а олигонуклеотидные праймеры, имеющие структуры SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 выполняют функции обратных праймеров.

При разработке применяемых в заявляемом способе праймеров для таргетной амплификации фрагментов гена HLA-DPA1 олигонуклеотидные последовательности были подобраны вручную с учетом имеющейся информации об известных аллелях данного гена. Этот процесс включал в себя загрузку референсных последовательностей аллелей гена HLA-DPA1 из базы данных IPD-IMGT/HLA Database (https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/) и выравнивание последовательностей с целью определения консервативных для данных аллелей фрагментов. Температуры плавления олигонуклеотидов и характер взаимодействий между ними определялись с помощью инструмента Multiple Primer Analyzer от Thermo Fisher Scientific (США). С помощью программы blastn оценивалась специфичность каждой полученной последовательности ко всем известным организмам, в частности Homo sapiens, что позволяет исключить неспецифическое взаимодействие между праймерами и участками ДНК человека и других организмов. Кроме того, синтезированные олигонуклеотиды содержат дополнительные последовательности, облегчающие и удешевляющие процесс индексации продуктов амплификации.

Расстояния между праймерами в парах были подобраны таким образом, чтобы длина исследуемого региона была в пределах 600 п. н., что совместимо с длиной прочтений при использовании наборов для секвенирования Illumina MiSeq v3.

Полученные олигонуклеотиды на одном конце содержат праймерную последовательность, комплементарную участкам генома, а на другом - адаптерные последовательности. Следовательно, полученные после амплификации целевые фрагменты сразу фланкированы такими адаптерными последовательностями. Олигонуклеотиды, используемые для индексации, в свою очередь, комплементарны адаптерным последовательностям с одного конца и соответствуют индексам с другого.

В качестве индексных последовательностей используют олигонуклеотиды, несущие различные индексы, которые позволяют отличать данные секвенирования молекул из разных образцов. Примеры подобных индексных последовательностей доступны на сайтах производителей наборов реагентов для высокопроизводительного секвенирования. Таким образом, в процессе индексации происходят этапы отжига олигонуклеотидов на концах целевых фрагментов и амплификации. После этого продукты амплификации подвергаются секвенированию методом NGS. Данный подход является стандартом пробоподготовки библиотек для секвенирования и, например, использован в наборе ScisGo™ HLA v6 Kits.

По сравнению с известным протоколом пробоподготовки Illumina Nextera XT (https://www.illumina.com/products/by4ype/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html), предлагаемый способ пробоподготовки позволяет избежать этапов тагментации и отбора фрагментов с необходимыми длинами, поскольку продукты амплификации изначально имеют длину до 600 пар нуклеотидов без учета адаптерных последовательностей, то есть совместимы с наборами реагентов компании Illumina для ее секвенирующих платформ, а также содержат адаптерные последовательности для дальнейшей индексации, что существенно упрощает и удешевляет анализ полученных при секвенировании данных.

Заявляемое изобретение является результатом работы в рамках исследования, выполненной в ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора (Москва, Россия). Представленный способ был отработан более чем на 300 образцах биологического материала, представляющих собой ДНК, выделенную из крови и буккальных клеток эпителия (соскобов носоглотки) при помощи набора «РИБО-преп» (AmpliSens, Россия) согласно рекомендациям производителя.

Выделение ДНК из клинического материала производилось с помощью комплекта реагентов в соответствии с инструкцией производителя. Для выделения ДНК может быть использован комплект реагентов «РИБО-преп» (AmpliSens, Россия) или любой аналогичный коммерческий набор для выделения ДНК.

Материалом для исследования является геномная ДНК человека. Для анализа одного образца требуется 10 нг ДНК (1 мклДНК с концентрацией 10 нг/мкл). Реакцию амплификации проводят с использованием ДНК в качестве матрицы и набора заявляемых олигонуклеотидов с концентрацией в реакционной смеси, указанной в Таблице 1.

ПЦР-микс объемом 20 мкл на одну реакцию содержит 10 мкл ПЦР-смеси-2 blue (AmpliSens, Россия), 1,4 мкл эквимолярной смеси четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов со стоковой концентрацией 4,4 мМ, олигонуклеотиды в указанных в Таблице 1 концентрациях и воду milli-Q. ДНК-матрицу добавляют в количестве 5 мкл (концентрация ДНК от 2 до 50 нг/мкл), итоговый объем реакции составляет 25 мкл. Продуктами амплификации являются целевые участки гена HLA-DPA1. Длины получаемых фрагментов составляют 251-476 п. н. без учета длин адаптерных и индексных последовательностей, что обеспечивает их полное покрытие при использовании набора реагентов для секвенирования MiSeq Reagent Kit v3 (600-cycle) Illumina (США).

Затем проводят очистку ПЦР-продуктов от реакционной смеси с использованием магнитных частиц, например, AMPure ХР beads (Beckman Coulter, США) в объемном отношении 1:0,8.

После этого осуществляют индексацию полученных фрагментов. Синтезированные олигонуклеотиды на одном конце содержат праймерную последовательность, комплементарную целевым участкам генов, а на другом - адаптерные последовательности. Таким образом, полученные после амплификации целевые фрагменты сразу фланкируются адаптерными последовательностями, что существенно ускоряет и удешевляет пробоподготовку.

Олигонуклеотидные праймеры, используемые для индексации, в свою очередь, на одном конце содержат последовательности, соответствующие индексам, а на другом -последовательности, соответствующие упомянутым ранее адаптерным последовательностям. Таким образом, в процессе индексации происходят этапы отжига олигонуклеотидов на концах целевых фрагментов и амплификации продукта.

ПЦР-микс объемом 15 мкл на одну реакцию содержит 10 мкл ПЦР-смеси-2 blue (AmpliSens, Россия), 1,4 мкл эквимолярной смеси четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов со стоковой концентрацией 4,4 мМ, соответствующие олигонуклеотиды в концентрации 0,25 пмоль/мкл и воду milli-Q. ДНК-матрица добавляется в количестве 5 мкл, итоговый объем реакции составляет 20 мкл.

Длины полученных продуктов амплификации могут быть проанализированы с помощью электрофореза в 1% агарозном геле. Далее повторно проводят очистку от реакционной смеси с использованием магнитных частиц, например, AMPure ХР beads (Beckman Coulter, США) в объемном отношении 1:0,8.

В результате получаются готовые для секвенирования олигонуклеотидные последовательности, содержащие целевые фрагменты гена. HLA-DPA1, которые позволяют определить аллели данного гена в исходном образце ДНК.

Реализация заявляемого изобретения поясняется следующими примерами:

Пример 1. Получение набора олигонуклеотидных праймеров, используемого для секвенирования экзонов гена, HLA-DPA1.

При разработке заявляемых оригинальных синтезированных олигонуклеотидных праймеров для таргетной амплификации фрагментов генов HLA-DPA1 олигонуклеотидные последовательности были подобраны вручную с учетом имеющейся информации об известных аллелях данных генов.

Данный процесс включал в себя загрузку множества референсных последовательностей аллелей генов HLA-DPA1 из базы данных IPD-IMGT/HLA Database (https://www.ebi.ac.ulc/ipd/imgt/hla/) и выравнивание последовательностей с целью определения консервативных для указанных аллелей фрагментов.

Температуры плавления олигонуклеотидов и характер взаимодействий между ними определялись с помощью инструмента Multiple Primer Analyzer от Thermo Fisher Scientific (США). С помощью программы blastn оценивалась специфичность каждой полученной последовательности ко всем известным организмам, в частности Homo sapiens, что позволило исключить неспецифическое взаимодействие между праймерами и участками ДНК человека и других организмов.

В результате были получены праймеры, имеющие структуры SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, которые выполняют функции прямых праймеров, и олигонуклеотидные праймеры, имеющие структуры SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 выполняющие функции обратных праймеров.

Расстояния между праймерами в парах были подобраны таким образом, чтобы длина исследуемого региона была в пределах 600 п. н., что совместимо с длиной прочтений при использовании наборов для секвенирования Illumina MiSeq v3.

Поскольку полученные олигонуклеотидные праймеры на одном конце содержали праймерную последовательность, комплементарную участкам генома, а на другом -адаптерные последовательности, полученные после амплификации, целевые фрагменты сразу были фланкированы такими адаптерными последовательностями.

В качестве индексных последовательностей использовали олигонуклеотиды, несущие различные индексы, которые позволяют отличать данные секвенирования молекул из разных образцов. В частности, использовалась информация об индексных последовательностях, опубликованная на сайтах производителей наборов реагентов для высокопроизводительного секвенирования.

Олигонуклеотидные праймеры, используемые для индексации, на одном конце содержали последовательности, соответствующие индексам, а на другом последовательности, соответствующие адаптерным последовательностям.

Таким образом, в процессе индексации произошли этапы отжига олигонуклеотидов на концах целевых фрагментов и амплификации. После этого продукты амплификации подверглись высокопроизводительному секвенированию на платформе Illumina.

Пример 2. Секвенирование гена HLA-DPA1 в образце ДНК, выделенной из буккальных клеток эпителия.

У сотрудника лаборатории взят соскоб из носоглотки, выделение ДНК осуществлялось при помощи набора реагентов «РИБО-преп» (AmpliSens, Россия) согласно рекомендациям производителя. Концентрация выделенной ДНК была измерена набором «Quantum-211» (Евроген, Россия) и составила 13,8 нг/мкл. Амплификация осуществлялась с применением набора оригинальных синтезированных олигонуклеотидных праймеров SEQ ID NO: 1-8.

ПЦР-микс объемом 20 мкл на одну реакцию содержал 10 мкл ПЦР-смеси-2 blue (AmpliSens, Россия), 1,4 мкл эквимолярной смеси четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов со стоковой концентрацией 4,4 мМ, олигонуклеотидные праймеры SEQ ID NO: 1-8 в концентрациях, указанных в Таблице 1, и воду milli-Q. ДНК-матрица добавлялась в количестве 5 мкл (концентрация ДНК 13,8 нг/мкл), итоговый объем реакции составлял 25 мкл.

Далее проводилась очистка ПЦР-продуктов от реакционной смеси с использованием магнитных частиц AMPure ХР beads (Beckman Coulter, США) в объемном отношении 1:0,8. После этого осуществлялась индексация полученных фрагментов.

ПЦР-микс объемом 15 мкл на одну реакцию содержал 10 мкл ПЦР-смеси-2 blue (AmpliSens, Россия), 1,4 мкл эквимолярной смеси четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов со стоковой концентрацией 4,4 мМ, соответствующие олигонуклеотиды в концентрации 0,25 пмоль/мкл и воду milli-Q. ДНК-матрица добавлялась в количестве 5 мкл, итоговый объем реакции составлял 20 мкл.

Длины полученных продуктов амплификации были проанализированы с помощью электрофореза в 1% агарозном геле. Далее повторно производилась очистка от реакционной смеси с использованием магнитных частиц AMPure ХР beads (Beckman Coulter, США) в объемном отношении 1:0,8. Концентрация полученной библиотеки измерялась при помощи набора QuDye dsDNA HS Assay Kit (Lumiprobe, Россия) и составила 14,6 нг/мкл.

Индексированные последовательности были секвенированы на приборе Illumina MiSeq с использованием реагентов MiSeq Reagent Kit v3 (600-cycle). Результаты исследования были проанализированы биоинформатически с помощью утилит FastQC, bwa, samtools и SpecHLA. По результатам биоинформатического анализа в исходном образце были определены следующие аллели: DPA1*01:03:01, DPA1*02:01:02. Данные аллели совпали с результатами полногеномного секвенирования, которое ранее было выполнено для данного сотрудника.

Пример 3. Секвенирование гена HLA-DPA1 в образце ДНК, выделенной из крови.

У сотрудника лаборатории взят был взят клинический образец цельной крови в пробирке с ЭДТА, выделение ДНК осуществлялось при помощи набора реагентов «РИБО-преп» (AmpliSens, Россия) согласно рекомендациям производителя. Концентрация выделенной ДНК была измерена набором «Quantum-211» (Евроген, Россия) и составила 14,9 нг/мкл. Амплификация осуществлялась с применением набора оригинальных синтезированных олигонуклеотидных праймеров SEQ ID NO: 1-8.

ПЦР-микс объемом 20 мкл на одну реакцию содержал 10 мкл ПЦР-смеси-2 blue (AmpliSens, Россия), 1,4 мкл эквимолярной смеси четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов со стоковой концентрацией 4,4 мМ, олигонуклеотидные праймеры SEQ ID NO: 1-8 в концентрациях, указанных в Таблице 1, и воду milli-Q. ДНК-матрица добавлялась в количестве 5 мкл (концентрация ДНК 13,8 нг/мкл), итоговый объем реакции составлял 25 мкл.

Далее проводилась очистка ПЦР-продуктов от реакционной смеси с использованием магнитных частиц AMPure ХР beads (Beckman Coulter, США) в объемном отношении 1:0,8. После этого осуществлялась индексация полученных фрагментов.

ПЦР-микс объемом 15 мкл на одну реакцию содержал 10 мкл ПЦР-смеси-2 blue (AmpliSens, Россия), 1,4 мкл эквимолярной смеси четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов со стоковой концентрацией 4,4 мМ, соответствующие олигонуклеотиды в концентрации 0,25 пмоль/мкл и воду milli-Q. ДНК-матрица добавлялась в количестве 5 мкл, итоговый объем реакции составлял 20 мкл.

Длины полученных продуктов амплификации были проанализированы с помощью электрофореза в 1% агарозном геле. Далее повторно производилась очистка от реакционной смеси с использованием магнитных частиц AMPure ХР beads (Beckman Coulter, США) в объемном отношении 1:0,8. Концентрация полученной библиотеки измерялась при помощи набора QuDye dsDNA HS Assay Kit (Lumiprobe, Россия) и составила 12,2 нг/мкл. Индексированные последовательности были секвенированы на приборе Illumina MiSeq с использованием реагентов MiSeq Reagent Kit v3 (600-cycle). Результаты исследования были проанализированы биоинформатически с помощью утилит FastQC, bwa, samtools и SpecHLA. По результатам биоинформатического анализа в исходном образце были определены следующие аллели: DPA1*01:03:01, DPA1*01:03:01 (гомозигота). Данные аллели совпали с результатами секвенирования гена HLA-DPA1 в данном образце при помощи набора Nextera XT DNA Library Preparation Kit (Illumina).

Пример 4. Секвенирование гена HLA-DPA1 в образце ДНК, выделенной из гомогената печени.

Для выделения ДНК был взят клинический образец гомогената печени человека, выделение ДНК осуществлялось при помощи набора реагентов «РИБО-преп» (AmpliSens, Россия) согласно рекомендациям производителя. Концентрация выделенной ДНК была измерена набором «Quantum-211» (Евроген, Россия) и составила 11,9 нг/мкл. Амплификация осуществлялась с применением набора оригинальных синтезированных олигонуклеотидных праймеров SEQ ID NO: 1-8.

ПЦР-микс объемом 20 мкл на одну реакцию содержал 10 мкл ПЦР-смеси-2 blue (AmpliSens, Россия), 1,4 мкл эквимолярной смеси четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов со стоковой концентрацией 4,4 мМ, олигонуклеотидные праймеры SEQ ID NO: 1-8 в концентрациях, указанных в Таблице 1, и воду milli-Q. ДНК-матрица добавлялась в количестве 5 мкл (концентрация ДНК 11,9 нг/мкл), итоговый объем реакции составлял 25 мкл.

Далее проводилась очистка ПЦР-продуктов от реакционной смеси с использованием магнитных частиц AMPure ХР beads (Beckman Coulter, США) в объемном отношении 1:0,8. После этого осуществлялась индексация полученных фрагментов.

ПЦР-микс объемом 15 мкл на одну реакцию содержал 10 мкл ПЦР-смеси-2 blue (AmpliSens, Россия), 1,4 мкл эквимолярной смеси четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов со стоковой концентрацией 4,4 мМ, соответствующие олигонуклеотиды в концентрации 0,25 пмоль/мкл и воду milli-Q. ДНК-матрица добавлялась в количестве 5 мкл, итоговый объем реакции составлял 20 мкл.

Длины полученных продуктов амплификации были проанализированы с помощью электрофореза в 1% агарозном геле. Далее повторно производилась очистка от реакционной смеси с использованием магнитных частиц AMPure ХР beads (Beckman Coulter, США) в объемном отношении 1:0,8. Концентрация полученной библиотеки измерялась при помощи набора QuDye dsDNA HS Assay Kit (Lumiprobe, Россия) и составила 15,3 нг/мкл. Индексированные последовательности были секвенированы на приборе Illumina MiSeq с использованием реагентов MiSeq Reagent Kit v3 (600-cycle). Результаты исследования были проанализированы биоинформатически с помощью утилит FastQC, bwa, samtools и SpecHLA. По результатам биоинформатического анализа в исходном образце были определены следующие аллели: DPA1*01:03:01, DPA1*02:07:01. Данные аллели совпали с результатами секвенирования гена HLA-DPA1 в данном образце при помощи набора Nextera XT DNA Library Preparation Kit (Illumina).

Предложенное изобретение позволяет секвенировать экзоны гена HLA-DPA1 и по результатам секвенирования определить аллели данного гена, содержащиеся в исходном образце, а также исключает амплификацию нецелевых регионов ДНК человека.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.2//EN" "ST26SequenceListing_V1_2.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_2" fileName="Nabor sinteticheskih

oligonukleotidov dlya sekvenirovaniya ekzonov gena HLA-DPA1"

softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="1.0.0"

productionDate="2024-06-21">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>nn</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2024-06-21</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>1</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>nn</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2024-06-21</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии

Роспотребнадзора</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>FBUN CRIE</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ секвенирования экзонов гена

HLA-DPA1 и набор синтетических олигонуклеотидов для его

реализации</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>8</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>53</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..53</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacaggtgctagaggcccaca

gttt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>56</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..56</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gtctcgtgggctcggagatgtgtataagagacagggaccagatagatca

atgagcc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>54</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..54</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacaggttgctccttcttctt

cccca</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>54</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..54</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gtctcgtgggctcggagatgtgtataagagacagttcctagtctgaggg

tggca</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="5">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>54</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..54</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacagtcctaacctggtgctg

tctcc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="6">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>55</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..55</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gtctcgtgggctcggagatgtgtataagagacagtgaaagctggtgcag

aggaca</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="7">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>56</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..56</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacagtgaccctatctcttca

ttcttcc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="8">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>59</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..59</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gtctcgtgggctcggagatgtgtataagagacagttttcctcccttcct

tacattctac</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области молекулярной биологии. Описан способ секвенирования экзонов гена HLA-DPA1 методом фрагментарного NGS-секвенирования с применением олигонуклеотидных праймеров, имеющих структуру SEQ ID NO: 1-8. Также описан набор указанных олигонуклеотидных праймеров. Технический результат заключается в разработке эффективного способа фрагментарного NGS-секвенирования экзонов гена HLA-DPA1 в целях точного определения аллелей данного гена. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 9 табл., 4 пр.

1. Способ секвенирования экзонов гена HLA-DPA1 методом фрагментарного NGS-секвенирования, включающий стадии:

(a) выделение ДНК из биологического материала;

(b) проведение ПЦР с применением олигонуклеотидных праймеров, имеющих структуру SEQ ID NO: 1-8, при этом реакционная смесь для амплификации содержит олигонуклеотидные праймеры в следующей концентрации: SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 7, 8 – по 0,1 пмоль/мкл каждый; SEQ ID NO: 3, 4 - по 0,15 пмоль/мкл каждый;

(c) очистку продуктов ПЦР при помощи магнитных частиц;

(d) индексацию полученных ампликонов;

(e) повторную очистку продуктов ПЦР при помощи магнитных частиц;

(f) секвенирование полученных индексированных ампликонов.

2. Набор олигонуклеотидных праймеров для реализации способа по п. 1, имеющих структуру SEQ ID NO: 1-8, для выполнения функции праймеров, комплементарных участкам гена HLA-DPA1.

3. Набор олигонуклеотидных праймеров по п. 2, где функции прямых праймеров выполняют олигонуклеотидные праймеры, имеющие структуру SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7.

4. Набор олигонуклеотидных праймеров по п. 2, где функции обратных праймеров выполняют олигонуклеотидные праймеры, имеющие структуру SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8.