ШАБЛОНЫ АФЛАТОКСИНА, ПОЛИМЕРЫ С МОЛЕКУЛЯРНЫМИ ОТПЕЧАТКАМИ И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2019 года по МПК C07D311/16 C08F222/10 C08F226/06 C08J9/26 B01J20/26 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0001] В целом, настоящее изобретение относится к шаблонам афлатоксина и полимерам с молекулярными отпечатками (ПМО). В частности, изобретение относится к экологически безопасным ПМО многократного использования, способам их получения и способам их применения (например, для секвестирования и/или адсорбирования афлатоксинов). Композиции и способы согласно изобретению находят применение в различных областях, в том числе, при обработке и производстве диетических продуктов, терапевтических средств, профилактических средств, продуктов питания и напитков, а также в целях исследования и контроля качества.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002] Микотоксины представляют собой вторичные метаболиты, продуцируемые различными грибами, которые часто встречаются в зернах злаковых, а также в фуражных кормах до, во время и после сбора урожая. В природных условиях фуражные корма и зерновые контактируют с грибковыми спорами. Грибковое инфицирование растений и биосинтез токсинов зависят от состояния здоровья растения перед сбором урожая, метеорологических условий, техники сбора урожая, задержек и гидротермических условий перед стабилизацией при консервировании и обработке сырья. В зависимости от разновидности грибка грибковый рост контролируют с помощью ряда физико-химических параметров, включающих количество свободной воды (a_w), температуру, присутствие кислорода, природу субстрата и величину рН. Микотоксины разрастаются до уборки урожая, а также после уборки урожая при хранении.

[0003] Некоторые грибы вырабатывают токсины только при определенных уровнях влажности, при наличии воды, температуры или кислорода. Воздействие микотоксинов значительно различается по своей тяжести. Некоторые микотоксины смертельны, некоторые вызывают распознаваемые заболевания или проблемы со здоровьем, некоторые ослабляют иммунную систему, не вызывая симптомов, характерных для такого микотоксина, некоторые действуют как аллергены или раздражители, и некоторые микотоксины не оказывают известного действия на животных или людей. Согласно последним отчетам Продовольственной и сельскохозяйственной организации ООН (ФАО), приблизительно 25% мировых зерновых ресурсов заражено микотоксинами. Заражение микотоксинами оказывает отрицательное экономическое воздействие на производителей продуктов питания и кормов, в частности, на производителей зерна и продукции животноводства.

[0004] Микотоксины могут появляться в пищевой цепи в результате грибкового заражения растительных продуктов (например, фуража, зерна, растительного белка, полуфабрикатов из обработанного зерна, грубых кормов и продуктов на основе патоки), и могут поступать в организм людей непосредственно при еде или посредством загрязненного зерна, корма (кормов) для крупного рогатого скота или других животных. Микотоксины проявляют высокую устойчивость к разложению в процессе пищеварения, поэтому они остаются в пищевой цепи в съедобных продуктах (например, в мясе, рыбе, яйцах и молочных продуктах) или в форме метаболитов исходных потребленных токсинов. Температурная обработка, такая как варка и замораживание, не являются подходящими способами снижения распространения микотоксинов. Таким образом, существует потребность в композициях и/или способах для уменьшения вредного воздействия микотоксинов и/или устранения их возникновения в продуктах питания и/или пищевых цепях.

[0005] Афлатоксины относятся к семейству микотоксинов. Указанные токсины вырабатываются плесенями вида Aspergillus, такими как Aspergillus flavus или А. Parasiticus, которые заражают различное кормовое и пищевое сырье и которые могут в конечном счете передаваться в их нативной форме или содержаться в виде метаболитов в полуфабрикатах из животного сырья, таких как молоко, яйца или возможно мясо. Афлатоксины представляют собой значительный риск для здоровья вследствие их высокой токсичности и канцерогенности, и нормативные уровни строго регламентируют их допустимую концентрацию в кормах для животных и продуктах питания человека.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0006] Имеется потребность в выделении афлатоксинов и метаболитов из материалов, как для диагностических целей, так и с целью уменьшения отрицательных последствий. Полимеры с молекулярными отпечатками (ПМО), описанные в настоящей заявке представляют собой материалы, проявляющие молекулярное распознавание афлатоксина. ПМО синтезируют в присутствии шаблона афлатоксина (например, имитатора афлатоксина), который используют для изготовления отпечатка и затем удаляют из полимера после завершения процесса полимеризации, при этом в полимере остается полость с той же стереохимией, функциональными группами и морфологией, что и шаблон. При столкновении ПМО с афлатоксином афлатоксин связывается в полости.

[0007] Настоящее изобретение, в целом, относится к шаблонам афлатоксина и полимерам с молекулярными отпечатками (ПМО). В частности, изобретение относится к экологически безопасным ПМО многократного использования, способам их получения, способам их применения (например, для секвестирования и/или адсорбирования афлатоксинов) и другим способам применения (например, для обнаружения присутствия афлатоксинов в целях соблюдения прослеживаемости и для удаления афлатоксинов из зараженного источника). Композиции и способы согласно изобретению находят применение в различных областях, в том числе, при обработке и производстве диетических продуктов, терапевтических средств, профилактических средств, продуктов питания и напитков, при фильтровании жидкостей, а также в целях исследования и контроля качества.

[0008] Согласно вариантам реализации изобретения шаблоны афлатоксина, мономеры, сшивающие агенты и/или ПМО имеют подходящие характеристики безопасности и/или особенности поведения в окружающей среде, такие как пониженная токсичность или ее отсутствие, высокая водопоглощаемость и удерживание афлатоксинов. Согласно предпочтительным вариантам реализации изобретения ПМО может быть многократного использования и экономически осуществимым/производимым.

[0009] Согласно одному из аспектов изобретения предложены шаблоны афлатоксина. Согласно конкретному варианту реализации изобретения шаблон афлатоксина имеет формулу (I):

где R₁ выбран из Н, C_1-6 алкила, замещенного C_1-6 алкила и галогензамещенного C_1-6 алкила; R₂ выбран из галогена, C_1-6 алкила, замещенного C_1-6алкила, галогензамещенного C_1-6 алкила, CH₂C(O)OR' и CH(C(O)OR')₂; где R' выбран из Н, C_1-6 алкила и замещенного C_1-6 алкила; и R₃ выбран из Н, C_1-6 алкокси и замещенного C_1-6 алкила. Согласно вариантам реализации изобретения R' дополнительно содержит заместители, выбранные из ряда, состоящего из галоген-, гидрокси- и алкокси- групп. Согласно специфическому варианту реализации изобретения шаблон афлатоксина представляет собой выделенное соединение, имеющее формулу:

Дополнительные варианты реализации изобретения включают шаблоны афлатоксина, которые представляют собой выделенное соединение, выбранное из группы, состоящей из:

и их комбинаций.

[0010] Другой аспект изобретения включает способ синтеза шаблона афлатоксина формулы (I), включающий: взаимодействие 3,5-диметоксифенола с этил-4-хлорацетоацетатом в кислоте с получением 4-(хлорметил)-5,7-диметоксикумарина.

[0011] Согласно другим вариантам реализации изобретения способ синтеза шаблона афлатоксина включает суспендирование моноосновной кислоты следующей формулы:

в полифосфорной кислоте и нагревание до по меньшей мере 50°С; охлаждение реакционной смеси ниже 50°С и добавление водного раствора с получением шаблона афлатоксина с формулой:

[0012] Согласно другим вариантам реализации изобретения, моноосновную кислоту получают путем суспендирования двухосновной кислоты с формулой:

в растворителе и нагревания до по меньшей мере от 100 до 140°С.

[0013] Согласно другому варианту реализации изобретения способ синтеза шаблонного соединения афлатоксина включает: снятие защиты с интермедиата 1,3-диэтилового эфира 2-[(5,7-диметокси-2-оксо-2Н-1-бензопиран-4-ил)метил]малоновой кислоты с получением аналога двухосновной кислоты; и осаждение аналога двухосновной кислоты для выделения шаблона афлатоксина с формулой:

[0014] Согласно другим вариантам реализации изобретения 1,3-диэтиловый эфир 2-[(5,7-диметокси-2-оксо-2Н-1-бензопиран-4-ил)метил]малоновой кислоты получают способом, включающим: соединение 4-(хлорметил)-5,7-диметоксикумарина с диэтилмалонатом, иодидом калия и краун-эфиром в полярном растворителе с получением смеси; и добавление в смесь бутоксида калия с получением 1,3-диэтилового эфира 2-[(5,7-диметокси-2-оксо-2Н-1-бензопиран-4-ил)метил]малоновой кислоты.

[0015] Согласно другим вариантам реализации изобретения способ синтеза шаблона афлатоксина формулы (I) включает: снятие защиты с 1,3-диэтилового эфира 2-[(5,7-диметокси-2-оксо-2Н-1-бензопиран-4-ил)метил]малоновой кислоты с получением аналога двухосновной кислоты и осаждение аналога двухосновной кислоты формулы:

суспендирование аналога двухосновной кислоты в растворителе, нагревание до по меньшей мере от 100 до 140°С и осаждение моноосновной кислоты формулы:

суспендирование моноосновнои кислоты в кислоте и нагревание до по меньшей мере 50°С, охлаждение реакционной смеси ниже 50°С и добавление водного раствора с получением соединения формулы:

[0016] Другой аспект изобретения приводит к образованию интермедиата полимера с молекулярными отпечатками, содержащего комплекс сшитого полимера, полученный из мономера и шаблона афлатоксина, имеющего формулу (I):

где R₁ выбран из Н, C_1-6 алкила, замещенного C_1-6 алкила и галогензамещенного C_1-6 алкила; R₂ выбран из галогена, C_1-6 алкила, замещенного C_1-6алкила, галогензамещенного C_1-6 алкила, CH₂C(O)OR' и CH(C(O)OR')₂; где R' выбран из Н, C_1-6 алкила и замещенного C_1-6 алкила; и R₃ выбран из Н, C_1-6 алкокси и замещенного C_1-6 алкила или где R₁ вместе с R₂ образуют С_4-7 циклоалкильное кольцо, галогензамещенное С_4-7 циклоалкильное кольцо, оксозамещенное С_4-7 циклоалкильное кольцо, С_4-7 циклоалкокси кольцо, гидроксизамещенное С_4-7 циклоалкильное кольцо или содержащий карбоксильную группу С_4-7 циклоалкил; и R₃ выбран из Н, C_1-6 алкокси и замещенного C_1-6 алкила. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения отношение шаблона афлатоксина к мономеру в интермедиате полимера с молекулярными отпечатками составляет от примерно 100:1 до 1:100. Согласно другим вариантам реализации изобретения отношение мономера к сшивающему агенту в интермедиате полимера с молекулярными отпечатками составляет от примерно 1:4.1 до 1:10. Согласно другим вариантам реализации изобретения интермедиат полимера с молекулярными отпечатками включает шаблон афлатоксина формулы (I), выбранный из группы, состоящей из 4-(хлорметил)-5,7-диметоксикумарина, 5,7-диметоксициклопентенон[2,3-с]кумарина и их комбинаций.

[0017] Другой аспект изобретения включает полимер с молекулярными отпечатками, содержащий сшитый полимер, полученный из мономера, при этом полимер содержит множество полостей, причем по меньшей мере одна из указанных полостей была получена с помощью шаблона афлатоксина, имеющего формулу (I):

где R₁ выбран из Н, C_1-6 алкила, замещенного C_1-6 алкила и галогензамещенного C_1-6 алкила; R₂ выбран из галогена, C_1-6 алкила, замещенного C_1-6 алкила, галогензамещенного C_1-6 алкила, CH₂C(O)OR' и CH(C(O)OR')₂; где R' выбран из Н, C_1-6 алкила и замещенного C_1-6 алкила; и R₃ выбран из Н, C_1-6 алкокси и замещенного C_1-6 алкила или где R₁ вместе с R₂ образуют С_4-7 циклоалкильное кольцо, галогензамещенное С_4-7 циклоалкильное кольцо, оксозамещенное С_4-7 циклоалкильное кольцо, С_4-7 циклоалкокси кольцо, гидроксизамещенное С_4-7 циклоалкильное кольцо или содержащий карбоксильную группу С_4-7 циклоалкил; и R₃ выбран из Н, C_1-6 алкокси и замещенного C_1-6 алкила. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения полимер с молекулярными отпечатками включает шаблон афлатоксина, который представляет собой 4-(хлор метил)-5,7-диметоксикумарин. Согласно вариантам реализации изобретения полимер с молекулярными отпечатками включает шаблонное соединение афлатоксина, которое представляет собой 5,7-диметоксициклопентенон[2,3-с]кумарин. Согласно вариантам реализации изобретения полимер с молекулярными отпечатками содержит мономер, выбранный из группы, состоящей из метакриловой кислоты, 2-винилпиридина, 2-гидроксиэтилметакрилата и их комбинаций. Согласно вариантам реализации изобретения полимер с молекулярными отпечатками содержит сшивающий агент, который представляет собой диметакрилат этиленгликоля. Согласно другим вариантам реализации изобретения полимер с молекулярными отпечатками имеет отношение шаблона афлатоксина к мономеру, составляющее от примерно 100:1 до 1:100. Согласно другим вариантам реализации изобретения полимер с молекулярными отпечатками имеет отношение мономера к сшивающему агенту, составляющее от примерно 1:4.1 до 1:10.

[0018] Другой аспект изобретения включает способ получения полимера с молекулярными отпечатками, включающий стадии: получения шаблона афлатоксина, имеющего формулу (I):

где R₁ выбран из Н, C_1-6 алкила, замещенного C_1-6 алкила и галогензамещенного C_1-6 алкила; R₂ выбран из галогена, C_1-6 алкила, замещенного C_1-6 алкила, галогензамещенного C_1-6 алкила, CH₂C(O)OR' и CH(C(O)OR')₂; где R' выбран из Н, C_1-6 алкила и замещенного C_1-6 алкила; и R₃ выбран из Н, C_1-6 алкокси и замещенного C_1-6 алкила или где R₁ вместе с R₂ образуют С_4-7 циклоалкильное кольцо, галогензамещенное С_4-7 циклоалкильное кольцо, оксозамещенное С_4-7 циклоалкильное кольцо, С_4-7 циклоалкокси кольцо, гидроксизамещенное С_4-7 циклоалкильное кольцо или содержащий карбоксильную группу С_4-7 циклоалкил; и R₃ выбран из Н, C_1-6 алкокси и замещенного C_1-6 алкила; объединения шаблона афлатоксина с по меньшей мере одним мономером и одним или более сшивающими агентами; полимеризации мономера и одного или более сшивающих агентов с получением интермедиата полимера с молекулярными отпечатками; и удаления шаблона афлатоксина из интермедиата полимера с молекулярными отпечатками с получением полимера с молекулярными отпечатками. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения шаблон афлатоксина содержит 5,7-диметокси-циклопентенон [2,3-с]кумарин, 4-(хлорметил)-5,7-диметоксикумарин или их комбинации. Согласно вариантам реализации изобретения ПМО получают способом, описанным в настоящей заявке.

[0019] Согласно вариантам реализации изобретения стадия объединения шаблонного соединения афлатоксина с по меньшей мере одним мономером и одним или более сшивающими агентами включает смешивание мономера и сшивающего агента в растворе одного или более органических растворителей. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения один или более растворителей выбраны из группы, состоящей из ацетонитрила, толуола, циклогексана, поливинилового спирта в водном растворе и смеси двух или более соединений, выбранных из ацетонитрила, толуола, циклогексана, поливинилового спирта в водном растворе.

[0020] Согласно другим вариантам реализации изобретения способ дополнительно включает добавление инициатора. Согласно конкретному варианту реализации изобретения инициатор представляет собой азо-бис-изобутиронитрил (AIBN), при этом свободные радикалы образуются при термическом разложении AIBN, действующего как инициатор. Согласно другим вариантам реализации изобретения полимеризацию инициируют путем образования свободных радикалов в органическом растворителе при температуре от 55 до 110°С.

[0021] Согласно вариантам реализации изобретения удаление шаблона афлатоксина из интермедиата полимера с молекулярными отпечатками включает промывание интермедиата полимера с молекулярными отпечатками с помощью растворителя. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения органический растворитель выбран из группы, состоящей из этилового спирта, метилового спирта, ацетонитрила, толуола и их смеси.

[0022] Согласно вариантам реализации изобретения полимер с молекулярными отпечатками высушивают после указанного одного или более промываний.

[0023] Другой аспект изобретения включает способ секвестрации афлатоксина, включающий: получение полимера с молекулярными отпечатками, содержащего множество полостей, при этом по меньшей мере одна из полостей получена с помощью шаблона афлатоксина, имеющего формулу (I):

где R₁ выбран из Н, C_1-6 алкила, замещенного C_1-6 алкила и галогензамещенного C_1-6 алкила; R₂ выбран из галогена, C_1-6 алкила, замещенного C_1-6 алкила, галогензамещенного C_1-6 алкила, CH₂C(O)OR' и CH(C(O)OR')₂; где R' выбран из Н, C_1-6 алкила и замещенного C_1-6 алкила; и R₃ выбран из Н, C_1-6 алкокси и замещенного C_1-6 алкила или где R₁ вместе с R₂ образуют С_4-7 циклоалкильное кольцо, галогензамещенное С_4-7 циклоалкильное кольцо, оксозамещенное С_4-7 циклоалкильное кольцо, С_4-7 циклоалкокси кольцо, гидроксизамещенное С_4-7 циклоалкильное кольцо или содержащий карбоксильную группу С_4-7 циклоалкил; и R₃ выбран из Н, C_1-6 алкокси и замещенного C_1-6 алкила; обеспечение материала, при этом указанный материал возможно содержит афлатоксин; и приведение полимера с молекулярными отпечатками в контакт с материалом.

[0024] Согласно вариантам реализации изобретения материал представляет собой жидкость, твердое вещество или газ. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения материал выбран из группы, состоящей из почвы, специи, напитка, продукта питания, корма для животных, лекарственного препарата, нутрицевтической композиции и косметической композиции. Согласно специфическому варианту реализации изобретения материал представляет собой молоко.

[0025] Согласно вариантам реализации изобретения полимер с молекулярными отпечатками приводят в контакт с материалом в течение по меньшей мере 1 секунды.

[0026] Согласно вариантам реализации изобретения способ дополнительно включает отделение материала с молекулярными отпечатками от указанного материала. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения отделение полимера с молекулярными отпечатками включает отделение посредством фильтрации или центрифугирования.

[0027] Согласно вариантам реализации изобретения способ дополнительно включает определение количества афлатоксина, образующего комплекс с полимером с молекулярными отпечатками, определение количества афлатоксина в материале после приведения в контакт с полимером с молекулярными отпечатками или и то и другое.

[0028] Согласно другим вариантам реализации изобретения способ секвестрации афлатоксина включает стадии: получения полимера с молекулярными отпечатками, содержащего множество полостей, при этом по меньшей мере одна полость была получена с помощью шаблона афлатоксина, имеющего формулу (I):

где R₁ выбран из Н, C_1-6 алкила, замещенного C_1-6 алкила и галогензамещенного C_1-6 алкила; R₂ выбран из галогена, C_1-6 алкила, замещенного C_1-6 алкила, галогензамещенного C_1-6 алкила, CH₂C(O)OR' и CH(C(O)OR')₂; где R' выбран из Н, C_1-6 алкила и замещенного C_1-6 алкила; и R₃ выбран из Н, C_1-6 алкокси и замещенного C_1-6 алкила или где R₁ вместе с R₂ образуют С_4-7 циклоалкильное кольцо, галогензамещенное С_4-7 циклоалкильное кольцо, оксозамещенное С_4-7 циклоалкильное кольцо, С_4-7 циклоалкокси кольцо, гидроксизамещенное С_4-7 циклоалкильное кольцо или содержащий карбоксильную группу С_4-7 циклоалкил; и R₃ выбран из Н, C_1-6 алкокси и замещенного C_1-6 алкила; b) обеспечения материала, содержащего афлатоксин; и с) приведения полимера с молекулярными отпечатками в контакт с указанным материалом, при этом полимер с молекулярными отпечатками секвестирует по меньшей мере 40 процентов афлатоксина по массе на единицу материала. Согласно вариантам реализации изобретения материал представляет собой жидкость, при этом полимер с молекулярными отпечатками секвестирует по меньшей мере 40 процентов массы афлатоксина на объем материала.

ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0029] На фиг. 1 показано количество афлатоксина M1 (AFM1), адсорбированного 1 мг каждого ПМО в устройстве с колонкой для твердофазной экстракции (SPE) при мгновенном улавливании при применении 1 мл 100 нг/л раствора AFM1 в аммонийно-ацетатном буферном растворе с рН 6,0 . Также показаны количества AFM1, присутствующие последовательно в метаноле и толуоле (), при промывании, выполненном после стадии адсорбции. Можно определить количество адсорбированного AFM1 относительно количества AFM1, высвобожденного из материала.

[0030] На фиг. 2 показано среднее значение адсорбции AFM1, усредненное по нескольким временным точкам, для указанных ПМО и соответствующих полимеров без молекулярных отпечатков (ПБМО) (в диапазоне от 0,001% до 0,1%) при взаимодействии свободнотекучего ПМО/ПБМО в течение 6 периодов времени, от 5 до 500 минут, с 10 мл 90 нг/л раствора AFM1. Эффективность адсорбции измеряли путем количественного определения микотоксина, оставшегося в надосадочной жидкости и элюирующем растворе из ПМО/ПБМО после промывания метанолом , что позволяло определить эффективность и селективность адсорбции. Благодаря тому факту, что имеет место мгновенная адсорбция, значения адсорбции AFM1 для каждого момента времени (15, 30, 60, 90 минут и 18 часов) были усреднены для каждого продукта. Затем все пробирки центрифугировали в течение 10 минут при 3000 об/мин и переносили содержимое в UPLC флакон для анализа. Далее порошок (ПМО или ПБМО) переносили в пробирку Эппендорфа объемом 2 мл, в которую добавляли 1 мл метанола, и встряхивали в течение приблизительно трех секунд.

[0031] На фиг. 3 показано среднее значение адсорбции AFM1, усредненное для ПМО-003 (в диапазоне от 0,001% до 0,1%) в 10 мл сырого молока с добавкой AFM1 с концентрацией 225 нг/л.

[0032] Фиг. 4 представляет собой схематическую диаграмму синтеза шаблона афлатоксина.

[0033] На фиг. 5 показаны результаты мгновенного улавливания AFM1 с помощью ПМО-005 при различных степенях включения (в диапазоне от 0,001% - 0,1%) в установке с колонкой SPE при комнатной температуре.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

[0034] В настоящей заявке термин «примерно», применяемый со ссылкой на конкретное приведенное численное значение, означает, что указанное значение может отклоняться относительно приведенного значения не более чем на 1%. Например, в настоящей заявке выражение «примерно 100» включает 99 и 101 и все значения между ними (например, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4 и т.п.).

[0035] В настоящей заявке термин «полимер (полимеры) с молекулярными отпечатками» или «ПМО» относится к синтетическим полимерам, которые селективно связываются с одним или более афлатоксинами. Согласно вариантам реализации изобретения ПМО проявляет высокую энантиоселективность и низкую селективность к субстрату, при этом ПМО взаимодействует с рацематом шаблонного афлатоксина, а также с его соответствующими аналогами, такими как природные афлатоксины. Согласно вариантам реализации изобретения ПМО имеет более высокую энантиоселективность, чем соответствующий полимер без молекулярных отпечатков, в отношении связывания афлатоксинов. Согласно вариантам реализации изобретения ПМО селективно связывается с афлатоксинами и не связывается с другими микотоксинами. Согласно вариантам реализации изобретения ПМО связывается с одним или более афлатоксинами B1, В2, G1, G2, M1, М2, Р1 и Q1. Согласно вариантам реализации изобретения ПМО селективно связывает афлатоксин В1 и афлатоксин M1.

[0036] Согласно вариантам реализации изобретения полимер сшивают для получения полостей, по меньшей мере одна из которых получена с помощью шаблона афлатоксина формулы (I). Согласно некоторым вариантам реализации изобретения по меньшей мере одна полость обеспечивает место взаимодействия для обратимого связывания с шаблоном афлатоксина формулы (I) и/или афлатоксинами. В целом, ПМО получают с применением: i) шаблонов (например, шаблона афлатоксина), которые имитируют структуру, размер, форму и/или другие химические характеристики одного или более заданного соединения (соединений) (например, афлатоксинов) и ii) других компонентов, таких как мономеры и/или сшивающие реагенты. Например, один или более шаблонов афлатоксина вводят в преполимерную смесь, содержащую мономеры и сшивающий агент. Затем смесь полимеризуют с получением «интермедиата полимера с молекулярными отпечатками» или «интермедиата ПМО», содержащего сшитый полимер и шаблон (шаблоны) афлатоксина. После образования полимера шаблон (шаблоны) афлатоксина удаляют, при этом остаются комплементарные полости, обладающие химической и/или физической способностью образовывать комплекс с одним или более афлатоксинами или другими соединениями, похожими на афлатоксин. Такие области (например, полости или другие области) приспособлены для связывания одного или более афлатоксинов и являются причиной увеличения сродства в отношении такого рода афлатоксинсодержащих соединений и селективности. Хотя шаблонные соединения афлатоксина применяют для получения полимеров с молекулярными отпечатками, согласно некоторым вариантам реализации изобретения ПМО может иметь высокое сродство в отношении класса соединений, которые отличаются от, но похожи на один или более афлатоксинов. Например, ПМО может связывать ряд соединений, содержащих молекулы, похожие по форме, размеру, плотности заряда, геометрии или другим физическим или химическим свойствам на один или более афлатоксинов.

[0037] В настоящей заявке термин «полимер без молекулярных отпечатков» или «ПБМО» относится к синтетическим полимерам, которые получают в отсутствие шаблонного соединения (например, шаблона афлатоксина). Такие полимеры, которые не обладают ни энантиоселективностью, ни селективностью в отношении субстрата, могут взаимодействовать с любыми молекулами, склонными к образованию водородных связей, ионному взаимодействию, электростатическому взаимодействию и т.п., с компонентами ПБМО. ПБМО участвуют в неспецифических нековалентных поверхностных взаимодействиях, характеризующихся меньшей устойчивостью, чем в случае, когда в сети ПМО имеется специфическая полость, полученная в результате процесса импринтинга, нацеленная на конкретное соединение (например, AFB1, AFM1). Согласно вариантам реализации изобретения, «соответствующий» ПБМО относится к синтетическому полимеру, полученному с применением того же мономера и сшивающего агента, что и ПМО, но без применения шаблона (например, шаблона афлатоксина).

[0038] В настоящей заявке термин «полимер» относится к молекуле (макромолекуле), состоящей из повторяющихся структурных звеньев (например, мономера), обычно связанных с помощью ковалентных химических связей, образующих сеть. Согласно вариантам реализации изобретения полимер получают путем сшивания мономеров, образующих первичные цепи или структурные звенья, которые объединяются с образованием сети.

[0039] В настоящей заявке термин «шаблон (шаблоны) афлатоксина» относится (относятся) к одной или более синтетически сконструированной молекуле (молекулам), которые имитируют структуру, размер, форму и/или другие химические характеристики одного или более природных афлатоксинов. Изобретение не ограничено видом используемого шаблона афлатоксина, который может быть синтетическим или природным. В действительности различные афлатоксины могут связываться с ПМО, получаемым с помощью шаблонного соединения афлатоксина, в том числе, но не ограничиваясь ими, с помощью афлатоксина B1, В2, G1, G2, M1, P1, Q1 и других афлатоксинов, описанных в настоящей заявке.

[0040] В настоящей заявке термин «мономер (мономеры)» относится к молекуле, которая может химически связываться с другими мономерами с образованием полимера.

[0041] В настоящей заявке термины «сшиватель» и «сшивающий агент» относятся к молекулам, содержащим две, три или четыре двойные связи, способные присоединяться к двум или более мономерам с образованием полимерной сети.

[0042] В настоящей заявке термин «структурное звено», относится к элементу структуры полимерной цепи и касается повторяющегося звена.

[0043] В настоящей заявке термин «анионный» или «анион» относится к иону, имеющему отрицательный заряд.

[0044] В настоящей заявке термин «катионный» или «катион» относится к иону, имеющему положительный заряд. Этот термин может относиться к полимерным соединениям, таким как полимеры с молекулярными отпечатками, которые имеют положительный заряд.

[0045] В настоящей заявке термин «кислота» относится к любому химическому соединению, которое может отдавать протон (протоны) и/или принимать электрон (электроны). В настоящей заявке термин «основание» относится к любому химическому соединению, которое может принимать протон (протоны) и/или отдавать электрон (электроны), или гидроксильным ионам. В настоящей заявке термин «соль» относится к соединениям, которые можно получить из неорганических или органических кислот и оснований.

[0046] В настоящей заявке термин «вымывание» относится к остаточной фракции шаблона, которая все еще связана с ПМО после нескольких стадий промывания ПМО и продолжает отделяться от ПМО и препятствовать его адсорбционной активности.

[0047] В настоящей заявке термин «порообразующий/порообразующий агент» относится к веществу, молекуле, буферу, растворителю (например, толуолу, ксилолу, этилбензолу), применяемому для изменения размера полостей в полимере (например, полостей в ПМО). Согласно вариантам реализации изобретения отношение полимера к порообразующему агенту непосредственно коррелирует со степенью пористости конечной структуры и обуславливает размер образующихся полимерных агломератов.

[0048] В настоящей заявке термин «степень включения» относится к количеству ПМО, обеспеченного на единицу материала (например, молока), например, в единицах массы полимера относительно единицы объема материала или в единицах массы полимера относительно единицы на массу материала.

[0049] В настоящей заявке термин «полость (полости)» относится (относятся) к пространству, поре или другому отверстию, которое находится/находятся внутри ПМО и которые имеют размеры и/или форму, позволяющие афлатоксину связываться внутри ПМО. Согласно вариантам реализации изобретения полость образуется в сшитом полимере при полимеризации полимера в присутствии шаблона афлатоксина и удалении шаблона афлатоксина с образованием полости в сшитом полимере, который теперь представляет собой ПМО.

[0050] В настоящей заявке термин «полимеризация» относится к процессу взаимодействия молекул мономера друг с другом в химической реакции с образованием трехмерных сетей или полимерных цепей и агломерированных полимерных цепей.

[0051] В настоящей заявке термин «осаждение» относится к образованию твердого вещества в растворе в ходе химической реакции. Образовавшееся в процессе реакции твердое вещество называют осадком, а жидкость, остающуюся над твердым веществом, называют надосадочной жидкостью.

[0052] В настоящей заявке термин «центрифугирование» относится к процессу разделения молекул по размеру или плотности с помощью центробежных сил, генерируемых вращающимся ротором, который размещает объект при вращении вокруг неподвижной оси, прикладывая силу, перпендикулярную оси. Центрифуга работает на основе принципа седиментации, при котором центростремительное ускорение используют для равномерного распределения веществ с большей и меньшей плотностью в разных слоях в зависимости плотности.

[0053] В настоящей заявке термин «концентрация» относится к количеству вещества на определенное пространство. Концентрацию обычно выражают в терминах массы на единицу объема. Для разбавления раствора следует добавить больше растворителя или уменьшить количество растворенного вещества (например, с помощью селективного отделения, испарения, распылительной сушки, сублимационной сушки). Напротив, для концентрирования раствора следует уменьшить количество растворителя.

[0054] В настоящей заявке термин «слой» относится к обычно горизонтальному отложению, образующему пласт материала, формирующего вышележащий участок или сегмент, полученный после отделения посредством центрифугирования или седиментации в зависимости от плотностных характеристик материала.

[0055] В настоящей заявке термин «очищенный» или «очищать» относится к удалению инородных компонентов из пробы. При применении в химическом контексте «очищенный» или «очищать» относится к физическому отделению представляющего интерес химического вещества от нежелательных веществ. Широко применяемые способы очистки органических молекул включают, но не ограничиваются ими, следующие способы: афинную очистку, механическую фильтрацию, центрифугирование, упаривание, экстракцию примеси, растворение в растворителе, в котором другие компоненты нерастворимы, кристаллизацию, адсорбцию, дистилляцию, фракционированию, сублимацию, плавление, перегонку, электролиз и диализ.

[0056] В настоящей заявке термин «сушка» относится к процессу любого рода, который позволяет уменьшить или устранить количество жидкости в веществе.

[0057] В настоящей заявке термин «промывание» относится к удалению (например, с применением любого типа раствора (например, дистиллированной воды, буфера или растворителя или смеси)) примесей или растворимого нежелательного компонента из препарата (например, ПМО можно промыть для удаления из образца компонентов шаблона афлатоксина).

[0058] В настоящей заявке термин «аналит» относится к атому, молекуле, веществу или химическому компоненту. В целом, аналит не измеряют сам по себе, скорее, определяют аспекты или свойства (физические, химические, биологические и т.п.) аналита с применением аналитического метода, такого как ультраэффективная жидкостная хроматография (сокращенно UPLC). Например, обычно не оценивают «плечо/пик» (аналит - компонент) само по себе, но измеряют высоту, ширину и т.п. плеча/пика. Подобным образом, в целом, не оценивают афлатоксин, но скорее измеряют одно или более свойств афлатоксина (например, флуоресценцию или молекулярную массу афлатоксинов, связанную, например, с его стабильностью, концентрацией или биологической активностью).

[0059] В настоящей заявке термин «образец» используют в широком смысле, включающем образцы из любого источника (например, синтетические, биологические и образцы из окружающей среды). Синтетические образцы включают любой материал, который получают искусственным путем (например, ПМО). Биологические образцы могут быть получены от животных (в том числе, человека) и включают жидкости, твердые вещества, ткани и газы. Биологические образцы включают препараты крови, такие как плазма, сыворотка и т.п. Образцы из окружающей среды включают материал из объектов окружающей среды, таких как материал пластов, почва, вода, кристаллы и промышленные образцы.

[0060] В настоящей заявке термин «ультраэффективная жидкостная хроматография» или «UPLC» относится к виду жидкостной хроматографии, предназначенной для разделения соединений. Соединения растворяют в растворе. Соединения разделяют путем введения исследуемой смеси в колонку, через которую пропускают растворитель или смесь растворителей при определенном давлении для элюирования компонентов смеси из колонки. Инструментарий UPLC содержит один или более емкостей с подвижными фазами, насос, дозатор, разделительную колонку и детектор. Присутствие аналитов в элюате регистрируют путем количественного определения изменения показателя преломления, поглощения в УФ и видимой области при заданной длине волны, флуоресценции после возбуждения с помощью подходящей длины волны, электрохимического отклика или по отношению массы к заряду на основе молекулярной массы анализируемого вещества в заряженном состоянии.

[0061] В настоящей заявке термин «сигнал», в целом, используют со ссылкой на любой регистрируемый процесс, который указывает, что произошла реакция (например, связывание антитела с антигеном). Сигналы можно оценить количественно, а также качественно. Примеры различных типов «сигналов» включают, но не ограничиваются ими, радиоактивные сигналы, флуорометрические сигналы, колориметрические сигналы продукта/реагента, показатель отношения массы к заряду.

[0062] В настоящей заявке термины «абсорбировать» и «абсорбция» относятся к процессу, посредством которого материал «впитывает» или «всасывает» другое вещество. Например, «абсорбция» может относиться к процессу впитывания или ассимилирования веществ в клетки или через ткани и органы посредством диффузии или осмоса (например, поглощение питательных веществ с помощью пищеварительной системы или поглощение лекарственных препаратов в кровоток).

[0063] В настоящей заявке термины «адсорбировать» и «адсорбция» относятся к процессу, который протекает при захвате, секвестировании, связывании, улавливании и/или аккумулировании (например, на поверхности) материала с помощью композиции (адсорбента) или к процессу, в котором композиция (например, ПМО) связывается с молекулой-мишенью (например, одним или более афлатоксинами) в образце (например, для удаления молекулы-мишени из образца).

[0064] В настоящей заявке термины «сорбировать» и «сорбция» относятся как к адсорбции, так и к абсорбции.

[0065] В настоящей заявке термины «секвестировать», «захватывать», «улавливать», «адсорбировать» или «связывать» относятся к физической ассоциации, например, посредством образования связей (например, водородной связи, ионной связи, ковалентной связи или другого типа связи) двух или более элементов, которые приводят в контакт друг с другом (например, с образованием, тем самым, комплекса). Типичные формы ассоциаций включают, но не ограничиваются ими, водородную связь, координацию и образование ионных пар. Секвестирующие взаимодействия могут включать переменное количество химических взаимодействий (например, химических связей) в зависимости от стереохимии и геометрии каждого элемента (например, дополнительное определение специфичности секвестрации). При взаимодействии двух или более элементов они могут секвестироваться посредством химических связей или физических связей, но могут также быть соединены с помощью заряда, диполь-дипольных взаимодействий или другого типа взаимодействий.

[0066] В настоящей заявке термины «секвестирующий агент», «поглощающий агент», «улавливающий агент», «адсорбирующий агент» и/или «связывающий агент» относятся к элементу, способному образовывать комплекс со вторым элементом.

[0067] В настоящей заявке термин «комплекс» относится к элементу, полученному путем ассоциации двух или более отдельных элементов (например, ассоциации двух или более элементов, в которой элементы являются одинаковыми или различными (например, одинаковыми или различными химическими соединениями). Ассоциацию можно обеспечить с помощью ковалентной связи или нековалентной связи (например, с помощью сил ван-дер-ваальсового взаимодействия, электростатического взаимодействия, взаимодействия между зарядами, гидрофобного взаимодействия, дипольного взаимодействия и/или водородного связывания (например, с помощью уретановых связей, амидных связей, сложноэфирных связей и их комбинации)).

[0068] В настоящей заявке термин «связь» относится к тесной ассоциации двух или более отдельных элементов (например, ассоциации двух или более элементов, в которой элементы являются одинаковыми или различными (например, одинаковыми или различными химическими соединениями). Ассоциацию можно обеспечить с помощью ковалентной связи или нековалентной связи (например, с помощью сил ван-дер-ваальсового взаимодействия, электростатического взаимодействия, взаимодействия между зарядами, гидрофобного взаимодействия, дипольного взаимодействия и/или водородного связывания (например, с помощью уретановых связей, амидных связей, сложноэфирных связей и их комбинации)). В настоящей заявке термин «тесная» относится к соприкосновению или почти соприкосновению.

[0069] В настоящей заявке термин «эффективное количество» относится к количеству композиции (например, ПМО), достаточному для достижения полезных или требуемых результатов. Эффективное количество можно ввести и/или объединить с другим материалом при однократном или нескольких введениях, нанесениях в одной или более дозах, при этом указанное количество не предполагают ограничить конкретным составом или способом введения.

[0070] В настоящей заявке термин «животное» относится к любому одному или более видам из царства животных. Указанный термин включает, но не ограничивается ими, крупный рогатый скот, других сельскохозяйственных животных, домашних животных, комнатных животных, морских и пресноводных животных и диких животных.

[0071] В настоящей заявке термин «корма» относится к материалу (материалам), которые потребляет человек или животное и которые обеспечивают поступление в субъект энергии и/или питательных веществ. Примеры кормов включают, но не ограничиваются ими, молочные продукты, соки, зерновые, в том числе, но не ограничиваясь ими, крупы, фрукты, овощи, мясо, однородную смесь компонентов рациона (TMR), фуражный корм (корма), кормовую гранулу (гранулы), концентрат (концентраты) любого из перечисленных выше продуктов, премикс (премиксы) или сопутствующий продукт (продукты) любого из перечисленных выше продуктов, патоку, волокно (волокна), фураж (фуражи), траву (травы), сено, зерно (зерна), листья, муку, сделанную из любого из перечисленных выше продуктов, растворимое вещество (вещества) и добавку (добавки), содержащие любой из перечисленных выше продуктов.

[0072] В настоящей заявке термин «микотоксин» относится к токсичному и/или канцерогенному соединению (соединениям), продуцируемому различными видами грибков. Согласно вариантам реализации изобретения микотоксин представляет собой афлатоксин.

[0073] В настоящей заявке термин «микотоксикоз» относится к состоянию, в котором микотоксины преодолевают барьеры резистентности организма человека или животного. Микотоксикоз можно рассматривать как инфекцию или заболевание, при этом он может оказывать вредное воздействие на пораженные организмы.

[0074] В настоящей заявке термин «токсичный» относится к любому пагубному, разрушительному, вредному или иным образом отрицательному действию (действиям) на животное или человека, в том числе, но не ограничиваясь ими, на клетку или ткань такого животного или человека. В настоящей заявке термины «пагубный», «разрушительный», «вредный» или «иным образом отрицательный» в отношении «действия» можно определить путем сравнения одной и той же клетки или ткани животного или человека до контакта или введения токсина или токсического вещества и после такого контакта и обнаружения нежелательного изменения в указанной клетке или ткани при проведении такого сравнения.

[0075] В настоящей заявке термин «прослеживаемость» относится к свойству результата измерения или значению стандарта, тем самым этот результат может быть прослеживаем до установленных эталонных величин, обычно национальных или международных стандартов, через непрерывную цепь сравнений, при этом все величины характеризуются установленными неопределенностями. Это пример практического применения общего метрологического подхода к химическим измерениям, обеспечивающего терминологию, подход и стратегию, гарантирующие, что аналитические химические измерения являются прослеживаемыми. Это позволяет анализировать однозначно определяемые элементы проверенным способом. Данные прослеживаемости используют, помимо прочего, для установления взаимосвязи между измерением времени, местоположением и/или применением объекта посредством документально зафиксированной идентификации.

[0076] В настоящей заявке термин «алкил», сам по себе или как часть другого заместителя, относится, если не указано иное, к прямой или разветвленной цепи или циклическому углеводородному радикалу или их комбинации, при этом указанная цепь или радикал являются полностью насыщенными и содержат несколько указанных углеродных атомов (например, С1-С6 означает от одного до шести атомов углерода). Примеры алкильных групп включают, но не ограничиваются ими, метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, трет-бутал, изобутил, циклогексил, гомологи и изомеры, например, н-пентила, н-гексила и т.п.

[0077] В настоящей заявке термин «гетероалкил», сам по себе или как часть другого заместителя, относится, если не указано иное, к прямой или разветвленной цепи или циклическому углеводородному радикалу или их комбинации, при этом указанная цепь или радикал являются полностью насыщенными и содержат несколько указанных углеродных атомов (например, С1-С6 означает от одного до шести атомов углерода), в которых один из углеродных атомов заменен на гетероатом. Согласно вариантам реализации изобретения гетероатом представляет собой кислород.

[0078] В настоящей заявке термин «замещенный алкил», если не указано иное, относится к прямой или разветвленной цепи или циклическому углеводородному радикалу или их комбинации, при этом указанная цепь или радикал являются полностью насыщенными, содержат несколько указанных углеродных атомов (например, С1-С6 означает от одного до шести атомов углерода) и характеризуются замещением по меньшей мере одного из атомов Н. Примеры алкильных групп включают метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, трет-бутил, изобутил, циклогексил, гомологи и изомеры, например, н-пентила, н-гексила и т.п. Примеры заместителей, которые можно использовать в замещенном алкиле, включают, но не ограничиваются ими, галогены, карбоксильные и гидроксильные группы. В настоящей заявке термин «галогензамещенный алкил», сам по себе или в сочетании с другими терминами, если не указано иное, относится к замещенному алкилу, в котором атом галогена используют для замещения по меньшей мере одного из атомов Н.

[0079] В настоящей заявке термины «циклоалкил» и «гетероциклоалкил», сами по себе или в сочетании с другими терминами, относятся, если не указано иное, к циклическим вариантам «алкила» и «гетероалкила», соответственно. Кроме того, в случае гетероциклоалкила, гетероатом может находиться в положении, в котором гетероцикл присоединен к остатку молекулы.

[0080] Термины «гало» или «галоген», сами по себе или в сочетании с другими терминами, означают, если не указано иное, атом фтора, хлора, брома или йода. Кроме того, подразумевают, что такие термины, как «галоалкил», включают одну или более замещенных алкильных групп с атомами галогена, которые могут быть одинаковыми или различными, в количестве от одного до (2m+1), где т представляет собой общее количество углеродных атомов в алкильной группе. Таким образом, термин «галоалкил» включает моногалогеналкил (алкил, замещенный одним атомом галогена) и полигалогеналкил (алкил, замещенный атомами галогена в количестве от двух до (2m+1) атомов галогена).

[0081] Термин «алкокси» относится к одной или более алкильным группам, присоединенным к остатку молекулы через атом кислорода.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0082] В настоящем изобретении описаны шаблон (шаблоны) афлатоксина, соединения, содержащие один или более таких шаблонов афлатоксина, и полимеры с молекулярными отпечатками, полученные с применением указанных соединений, и способы получения и применения таких шаблонов и соединений.

Шаблон (шаблоны) афлатоксина и интермедиаты

[0083] Согласно вариантам реализации изобретения шаблоны афлатоксина, описанные в настоящей заявке, представляют собой структурные аналоги молекул афлатоксина. Согласно другим вариантам реализации изобретения шаблон (шаблоны) афлатоксина похожи по форме, размеру, плотности заряда, геометрии и/или другим физическим или химическим свойствам на один или более афлатоксинов. Согласно специфическим вариантам реализации изобретения шаблон афлатоксина содержит фрагмент кумарина, по меньшей мере один алкокси-замещенный фрагмент и карбонильный фрагмент. Молекулы афлатоксинов включают один или более типов афлатоксина B1, В2, G1, G2, M1, М2, Р1 и Q1.

[0084] Согласно вариантам реализации изобретения афлатоксин B1 (AFB1) применяли в качестве модели для создания структурного аналога, используя синтез, описанный в настоящей заявке. Аналоги афлатоксина имеют преимущество, поскольку они уменьшают или устраняют необходимость обрабатывать большие количества токсичных афлатоксинов и предотвращать вымывание афлатоксинов из полимера. Согласно вариантам реализации изобретения получены по меньшей мере два разных шаблона афлатоксина. Согласно вариантам реализации изобретения шаблоны афлатоксина имеют пониженную токсичность или не являются токсичными по сравнению с природными афлатоксинами.

[0085] Шаблон афлатоксина имеет формулу или содержит фрагмент с формулой:

где R₁ выбран из Н, C_1-6 алкила, замещенного C_1-6 алкила и галогензамещенного C_1-6 алкила; R₂ выбран из галогена, C_1-6 алкила, замещенного C_1-6 алкила, галогензамещенного C_1-6 алкила, CH₂C(O)OR и CH(C(O)OR')₂; R выбран из Н, C_1-6 алкила, замещенного C_1-6 алкила и галогензамещенного C_1-6 алкила; и R₃ выбран из Н, C_1-6 алкокси и замещенного C_1-6 алкила. Согласно связанным вариантам реализации изобретения R' представляет собой один или более заместителей, выбранных из группы, состоящей из галогена, оксо-, гидрокси- и алкокси- групп.

[0086] Согласно вариантам реализации изобретения R₁, R₂, R₃ и R' могут независимо представлять собой алкильные группы. Алкил относится к прямой или разветвленной цепи или циклическому углеводородному радикалу или их комбинации, при этом указанная цепь или радикал являются полностью насыщенными и содержат несколько указанных углеродных атомов (например, С1-С6 означает от одного до шести атомов углерода). Примеры алкильных групп включают метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, трет-бутил, изобутил, циклогексил, гомологи и изомеры, например, н-пентила, н-гексила и т.п.

[0087] Согласно вариантам реализации изобретения R₁, R₂, R₃ и R' могут независимо представлять собой замещенные алкильные группы. Замещенный алкил представляет собой прямую или разветвленную цепь или циклический углеводородный радикал или их комбинацию, при этом указанная цепь или радикал являются полностью насыщенными, содержат несколько указанных углеродных атомов (например, С1-С6 означает от одного до шести атомов углерода) и характеризуются замещением по меньшей мере одного из атомов Н. Примеры алкильных групп включают метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, трет-бутил, изобутил, циклогексил, гомологи и изомеры, например, н-пентила, н-гексила и т.п. Примеры заместителей включают галогены, карбоксильные и гидроксильные группы.

[0088] Согласно вариантам реализации изобретения R₁, R₂, R₃ и R' могут независимо представлять собой галоген. Галогенгруппа или галоген относится к атому фтора, хлора, брома или йода. Кроме того, галогеналкил включает алкил, замещенный одним или более атомами галогена, каждый из которых может быть одинаковым или различным, в количестве от одного до (2m+1), где т представляет собой общее количество углеродных атомов в алкильной группе. Примеры включают моногалогеналкил (алкил, замещенный одним атомом галогена) и полигалогеналкил (алкил, замещенный атомами галогена в количестве от двух до (2m+1) атомов галогена). Согласно вариантам реализации изобретения галоген представляет собой хлор или фтор.

[0089] Согласно вариантам реализации изобретения R₃ может независимо представлять собой алкокси-группу. Алкокси-группа относится к указанным алкильным группам, присоединенным к остатку молекулы через атом кислорода. Примеры включают метокси, этокси и т.п.

[0090] Согласно некоторым типичным вариантам реализации изобретения шаблон афлатоксина имеет формулу или содержит фрагмент с формулой

Согласно специфическому варианту реализации изобретения шаблон афлатоксина представляет собой 4-(хлорметил)-5,7-диметоксикумарин.

[0091] Согласно другим связанным вариантам реализации изобретения шаблон афлатоксина содержит изолированную молекулу, выбранную из группы, состоящей из

и их комбинаций.

[0092] Согласно вариантам реализации изобретения шаблон афлатоксина содержит изолированную молекулу, выбранную из группы, состоящей из 2-((5,7-диметокси-2-оксо-2Н-хромен-4-ил)метил)малоновой кислоты, 3-(5,7-диметокси-2-оксо-2Н-хромен-4-ил)пропановой кислоты, 1,3-диэтилового эфира 2-[(5,7-диметокси-2-оксо-2Н-1-бензопиран-4-ил)метил]малоновой кислоты и их комбинаций.

[0093] Согласно альтернативному варианту реализации изобретения шаблон афлатоксина имеет формулу или содержит фрагмент с формулой (I)

где R₁ вместе с R₂ образуют С_4-7 циклоалкильное кольцо, галогензамещенное С_4-7 циклоалкильное кольцо, оксозамещенное С_4-7 циклоалкильное кольцо, С_4-7 циклоалкокси кольцо, гидроксизамещенное С_4-7 циклоалкильное кольцо или содержащий карбоксильную группу С_4-7 циклоалкил; и

R₃ выбран из Н, C_1-6 алкокси и замещенного C_1-6 алкила.

[0094] Согласно вариантам реализации изобретения циклоалкил и гетер оциклоалкил представляют собой циклические варианты алкила и гетероалкила, соответственно. Кроме того, в случае гетероциклоалкила, гетероатом может находиться в положении, в котором гетероцикл присоединен к остатку молекулы.

[0095] Согласно другим связанным вариантам реализации изобретения шаблон афлатоксина имеет формулу или содержит фрагмент с формулой:

Согласно специфическому варианту реализации изобретения шаблон афлатоксина представляет собой 5,7-диметоксициклопентенон[2,3-с]кумарин.

Синтез шаблона афлатоксина

[0096] Шаблоны афлатоксина и соединения, содержащие такие шаблоны афлатоксина, как описано в настоящей заявке, можно получить различными способами. Типичные способы, описанные в настоящей заявке, обеспечивают процессы (например, процесс синтеза) и материалы, позволяющие осуществить крупномасштабное производство соединений, содержащих один или более шаблонов афлатоксина, которые являются не только экономически выгодными (например, позволяют наладить реальное крупномасштабное производство экономически доступным способом), но также используют реагенты, которые, как правило, являются более общедоступными, чем реагенты, ранее применяемые для получения шаблонов микотоксинов.

[0097] Согласно вариантам реализации изобретения способ синтеза шаблона афлатоксина формулы (I) включает взаимодействие 3,5-диметоксифенола с этил-4-хлорацетоацетатом в кислоте с получением 4-(хлорметил)-5,7-диметоксикумарина. Согласно другим вариантам реализации изобретения соединение 4-(хлорметил)-5,7-диметоксикумарин выделяют и используют для получения ПМО.

[0098] Согласно вариантам реализации изобретения способ синтеза шаблона афлатоксина включает суспендирование моноосновной кислоты с формулой:

в полифосфорной кислоте и нагревание до по меньшей мере 50°С; охлаждение реакционной смеси 50°С и добавление водного раствора с получением шаблона афлатоксина с формулой:

Указанный шаблон афлатоксина выделяют и применяют для получения ПМО.

[0099] Согласно вариантам реализации изобретения способ получения моноосновной кислоты включает суспендирование двухосновной кислоты с формулой:

в растворителе и нагревание до по меньшей мере 100°С или примерно от 100 до 140°С.

[0100] Согласно вариантам реализации изобретения способ синтеза шаблона афлатоксина включает снятие защиты с аналога сложного диэфира (т.е. 1,3-диэтилового эфира 2-[(5,7-диметокси-2-оксо-2Н-1-бензопиран-4-ил)метил]малоновой кислоты) с формулой:

с помощью основания (например, NaOH) в растворителе (например, этаноле) и нагревание до по меньшей мере 60°С с получением аналога двухосновной кислоты; и осаждение аналога двухосновной кислоты для выделения шаблона афлатоксина с формулой:

[0101] Согласно вариантам реализации изобретения способ синтеза промежуточного сложного диэфира (т.е., 1,3-диэтилового эфира 2-[(5,7-диметокси-2-оксо-2Н-1-бензопиран-4-ил)метил]малоновой кислоты) включает объединение 4-(хлорметил)-5,7-диметоксикумарина с формулой:

с диэтилмалонатом, иодидом калия и краун-эфиром с получением аналога сложного диэфира; и осаждение указанного аналога сложного диэфира для выделения промежуточного шаблона афлатоксина с формулой:

[0102] Согласно вариантам реализации изобретения способ синтеза шаблона афлатоксина формулы (I) включает снятие защиты с 1,3-диэтилового эфира 2-[(5,7-диметокси-2-оксо-2Н-1-бензопиран-4-ил)метил]малоновой кислоты с получением аналога двухосновной кислоты и осаждение аналога двухосновной кислоты с формулой:

суспендирование аналога двухосновной кислоты в растворителе и нагревание до 100°С или от 100 до 140°С и осаждение монокислоты с формулой:

суспендирование моноосновной кислоты в кислоте и нагревание до по меньшей мере 50°С, охлаждение реакционной смеси ниже 50°С и добавление водного раствора с получением

[0103] Обратимся теперь к фиг. 4, на которой показана схема получения аналогов шаблонов афлатоксина и интермедиатов путем конденсации 3,5-диметоксифенола с этил-4-хлорацетоацетатом в присутствии H₂SO₄ в толуоле с образованием хлорированного аналога, 4-(хлорметил)-5,7-диметоксикумарина. В этом примере 4-(хлорметил)-5,7-диметоксикумарин объединяют с диэтилмалонатом, иодидом калия и краун-эфиром в ацетонитриле с получением смеси. После получения смеси к ней добавляют трет-бутоксид калия с получением сложного диэфира с формулой 1,3-диэтилового эфира 2-[(5,7-диметокси-2-оксо-2Н-1-бензопиран-4-ил)метил]малоновой кислоты.

[0104] Согласно такому варианту реализации изобретения после получения 1,3-диэтилового эфира 2-[(5,7-диметокси-2-оксо-2Н-1-бензопиран-4-ил)метил]малоновой кислоты получают двухосновную кислоту путем снятия защиты с 1,3-диэтилового эфира 2-[(5,7-диметокси-2-оксо-2Н-1-бензопиран-4-ил)метил]малоновой кислоты с помощью основания в спирте. Двухосновную кислоту, имеющую формулу:

нагревают до по меньшей мере 135°С в растворителе. Согласно указанному варианту реализации изобретения далее двухосновную кислоту превращают в ее моноосновный аналог путем частичного декарбоксилирования в ксилоле при температуре кипения. Согласно по меньшей мере такому варианту реализации изобретения моноосновную кислоту подвергали циклизации с помощью полифосфорной кислоты и получали конечный шаблон афлатоксина AFT-1 (AFT-1) с формулой:

[0105] Следует учесть, что применяемая химическая формула должна позволять интермедиатам полимера с молекулярными отпечатками, которые более подробно описаны ниже, обратимо связывать шаблон афлатоксина с ПМО. Кроме того, шаблон афлатоксина, содержащийся в шаблоне афлатоксина, должен способствовать образованию полости в интермедиате полимера с молекулярными отпечатками, которая сохраняет высокий уровень сродства в отношении одного или более афлатоксинов, таких как афлатоксин В1.

[0106] Согласно вариантам реализации изобретения предложена композиция, содержащая шаблон афлатоксина и носитель. Согласно вариантам реализации изобретения композиция содержит эффективное количество шаблона афлатоксина для получения ПМО с заданными характеристиками (например, обычно представляемое как количество относительно количества мономера, отношение). Композиции получают с применением подходящих носителей, наполнителей и других агентов, которые обеспечивают подходящую транспортировку, доставку, стабильность и функциональность шаблона афлатоксина.

Полимеры с молекулярными отпечатками

[0107] Согласно вариантам реализации изобретения полимер с молекулярными отпечатками содержит сшитый полимер, содержащий мономер или полученный из мономера, при этом сшитый полимер содержит множество полостей, причем по меньшей мере одна из указанных полостей получена с помощью шаблона афлатоксина формулы (I), приведенной ниже:

где R₁ выбран из Н, C_1-6 алкила, замещенного C_1-6 алкила и галогензамещенного C_1-6 алкила; R₂ выбран из галогена, C_1-6 алкила, замещенного C_1-6 алкила, галогензамещенного C_1-6 алкила, CH₂C(O)OR' и CH(C(O)OR')₂; где R' выбран из Н, C_1-6 алкила и замещенного C_1-6 алкила; и R₃ выбран из Н, C_1-6 алкокси и замещенного C_1-6 алкила; или где R₁ вместе с R₂ образуют С_4-7 циклоалкильное кольцо, галогензамещенное С_4-7 циклоалкильное кольцо, оксозамещенное С_4-7 циклоалкильное кольцо, С_4-7 циклоалкокси кольцо, гидроксизамещенное С_4-7 циклоалкильное кольцо или содержащий карбоксильную группу С_4-7 циклоалкил; и

R₃ выбран из Н, C_1-6 алкокси и замещенного C_1-6 алкила.

[0108] Согласно вариантам реализации изобретения по меньшей мере одна полость обеспечивает связывание шаблона афлатоксина формулы (I). Согласно одному из вариантов реализации изобретения ПМО селективно связывает один или более шаблонов афлатоксина. Согласно вариантам реализации изобретения ПМО селективно связывает один или более типов афлатоксинов, например, афлатоксины B1, В2, G1, G2, M1, М2, Р1 и Q1. Согласно вариантам реализации изобретения сродство и/или селективность ПМО в отношении афлатоксина сравниваются с соответствующим ПБМО.

[0109] В некоторых случаях при определенных условиях связывание шаблона афлатоксина или афлатоксина полностью или частично является обратимым. После образования интермедиата ПМО шаблон афлатоксина удаляют с помощью растворителя. Согласно вариантам реализации изобретения выбирают растворитель, который может разрушить взаимодействие шаблона афлатоксина с полимером и имеет сходную полярность и/или растворимость, что и шаблон афлатоксина. Согласно вариантам реализации изобретения растворитель представляет собой полярный растворитель.

[0110] Альтернативно, после связывания ПМО с афлатоксином, содержащемся в материале, и отделения афлатоксина от материала, согласно вариантам реализации изобретения связанный афлатоксин можно удалить и повторно использовать ПМО. Согласно вариантам реализации изобретения по меньшей мере часть связанного афлатоксина и/или шаблона афлатоксина может быть удалена из ПМО с помощью растворителя, такого как полярный растворитель. Согласно вариантам реализации изобретения выбирают растворитель, который может разрушить взаимодействие афлатоксина с полимером и имеет похожую полярность и/или растворимость, что и афлатоксин. Согласно вариантам реализации изобретения растворитель выбирают из группы, состоящей из этилового спирта, метилового спирта, ацетонитрила, толуола и их смеси. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения в присутствии растворителя высвобождается примерно 25% или менее афлатоксина, связанного с ПМО, в пересчете по массе на объем. Согласно вариантам реализации изобретения ПМО высвобождает из материала 25%, 20%, 15%, 10%, 5% или 1% или менее по массе одного или более секвестированных афлатоксинов, например, в полярном растворителе. Для сравнения, примерно 90% или более афлатоксина высвобождается из соответствующего ПБМО в присутствии того же растворителя.

[0111] Согласно вариантам реализации изобретения ПМО связывается с шаблоном афлатоксина посредством химического и/или физического взаимодействия. Согласно другим вариантам реализации изобретения полимерная сеть, образующая полости, связывается с шаблоном афлатоксина посредством ковалентной или нековалентной связи. Согласно вариантам реализации изобретения ПМО содержит микропоры размером примерно 20 ангстрем или менее и мезо- и макропоры размером от примерно 20 до 2000 ангстрем. Согласно вариантам реализации изобретения молярный объем шаблона афлатоксина составляет по меньшей мере 300 кубических ангстрем. Согласно другим вариантам реализации изобретения ПМО содержит одну или более полостей или пор, молярный объем которых составляет по меньшей мере 300 кубических ангстрем.

[0112] Согласно вариантам реализации изобретения шаблон афлатоксина имеет формулу (I), описанную в настоящей заявке. Согласно специфическому варианту реализации изобретения шаблон афлатоксина формулы (I) выбран из группы, состоящей из 4-(хлорметил)-5,7-диметоксикумарина, 5,7-диметоксициклопентенон[2,3-с]кумарина и их комбинаций. Согласно вариантам реализации изобретения полимер с молекулярными отпечатками синтезируют с применением более чем одного шаблонов афлатоксина формулы (I).

[0113] Согласно вариантам реализации изобретения полимер получают из мономера. Мономер выбирают с учетом структурных особенностей шаблона афлатоксина, чтобы оценить, какой мономер или комбинация мономеров является наиболее подходящей для образования взаимодействия (например, ковалентного, нековалентного, ионного, водородных связей, гидрофобного взаимодействия, ван-дер-ваальсового взаимодействия) с шаблоном. В случае полимерных или олигомерных соединений, которые должны быть использованы in vivo (например, в качестве терапевтических или диагностических средств, или в качестве расходуемых секвестирующих компонентов для животного корма или продуктов питания для человека), важно выбрать мономеры, которые являются нетоксичными и которые проявляют подходящую стабильность и растворимость in vivo. Предпочтительные примеры ПМО для афлатоксина включают, но не ограничиваются ими, акриламиды и метакрилаты. Альтернативно, полимер можно обработать после полимеризации для увеличения растворимости шаблона, например, посредством реакции с подходящими органическими или неорганическими реагентами.

[0114] Классы мономеров и специфических мономеров (например, применяемых в способах синтеза ПМО согласно изобретению) включают, но не ограничиваются ими, следующие классы и их производные: акриловую кислоту и производные (например, 2-бромакриловую кислоту, акрилоилхлорид, N-акрилоилтирозин, N-акрилоилпирролидинон, транс-2-(3-пиридил)-акриловую кислоту), акрилаты (например, алкилакрилаты, аллилакрилаты, гидроксипропилакрилат), метакриловую кислоту и производные (например, итаконовую кислоту, 2-(трифторметил)пропеновую кислоту), метакрилаты (например, метилметакрилат, гидроксиэтилметакрилат, 2-гидроксиэтилметакрилат, натриевую соль 3-сульфопропилметакрилата, этиленгликоль монометакрилат), стиролы (например, (2, 3 и 4)-аминостирол, стирол-4-сульфоновую кислоту, 3-нитростирол, 4-этистирол), винилы (например, винилхлорформиат, 4-винилбензойную кислоту, 4-винилбензальдегид, винилимидазол, 4-винилфенол, 4-виниламин, акролеин), винилпиридины (например, (2, 3, и/или 4)-винилпиридин, 3-бутен-1,2-диол), бороновые кислоты (например, 4-винилбороновую кислоту), сульфоновые кислоты (например, 4-винилсульфоновую кислоту, акриламидо-2-метил-1-пропан-сульфокислоту), металлохелаты (например, стиролиминодиуксусную кислоту), акриламиды и производные (например, N-метилакриламид), метакриламиды и производные (например, N,N-диметилакриламид, N-(3-аминопропил)метакриламид), алкены (например, 4-пентеновую кислоту, 3-хлор-1-фенилпен-1-пропен), ангидрид (мет)акриловой кислоты и производные (например, метакриловый ангидрид), кремнийсодержащие мономеры (например, (3-метакрилоксипропил)триметоксисилан, тетраметилдисилоксан), полиены (например, изопрен, 3-гидрокси-3,7,11-триметил-1,6,10-додекатриен), азиды (например, 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензойную кислоту), тиолы (например, аллилмеркаптан). Согласно вариантам реализации настоящего изобретения, также можно использовать содержащие концевые акрилатные группы или иным образом ненасыщенные уретаны, карбонаты и эпоксидные смолы, а также мономеры на основе кремния.

[0115] При применении, один или более сшивающих агентов будут предпочтительно представлять собой одно или несколько полимерных или олигомерных соединений или соединение, обеспечивающее отщепление при специфических условиях. Сшивающие агенты, придающие жесткость исследуемым полимерным соединениям, известны специалистам в данной области техники и включают, но не ограничиваются ими, ди-, три-, тетра- и пентафункциональные акрилаты, метакрилаты, акриламиды, винилы, аллилы и стиролы. Специфические примеры сшивающих агентов включают, но не ограничиваются ими, n-дивинилбензол, диметакрилат этиленгликоля (сокращенно EGDMA), тетраметилендиметакрилат (сокращенно TDMA), N,N'-метилен-бис-акриламид (MDAA), N,N'-1,3-фенилен-бис-(2-метил-2-пропенамид) (PDBMP), 2,6-бис-акрилоиламидопиридин, 1,4-диакрилоилпиперазин (сокращенно DAP), 1,4-фенилендиакриламид и N,O-бис-акрилоил-L-фенилаланинол. Примеры обратимых, отщепляемых сшивающих агентов включают, но не ограничиваются ими, N,N'-бис-(акрилоил)цистамин, N,N-диаллилтартардиамид, N,N-(1,2-дигидроксиэтилен)-бис-акриламид, N1-((Е)-1-(4-винилфенил)метилиден)-4-виниланилен, аллилдисульфид и бис-(2-метакрилоилоксиэтил))дисульфид. Согласно предпочтительным вариантам реализации изобретения, в качестве сшивающего агента используют диметакрилат этиленгликоля. Хотя предпочтительным сшивающим мономером является диметакрилат этиленгликоля, варианты реализации настоящего изобретения не ограничены указанным агентом и можно использовать другие сшивающие мономеры, такие как, дивинилбензол и триметилолпропантриметакрилат (сокращенно TRIM).

[0116] Можно использовать любое отношение простых мономеров к сшивающим агентам, позволяющее получить структуру ПМО подходящей функциональности, например, которую можно использовать в контексте конечного применения (например, в продуктах питания или кормовых продуктах, в воде, предназначенной для использования в аквакультурах, in vivo и т.п.). Специалист в данной области техники может выбрать подходящие отношения мономеров для обеспечения требуемой структурной функциональности, которая тесно связана с природой и структурой заданной молекулы и с природой и структурой применяемого шаблона.

[0117] Согласно вариантам реализации изобретения молярное отношение шаблона афлатоксина к мономеру в ПМО составляет от примерно 100:1 до 1:100 (масс/масс). Например, применяют отношения шаблона афлатоксина к отношениям мономеров, составляющие от примерно 1:2 до 1:7. Согласно другим вариантам реализации изобретения молярное отношение мономера к сшивающему агенту в ПМО составляет от примерно 1:4 до 1:10.

[0118] Согласно вариантам реализации изобретения при контакте с растворителем изменяется объем ПМО. Согласно вариантам реализации изобретения ПМО, приведенный в контакт с водным растворителем, может адсорбировать воду в количестве в 10 раз большем, чем его масса. Согласно другим вариантам реализации изобретения ПМО выбирают таким образом, что при добавлении в растворитель, объем ПМО увеличивается примерно на 75%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% или меньше относительно объема ПМО в высушенном состоянии. Растворитель или смесь растворителей, применяемая в качестве среды для синтеза ПМО, также оказывает влияние на набухаемость ПМО, на размер полостей и пор, распределение внутри трехмерной сети ПМО и образование микро-, мезо-, макросфер и агломератов. Согласно вариантам реализации изобретения в синтезе ПМО можно использовать один или более порообразующих агентов для изменения размера полости или набухаемости ПМО. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения полярные растворители, такие как ацетонитрил, используют в качестве растворителя или сорастворителя для полимеризации ПМО при необходимости увеличения набухания ПМО и увеличения размера полости ПМО. Кроме того, избегают применения таких растворителей, когда увеличение набухания ПМО и размера полости ПМО не требуется (например, когда ПМО предназначен для применения в качестве хроматографической колонки, в которой набухание может препятствовать скорости потока и нарушать элюирование аналитов и работу прибора ВЭЖХ). Согласно вариантам реализации изобретения сравнивают набухаемость ПМО и соответствующего ПБМО.

[0119] Согласно вариантам реализации изобретения характеристики ПМО сравнивают с характеристиками соответствующего ПБМО. Соответствующий ПБМО содержит такой же сшитый полимер, что и ПМО, но его получают в отсутствии шаблона афлатоксина.

[0120] Согласно вариантам реализации изобретения композиция содержит ПМО и носитель. Согласно вариантам реализации изобретения композиция содержит эффективное количество ПМО для секвестирования афлатоксина от материала. Согласно вариантам реализации изобретения эффективное количество представляет собой количество, обеспечивающее по меньшей мере 40% афлатоксина в материале в пересчете по массе на единицу материала и/или уменьшающее количество афлатоксина в материале до менее, чем 0,5 частей на миллиард (ppb). Композиции получают с применением подходящих носителей, наполнителей и других агентов, которые обеспечивают подходящую транспортировку, доставку, стабильность и функциональность ПМО.

Способы синтеза ПМО

[0121] Согласно вариантам реализации изобретения описаны способы синтеза ПМО. Можно использовать различные способы полимеризации, в том числе свободнорадикальную, катионную и анионную полимеризацию. В настоящей заявке выбраны и обеспечены условия полимеризации, которые не оказывают неблагоприятного воздействия на активную конформацию соединения, для которого должно быть получено дополнительное полимерное соединение. Согласно особенно предпочтительным вариантам реализации изобретения применяют способы свободнорадикальной осадительной полимеризации.

[0122] Способ получения ПМО, в целом, включает получение шаблона афлатоксина, такого как показано согласно формуле (I),

где R₁ выбран из Н, C_1-6 алкила, замещенного C_1-6 алкила и галогензамещенного C_1-6 алкила; R₂ выбран из галогена, C_1-6 алкила, замещенного C_1-6 алкила, галогензамещенного C_1-6 алкила, CH₂C(O)OR' и CH(C(O)OR')₂; R' выбран из Н, C_1-6 алкила, замещенного C_1-6 алкила и галогензамещенного C_1-6 алкила; и R₃ выбран из Н, C_1-6 алкокси и замещенного C_1-6 алкила; или где R₁ вместе с R₂ образуют С_4-7 циклоалкильное кольцо, галогензамещенное С_4-7 циклоалкильное кольцо, оксозамещенное С_4-7 циклоалкильное кольцо, С_4-7 циклоалкокси кольцо, гидроксизамещенное С_4-7 циклоалкильное кольцо или содержащий карбоксильную группу С_4-7 циклоалкил; и R₃ выбран из Н, C_1-6 алкокси и замещенного C_1-6 алкила;

и объединение шаблона афлатоксина с по меньшей мере одним мономером и одним или более сшивающими агентами. После объединения мономера и сшивающего агента (агентов) мономер и сшивающий агент (агенты) полимеризуют с получением интермедиата полимера с молекулярными отпечатками.

[0123] Соответствующий полимер (ПБМО) без молекулярных отпечатков для конкретного ПМО получают с применением того же способа, того же мономера и того же сшивающего агента, что и ПМО, но в отсутствие шаблона афлатоксина.

[0124] В настоящем изобретении также предложены композиции, содержащие ПМО, описанный в настоящей заявке, на носителе. Согласно вариантам реализации изобретения указанный носитель представляет собой физиологически приемлемый носитель. Согласно другим вариантам реализации изобретения носитель представляет собой растворитель.

Интермедиаты полимеров с молекулярными отпечатками

[0125] Шаблон афлатоксина, объединенный с полимером-предшественником ПМО, образует интермедиат полимера с молекулярными отпечатками. Такой интермедиат полимера с молекулярными отпечатками представляет собой комплекс сшитого полимера-предшественника ПМО, полученного с помощью мономера, и шаблона афлатоксина. Согласно по меньшей мере одному из вариантов реализации изобретения шаблон афлатоксина имеет формулу (I) или содержит соединение формулы (I):

где R₁ выбран из Н, C_1-6 алкила, замещенного C_1-6 алкила и галогензамещенного C_1-6 алкила; R₂ выбран из галогена, C_1-6 алкила, замещенного C_1-6 алкила, галогензамещенного C_1-6 алкила, CH₂C(O)OR' и CH(C(O)OR')₂; R' выбран из Н, C_1-6 алкила, замещенного C_1-6 алкила и галогензамещенного C_1-6 алкила; и R₃ выбран из Н, C_1-6 алкокси и замещенного C_1-6 алкила; или где R₁ вместе с R₂ образуют С_4-7 циклоалкильное кольцо, галогензамещенное С_4-7 циклоалкильное кольцо, оксозамещенное С_4-7 циклоалкильное кольцо, С_4-7 циклоалкокси кольцо, гидроксизамещенное С_4-7 циклоалкильное кольцо или содержащий карбоксильную группу С_4-7 циклоалкил; и R₃ выбран из Н, C_1-6 алкокси и замещенного C_1-6 алкила. В частности, аналог шаблона афлатоксина выбран из группы, состоящей из 4-(хлорметил)-5,7-диметоксикумарина и 5,7-диметоксициклопентенон[2,3-с] кумарина.

[0126] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения шаблон афлатоксина и по меньшей мере один мономер и один или более сшивающих агентов объединяют в одном или более органических растворителей. Согласно вариантам реализации изобретения один или более растворителей выбраны из группы, состоящей из ацетонитрила, толуола, циклогексана, поливинилового спирта в водном растворе и смеси двух или более соединений, выбранных из ацетонитрила, толуола, циклогексана, поливинилового спирта в водном растворе. Согласно специфическому варианту реализации изобретения в качестве растворителя используют смесь ацетонитрила и толуола. В частности, раствор ацетонитрила и толуола содержит по меньшей мере примерно 20% ацетонитрила.

[0127] Согласно другим связанным вариантам реализации изобретения инициатор используют для получения свободных радикалов, образующихся при термическом разложении. Инициирующие агенты включают, но не ограничиваются ими, азо-бис-изобутиронитрил (сокращенно AIBN), азо-бис-диметилвалеронитрил (сокращенно ABDV), бензилдиметилацеталь, бензоилпероксид (сокращенно ВРО) и 4,4'-азо-(4-циановалериановую кислоту). Согласно специфическому варианту реализации изобретения азо-бис-изобутиронитрил представляет собой инициатор. Согласно вариантам реализации изобретения полимеризацию инициируют путем образования свободных радикалов в органическом растворителе при температуре от 55 до 110°С.

[0128] Согласно вариантам реализации изобретения способ синтеза дополнительно включает добавление порообразующего агента для изменения размера полостей и набухаемости ПМО. Примеры порообразующих агентов включают толуол, ксилол и этилбензол.

[0129] Интермедиат полимера с молекулярными отпечатками можно получить, используя отношение шаблонного соединения афлатоксина к мономеру, составляющее от примерно 100:1 до 1:100. Согласно другим вариантам реализации изобретения отношение шаблонного соединения афлатоксина к мономеру составляет от примерно 1:2 до 1:7.

[0130] Кроме того, интермедиат полимера с молекулярными отпечатками можно получить с помощью сшивающего агента, при этом отношение мономера к сшивающему агенту может составлять от примерно 1:4.1 до 1:10.

[0131] В таблице 1 приведен ряд примеров интермедиатов полимеров с молекулярными отпечатками (ПМО) и интермедиатов полимеров без молекулярных отпечатков (ПБМО) и несколько отношений шаблона афлатоксина к мономеру и отношений мономера к сшивающему агенту, которые включены в объем интермедиатов полимеров с молекулярными отпечатками, описанных в настоящей заявке.

[0132] После образования интермедиата полимера с молекулярными отпечатками его осаждают, и шаблон афлатоксина удаляют из интермедиата полимера с молекулярными отпечатками с получением полимера с молекулярными отпечатками. Указанный процесс можно осуществить путем вымывания интермедиата полимера с молекулярными отпечатками растворителем. Согласно вариантам реализации изобретения растворитель выбирают таким образом, чтобы он имел схожую полярность и/или растворимость, что и шаблон афлатоксина. Согласно вариантам реализации изобретения органический растворитель выбирают из группы, состоящей из этилового спирта, метилового спирта, ацетонитрила, толуола и их смеси. Удаление шаблона афлатоксина можно зафиксировать известными способами, такими как ЖХ-МС. После удаления шаблона афлатоксина получают полимер с молекулярными отпечатками, подходящий для секвестирования молекулы афлатоксина. Согласно вариантам реализации изобретения ПМО высушивают.

[0133] Согласно вариантам реализации изобретения выход ПМО можно повысить путем увеличения отношения шаблона к мономеру и/или увеличения отношения мономера к сшивающему агенту. Согласно вариантам реализации изобретения отношение шаблона к мономеру составляет по меньшей мере 1:2 и/или отношение мономера к сшивающему агенту составляет по меньшей мере 1:6.

Способ применения

[0134] В настоящем изобретении предложены способы секвестрации одного или более афлатоксинов, включающие взаимодействие полимера с молекулярными отпечатками, содержащего сшитый полимер с множеством полостей, при этом по меньшей мере некоторые из полостей обеспечивают обратимое связывание с по меньшей мере одним из описанных выше афлатоксинов. После получения ПМО его можно разместить внутри материала или на материал, который, как считают, содержит афлатоксин, возможно содержит афлатоксин или, как известно, содержит афлатоксин. Следует учесть, что материалы, содержащие афлатоксин, могут представлять собой газ, полугаз, жидкость, полужидкость или твердое вещество. Согласно типичным вариантам реализации изобретения материалы, содержащие афлатоксин, выбирают из группы, состоящей из почвы, специи, напитка, продукта питания, корма для животных, лекарственного препарата, нутрицевтической композиции и косметической композиции. Согласно одному вариантов реализации изобретения материал, содержащий афлатоксин, представляет собой молоко.

[0135] ПМО в определенном количестве относительно выбранного критерия (например, эффективное количество или степень включения) подвергают воздействию материала, содержащего афлатоксин или, как подозревают, содержащего афлатоксин. Согласно вариантам реализации изобретения количество ПМО на единицу материала составляет по меньшей мере 0,01%. Например, ПМО, полученный с применением молярного отношения шаблонного соединения афлатоксина к мономеру, составляющему по меньшей мере 1:6,8, и молярного отношения мономера к сшивающему агенту, составляющему по меньшей мере 1:5,8, имеет степень включения по меньшей мере 0,1%, адсорбирует по меньшей мере 76,5% афлатоксина M1(AFM1) из 100 нг/л раствора AFM1 в буферном растворе. В другом примере при степени включения по меньшей мере 1,0% адсорбция составляла 100%. Согласно другим вариантам реализации изобретения отношение ПМО/материал составляет по меньшей мере от 0,01% до 100%. Согласно вариантам реализации изобретения количество ПМО на объем жидкости составляет от примерно 100 мг до 1 килограмма на литр материала.

[0136] Согласно вариантам реализации изобретения ПМО приводят в контакт с материалом, содержащим афлатоксин или, как подозревают, содержащим афлатоксин, в течение по меньшей мере 1 секунды. Согласно другим вариантам реализации изобретения ПМО приводят в контакт с материалом, содержащим афлатоксин или, как подозревают, содержащим афлатоксин, в течение примерно 1, 2, 3, 4, 5 минут или более. Согласно другим вариантам реализации изобретения ПМО приводят в контакт с материалом в течение от примерно 1 секунд до 500 минут.

[0137] Согласно вариантам реализации изобретения материал и ПМО приводят в контакт в растворе с рН от 1 до 13. Согласно другим вариантам реализации изобретения рН составляет примерно 6,0, 7,0, 7,5 или менее.

[0138] Согласно вариантам реализации изобретения ПМО приводят в контакт с материалом при периодическом перемешивании или без перемешивания. Согласно другим вариантам реализации изобретения ПМО помещают в хроматографическую колонку, такую как колонка для твердофазной экстракции.

[0139] После того как ПМО приводят в контакт с материалом в течение заданного периода времени, ПМО, который теперь содержит секвестированный афлатоксин, отделяют от материала. Одним из таких способов отделения является фильтрация. Другой способ отделения представляет собой центрифугирование.

[0140] Адсорбция афлатоксина с помощью ПМО составляет от по меньшей мере 10%, 20%, 30 или 40% или больше по массе афлатоксина на единицу материала. Достигаемая адсорбция из материала является специфичной для применяемых условий в отношении рН, температуры, концентрации токсина, природы ПМО, перемешивания и потока материала. При увеличении времени воздействия микотоксина на ПМО и/или при повышении степени включения наблюдается 100% адсорбция. На адсорбцию влияет время воздействия, концентрация афлатоксина, степень включения ПМО и окружающая среда. При воздействии ПМО на материал в течение по меньшей мере 5 минут при степени включения по меньшей мере 0,1%, ПМО может секвестировать по меньшей мере 40% по массе афлатоксина в материале. Согласно связанным вариантам реализации изобретения ПМО будет секвестировать достаточное количество афлатоксина из материала, чтобы уменьшить количество афлатоксина в материале до менее 0,5 или менее 0,05 частей на миллиард (ppb).

[0141] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения материал можно приводить в контакт с ПМО для многократного воздействия до тех пор, пока уровни афлатоксина не снизятся. Например, первое воздействие ПМО на материал может привести к удалению примерно 10% или более афлатоксина. Далее ПМО со связанным афлатоксином удаляют, промывают и повторно используют или затем ПМО с небольшим количеством связанного афлатоксина или без него снова приводят в контакт с материалом. Многократное воздействие может продолжаться до тех пор, пока количество афлатоксина не уменьшится, например, до менее 0,5 ppb.

[0142] В некоторых случаях после отделения ПМО со связанным афлатоксином, афлатоксин можно удалить из ПМО путем обработки растворителем, который может разрушить химическую ассоциацию афлатоксина с ПМО. Однако имеется равновесие между сродством ПМО в отношении связывания афлатоксина и количеством связанного афлатоксина, которое можно удалить. Согласно вариантам реализации изобретения в случае ПМО с высоким сродством в отношении афлатоксина ПМО высвобождает примерно 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1% или менее афлатоксина, секвестированного из материала, в присутствии растворителя, например, по сравнению с соответствующим ПБМО. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения желательно повторно использовать ПМО, из которого с помощью подходящего и достаточного количества промываний органическим растворителем был предварительно удален ранее секвестированный афлатоксин, так что невозможно обнаружить определяемое количество афлатоксина путем выщелачивания из ПМО материала с применением общепринятых методов ЖХ-УФ или ЖХ-флуоресценции или количественных методов ЖХ-МС.

[0143] Другие возможные стадии при применении ПМО для секвестрации афлатоксина состоят в определении количества афлатоксина (т.е. частей на миллиард (ppb)) в материале перед обработкой с помощью ПМО. Кроме того, материал можно снова подвергнуть испытанию во время и/или после обработки с помощью ПМО для определения скорости секвестирования афлатоксина. Кроме того, можно также выявить количество ПМО, необходимое для секвестирования заданной концентрации афлатоксина в зависимости от конкретного применяемого ПМО. Более того, ПМО, образующий комплекс с афлатоксином, после отделения от материала, можно проанализировать с целью определения концентрации секвестированного афлатоксина.

[0144] Эффективность количественной адсорбции можно определить с помощью метода UPLC-Xevo-TQD MS/MS (Waters Corp.). Например, используют градиентные смеси вода/0,1% муравьиная кислота (об./об.) и метанол/0,1% метанол (об./об.), при этом анализируемые вещества можно разделить на 2,1×50 мм колонке Acquity UPLC® ВЕН С18, 1,7 мкм (Waters. Corp.). Способ оптимизируют для анализа шаблона AFM1/AFB1/афлатоксина в буферном растворе и молоке, используя изотопное разбавление C13-AFB1 и метод нормирования.

Примеры

Синтез молекул шаблона афлатоксина M1

Пример 1 Получение 4-(хлорметил)-5,7-диметоксикумарина (шаблона AFM-1):

[0145] Холодный раствор этил-4-хлорацетоацетата (26,6 г) в уксусной кислоте (12,5 мл) и концентрированную серную кислоту (6,25 мл) добавляли по каплям в атмосфере азота в течение 15 минут к раствору 3,5-диметоксифенола (25,0 г) в уксусной кислоте (50,0 мл) при 8-10°С. Реакционную смесь далее перемешивали при 20-25°С в течение 1 часа, медленно нагревали до 60°С и перемешивали в течение 12 часов при 55-60°С. Реакционную смесь охлаждали до 40°С и добавляли по каплям горячую воду (150,0 мл) в течение 30 минут при 40-45°С. Смесь охлаждали до комнатной температуры и перемешивали в течение 1 часа для осаждения продукта. Продукт фильтровали, промывали водой (2×25 мл) и высушивали под вакуумом в течение 30 минут. К неочищенному продукту добавляли холодный метанол (50,0 мл) и суспензию перемешивали при 8-10°С в течение 30 минут. Продукт фильтровали и промывали холодным метанолом (2×25 мл) и высушивали в вакууме с получением конечного продукта, 4-(хлорметил)-5,7-диметоксикумарина (шаблон AFM-1), который по виду представлял собой белый рыхлый порошок (39 г). Полученный продукт передавали для дальнейшей обработки и применяли на следующей стадии как есть.

Пример 2 Получение 4-(2,2-дикарбоэтокси-этил)-5,7-диметоксикумарина (интермедиат AFM-1):

[0146] Диэтилмалонат (32,75 г) добавляли в атмосфере азота к смеси 4-(хлорметил)-5,7-диметоксикумарина (шаблон AFM-1, 40,0 г), 18-краун-6 (4,96 г) и иодида калия (3,12 г) в ацетонитриле (400 мл) при комнатной температуре. К реакционной смеси (слегка разогретой) при комнатной температуре добавляли в один прием трет-бутоксид калия (трет-BuOK, 22,8 г). Температуру реакционной смеси (суспензии) медленно повышали до 40°С, затем перемешивали в атмосфере азота в течение 24 часов при 35-40°С. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и упаривали досуха в вакууме при 35-40°С с получением желтого полутвердого остатка. Остаток растворяли в смеси воды (200 мл) и этилацетата (400 мл) при перемешивании. рН смеси регулировали до 5 с помощью разбавленной соляной кислоты. Органическую фазу отделяли от водной фазы, при этом последнюю дополнительно экстрагировали этилацетатом (2×200 мл). Органические фракции, высушенные над безводным сульфатом натрия (100 г), объединяли и фильтровали. Фильтрат концентрировали досуха в вакууме при 35-40°С с получением 4-(2,2-дикарбоэтокси-этил)-5,7-диметоксикумарина (интермедиат AFM-1), который по виду представлял собой желтое твердое вещество (58 г). Полученный продукт передавали для дальнейшей обработки и применяли на следующей стадии как есть.

Пример 3 Получение двухосновной кислоты (интермедиат AFM-2):

[0147] Таблетки гидроксида натрия (15,6 г) добавляли при комнатной температуре к суспензии 4-(2,2-дикарбоэтокси-этил)-5,7-диметоксикумарина (интермедиата AFM-1, 58,0 г) в этиловом спирте (290 мл). Температуру реакционной смеси (суспензии) медленно повышали до 60°С, затем перемешивали в течение 3 часов при 60-65°С. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и затем рН смеси доводили до 2 с помощью концентрированной соляной кислоты для осаждения продукта. Суспензию охлаждали до температуры 10°С и перемешивали в течение 1 часа при 8-10°С для завершения осаждения продукта. Продукт отфильтровывали (Crop-1) и затем отгоняли этанол из маточного раствора путем дистилляции при 20-25°С в вакууме и далее концентрированную массу охлаждали до 10°С для осаждения продукта, продукт отфильтровывали (Crop-2). Объединенный продукт промывали 1:1 (об./об.) смесью метанола и воды (2×200 мл) и затем дополнительно высушивали в вакууме с получением двухосновной кислоты (интермедиата AFM-2), которая по виду представляла собой желтое твердое вещество (45 г). Полученный продукт передавали для дальнейшей обработки и применяли на следующей стадии как есть.

Пример 4 Получение моноосновной кислоты (интермедиата AFM-3):

[0148] Двухосновную кислоту (интермедиат AFM-2, 30 г) суспендировали в м-ксилоле (300 мл) при комнатной температуре. Температуру реакционной смеси (суспензии) медленно повышали до 135°С, затем перемешивали в течение 12 часов при 135-140°С. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и затем отфильтровывали полученный осадок. Осадок промывали н-гексаном (2×100 мл) и высушивали в вакууме с получением моноосновной кислоты (интермедиата AFM-3), которая выглядела как почти белое твердое вещество (25 г). Полученный продукт передавали для дальнейшей обработки и применяли на следующей стадии как есть.

Пример 5 Получение 5,7-диметоксициклопентенон[2,3-с]кумарина (шаблона AFM-2):

[0149] Моноосновную кислоту (интермедиат AFM-3, 4,75 г) суспендировали в полифосфорной кислоте (9,50 г) при комнатной температуре в атмосфере азота. Температуру реакционной смеси (суспензии) медленно повышали до 75°С, затем перемешивали в течение 12 часов при 70-75°С. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и затем медленно добавляли воду (50 мл) для разложения избытка полифосфорной кислоты и перемешивали реакционную смесь в течение 1 часа при комнатной температуре. К реакционной смеси добавляли дихлорметан (50 мл) и перемешивали в течение 15 минут, органическую фазу отделяли. Продукт экстрагировали дихлорметаном (2×25 мл). Объединенные органические фракции высушивали над безводным сульфатом натрия (25 г) и концентрировали досуха путем отгонки в вакууме. Остаток суспендировали в метаноле и перемешивали в течение 30 минут при комнатной температуре. Продукт отфильтровывали и промывали метанолом (2×10 мл) и затем высушивали в вакууме с получением 5,7-диметоксициклопентенон[2,3-с]кумарина (шаблона AFM-2), который выглядел как почти белое твердое вещество (2,5 г).

Пример 6 Состав и характеристики полученных ПМО:

[0150] В ходе разработки вариантов реализации изобретения были проведены эксперименты для испытания полимеров ПМО в их свободнотекучей порошковой форме на их адсорбционные свойства в отношении микотоксина AFM1 (Biopure, Romer Labs® Inc, Union, МО) и на способность к удалению микотоксина AFM1 из жидких или полужидких сред посредством химических взаимодействий. В настоящей заявке полученный ПМО применяли для демонстрации различий в сродстве при секвестрации микотоксина AFM1 и для оценки специфичности материала.

[0151] При комнатной температуре в атмосфере азота были получены шесть независимых ПМО с применением AFT-1 (1,0 ммоль, шаблон), метакриловой кислоты (2,0 ммоль, МАА, мономер) и диметакрилата этиленгликоля (5,0 ммоль, EGDMA, сшивающий агент) в смеси ацетонитрила и толуола (1:3 об./об.) при разных молярных отношениях AFT-1 относительно МАА и мономера относительно сшивающего агента (таблица 1). Раствор перемешивали в течение 1 часа при комнатной температуре в инертной атмосфере. Далее добавляли азо-бис-изобутиронитрил (0,01 ммоль, AIBN, инициатор), медленно нагревали и выдерживали в течение 30 мин при 60-65°С для осаждения микросфер ПМО. Кроме того, были получены два независимых полимера без молекулярных отпечатков (ПБМО) с применением той же процедуры, но в отсутствии AFT-1. Шаблон (AFT-1) удаляли из ПМО путем непрерывного промывания толуолом до полного исчезновения шаблона в промывочных растворах, что определяли путем анализа элюента методами ЖХ-УФ, ЖХ-флуоресценции.

[0152] Синтезировали конечный полимерный материал ПМО и ПБМО в виде блок-сополимера, который растирали в порошок с помощью ступки и пестика. Полимерный материал ПБМО был белого цвета и, будучи растертым в порошок, был сильно электростатическим. Полимерные материалы ПМО были коричневого цвета вследствие присутствия коричневого шаблона, за исключением ПМО-005, который был красного цвета (для этого ПМО использовали шаблон из другой синтетической партии, который имел красный цвет). В процессе промываний толуолом продуктов ПМО наблюдалось минимальное изменение цвета. Однако при промывании метанолом цвет порошка был чрезвычайно приглушен и становился менее темным, потому что окрашенный шаблон вымывался из полимерной структуры. Полимерные материалы ПМО в порошковой форме также были несколько электростатическими, хотя и не в той степени, что продукты ПБМО.

[0153] Была исследована набухаемость порошка в форме ПМО/ПБМО (таблица 2). Нами был сделан вывод, что набухаемость ПМО была значительно более высокой, чем в случае ПБМО. ПМО-001 проявлял наибольшее увеличение объема при набухании, составляющее в буферном растворе до 240% от его первоначального размера. ПМО-002 также демонстрировал значительное увеличение размера, составляющее до 200% от его первоначального размера. ПМО-005 и ПБМО-005 представляли собой единственные полимерные материалы, которые не демонстрировали увеличение размера при воздействии на них буферного раствора в течение длительного периода времени, тогда как ПБМО-004 проявлял минимальное 11%-ное увеличение объема. Остальные все продукты ПМО демонстрировали умеренную степень увеличения объема вследствие набухания, составляющую до 150-167% относительно их первоначального размера.

[0154]

[0155]

Пример 7 Способности к секвестрации полученных ПМО в отношении микотоксинов - применимо к AFM1 в буферном растворе.

[0156] Эффективность количественной адсорбции оценивали с помощью метода UPLC-Xevo-TQD MS/MS (также известного как UPLC-MS/MS) (Waters Corp.). Использовали градиентные смеси вода/0,1% муравьиная кислота (об./об.) и метанол/0,1% метанол (об./об.) и разделяли аналиты на 2,1×50 мм колонке Acquity UPLC® ВЕН С18, 1,7 мкм (Waters. Corp.). Способ оптимизировали для анализа AFM1/AFB1/AFT-1 в буферном растворе и молоке, используя изотопное разбавление C13-AFB1 и метод нормирования.

Способность к мгновенному улавливанию

[0157] В ходе разработки вариантов реализации изобретения были проведены эксперименты для определения степени включения исследуемых ПМО/ПБМО путем линейного изменения указанных степеней включения от 0,001 до 1,0% (масс./об.) материала при рН среды 6,0. Несколько определений мгновенного улавливания были проведены для определения целесообразности применения продуктов ПМО для адсорбирования AFM1. Для проведения такого исследования 0,01 мг, 0,1 мг, 1,0 мг и 10,0 мг ПМО-005 загружали в экстракционные патроны с политетрафторэтиленовыми (ПТФЭ) фриттами, применяя суспендирование в буферном растворе для самых низких степеней включения. Вкратце, ПМО добавляли в суспензию, используя буферный раствор, загружали в патрон и взвешивали для определения точного количества ПМО. Количества ПМО, применяемые в этом эксперименте, соответствовали степеням включения 0,001%, 0,01%, 0,1% и 1,0% (масс/об.). Указанный эксперимент выполняли при комнатной температуре.

[0158] Полимерный материал «предварительно обрабатывали» путем добавления и последующего элюирования по очереди 1 объема (1 мл) воды, 1 объема метанола и 2 объемов буферного раствора. Затем в каждый патрон добавляли один миллилитр буферного раствора с добавкой 100 нг/л AFM1 с последующим добавлением через 1 мин 1 мл буферного раствора без AFM1. Указанные готовые два раствора для элюирования собирали в один и тот же силанизированный флакон UPLC для анализа на содержание AFM1. В патроны добавляли метанол объемом 1 мл для элюирования уловленного AFM1 и собирали элюент с последующим сбором 1 мл толуольного элюента, который аналогичным образом собирали отдельно для анализа. Образцы метанольных и толуольных элюентов высушивали с помощью газообразного азота и ресуспендировали перед анализом в 1 мл буферного раствора. Для обеспечения эффективного количественного определения результатов с применением UPLC-MC/MC, готовили стандартные образцы с известными концентрациями AFM1 в буферном растворе при 1, 5, 10, 50 и 100 нг/л.

[0159] Полученные результаты показали, что концентрации свободнотекучего полимера в 1 мг/л было достаточно для адсорбции 76,5% в случае 100 нг/л AFM1, который был выбран в качестве потенциальной мишени афлатоксина. Фиг. 1. Указанную степень включения использовали в качестве эталона для оценки остальных ПМО. Была исследована мгновенная сорбция 100 нг/л AFM1 под действием ПМО и ПБМО, упакованных в патроны для твердофазной экстракции (SPE) и элюированных 100% метанолом. Было обнаружено, что адсорбция изменялась от 75,2 до 94,4 нг/л адсорбированного AFM1.

[0160] Количество AFM1, присутствующее в метанольных и толуольных экстракционных промывочных растворах, служило в качестве индикатора силы, с которой ПМО/ПБМО удерживал AFM1. Было продемонстрировано, что каждый тестируемый продукт высвобождал от 31,1 до 44,4 нг/л AFM1 при промывании 100% метанолом за двумя исключениями. ПМО-001 высвобождал 64,3 нг/л AFM1 и ПМО-005 высвобождал небольшое количество 22,6 нг/л AFM1. Однако за исключением указанных двух продуктов, каждый полимер из ПМО и ПБМО проявлял сходную величину силы взаимодействия с AFM1. Для каждого из продуктов ПМО/ПБМО в толуольных промывочных растворах было обнаружено небольшое количество AFM1 или AFM1 не был обнаружен вовсе. Такой результат, вероятно, обусловлен тем фактом, что большая часть AFM1 была высвобождена при экстракции метанолом, а также тем, что вследствие невысокой полярности толуола, он оказывал незначительное влияние на десорбцию полярного AFM1. См. фиг. 1.

Кинетика адсорбции

[0161] В ходе разработки вариантов реализации изобретения были проведены эксперименты для исследования времени реакции и его влияния на адсорбцию с применением свободнотекучего ПМО/ПБМО, взаимодействующего при орбитальном встряхивании со скоростью 225 об/мин при рН 6,0 в течение 6 периодов времени, от 5 до 500 минут, с 10 мл раствора, содержащего 90 нг/л AFM1. Эффективность адсорбции измеряли путем количественного определения микотоксина, оставшегося в надосадочной жидкости и элюирующем растворе из ПМО/ПБМО после промывания метанолом, что позволяло определить эффективность и селективность адсорбции. Благодаря тому факту, что имеет место мгновенная адсорбция, для каждого продукта были усреднены значения адсорбции AFM1 на каждый момент времени (15, 30, 60, 90 минут и 18 часов). Затем все пробирки центрифугировали в течение 10 минут при 3000 об/мин и переносили содержимое в UPLC флакон для анализа. Далее порошок (ПМО или ПБМО) переносили в пробирку Эппендорфа объемом 2 мл, в которую добавляли 1 мл метанола, и встряхивали в течение приблизительно трех секунд. Затем каждую пробирку центрифугировали в течение 5 минут при 10000 об/мин и 500 мкл жидкости удаляли и помещали во флакон для UPLC. Затем указанные пробы высушивали с помощью азота и ресуспендировали в 500 мкл буферного раствора перед анализом с помощью метода UPLC-MC/MC.

[0162] Все полимеры в каждый момент времени были способны адсорбировать от 45 до 55% AFM1, при этом наблюдались незначительные различия между ПМО и ПБМО. См. фиг. 2. Однако селективность ПМО и ПБМО значительно различалась. ПМО в зависимости от их состава только частично высвобождали AFM1. Различия, наблюдаемые в отношении высвобождения заданной молекулы после промывания метанолом согласно предыдущему эксперименту, ясно продемонстрировали, что при увеличении времени реакции между молекулой-мишенью и ПМО стабильность секвестрации повышалась, тогда как ПБМО демонстрировал более низкую стабильность взаимодействия, что приводило к высвобождению большего количества заданного соединения при промывании метанолом. Этот эксперимент позволил установить четкую специфичность взаимодействия и адсорбционного свойства ПМО в отношении афлатоксина M1. Дальнейшее исследование показало, что при испытании различных концентраций AFM1, варьирующих от 45 до 450 нг/мл, ПМО/ПБМО проявляли похожую адсорбционную способность, составляющую примерно 50%, с учетом химического равновесия между адсорбированным AFM1 относительно неадсорбированного AFM1, присутствующего в окружении.

Пример 8 Способности к секвестрации полученных ПМО в отношении микотоксинов - применимо к AFM1 в молоке.

[0163] В ходе разработки вариантов реализации изобретения были проведены эксперименты для исследования ПМО (ПМО-003) на его способность к секвестрации при взаимодействии с 225 нг/л AFM1 в сыром молоке. Суспензию ПМО-003 в воде чистоты ЖХ-МС использовали для размещения 0,1 мг, 1,0 мг и 10,0 мг порошка в соответствующие силанизированные пробирки (1 мл воды из суспензии в каждую пробирку). Помещали 1 мл воды в две дополнительные пробирки, не содержащие порошок, которые служили в качестве контрольных проб в форме как для сырого молока с добавкой, так и для холостой пробы сырого молока. Затем 9 мл сырого молока с добавкой 250 нг/л AFM1 помещали в каждую пробирку, за исключением холостой контрольной пробы молока, в которую вводили 9 мл молока без добавки. Далее при комнатной температуре все пробирки помещали на один час на орбитальный встряхиватель, скорость которого устанавливали при 200 об/мин, после чего пробирки центрифугировали при 4000 об/мин в течение 10 минут. Четырнадцать 100 мг-мовых патронов С18 SPE (тройные для каждой пробы молока с добавкой и двойные для холостой пробы молока) активировали путем элюирования по очереди 1 мл метанола и 1 мл воды с применением вакуума. После центрифугирования 1 мл жидкости помещали в каждый соответствующий SPE патрон, и в каждую пробу, за исключением холостой пробы молока, вносили 10 мкл 100 ppb пробы AFB1 в ацетонитриле в качестве внутреннего стандарта. Затем жидкости элюировали с применением вакуума с последующим элюированием 1 мл воды через каждый патрон. После этого 1 мл метанола помещали в каждый патрон и элюировали в силанизированный UPLC флакон, используя положительное давление. После элюирования в одну из двух холостых проб молока вносили 225 нг/л AFM1 и добавляли 10 мкл 100 ppb AFB1 раствора внутреннего стандарта. Для обеспечения количественного определения результатов в ацетонитриле готовили стандартные образцы с концентрациями AFM1 1, 5, 10, 25, 50, 100, 250 и 500 нг/л. Один миллилитр каждой пробы высушивали путем продувания азота над пробой и ресуспендировали в 1 мл буферного раствора. Затем к каждому стандартному образцу объемом 500 мкл вносили 5 мкл 100 ppb AFB1 раствора для построения калибровочной кривой.

[0164] При степени включения 0,1% (масс/об.), ПМО может удалить 45,3% токсина. Как видно на фиг. 3, было установлено, что даже 0,1 мг (степень включения 0,001%) и 1,0 мг (0,01%) свободнотекучего порошка также проявляли адсорбцию, составляющую, соответственно, 6,7% и 15,4% AFM1, удаленного из молока. Указанный эксперимент четко определил применимость ПМО в отношении конкретно AFM1 в сложной матрице сырого молока даже при степенях включения до 0,001%.

Пример 9

[0165] При первоначальном исследовании оценивали уровень включения ПМО, необходимый для секвестирования AFM1. Материал ПМО-005 исследовали в среде буферного раствора. Как показано на фиг. 5, было обнаружено, что 1 мг порошка (имеющий степень включения 0,1%, масс/об.) мог адсорбировать 76,5% AFM1 из 100 нг/л раствора AFM1 в буферном растворе. Между тем, при степени включения 0,001% и 0,01% (масс/об.) наблюдалась незначительная адсорбция AFM1. С другой стороны при степени включения 1,0% (масс/об.) адсорбция AFM1 составляла 100%. См. фиг. 5.

[0166] Все публикации и патенты, описанные в настоящей заявке, в полном объеме включены в настоящий документ посредством ссылки.

[0167] Специалисты в данной области техники легко поймут, что многие модификации возможны без существенного отклонения от новых идей и преимуществ настоящего изобретения. Соответственно, подразумевается, что все такие модификации должны быть включены в объем настоящего изобретения, определенный в приведенной ниже формуле изобретения.

Изобретение относится к композиции шаблона для секвестирования одного или более афлатоксинов, содержащей: (a) шаблон афлатоксина, имеющий формулу (I), где R₁ выбран из H; R₂ выбран из галогена, CH₂C(O)OR' и CH(C(O)OR')₂; где R' выбран из H и C_1-6 алкила; и R₃ выбран из C_1-6 алкокси или где R₁ вместе с R₂ образуют C_4-7 циклоалкильное кольцо; (b) мономеры, способные химически связываться друг с другом; (c) носитель, где мономеры представляют собой метакриловую кислоту, 2-винилпиридин, 2-гидроксиэтилметакрилат или любую их комбинацию. Изобретение также относится к интермедиату полимера с молекулярными отпечатками, содержащему комплекс сшитого полимера и шаблона афлатоксина формулы (I), при этом шаблон афлатоксина является удаляемым из полимера для формирования полости, размер и/или форма которой позволяют афлатоксину связываться с ней. Технический результат – получена новая композиция на основе шаблона афлатоксина формулы (I), которая может найти применение при обработке и производстве диетических продуктов, терапевтических средств, продуктов питания и напитков, а также в целях исследования и контроля качества. 2 н. и 10 з.п. ф-лы, 5 ил., 9 пр.

1. Композиция шаблона для секвестирования одного или более афлатоксинов, содержащая:

(a) шаблон афлатоксина, имеющий формулу (I):

где

R₁ выбран из H;

R₂ выбран из галогена, CH₂C(O)OR' и CH(C(O)OR')₂; где R' выбран из H и C_1-6 алкила; и

R₃ выбран из C_1-6 алкокси, или

где R₁ вместе с R₂ образуют C_4-7 циклоалкильное кольцо;

(b) мономеры, способные химически связываться друг с другом;

(c) носитель,

где мономеры представляют собой метакриловую кислоту, 2-винилпиридин, 2-гидроксиэтилметакрилат или любую их комбинацию.

2. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что шаблон афлатоксина и мономеры присутствуют в молярном соотношении от 100:1 до 1:100.

3. Композиция по п. 1, дополнительно содержащая сшивающий агент.

4. Композиция по п. 3, отличающаяся тем, что сшивающий агент представляет собой диметакрилат этиленгликоля, дивинилбензол, триметилолпропантриметакрилат или любую их комбинацию.

5. Композиция по п. 3, отличающаяся тем, что мономеры и сшивающий агент присутствуют в молярном соотношении от 1:4,1 до 1:10.

6. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что носитель представляет собой растворитель.

7. Композиция по п. 6, отличающаяся тем, что растворитель выбран из группы, состоящей из ацетонитрила, толуола, циклогексана, поливинилового спирта в водном растворе и смеси двух или более соединений, выбранных из ацетонитрила, толуола, циклогексана, поливинилового спирта в водном растворе или любой их комбинации.

8. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что шаблон афлатоксина формулы (I) выбран из группы, состоящей из 4-(хлорметил)-5,7-диметоксикумарина, 5,7-диметоксициклопентенон[2,3-c]кумарина или любой их комбинации.

9. Интермедиат полимера с молекулярными отпечатками, содержащий комплекс сшитого полимера, полученного из мономеров, химически связанных друг с другом, и шаблона афлатоксина, имеющего формулу (I):

где

R₁ выбран из H;

R₂ выбран из галогена, CH₂C(O)OR' и CH(C(O)OR')₂; где R' выбран из H и C_1-6 алкила; и

R₃ выбран из C_1-6 алкокси, или

где R₁ вместе с R₂ образуют C_4-7 циклоалкильное кольцо;

и при этом шаблон афлатоксина является удаляемым из сшитого полимера для формирования полости, размер и/или форма которой позволяют афлатоксину связываться с ней.

10. Интермедиат полимера с молекулярными отпечатками по п. 9, отличающийся тем, что шаблон афлатоксина и мономеры использованы в молярном соотношении от 100:1 до 1:100.

11. Интермедиат полимера с молекулярными отпечатками по п. 9, отличающийся тем, что сшитый полимер содержит полимерную сеть, образованную мономерами и сшивающим агентом, где мономеры и сшивающий агент использованы в молярном соотношении от 1:4,1 до 1:10.

12. Интермедиат полимера с молекулярными отпечатками по п. 9, отличающийся тем, что шаблон афлатоксина формулы (I) выбран из группы, состоящей из 4-(хлорметил)-5,7-диметоксикумарина, 5,7-диметоксициклопентенон[2,3-c]кумарина или любой их комбинации.