КОМПОЗИЦИЯ ВИРУСОПОДОБНЫХ ЧАСТИЦ Российский патент 2019 года по МПК C07K19/00 C07K14/18 C07K14/525 C12N15/62 C12P21/08 A61K39/00 

Ссылки на родственные заявки

Настоящая заявка претендует на приоритет от Предварительной патентной заявки США No. 61/599,746, поданной 16 февраля 2012 г., все содержание которой включено сюда путем ссылки.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение имеет отношение к частицам, включающим полипептид и по меньшей мере один антиген, и к содержащей их композиции.

Уровень техники

Вирусоподобные частицы (VLPs) представляют собой мультибелковые структуры, которые имитируют организацию и конформацию истинных природных вирусов, но не имеют вирусного генома, потенциально являясь более безопасными и дешевыми кандидатами вакцин. В настоящее время во всем мире коммерчески доступна лишь горстка профилактических вакцин на основе VLP: Engerix® (вирус гепатита В) и Cervarix® (вирус папилломы человека) фирмы GlaxoSmithKline и Recombivax НВ® (вирус гепатита В) и Gardasil® (вирус папилломы человека) фирмы Merck and Co., Inc. - вот некоторые примеры. Другие вакцины-кандидаты на основе VLP проходят клинические испытания или проходят дополнительную доклиническую оценку, как-то вирус гриппа, парвовирус, Norwalk и различные химерные VLPs. Многие другие по-прежнему сводятся к малосерийным фундаментальным исследованиям, несмотря на их успех при доклинических испытаниях. Обсуждаются последствия крупномасштабного производства VLP в контексте управления процессом, мониторинга и оптимизации. Соответственно выявляются и обсуждаются основные технические проблемы на ранних и поздних стадиях производства. Вкратце рассмотрены успешные вакцины-блокбастеры на основе VLP вместе с последними результатами клинических испытаний и последними разработками в области химерной технологии VLP для терапевтической или профилактической вакцинации (Expert Rev. Vaccines 9(10), 1149-1176, 2010).

Вирус чикунгунья (Chikungunya; CHIKV) уже заразил миллионы людей в Африке, Европе и Азии с тех пор, как этот альфавирус вновь появился из Кении в 2004 г. Тяжесть заболевания и распространение этого эпидемического вируса представляет серьезную угрозу для здравоохранения в отсутствие вакцины или противовирусной терапии. Сообщалось, что вакцина типа VLP против эпидемического вируса чикунгунья защищает других приматов от заражения (Nat Med. 2010, 16(3): 334-338). В патентной публикации US No. 2012/0003266 раскрыты вирусоподобные частицы (VLP), содержащие один или несколько структурных полипептидов вируса чикунгунья, которые применимы для составления вакцин или антигенных композиций от чикунгуньи, вызывающих иммунитет от инфекции или по меньшей мере одного ее симптома. В WO 2012/106356 раскрыты модифицированные вирусоподобные частицы (VLPs) из альфавирусов или флавивирусов и способы увеличения продукции модифицированных VLPs для применения при профилактике или лечении вызванных альфавирусами и флавивирусами заболеваний (эти приведенные ссылки включены сюда путем ссылки).

Сущность изобретения

В первом аспекте настоящего изобретения предусмотрены частицы, которые обладают способностью к самосборке и содержат полипептид и по меньшей мере один антиген, причем указанный полипептид содержит по меньшей мере один первый сайт прикрепления, а указанный по меньшей мере один антиген содержит по меньшей мере один второй сайт прикрепления, при этом указанный полипептид и указанный антиген соединяются через указанный по меньшей мере один первый и указанный по меньшей мере один второй сайт прикрепления.

Во втором аспекте настоящего изобретения предусмотрены молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие последовательности нуклеотидов, кодирующие частицы, предусмотренные в первом аспекте настоящего изобретения.

В третьем аспекте настоящего изобретения предусмотрены композиции, содержащие частицы, предусмотренные в первом аспекте настоящего изобретения, и/или молекулы нуклеиновой кислоты, предусмотренные во втором аспекте настоящего изобретения.

В четвертом аспекте настоящего изобретения предусмотрен способ получения антител, включающий контакт с млекопитающими частиц, предусмотренных в первом аспекте настоящего изобретения, и/или молекул нуклеиновой кислоты, предусмотренных во втором аспекте настоящего изобретения.

В пятом аспекте настоящего изобретения предусмотрен способ иммуномодуляции, способ лечения аутоиммунных заболеваний, способ индуцирования и/или усиления иммунного ответа против антигена у млекопитающих и способ лечения рака, включающий введение млекопитающим композиции, предусмотренной в третьем аспекте настоящего изобретения.

В шестом аспекте настоящего изобретения предусмотрен способ пассивной иммунизации, включающий введение млекопитающим антител, предусмотренных в четвертом аспекте настоящего изобретения.

В седьмом аспекте настоящего изобретения предусмотрен способ презентации антигена на макрофагах, включающий контакт с млекопитающими частиц, предусмотренных в первом аспекте настоящего изобретения, и/или молекул нуклеиновой кислоты, предусмотренных во втором аспекте настоящего изобретения.

В восьмом аспекте настоящего изобретения предусмотрен способ получения частиц, предусмотренных в первом аспекте настоящего изобретения, включающий получение гена, содержащего последовательность нуклеотидов, кодирующую указанные частицы; культивирование клеток, трансфецированных указанным геном, для экспрессии указанных частиц; и выделение указанных частиц.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 представлена модификация последовательности TNF-α, которая вводится в структурный полипептид вируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEEV).

На фиг. 2 представлены результаты вестерн-блота, показывающие, что происходит экспрессия конъюгированного с VLP TNF-α.

На фиг. 3 представлен вектор VLP_CHI 512.

На фиг. 4 представлен вектор VLP_CHI 532.

На фиг. 5 представлен вектор VLP CHI 520.

На фиг. 6 представлен вектор VLP_VEEV VLP 518.

На фиг. 7 представлен вектор VLP_VEEV VLP 519.

На фиг. 8 представлен вектор VLP_VEEV VLP 538.

На фиг. 9 представлено детектирование антител против TNF-α, индуцированных вирусоподобными частицами, конъюгированными с пептидом, полученным из TNF-α.

На фиг. 10 представлено детектирование антител против CD20 человека, индуцированных вирусоподобными частицами, конъюгированными с пептидом, полученным из CD20.

На фиг. 11 представлено детектирование антител против CD20 мыши, индуцированных вирусоподобными частицами, конъюгированными с пептидом, полученным из CD20.

Раскрытие сущности изобретения

1. Частицы, содержащие полипептид и по меньшей мере один антиген

В первом аспекте настоящего изобретения предусмотрены частицы, которые обладают способностью к самосборке и содержат полипептид и по меньшей мере один антиген, причем указанный полипептид содержит по меньшей мере один первый сайт прикрепления, а указанный по меньшей мере один антиген содержит по меньшей мере один второй сайт прикрепления, при этом указанный полипептид и указанный антиген соединяются через указанный по меньшей мере один первый и указанный по меньшей мере один второй сайт прикрепления.

"Частицы, обладающие способностью к самосборке" в настоящем изобретении относится к частицам, образующимся по меньшей мере из одного компонента, который собирается спонтанно. Компонент может представлять собой полипептид или непептидное химическое соединение. В одном воплощении "частицы, обладающие способностью к самосборке" могут представлять собой частицы, содержащие или состоящие из по меньшей мере одного полипептида. По меньшей мере один полипептид состоит из одного или нескольких разных пептидов. В одном воплощении указанные частицы имеют диаметр по меньшей мере 10 нм, к примеру, по меньшей мере 20 нм, предпочтительно по меньшей мере 50 нм. В одном воплощении молекулярный вес указанных частиц составляет от 100 кДа до 100000 кДа, предпочтительно от 400 кДа до 30000 кДа.

Полипептид, используемый для настоящего изобретения, не имеет ограничений, если только он собирается спонтанно. Полипептид может быть структурным полипептидом вируса. Таким образом, частицы, предусмотренные настоящим изобретением, могут представлять собой вирусоподобные частицы.

Структурный полипептид вируса может быть природным полипептидом вируса или его модифицированным полипептидом. В одном воплощении у модифицированного полипептида аминокислотная последовательность по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентична природному структурному полипептиду вируса, включая белки капсида и оболочки. В одном воплощении модифицированный полипептид представлен мутантом, у которого не более 10% аминокислот подверглись делеции, замене и/или вставке в природный структурный полипептид вируса, включая белки капсида и оболочки.

В одном воплощении структурный полипептид вируса, используемый для настоящего изобретения, состоит из или содержит белок капсида и/или оболочки либо его фрагмент. К примеру, белок оболочки включает по меньшей мере один, выбранный из группы, состоящей из Е3, Е2, 6K и E1.

Структурный полипептид вируса, используемый для настоящего изобретения, может происходить из альфавируса или флавивируса. Таким образом, частицы, предусмотренные настоящим изобретением, могут представлять собой вирусоподобные частицы, полученные из альфавируса или флавивируса.

Примеры альфавирусов и флавивирусов включают, без ограничения, вирус Aura, вирус Babanki, вирус Barman Forest (BFV), вирус Bebaru, вирус Cabassou, вирус Chikungunya (CHIKV), вирус восточного энцефалита лошадей (EEEV), вирус Eilat, вирус Everglades, вирус Fort Morgan, вирус Getah, вирус Highlands J, вирус Kyzylagach, вирус Mayaro, вирус Me Tri, вирус Middelburg, вирус Mosso das Pedras, вирус Mucambo, вирус Ndumu, вирус Oʹnyong-nyong, вирус Pixuna, вирус Rio Negro, вирус Ross River (RRV), вирус панкреатической болезни лосося, вирус Sernliki Forest, вирус Sindbis, вирус южного морского слона, вирус Tonate, вирус Trocara, вирус Una, вирус венесуэльского энцефалита лошадей (VEEV), вирус западного энцефалита лошадей (WEEV), вирус Whataroa, вирус Западного Нила, вирус денге, вирус клещевого энцефалита и вирус желтой лихорадки.

Термин "антиген" в настоящем изобретении относится к молекулам, способным связываться с антителом или клеточным рецептором (TCR), если они презентированы молекулой МНС. Термин "антиген" в настоящем изобретении также охватывает Т-клеточные эпитопы. Т-клеточные эпитопы распознаются Т-клеточными рецепторами в контексте МНС класса I, присутствующих на всех клетках организма, за исключением эритроцитов, или класса II, присутствующих на иммунных клетках, в частности, на антиген-презентирующих клетках. Такое распознавание приводит к активации Т-клеток и последующих эффекторных механизмов, таких как пролиферация Т-клеток, секреция цитокинов, секреция перфорина и т.д. Антигены также могут распознаваться иммунной системой и/или индуцировать гуморальный иммунный ответ и/или клеточный иммунный ответ, приводящий к активации В- и/или Т-лимфоцитов. Но для этого может потребоваться, чтобы по меньшей мере в некоторых случаях антиген содержал или соединялся с клеточным эпитопом и вводился в адъюванте. Антиген может иметь один или несколько эпитопов (В- и Т-эпитопы). Приведенная выше специфическая реакция означает то, что антиген будет предпочтительно реагировать, как правило с высокой избирательностью, с соответствующим ему антителом или TCR, но не с множеством других антител или TCRs, которые могут быть вызваны другими антигенами. Антигены в настоящем изобретении также могут быть смесью из нескольких отдельных антигенов. Антигены в настоящем изобретении, включают, без ограничения, аллергены, аутоантигены, гаптены, раковые антигены (т.е. опухолевые антигены) и антигены инфекционных заболеваний, а также небольшие органические молекулы типа наркотических препаратов (вроде никотина) и их фрагменты и производные. Кроме того, антигены, используемые для настоящего изобретения, могут быть представлены пептидами, белками, доменами, углеводами, алкалоидами, липидами или небольшими молекулами, такими, к примеру, как стероидные гормоны и их фрагменты и производные, аутоантителами и самими цитокинами.

Примеры цитокинов включают, без ограничения, интерлейкины (IL), включающие свыше 30 типов, таких как IL-1α, IL-1β, IL-2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11 до -37; интерфероны (IFN), такие как IFN-α, IFN-β и IFN-γ; факторы некроза опухолей (TNF), такие как TNF-α и TNF-β; трансформирующие факторы роста (TGF), такие как TGF-α и TGF-β; колониестимулирующие факторы (CSF), как-то колониестимулирующие факторы гранулоцитов (G-CSF), колониестимулирующие факторы гранулоцитов-макрофагов (GM-CSF), колониестимулирующие факторы макрофагов (M-CSF), эритропоетины (ЕРО), факторы стволовых клеток (SCF) и факторы хемотаксиса и активации моноцитов (MCAF); факторы роста (GF), такие как фактор роста эпидермиса (EGF), фактор роста фибробластов (FGF), инсулиноподобный фактор роста (IGF), фактор роста нервов (NGF), полученный из мозга нейротрофный фактор (BDNF), тромбоцитарный фактор роста (PDGF), фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF), фактор роста гепатоцитов (HGF), фактор роста кератиноцитов (KGF), тромбопоэтин (ТРО) и белок морфогенеза костей (BMP); и другие полипептидные факторы, в том числе LIF, лиганд kit (KL), МРО (миелопероксидаза) и CRP (С-реактивный белок); СОХ (циклооксигеназа) типа СОХ-1, СОХ-2 и СОХ-3, NOS (синтаза оксида азота) ranaNOS-l, NOS-2 и NOS-3; и др.

Цитокины также включают хемокины, которые представляют собой цитокины, индуцирующие хемотаксис. Есть два главных класса хемокинов, СХС и СС. Хемокины СХС, такие как активирующий нейтрофилы белок-2 (NAP-2) и белок, стимулирующий активность роста меланомы (MGSA), являются хемотаксическими главным образом для нейтрофилов и Т-лимфоцитов, тогда как хемокины СС, такие как RANTES, воспалительный белок макрофагов (MIP), включая MIP-1α и MIP-1β, хемокин из кератиноцитов (KC), хемотаксические белки моноцитов (МСР-1, МСР-2, МСР-3, МСР-4 и МСР-5) и эотаксины (-1 и -2) являются хемотаксическими, среди прочих клеточных типов, для макрофагов, Т-лимфоцитов, эозинофилов, нейтрофилов, дендритных клеток и базофилов. Существуют и такие хемокины - лимфотактин-1, лимфотактин-2 (оба они хемокины СС) и фракталкин (хемокин СХ3С), которые не входят ни в одно из основных подсемейств хемокинов.

В настоящем изобретении термин "антигенная детерминанта" служит для обозначения той части антигена, которая специфически распознается либо В-, либо Т-лимфоцитами. В-лимфоциты реагируют на чужеродные антигенные детерминанты вырабатыванием антител, тогда как Т-лимфоциты являются медиаторами клеточногоиммунитета. Таким образом, антигенные детерминанты или эпитопы представляют собой те части антигена, которые распознаются антителами или же, в контексте МНС, Т-клеточными рецепторами. Антигенная детерминанта содержит один или несколько эпитопов.

В настоящем изобретении термин "антитело" относится к таким молекулам, которые способны связываться с эпитопом или антигенной детерминантой. Термин охватывает целые антитела и их антиген-связывающие фрагменты, в том числе одноцепочечные антитела. Такие антитела включают и антиген-связывающие фрагменты антител человека и включают, без ограничения, фрагменты Fab, Fabʹ и F(abʹ)2, Fd, одноцепочечные Fvs (scFv), одноцепочечные антитела, связанные через дисульфиды Fvs (sdFv) и фрагменты, содержащие домен V_L либо V_H. Антитела могут происходить из любых животных, включая птиц и млекопитающих. Предпочтительно антитела происходят из млекопитающих, например, человека, мыши, кролика, козы, морской свинки, верблюда, лошади и т.п. либо других подходящих животных, например, курицы. В настоящем изобретении "человеческие" антитела включают антитела, имеющие аминокислотную последовательность иммуноглобулина человека, и включают антитела, выделенные из библиотек иммуноглобулинов человека или из животных, трансгенных по одному или нескольким иммуноглобулинам человека и не экспрессирующих эндогенные иммуноглобулины, как описано, к примеру, в U.S. Patent No. 5939598, содержание которого включено сюда путем ссылки во всей полноте.

Антигеном может быть вещество (например, белок), которое не происходит из вируса (например, вируса Chikungunya, вируса венесуэльского энцефалита лошадей).

В одном воплощении антиген, который используется для настоящего изобретения, представлен по меньшей мере одним из числа тех мишеней или полипептидов, которые перечислены в табл. 1.

В одном воплощении антиген, который используется в настоящем изобретении, представлен по меньшей мере одним белком или полипептидом, выбранным из группы, состоящей из CTLA-4, PD-1, TIM-3, BTLA, VISTA, LAG-3, CD28, ОХ40, GITR, CD137, CD27 и HVEM. CTLA-4, PD-1, TIM-3, BTLA, VISTA и LAG-3 являются рецепторами, ингибирующими стимуляцию Т-клеток, a CD28, ОХ40, GITR, CD137, CD27 и HVEM являются рецепторами, активирующими стимуляцию Т-клеток (см. Mellman et al., Nature 480,480-489(2011)).

Антиген, используемый в настоящем изобретении, может представлять собой модифицированный полипептид, происходящий из природного белка. Модифицированный полипептид может представлять собой фрагмент природного белка. В одном воплощении у модифицированного полипептида аминокислотная последовательность по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентична полипептиду, происходящему из природного белка. В одном воплощении указанный модифицированный полипептид представлен мутантом, у которого не более 10% аминокислот подверглись делеции, замене и/или вставке на основе полипептида, полученного из природного белка.

В частицах, предусмотренных настоящим изобретением, полипептид и антиген могут соединяться через по меньшей мере один первый сайт прикрепления, который находится в полипептиде, и по меньшей мере один второй сайт прикрепления, который находится в антигене.

В настоящем изобретении выражения "первый сайт прикрепления" и "второй сайт прикрепления" относятся к сайтам, по которым соединяются друг с другом более чем одна субстанция.

В одном воплощении полипептид и антиген соединяются непосредственно. С другой стороны, между ними могут находиться один или два линкера между N-концевым остатком антигена и полипептидом и/или между C-концевым остатком антигена и полипептидом.

Антиген или полипептид может быть укорочен и заменен коротким линкером. В некоторых воплощениях антиген или полипептид включает один или несколько пептидных линкеров. Как правило, линкер состоит из от 2 до 25 аминокислот. Обычно его длина составляет от 2 до 15 аминокислот, хотя в некоторых случаях это может быть лишь одна аминокислота, как-то один остаток глицина.

В одном воплощении молекула нуклеиновой кислоты, в которой полинуклеотид, кодирующий полипептид, генетически слит с полинуклеотидом, кодирующим антиген, экспрессируется в клетках хозяина так, что первый сайт прикрепления и второй сайт прикрепления соединяются через пептидную связь. В этом случае полипептид и антиген соединяются через пептидную связь. В отношении этого воплощения, первый сайт прикрепления и/или второй сайт прикрепления могут подвергаться генетической модификации от исходного полипептида или антигена. Например, первый сайт прикрепления подвергается такой модификации от полипептида, что полипептид будет конъюгирован с антигеном через пептидный линкер, включающий SG, GS, SGG, GGS и SGSG.

При химической конъюгации полипептида с антигеном, первый сайт прикрепления и второй сайт прикрепления могут соединяться через химический сшивающий линкер, которым является химическое соединение.

Примеры сшивающих линкеров включают, без ограничения, SMPH, sulfo-MBS, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMPB, sulfo-SMCC, SVSB, SIA и другие сшивающие линкеры, доступные от Pierce Chemical Company.

В одном воплощении частицы, предусмотренные настоящим изобретением, включают полипептид, соединенный с антигеном, причем пространственное расстояние между N-концевым остатком и C-концевым остатком антигена составляет 30Å или меньше, при этом расстояние определяется в кристаллах антигена или природного бежа, содержащего антиген или модифицированный белок.

Антиген, используемый в настоящем изобретении, может быть разработан специалистом в указанной области. Например, антиген, используемый в настоящем изобретении, может быть природным белком или его фрагментом. С другой стороны, антиген, используемый в настоящем изобретении, может представлять собой белок, модифицированный из природного белка или его фрагмента. Специалист может сконструировать антиген так, чтобы пространственное расстояние между N-концевым остатком и C-концевым остатком антигена составляло 30Å или меньше при определении расстояния в кристаллах антигена или природного белка, содержащего антиген или модифицированный белок. Например, антиген, используемый для частиц, предусмотренных настоящим изобретением, может быть разработан с помощью программного обеспечения в свободном доступе, включая PyMOL (например, PyMOL vO.99: http./www.pymol.org). В одном воплощении пространственное расстояние между N-концевым остатком и C-концевым остатком антигена составляет 30Å (ангстрем) или меньше, 20Å или меньше либо 10Å или меньше (например, от 5Å до 15Å, от 5Å до 12Å, от 5Å до 11Å, от 5Å до 10Å, от 5Å до 8Å, от 8Å до 15Å, от 8Å до 13Å, от 8Å до 12Å, от 8Å до 11Å, от 9Å до 12Å, от 9Å до 11Å, от 9Å до 10Å или от 10Å до 11Å).

Вирусоподобные частицы вируса Chikungunya или вирусоподобные частицы вируса венесуэльского энцефалита лошадей

В одном воплощении настоящего изобретения предусмотрены вирусоподобные частицы вируса Chikungunya или вирусоподобные частицы вируса венесуэльского энцефалита лошадей, содержащие структурный полипептид вируса Chikungunya или венесуэльского энцефалита лошадей и по меньшей мере один антиген, причем указанный структурный полипептид вируса Chikungunya или указанный структурный полипептид вируса венесуэльского энцефалита лошадей содержит по меньшей мере один первый сайт прикрепления, а указанный по меньшей мере один антиген содержит по меньшей мере один второй сайт прикрепления, при этом указанный структурный полипептид вируса Chikungunya или венесуэльского энцефалита лошадей и указанный по меньшей мере один антиген соединяются через указанный по меньшей мере один первый и указанный по меньшей мере один второй сайт прикрепления.

В одном воплощении пространственное расстояние между N-концевым остатком и C-концевым остатком антигена может составлять 30Å или меньше; 25Å или меньше; 20Å или меньше; 15Å или меньше; 14Å или меньше; 13Å или меньше; 12Å или меньше; 11Å или меньше; 10Å или меньше; 9Å или меньше; либо 8Å или меньше (например, от 5Å до 15Å, от 5Å до 12Å, от 5Å до 11Å, от 5Å до 10Å, от 5Å до 8Å, от 8Å до 15Å, от 8Å до 13Å, от 8 Å до 12Å, от 8Å до 11Å, от 9Å до 12Å, от 9Å до 11Å, от 9Å до 10Å либо от 10Å до 11Å) при определении расстояния в кристаллах антигена или природного белка, содержащего антиген или модифицированный белок.

В одном воплощении антиген соединяется со структурным полипептидом вируса Chikungunya или венесуэльского энцефалита лошадей посредством химической сшивки или в виде слитого белка, полученного посредством генной инженерии.

Структурный полипептид вируса Chikungunya или венесуэльского энцефалита лошадей, используемый в настоящем изобретении, может включать белок оболочки и/или капсида вируса Chikungunya или венесуэльского энцефалита лошадей.

Примеры вируса Chikungunya включают, без ограничения, штаммы 37997 и LR2006 OPY-1.

Примеры вируса венесуэльского энцефалита лошадей включают, без ограничения, ТС-83.

Структурный полипептид вируса Chikungunya или венесуэльского энцефалита лошадей, используемый в настоящем изобретении, может быть природным структурным полипептидом вируса или его модифицированным полипептидом. Модифицированный полипептид может быть фрагментом природного структурного полипептида вируса. В одном воплощении у модифицированного полипептида аминокислотная последовательность по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентична природному белку капсида и/или оболочки вируса. В одном воплощении модифицированный полипептид представлен мутантом, у которого не более 10% аминокислот подверглись делеции, замене и/или вставке на основе природного белка капсида и/или оболочки вируса. Например, в структурный полипептид капсида вируса венесуэльского энцефалита лошадей, используемый в настоящем изобретении, может быть введена мутация K64A или K64N.

Белок оболочки вируса Chikungunya или венесуэльского энцефалита лошадей может включать по меньшей мере один, выбранный из группы, состоящей из E3, Е2, 6K и E1.

Примеры структурных полипептидов вируса Chikungunya включают, без ограничения, E3-E2-6K-E1 штамма 37997 вируса Chikungunya, капсид-E3-E2-6K-E1 штамма 37997 вируса Chikungunya, E3-E2-6K-E1 штамма LR2006 OPY-1 вируса Chikungunya и капсид-Е3-Е2-6K-Е1 штамма LR2006 OPY-1 вируса Chikungunya.

Примеры структурных полипептидов вируса венесуэльского энцефалита лошадей включают, без ограничения, Е3-Е2-6K-Е1 штамма ТС-83 вируса венесуэльского энцефалита лошадей и капсид-Е3-Е2-6K-Е1 штамма ТС-83 вируса венесуэльского энцефалита лошадей.

Типичная последовательность структурного полипептида вируса Chikungunya приведена в Genbank, № доступа АВХ40006.1, которая представлена ниже (SEQ ID NO: 1):

Другая типичная последовательность структурного полипептида вируса Chikungunya приведена в Genbank, № доступа АВХ40011.1, которая представлена ниже (SEQ ID NO: 2):

Типичная последовательность структурного полипептида вируса венесуэльского энцефалита лошадей приведена в Genbank, № доступа L01443.1 (bttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/L01443.1), которая представлена ниже (SEQ ID NO: 3):

В одном воплощении первый сайт прикрепления включает аминогруппу, предпочтительно аминогруппу остатка лизина. В одном воплощении второй сайт прикрепления включает сульфгидрильную группу, предпочтительно сульфгидрильную группу цистеина.

В одном воплощении конъюгирование более чем двух субстанций (например, антигена и структурного полипептида вируса Chikungunya или венесуэльского энцефалита лошадей) через первый сайт прикрепления или второй сайт прикрепления осуществляется с помощью химического сшивающего линкера. Примеры сшивающих линкеров включают, без ограничения, SMPH, sulfo-MBS, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMPB, sulfo-SMCC, SVSB, SIA и другие сшивающие линкеры, доступные от Pierce Chemical Company.

В соответствии с настоящим изобретением, предусматриваются вирусоподобные частицы вируса Chikungunya или венесуэльского энцефалита лошадей, включающие структурный полипептид вируса Chikungunya или венесуэльского энцефалита лошадей и антиген, при этом указанный структурный полипептид вируса Chikungunya или венесуэльского энцефалита лошадей и указанный антиген экспрессируются в виде слитого белка.

В одном воплощении антиген может быть слит с любым сайтом структурного полипептида вируса Chikungunya или венесуэльского энцефалита лошадей. Например, антиген может прямо или косвенно соединяться с N- или С-концом структурного полипептида вируса Chikungunya или венесуэльского энцефалита лошадей (например, капсида, Е3, Е2, 6K или E1), или же антиген может быть вставлен в структурный белок вируса Chikungunya или венесуэльского энцефалита лошадей (например, капсид, E3, Е2, 6K или E1).

В одном воплощении по меньшей мере один антиген вставляется в структурный белок Е2 вируса Chikungunya или венесуэльского энцефалита лошадей. Например, касательно структурного белка вируса Chikungunya, по меньшей мере один антиген вставляется между остатками 519 и 520 в SEQ ID NO: 1 или 2 (то есть между G в положении 519 и Q в положении 520 в SEQ ID NO: 1 или 2); между остатками 530 и 531 в SEQ ID NO: 1 или 2 (то есть между G в положении 530 и S в положении 531 в SEQ ГО NO: 1 или 2); между остатками 531 и 532 в SEQ ID NO: 1 или 2 (то есть между S в положении 531 и N в положении 532 в SEQ ID NO: 1 или 2); между остатками 529 и 530 в SEQ ID NO: 1 или 2 (то есть между G в положении 529 и G в положении 530 в SEQ ID NO: 1 или 2); или между остатками 510 и 511 в SEQ ID NO: 1 или 2 (то есть между S в положении 510 и G в положении 511 в SEQ ID NO: 1 или 2); или между остатками 511 и 512 в SEQ ID NO: 1 или 2 (то есть между G в положении 511 и N в положении 512 в SEQ ID NO: 1 или 2); или между остатками 509 и 510 в SEQ ID NO:1 или 2 (то есть между Q в положении 509 и S в положении 510 в SEQ ID NO: 1 или 2).

Например, касательно структурного белка вируса венесуэльского энцефалита лошадей, по меньшей мере один антиген вставляется между остатками 517 и 518 в SEQ ID NO: 3 (то есть между G в положении 517 и S в положении 518 в SEQ ID NO: 3); между остатками 518 и 519 SEQ ID NO: 3 (то есть между S в положении 518 и S в положении 519 в SEQ ID NO: 3); между остатками 519 и 520 в SEQ ID NO: 3 (то есть между S в положении 519 и V в положении 520 в SEQ ID NO: 3); между остатками 515 и 516 в SEQ ID NO: 3 (то есть между L в положении 515 и S в положении 516 в SEQ ID NO: 3); между остатками 516 и 517 в SEQ ID NO: 3 (то есть между S в положении 516 и G в положении 517 в SEQ ID NO: 3); между остатками 536 и 537 в SEQ ID NO: 3 (то есть между С в положении 536 и G в положении 537 в SEQ ID NO: 3); между остатками 537 и 538 в SEQ ID NO: 3 (то есть между G в положении 537 и G в положении 538 в SEQ ID NO: 3); между остатками 538 и 539 в SEQ ID NO: 3 (то есть между G в положении 538 и Τ в положении 539 в SEQ ID NO: 3).

Слитый белок можно экспрессировать любым стандартным методом. Для экспрессии слитого белка можно использовать различные системы экспрессии. Например, слитый белок можно экспрессировать в клетках 293, клетках Sf9 или E. coli.

В одном воплощении антигеном является вещество (например, белок), которое не происходит из вируса Chikungunya или венесуэльского энцефалита лошадей. Антигеном может быть по меньшей мере одно из группы, состоящей из собственных антигенов и раковых антигенов. Например, антигеном может быть полипептид, происходящий из TNF-α, CD20 или CTLA4. Так, примеры комбинаций полипептида и антигена, используемых в настоящем изобретении, включают, без ограничения:

i) полипептид, происходящий из вируса Chikungunya (CHIKV), и полипептид, происходящий из TNF-α;

ii) полипептид, происходящий из вируса Chikungunya (CHIKV), и полипептид, происходящий из CD20;

iii) полипептид, происходящий из вируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEEV), и полипептид, происходящий из TNF-α;

iv) полипептид, происходящий из вируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEEV), и полипептид, происходящий из CD20; или

v) полипептид, происходящий из вируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEEV), и полипептид, происходящий из CTLA4.

Полипептид, происходящий из вируса Chikungunya (CHIKV) или вируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEEV), может быть природным полипептидом вируса или его модифицированным полипептидом. Кроме того, полипептид, происходящий из TNF-α, CD20 или CTLA4, может быть природным полипептидом или модифицированным полипептидом природного полипептида либо фрагментом природного полипептида или модифицированного полипептида. Модифицированный полипептид может быть фрагментом природного структурного полипептида вируса.

В одном воплощении у модифицированного полипептида, происходящего из TNF-α, CD20 или CTLA4, аминокислотная последовательность по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ли 98% идентична природному полипептиду. В одном воплощении модифицированный пептид, происходящий из TNF-α, CD20 или CTLA4, представлен мутантом, у которого не более 10% аминокислот подверглись делеции, замене и/или вставке на основе природного полипептида, происходящего из TNF-α, CD20 или CTLA4.

При конъюгировании полипептида, происходящего из вируса, с полипептидом, происходящим из антигена, можно использовать пептидный линкер, в том числе SG, GS, SGG, GGS SGSG и TRGGS. Примеры конъюгирования полипептида, происходящего из вируса (ниже он обозначается как "PFV"), с полипептидом, происходящим из антигена (ниже он обозначается как "PFA"), включают, без ограничения: PFV-SG-PFA-GS-PFV; PFV-SG-PFA-GGS-PFV; PFV-SSG-PFA-GS-PFV; PFV-SGG-PFA-GGS-PFV; PFV-SGSG-PFA-GS-PFV; и PFA-SGG-PFA-TRGGS-PFV.

В одном воплощении настоящего изобретения предусмотрены вирусоподобные частицы, включающие:

i) слитый белок из полипептида, происходящего из вируса Chikungunya (CHIKV), и полипептида, происходящего из TNF-α, который состоит из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4;

ii) слитый белок из полипептида, происходящего из вируса Chikungunya (CHIKV), и полипептида, происходящего из CD20, который состоит из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 5;

iii) слитый белок из полипептида, происходящего из вируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEEV), и полипептида, происходящего из TNF-α, который состоит из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 6;

iv) слитый белок из полипептида, происходящего из вируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEEV), и полипептида, происходящего из CD20, который состоит из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 7; или

v) слитый белок из полипептида, происходящего из вируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEEV), и полипептида, происходящего из CTLA4, который состоит из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 8.

В одном воплощении настоящего изобретения предусмотрены вирусоподобные частицы, включающие слитый белок, который модифицирован из слитого белка, имеющего аминокислотную последовательность, представленную одной из SEQ ID NOs: 4-8. У модифицированного слитого белка аминокислотная последовательность может быть по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентична слитому белку, имеющему аминокислотную последовательность, представленную одной из SEQ ID NOs: 4-8. К тому же модифицированный слитый белок может быть представлен мутантом, у которого не более 10% аминокислот подверглись делеции, замене и/или вставке на основе слитого белка, имеющего аминокислотную последовательность, представленную одной из SEQ ID NOs: 4-8.

2. Нуклеотиды, векторы, клетки хозяина

Во втором аспекте настоящего изобретения предусмотрены молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие последовательности нуклеотидов, кодирующие частицы, предусмотренные в первом аспекте настоящего изобретения.

В одном воплощении настоящего изобретения предусмотрены молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие последовательности нуклеотидов, кодирующие вирусоподобные частицы вируса Chikungunya или венесуэльского энцефалита лошадей, как описано выше.

Примеры последовательностей нуклеотидов, кодирующих вирусоподобные частицы вируса Chikungunya или венесуэльского энцефалита лошадей, включают, без ограничения, последовательность нуклеотидов, кодирующую E3-Е2-6K-Е1 штамма 37997 вируса Chikungunya, последовательность нуклеотидов, кодирующую капсид-Е3-Е2-6K-Е1 штамма 37997 вируса Chikungunya, последовательность нуклеотидов, кодирующую Е3-Е2-6K-Е1 штамма LR2006 OPY-1 вируса Chikungunya, последовательность нуклеотидов, кодирующую капсид-Е3-Е2-6K-Е1 штамма LR2006 OPY-1 вируса Chikungunya, последовательность нуклеотидов, кодирующую Е3-Е2-6K-Е1 штамма ТС-83 вируса венесуэльского энцефалита лошадей, и последовательность нуклеотидов, кодирующую капсид-Е3-Е2-6K-Е1 штамма ТС-83 вируса венесуэльского энцефалита лошадей.

Касательно вируса Chikungunya, ниже представлена типичная последовательность нуклеотидов, кодирующая Е3-Е2-6K-Е1 (SEQ ID NO: 9):

Касательно вируса Chikungunya, ниже представлена другая типичная последовательность нуклеотидов, кодирующая Е3-Е2-6K-Е1 (SEQ ID NO: 10):

Касательно вируса Chikungunya, ниже представлена типичная последовательность нуклеотидов, кодирующая капсид-Е3-Е2-6K-Е1 (SEQ ID NO: 11):

Касательно вируса Chikungunya, ниже представлена другая типичная последовательность нуклеотидов, кодирующая капсид-Е3-Е2-6K-Е1 (SEQ ID NO: 12):

В одном воплощении настоящего изобретения предусмотрен вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, описанной выше, причем вектор необязательно содержит контролирующую экспрессию последовательность, операбельно связанную с молекулой нуклеиновой кислоты.

Примеры контролирующих экспрессию последовательностей включают, без ограничения, такие промоторы, как промотор CMV, промотор PL фага лямбда, промоторы lac, phoA и tac Ε. coli, ранний и поздний промоторы SV40 и промоторы ретровирусных LTRs.

Экспрессионный вектор может быть получен специалистом в указанной области на основании WO/2012/006180, все содержание которого включено сюда путем ссылки.

Примеры векторов, которые могут использоваться для экспрессии слитого белка из полипептида, происходящего из вируса Chikungunya (CHIKV), и полипептида антигена, включают вектор, представленный в виде вектора VLP_CHI 512 (SEQ ID NO: 23), содержащего полинуклеотид VLP CHIKV (SEQ ID NO: 28; соответствует аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 29); и вектора VLP_CHI 532 (SEQ ID NO: 24), содержащего полинуклеотид VLP CHIKV (SEQ ID NO: 30; соответствует аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 31).

Экспрессионный вектор может быть получен специалистом в указанной области на основании US 2012/0003266, все содержание которого включено сюда путем ссылки.

Примеры векторов, которые могут использоваться для экспрессии слитого белка из полипептида, происходящего из вируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEEV), и полипептида антигена, включают вектор, представленный в виде вектора VLP_VEEV VLP 518 (SEQ ID NO: 25), содержащего полинуклеотид VLP VEEV (SEQ ID NO: 32; соответствует аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 33); вектора VLP_VEEV VLP 519 (SEQ ID NO: 26), содержащего полинуклеотид VLP VEEV (SEQ ID NO: 34; соответствует последовательности, представленной в SEQ ID NO:35); и вектора VLP_VEEV VLP 538 (SEQ ID NO: 27), содержащего полинуклеотид VLP VEEV (SEQ ID NO: 36; соответствует последовательности, представленной в SEQ ID NO: 37).

В одном воплощении настоящего изобретения предусмотрена:

i) молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок из полипептида, происходящего из вируса Chikungunya (CHIKV), и полипептида, происходящего из TNF-α, которая состоит из последовательности нуклеотидов, представленной в SEQ ID NO: 13;

ii) молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок из полипептида, происходящего из вируса Chikungunya (CHIKV), и полипептида, происходящего из CD20, которая состоит из последовательности нуклеотидов, представленной в SEQ ID NO: 14;

iii) молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок из полипептида, происходящего из вируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEEV), и полипептида, происходящего из TNF-α, которая состоит из последовательности нуклеотидов, представленной в SEQ ID NO: 15;

iv) молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок из полипептида, происходящего из вируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEEV), и полипептида, происходящего из CD20, которая состоит из последовательности нуклеотидов, представленной в SEQ ID NO: 16; или

v) молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок из полипептида, происходящего из вируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEEV), и полипептида, происходящего из CTLA4, которая состоит из последовательности нуклеотидов, представленной в SEQ ID NO: 17.

В одном воплощении настоящего изобретения предусмотрены молекулы нуклеиновой кислоты, которые модифицированы из молекул нуклеиновой кислоты, имеющих нуклеотидные последовательности, представленные любыми из SEQ ID NOs: 13-17. У модифицированной молекулы нуклеиновой кислоты нуклеотидная последовательность может быть по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентична молекуле нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NOs: 13-17. К тому же модифицированная молекула нуклеиновой кислоты может быть представлена мутантом, у которого не более 10% аминокислот подверглись делеции, замене и/или вставке на основе молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NOs: 13-17.

3. Композиции

В третьем аспекте настоящего изобретения предусмотрены композиции, содержащие частицы, предусмотренные в первом аспекте настоящего изобретения, и/или молекулы нуклеиновой кислоты, предусмотренные во втором аспекте настоящего изобретения.

В одном воплощении настоящего изобретения предусмотрены композиции, содержащие вирусоподобные частицы вируса Chikungunya или вируса венесуэльского энцефалита лошадей, как описано выше, или молекулы нуклеиновой кислоты, как описано выше.

Композиции могут также содержать фармацевтически приемлемый носитель и/или адъювант. Примеры адъювантов включают, без ограничения, раствор Ribi (Sigma Adjuvant System, Sigma-Aldrich).

Фармацевтические композиции настоящего изобретения могут содержать один активный ингредиент или комбинацию из двух или нескольких активных ингредиентов, если только они не противоречат целям настоящего изобретения. Например, при комбинированной терапии можно использовать цитокины, в том числе хемокины, антитела к цитокинам типа антител против TNF (например, инфликсимаб, адалимумаб), антитела против VEGF (например, бевацизумаб и ранибизумаб), антагонисты рецепторов цитокинов типа антител против HER2 (например, трастузумаб), антитела против рецепторов EGF (например, цетуксимаб), аптамеры против VEGF (например, пегаптаниб) и такие иммуномодуляторы, как циклоспорин, такролимус, убенимекс.

При комбинировании нескольких активных ингредиентов соответствующее им содержимое можно надлежащим образом увеличивать или уменьшать с учетом их терапевтических эффектов и безопасности.

Термин "комбинация" в настоящем изобретении означает, что два или несколько активных ингредиентов вводятся пациенту одновременно в виде одного целого или одной дозы или же оба вводятся пациенту в виде отдельных единиц одновременно либо последовательно без особых ограничений по времени, причем такое введение обеспечивает терапевтически эффективные уровни обоих компонентов в организме, предпочтительно в одно и то же время.

В одном воплощении композиция представляет собой вакцинную композицию, включающую ДНК-вакцину. В одном воплощении ДНК-вакцина, предусмотренная настоящим изобретением, включает содержащий CpG олигонуклеотид.

4. Способ получения антител, способ иммуномодуляции, способ лечения аутоиммунных заболеваний, способ индуцирования и/или усиления иммунного ответа против антигена у млекопитающих, способ лечения рака, способ пассивной иммунизации, способ презентации антигена на макрофагах и способ получения частиц

В четвертом аспекте настоящего изобретения предусмотрен способ получения антител, включающий контакт с млекопитающими частиц, предусмотренных в первом аспекте настоящего изобретения, и/или молекул нуклеиновой кислоты, предусмотренных во втором аспекте настоящего изобретения.

Антитела, полученные в четвертом аспекте настоящего изобретения, могут быть подвергнуты гуманизации стандартными методами. Так, в одном воплощении способ, предусмотренный в четвертом аспекте настоящего изобретения, дополнительно включает стадию гуманизации антител, полученных из других млекопитающих.

Частицы, предусмотренные в первом аспекте настоящего изобретения, и/или молекулы нуклеиновой кислоты, предусмотренные во втором аспекте настоящего изобретения, можно вводить непосредственно пациенту, в пораженный орган или системно, либо применять ex vivo на клетках, полученных из пациента, или на линии клеток человека, которые затем вводятся пациенту, либо использовать in vitro для отбора субпопуляции из иммунных клеток типа В-клеток и Т-клеток, полученных от пациента, которые затем снова вводятся пациенту.

В соответствии с настоящим изобретением, вирусоподобные частицы могут применяться для иммунотерапии.

В пятом аспекте настоящего изобретения предусмотрен способ иммуномодуляции, способ лечения аутоиммунных заболеваний, способ индуцирования и/или усиления иммунного ответа против антигена у млекопитающих и способ лечения рака, включающий введение млекопитающим композиции, предусмотренной в третьем аспекте настоящего изобретения.

В шестом аспекте настоящего изобретения предусмотрен способ пассивной иммунизации, включающий введение млекопитающим антител, предусмотренных в четвертом аспекте настоящего изобретения.

В седьмом аспекте настоящего изобретения предусмотрен способ презентации антигена на макрофагах, включающий контакт с млекопитающими частиц, предусмотренных в первом аспекте настоящего изобретения, и/или молекул нуклеиновой кислоты, предусмотренных во втором аспекте настоящего изобретения.

В восьмом аспекте настоящего изобретения предусмотрен способ получения частиц, предусмотренных в первом аспекте настоящего изобретения, включающий получение гена, содержащего последовательность нуклеотидов, кодирующую указанные частицы; культивирование клеток, трансфецированных указанным геном, для экспрессии указанных частиц; и выделение указанных частиц.

В одном воплощении настоящего изобретения предусмотрен способ получения антител, включающий контакт с млекопитающими вирусоподобных частиц вируса Chikungunya или венесуэльского энцефалита лошадей, как описано выше, и/или молекул нуклеиновой кислоты, как описано выше. Полученные антитела могут представлять собой антитела, которые способны специфически связываться с антигеном, содержащимся в вирусоподобных частицах вируса Chikungunya или венесуэльского энцефалита лошадей, либо с антигеном, кодируемым молекулой нуклеиновой кислоты. Способ получения антител, предусмотренный настоящим изобретением, может применяться для получения моноклональных или поликлональных антител против антигена (например, TNFα, CD20 и CLTA4).

В одном воплощении антитела, полученные способом получения антител по настоящему изобретению, применяются для пассивной иммунизации. Способ пассивной иммунизации может включать введение полученных антител млекопитающим.

В соответствии с настоящим изобретением, композиции настоящего изобретения применимы для иммуномодуляции. Такая иммуномодуляции особенно подходит для лечения аутоиммунных заболеваний, неврологических заболеваний, воспалительных заболеваний типа воспалительных заболеваний легких, включая острый респираторный дистресс-синдром, хронические обструктивные заболевания легких и астму, связанных с ангиогенезом заболеваний, в том числе новообразований.

В одном предпочтительном воплощении иммуномодуляция, предусмотренная настоящим изобретением, заключается в индуцировании и/или усилении иммунного ответа против антигена у млекопитающих. Так, в одном воплощении настоящего изобретения предусмотрен способ индуцирования и/или усиления иммунного ответа против антигена у млекопитающих, включающий введение млекопитающим эффективного количества описанной выше композиции. Примеры млекопитающих включают, без ограничения, человека.

Поскольку многие антитела применимы для лечения заболеваний, то способ и композиции, предусмотренные настоящим изобретением, могут применяться для лечения заболеваний. Например, для лечения заболеваний, приведенных в таблице 1, применимы антитела, которые специфически связываются с мишенями, приведенными в таблице 1, либо антитела, которые связываются с эпитопами на мишенях, приведенных в таблице 1.

В одном воплощении по меньшей мере один антиген, который используется в настоящем изобретении, представляет собой по меньшей мере одну мишень, приведенную в табл. 1. Когда по меньшей мере один антиген, который используется в настоящем изобретении, представляет собой по меньшей мере одну мишень, приведенную в таблице 1, то частицы, выделенная нуклеиновая кислота, вектор, композиции и способы, предусмотренные настоящим изобретением, могут применяться для лечения заболевания или состояния, приведенного в табл. 1 (см. "Применение" в табл. 1).

Например, когда по меньшей мере один антиген, используемый в настоящем изобретении, представляет собой один или несколько раковых антигенов, то частицы, выделенная нуклеиновая кислота, вектор, композиции и способы, предусмотренные настоящим изобретением, могут применяться для лечения рака.

Примеры раковых антигенов включают, без ограничения, VEGF, рецептор фактора роста эпидермиса, CD33, CD20 и ErbB2. Когда композиция настоящего изобретения, содержащая один или несколько раковых антигенов, вводится млекопитающим, то антитела, направленные на два или несколько раковых антигенов, могут атаковать рак.

Например, когда по меньшей мере один антиген, используемый в настоящем изобретении, представляет собой β-амилоид, то выделенная нуклеиновая кислота, вектор, композиции и способы, предусмотренные настоящим изобретением, могут применяться для лечения болезни Альцгеймера.

Например, когда по меньшей мере один антиген, используемый в настоящем изобретении, представляет собой TNF-α, то выделенная нуклеиновая кислота, вектор, композиции и способы, предусмотренные настоящим изобретением, могут применяться для лечения воспаления; аутоиммунных заболеваний, включая ревматоидный артрит; псориаза, болезни Крона; язвенного колита и пр.

Например, когда по меньшей мере один антиген, используемый в настоящем изобретении, представляет собой CD20, то выделенная нуклеиновая кислота, вектор, композиции и способы, предусмотренные настоящим изобретением, могут применяться для лечения аутоиммунных заболеваний, включая ревматоидный артрит и SLE; рака, включая неходжкинскую лимфому, и пр.

Например, когда по меньшей мере один антиген, используемый в настоящем изобретении, представляет собой CTLA4, то выделенная нуклеиновая кислота, вектор, композиции и способы, предусмотренные настоящим изобретением, могут применяться для лечения рака, включая меланому; и применимы для активации Т-клеток и пр.

Учитывая симптомы пациентов, зараженных Chikungunya или венесуэльским энцефалитом лошадей, а также необычно большие молекулы вируса Chikingunya или венесуэльского энцефалита лошадей, такие VLP могут действовать эффективно и действенно воздействовать на макрофаги и их содержимое типа цитокинов и иммуномодуляторных соединений.

В одном аспекте настоящего изобретения предусмотрен способ презентации антигена на макрофагах, включающий введение млекопитающим вирусоподобных частиц вируса Chikungunya или венесуэльского энцефалита лошадей, описанных выше, и/или молекул нуклеиновой кислоты, описанных выше. Вирусоподобные частицы вируса Chikungunya или венесуэльского энцефалита лошадей, предусмотренные настоящим изобретением, являются хорошей мишенью для макрофагов. В одном воплощении вирусоподобные частицы вируса Chikungunya или венесуэльского энцефалита лошадей, предусмотренные настоящим изобретением, представляет собой своего рода систему доставки по меньшей мере одного антигена, содержащегося в вирусоподобных частицах вируса Chikungunya или венесуэльского энцефалита лошадей, к макрофагам.

В одном воплощении настоящего изобретения предусмотрен способ получения вирусоподобных частиц вируса Chikungunya или венесуэльского энцефалита лошадей, предусмотренных в первом аспекте настоящего изобретения, включающий получение гена, содержащего последовательность нуклеотидов, кодирующую указанные частицы; культивирование клеток, трансфецированных указанным геном, для экспрессии указанных частиц; и выделение указанных частиц. В этом воплощении трансфекция может проводиться стандартным методом. Клетки, используемые для трансфекции, могут быть представлены клетками 293. Выделение VLP может включать сбор кондиционированной среды после трансфецирования клеток плазмидой, содержащей ген, а также может включать очистку VLP из кондиционированной среды при помощи ультрацентрифугирования. В одном воплощении в способ получения вирусоподобных частиц вируса Chikungunya или венесуэльского энцефалита лошадей, предусмотренный в восьмом аспекте настоящего изобретения, может быть включена дополнительная стадия, в которой полинуклеотид, кодирующий антиген, составляется таким образом, чтобы пространственное расстояние между N-концевым остатком и С-концевым остатком антигена составляло 30Å или меньше (например, от 5Å до 15Å, от 5Å до 12Å, от 5Å до 11Å, от 5Å до 10Å, от 5Å до 8Å, от 8Å до 15Å, от 8Å до 13Å, от 8 Å до 12Å, от 8Å до 11Å, от 9Å до 12Å, от 9Å до 11Å, от 9Å до 10Å либо от 10Å до 11Å) при определении расстояния в кристаллах антигена или природного белка, содержащего антиген или модифицированный белок.

Иммунная система эволюционировала так, чтобы она распознавала чужеродные антигены для уничтожения таких патогенов, как вирусы или бактерии. Она также эволюционировала так, чтобы она не распознавала собственные белки для защиты собственных белков. Это называется системой иммунотолерантности. Именно поэтому трудно индуцировать антитела против собственных антигенов традиционными методами иммунизации. Для преодоления иммунотолерантности мы разработали новый способ вакцинации с использованием самосборочных субъединиц, содержащих собственный антиген. Самосборочная субъединица спонтанно собирается и образует устойчивую организованную единицу, которая презентирует сильно повторяющиеся антигены на поверхности. Иммуноген из сильно повторяющихся антигенов усиливает сигнальные пути в В-клетках и вызывает стимуляцию антительного ответа по сравнению с иммуногенами из одного антигена, как при традиционных методах иммунизации. Применение этого механизма для разработки вакцин не только усиливает антительные ответы против искомых иммуногенов, но и преодолевает толерантность к собственным антигенам.

Далее настоящее изобретение будет описано подробно на следующих примерах, которые, однако, не должны ограничивать объем настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Получение вирусоподобных частиц вируса Chikungunya, содержащих структурный полипептид вируса и фрагмент TNF-α человека

Ожидалось, что будет трудно стабильно экспрессировать мономер полипептида TNF-α, слитый со структурным полипептидом вируса Chikungunya, потому что в естественных условиях TNF-α встречается в виде тримера. Однако при использовании слитого белка, в котором пептид из мономера TNF-α (пептидный фрагмент мономера TNF-α) слит со структурным полипептидом вируса Chikungunya через линкеры на N- и С-концах полученного из TNF-α пептида для присоединения полученного из TNF-α пептида к структурному полипептиду вируса Chikungunya, происходит стабильная экспрессия вирусоподобных частиц вируса Chikungunya, содержащих структурный полипептид вируса и полученный из мономера TNF-α пептид.

Вкратце, полинуклеотид, кодирующий исходный TNF-α человека, подвергали модификации с тем, чтобы получить полинуклеотид, кодирующий модифицированный пептид, происходящий из TNF-α, в котором RTPSD, то есть N-концевую последовательность исходного пептида из TNF-α, заменяли на SGG и TRGGS и присоединяли к С-концу TNF-α (см. SEQ ID NOs: 18-20, как показано на фиг. 1). Полученный полинуклеотид вставляли между кодонами, кодирующими G в положении 519 и Q в положении 520 SEQ ID NO: 2, и конструировали плазмиду (которая в дальнейшем именуется CHIKV-TNFa4) для экспрессии вирусоподобных частиц вируса Chikungunya, у которых модифицированный пептид из TNF-α вставлен в Е2 структурного полипептида вируса Chikungunya (С-Е3-Е2-6K-Е1). После этого трансфецировали клетки 293F (1,5×10⁶ клеток/мл) с помощью 250 мкг CHIKV-TNFa4. После культивирования в течение 4 дней собирали супернатант. Полученный супернатант наслаивали на Opti Prep (Sigma DI556), а затем подвергали ультрацентрифугированию (20000 об/мин, 120 мин) с помощью ротора SW28 для концентрирования VLP (т.е. вирусоподобных частиц). После концентрирования смешивали VLP с Opti Prep, чтобы образовался градиент плотности, а затем подвергали ультрацентрифугированию (75000 об/мин, 4 ч) с помощью ротора NVT100. После ультрацентрифугирования собирали очищенные VLP. Экспрессию VLP, содержащих TNF-α, конъюгированный со структурным полипептидом вируса Chikungunya, проверяли методом вестерн-блота с помощью антитела, специфичного к CHIVK (АТСС: VR-1241AF), и антитела, специфичного к TNF-α (Cell Signal: #6945).

Пространственное расстояние между N-концевым остатком и C-концевым остатком происходящего из TNF-α пептида составило 8,27Å при определении расстояния на кристаллах TNF-α.

Пример 2. Получение вирусоподобных частиц вируса венесуэльского энцефалита лошадей, содержащих структурный полипептид вируса и пептид, происходящий из TNF-α человека (которые именуются "VLPs VEEV-TNFa")

В соответствии с вышеописанным примером 1 получали полинуклеотид, кодирующий модифицированный пептид, происходящий из TNF-α, слитый с полинуклеотидом, кодирующим структурный полипептид вируса венесуэльского энцефалита лошадей (см. SEQ ID NO: 15), и конструировали экспрессионный вектор, с помощью которого затем трансфецировали клетки 293F.

VLPs VEEV-TNFa очищали центрифугированием в градиенте плотности. Как видно из дорожки 4, экспрессия происходящего из TNF-α пептида и VEEV подтверждается методом вестерн-блота с помощью моноклонального антитела к TNF-α (верхняя панель) и поликлональных антител к VEEV (нижняя панель), соответственно (см. фиг. 2).

Пространственное расстояние между N-концевым остатком и С-концевым остатком происходящего из TNF-α пептида составило 8,27Å при определении расстояния на кристаллах TNF-α.

Пример 3. Детектирование антител против TNF-α человека у иммунизированных мышей

Мышей разбивали на три группы (n=5 для каждой группы). Каждой группе мышей внутримышечно вводили вирусоподобные частицы вируса Chikungunya, содержащие структурный полипептид вируса и полипептид, происходящий из TNF-α человека, полученные в соответствии с примером 1 (ниже они обозначены как "CHIKV-TNF-α"), вирусоподобные частицы вируса Chikungunya, не содержащие полипептида, происходящего из TNF-α человека (ниже они обозначены как "CHIKV-VLP"), вирусоподобные частицы вируса венесуэльского энцефалита лошадей, содержащие структурный полипептид вируса и полипептид, происходящий из TNF-α человека, полученные в соответствии с примером 2 (ниже они обозначены как "VEEV-TNF-α"), вирусоподобные частицы вируса венесуэльского энцефалита лошадей, не содержащие полипептида, происходящего из TNF-α человека (ниже они обозначены как "VEEV-VLP"), или носитель (т.е. PBS). В начале эксперимента (что обозначено ниже как " недель") и через три недели после первого введения (что обозначено ниже как "3 недели") мышам вводили, как описано ниже: группа 1: VEEV-TNF-α (0 недель), CHIKV-TNF-α (3 недели); группа 2: VEEV-VLP (0 недель), CHIKV-VLP (3 недели); и группа 3: PBS (0 недель), PBS (3 недели).

Через 6 недель после начала эксперимента у каждой мыши брали образцы крови и получали сыворотку. Вырабатываемые антитела против TNF-α человека детектировали методом ELISA, при этом на планшете для ELISA фиксировали белок TNF-α. Результаты показали, что вирусоподобные частицы, содержащие структурный полипептид вируса и полипептид, происходящий из TNF-α человека, индуцировали антитела против TNF-α человека у мышей (см. фиг. 9).

Пример 4. Получение вирусоподобных частиц вируса венесуэльского энцефалита лошадей, содержащих структурный полипептид вируса и фрагмент CD20 человека

В соответствии с вышеописанными примерами 1 и 2, выделяли VLPs VEEV-CD20 методом центрифугирования в градиенте плотности и проверяли экспрессию фрагмента CD20 и VEEV методом вестерн-блота. В качестве антигена использовали слитый со структурным полипептидом вируса венесуэльского энцефалита лошадей пептид IYNCEPANPSEKNSPSTQYCYSIQ (SEQ ID NO: 21), который является фрагментом CD20.

Пространственное расстояние между N-концевым остатком и C-концевым остатком фрагмента CD20 составило 10,07Å при определении расстояния на кристаллах CD20.

Пример 5. Получение вирусоподобных частиц вируса венесуэльского энцефалита лошадей, содержащих структурный полипептид вируса и фрагмент CTLA4 человека

Фрагмент CTLA4: CKVELMYPPPYYLGIG (SEQ ID NO: 22) был выбран на основе полноразмерной аминокислотной последовательности CTLA4 так, чтобы пространственное расстояние между N-концевым остатком и C-концевым остатком у фрагмента, который подвергался слиянию со структурным полипептидом Е2 вируса венесуэльского энцефалита лошадей, составляло 5,6Å при определении расстояния на кристаллах CLTA4.

Полинуклеотид, кодирующий фрагмент CTLA4, вводили в вектор VLP_VEEV VLP 518 и конструировали плазмиду для экспрессии фрагмента CTLA4, слитого со структурным полипептидом вируса венесуэльского энцефалита лошадей, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8.

Пример 6. Получение вирусоподобных частиц вируса венесуэльского энцефалита лошадей, содержащих структурный полипептид вируса и полноразмерный CTLA4 человека

Полинуклеотид, кодирующий полноразмерный CTLA4 человека, вводили в вектор VLP_VEEV VLP 518 и конструировали плазмиду для экспрессии CTLA4, слитого со структурным полипептидом вируса венесуэльского энцефалита лошадей.

Пространственное расстояние между N-концевым остатком и C-концевым остатком полноразмерного CTLA4 человека составило около 39,6Å при определении расстояния на кристаллах CTLA4.

Экспрессия CTLA4, слитого со структурным полипептидом вируса венесуэльского энцефалита лошадей, не обнаруживалась методом ELISA после трансфекции клеток 293 полученной плазмидой.

Пример 7. Получение вирусоподобных частиц вируса Chikungunya, содержащих структурный полипептид вируса и фрагмент CD20 человека или мыши, и детектирование антител против CD20 человека или мыши

Вирусоподобные частицы вируса Chikungunya, содержащие структурный полипептид вируса и фрагмент CD20 человека или мыши, получали с помощью вектора VLP_CHI 532 и фрагментов антител к TNF-α человека или мыши. Фрагменты антител к TNF-α человека и мыши таковы:

CD20 человека: iyncepanpseknspstqycysiq (SEQ ID NO: 21);

CD20 мыши: dcepsnsseknspstqycnsi (SEQ ID NO: 41).

Для вставки фрагмента CD20 между G в положении 519 и Q в положении 520 SEQ ID NO: 2 использовали следующие линкеры (например, SGG, SG, GS или GGS):

CD20 человека: SGGiyncepanpseknspstqycysiqGS (SEQ ID NO: 42);

CD20 мыши, версия 2: SGydcepsnsseknspstqycnsiGGS (SEQ ID NO: 43);

CD20 мыши, версия 3: SGGydcepsnsseknspstqycnsiGS (SEQ ID NO: 44).

Для экспрессии вирусоподобных частиц вируса Chikungunya, содержащих структурный полипептид вируса и фрагмент CD20 человека или мыши, использовали плазмиды: VLP_CHI VLP 532 CD20H (SEQ ID NO: 45; аминокислотная последовательность экспрессируемого полипептида представлена SEQ ID NO: 46), VLP_CHI VLP 532 CD20-2 mouse (SEQ ID NO: 47; аминокислотная последовательность экспрессируемого полипептида представлена SEQ ID NO: 48) и VLP_CHI VLP 532 CD20-3 mouse (SEQ ID NO: 49; аминокислотная последовательность экспрессируемого полипептида представлена SEQ ID NO: 50).

Вирусоподобные частицы очищали по методике, описанной в примере 1. Мышей иммунизировали один раз с помощью 100 мкг очищенных VLPs; 100 мкг фрагмента CD20 человека или мыши; либо PBS (контроль). Через десять дней после иммунизации у мышей брали образцы крови и получали сыворотку. Антитела против CD20 человека, индуцированные иммунизацией, детектировали методом ELISA при фиксации фрагмента CD20 человека, а антитела против CD20 мыши, индуцированные иммунизацией, детектировали методом ELISA при фиксации фрагмента CD20 мыши. Результаты показали, что при введении вирусоподобных частиц вируса Chikungunya, содержащих фрагмент CD20 человека или мыши, слитый со структурным полипептидом вируса, адекватно индуцируются антитела против CD20 человека и антитела против CD20 мыши. Также результаты показали, что при введении вирусоподобных частиц вируса Chikungunya, содержащих фрагмент собственного антигена, слитый со структурным полипептидом вируса, могут адекватно индуцироваться антитела, специфичные к собственному антигену (см. фиг. 10 и фиг. 11).

Изобретение относится к биотехнологии. Описана вирусоподобная частица для индуцирования и/или усиления иммунного ответа против антигена у млекопитающих, содержащая структурный полипептид вируса и по меньшей мере один антиген, в которой структурный полипептид вируса содержит по меньшей мере один первый сайт прикрепления, по меньшей мере один антиген содержит по меньшей мере один второй сайт прикрепления, структурный полипептид вируса и антиген соединяются через по меньшей мере один первый и по меньшей мере один второй сайт прикрепления, и структурный полипептид вируса получен из вируса Chikungunya (CHIKV) или вируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEEV), в которой антиген не происходит из вируса CHIKV или вируса VEEV. Изобретение расширяет арсенал иммунологических средств. 8 з.п. ф-лы, 11 ил., 1 табл., 7 пр.

1. Вирусоподобная частица для индуцирования и/или усиления иммунного ответа против антигена у млекопитающих, содержащая структурный полипептид вируса и по меньшей мере один антиген, в которой структурный полипептид вируса содержит по меньшей мере один первый сайт прикрепления, по меньшей мере один антиген содержит по меньшей мере один второй сайт прикрепления, структурный полипептид вируса и антиген соединяются через по меньшей мере один первый и по меньшей мере один второй сайт прикрепления и структурный полипептид вируса получен из вируса Chikungunya (CHIKV) или вируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEEV), в которой антиген не происходит из вируса CHIKV или вируса VEEV.

2. Вирусоподобная частица по п. 1, в которой структурный полипептид вируса получен из вируса Chikungunya (CHIKV).

3. Вирусоподобная частица по п. 1, в которой по меньшей мере один антиген вставлен в белок оболочки E2.

4. Вирусоподобная частица по п. 1, в которой по меньшей мере один антиген выбран из раковых антигенов.

5. Вирусоподобная частица по п. 1, в которой антиген представляет собой полипептид, происходящий из CTLA4, CD20 или TNF-α.

6. Вирусоподобная частица по п. 1, в которой вирусный структурный полипептид и по меньшей мере один антиген представляют собой:

i) вирусный структурный полипептид, происходящий из вируса Chikungunya (CHIKV), и полипептид CTLA4;

ii) вирусный структурный полипептид, происходящий из вируса Chikungunya (CHIKV), и полипептид CD20;

iii) вирусный структурный полипептид, происходящий из вируса Chikungunya (CHIKV), и полипептид TNF-α;

iv) вирусный структурный полипептид, происходящий из вируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEEV), и полипептид CTLA4;

v) вирусный структурный полипептид, происходящий из вируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEEV), и полипептид CD20 или

vi) вирусный структурный полипептид, происходящий из вируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEEV), и полипептид TNF-α.

7. Вирусоподобная частица по п. 1, в которой по меньшей мере один антиген и полипептид экспрессируются в виде слитого белка.

8. Вирусоподобная частица по п. 1, в которой по меньшей мере один антиген сливается с полипептидом так, что между N-концевым остатком антигена и полипептидом и/или между C-концевым остатком антигена и полипептидом располагаются один или два линкера.

9. Вирусоподобная частица по п. 1, в которой по меньшей мере один антиген вставлен между остатками 519 и 520 в SEQ ID NO: 1 или 2, между остатками 530 и 531 в SEQ ID NO: 1 или 2, между остатками 531 и 532 в SEQ ID NO: 1 или 2 либо между остатками 532 и 533 в SEQ ID NO: 1 или 2.