ЧАСТИЦА РЕПЛИКОНА АЛЬФАВИРУСА Российский патент 2023 года по МПК C12N15/86 C12N7/01 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к частице репликона на основе альфавируса, которую можно применять в качестве системы доставки генов.

Уровень техники

Генная терапия предназначена для введения генетического материала в клетки для компенсации аномальных генов или создания полезного белка. Если мутировавший ген вызывает сбой в работе или утрату необходимого белка, то генная терапия может обеспечить нормальную копию гена для восстановления функции белка.

Генотерапия представляет собой новую область в медицинских и фармацевтических науках из-за своего потенциала в лечении хронических заболеваний, таких как рак, вирусных инфекций, инфаркта миокарда, генетических расстройств и т.п.

Ген, который вставляют непосредственно в клетку, обычно не функционирует. Вместо этого, для доставки гена генетически конструируют носитель, называемый вектором. В качестве векторов часто применяют определенные вирусы, потому что они могут доставлять новый ген путем заражения клетки. Такие вирусы представляет собой модифицированные вирусы, поэтому они не способны вызывать заболевания при применении у людей. Некоторые типы вирусов, такие как ретровирусы, интегрируют свой генетический материал (включая новый ген) в хромосому в клетке человека. Другие вирусы, такие как аденовирусы, вводят свой ген в ядро клетки, но ген не интегрируется в хромосому.

Вектор может быть введен непосредственно в конкретную ткань, где его поглощают индивидуальные клетки, или его вводят внутривенно (в/в) в организм. Альтернативно, образец клеток пациента может быть извлечен и подвергнут воздействию вектора в лабораторных условиях. Клетки, включившие вектор, затем возвращают пациенту. Если лечение будет успешным, то новый ген, доставляемый вектором, сделает функционирующий белок. (https://ghr.nlm.nih.gov/primer/therapy/procedures, Int J Pharm Investig. 2013 Jan-Mar; 3(1): 1-7.)

Альфавирусы включают набор генетически, структурно и серологически связанных вирусов, переносимых комарами семейства Togaviridae. Альфавирусы включают вирус восточного конского энцефалита (EEEV), вирус венесуэльского конского энцефалита (VEEV), вирус Эверглейдс, вирус Мукамбо, вирус Пиксуна, вирус западного конского энцефалита (WEEV), вирус Синдбис, вирус леса Семлики, вирус Мидлберга, вирус Чикунгунья (CHIKV), вирус о'Нъонг-нъонг, вирус Росс-Ривер, вирус леса Барма, вирус Гета, вирус Сагияма, вирус Бебару, вирус Майаро, вирус Уна, аура-вирус, вирус Ватароа, вирус Бабанки, вирус Кизилагача, вирус Хайлендс Джи, вирус Форт-Моргана, вирус Ндуму и вирус Багги-Крик. Структурные субъединицы, включающие единственный вирусный белок, капсид, связываются с РНК-геномом в икосаэдрический нуклеокапсид. В вирионе капсид окружен липидной оболочкой, покрытой регулярным массивом трансмембранных белковых шипов, каждый из которых состоит из гетеродимерного комплекса из двух гликопротеинов, E1 и E2.

Частица репликона альфавируса (ARP) продуцируется в клетках или культурах и включает «репликон», который может экспрессировать не принадлежащие альфавирусу гены в оболочке вириона, включая структурные белки альфавируса и мембранный липид.

Частицы репликона альфавируса описаны в патенте США №7,045,335, WO 2004/085660 и в работе Virology 239, 389-401, 1997. Процессы их получения описаны в патенте США №7,078,218, содержание документов, цитируемых в этом параграфе, включено посредством отсылки.

Клиническое применение генной терапии все еще ограничено из-за отсутствия подходящих методов правильного введения генов в клетки, и, следовательно, эта область представляет интерес для многих исследователей. Для достижения успешной генной терапии разработка правильных систем доставки генов может представлять собой один из наиболее важных факторов (Int. J Pharm Investig. 2013 Jan-Mar; 3(1): 1-7).

Список цитирования

Патентная литература

PTL 1: Патент США № 7,045,335

PTL 2: WO2004/085660

PTL 3: Патент США № 7,078,218

Непатентная литература

NPL 1: Int J Pharm Investig. 2013 Jan-Mar; 3(1): 1-7

NPL 2: Virology 239, 389-401, 1997

Раскрытие изобретения

Настоящее изобретение относится к системе доставки генов, включающей улучшенную частицу репликона альфавируса.

В одном из аспектов, частица репликона альфавируса (ARP), которая включает

(i) структурные белки альфавируса, включающие капсид и/или оболочку, и

(ii) репликон альфавируса, включающий полинуклеотид, кодирующий неструктурные белки альфавируса nsp1, nsp2, nsp3 и nsp4 и, по меньшей мере, один представляющий интерес ген

в которой, по меньшей мере, один из капсида, E3 и E2 в оболочке содержит одно или несколько аминокислотных изменений, но E1 в оболочке не содержит аминокислотных изменений.

В одном из аспектов, изобретение относится к ARP, в которой структурный белок вируса имеет одно или несколько изменений в сигнале ядерной локализации (NLS) капсидного белка альфавируса.

В одном из аспектов, капсидный белок альфавируса представляет собой капсидный белок вируса EEEV, WEEV, VEEV, CHIKV, вируса Росс-Ривер или вируса леса Бармах. В различных воплощениях вышеупомянутых аспектов или любого другого аспекта изобретения, описанного в настоящем документе, одно или несколько изменений находятся в NLS в аминокислотах 67-70 капсидного белка EEEV; в аминокислотах 67-70 капсидного белка WEEV; в аминокислотах 64-68 капсидного белка VEEV; в аминокислотах 62-69 капсидного белка CHIKV; в аминокислотах 71-74 капсидного белка вируса Росс-Ривер; или в аминокислотах 64-68 капсидного белка вируса леса Бармах.

В различных воплощениях вышеуказанных аспектов или любого другого аспекта изобретения, описанного в настоящем документе, изменение представляет собой замену заряженной аминокислоты NLS или основной заряженной аминокислоты NLS. В некоторых воплощениях, заряженная аминокислота или основная заряженная аминокислота представляет собой лизин или аргинин. В определенных воплощениях, лизин или аргинин замещают аминокислотами, не представляющими собой лизин или аргинин. В конкретных воплощениях, лизин или аргинин замещают аспарагином или аланином.

В различных воплощениях вышеуказанных аспектов или любого другого аспекта изобретения, описанных в настоящем документе, капсидный белок NLS вируса EEEV изменяют в положении аминокислоты 67. В конкретных воплощениях, капсидный белок NLS вируса EEEV имеет замену K67N.

В различных воплощениях вышеуказанных аспектов или любого другого аспекта изобретения, описанного в настоящем документе, капсидный белок NLS вируса WEEV изменяют в одном или нескольких положениях аминокислот 67, 68 и 69. В конкретных воплощениях, капсидный белок NLS WEEV включает K67N, K68N и/или K69N.

В различных воплощениях вышеуказанных аспектов или любого другого аспекта изобретения, описанного в настоящем документе, капсидный белок NLS VEEV изменяют в одном или нескольких положениях аминокислот 64, 65 и 67. В конкретных воплощениях, капсидный белок NLS вируса VEEV включает K64N, K65A или K65N и/или K67A или K67N.

В различных воплощениях вышеуказанных аспектов или любого другого аспекта изобретения, описанного в настоящем документе, капсидный белок NLS вируса Росс-Ривер изменяют в одном или нескольких положениях аминокислот 71, 72, 73 и 74. В конкретных воплощениях, капсидный белок NLS вируса Росс-Ривер включает R71N, R72N, R73N и/или R74N.

В различных воплощениях вышеуказанных аспектов или любого другого аспекта изобретения, описанного в настоящем документе, капсидный белок NLS вируса леса Бармах изменяют в одном или нескольких положениях аминокислот 64, 65, 67 и 68. В конкретных воплощениях, капсидный белок NLS вируса леса Бармах включает K64A, K65A или K65N, K67A, K67N, K68A и/или K68N.

Изменение в капсидном NLS подробно описано в патентных публикациях США №№ 2014-170186 или 2017-073377. Содержание этих публикаций включено в настоящий документ посредством отсылки.

В одном из аспектов, белок альфавируса E2 может иметь остаток, не представляющий собой лизин (например, аспарагин) в положении аминокислоты, соответствующем аминокислоте 234 в белке E2 CHIKV, и/или модификацию в положении аминокислоты, соответствующем аминокислоте 251 в белке E2 CHIKV, которая дестабилизирует белок E2 во время отпочковывания вируса из клеточной мембраны (баддинг).

В одном из аспектов, белок альфавируса E3 может включать изменение/мутацию в аминокислотной последовательности в сайте расщепления фурином (Arg-X-X-Arg).

Термин «Arg-X-X-Arg» обозначает минимальный сайт расщепления фурином, а «X-X» включает любую комбинацию двух аминокислот. Пример изменения аминокислотной последовательности в сайте расщепления фурином включает изменение Ile-Glu/Asp-Gly-Arg, Asp-Asp-Asp-Asp-Lys или Ser-Gly-Gly-Gly-Ser. Подробности, касающиеся изменения сайта расщепления фурином, описаны в патентных публикациях США №№ 2016-0040134 и 2016-0200775 (цитированные документы включены в настоящий документ посредством отсылки).

Например, штамм CT83 VEEV имеет сайт расщепления фурином RKRR в конце своей области E3, и RKRR может быть заменен SGGGS.

Согласно настоящему изобретению, репликон альфавируса включает нуклеотид, кодирующий неструктурные белки альфавируса nsp1, nsp2, nsp3 и nsp4, и, по меньшей мере, один представляющий интерес ген. Неструктурные белки альфавируса могут представлять собой белки, полученные из того же альфавируса, из которого были получены структурные белки. Неструктурные белки альфавируса могут представлять собой белки, полученные из альфавируса, отличного от альфавируса, из которого получены структурные белки (химерная частица репликона альфавируса).

Например, в соответствии с настоящим изобретением могут быть обеспечены ARP, включающая структурные белки альфавируса, полученные из CHIKV, и репликон альфавируса, включающий нуклеотиды, кодирующие nsp1, nsp2, nsp3 и nsp4 VEEV, и представляющий интерес ген

В одном из аспектов, настоящее изобретение обеспечивает частицу репликона альфавируса (ARP), которая включает

(i) структурные белки CHIKV, включающие капсид и/или оболочку, и

(ii) репликон VEEV, включающий полинуклеотид, кодирующий неструктурные белки nsp1, nsp2, nsp3 и nsp4 VEEV, и, по меньшей мере, один представляющий интерес ген.

Представляющий интерес ген может быть выбран из широкого ряда последовательностей, полученных из любого желаемого источника, например, вирусов, прокариот, эукариот, архей. Примеры категорий представляющих интерес генов включают, например, иммуногены, включая антигенные белки, цитокины, токсины, терапевтические белки, ферменты, антисмысловые последовательности и модуляторы иммунного ответа.

В другом аспекте, изобретение обеспечивает способ получения частиц репликона альфавируса, включающий стадии котрансфекции клеток с

i) вектором, включающим полинуклеотид, кодирующий неструктурный белок альфавируса nsp1, nsp2, nsp3 и nsp4, и, по меньшей мере, один представляющий интерес ген,

ii) вектором, включающим полинуклеотид, кодирующий белок капсида альфавируса, и

iii) вектором, включающим полинуклеотид, кодирующий E3-E2-6K-E1 альфавируса,

в которой, по меньшей мере, один из капсида, E3 и E2 включает одно или несколько аминокислотных изменений, но E1 не включает аминокислотных изменений,

культивирования трансфицированных клеток, и

очистки ARP из клеточной культуры.

Обычно нуклеотиды, кодирующие структурные белки альфавируса, включают нуклеотиды, кодирующие E1, E2, 6k и E3. При экспрессии структурных белков вируса дикого типа 6K и E3 естественным образом расщепляются в процессе сборки и удаляются из ARP. Зрелые ARP дикого типа могут содержать капсидные белки, белки E1 и E2. Если вводят одно или несколько изменений аминокислотных последовательностей, например, в сайт расщепления фурином белка E3, то E3 может не расщепляться и сохраняться в ARP. В настоящем описании и формуле изобретения термин «вирусные структурные белки» относится не только к белкам, которые имеют 6k и/или E3, но также к тем, которые не имеют 6K и/или E3.

Типичные ARP, в которых альфавирус представляет собой CHIKV или VEEV, проиллюстрированы на фиг. 1.

В одном из аспектов, настоящее изобретение обеспечивает химерную частицу репликона альфавируса,

(i) структурные белки CHIKV, включающие капсид и/или оболочку, и

(ii) репликон VEEV, включающий полинуклеотид, кодирующий неструктурные белки nsp1, nsp2, nsp3 и nsp4 из VEEV, и, по меньшей мере, один представляющий интерес ген.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 показывает схематический протокол для получения ARP.

Фиг. 2 показывает конструкцию частицы репликона VEEV.

Фиг. 3 показывает вектор VEEV_pBR322_NLuc.

Фиг. 4 показывает вектор TC83_CMV_CAwt_хелпер 1p.

Фиг. 5 показывает вектор TC83_CMV_CAmut_хелпер 1P.

Фиг. 6 показывает вектор TC83_CMV_WTgp_хелпер 2P.

Фиг. 7 показывает вектор TC83_CMV_E3gp_хелпер 2P.

Фиг. 8 схематически показывает протокол для определения способности упаковки VEEV-репликона в VEE VRP.

Фиг. 9 показывает результаты теста, приведенные на фиг. 8.

Фиг. 10 показывает включение сайта множественного клонирования в конструкцию частицы репликона VEEV.

Фиг. 11 показывает вектор VEEV_pBR322_MCS_NLuc_Предполагаемый.

Фиг. 12 показывает результат вестерн-блоттинга очищенных частиц репликона вируса VEE.

Фиг. 13 показывает вестерн-блоттинг клеток, инфицированных VRP, включающих нуклеотид, кодирующий IKK. Дорожка 1, клетки, инфицированные VRP, дорожка 2, клетки, трансфицированные плазмидным вектором IKK (положительный контроль).

Фиг. 14 показывает вестерн-блоттинг клеток, инфицированных VRP, включающих нуклеотид, кодирующий JNK2.

Фиг. 15 показывает результаты люциферазного анализа клеток, инфицированных VRP, включающих ген, кодирующий люциферазу.

Фиг. 16 показывает экспрессию GFP в клетках, инфицированных VRP, включающих ген, кодирующий GFP.

Фиг. 17 показывает экспрессию GFP в клетках поляризованных макрофагов М2, инфицированных VRP, включающих ген, кодирующий GFP.

Фиг. 18 схематически показывает протокол по примеру 9.

Фиг. 19 показывает результаты по примеру 9.

Фиг. 20 показывает вестерн-блоттинг очищенных химерных ARP, полученных из структурных белков CHIKV и репликона VEEV.

Фиг. 21 показывает FACS-анализ клеток, инфицированных ARPS по фиг. 20.

Описание воплощений

Определения

Примененный в настоящем документе термин «альфавирус» относится к РНК-содержащим вирусам, которые относятся к семейству вирусов Togaviridae. Типичные вирусы Togaviridae включают, без ограничений, вирус восточного конского энцефалита (EEEV), вирус венесуэльского конского энцефалита (VEEV), вирус Эверглейдс, вирус Мукамбо, вирус Пиксуна, вирус западного конского энцефалита (WEEV), вирус Синдбис, вирус леса Семлики, вирус Мидлбург, вирус Чикунгунья (CHIKV), вирус о'Нъонг-нъонг, вирус Росс-Ривер, вирус леса Барма, вирус Гета, вирус Сагияма, вирус Бебару, вирус Майаро, вирус Уна, аура-вирус, вирус Ватароа, вирус Бабанки, вирус Кизилагача, вирус Хайлендс Джи, вирус Форт-Моргана, вирус Ндуму и вирус Багги-Крик и вирус Окельбо.

Под «структурным белком альфавируса» подразумевают полипептид или его фрагмент, имеющий, по меньшей мере, примерно 80% идентичности аминокислотной последовательности с природным вирусным капсидом или белком оболочки. В одном из воплощений, структурный белок альфавируса имеет, по меньшей мере, примерно 85%, 90%, 95% или более идентичность аминокислотной последовательности с вирусом восточного конского энцефалита (EEEV), вирусом венесуэльского конского энцефалита (VEEV), вирусом Эверглейдс, вирусом Мукамбо, вирусом Пиксуна, вирусом западного конского энцефалита (WEEV), вирусом Синдбис, вирусом леса Семлики, вирусом Мидлбурга, вирусом Чикунгунья (CHIKV), вирусом о'Нъонг-нъонг, вирусом Росс-Ривер, вирусом леса Барма, вирусом Гета, вирусом Сагияма, вирусом Бебару, вирусом Майаро, вирусом Уна, аура-вирусом, вирусом Ватароа, вирусом Бабанки, вирусом Кизилагача, вирусом Хайлендс Джи, вирусом Форт-Моргана, вирусом Ндуму и вирусом Багги-Крик. Аминокислотные последовательности дикого типа структурных белков альфавируса можно получить в GenBank.

В конкретных воплощениях, альфавирус представляет собой штамм CHIKV, например, штамм CHIKV 37997 или LR2006 OPY-1. В других воплощениях, альфавирус представляет собой VEEV, например, VEEV штамм TC-83.

Под «репликоном альфавируса» понимают молекулу РНК, которая может направлять свою собственную амплификацию in vivo в клетке-мишени. Репликон кодирует полимеразу(полимеразы), которая(которые) катализирует(катализируют) амплификацию РНК (nspl, nsp2, nsp3, nsp4) и содержит последовательности цис-РНК, необходимые для репликации, которые распознаются и применяются кодируемой полимеразой (кодируемыми полимеразами). Репликон альфавируса обычно содержит следующие упорядоченные элементы: 5'-UTR, последовательности, которые кодируют неструктурные белки альфавируса (nspl, nsp2, nsp3, nsp4), 3'-UTR и сигнал поли-A. Репликон альфавируса также содержит один или несколько вирусных субгеномных промоторов, направляющих экспрессию представляющего интерес гена. Эти последовательности могут иметь одну или несколько мутаций, описанных в предшествующем уровне техники.

Под «частицей репликона альфавируса» (ARP) понимают репликон альфавируса, упакованный со структурными белками альфавируса. ARP не содержит полинуклеотидов, кодирующих какие-либо структурные белки альфавируса.

Под термином «агент» понимают любое низкомолекулярное химическое соединение, антитело, молекулу нуклеиновой кислоты или полипептид или их фрагменты.

Как применен в настоящем документе, термин «адъювант» предназначен для обозначения соединения, которое при применении в комбинации со специфическим иммуногеном в композиции будет усиливать, изменять или модифицировать результирующий иммунный ответ. В определенных воплощениях, адъювант применяют в комбинации с ARP. Модификация иммунного ответа включает в себя усиление или расширение специфичности антител или клеточных иммунных ответов. Модификация иммунного ответа также может означать уменьшение или подавление определенных антигенспецифических иммунных ответов. В одном из воплощений адъювант представляет собой адъювант Риби.

Под «улучшением» подразумевают снижение, подавление, ослабление, уменьшение, остановку или стабилизацию развития или прогрессирования заболевания или его симптома.

Под «изменением» подразумевают изменение аминокислоты или нуклеотида в указанном положении по отношению к полипептидной последовательности или полинуклеотидной последовательности. Как применено в настоящем документе, изменение включает замену, делецию или вставку аминокислоты или нуклеотида в указанное положение полипептида или полинуклеотида. В некоторых воплощениях изменение сигнала ядерной локализации капсидного белка альфавируса включает замену заряженной аминокислоты (например, лизина или аргинина) незаряженной аминокислотой (например, аланином или аспарагином или любой аминокислотой, кроме основной заряженной аминокислоты, такой как лизин или аргинин).

Под «изменением» подразумевают изменение (увеличение или уменьшение) по отношению к уровням экспрессии или активности гена или полипептида, которые обнаруживают стандартными известными в данной области способами, такими как описанные в настоящем документе. Как применено в данном документе, изменение включает в себя изменение уровня экспрессии на 10%, 25%, 50%, 75%, 100% или более. Изменение включает 10-, 20-, 50-, 70-, 80-, 90-, 100-, 200-, 500-, 1000-кратное или большее изменение уровней экспрессии.

Под «аналогом» понимают молекулу, которая не идентична, но имеет аналогичные функциональные или структурные особенности. Например, аналог полипептида сохраняет биологическую активность соответствующего встречающегося в природе полипептида, в то же время имеет определенные биохимические модификации, которые усиливают функцию аналога по сравнению с встречающимся в природе полипептидом. Такие биохимические модификации могут увеличивать устойчивость аналога к протеазе, трансмембранный перенос или период полураспада без изменения, например, связывания лиганда. Аналог может включать неприродную аминокислоту.

В этом раскрытии термины «включает», «включающий», «содержащий» и «имеющий» и им подобные могут иметь значение, приписываемое им в Патентном законе США, и могут означать «включает», «включающий» и тому подобное; термины «состоящий по существу из» или «состоящий по существу» аналогичным образом имеют значение, указанное в Патентном законе США, и термин представляет собой открытый термин, что допускает наличие большего, чем то, что указано, при условии, что основные или новые характеристики того, о чем говорится, не изменяются при наличии большего, чем то, что указано, но исключают воплощения предшествующего уровня техники.

Термин «обнаружение» относится к идентификации наличия, отсутствия или количества определяемого аналита.

Под «заболеванием» понимают любое состояние или расстройство, которое повреждает или нарушает нормальное функционирование клетки, ткани или органа.

Под «эффективным количеством» подразумевают количество средства, необходимое для ослабления симптомов заболевания по сравнению с пациентом, не получавшим лечения. Эффективное количество активного соединения(соединений), применяемого(применяемых) на практике настоящего изобретения для профилактики или лечения заболевания, варьируют в зависимости от способа введения, возраста, массы тела и общего состояния здоровья субъекта. В конечном итоге, лечащий врач или ветеринар определит подходящее количество и режим дозирования. Такое количество называется «эффективным» количеством.

Термин «фрагмент» подразумевает часть молекулы полипептида или нуклеиновой кислоты. Эта часть содержит, предпочтительно, по меньшей мере, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% всей длины эталонной молекулы нуклеиновой кислоты или полипептида. Фрагмент может содержать 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 или 1000 нуклеотидов или аминокислот.

Под «маркером» подразумевают любой белок или полинуклеотид, имеющий изменение в уровне экспрессии или активности, которое связано с заболеванием или расстройством.

Как применен в настоящем документе, «сигнал ядерной локализации» или «NLS» представляет собой аминокислотную последовательность, которая, если присутствует на поверхности полипептида, направляет полипептид к ядру клетки. Последовательности NLS известны в данной области техники. Смотри, например, Goldfarb, D. and N. Michaud (1991) Trends Cell Biol. 1, 20-24; Gorlich, D., and I. W. Mattaj (1996) Science 271, 1513-1518). В одном из воплощений, NLS включает одну или несколько коротких последовательностей положительно заряженных аминокислот, таких как лизины или аргинины. Консенсусные последовательности для NLS включают KK/RXK/R (Schneider, J. et al. (1988) Cell 54, 117-125) и два кластера основных аминокислот, разделенные спейсером из примерно 10 аминокислот, например KR [PAATKKAGQA] KKKK (Dingwall et al., / Cell Biol. 107 (3): 841-9). Что касается аминокислотных последовательностей альфавируса по изобретению, то NLS присутствуют в положениях аминокислот 67-70 капсидного белка EEEV (KRKK); в положениях аминокислот 67-70 капсидного белка WEEV (KKKK); в положениях аминокислот 64-68 капсидного белка VEEV (KKPKK); в положениях аминокислот 62-69 капсидного белка CHIKV (RRNRKNKK); в положениях аминокислот 71-74 капсидного белка вируса Росс-Ривер (RKKK); и в положениях аминокислот 64-68 капсидного белка вируса леса Бармах (KKPKK). Например, можно применять K64N капсидного белка VEEV TC83.

Как применен в настоящем документе, термин «получение», как во фразе «получение агента», включает синтез, покупку или иное приобретение агента.

Под «уменьшает» подразумевают отрицательное изменение, по крайней мере, на 10%, 25%, 50%, 75% или 100%.

Под «эталонный» подразумевают стандартное или контрольное условие.

«Эталонная последовательность» - это определенная последовательность, применяемая в качестве основы для сравнения последовательностей. Эталонная последовательность может представлять собой подмножество или всю указанную последовательность; например, сегмент полноразмерной кДНК или последовательность гена или полную кДНК или последовательность гена. Для полипептидов длина эталонной полипептидной последовательности обычно будет составлять, по меньшей мере, примерно 16 аминокислот, предпочтительно, по меньшей мере, примерно 20 аминокислот, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 25 аминокислот и даже более предпочтительно, примерно 35 аминокислот, примерно 50 аминокислот или примерно 100 аминокислот. Для нуклеиновых кислот длина эталонной последовательности нуклеиновой кислоты обычно будет составлять, по меньшей мере, примерно 50 нуклеотидов, предпочтительно, по меньшей мере, примерно 60 нуклеотидов, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 75 нуклеотидов и даже более предпочтительно, примерно 100 нуклеотидов, или примерно 300 нуклеотидов, или любое целое число около этого или между ними.

Идентичность последовательности обычно измеряют с помощью программного обеспечения для анализа последовательности (например, пакет программного обеспечения для анализа последовательности из компьютерной группы Genetics, Университет биотехнологических исследований Университета Висконсин, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705, BLAST, BESTFIT, GAP или PILEUP/PRETTYBOX). Такое программное обеспечение сопоставляет идентичные или сходные последовательности, присваивая степени гомологии различным заменам, делециям и/или другим модификациям. Консервативные замены обычно включают замены в следующих группах: глицин, аланин; валин, изолейцин, лейцин; аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, аспарагин, глютамин; серин, треонин; лизин, аргинин; и фенилаланин, тирозин. В типичном подходе к определению степени идентичности можно применять программу BLAST с показателем вероятности, между e<"3> и e<"100>, указывающим на родственную последовательность.

Под «структурным полипротеином» подразумевается составная молекула, включающая, по меньшей мере, два разделяемых полипептида, которые вносят вклад в вирусный капсид или оболочку. В одном из воплощений полипептиды подвержены расщеплению вирусным ферментом (например, капсидной аутопротеиназой и сигналазой).

Под «субъектом» подразумевают млекопитающее, включая без ограничений, млекопитающее, представляющее собой человека или не представляющее собой человека, такое как бык, лошадь, собака, овца или кошка.

Обеспеченные в настоящем документе диапазоны считаются сокращенными для всех значений в диапазоне. Например, считают, что диапазон от 1 до 50 включает любое число, комбинацию чисел или поддиапазон из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 , 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 , 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50.

Термины «лечить», «осуществлять лечение», «лечение» и тому подобное относятся к снижению или ослаблению расстройства и/или связанных с ним симптомов. Понятно, что, хотя это и не исключается, лечение расстройства или состояния не требует полного устранения расстройства, состояния или связанных с ним симптомов.

Если специально не указано или не очевидно из контекста, как применен в данном документе, термин «или» понимается как включающий.

Если специально не указано или не очевидно из контекста, как применены в настоящем документе, термины в единственном числе включают как единственное, так и множественное число.

Если специально не указано или не очевидно из контекста, как применен в настоящем документе, термин «примерно» понимают как находящийся в пределах нормального допуска в данной области техники, например, в пределах 2 стандартных отклонений от среднего значения. Термин «примерно» можно понимать как в пределах 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,05% или 0,01% от заявленной величины. Если иное не ясно из контекста, то все обеспеченные в настоящем документе числовые значения изменяют термином «примерно».

Любые композиции или способы, обеспеченные в настоящем документе, могут быть объединены с одной или несколькими любыми другими композициями и способами, обеспеченными в данном документе.

Репликон альфавируса

Репликон альфавируса может при доставке в эукариотическую клетку приводить к образованию множественных дочерних РНК путем транскрипции из себя (через антисмысловую копию, которую он генерирует из себя). Репликон альфавируса может быть непосредственно транслирован после доставки в клетку, и эта трансляция обеспечивает РНК-зависимую РНК-полимеразу, которая затем продуцирует как антисмысловые, так и смысловые транскрипты из доставленной РНК. Таким образом, доставленная РНК приводит к продукции множественных дочерних РНК. Эти дочерние РНК, а также коллинеарные субгеномные транскрипты могут сами транслироваться для обеспечения in situ экспрессии кодируемого белка или могут транскрибироваться для обеспечения дополнительных транскриптов с тем же смыслом, что и доставленная РНК, которая транслируется для обеспечения in situ экспрессии белка. Общий результат этой последовательности транскрипции представляет собой огромную амплификацию числа введенных репликонных РНК, и поэтому кодируемый белок становится основным полипептидным продуктом клеток.

Согласно настоящему изобретению, репликон альфавируса включает полинуклеотиды, которые кодируют неструктурные белки n1, n2, n3 и n4, и, по меньшей мере, один представляющий интерес ген. Репликон альфавируса не кодирует ни один из структурных белков альфавируса.

Неструктурные белки альфавируса могут представлять собой белки дикого типа, полученные из одного из обсуждаемых выше альфавирусов, или могут иметь одно или несколько изменений в аминокислотных последовательностях дикого типа. Изменения неструктурных белков альфавируса раскрыты в различных ссылках предшествующего уровня техники, и специалист может выбрать подходящий неструктурный белок альфавируса на основе этой общеизвестной информации.

Репликоны альфавирусов хорошо известны в данной области техники и могут быть применены любые из ранее раскрытых репликонов (например, Virology. 1997 Dec 22;239(2):389-401.,WO2009/131604, WO2011/005799, WO2012/031043, WO2014/1270493 и WO2015/095167, содержание указанных документов включено в настоящий документ посредством отсылки).

Структурные белки альфавируса

ARP содержит структурные белки альфавируса белков капсида и оболочки. Предпочтительно структурные белки альфавируса включают белок капсида и белки E2 и E1 оболочки, а также могут содержать белок E3 оболочки. Согласно настоящему изобретению, по меньшей мере, один из капсида и оболочки имеет, по меньшей мере, одно изменение, которое усиливает экспрессию ARP в клетках млекопитающих.

В одном из воплощений, структурные белки альфавируса включают, по меньшей мере, белок капсида альфавируса, имеющий остаток, не представляющий собой лизин, (например, аланин или аспарагин) в положении аминокислоты, соответствующем остатку лизина в альфавирусном капсидном белке NLS, и/или остаток, не представляющий собой аргинин, (например, аланин или аспарагин) в положении аминокислоты, соответствующем остатку аргинина в капсидном белке альфавируса NLS. В некоторых воплощениях капсидный белок альфавируса представляет собой капсидный белок штамма WEEV CBA87, имеющий одно или несколько изменений K67N, K68N и K69N. В некоторых воплощениях капсидный белок альфавируса представляет собой капсидный белок штамма VEEV TC83, имеющий одно или несколько изменений K64N, K65A, K65N, K67A и K67N. В некоторых воплощениях капсидный белок альфавируса представляет собой капсидный белок штамма EEEV PE-6, имеющий изменение K67N. В некоторых воплощениях капсидный белок альфавируса представляет собой капсидный белок штамма 37997 CHIKV, имеющий одно или несколько изменений R62A, R63A, R65A, K66A, K68A и K69A; капсидный белок альфавируса представляет собой капсидный белок вируса Росс-Ривер, имеющий одно или несколько изменений R71N, K72N, K73N и K74N; капсидный белок альфавируса представляет собой капсидный белок вируса леса Барма, имеющий одно или несколько изменений K64A, K64N, K65A, K65N, K67A, K67N, K68A и K68N. Аминокислотные последовательности капсидного белка дикого типа вышеописанных альфавирусов доступны в GenBank.

В одном из воплощений, белок E2 альфавируса имеет остаток, не представляющий собой лизин, (например, аспарагин) в положении аминокислоты, соответствующий аминокислоте 234 в белке E2 CHIKV, и/или модификацию в положении аминокислоты, соответствующем аминокислоте 251 в белке Е2 CHIKV, которая дестабилизирует белок Е2 во время отпочковывания вируса от клеточной мембраны.

В одном из воплощений, полинуклеотид, кодирующий E3 альфавирус, может быть модифицирован для включения изменения/мутации в аминокислотную последовательность в сайте расщепления фурином (Arg-X-X-Arg).

Термин «Arg-X-X-Arg» обозначает минимальный сайт расщепления фурином, а «X-X» включает любую комбинацию двух аминокислот. Пример изменения аминокислотной последовательности в сайте расщепления фурином включает изменение Ile-Glu/Asp-Gly-Arg, Asp-Asp-Asp-Asp-Lys или Ser-Gly-Gly-Gly-Ser. Подробные описания приведены в патентных публикациях США №№ 2016-0040134 и 2016-0200775 (указанные документы включены в настоящий документ посредством отсылки).

Например, штамм CT83 VEEV имеет в сайте расщепления фурином, включающий RKRR на конце своей области E3, и полинуклеотидная последовательность, кодирующая RKRR, может быть заменена на кодирующую SGGGS.

В некоторых воплощениях изобретения, белки могут включать мутации, включающие изменения, которые производят молчащие замены, добавления или делеции, но не изменяют свойства или активность кодируемого белка или способ его получения.

Способ получения ARP

ARP могут быть получены с помощью процедур, известных в данной области техники. Типичная процедура получения ARP раскрыта в Virology 239, 389-401, 1997, содержание цитируемого документа включено в настоящий документ посредством отсылки.

В общем, ARP могут быть получены путем совместной трансфекции подходящих клеток-хозяев вектором, кодирующим репликон альфавируса, то есть вектором, содержащим полинуклеотид, кодирующий nsp1, nsp2, nsp3 и nsp4, и представляющий интерес ген; и, по меньшей мере, одним вектором-помощником, кодирующим структурные белки вируса альфавируса. Предпочтительно клетки совместно трансфицируют вектором, кодирующим репликон альфавируса, вектором, кодирующим белок капсида, и вектором, кодирующим белки оболочки.

В частности, изобретение относится к способу получения частиц репликона альфавируса, включающему стадии котрансфекции клеток с

i) вектором, включающим полинуклеотид, кодирующий неструктурный белок альфавируса nsp1, nsp2, nsp3 и nsp4, и, по меньшей мере, один представляющий интерес ген,

ii) вектором, включающим полинуклеотид, кодирующий белок капсида альфавируса, и

iii) вектором, включающим полинуклеотид, кодирующий E3-E2-6K-E1 альфавируса,

в которых, по меньшей мере, один из капсида, E3 и E2 включает одно или несколько аминокислотных изменений, но E1 не включает аминокислотных изменений,

культивирования трансфицированных клеток, и

очистки ARP из клеточной культуры.

Специалисты в области молекулярной биологии поймут, что любая из множества систем экспрессии может быть применена для получения ARP. Для изобретения не критично, какую конкретную клетку (клетку-хозяина) подвергнут котрансфекции. ARP может быть продуцирована в прокариотическом хозяине (например, в E. coli) или в эукариотическом хозяине (например, в Saccharomyces cerevisiae, клетках насекомых, например, клетках Sf21 или клетках млекопитающих, например, NIH 3T3, HeLa, клетках COS). Такие клетки доступны из широкого круга источников (например, в Американской коллекции типовых культур, Rockland, Md.; смотри также, например, работу Ausubel et al., supra). Клетки Spodoptera frugiperda (Sf) представляют собой неограничивающие примеры клеток насекомых, например, клетки Sf9, Sf21, клетки Trichoplusia ni, например, клетки High Five и клетки Drosophila S2. S. cerevisiae, Kluyveromyces lactis (K lactis), виды Candida, включая C. albicans и C. glabrata, Aspergillus nidulans, Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), Pichia pastoris и Yarrowia lipolytica представляют собой примеры грибов (включая дрожжи), применяемых в качестве клеток-хозяев. Примерами клеток млекопитающих - это клетки COS, клетки почки новорождённого хомяка, клетки L мыши, клетки LNCaP, клетки яичника китайского хомяка (CHO), клетки эмбриональной почки человека (HEK), клетки африканской зеленой обезьяны, клетки CV1, клетки HeLa, клетки MDCK, клетки Vero и Hep-2. Ооциты Xenopus laevis или другие клетки, происходящие из амфибий, также могут быть применены. Прокариотические клетки-хозяева включают бактериальные клетки, например, E.coli, B. subtilis и микобактерии.

Способы получения полинуклеотидов, кодирующих указанные белки, известны в данной области техники. Например, ген, кодирующий специфический белок альфавируса, например, структурный белок CHIKV, WEEV, EEEV, VEEV, вируса Росс-Ривер или вируса леса Барма, может быть выделен методом ОТ-ПЦР из полиаденилированной мРНК, выделенной из клеток, которые были инфицированы указанным вирусом. Полученный ген-продукт может быть клонирован в виде полинуклеотидной вставки в вектор.

Термин «вектор» относится к средствам, с помощью которых последовательность нуклеиновой кислоты может размножаться и/или переноситься между организмами, клетками или клеточными компонентами. Векторы включают плазмиды, вирусы, бактериофаги, провирусы, фагмиды, транспозоны, искусственные хромосомы и тому подобное, которые автономно реплицируются или могут интегрироваться в хромосому клетки-хозяина. Вектор также может представлять собой полинуклеотид голой РНК, полинуклеотид голой ДНК, полинуклеотид, состоящий из ДНК и РНК в одной цепи, конъюгированную с полилизином ДНК или РНК, конъюгированную с пептидом ДНК или РНК, конъюгированную с липосомами ДНК или тому подобное, которая не воспроизводится автономно. Во многих, но не во всех общих воплощениях векторы по настоящему изобретению представляют собой плазмиды или бактерии.

Как правило, молекула нуклеиновой кислоты, которую нужно экспрессировать, «функционально связана» с промотором и/или энхансером и подвергается регуляции транскрипции с помощью промотора и/или энхансера.

Способ трансфекции и выбор носителя экспрессии будет зависеть от выбранной системы хозяина. Способы трансфекции описаны, например, в работе Ausubel et al. (supra); носители экспрессии гена могут быть выбраны из тех, которые обеспечены, например, в руководстве Cloning Vectors: A Laboratory Manual (P. H. Pouwels et al., 1985, Supp. 1987). Ссылки, цитируемые в этом параграфе, включены в настоящий документ посредством отсылки.

Существуют различные системы экспрессии для получения ARP изобретения. Векторы экспрессии, полезные для получения таких ARP, включают, без ограничения, хромосомные, эписомальные и вирусные векторы, например, векторы, полученные из бактериальных плазмид, из бактериофага, из транспозонов, из дрожжевых эписом, из элементов вставки, из хромосомных элементов дрожжей, из вирусов, таких как бакуловирусы, паповавирусы, такие как SV40, вирусы коровьей оспы, аденовирусы, вирусы оспы птиц, вирусы псевдобешенства и ретровирусы, и векторы, полученные из их комбинаций.

Конструкции и/или векторы, применяемые в настоящем документе, включают полинуклеотиды альфавируса, которые кодируют структурные белки, включая белки оболочки или белок капсида, как описано в настоящем документе. Кроме того, конструкции и/или векторы, применяемые в настоящем документе, содержат полинуклеотиды альфавируса, которые кодируют неструктурные белки nsp1, nsp2, nsp3 и nsp4 и представляющий интерес ген.

Вектор может представлять собой, например, фаговый, плазмидный, вирусный или ретровирусный вектор. Конструкции и/или векторы, которые содержат нуклеотиды, должны быть функционально связаны с соответствующим промотором, таким как промотор CMV, лямбда PL фага, промоторы E.coli lac, phoA и tac, ранние и поздние промоторы SV40 и промоторы ретровирусных LTR, представляющими собой неограничивающие примеры. Специалистам в данной области техники известны другие подходящие промоторы в зависимости от клетки-хозяина и/или желаемой скорости экспрессии. Экспрессирующие конструкции будут дополнительно содержать сайты инициации, терминации транскрипции и, в транскрибируемой области, сайт связывания рибосомы для трансляции. Кодирующая часть транскриптов, экспрессируемых этими конструкциями, предпочтительно будет включать инициирующий трансляцию кодон в начале и терминирующий кодон, соответствующим образом расположенный на конце полипептида, подлежащего трансляции.

Векторы предпочтительно будут включать, по меньшей мере, один селектируемый маркер. Такие маркеры включают дигидрофолатредуктазу, устойчивость к G418 или неомицину для культуры эукариотических клеток и гены устойчивости к тетрациклину, канамицину или ампициллину для культивирования в E.coli и других бактериях. Среди векторов предпочтительные векторы представляют собой вирусные векторы, такие как бакуловирус, поксвирус (например, вирус коровьей оспы, авипоксвирус, вирус оспы канарейки, вирус оспы птиц, вирус оспы енотов, вирус оспы свиней и т.д.), аденовирус (например, аденовирус собак), герпесвирус и ретровирус. Другие векторы, которые можно применять с изобретением, включают векторы для применения в бактериях, которые включают pQE70, pQE60 и pQE-9, pBluescript-векторы, векторы Phagescript, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5. Предпочтительные эукариотические векторы включают pFastBacl pWINEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl и pSG, pSVK3, pBPV, pMSG и pSVL. Другие подходящие векторы будут очевидны для специалиста в данной области техники.

Рекомбинантные конструкции могут быть получены и применены для трансфекции, они могут экспрессировать вирусные белки, в том числе описанные в настоящем документе, в эукариотические клетки и/или прокариотические клетки. Таким образом, изобретение обеспечивает клетки-хозяева, которые включают вектор (или векторы), который содержит (которые содержат) нуклеиновые кислоты, кодирующие структурные белки альфавируса, включая капсид, E3, E2, 6K и El или их части, и вектор, который включает нуклеиновые кислоты, кодирующие nsp1, nsp2, nsp3 и nsp4 альфавируса и, по крайней мере, один из представляющих интерес генов в условиях, позволяющих формировать ARP.

В одном из воплощений, указанный вектор представляет собой рекомбинантный бакуловирус. В другом воплощении указанный рекомбинантный бакуловирус трансфицируют в клетку насекомого. В предпочтительном воплощении указанная клетка представляет собой клетку насекомого. В другом воплощении указанная клетка насекомого представляет собой клетку Sf9.

Система экспрессии pET E. coli («Novagen», Inc., Madison, Wis) представляет собой одну из конкретных бактериальных систем экспрессии для получения полипептида. В соответствии с этой системой экспрессии ДНК, кодирующая полипептид, встраивается в вектор pET в ориентации, предназначенной для обеспечения экспрессии. Поскольку ген, кодирующий такой полипептид, находится под контролем регуляторных сигналов Т7, то экспрессии полипептида достигают путем индукции экспрессии РНК-полимеразы Т7 в клетке-хозяине. Этого обычно достигают путем применения штаммов-хозяев, которые экспрессируют РНК-полимеразу Т7 в ответ на индукцию IPTG. Затем, после получения рекомбинантного полипептида, его выделяют в соответствии со стандартными способами, известными в данной области техники, например, описанными в настоящем документе.

Система экспрессии pGEX («Pharmacia») представляет собой другую бактериальную систему экспрессии для продуцирования полипептида. В этой системе применяют систему слияния генов GST, которая предназначена для экспрессии генов или фрагментов генов на высоком уровне в виде белков слияния с быстрой очисткой и восстановлением функциональных генных продуктов. Представляющий интерес белок сливают с карбоксильным концом белка глутатион-S-трансферазы из Schistosoma japonicum и легко очищают от бактериальных лизатов с помощью аффинной хроматографии с применением глутатион-сефарозы 4B. Слитые белки могут быть выделены в мягких условиях путем элюции глутатионом. Отщепление глутатион-S-трансферазного домена от слитого белка облегчается наличием сайтов узнавания для сайт-специфических протеаз, расположенных выше этого домена. Например, белки, экспрессируемые в плазмидах pGEX-2T, могут расщепляться тромбином; те, которые экспрессируются в pGEX-3X, могут быть расщеплены фактором Ха.

В зависимости от выбранных векторов и клеток-хозяев растущие клетки-хозяева, трансфицированные векторами, в условиях, при которых рекомбинантные белки экспрессируются и генерируется репликон альфавируса, продуцируют ARP, и формируются ARP, включающие репликон альфавируса, упакованный с частицей структурных белков альфавируса. В одном из воплощений изобретение включает способ получения ARP, который включает котрансфекцию вектора, включающего полинуклеотид, кодирующий неструктурный белок альфавируса nsp1, nsp2, nsp3 и nsp4, и, по меньшей мере, один представляющий интерес ген, по меньшей мере, по одному вектору, каждый из которых кодирует, по меньшей мере, один белок альфавируса в подходящих клетках-хозяевах и экспрессирует указанный белок альфавируса в условиях, которые обеспечивают образование ARP. В другом воплощении эукариотическую клетку выбирают из группы, состоящей из клеток дрожжей, насекомых, земноводных, птиц или млекопитающих. Выбор подходящих условий роста находится в компетенции специалиста в данной области техники.

Способы выращивания клеток, которые продуцируют ARP, включают, но не ограничиваются ими, методы периодического культивирования клеток с непрерывным и перфузионным культивированием. В одном из воплощений клетки, котрансфицированные вектором, кодирующим репликон альфавируса, и вектором, включающим полипептид, кодирующий капсид, и вектором, включающим полинуклеотид, кодирующий белки оболочки, такие как полученные из CHIKV или VEEV, выращивают в биореакторе или ферментационной камере, в которой клетки размножаются и экспрессируют белок (например, рекомбинантные белки) для очистки и выделения. Как правило, культивирование клеток проводят в стерильных условиях с контролируемой температурой и атмосферой. Биореактор представляет собой камеру, применяемую для культивирования клеток, в которой можно контролировать условия окружающей среды, такие как температура, атмосфера, перемешивание и/или pH. В одном из воплощений биореактор представляет собой камеру из нержавеющей стали. В другом воплощении указанный биореактор представляет собой предварительно стерилизованный пластиковый пакет (например, Cellbag®, «Wave Biotech», Bridgewater, N.J.). В другом воплощении указанные предварительно стерилизованные пластиковые пакеты представляют собой пакеты объемом примерно от 50 до 1000 л.

ARP выделяют, применяя способы, которые сохраняют их целостность, такие как градиентное центрифугирование, например, в хлориде цезия, сахарозе и йодиксаноле, а также стандартные методы очистки, включая, например, ионообменную и гель-фильтрационную хроматографию.

Ниже приведен пример того, как ARP изобретения могут быть получены, выделены и очищены. Специалист в данной области техники понимает, что существуют дополнительные методы, которые можно применять для получения и очистки ARP. Соответственно, изобретение не ограничено способами, описанными в настоящем документе.

В общем, продуцирование ARP изобретения достигают путем посева клеток млекопитающих (например, клеток эмбриональной почки человека (293T)) или клеток Sf9 (неинфицированных) в шейкерные колбы, что позволяет клеткам размножаться и увеличивать масштаб производства по мере роста и размножения клеток (например, от колбы на 125 мл до пакета объемом 50 л). Среду, применяемую для выращивания клеток, составляют для соответствующей клеточной линии (предпочтительно бессывороточная среда, например, среда для насекомых ExCell-420, JRH). Затем клетки трансфицируют или инфицируют подходящим вектором (например, вектором экспрессии млекопитающих или для SF клеток рекомбинантным бакуловирусом при наиболее эффективной множественности инфекции (например, от приблизительно 1 до приблизительно 3 бляшкоообразующих единиц на клетку). Полинуклеотиды или их части экспрессируют в клетках, где они самособираются в ARP, и секретируются из клеток приблизительно через 24-72 часа после инфицирования (hpi). Обычно трансфекция или инфекция наиболее эффективны, когда клетки находятся в середине логарифмической фазы роста (4-8 × 10⁶ клеток/мл) и жизнеспособны, по меньшей мере, примерно на 90%. Кроме того, трансфицированные клетки могут быть подвергнуты воздействию высоких рН в культуре клеток (рН > 7,2, например, рН 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8 или выше) для увеличения продукции ARP.

ARP изобретения собирают приблизительно через 48-120 часов после заражения, когда уровни ARP в среде для культивирования клеток близки к максимальным, но до обширного лизиса клеток. Плотность и жизнеспособность клеток во время сбора могут составлять от примерно 0,5 × 10⁶ клеток/мл до примерно 1,5 × 10⁶ клеток/мл с жизнеспособностью, по меньшей мере, 20%, что определяют с помощью анализа исключения красителя. Далее, среду удаляют и очищают. Можно добавить в среду NaCl до концентрации от примерно 0,4 до примерно 1,0 М, предпочтительно, до примерно 0,5 М, чтобы избежать агрегации ARP. Удаление клеток и клеточного дебриса из среды для культивирования клеток, содержащей ARP изобретения, может быть осуществлено путем фильтрации в тангенциальном потоке (TFF) с помощью одноразового, предварительно стерилизованного картриджа с полыми волокнами 0,5 или 1,00 мкм или подобного устройства.

Кроме того, ARP могут быть подвергнуты воздействию высоких pH во время очистки (pH> 7,2, например, pH 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8 или выше) для увеличения продукции ARP.

Затем, ARP в очищенной культуральной среде концентрируют ультрафильтрацией с применением одноразового, предварительно стерилизованного картриджа с полыми волокнами с отсечением по молекулярной массе, равным 500000. Концентрированные ARP могут быть подвергнуты диафильтрации против 10 объемов pH 7,0-8,0 с фосфатно-солевым буфером (PBS), содержащим 0,5 М NaCl, для удаления остаточных компонентов среды.

Концентрированные, диафильтрованные ARP можно дополнительно очищать с помощью прерывистого градиента сахарозы от 20% до 60% в буфере PBS pH 7,2 с 0,5 М NaCl путем центрифугирования при 6500 g в течение 18-ти часов при температуре от примерно 4°C до примерно 10°C. Обычно ARP образуют характерную видимую полосу от примерно 30% до примерно 40% сахарозы или на границе раздела (с шагом 20% и 60% градиента), которую можно собрать из градиента и сохранить. Этот продукт может быть разбавлен до 200 мМ NaCl для подготовки к следующей стадии процесса очистки. Этот продукт содержит ARP и может содержать интактные частицы бакуловируса.

Дальнейшая очистка ARP может быть достигнута анионообменной хроматографией или изопикническим центрифугированием в 44%-ной сахарозной подушке. В анионообменной хроматографии образец из градиента сахарозы (смотри выше) загружают в колонку, содержащую среду с анионом (например, Matrix Fractogel EMD TMAE), и элюируют в градиенте соли (от примерно 0,2 М до примерно 1,0 М NaCl ) в котором можно отделить ARP от других загрязнений (например, бакуловируса и ДНК/РНК). В методе с сахарозной подушкой образец, содержащий ARP, добавляют к 44%-ной сахарозной подушке и центрифугируют в течение примерно 18-ти часов при 30000 g. ARP образуют полосу в верхней части 44%-ной сахарозы, в то время как бакуловирус осаждается в нижней части, а другие загрязняющие белки остаются в 0% сахарозном слое в верхней части. Пик или полосу ARP собирают.

При желании интактный бакуловирус может быть инактивирован. Инактивацию можно проводить химическими способами, например, формалином или β-пропиолактоном (BPL). Удаление и/или инактивацию интактного бакуловируса также можно в значительной степени осуществить, применяя методы селективного осаждения и хроматографии, известные в данной области техники, как показано выше. Способы инактивации включают инкубацию образца, содержащего ARP в 0,2% BPL, в течение 3-х часов при температуре от примерно 25°C до примерно 27°C. Бакуловирус также можно инактивировать путем инкубации образца, содержащего ARP, при 0,05% BPL при 4°C в течение 3-х дней, затем при 37°С в течение одного часа.

После стадии инактивации/удаления продукт, содержащий ARP, может быть пропущен через другую стадию диафильтрации для удаления любого реагента со стадии инактивации и/или любой остаточной сахарозы и для помещения ARP в желаемый буфер (например, PBS). Раствор, содержащий ARP, можно стерилизовать способами, известными в данной области техники (например, стерильная фильтрация), и хранить в холодильнике или морозильной камере.

Вышеуказанные способы могут быть применены в различных масштабах. Например, от T-колб, встряхиваемых колб, бутылок с постоянным перемешиванием до биореакторов промышленного размера. Биореакторы могут включать или резервуар из нержавеющей стали, или предварительно стерилизованный пластиковый пакет (например, система, продаваемая «Wave Biotech», Bridgewater, N.J.). Специалист в данной области техники знает, что наиболее желательно для этих целей.

Как описано в настоящем документе, после введения желаемому хозяину ARP по настоящему изобретению поглощаются клетками, обычно зараженными альфавирусом, из которого получены структурные белки. Представляющий интерес ген, содержащийся в репликоне, интернализуется в клетку при поступлении ARP. Это свойство облегчает применение описанных в настоящем документе ARP в качестве средств доставки гена, поскольку они обеспечивают доставку представляющего интерес гена в желаемую клетку.

В то время как природные геномы альфавируса кодируют структурные белки вируса в дополнение к неструктурному полипротеину репликазы, репликон альфавируса не кодирует структурные белки альфавируса. Таким образом, репликон альфавируса может приводить к образованию собственных копий геномной РНК в клетке, но не к производству РНК-содержащих вирионов. Невозможность продуцировать эти вирионы означает, что, в отличие от альфавируса дикого типа, репликон не может сохраняться в инфекционной форме. Структурные белки альфавируса, которые необходимы для увековечения в вирусах дикого типа, отсутствуют в репликоне, и их место занимает, по меньшей мере, один представляющий интерес ген, так что субгеномный транскрипт кодирует представляющий интерес белок, а не структурные белки альфавируса.

Таким образом, в определенных воплощениях, ARP включает представляющий интерес ген, который может представлять собой или может кодировать, например, терапевтический или диагностический агент (терапевтические или диагностические агенты), который должен быть доставлен субъекту, например, агент визуализации, последовательность нуклеиновой кислоты (включая миРНК и микроРНК), радионуклид, гормон, пептид, противовирусный агент, противоопухолевый/химиотерапевтический агент, агент, модулирующий рост клеток, ингибитор роста клеток, цитокин, антиген, адъювант и токсин. Репликон, упакованный в частицу вирусных структурных белков, не должен отрицательно влиять на стабильность ARP. Это может быть определено путем создания ARP, содержащей данный представляющий интерес ген, и оценки его влияния, если таковое имеется, на стабильность ARP.

Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает способы введения представляющего интерес гена в клетку. Согласно настоящему изобретению, представляющий интерес ген содержится в репликоне альфавируса, а репликон альфавируса упакован с частицей структурных белков альфавируса. В сходных воплощениях ARP связывается с клеткой. В сходных воплощениях ARP позволяют входить в клетку, тем самым приводя к доставке представляющего интерес гена в клетку.

Как применены в настоящем документе, термины «лечить», «осуществлять лечение», «лечение» и тому подобное относятся к снижению или ослаблению расстройства и/или связанных с ним симптомов. Понятно, что, хотя это и не исключается, лечение расстройства или состояния не требует полного устранения расстройства, состояния или связанных с ним симптомов.

Как применен в настоящем документе, термины «предотвращать», «предупреждать», «предотвращение», «профилактическое лечение» и тому подобное относятся к уменьшению вероятности развития расстройства или состояния у субъекта, который не имеет, но подвержен риску или подвержен развитию расстройства или состояния.

Представляющий интерес ген может представлять собой ген, который кодирует антиген. ARP по настоящему изобретению могут быть получены в форме для инъекций, либо в виде жидкого раствора, либо в виде суспензии. Твердые формы, подходящие для инъекции, также могут быть получены в виде эмульсий или с ARP, инкапсулированными в липосомы. Вакцинные антигены обычно комбинируют с фармацевтически приемлемым носителем, который включает любой носитель, который не индуцирует выработку антител, вредных для субъекта, получающего носитель. Подходящие носители обычно включают крупные макромолекулы, которые медленно метаболизируются, такие как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, аминокислотные сополимеры, липидные агрегаты и неактивные вирусные частицы. Такие носители хорошо известны специалистам в данной области техники. Эти носители могут также функционировать в качестве адъювантов.

Описанные в настоящем документе ARP можно вводить в комбинации с адъювантом (например, Риби). Адъюванты представляют собой иммуностимулирующие агенты, которые повышают эффективность вакцины. При желании ARP, включающие один или несколько полипептидов альфавирусов или их фрагментов или вариантов, вводят в комбинации с адъювантом, который усиливает эффективность иммунного ответа, генерируемого против представляющего интерес антигена. Эффективные адъюванты включают, но не ограничиваются ими, соли алюминия, такие как гидроксид алюминия и фосфат алюминия, мурамилпептиды, компоненты бактериальной клеточной стенки, сапониновые адъюванты и другие вещества, которые действуют как иммуностимулирующие агенты для повышения эффективности композиции.

Иммуногенные композиции, то есть описанные в настоящем документе ARP, фармацевтически приемлемый носитель и адъювант, также обычно содержат разбавители, такие как вода, физиологический раствор, глицерин, этанол. Также могут присутствовать вспомогательные вещества, такие как смачивающие или эмульгирующие средства, рН-буферные вещества и тому подобное. Белки могут быть включены в вакцину в виде нейтральных форм или в форме солей. Иммуногенные композиции обычно вводят парентерально, путем инъекции; такая инъекция может быть либо подкожной, либо внутримышечной. Дополнительные композиции подходят для других форм введения, таких как с помощью суппозиториев или перорально. Пероральные композиции можно вводить в виде раствора, суспензии, таблетки, пилюли, капсулы или композиции с замедленным высвобождением.

Иммуногенные композиции вводят способом, совместимым с дозированной композицией. Иммуногенная композиция включает иммунологически эффективное количество ARP, описанных в настоящем документе, и другие ранее упомянутые компоненты. Под иммунологически эффективным количеством подразумевают однократную дозу или композицию, вводимую по схеме с многократными дозами, которая эффективна для лечения или предотвращения инфекции. Вводимая доза будет варьировать в зависимости от подлежащего лечению субъекта, его здоровья и физического состояния, способности иммунной системы субъекта вырабатывать антитела, желаемой степени защиты и других соответствующих факторов. Точное количество требуемого активного ингредиента будет зависеть от суждения практикующего врача, но обычно оно составляет от 5 мкг до 250 мкг антигена на дозу.

Фармацевтические композиции и введение

Изобретение относится к фармацевтическим композициям, которые содержат ARP, как описано в настоящем документе. Применяемые в настоящем документе фармацевтические композиции содержат фармацевтически приемлемый носитель, включая любой подходящий разбавитель или вспомогательное вещество, которые включают любой фармацевтическое средство, которое само по себе не вызывает продукцию иммунного ответа, вредного для позвоночных, получающих композицию, и которое можно вводить без чрезмерной токсичности, и ARP изобретения. Как применен в настоящем документе, термин «фармацевтически приемлемый» означает одобрение регулирующего органа федерального правительства или правительства штата или внесение в список фармакопеи США, Европейской фармакопеи или другой общепризнанной фармакопеи для применения у млекопитающих и, в особенности, у людей. Эти композиции могут быть полезны в качестве вакцинных и/или антигенных композиций для индукции защитного иммунного ответа у позвоночных.

Фармацевтически приемлемые носители включают, но не ограничиваются ими, солевой раствор, забуференный солевой раствор, декстрозу, воду, глицерин, стерильный изотонический водный буфер и их комбинации. Подробное обсуждение фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей и других вспомогательных веществ представлено в руководстве Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co. N.J., текущее издание). Состав должен соответствовать способу введения. В предпочтительном воплощении композиция, подходящая для введения людям, предпочтительно представляет собой стерильную, не содержащую частиц и/или непирогенную композицию.

Композиция, если желательно, может также содержать незначительные количества смачивающих или эмульгирующих средств или рН-буферных средств. Композиция может быть в твердой форме, такой как лиофилизированный порошок, подходящий для восстановления, жидкий раствор, суспензия, эмульсия, таблетка, пилюля, капсула, состав с замедленным высвобождением или порошок. Пероральная композиция может включать стандартные носители, такие как фармацевтические сорта маннита, лактозы, крахмала, стеарата магния, сахарина натрия, целлюлозы, карбоната магния и т.д.

В определенных воплощениях, композицию ARP поставляют в жидкой форме, например, в запечатанном контейнере с указанием количества и концентрации композиции ARP.

Предпочтительно, жидкую форму композиции ARP поставляют в герметически закрытом контейнере, по меньшей мере, примерно 50 мкг/мл, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 100 мкг/мл, по меньшей мере, примерно 200 мкг/мл, по меньшей мере, 500 мкг/мл, или, по меньшей мере, 1 мг/мл.

Альтернативно, композицию вакцины вводят интраназально, либо каплями, аэрозолем с крупными частицами (более чем около 10 микрон), либо распылением в верхние дыхательные пути или аэрозолем с малыми частицами (менее чем 10 микрон), либо распылением в нижние дыхательные пути. В то время как любой из вышеуказанных путей доставки приводит к иммунному ответу, интраназальное введение дает дополнительное преимущество в выявлении иммунитета слизистой оболочки в месте проникновения многих вирусов, включая альфавирусы, например, CHIKV или VEEV.

Таким образом, изобретение также включает способ составления вакцины или антигенной композиции, которая индуцирует иммунитет к инфекции или, по меньшей мере, к одному из ее симптомов у млекопитающего, включающий добавление к указанной композиции эффективной дозы ARP, например альфавируса (например, CHIKV или VEEV).

В определенных случаях стимуляция иммунитета однократной дозой представляет собой предпочтительной, однако для достижения желаемого эффекта можно также вводить дополнительные дозы тем же или другим путем. Например, у новорожденных и детей грудного возраста может потребоваться многократное введение, чтобы вызвать достаточный уровень иммунитета. Введение можно продолжать с интервалами в течение всего детства, если это необходимо для поддержания достаточного уровня или защиты.

Точно так же взрослым, которые особенно подвержены повторным или серьезным инфекциям, таким как, например, медицинские работники, работники дневного ухода, члены семей с маленькими детьми, пожилые люди и люди с нарушенной сердечно-легочной функцией или иммунной системой, которым могут потребоваться множественные иммунизации для установления и/или поддержания защитных иммунных реакций. Уровни индуцированного иммунитета можно контролировать, например, путем измерения количества нейтрализующих секреторных и сывороточных антител, а также скорректированных дозировок или повторных прививок по мере необходимости для выявления и поддержания желаемых уровней защиты.

Дозировка фармацевтической композиции может быть легко определена специалистом в данной области техники, например, сначала путем определения доз, эффективных для получения профилактического или терапевтического иммунного ответа, например, путем измерения титра вирус-специфических иммуноглобулинов в сыворотке или путем измерения коэффициента ингибирования антител в образцах сыворотки или мочи или секретов слизистых оболочек. Указанные дозы могут быть определены из исследований на животных. Неограничивающий список животных, применяемых для изучения эффективности вакцин, включает морских свинок, хомяков, хорьков, шиншилл, мышей и хлопковых хомяков и приматов, не представляющих собой людей. Большинство животных не представляю собой естественных хозяев инфекционных агентов, но все же могут участвовать в исследованиях различных аспектов заболевания. Например, любому из указанных выше животных можно ввести дозу вакцины-кандидата, например, ARP, чтобы частично охарактеризовать индуцированный иммунный ответ и/или определить, были ли продуцированы какие-либо нейтрализующие антитела. Например, многие исследования были проведены на мышиной модели, потому что мыши имеют небольшие размеры, а их низкая стоимость позволяет исследователям проводить эксперименты в более широком масштабе.

Кроме того, специалист в данной области техники может провести клинические исследования на людях для определения предпочтительной эффективной дозы для людей. Такие клинические исследования представляют собой рутинные исследования и хорошо известны в данной области техники. Точная доза для применения также будет зависеть от пути введения. Эффективные дозы могут быть экстраполированы из кривых доза-ответ, полученных в тест-системах in vitro или на животных.

Как также хорошо известно в данной области техники, иммуногенность конкретной композиции может быть повышена путем применения неспецифических стимуляторов иммунного ответа, известных как адъюванты. Адъюванты были применены экспериментально для стимуляции общего повышения иммунитета против неизвестных антигенов. Протоколы иммунизации применяли адъюванты для стимуляции ответов в течение многих лет, и, как таковые, адъюванты хорошо известны специалисту в данной области техники. Некоторые адъюванты влияют на представление антигенов. Например, иммунный ответ увеличивается, когда белковые антигены осаждаются квасцами. Эмульгирование антигенов также продлевает продолжительность презентации антигена. Включение любого адъюванта, описанного в справочнике Vogel et al., «A Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients (2nd Edition)» и включенного в настоящий документ посредством отсылки во всей своей полноте для всех целей, предусмотрено в пределах объема настоящего изобретения.

Типичные адъюванты включают полный адъювант Фрейнда (неспецифический стимулятор иммунного ответа, содержащий убитую Mycobacterium tuberculosis), неполные адъюванты Фрейнда и адъювант гидроксид алюминия. Другие адъюванты включают GMCSP, BCG, гидроксид алюминия, соединения MDP, такие как thur-MDP и nor-MDP, CGP (MTP-PE), липид A и монофосфориллипид A (MPL). Также рассматривают систему RIBI, которая содержит три компонента, экстрагированные из бактерий, MPL, трегалозы димиколат (TDM) и скелет клеточной стенки (CWS) в 2%-ной эмульсии сквален/Твин-80. Также могут быть применены MF-59, Novasome®, антигены для MHC.

ARP изобретения также могут быть составлены с «иммуностимуляторами». Это собственные химические мессенджеры организма (цитокины), служащие для усиления ответа иммунной системы. Иммуностимуляторы включают, но не ограничиваются ими, различные цитокины, лимфокины и хемокины с иммуностимулирующей, иммунопотенциирующей и провоспалительной активностями, такие как интерлейкины (например, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-12, IL-13); факторы роста (например, гранулоцитарно-макрофагальный (GM)-колониестимулирующий фактор (CSF)); и другие иммуностимулирующие молекулы, такие как фактор воспаления макрофагов, лиганд Flt3, B7.1; B7.2 и т.д. Иммуностимулирующие молекулы можно вводить в той же композиции, что и ARP, или их можно вводить отдельно. Для получения иммуностимулирующего эффекта можно вводить либо белок, либо вектор экспрессии, кодирующий белок. Таким образом, в одном из воплощений изобретение включает антигенные и вакцинные композиции, включающие адъювант и/или иммуностимулятор.

Согласно изобретению система доставки, включающая указанную ARP, может доставлять представляющий интерес ген в цитоплазму эукариотических клеток, тем самым может лечить рак, вирусные инфекции, неврологические нарушения, аутоиммунные заболевания, отторжение трансплантата и моногенные или полигенные наследственные заболевания.

Изобретение будет подробно описано с отсылкой к следующим примерам, которые, однако, не предназначены для ограничения объема настоящей заявки.

Пример 1

Конструкция частиц репликона VEEV (VRP)

Схематически процедура показана на фиг. 2.

Создание плазмиды репликона VEEV, экспрессирующей люциферазу

1) Синтезировали полноразмерный фрагмент неструктурного белка nsp 1, nsp2, nsp3 и nsp4 VEEV TC83 («ThermoFisher»).

Точно так же gBlocks, соответствующие различным фрагментам конструкции Replicon, были синтезированы («IDT») следующим образом:

2) VEEV gBlock1 - ClaI-RSVp-5'UTR-nsp1 (bp1-470) -RsrII-ApaI-26Sp-sgRNA вплоть до ATG гена CA VEEV. Этот фрагмент имел перекрытие в 36 п.о. с остовом плазмиды pBR322 на 5'-конце. Это фрагмент № 1.

3) VEEV gBlock2 - Этот фрагмент имел перекрытие в 64 п.о. с VEEV gBlock1, начиная с сайта ApaI и вплоть до стартового кодона ATG. За этим следуют Nano Luciferase ORF («Promega») и первые 72 основания VEEV 3 'UTR.

4) Клонирование фрагмента № 2 - VEEV gBlock2, полноразмерный VEEV 3'UTR и сигнал VEEV PolyA (A (n = 55)) сначала собирали с помощью ПЦР с удлинением с перекрытием, применяя олигомеры, показанные в приведенной ниже таблице:

Таблица 1

VEEV_Oligo2 имеет перекрытие в 15 п.о. с остовом плазмиды pBR322.

5) Затем VEEV gBlock1 (фрагмент № 1), фрагмент № 2 и остов pBR322 (расщепленные с помощью ClaI и NruI-HF) собирают с применением сборки Гибсона для получения остова конструкции (BB) pBR322-RSVp-RsrII-ApaI-26Sp-sgRNA-NanoLuc-A(n=55)-SV40 pA. В этом остове конструкции отсутствовал полноразмерный фрагмент TC83 nsp1-4.

6) Фрагмент nsp1-4 (п.о. 470-7461) амплифицировали из синтезированной Thermo plasmid, полученной в 1), с применением праймеров, содержавших сайты рестрикции RsrII и ApaI -

i) 5'-ccggccCGGACCGacaagtctctatcacc-3' (SEQ ID NO: 11, прямой праймер) и ii)5'-ggccggGGGCCCctctcaggtagctgaatg-3' (SEQ ID NO: 12, обратный праймер). Этот амплифицированный с помощью ПЦР фрагмент nsp клонировали в остов (BB) плазмиды BB с применением сайтов RsrII и ApaI для получения полноразмерной конструкции репликона VEEV TC83 (фиг. 3).

Плазмиды-помощники

Конструкции плазмид-помощников, кодирующие капсид VEEV TC83, показаны на фиг. 4 и 5. Конструкции экспрессируют капсидный белок VEEV дикого типа (SEQ ID NO: 1) и капсид VEEV, имеющий мутацию в NLS (K64N, SEQ ID NO: 2), соответственно.

Конструкции плазмид-помощников, экспрессирующие гликопротеины VEEV TC83 E3-E2-6K-E1, применяемые в настоящем документе, показаны на фиг. 6 и 7. Конструкции экспрессируют гликопротеины E3-E2-6K-E1 из VEEV TC83 дикого типа (SEQ ID NO: 3) и E3 модифицированный E3-E2-6K-E1 (участок расщепления фурином в конце E3 RKRR был заменен SGGGS, SEQ ID NO: 4), соответственно.

Клеточная культура и котрансфекция

Клетки 293T высевали в 6-луночный планшет в полной DMEM, содержавшей 10% FBS, пенициллин и стрептомицин. Клетки котрансфицировали равными количествами конструкции VEEV RSVp-NLuc, содержавшей (VR) (SEQ ID NO: 5) или не содержавшей (BB) фрагмент nsp1-4, наряду с капсидом, кодирующим хелперную плазмиду, и кодирующим гликопротеины E1- 6K-E2-E3 с применением PEI (1,7 мкг каждой плазмиды). Комбинация хелперных плазмид была следующей: (SEQ ID NO: 1 и 3), (SEQ ID NO: 1 и 4), (SEQ ID NO: 2 и 3) или (SEQ ID NO: 2 и 4). Клетки инкубировали со смесью для трансфекции в течение примерно 3-х часов при 37°С, после чего смесь для трансфекции удаляли, клетки промывали 1X PBS и добавляли свежую DMEM. Упакованные частицы вирусного репликона (VRP) собирали либо через 48 hpt (часы после трансфекции), либо через 72 hpt. Для сбора VRP супернатант культуры трансфицированных клеток получали центрифугированием клеточной культуры при 1200 об/мин в течение 5 минут при 4°C для осаждения любого клеточного дебриса. Супернатант фильтровали через фильтр 0,45 мкм. Собранные VRP хранили либо при 4°С, либо при -80°С.

Пример 2

Определение способности к упаковке репликона VEEV в частицы репликона вируса VEE (VRP)

Инфекция и анализ на люциферазу

Протокол схематически показан на фиг. 8.

Клетки 293T высевали в полной среде DMEM в 96-луночный планшет в плотности, приблизительно равной 10000 клеток на лунку. Клетки инфицировали при 37°С собранными VRP, неразбавленными или в 2-кратном серийном разведении. Через 14 часов после заражения (hpi) VRP удаляли; клетки промывали PBS и в лунки добавляли свежую DMEM. Затем клетки инкубировали и собирали для анализа на люциферазу при 24, 48 и 72 hpi. Анализ на люциферазу проводили путем добавления равных количеств инфицированных клеток и системы анализа на люциферазу Nano-Glo («Promega») в непрозрачный 96-луночный планшет с белым дном («Costar»). Активность люциферазы измеряли немедленно, применяя считывающее устройство для микропланшетов Synergy HTX «Bio-Tek».

Результат

Результаты показаны на фиг. 9. Экспрессию люциферазы подтверждали в клетках, инфицированных VRP (VR), уже в 24 hpi. Клетки, инфицированные остовом конструкции, лишенным nsp 1-4 (BB), практически не экспрессировали люциферазу.

Пример 3

Новые конструкции репликонов VEEV

Новые конструкции плазмид репликона VEEV TC83 были получены путем введения сайта множественного клонирования (MCS) для обеспечения возможности введения различных «представляющих интерес генов». Протокол схематически показан на фиг. 10. Конструкция приведена на фиг. 11 и в SEQ ID NO: 6. В конструкцию фиг. 11 нуклеотид, кодирующий люциферазу, вводят в качестве представляющего интерес гена. Промотор в плазмиде может быть выбран с учетом клеток, подлежащих заражению.

Пример 4

Получение VRP с мутацией/без мутации в капсиде и/или E3-E2-6K-E1, и имеющих представляющий интерес ген

В данном примере, плазмида репликона VEEV, содержащая представляющий интерес ген, была котрансфицирована с плазмидой-помощником с капсидом VEEV и плазмидой-помощником с гликопротеинами E3-E2-6K-E1 VEEV в клетки 293T аналогичным образом, как в примере 1. В качестве представляющего интерес гена применяли гены, кодирующие люциферазу, GFP, IKK или JNK2.

Применяли следующие плазмиды:

i-1) плазмида, включающая полинуклеотид, кодирующий капсидный белок CT83 VEEV дикого типа, или

i-2) плазмида, включающая полинуклеотид, кодирующий капсидный белок CT83 VEEV, имеющий мутацию в NLS (K64N).

ii-1) плазмида, включающая полинуклеотид, кодирующий E3-E2-6K-E1 из CT83 VEEV дикого типа, или

ii-2) плазмида, включающая полинуклеотид, кодирующий E3-E2-6K-E1 CT83 VEEV, имеющий мутацию в сайте расщепления фурином в E3

и

iii) плазмида, включающая полинуклеотид, кодирующий nsp1, nsp2, nsp3 и nsp4 из CT83VEEV, и представляющий интерес ген, кодирующий люциферазу, GFP, IKK или JNK2.

Котрансфекция

Клетки 293T совместно трансфицировали плазмидой репликона VEEV TC83, содержавшей представляющий интерес ген, хелперной плазмидой, кодировавшей капсид VEEV (WT или мутацию), и хелперной плазмидой, кодировавшей E3-E2-6K-E1 (WT или мутацию). Три плазмиды (1 мкг капсида, 1 мкг E3-E2-6K-E1 и 10 мкг репликона VEEV, содержавшего представляющий интерес ген) трансфицировали в клетки 293T (методом PEI), и клетки инкубировали 4-7 дней. Затем VRP собирали из супернатанта и очищали путем осаждения в градиенте плотности Optiprep.

Очистку VRP подтверждали вестерн-блоттингом с применением антитела против VEEV (ATCC) в качестве первого антитела (1: 2000) и антител протии IgG мыши (1: 4000) в качестве вторичного антитела. Результаты VRP, полученные с применением следующих плазмид показаны на фиг. 12:

i) плазмида, включающая полинуклеотид, кодирующий капсидный белок CT83 VEEV, имеющий мутацию в NLS (K64N).

ii) плазмида, включающая полинуклеотид, кодирующий E3-E2-6K-E1 из CT83 VEEV дикого типа, и

iii) плазмида, включающая полинуклеотид, кодирующий nsp1, nsp2, nsp3 и nsp4 из CT83 VEEV, а также полинуклеотид, кодирующий GFP, IKK или JNK2.

Пример 5

Применяли VRP, полученные в примере 4 с помощью следующих векторов:

i) плазмида, включающая полинуклеотид, кодирующий капсидный белок CT83 VEEV, имеющий мутацию в NLS (K64N).

ii) плазмида, включающая полинуклеотид, кодирующий E3-E2-6K-E1 из CT83 VEEV дикого типа, и

iii) плазмида, включающая полинуклеотид, кодирующий nsp1, nsp2, nsp3 и nsp4 из CT83 VEEV, а также полинуклеотид, кодирующий IKK or JNK2.

Клетки 293T были инфицированы VRP, которые содержали ген IKK или JNK2. Заражение VRP клетками 293T проводили таким же образом, как в примере 2.

Экспрессия IKK в VRP-инфицированных клетках 293T была подтверждена вестерн-блоттингом. В качестве положительного контроля применяли клетки 293Т, трансфицированные плазмидой вектора экспрессии IKK. Клеточный лизат подвергали вестерн-блоттингу с Rb анти-IKK антителом («Proteintech») в качестве первого антитела (1: 500) и HRP метили анти-RbIgG в качестве вторичного антитела (1: 4000).

Результаты показаны на фиг. 13. На фиг. 13, дорожка 1 показывает клетки 293T, инфицированные VRP. Дорожка 2 показывает положительный контроль, т.е. клетки, трансфицированные плазмидами вектора экспрессии IKK. Как показано на этой фигуре, клетки 293T, инфицированные VRP, экспрессировали белок IKK.

Экспрессию JNK2 из вставленного в репликон гена JNK2 в инфицированных клетках 293T подтверждали вестерн-блоттингом. В качестве контроля применяли клетки 293Т без инфекции. В качестве первого антитела применяли мышиное антитело против JNK2 («Santa Cruz») (1: 500), а в качестве второго антитела применяли меченый HRP против IgG мыши (1: 4000). Результаты показаны на фиг. 14. Было подтверждено, что клетки 293T, инфицированные VRP, имеющими JNK2 в качестве представляющего интерес гена, экспрессируют JNK2.

Пример 6

Эффект мутации в капсиде NLS

Применяли два типа VRP, полученных в примере 4 с помощью следующих плазмид:

i-1) плазмида, включающая полинуклеотид, кодирующий капсидный белок CT83 VEEV дикого типа, или

i-2) плазмида, включающая полинуклеотид, кодирующий капсидный белок CT83 VEEV, имеющий мутацию в NLS (K64N).

ii) плазмида, включающая полинуклеотид, кодирующий E3-E2-6K-E1 из CT83 VEEV дикого типа, и

iii) плазмида, включающая полинуклеотид, кодирующий nsp1, nsp2, nsp3 и nsp4 из CT83 VEEV, а также полинуклеотид, кодирующий люциферазу.

Клетки 293T инфицировали VRP таким же образом, как в примере 2. Анализ на люциферазу проводили таким же образом, как в примере 2. Результаты показаны на фиг. 15.

На данной фигуре, контроль соответствует фоновой активности люциферазы. VRP с капсидом, имеющим мутацию в NLS, показали гораздо более высокую активность люциферазы (900556) по сравнению с VRP с капсидом WT (118063).

Данные показали, что модификация капсида приводит к более высокому выходу и экспрессии по сравнению с частицей репликона альфавируса без модификации капсида.

Пример 7

Применяли частицы репликонов вируса VEE (VRP), полученные в примере 4 путем котрансфекции клеток 293T со следующими векторами:

i) плазмида, включающая полинуклеотид, кодирующий капсидный белок CT83 VEEV, имеющий мутацию в NLS (K64N).

ii) плазмида, включающая полинуклеотид, кодирующий E3-E2-6K-E1 из CT83 VEEV дикого типа.

iii) плазмида, включающая полинуклеотид, кодирующий nsp1, nsp2, nsp3 и nsp4 из CT83 VEEV, и полинуклеотид, кодирующий GFP.

Клетки 293T инфицировали полученными таким способом VRP так же, как в примере 2. Контроль показывает нормальные клетки без инфекции. Экспрессия GFP в клетках была подтверждена. Результаты показаны на фиг. 16.

Пример 8

Применяли те же частицы репликона VEEV, которые применяли в примере 7. Клетки макрофагов J774.A1 и клетки макрофагов (BMDM), полученные из костного мозга, были инфицированы VRP. Представляющий интерес ген, кодирующий GFP, экспрессировался в трансфицированных клетках макрофагов.

Оба типа клеток обрабатывали IL-4 в течение 48-ми часов для поляризации и анализа на экспрессию GFP. Результаты показаны на фиг. 17.

Пример 9

Исследование эффективности in vivo на моделях CT26

Протокол этого примера схематически показан на фиг. 18. Применяемые в данном примере VRP были получены в примере 4 с помощью следующих плазмид:

i) плазмида, включающая полинуклеотид, кодирующий капсидный белок CT83 VEEV, имеющий мутацию в NLS (K64N),

ii) плазмида, включающая полинуклеотид, кодирующий E3-E2-6K-E1 из CT83 VEEV дикого типа, и

iii) плазмида, включающая полинуклеотид, кодирующий nsp1, nsp2, nsp3 и nsp4 из CT83 VEEV, и полинуклеотид, кодирующий киназы IκB человека (IKK).

Это исследование состоит из 4 групп, n = 8, всего 32 животных. Животные были получены. Животные были рандомизированы в день 0, когда объем опухоли достигал 60-100 мм³, и введение доз начинали в день 0 с G1: носитель, G2: анти-PD-1 mAb, G3: VRP и G4: комбинация VRP и анти-PD-1 mAb в дозе 10 мг/кг (BIWx3 и IP). Рост опухоли контролировали до 30 дня после начала лечения.

Для групп 1, 3, 4 мышам внутриопухолево вводили по 50 мкл носителя или VRP, диспергированных в носителе в день 0, 2, 4, 6, 8 и 10. VRP или носитель вводили в опухоль в правый бок с помощью 0,3 мл шприца инсулинового типа. Цель состояла в том, чтобы применять одну точку входа, но распределить материал через опухоль, перемещая иглу внутрь и наружу.

Измерения размера опухоли проводили два раза в неделю. Гуманной конечной точкой этого исследования рассматривали опухолевую нагрузку 3000 мм³ и/или потерю массы тела на 20% или более. Результаты для всех 8 животных в каждой группе показаны на фиг. 19.

Данные показывают, что VRP, включающие ген, кодирующий IKK, и комбинация VRP и антитела против PD-1, продемонстрировали превосходное противоопухолевое действие по сравнению с контрольной и однократной иммунотерапией против PD-1.

Пример 10

Химерные частицы репликона альфавируса получали таким же способом, как в примере 4, применяя следующие наборы векторов.

Химерная ARP 1

i) плазмида, включающая полинуклеотид, кодирующий капсидный белок штамма CHIKV 37997 дикого типа,

ii) плазмида, включающая полинуклеотид, кодирующий E3-E2-6K-E1 штамма CHIKV 37997 дикого типа, и

iii) плазмида, включающая полинуклеотид, кодирующий nsp1, nsp2, nsp3 и nsp4 из CT83 VEEV, и полинуклеотид, кодирующий GFP.

Химерная ARP 2

i) плазмида, включающая полинуклеотид, кодирующий капсидный белок штамма CHIKV OPY-1 дикого типа,

ii) плазмида, включающая полинуклеотид, кодирующий E3-E2-6K-E1 штамма CHIKV OPY-1 дикого типа, и

iii) плазмида, включающая полинуклеотид, кодирующий nsp1, nsp2, nsp3 и nsp4 из CT83 VEEV, и полинуклеотид, кодирующий GFP.

Полученные ARP очищали таким же способом, как в примере 1. Очищенные химерные ARP подтверждали вестерн-блоттингом с применением кроличьей сыворотки против CHIKV (1: 2000) в качестве первого антитела и козьих антител против IgG-HRP кролика (1: 4000) в качестве вторичного антитела. Результаты показаны на фиг. 20. Подтверждали генерацию обеих химерных ARP.

Клетки 293T были инфицированы химерными ARP, кодирующими GFP. После заражения клетки инкубировали в течение 48-ми часов, и экспрессию GFP подтверждали анализом FACS. В качестве контроля применяли клетки без инфекции. Результаты показаны на фиг. 21. 5,21% и 4,07% клеток, инфицированных ARPS, экспрессировали GFP, что позволяет предположить, что химерные ARP успешно экспрессировали белок GFP (представляющий интерес ген представлял собой нуклеотид, кодирующий GFP) в клетках.

Список последовательностей

674559_ST25.txt

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> VLP Therapeutics, LLC

<120> ALPHAVIRUS REPLICON PARTICLE

<130> 674559

<150> US62/608,213

<151> 2017-12-20

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 275

<212> PRT

<213> Venezuelan Equine Encephalitis Virus

<400> 1

Met Phe Pro Phe Gln Pro Met Tyr Pro Met Gln Pro Met Pro Tyr Arg

1 5 10 15

Asn Pro Phe Ala Ala Pro Arg Arg Pro Trp Phe Pro Arg Thr Asp Pro

20 25 30

Phe Leu Ala Met Gln Val Gln Glu Leu Thr Arg Ser Met Ala Asn Leu

35 40 45

Thr Phe Lys Gln Arg Arg Asp Ala Pro Pro Glu Gly Pro Ser Ala Lys

50 55 60

Lys Pro Lys Lys Glu Ala Ser Gln Lys Gln Lys Gly Gly Gly Gln Gly

65 70 75 80

Lys Lys Lys Lys Asn Gln Gly Lys Lys Lys Ala Lys Thr Gly Pro Pro

85 90 95

Asn Pro Lys Ala Gln Asn Gly Asn Lys Lys Lys Thr Asn Lys Lys Pro

100 105 110

Gly Lys Arg Gln Arg Met Val Met Lys Leu Glu Ser Asp Lys Thr Phe

115 120 125

Pro Ile Met Leu Glu Gly Lys Ile Asn Gly Tyr Ala Cys Val Val Gly

130 135 140

Gly Lys Leu Phe Arg Pro Met His Val Glu Gly Lys Ile Asp Asn Asp

145 150 155 160

Val Leu Ala Ala Leu Lys Thr Lys Lys Ala Ser Lys Tyr Asp Leu Glu

165 170 175

Tyr Ala Asp Val Pro Gln Asn Met Arg Ala Asp Thr Phe Lys Tyr Thr

180 185 190

His Glu Lys Pro Gln Gly Tyr Tyr Ser Trp His His Gly Ala Val Gln

195 200 205

Tyr Glu Asn Gly Arg Phe Thr Val Pro Lys Gly Val Gly Ala Lys Gly

210 215 220

Asp Ser Gly Arg Pro Ile Leu Asp Asn Gln Gly Arg Val Val Ala Ile

225 230 235 240

Val Leu Gly Gly Val Asn Glu Gly Ser Arg Thr Ala Leu Ser Val Val

245 250 255

Met Trp Asn Glu Lys Gly Val Thr Val Lys Tyr Thr Pro Glu Asn Cys

260 265 270

Glu Gln Trp

275

<210> 2

<211> 275

<212> PRT

<213> Venezuelan Equine Encephalitis Virus

<400> 2

Met Phe Pro Phe Gln Pro Met Tyr Pro Met Gln Pro Met Pro Tyr Arg

1 5 10 15

Asn Pro Phe Ala Ala Pro Arg Arg Pro Trp Phe Pro Arg Thr Asp Pro

20 25 30

Phe Leu Ala Met Gln Val Gln Glu Leu Thr Arg Ser Met Ala Asn Leu

35 40 45

Thr Phe Lys Gln Arg Arg Asp Ala Pro Pro Glu Gly Pro Ser Ala Asn

50 55 60

Lys Pro Lys Lys Glu Ala Ser Gln Lys Gln Lys Gly Gly Gly Gln Gly

65 70 75 80

Lys Lys Lys Lys Asn Gln Gly Lys Lys Lys Ala Lys Thr Gly Pro Pro

85 90 95

Asn Pro Lys Ala Gln Asn Gly Asn Lys Lys Lys Thr Asn Lys Lys Pro

100 105 110

Gly Lys Arg Gln Arg Met Val Met Lys Leu Glu Ser Asp Lys Thr Phe

115 120 125

Pro Ile Met Leu Glu Gly Lys Ile Asn Gly Tyr Ala Cys Val Val Gly

130 135 140

Gly Lys Leu Phe Arg Pro Met His Val Glu Gly Lys Ile Asp Asn Asp

145 150 155 160

Val Leu Ala Ala Leu Lys Thr Lys Lys Ala Ser Lys Tyr Asp Leu Glu

165 170 175

Tyr Ala Asp Val Pro Gln Asn Met Arg Ala Asp Thr Phe Lys Tyr Thr

180 185 190

His Glu Lys Pro Gln Gly Tyr Tyr Ser Trp His His Gly Ala Val Gln

195 200 205

Tyr Glu Asn Gly Arg Phe Thr Val Pro Lys Gly Val Gly Ala Lys Gly

210 215 220

Asp Ser Gly Arg Pro Ile Leu Asp Asn Gln Gly Arg Val Val Ala Ile

225 230 235 240

Val Leu Gly Gly Val Asn Glu Gly Ser Arg Thr Ala Leu Ser Val Val

245 250 255

Met Trp Asn Glu Lys Gly Val Thr Val Lys Tyr Thr Pro Glu Asn Cys

260 265 270

Glu Gln Trp

275

<210> 3

<211> 980

<212> PRT

<213> Venezuelan Equine Encephalitis Virus

<400> 3

Ser Leu Val Thr Thr Met Cys Leu Leu Ala Asn Val Thr Phe Pro Cys

1 5 10 15

Ala Gln Pro Pro Ile Cys Tyr Asp Arg Lys Pro Ala Glu Thr Leu Ala

20 25 30

Met Leu Ser Val Asn Val Asp Asn Pro Gly Tyr Asp Glu Leu Leu Glu

35 40 45

Ala Ala Val Lys Cys Pro Gly Arg Lys Arg Arg Ser Thr Glu Glu Leu

50 55 60

Phe Asn Glu Tyr Lys Leu Thr Arg Pro Tyr Met Ala Arg Cys Ile Arg

65 70 75 80

Cys Ala Val Gly Ser Cys His Ser Pro Ile Ala Ile Glu Ala Val Lys

85 90 95

Ser Asp Gly His Asp Gly Tyr Val Arg Leu Gln Thr Ser Ser Gln Tyr

100 105 110

Gly Leu Asp Ser Ser Gly Asn Leu Lys Gly Arg Thr Met Arg Tyr Asp

115 120 125

Met His Gly Thr Ile Lys Glu Ile Pro Leu His Gln Val Ser Leu Tyr

130 135 140

Thr Ser Arg Pro Cys His Ile Val Asp Gly His Gly Tyr Phe Leu Leu

145 150 155 160

Ala Arg Cys Pro Ala Gly Asp Ser Ile Thr Met Glu Phe Lys Lys Asp

165 170 175

Ser Val Arg His Ser Cys Ser Val Pro Tyr Glu Val Lys Phe Asn Pro

180 185 190

Val Gly Arg Glu Leu Tyr Thr His Pro Pro Glu His Gly Val Glu Gln

195 200 205

Ala Cys Gln Val Tyr Ala His Asp Ala Gln Asn Arg Gly Ala Tyr Val

210 215 220

Glu Met His Leu Pro Gly Ser Glu Val Asp Ser Ser Leu Val Ser Leu

225 230 235 240

Ser Gly Ser Ser Val Thr Val Thr Pro Pro Asp Gly Thr Ser Ala Leu

245 250 255

Val Glu Cys Glu Cys Gly Gly Thr Lys Ile Ser Glu Thr Ile Asn Lys

260 265 270

Thr Lys Gln Phe Ser Gln Cys Thr Lys Lys Glu Gln Cys Arg Ala Tyr

275 280 285

Arg Leu Gln Asn Asp Lys Trp Val Tyr Asn Ser Asp Lys Leu Pro Lys

290 295 300

Ala Ala Gly Ala Thr Leu Lys Gly Lys Leu His Val Pro Phe Leu Leu

305 310 315 320

Ala Asp Gly Lys Cys Thr Val Pro Leu Ala Pro Glu Pro Met Ile Thr

325 330 335

Phe Gly Phe Arg Ser Val Ser Leu Lys Leu His Pro Lys Asn Pro Thr

340 345 350

Tyr Leu Ile Thr Arg Gln Leu Ala Asp Glu Pro His Tyr Thr His Glu

355 360 365

Leu Ile Ser Glu Pro Ala Val Arg Asn Phe Thr Val Thr Glu Lys Gly

370 375 380

Trp Glu Phe Val Trp Gly Asn His Pro Pro Lys Arg Phe Trp Ala Gln

385 390 395 400

Glu Thr Ala Pro Gly Asn Pro His Gly Leu Pro His Glu Val Ile Thr

405 410 415

His Tyr Tyr His Arg Tyr Pro Met Ser Thr Ile Leu Gly Leu Ser Ile

420 425 430

Cys Ala Ala Ile Ala Thr Val Ser Val Ala Ala Ser Thr Trp Leu Phe

435 440 445

Cys Arg Ser Arg Val Ala Cys Leu Thr Pro Tyr Arg Leu Thr Pro Asn

450 455 460

Ala Arg Ile Pro Phe Cys Leu Ala Val Leu Cys Cys Ala Arg Thr Ala

465 470 475 480

Arg Ala Glu Thr Thr Trp Glu Ser Leu Asp His Leu Trp Asn Asn Asn

485 490 495

Gln Gln Met Phe Trp Ile Gln Leu Leu Ile Pro Leu Ala Ala Leu Ile

500 505 510

Val Val Thr Arg Leu Leu Arg Cys Val Cys Cys Val Val Pro Phe Leu

515 520 525

Val Met Ala Gly Ala Ala Gly Ala Gly Ala Tyr Glu His Ala Thr Thr

530 535 540

Met Pro Ser Gln Ala Gly Ile Ser Tyr Asn Thr Ile Val Asn Arg Ala

545 550 555 560

Gly Tyr Ala Pro Leu Pro Ile Ser Ile Thr Pro Thr Lys Ile Lys Leu

565 570 575

Ile Pro Thr Val Asn Leu Glu Tyr Val Thr Cys His Tyr Lys Thr Gly

580 585 590

Met Asp Ser Pro Ala Ile Lys Cys Cys Gly Ser Gln Glu Cys Thr Pro

595 600 605

Thr Tyr Arg Pro Asp Glu Gln Cys Lys Val Phe Thr Gly Val Tyr Pro

610 615 620

Phe Met Trp Gly Gly Ala Tyr Cys Phe Cys Asp Thr Glu Asn Thr Gln

625 630 635 640

Val Ser Lys Ala Tyr Val Met Lys Ser Asp Asp Cys Leu Ala Asp His

645 650 655

Ala Glu Ala Tyr Lys Ala His Thr Ala Ser Val Gln Ala Phe Leu Asn

660 665 670

Ile Thr Val Gly Glu His Ser Ile Val Thr Thr Val Tyr Val Asn Gly

675 680 685

Glu Thr Pro Val Asn Phe Asn Gly Val Lys Ile Thr Ala Gly Pro Leu

690 695 700

Ser Thr Ala Trp Thr Pro Phe Asp Arg Lys Ile Val Gln Tyr Ala Gly

705 710 715 720

Glu Ile Tyr Asn Tyr Asp Phe Pro Glu Tyr Gly Ala Gly Gln Pro Gly

725 730 735

Ala Phe Gly Asp Ile Gln Ser Arg Thr Val Ser Ser Ser Asp Leu Tyr

740 745 750

Ala Asn Thr Asn Leu Val Leu Gln Arg Pro Lys Ala Gly Ala Ile His

755 760 765

Val Pro Tyr Thr Gln Ala Pro Ser Gly Phe Glu Gln Trp Lys Lys Asp

770 775 780

Lys Ala Pro Ser Leu Lys Phe Thr Ala Pro Phe Gly Cys Glu Ile Tyr

785 790 795 800

Thr Asn Pro Ile Arg Ala Glu Asn Cys Ala Val Gly Ser Ile Pro Leu

805 810 815

Ala Phe Asp Ile Pro Asp Ala Leu Phe Thr Arg Val Ser Glu Thr Pro

820 825 830

Thr Leu Ser Ala Ala Glu Cys Thr Leu Asn Glu Cys Val Tyr Ser Ser

835 840 845

Asp Phe Gly Gly Ile Ala Thr Val Lys Tyr Ser Ala Ser Lys Ser Gly

850 855 860

Lys Cys Ala Val His Val Pro Ser Gly Thr Ala Thr Leu Lys Glu Ala

865 870 875 880

Ala Val Glu Leu Thr Glu Gln Gly Ser Ala Thr Ile His Phe Ser Thr

885 890 895

Ala Asn Ile His Pro Glu Phe Arg Leu Gln Ile Cys Thr Ser Tyr Val

900 905 910

Thr Cys Lys Gly Asp Cys His Pro Pro Lys Asp His Ile Val Thr His

915 920 925

Pro Gln Tyr His Ala Gln Thr Phe Thr Ala Ala Val Ser Lys Thr Ala

930 935 940

Trp Thr Trp Leu Thr Ser Leu Leu Gly Gly Ser Ala Val Ile Ile Ile

945 950 955 960

Ile Gly Leu Val Leu Ala Thr Ile Val Ala Met Tyr Val Leu Thr Asn

965 970 975

Gln Lys His Asn

980

<210> 4

<211> 981

<212> PRT

<213> Venezuelan Equine Encephalitis Virus

<400> 4

Ser Leu Val Thr Thr Met Cys Leu Leu Ala Asn Val Thr Phe Pro Cys

1 5 10 15

Ala Gln Pro Pro Ile Cys Tyr Asp Arg Lys Pro Ala Glu Thr Leu Ala

20 25 30

Met Leu Ser Val Asn Val Asp Asn Pro Gly Tyr Asp Glu Leu Leu Glu

35 40 45

Ala Ala Val Lys Cys Pro Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ser Thr Glu Glu

50 55 60

Leu Phe Asn Glu Tyr Lys Leu Thr Arg Pro Tyr Met Ala Arg Cys Ile

65 70 75 80

Arg Cys Ala Val Gly Ser Cys His Ser Pro Ile Ala Ile Glu Ala Val

85 90 95

Lys Ser Asp Gly His Asp Gly Tyr Val Arg Leu Gln Thr Ser Ser Gln

100 105 110

Tyr Gly Leu Asp Ser Ser Gly Asn Leu Lys Gly Arg Thr Met Arg Tyr

115 120 125

Asp Met His Gly Thr Ile Lys Glu Ile Pro Leu His Gln Val Ser Leu

130 135 140

Tyr Thr Ser Arg Pro Cys His Ile Val Asp Gly His Gly Tyr Phe Leu

145 150 155 160

Leu Ala Arg Cys Pro Ala Gly Asp Ser Ile Thr Met Glu Phe Lys Lys

165 170 175

Asp Ser Val Arg His Ser Cys Ser Val Pro Tyr Glu Val Lys Phe Asn

180 185 190

Pro Val Gly Arg Glu Leu Tyr Thr His Pro Pro Glu His Gly Val Glu

195 200 205

Gln Ala Cys Gln Val Tyr Ala His Asp Ala Gln Asn Arg Gly Ala Tyr

210 215 220

Val Glu Met His Leu Pro Gly Ser Glu Val Asp Ser Ser Leu Val Ser

225 230 235 240

Leu Ser Gly Ser Ser Val Thr Val Thr Pro Pro Asp Gly Thr Ser Ala

245 250 255

Leu Val Glu Cys Glu Cys Gly Gly Thr Lys Ile Ser Glu Thr Ile Asn

260 265 270

Lys Thr Lys Gln Phe Ser Gln Cys Thr Lys Lys Glu Gln Cys Arg Ala

275 280 285

Tyr Arg Leu Gln Asn Asp Lys Trp Val Tyr Asn Ser Asp Lys Leu Pro

290 295 300

Lys Ala Ala Gly Ala Thr Leu Lys Gly Lys Leu His Val Pro Phe Leu

305 310 315 320

Leu Ala Asp Gly Lys Cys Thr Val Pro Leu Ala Pro Glu Pro Met Ile

325 330 335

Thr Phe Gly Phe Arg Ser Val Ser Leu Lys Leu His Pro Lys Asn Pro

340 345 350

Thr Tyr Leu Ile Thr Arg Gln Leu Ala Asp Glu Pro His Tyr Thr His

355 360 365

Glu Leu Ile Ser Glu Pro Ala Val Arg Asn Phe Thr Val Thr Glu Lys

370 375 380

Gly Trp Glu Phe Val Trp Gly Asn His Pro Pro Lys Arg Phe Trp Ala

385 390 395 400

Gln Glu Thr Ala Pro Gly Asn Pro His Gly Leu Pro His Glu Val Ile

405 410 415

Thr His Tyr Tyr His Arg Tyr Pro Met Ser Thr Ile Leu Gly Leu Ser

420 425 430

Ile Cys Ala Ala Ile Ala Thr Val Ser Val Ala Ala Ser Thr Trp Leu

435 440 445

Phe Cys Arg Ser Arg Val Ala Cys Leu Thr Pro Tyr Arg Leu Thr Pro

450 455 460

Asn Ala Arg Ile Pro Phe Cys Leu Ala Val Leu Cys Cys Ala Arg Thr

465 470 475 480

Ala Arg Ala Glu Thr Thr Trp Glu Ser Leu Asp His Leu Trp Asn Asn

485 490 495

Asn Gln Gln Met Phe Trp Ile Gln Leu Leu Ile Pro Leu Ala Ala Leu

500 505 510

Ile Val Val Thr Arg Leu Leu Arg Cys Val Cys Cys Val Val Pro Phe

515 520 525

Leu Val Met Ala Gly Ala Ala Gly Ala Gly Ala Tyr Glu His Ala Thr

530 535 540

Thr Met Pro Ser Gln Ala Gly Ile Ser Tyr Asn Thr Ile Val Asn Arg

545 550 555 560

Ala Gly Tyr Ala Pro Leu Pro Ile Ser Ile Thr Pro Thr Lys Ile Lys

565 570 575

Leu Ile Pro Thr Val Asn Leu Glu Tyr Val Thr Cys His Tyr Lys Thr

580 585 590

Gly Met Asp Ser Pro Ala Ile Lys Cys Cys Gly Ser Gln Glu Cys Thr

595 600 605

Pro Thr Tyr Arg Pro Asp Glu Gln Cys Lys Val Phe Thr Gly Val Tyr

610 615 620

Pro Phe Met Trp Gly Gly Ala Tyr Cys Phe Cys Asp Thr Glu Asn Thr

625 630 635 640

Gln Val Ser Lys Ala Tyr Val Met Lys Ser Asp Asp Cys Leu Ala Asp

645 650 655

His Ala Glu Ala Tyr Lys Ala His Thr Ala Ser Val Gln Ala Phe Leu

660 665 670

Asn Ile Thr Val Gly Glu His Ser Ile Val Thr Thr Val Tyr Val Asn

675 680 685

Gly Glu Thr Pro Val Asn Phe Asn Gly Val Lys Ile Thr Ala Gly Pro

690 695 700

Leu Ser Thr Ala Trp Thr Pro Phe Asp Arg Lys Ile Val Gln Tyr Ala

705 710 715 720

Gly Glu Ile Tyr Asn Tyr Asp Phe Pro Glu Tyr Gly Ala Gly Gln Pro

725 730 735

Gly Ala Phe Gly Asp Ile Gln Ser Arg Thr Val Ser Ser Ser Asp Leu

740 745 750

Tyr Ala Asn Thr Asn Leu Val Leu Gln Arg Pro Lys Ala Gly Ala Ile

755 760 765

His Val Pro Tyr Thr Gln Ala Pro Ser Gly Phe Glu Gln Trp Lys Lys

770 775 780

Asp Lys Ala Pro Ser Leu Lys Phe Thr Ala Pro Phe Gly Cys Glu Ile

785 790 795 800

Tyr Thr Asn Pro Ile Arg Ala Glu Asn Cys Ala Val Gly Ser Ile Pro

805 810 815

Leu Ala Phe Asp Ile Pro Asp Ala Leu Phe Thr Arg Val Ser Glu Thr

820 825 830

Pro Thr Leu Ser Ala Ala Glu Cys Thr Leu Asn Glu Cys Val Tyr Ser

835 840 845

Ser Asp Phe Gly Gly Ile Ala Thr Val Lys Tyr Ser Ala Ser Lys Ser

850 855 860

Gly Lys Cys Ala Val His Val Pro Ser Gly Thr Ala Thr Leu Lys Glu

865 870 875 880

Ala Ala Val Glu Leu Thr Glu Gln Gly Ser Ala Thr Ile His Phe Ser

885 890 895

Thr Ala Asn Ile His Pro Glu Phe Arg Leu Gln Ile Cys Thr Ser Tyr

900 905 910

Val Thr Cys Lys Gly Asp Cys His Pro Pro Lys Asp His Ile Val Thr

915 920 925

His Pro Gln Tyr His Ala Gln Thr Phe Thr Ala Ala Val Ser Lys Thr

930 935 940

Ala Trp Thr Trp Leu Thr Ser Leu Leu Gly Gly Ser Ala Val Ile Ile

945 950 955 960

Ile Ile Gly Leu Val Leu Ala Thr Ile Val Ala Met Tyr Val Leu Thr

965 970 975

Asn Gln Lys His Asn

980

<210> 5

<211> 11542

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Genomic RNA expression Vector including Luciferase gene

nucleotide

<400> 5

ttctcatgtt tgacagctta tcatcgatgc accgtgcatg ccgattggtg gaagtaaggt 60

ggtacgatcg tgccttatta ggaaggcaac agacaggtct gacatggatt ggacgaacca 120

ctgaattccg cattgcagag ataattgtat ttaagtgcct agctcgatac aataaacgcc 180

atttgaccat tcaccacatt ggtgtgcacc tccaataggc ggcgcatgag agaagcccag 240

accaattacc tacccaaaat ggagaaagtt cacgttgaca tcgaggaaga cagcccattc 300

ctcagagctt tgcagcggag cttcccgcag tttgaggtag aagccaagca ggtcactgat 360

aatgaccatg ctaatgccag agcgttttcg catctggctt caaaactgat cgaaacggag 420

gtggacccat ccgacacgat ccttgacatt ggaagtgcgc ccgcccgcag aatgtattct 480

aagcacaagt atcattgtat ctgtccgatg agatgtgcgg aagatccgga cagattgtat 540

aagtatgcaa ctaagctgaa gaaaaactgt aaggaaataa ctgataagga attggacaag 600

aaaatgaagg agctcgccgc cgtcatgagc gaccctgacc tggaaactga gactatgtgc 660

ctccacgacg acgagcgtgt cgctacgaag ggcaagtcgc tgtttaccag gatgtatacg 720

cggttgacgg accgacaagt ctctatcacc aagccaataa gggagttaga gtcgcctact 780

ggataggctt tgacaccacc ccttttatgt ttaagaactt ggctggagca tatccatcat 840

actctaccaa ctgggccgac gaaaccgtgt taacggctcg taacataggc ctatgcagct 900

ctgacgttat ggagcggtca cgtagaggga tgtccattct tagaaagaag tatttgaaac 960

catccaacaa tgttctattc tctgttggct cgaccatcta ccacgagaag agggacttac 1020

tgaggagctg gcacctgccg tctgtatttc acttacgtgg caagcaaaat tacacatgtc 1080

ggtgtgagac tatagttagt tgcgacgggt acgtcgttaa aagaatagct atcagtccag 1140

gcctgtatgg gaagccttca ggctatgctg ctacgatgca ccgcgaggga ttcttgtgct 1200

gcaaagtgac agacacattg aacggggaga gggtctcttt tcccgtgtgc acgtatgtgc 1260

cagctacatt gtgtgaccaa atgactggca tactggcaac agatgtcagt gcggacgacg 1320

cgcaaaaact gctggttggg ctcaaccagc gtatagtcgt caacggtcgc acccagagaa 1380

acaccaatac catgaaaaat taccttttgc ccgtagtggc ccaggcattt gctaggtggg 1440

caaaggaata taaggaagat caagaagatg aaaggccact aggactacga gatagacagt 1500

tagtcatggg gtgttgttgg gcttttagaa ggcacaagat aacatctatt tataagcgcc 1560

cggataccca aaccatcatc aaagtgaaca gcgatttcca ctcattcgtg ctgcccagga 1620

taggcagtaa cacattggag atcgggctga gaacaagaat caggaaaatg ttagaggagc 1680

acaaggagcc gtcacctctc attaccgccg aggacgtaca agaagctaag tgcgcagccg 1740

atgaggctaa ggaggtgcgt gaagccgagg agttgcgcgc agctctacca cctttggcag 1800

ctgatgttga ggagcccact ctggaagccg atgtcgactt gatgttacaa gaggctgggg 1860

ccggctcagt ggagacacct cgtggcttga taaaggttac cagctacgat ggcgaggaca 1920

agatcggctc ttacgctgtg ctttctccgc aggctgtact caagagtgaa aaattatctt 1980

gcatccaccc tctcgctgaa caagtcatag tgataacaca ctctggccga aaagggcgtt 2040

atgccgtgga accataccat ggtaaagtag tggtgccaga gggacatgca atacccgtcc 2100

aggactttca agctctgagt gaaagtgcca ccattgtgta caacgaacgt gagttcgtaa 2160

acaggtacct gcaccatatt gccacacatg gaggagcgct gaacactgat gaagaatatt 2220

acaaaactgt caagcccagc gagcacgacg gcgaatacct gtacgacatc gacaggaaac 2280

agtgcgtcaa gaaagaacta gtcactgggc tagggctcac aggcgagctg gtggatcctc 2340

ccttccatga attcgcctac gagagtctga gaacacgacc agccgctcct taccaagtac 2400

caaccatagg ggtgtatggc gtgccaggat caggcaagtc tggcatcatt aaaagcgcag 2460

tcaccaaaaa agatctagtg gtgagcgcca agaaagaaaa ctgtgcagaa attataaggg 2520

acgtcaagaa aatgaaaggg ctggacgtca atgccagaac tgtggactca gtgctcttga 2580

atggatgcaa acaccccgta gagaccctgt atattgacga agcttttgct tgtcatgcag 2640

gtactctcag agcgctcata gccattataa gacctaaaaa ggcagtgctc tgcggggatc 2700

ccaaacagtg cggttttttt aacatgatgt gcctgaaagt gcattttaac cacgagattt 2760

gcacacaagt cttccacaaa agcatctctc gccgttgcac taaatctgtg acttcggtcg 2820

tctcaacctt gttttacgac aaaaaaatga gaacgacgaa tccgaaagag actaagattg 2880

tgattgacac taccggcagt accaaaccta agcaggacga tctcattctc acttgtttca 2940

gagggtgggt gaagcagttg caaatagatt acaaaggcaa cgaaataatg acggcagctg 3000

cctctcaagg gctgacccgt aaaggtgtgt atgccgttcg gtacaaggtg aatgaaaatc 3060

ctctgtacgc acccacctca gaacatgtga acgtcctact gacccgcacg gaggaccgca 3120

tcgtgtggaa aacactagcc ggcgacccat ggataaaaac actgactgcc aagtaccctg 3180

ggaatttcac tgccacgata gaggagtggc aagcagagca tgatgccatc atgaggcaca 3240

tcttggagag accggaccct accgacgtct tccagaataa ggcaaacgtg tgttgggcca 3300

aggctttagt gccggtgctg aagaccgctg gcatagacat gaccactgaa caatggaaca 3360

ctgtggatta ttttgaaacg gacaaagctc actcagcaga gatagtattg aaccaactat 3420

gcgtgaggtt ctttggactc gatctggact ccggtctatt ttctgcaccc actgttccgt 3480

tatccattag gaataatcac tgggataact ccccgtcgcc taacatgtac gggctgaata 3540

aagaagtggt ccgtcagctc tctcgcaggt acccacaact gcctcgggca gttgccactg 3600

gaagagtcta tgacatgaac actggtacac tgcgcaatta tgatccgcgc ataaacctag 3660

tacctgtaaa cagaagactg cctcatgctt tagtcctcca ccataatgaa cacccacaga 3720

gtgacttttc ttcattcgtc agcaaattga agggcagaac tgtcctggtg gtcggggaaa 3780

agttgtccgt cccaggcaaa atggttgact ggttgtcaga ccggcctgag gctaccttca 3840

gagctcggct ggatttaggc atcccaggtg atgtgcccaa atatgacata atatttgtta 3900

atgtgaggac cccatataaa taccatcact atcagcagtg tgaagaccat gccattaagc 3960

ttagcatgtt gaccaagaaa gcttgtctgc atctgaatcc cggcggaacc tgtgtcagca 4020

taggttatgg ttacgctgac agggccagcg aaagcatcat tggtgctata gcgcggcagt 4080

tcaagttttc ccgggtatgc aaaccgaaat cctcacttga agagacggaa gttctgtttg 4140

tattcattgg gtacgatcgc aaggcccgta cgcacaatcc ttacaagctt tcatcaacct 4200

tgaccaacat ttatacaggt tccagactcc acgaagccgg atgtgcaccc tcatatcatg 4260

tggtgcgagg ggatattgcc acggccaccg aaggagtgat tataaatgct gctaacagca 4320

aaggacaacc tggcggaggg gtgtgcggag cgctgtataa gaaattcccg gaaagcttcg 4380

atttacagcc gatcgaagta ggaaaagcgc gactggtcaa aggtgcagct aaacatatca 4440

ttcatgccgt aggaccaaac ttcaacaaag tttcggaggt tgaaggtgac aaacagttgg 4500

cagaggctta tgagtccatc gctaagattg tcaacgataa caattacaag tcagtagcga 4560

ttccactgtt gtccaccggc atcttttccg ggaacaaaga tcgactaacc caatcattga 4620

accatttgct gacagcttta gacaccactg atgcagatgt agccatatac tgcagggaca 4680

agaaatggga aatgactctc aaggaagcag tggctaggag agaagcagtg gaggagatat 4740

gcatatccga cgactcttca gtgacagaac ctgatgcaga gctggtgagg gtgcatccga 4800

agagttcttt ggctggaagg aagggctaca gcacaagcga tggcaaaact ttctcatatt 4860

tggaagggac caagtttcac caggcggcca aggatatagc agaaattaat gccatgtggc 4920

ccgttgcaac ggaggccaat gagcaggtat gcatgtatat cctcggagaa agcatgagca 4980

gtattaggtc gaaatgcccc gtcgaagagt cggaagcctc cacaccacct agcacgctgc 5040

cttgcttgtg catccatgcc atgactccag aaagagtaca gcgcctaaaa gcctcacgtc 5100

cagaacaaat tactgtgtgc tcatcctttc cattgccgaa gtatagaatc actggtgtgc 5160

agaagatcca atgctcccag cctatattgt tctcaccgaa agtgcctgcg tatattcatc 5220

caaggaagta tctcgtggaa acaccaccgg tagacgagac tccggagcca tcggcagaga 5280

accaatccac agaggggaca cctgaacaac caccacttat aaccgaggat gagaccagga 5340

ctagaacgcc tgagccgatc atcatcgaag aggaagaaga ggatagcata agtttgctgt 5400

cagatggccc gacccaccag gtgctgcaag tcgaggcaga cattcacggg ccgccctctg 5460

tatctagctc atcctggtcc attcctcatg catccgactt tgatgtggac agtttatcca 5520

tacttgacac cctggaggga gctagcgtga ccagcggggc aacgtcagcc gagactaact 5580

cttacttcgc aaagagtatg gagtttctgg cgcgaccggt gcctgcgcct cgaacagtat 5640

tcaggaaccc tccacatccc gctccgcgca caagaacacc gtcacttgca cccagcaggg 5700

cctgctcgag aaccagccta gtttccaccc cgccaggcgt gaatagggtg atcactagag 5760

aggagctcga ggcgcttacc ccgtcacgca ctcctagcag gtcggtctcg agaaccagcc 5820

tggtctccaa cccgccaggc gtaaataggg tgattacaag agaggagttt gaggcgttcg 5880

tagcacaaca acaatgacgg tttgatgcgg gtgcatacat cttttcctcc gacaccggtc 5940

aagggcattt acaacaaaaa tcagtaaggc aaacggtgct atccgaagtg gtgttggaga 6000

ggaccgaatt ggagatttcg tatgccccgc gcctcgacca agaaaaagaa gaattactac 6060

gcaagaaatt acagttaaat cccacacctg ctaacagaag cagataccag tccaggaagg 6120

tggagaacat gaaagccata acagctagac gtattctgca aggcctaggg cattatttga 6180

aggcagaagg aaaagtggag tgctaccgaa ccctgcatcc tgttcctttg tattcatcta 6240

gtgtgaaccg tgccttttca agccccaagg tcgcagtgga agcctgtaac gccatgttga 6300

aagagaactt tccgactgtg gcttcttact gtattattcc agagtacgat gcctatttgg 6360

acatggttga cggagcttca tgctgcttag acactgccag tttttgccct gcaaagctgc 6420

gcagctttcc aaagaaacac tcctatttgg aacccacaat acgatcggca gtgccttcag 6480

cgatccagaa cacgctccag aacgtcctgg cagctgccac aaaaagaaat tgcaatgtca 6540

cgcaaatgag agaattgccc gtattggatt cggcggcctt taatgtggaa tgcttcaaga 6600

aatatgcgtg taataatgaa tattgggaaa cgtttaaaga aaaccccatc aggcttactg 6660

aagaaaacgt ggtaaattac attaccaaat taaaaggacc aaaagctgct gctctttttg 6720

cgaagacaca taatttgaat atgttgcagg acataccaat ggacaggttt gtaatggact 6780

taaagagaga cgtgaaagtg actccaggaa caaaacatac tgaagaacgg cccaaggtac 6840

aggtgatcca ggctgccgat ccgctagcaa cagcgtatct gtgcggaatc caccgagagc 6900

tggttaggag attaaatgcg gtcctgcttc cgaacattca tacactgttt gatatgtcgg 6960

ctgaagactt tgacgctatt atagccgagc acttccagcc tggggattgt gttctggaaa 7020

ctgacatcgc gtcgtttgat aaaagtgagg acgacgccat ggctctgacc gcgttaatga 7080

ttctggaaga cttaggtgtg gacgcagagc tgttgacgct gattgaggcg gctttcggcg 7140

aaatttcatc aatacatttg cccactaaaa ctaaatttaa attcggagcc atgatgaaat 7200

ctggaatgtt cctcacactg tttgtgaaca cagtcattaa cattgtaatc gcaagcagag 7260

tgttgagaga acggctaacc ggatcaccat gtgcagcatt cattggagat gacaatatcg 7320

tgaaaggagt caaatcggac aaattaatgg cagacaggtg cgccacctgg ttgaatatgg 7380

aagtcaagat tatagatgct gtggtgggcg agaaagcgcc ttatttctgt ggagggttta 7440

ttttgtgtga ctccgtgacc ggcacagcgt gccgtgtggc agacccccta aaaaggctgt 7500

ttaagcttgg caaacctctg gcagcagacg atgaacatga tgatgacagg agaagggcat 7560

tgcatgaaga gtcaacacgc tggaaccgag tgggtattct ttcagagctg tgcaaggcag 7620

tagaatcaag gtatgaaacc gtaggaactt ccatcatagt tatggccatg actactctag 7680

ctagcagtgt taaatcattc agctacctga gaggggcccc tataactctc tacggctaac 7740

ctgaatggac tacgacatag tctagtccgc caagatggtc ttcacactcg aagatttcgt 7800

tggggactgg cgacagacag ccggctacaa cctggaccaa gtccttgaac agggaggtgt 7860

gtccagtttg tttcagaatc tcggggtgtc cgtaactccg atccaaagga ttgtcctgag 7920

cggtgaaaat gggctgaaga tcgacatcca tgtcatcatc ccgtatgaag gtctgagcgg 7980

cgaccaaatg ggccagatcg aaaaaatttt taaggtggtg taccctgtgg atgatcatca 8040

ctttaaggtg atcctgcact atggcacact ggtaatcgac ggggttacgc cgaacatgat 8100

cgactatttc ggacggccgt atgaaggcat cgccgtgttc gacggcaaaa agatcactgt 8160

aacagggacc ctgtggaacg gcaacaaaat tatcgacgag cgcctgatca accccgacgg 8220

ctccctgctg ttccgagtaa ccatcaacgg agtgaccggc tggcggctgt gcgaacgcat 8280

tctggcgtaa atacagcagc aattggcaag ctgcttacat agaactcgcg gcgattggca 8340

tgccgcctta aaatttttat tttatttttc ttttcttttc cgaatcggat tttgttttta 8400

atatttcaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 8460

aatcgcgaca gacatgataa gatacattga tgagtttgga caaaccacaa ctagaatgca 8520

gtgaaaaaaa tgctttattt gtgaaatttg tgatgctatt gctttatttg taaccattat 8580

aagctgcaat aaacaagtta acaacaacaa ttgcattcat tttatgtttc aggttcaggg 8640

ggaggtgtgg gaggtttttt aggacccggc taggctggcg gggttgcctt actggttagc 8700

agaatgaatc accgatacgc gagcgaacgt gaagcgactg ctgctgcaaa acgtctgcga 8760

cctgagcaac aacatgaatg gtcttcggtt tccgtgtttc gtaaagtctg gaaacgcgga 8820

agtcagcgcc ctgcaccatt atgttccgga tctgcatcgc aggatgctgc tggctaccct 8880

gtggaacacc tacatctgta ttaacgaagc gctggcattg accctgagtg atttttctct 8940

ggtcccgccg catccatacc gccagttgtt taccctcaca acgttccagt aaccgggcat 9000

gttcatcatc agtaacccgt atcgtgagca tcctctctcg tttcatcggt atcattaccc 9060

ccatgaacag aaatccccct tacacggagg catcagtgac caaacaggaa aaaaccgccc 9120

ttaacatggc ccgctttatc agaagccaga cattaacgct tctggagaaa ctcaacgagc 9180

tggacgcgga tgaacaggca gacatctgtg aatcgcttca cgaccacgct gatgagcttt 9240

accgcagctg cctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac atgcagctcc 9300

cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc cgtcagggcg 9360

cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggcg cagccatgac ccagtcacgt agcgatagcg 9420

gagtgtatac tggcttaact atgcggcatc agagcagatt gtactgagag tgcaccatat 9480

gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc gctcttccgc 9540

ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca 9600

ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg 9660

agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca 9720

taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa 9780

cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc 9840

tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc 9900

gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct 9960

gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg 10020

tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag 10080

gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta 10140

cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg 10200

aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt 10260

tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt 10320

ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag 10380

attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat 10440

ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc 10500

tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat 10560

aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc 10620

acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag 10680

aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag 10740

agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgctg caggcatcgt 10800

ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg 10860

agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt 10920

tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc 10980

tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc 11040

attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa cacgggataa 11100

taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg 11160

aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc 11220

caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag 11280

gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt 11340

cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt 11400

tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc 11460

acctgacgtc taagaaacca ttattatcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac 11520

gaggcccttt cgtcttcaag aa 11542

<210> 6

<211> 11596

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Genomic RNA expression Vector including Luciferase gene with

Multiple cloning sites

<400> 6

ttctcatgtt tgacagctta tcatcgatgc accgtgcatg ccgattggtg gaagtaaggt 60

ggtacgatcg tgccttatta ggaaggcaac agacaggtct gacatggatt ggacgaacca 120

ctgaattccg cattgcagag ataattgtat ttaagtgcct agctcgatac aataaacgcc 180

atttgaccat tcaccacatt ggtgtgcacc tccaataggc ggcgcatgag agaagcccag 240

accaattacc tacccaaaat ggagaaagtt cacgttgaca tcgaggaaga cagcccattc 300

ctcagagctt tgcagcggag cttcccgcag tttgaggtag aagccaagca ggtcactgat 360

aatgaccatg ctaatgccag agcgttttcg catctggctt caaaactgat cgaaacggag 420

gtggacccat ccgacacgat ccttgacatt ggaagtgcgc ccgcccgcag aatgtattct 480

aagcacaagt atcattgtat ctgtccgatg agatgtgcgg aagatccgga cagattgtat 540

aagtatgcaa ctaagctgaa gaaaaactgt aaggaaataa ctgataagga attggacaag 600

aaaatgaagg agctcgccgc cgtcatgagc gaccctgacc tggaaactga gactatgtgc 660

ctccacgacg acgagcgtgt cgctacgaag ggcaagtcgc tgtttaccag gatgtatacg 720

cggttgacgg accgacaagt ctctatcacc aagccaataa gggagttaga gtcgcctact 780

ggataggctt tgacaccacc ccttttatgt ttaagaactt ggctggagca tatccatcat 840

actctaccaa ctgggccgac gaaaccgtgt taacggctcg taacataggc ctatgcagct 900

ctgacgttat ggagcggtca cgtagaggga tgtccattct tagaaagaag tatttgaaac 960

catccaacaa tgttctattc tctgttggct cgaccatcta ccacgagaag agggacttac 1020

tgaggagctg gcacctgccg tctgtatttc acttacgtgg caagcaaaat tacacatgtc 1080

ggtgtgagac tatagttagt tgcgacgggt acgtcgttaa aagaatagct atcagtccag 1140

gcctgtatgg gaagccttca ggctatgctg ctacgatgca ccgcgaggga ttcttgtgct 1200

gcaaagtgac agacacattg aacggggaga gggtctcttt tcccgtgtgc acgtatgtgc 1260

cagctacatt gtgtgaccaa atgactggca tactggcaac agatgtcagt gcggacgacg 1320

cgcaaaaact gctggttggg ctcaaccagc gtatagtcgt caacggtcgc acccagagaa 1380

acaccaatac catgaaaaat taccttttgc ccgtagtggc ccaggcattt gctaggtggg 1440

caaaggaata taaggaagat caagaagatg aaaggccact aggactacga gatagacagt 1500

tagtcatggg gtgttgttgg gcttttagaa ggcacaagat aacatctatt tataagcgcc 1560

cggataccca aaccatcatc aaagtgaaca gcgatttcca ctcattcgtg ctgcccagga 1620

taggcagtaa cacattggag atcgggctga gaacaagaat caggaaaatg ttagaggagc 1680

acaaggagcc gtcacctctc attaccgccg aggacgtaca agaagctaag tgcgcagccg 1740

atgaggctaa ggaggtgcgt gaagccgagg agttgcgcgc agctctacca cctttggcag 1800

ctgatgttga ggagcccact ctggaagccg atgtcgactt gatgttacaa gaggctgggg 1860

ccggctcagt ggagacacct cgtggcttga taaaggttac cagctacgat ggcgaggaca 1920

agatcggctc ttacgctgtg ctttctccgc aggctgtact caagagtgaa aaattatctt 1980

gcatccaccc tctcgctgaa caagtcatag tgataacaca ctctggccga aaagggcgtt 2040

atgccgtgga accataccat ggtaaagtag tggtgccaga gggacatgca atacccgtcc 2100

aggactttca agctctgagt gaaagtgcca ccattgtgta caacgaacgt gagttcgtaa 2160

acaggtacct gcaccatatt gccacacatg gaggagcgct gaacactgat gaagaatatt 2220

acaaaactgt caagcccagc gagcacgacg gcgaatacct gtacgacatc gacaggaaac 2280

agtgcgtcaa gaaagaacta gtcactgggc tagggctcac aggcgagctg gtggatcctc 2340

ccttccatga attcgcctac gagagtctga gaacacgacc agccgctcct taccaagtac 2400

caaccatagg ggtgtatggc gtgccaggat caggcaagtc tggcatcatt aaaagcgcag 2460

tcaccaaaaa agatctagtg gtgagcgcca agaaagaaaa ctgtgcagaa attataaggg 2520

acgtcaagaa aatgaaaggg ctggacgtca atgccagaac tgtggactca gtgctcttga 2580

atggatgcaa acaccccgta gagaccctgt atattgacga agcttttgct tgtcatgcag 2640

gtactctcag agcgctcata gccattataa gacctaaaaa ggcagtgctc tgcggggatc 2700

ccaaacagtg cggttttttt aacatgatgt gcctgaaagt gcattttaac cacgagattt 2760

gcacacaagt cttccacaaa agcatctctc gccgttgcac taaatctgtg acttcggtcg 2820

tctcaacctt gttttacgac aaaaaaatga gaacgacgaa tccgaaagag actaagattg 2880

tgattgacac taccggcagt accaaaccta agcaggacga tctcattctc acttgtttca 2940

gagggtgggt gaagcagttg caaatagatt acaaaggcaa cgaaataatg acggcagctg 3000

cctctcaagg gctgacccgt aaaggtgtgt atgccgttcg gtacaaggtg aatgaaaatc 3060

ctctgtacgc acccacctca gaacatgtga acgtcctact gacccgcacg gaggaccgca 3120

tcgtgtggaa aacactagcc ggcgacccat ggataaaaac actgactgcc aagtaccctg 3180

ggaatttcac tgccacgata gaggagtggc aagcagagca tgatgccatc atgaggcaca 3240

tcttggagag accggaccct accgacgtct tccagaataa ggcaaacgtg tgttgggcca 3300

aggctttagt gccggtgctg aagaccgctg gcatagacat gaccactgaa caatggaaca 3360

ctgtggatta ttttgaaacg gacaaagctc actcagcaga gatagtattg aaccaactat 3420

gcgtgaggtt ctttggactc gatctggact ccggtctatt ttctgcaccc actgttccgt 3480

tatccattag gaataatcac tgggataact ccccgtcgcc taacatgtac gggctgaata 3540

aagaagtggt ccgtcagctc tctcgcaggt acccacaact gcctcgggca gttgccactg 3600

gaagagtcta tgacatgaac actggtacac tgcgcaatta tgatccgcgc ataaacctag 3660

tacctgtaaa cagaagactg cctcatgctt tagtcctcca ccataatgaa cacccacaga 3720

gtgacttttc ttcattcgtc agcaaattga agggcagaac tgtcctggtg gtcggggaaa 3780

agttgtccgt cccaggcaaa atggttgact ggttgtcaga ccggcctgag gctaccttca 3840

gagctcggct ggatttaggc atcccaggtg atgtgcccaa atatgacata atatttgtta 3900

atgtgaggac cccatataaa taccatcact atcagcagtg tgaagaccat gccattaagc 3960

ttagcatgtt gaccaagaaa gcttgtctgc atctgaatcc cggcggaacc tgtgtcagca 4020

taggttatgg ttacgctgac agggccagcg aaagcatcat tggtgctata gcgcggcagt 4080

tcaagttttc ccgggtatgc aaaccgaaat cctcacttga agagacggaa gttctgtttg 4140

tattcattgg gtacgatcgc aaggcccgta cgcacaatcc ttacaagctt tcatcaacct 4200

tgaccaacat ttatacaggt tccagactcc acgaagccgg atgtgcaccc tcatatcatg 4260

tggtgcgagg ggatattgcc acggccaccg aaggagtgat tataaatgct gctaacagca 4320

aaggacaacc tggcggaggg gtgtgcggag cgctgtataa gaaattcccg gaaagcttcg 4380

atttacagcc gatcgaagta ggaaaagcgc gactggtcaa aggtgcagct aaacatatca 4440

ttcatgccgt aggaccaaac ttcaacaaag tttcggaggt tgaaggtgac aaacagttgg 4500

cagaggctta tgagtccatc gctaagattg tcaacgataa caattacaag tcagtagcga 4560

ttccactgtt gtccaccggc atcttttccg ggaacaaaga tcgactaacc caatcattga 4620

accatttgct gacagcttta gacaccactg atgcagatgt agccatatac tgcagggaca 4680

agaaatggga aatgactctc aaggaagcag tggctaggag agaagcagtg gaggagatat 4740

gcatatccga cgactcttca gtgacagaac ctgatgcaga gctggtgagg gtgcatccga 4800

agagttcttt ggctggaagg aagggctaca gcacaagcga tggcaaaact ttctcatatt 4860

tggaagggac caagtttcac caggcggcca aggatatagc agaaattaat gccatgtggc 4920

ccgttgcaac ggaggccaat gagcaggtat gcatgtatat cctcggagaa agcatgagca 4980

gtattaggtc gaaatgcccc gtcgaagagt cggaagcctc cacaccacct agcacgctgc 5040

cttgcttgtg catccatgcc atgactccag aaagagtaca gcgcctaaaa gcctcacgtc 5100

cagaacaaat tactgtgtgc tcatcctttc cattgccgaa gtatagaatc actggtgtgc 5160

agaagatcca atgctcccag cctatattgt tctcaccgaa agtgcctgcg tatattcatc 5220

caaggaagta tctcgtggaa acaccaccgg tagacgagac tccggagcca tcggcagaga 5280

accaatccac agaggggaca cctgaacaac caccacttat aaccgaggat gagaccagga 5340

ctagaacgcc tgagccgatc atcatcgaag aggaagaaga ggatagcata agtttgctgt 5400

cagatggccc gacccaccag gtgctgcaag tcgaggcaga cattcacggg ccgccctctg 5460

tatctagctc atcctggtcc attcctcatg catccgactt tgatgtggac agtttatcca 5520

tacttgacac cctggaggga gctagcgtga ccagcggggc aacgtcagcc gagactaact 5580

cttacttcgc aaagagtatg gagtttctgg cgcgaccggt gcctgcgcct cgaacagtat 5640

tcaggaaccc tccacatccc gctccgcgca caagaacacc gtcacttgca cccagcaggg 5700

cctgctcgag aaccagccta gtttccaccc cgccaggcgt gaatagggtg atcactagag 5760

aggagctcga ggcgcttacc ccgtcacgca ctcctagcag gtcggtctcg agaaccagcc 5820

tggtctccaa cccgccaggc gtaaataggg tgattacaag agaggagttt gaggcgttcg 5880

tagcacaaca acaatgacgg tttgatgcgg gtgcatacat cttttcctcc gacaccggtc 5940

aagggcattt acaacaaaaa tcagtaaggc aaacggtgct atccgaagtg gtgttggaga 6000

ggaccgaatt ggagatttcg tatgccccgc gcctcgacca agaaaaagaa gaattactac 6060

gcaagaaatt acagttaaat cccacacctg ctaacagaag cagataccag tccaggaagg 6120

tggagaacat gaaagccata acagctagac gtattctgca aggcctaggg cattatttga 6180

aggcagaagg aaaagtggag tgctaccgaa ccctgcatcc tgttcctttg tattcatcta 6240

gtgtgaaccg tgccttttca agccccaagg tcgcagtgga agcctgtaac gccatgttga 6300

aagagaactt tccgactgtg gcttcttact gtattattcc agagtacgat gcctatttgg 6360

acatggttga cggagcttca tgctgcttag acactgccag tttttgccct gcaaagctgc 6420

gcagctttcc aaagaaacac tcctatttgg aacccacaat acgatcggca gtgccttcag 6480

cgatccagaa cacgctccag aacgtcctgg cagctgccac aaaaagaaat tgcaatgtca 6540

cgcaaatgag agaattgccc gtattggatt cggcggcctt taatgtggaa tgcttcaaga 6600

aatatgcgtg taataatgaa tattgggaaa cgtttaaaga aaaccccatc aggcttactg 6660

aagaaaacgt ggtaaattac attaccaaat taaaaggacc aaaagctgct gctctttttg 6720

cgaagacaca taatttgaat atgttgcagg acataccaat ggacaggttt gtaatggact 6780

taaagagaga cgtgaaagtg actccaggaa caaaacatac tgaagaacgg cccaaggtac 6840

aggtgatcca ggctgccgat ccgctagcaa cagcgtatct gtgcggaatc caccgagagc 6900

tggttaggag attaaatgcg gtcctgcttc cgaacattca tacactgttt gatatgtcgg 6960

ctgaagactt tgacgctatt atagccgagc acttccagcc tggggattgt gttctggaaa 7020

ctgacatcgc gtcgtttgat aaaagtgagg acgacgccat ggctctgacc gcgttaatga 7080

ttctggaaga cttaggtgtg gacgcagagc tgttgacgct gattgaggcg gctttcggcg 7140

aaatttcatc aatacatttg cccactaaaa ctaaatttaa attcggagcc atgatgaaat 7200

ctggaatgtt cctcacactg tttgtgaaca cagtcattaa cattgtaatc gcaagcagag 7260

tgttgagaga acggctaacc ggatcaccat gtgcagcatt cattggagat gacaatatcg 7320

tgaaaggagt caaatcggac aaattaatgg cagacaggtg cgccacctgg ttgaatatgg 7380

aagtcaagat tatagatgct gtggtgggcg agaaagcgcc ttatttctgt ggagggttta 7440

ttttgtgtga ctccgtgacc ggcacagcgt gccgtgtggc agacccccta aaaaggctgt 7500

ttaagcttgg caaacctctg gcagcagacg atgaacatga tgatgacagg agaagggcat 7560

tgcatgaaga gtcaacacgc tggaaccgag tgggtattct ttcagagctg tgcaaggcag 7620

tagaatcaag gtatgaaacc gtaggaactt ccatcatagt tatggccatg actactctag 7680

ctagcagtgt taaatcattc agctacctga gaggggcccc tataactctc tacggctaac 7740

ctgaatggac tacgacatag tctagtccgc caagggcgcg ccttcgaagg ccggccgttt 7800

aaacatggtc ttcacactcg aagatttcgt tggggactgg cgacagacag ccggctacaa 7860

cctggaccaa gtccttgaac agggaggtgt gtccagtttg tttcagaatc tcggggtgtc 7920

cgtaactccg atccaaagga ttgtcctgag cggtgaaaat gggctgaaga tcgacatcca 7980

tgtcatcatc ccgtatgaag gtctgagcgg cgaccaaatg ggccagatcg aaaaaatttt 8040

taaggtggtg taccctgtgg atgatcatca ctttaaggtg atcctgcact atggcacact 8100

ggtaatcgac ggggttacgc cgaacatgat cgactatttc ggacggccgt atgaaggcat 8160

cgccgtgttc gacggcaaaa agatcactgt aacagggacc ctgtggaacg gcaacaaaat 8220

tatcgacgag cgcctgatca accccgacgg ctccctgctg ttccgagtaa ccatcaacgg 8280

agtgaccggc tggcggctgt gcgaacgcat tctggcgtaa gcggccgccc tgcagggcga 8340

tcgcatacag cagcaattgg caagctgctt acatagaact cgcggcgatt ggcatgccgc 8400

cttaaaattt ttattttatt tttcttttct tttccgaatc ggattttgtt tttaatattt 8460

caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaatcgc 8520

gacagacatg ataagataca ttgatgagtt tggacaaacc acaactagaa tgcagtgaaa 8580

aaaatgcttt atttgtgaaa tttgtgatgc tattgcttta tttgtaacca ttataagctg 8640

caataaacaa gttaacaaca acaattgcat tcattttatg tttcaggttc agggggaggt 8700

gtgggaggtt ttttaggacc cggctaggct ggcggggttg ccttactggt tagcagaatg 8760

aatcaccgat acgcgagcga acgtgaagcg actgctgctg caaaacgtct gcgacctgag 8820

caacaacatg aatggtcttc ggtttccgtg tttcgtaaag tctggaaacg cggaagtcag 8880

cgccctgcac cattatgttc cggatctgca tcgcaggatg ctgctggcta ccctgtggaa 8940

cacctacatc tgtattaacg aagcgctggc attgaccctg agtgattttt ctctggtccc 9000

gccgcatcca taccgccagt tgtttaccct cacaacgttc cagtaaccgg gcatgttcat 9060

catcagtaac ccgtatcgtg agcatcctct ctcgtttcat cggtatcatt acccccatga 9120

acagaaatcc cccttacacg gaggcatcag tgaccaaaca ggaaaaaacc gcccttaaca 9180

tggcccgctt tatcagaagc cagacattaa cgcttctgga gaaactcaac gagctggacg 9240

cggatgaaca ggcagacatc tgtgaatcgc ttcacgacca cgctgatgag ctttaccgca 9300

gctgcctcgc gcgtttcggt gatgacggtg aaaacctctg acacatgcag ctcccggaga 9360

cggtcacagc ttgtctgtaa gcggatgccg ggagcagaca agcccgtcag ggcgcgtcag 9420

cgggtgttgg cgggtgtcgg ggcgcagcca tgacccagtc acgtagcgat agcggagtgt 9480

atactggctt aactatgcgg catcagagca gattgtactg agagtgcacc atatgcggtg 9540

tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc aggcgctctt ccgcttcctc 9600

gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa 9660

ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa 9720

aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct 9780

ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac 9840

aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc 9900

gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc 9960

tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg 10020

tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga 10080

gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag 10140

cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta 10200

cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag 10260

agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg 10320

caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac 10380

ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc 10440

aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag 10500

tatatatgag taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc 10560

agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac 10620

gatacgggag ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc 10680

accggctcca gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg 10740

tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag 10800

tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctgcaggca tcgtggtgtc 10860

acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac 10920

atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag 10980

aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac 11040

tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg 11100

agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaacacggg ataataccgc 11160

gccacatagc agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact 11220

ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg 11280

atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa 11340

tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt 11400

tcaatattat tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg 11460

tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga 11520

cgtctaagaa accattatta tcatgacatt aacctataaa aataggcgta tcacgaggcc 11580

ctttcgtctt caagaa 11596

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VEEV_gblock2_fwd primer

<400> 7

tcattcagct acctgagagg g 21

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VEEV_gblock2_rev primer

<400> 8

aaataaaaat tttaaggcgg catgc 25

<210> 9

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VEEV_Oligo1_fwd primer

<400> 9

ttaaaatttt tattttattt ttcttttctt ttccgaatcg gattttgttt ttaatatttc 60

<210> 10

<211> 100

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VEEV_Oligo2_rev primer

<400> 10

catcaatgta tcttatcatg tctgtcgcga tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60

tttttttttt tttttttttt tttttgaaat attaaaaaca 100

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 11

ccggcccgga ccgacaagtc tctatcacc 29

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 12

ggccgggggc ccctctcagg tagctgaatg 30

<---

Изобретение относится к биотехнологии, вирусологии. Предложена частица репликона альфавируса (ARP) для доставки генов, которая включает (1-i) капсид и/или оболочку, включающую структурные белки VEEV, и (1-ii) репликон VEEV, включающий полинуклеотид, кодирующий неструктурные белки альфавируса nsp1, nsp2, nsp3 и nsp4, и по меньшей мере один представляющий интерес ген, где указанные белки капсида альфавируса содержат мутацию в сигнале ядерной локализации (NLS), или (2-i) капсид и/или оболочку, включающую структурные белки CHIKV, и (1-ii) репликон VEEV, включающий полинуклеотид, кодирующий неструктурные белки VEEV nsp1, nsp2, nsp3 и nsp4, и по меньшей мере один представляющий интерес ген, где предпочтительно CHIKV представляет собой штамм CHIKV 37997 или штамм OPY-1, а VEEV является штаммом VEEV TC-83. Предложен способ получения частиц репликона альфавируса. Разработана правильная система доставки генов для достижения успешной генной терапии. 2 н. и 16 з.п. ф-лы, 21 ил., 1 табл.

1. Частица репликона альфавируса (ARP) для доставки генов, которая включает

(1-i) капсид и/или оболочку, включающую структурные белки VEEV, и

(1-ii) репликон VEEV, включающий полинуклеотид, кодирующий неструктурные белки альфавируса nsp1, nsp2, nsp3 и nsp4, и по меньшей мере один представляющий интерес ген,

где указанные белки капсида альфавируса содержат мутацию в сигнале ядерной локализации (NLS), или

(2-i) капсид и/или оболочку, включающую структурные белки CHIKV, и

(1-ii) репликон VEEV, включающий полинуклеотид, кодирующий неструктурные белки VEEV nsp1, nsp2, nsp3 и nsp4, и по меньшей мере один представляющий интерес ген,

где предпочтительно CHIKV представляет собой штамм CHIKV 37997 или штамм OPY-1, а VEEV является штаммом VEEV TC-83.

2. ARP по п. 1, в котором один или несколько из лизина или аргинина в сигнале ядерной локализации белка капсида альфавируса замещен аспарагином или аланином.

3. ARP по любому из пп. 1, 2, в котором структурные белки альфавируса включают одно или несколько изменений в белке Е2 альфавируса.

4. ARP по любому из пп. 1-3, в котором структурные белки альфавируса включают одно или несколько изменений в сайте расщепления фурином в белке E3 альфавируса.

5. ARP по любому из пп. 1-4, где ARP включает

(1-i) капсид и/или оболочку, включающую структурные белки VEEV, и

(1-ii) репликон VEEV, включающий полинуклеотид, кодирующий неструктурные белки альфавируса nsp1, nsp2, nsp3 и nsp4, и по меньшей мере один представляющий интерес ген.

6. ARP по любому из пп. 1-4, где ARP включает

(2-i) капсид и/или оболочку, включающую структурные белки CHIKV, и

(1-ii) репликон VEEV, включающий полинуклеотид, кодирующий неструктурные белки VEEV nsp1, nsp2, nsp3 и nsp4, и по меньшей мере один представляющий интерес ген.

7. ARP по любому из пп. 1-6, в котором представляющий интерес ген кодирует антиген.

8. ARP по п. 7, в котором CHIKV представляет собой штамм CHIKV 37997 или штамм OPY-1.

9. ARP по п. 7, в котором VEEV представляет собой штамм VEEV.TC-83

10. Способ получения частиц репликона альфавируса, включающий стадии котрансфекции клеток с

(1-i) вектором, включающим полинуклеотид, кодирующий неструктурные белки альфавируса nsp1, nsp2, nsp3 и nsp4, и по меньшей мере один представляющий интерес ген,

(1-ii) вектором, включающим полинуклеотид, кодирующий белок капсида VEEV, и

(1-iii) вектором, включающим полинуклеотид, кодирующий E3-E2-6K-E1 VEEV,

где капсидный белок включает мутацию в сигнале ядерной локализации (NLS), или

(2-i) вектором, включающим полинуклеотид, кодирующий неструктурные белки VEEV nsp1, nsp2, nsp3 и nsp4, и по меньшей мере один представляющий интерес ген,

(2-ii) вектором, включающим полинуклеотид, кодирующий белок капсида CHIKV, и

(2-iii) вектором, включающим полинуклеотид, кодирующий E3-E2-6K-E1 CHIKV,

культивирования трансфицированных клеток, и

очистки ARP из клеточной культуры.

11. Способ по п. 10, в котором один или несколько из лизина или аргинина в сигнале ядерной локализации белка капсида альфавируса замещен аспарагином или аланином.

12. Способ по любому из пп. 10, 11, в котором структурные белки альфавируса включают одно или несколько изменений в белке Е2 альфавируса.

13. Способ по любому из пп. 10-12, в котором структурные белки альфавируса включают одно или несколько изменений в сайте расщепления фурином в белке E3 альфавируса.

14. Способ по любому из пп. 10-13, где клетки котрансфицируют с

(1-i) вектором, включающим полинуклеотид, кодирующий неструктурные белки VEEV nsp1, nsp2, nsp3 и nsp4, и по меньшей мере один представляющий интерес ген,

(1-ii) вектором, включающим полинуклеотид, кодирующий белок капсида VEEV, где указанный капсидный белок включает мутацию в сигнале ядерной локализации (NLS), и

(1-iii) вектором, включающим полинуклеотид, кодирующий E3-E2-6K-E1 VEEV.

15. Способ по любому из пп. 10-13, где клетки котрансфицируют с

(2-i) вектором, включающим полинуклеотид, кодирующий неструктурные белки VEEV nsp1, nsp2, nsp3 и nsp4, и по меньшей мере один представляющий интерес ген,

(2-ii) вектором, включающим полинуклеотид, кодирующий белок капсида CHIKV, и

(2-iii) вектором, включающим полинуклеотид, кодирующий E3-E2-6K-E1 CHIKV.

16. Способ по любому из пп. 10-15, в котором представляющий интерес ген кодирует антиген.

17. Способ по п. 16, в котором CHIKV представляет собой штамм CHIKV 37997 или штамм OPY-1.

18. Способ по п. 16, в котором VEEV представляет собой штамм VEEV TC-83.