СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИОКИСЛИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ЧАЯ Российский патент 2019 года по МПК G01N33/00 G01N33/02 

Изобретение относится к пищевой промышленности, в частности к производству чая, и направлено на разработку новых ускоренных методов оценки качества сырья и готовой продукции.

Качество чая в значительной степени обусловлено высоким содержанием биологически активных веществ (БАВ) антиокислительного типа. Эта группа веществ представлена полифенолами - флавоноидами и их производными, фенолкарбоновыми кислотами, танинами, а также аскорбиновой кислотой и др. Концентрация веществ - антиокислителей в чае и их суммарная биологическая активность зависят от ряда факторов (качества сырья, технологии переработки, способа заваривания) и имеют широкий диапазон варьирования. Системный контроль этих показателей практически не производится, в частности, из-за отсутствия удобного метода определения антиокислительной активности (АОА).

Известен способ определения суммарной антиоксидантной активности экстрактов чаев методом вольтамперометрии на модифицированном электроде [1]. Данное изобретение относится к группе электрохимических способов определения АОА. Способ включает подготовку модифицированного фталоцианином кобальта Со(II) платинового электрода и определение антиоксидантной активности экстрактов чаев, которое проводят при скорости развертки потенциала 40 мВ/с и рабочем диапазоне потенциалов от 0 до -1,2 В, используя для расчета кинетический критерий, отражающий количество активных кислородных форм, прореагировавших с антиоксидантами за минуту времени, при этом в качестве фонового электролита для водно-спиртовых сред используют 0,1 моль/дм³ NaClO₃, растворенный в диметилформамиде. Недостатком способа является использование специального лабораторного оборудования, необходимость предварительного модифицирования платинового электрода, причем результаты анализа будут зависеть от точности выполнения этой операции. Кроме того, анализу подвергаются водно-спиртовые экстракты чаев, т.е. на водные экстракты черного или зеленого чаев из растения семейства Theaceae, полученные в режиме дегустационного заваривания, способ не распространяется.

Известны и другие электрохимические способы определения антиоксидантной активности водорастворимых биологически активных веществ: амперометрические [2] и вольтамперометрические [3]. Недостатками способов является использование громоздкой измерительной установки и дорогостоящих реактивов.

Известен, способ количественного определения антиоксидантной активности пептидов животного происхождения путем спектрофотометрического определения оптической плотности продукта реакции изучаемых пептидов с 2,2-дифенил-1-пекрилгидразилом в органическом растворителе, выбранном из группы, включающей метанол, этанол, изопропанол, ацетон и метилэтилкетон, отличающийся тем, что определяют оптическую плотность продукта реакции референтного пептидного антиоксиданта природного происхождения L-глутатиона восстановленного с 2,2-дифенил-1-пекрилгидразилом и рассчитывают антиоксидантную активность изучаемых пептидов как глутатионэквивалентную, которая выражается как отношение IC₅₀, найденной для глутатиона, к IC_50(sub), найденной для субстанции [4]. Недостатком способа является необходимость большой предварительной работы: определение антиоксидантной активности растворов глутатиона и растворов исследуемых пептидов разных концентраций, построение графиков зависимостей антиоксидантной активности растворов пептидов от концентрации растворенного вещества. Недостатками способа являются также использование токсичных органических растворителей, существенное различие химической природы антиоксидантов чая и пептидов животного происхождения, использование в качестве стандартного антиоксиданта трипептида - восстановленного глутатиона.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ определения антиокислительной активности биологически активных веществ [5], включающий взаимодействие анализируемой пробы с перманганатом калия до обесцвечивания последнего в водной сернокислой среде при комнатной температуре, отличающийся тем, что 0,05 Н раствор перманганата калия в 0,24 М растворе серной кислоты титруют раствором анализируемой пробы до обесцвечивания и расчет концентрации проводят в пересчете на кверцетин по соответствующей формуле.

К недостаткам этого метода можно отнести возможную неточность титрования, значительные различия в расходе на титрование растворов анализируемых БАВ и, в связи с этим, необходимость приготовления дополнительного количества раствора БАВ, если антиокислительная активность веществ в растворе будет низкой.

Недостатком является также то, что в формуле изобретения не указаны типы и свойства анализируемых БАВ, способы подготовки растворов БАВ, типы растворителей и другие факторы, которые могут повлиять на ход реакции и ее результаты.

Задачей настоящего изобретения является создание способа количественного определения АОА конкретного вида пищевой продукции - чая, выработанного из растения семейства Theaceae, превосходящего по точности и объективности результатов известный метод за счет использования в качестве реагента-окислителя 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия, создания оптимальных условий для действия БАВ чая, колориметрического контроля результатов реакции.

Поставленная задача решается тем, что предложенный способ определения антиокислительной активности чая предусматривает взаимодействие анализируемой пробы с реагентом-окислителем при обесцвечивании последнего, отличающийся тем, что в качестве анализируемой пробы используют разбавленный экстракт чая, полученный в режиме дегустационного заваривания, в качестве реагента-окислителя используют 0,001 н раствор 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия, анализируемую пробу и реагент-окислитель смешивают в соотношении объемов 9:1, через 5 мин реакции определяют уменьшение оптической плотности раствора колориметрическим методом при длине волны 500-520 нм.

Количественно АОА чая, соответствующую концентрации БАВ восстанавливающего характера в пересчете на стандартный антиокислитель (кверцетин), рассчитывают по формуле (1)

где АОА - концентрация биологически активных веществ восстанавливающего характера в образце чая в пересчете на кверцетин, мг/г;

А_к, А_с, А_n - оптическая плотность растворов: контрольного, стандартного антиокислителя (кверцетина) и анализируемой пробы чая, соответственно;

с_с, - концентрация стандартного антиокислителя (кверцетина) в растворе, мг/мл;

v - общий объем исходного раствора пробы чая, мл;

к - степень разведения исходного раствора пробы чая;

m - масса навески анализируемой пробы чая, г.

В заявляемом способе определение АОА чая основано на реакции веществ восстанавливающего характера (АН, АН2) с DCPIP (2,6-дихлорфенолиндофенолятом натрия, C12H6C12NNaO2) по схеме:

или

Раствор DCPIP в воде имеет темно-синюю окраску. В результате восстановления DCPIP темно-синяя окраска исчезает; реакцию контролируют колориметрическим методом по уменьшению оптической плотности раствора при длине волны 500-520 нм. Предложенный способ осуществляется следующим образом.

Для определения используют 0,001н водный раствор 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия. Раствор пригоден в течение 10 суток хранения во флаконе темного стекла с притертой пробкой, в защищенном от света месте.

В качестве стандартного антиоксиданта используют раствор кверцетина в этиловом спирте с концентрацией кверцетина 1 мг/мл.

Подготовка анализируемой пробы чая. Листовой чай измельчают по ИСО 1572 [6] и хранят в герметичных контейнерах, обеспечивая защиту от солнечного света. Берут пробу измельченного чая массой 1,0 г, переносят количественно в химический стакан вместимостью 150-200 см³, добавляют 50 см³ дистиллированной воды с температурой 95-100°С, перемешивают, настаивают в течение 5 мин при комнатной температуре и фильтруют. Соотношение массы пробы измельченного чая и воды, температура воды и продолжительность экстракции определены на основании технических рекомендаций заваривания чая при дегустационной оценке и при потреблении этого напитка [7]. При уменьшении массы пробы чая менее 1,0 г результат будет неточным из-за уменьшения объема чайной заварки, ускоренного ее охлаждения во время экстракции и вследствие этого снижения выхода веществ восстанавливающего характера в экстракт. Полученный исходный экстракт чая разбавляют водой в 10 раз.

Контрольная проба. Смешивают 9 см³ воды и 1 см³ раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия. Определяют оптическую плотность полученного раствора А_к на фотоэлектроколориметре при длине волны 500-520 нм; в качестве раствора сравнения используют воду.

Проба с экстрактом чая. Смешивают 9 см³ анализируемой пробы чая и 1 см³ раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия. Через 5 мин реакции определяют оптическую плотность полученного раствора А_n на фотоэлектроколориметре при длине волны 500-520 нм; в растворе сравнения 2,6-дихлорфенолиндофенолят натрия заменяют на воду. Величина А_n должна составлять не менее 20% от значения оптической плотности контрольного раствора, в противном случае следует увеличить кратность разведения исходного раствора чая. Если после 5 мин реакции величина А_n превышает 80% от оптической плотности контрольного раствора, кратность разведения исходного раствора чая рекомендуется уменьшить.

Проба со стандартным антиоксидантом. Смешивают 9 см³ спиртового раствора кверцетина и 1 см³ раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия. Через 5 мин определяют оптическую плотность полученного раствора А_с на фотоэлектроколориметре при длине волны 500-520 нм; в растворе сравнения 2,6-дихлорфенолиндофенолят натрия заменяют на воду.

Расчет показателя суммарной АОА чая осуществляют согласно формуле (1)

где АОА - концентрация биологически активных веществ восстанавливающего характера в образце чая в пересчете на кверцетин, мг/г;

А_к, А_с, А_n - оптическая плотность растворов: контрольного, стандартного антиокислителя и анализируемой пробы, соответственно;

с_с, - концентрация стандартного антиокислителя (кверцетина) в растворе, мг/мл;

v - общий объем исходного раствора пробы чая, мл;

к - степень разведения исходного раствора анализируемой пробы;

m - масса навески анализируемой пробы чая, г.

Пример

В качестве объектов выбраны чаи: черный байховый листовой, черный пакетированный, зеленый листовой.

Образцы листового чая измельчают по ИСО 1572. При анализе пакетированного чая пакет разрезают и используют измельченный образец чая. Пробу измельченного чая массой 1,0 г переносят в химический стакан вместимостью 150 см³, добавляют 50 см³ дистиллированной воды с температурой 95°С, перемешивают, настаивают в течение 5 мин при комнатной температуре и фильтруют. Полученный исходный экстракт чая разбавляют водой в 10 раз.

Для контрольной пробы смешивают 9 см³ воды и 1 см³ 0,001 н водного раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия. Определяют оптическую плотность раствора на фотоэлектроколориметре при длине волны 520 нм. Для определения активности кверцетина смешивают 9 см³ спиртового раствора кверцетина (1 мг/мл) и 1 см³ 0,001 н водного раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия. Через 5 мин реакции определяют оптическую плотность раствора на фотоэлектроколориметре при длине волны 520 нм. В пробах с чаем смешивают 9 см³ разбавленного экстракта чая и 1 см³ 0,001 н водного раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия. Через 5 мин реакции определяют оптическую плотность раствора на фотоэлектроколориметре при длине волны 520 нм.

Количественную оценку антиокислительной активности чаев проводили расчетным путем по формуле (1). Результаты определения антиокислительной активности чаев, которая соответствует концентрации БАВ восстанавливающего характера в образце чая в пересчете на кверцетин, приведены в таблице 1.

Заявляемый способ достаточно достоверен, не слишком трудоемок, не требует сложного лабораторного оборудования и позволяет анализировать разные образцы чая в широком диапазоне антиокислительной активности.

Литература

1. Патент РФ №2567727, МПК № G01N 33/00, G01N 27/26, опубл. 10.11.2015.

2. Патент РФ №2238554, МПК G01N 33/15, G01N 27/26, опубл. 20.10.2004.

3. Патент РФ №2356050, МПК G01N 33/15, G01N 27/26, опубл. 20.05.2009.

4. Патент РФ №2680604, МПК G01N 33/50, G01N 33/00, опубл. 25.02.2019.

5. Патент РФ №2170930, МПК G01N 33/50, G01N 33/52, опубл. 20.07.2001.

6. ГОСТ 28550-90 (ИСО 1572-80). Чай. Метод приготовления измельченной пробы и определения сухих веществ.

7. Славянский А.А., Вовк Г.А., Жигалов М.С., Мойсеяк М.Б. Лабораторный практикум по технохимическому контролю чайного сырья и готовой продукции чайного производства. - М.: Издательский комплекс МГУПП, 2007. - 56 с.

Изобретение относится к пищевой промышленности, в частности к производству чая, и может быть использовано при анализе черного, зеленого и других видов чая. Способ определения антиокислительной активности чая включает взаимодействие разбавленного экстракта чая, полученного в режиме дегустационного заваривания, с реагентом-окислителем - 2,6-дихлорфенолиндофенолятом натрия, определение величины изменения оптической плотности реакционного раствора колориметрическим методом при длине волны 500-520 нм, расчет антиокислительной активности чая в пересчете на кверцетин по предложенной формуле. Использование способа обеспечивает получение достоверных данных о величине антиокислительной активности веществ чая, переходящих в водный экстракт при заваривании для дегустационного анализа или пищевого потребления этого напитка. 1 табл., 1 пр.

Способ определения антиокислительной активности чая (АОА), включающий взаимодействие анализируемой пробы с реагентом-окислителем при обесцвечивании последнего, отличающийся тем, что в качестве анализируемой пробы используют разбавленный экстракт чая, полученный в режиме дегустационного заваривания, в качестве реагента-окислителя используют 0,001 н раствор 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия, анализируемую пробу и реагент-окислитель смешивают в соотношении объемов 9:1, через 5 мин реакции определяют уменьшение оптической плотности раствора колориметрическим методом при длине волны 500-520 нм и расчет показателя АОА в пересчете на стандартный антиокислитель (кверцетин) проводят по формуле

АОА=(А_к - А_n) ⋅ с_с ⋅ v ⋅ к / (А_к - А_с) ⋅ m,

где АОА - концентрация биологически активных веществ восстанавливающего характера в образце чая в пересчете на кверцетин, мг/г;

А_к, А_с, А_n - оптическая плотность растворов: контрольного, стандартного антиокислителя (кверцетина) и анализируемой пробы чая, соответственно;

с_с, - концентрация стандартного антиокислителя (кверцетина) в растворе, мг/мл;

v - общий объем исходного раствора пробы чая, мл;

к - степень разведения исходного раствора пробы чая;

m - масса навески анализируемой пробы чая, г.