СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИОКИСЛИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ Российский патент 2001 года по МПК G01N33/50 G01N33/52 

Изобретение относится к способам оценки антиокислительной активности (АОА) биологически активных веществ (БАВ) и может найти применение в фармации и пищевой промышленности.

Известен способ определения суммы антиокислительных веществ, таких как фенольные соединения, с помощью фотометрического титрования по Левенталю [1] , основанный на окислении в кислой среде перманганатом калия в присутствии индикатора индигокармина, являющегося регулятором реакции окисления. Для расчета используют коэффициент, равный 6,792 мг суммы фенольных соединений хмеля и соответствующий 1 мл 0,1 Н раствора перманганата калия.

Недостатком способа является то, что фенольные соединения представляют собой не единственные действующие вещества растений и фитопрепаратов на их основе - настоев, отваров, эликсиров, настоек, которые реагируют с перманганатом калия.

По ГФ XI [2] содержание дубильных веществ, обладающих АОА, в пересчете на танин в лекарственном растительном сырье определяют титрованием извлечения 0,1 Н раствором перманганата калия с индикатором индигокармином до золотисто-желтой окраски.

Часто содержание БАВ, найденное этим способом, обозначают термином "окисляемость" [3, 4], однако, по нашему мнению, в указанных условиях с индикатором индигокармином титруются не все вещества с антиокислительными свойствами, а только те соединения, окислительно-восстановительный потенциал которых более отрицателен по сравнению с окислительно-восстановительным потенциалом индигокармина (+0,3В [5]), что является недостатком метода.

Наиболее близок предлагаемому способу оценки АОА способ определения скорости окисления водно-спиртового извлечения прополиса [6] при подкислении извлечения 20% раствором серной кислоты, добавлении 1 капли (0,035-0,040 мл) 0,1 Н раствора перманганата калия и фиксации времени исчезновения розовой окраски раствора при комнатной температуре.

Недостатком способа является сравнительно невысокая точность, что связано с нечетким переходом окраски, неэквивалентным взаимодействием количеств перманганата калия и прополиса, выражающимся в мгновенном обесцвечивании раствора, требующем измерения времени в секундах с учетом сотых его долей, и отсутствием единого количественного показателя скорости окисления.

При проверке метрологической характеристики методики определения скорости окисления прополиса нами установлено, что приведенная авторами величина относительной ошибки ± 12,5% при доверительной вероятности 95% учитывает только ошибку измерения объема одной капли перманганата калия, равного 0,035 - 0,040 мл.

С целью уменьшения ошибки анализа путем титрования были определены эквивалентные количества калия перманганата и прополиса, вступающие в реакцию окисления-восстановления, что позволило увеличить время обесцвечивания раствора.

Результаты анализа прополиса известным способом представлены в таблице 1. Ошибка методики колеблется от 20 до 30% при разном содержании прополиса.

Задачей настоящего изобретения является повышение точности метода оценки АОА путем выбора оптимальных условий реакции и введения количественного показателя. Поставленная задача решается способом, заключающимся в том, что 0,05 Н раствор перманганата калия в 0,024 М растворе серной кислоты титруют при комнатной температуре раствором анализируемой пробы до обесцвечивания и расчет концентрации БАВ проводят по формуле в пересчете на кверцетин.

Показателем относительной АОА служит объем препарата (объекта) в миллилитрах, израсходованный на титрование 1 мл 0,05 Н раствора перманганата калия. Чем меньше объем препарата, израсходованный на титрование, тем выше антиокислительная активность препарата.

Для количественной оценки АОА препаратов (объектов) вводится показатель активности - В. Эта величина представляет собой сумму БАВ восстанавливающего характера и выражается количеством миллиграммов кверцетина в 1 мл или 1 г препарата (объекта). Чем выше величина В, тем более высокой АОА обладает объект.

В таблице 2 приведены результаты тестирования исследуемых объектов предлагаемым способом. Относительная ошибка определения не превышает ± 10%.

Пример 1.

А. Биологически активные вещества. Около 0,0500 г (точная навеска) кверцетина (ФС 42-1290-79) растворяют в 40 мл этилового спирта, переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят до метки спиртом и перемешивают. В стакан для титрования вместимостью 50 мл вносят 8 мл свежепрокипяченной и охлажденной дистиллированной воды, 1 мл 20% раствора серной кислоты, 1 мл 0,05 Н раствора перманганата калия, перемешивают и титруют из микробюретки (объемом 1 мл с ценой деления 0,01 мл) раствором кверцетина до исчезновения розовой окраски. 1 мл 0,05 Н раствора перманганата калия соответствует 0,25 мг кверцетина.

Б. Около 0,5000 г (точная навеска) прополиса растворяют в 50 мл этилового спирта, фильтруют и переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора до метки спиртом и перемешивают. Титрование проводят, как в примере 1.А. Расчет показателя АОА, которому соответствует концентрация БАВ восстанавливающего характера в пересчете на кверцетин (в мг/г), проводят по формуле

где B - концентрация биологически активных веществ восстанавливающего характера исследуемого объекта, израсходованного на титрование 1 мл 0,05 Н раствора перманганата калия, мг/г;
C_k - концентрация кверцетина в растворе, израсходованном на титрование 1 мл 0,05 Н раствора перманганата калия, мг/мл;
V_k - объем раствора кверцетина, израсходованный на титрование 1 мл 0,05 Н раствора перманганата калия, мл;
V_о - объем исследуемого раствора, мл;
V_x - объем раствора исследуемого объекта, израсходованный на титрование 1 мл 0,05 Н раствора перманганата калия, мл;
m - масса навески исследуемого объекта, г.

Пример 2. Водные извлечения из лекарственного растительного сырья
Настои и отвары готовят по ГФ XI и этими извлечениями титруют раствор, состоящий из 8 мл свежепрокипяченной и охлажденной дистиллированной воды, 1 мл 20% раствора серной кислоты, 1 мл 0,05 Н раствора перманганата калия. Титрование и расчет АОА проводят, как в примере 1.Б.

Пример 3. Спиртовые извлечения из лекарственного растительного сырья
В стакан вместимостью 50 мл вносят 8 мл свежепрокипяченной и охлажденной дистиллированной воды, 1 мл 20% раствора серной кислоты, 1 мл 0,05 Н раствора перманганата калия, перемешивают и титруют эликсиром, бальзамом, настойкой, как в примере 1.Б. Расчет показателя АОА объекта, B, которому соответствует концентрация БАВ восстанавливающего характера в пересчете на кверцетин (мг/мл), проводят по формуле
B = 0,25/V_x,
где 0,25 - количество кверцетина, соответствующее 1 мл 0,05 Н раствора перманганата калия, мг;
V_x - объем раствора исследуемого объекта, израсходованный на титрование 1 мл 0,05 Н раствора перманганата калия, мл.

Пример 4. Соки, вина, пиво
20,0 г свежих овощей или фруктов измельчают на пластмассовой терке, массу отжимают через марлю, сложенную вчетверо, затем сок фильтруют через бумажный фильтр на вакуум-фильтровальной установке. Титрование проводят соком, вином или пивом и рассчитывают величину АОА, как в примере 3.

Пример 5. Чай, кофе
А. 1 г (точная навеска) чая заливают 75 мл нагретой до кипения дистиллированной воды, закрывают часовым стеклом и настаивают 5 мин, затем фильтруют через бумажный фильтр, охлаждают и доводят объем извлечения водой до 75 мл.

Б. 1 г (точная навеска) растворимого кофе заливают 100 мл нагретой до кипения воды; после охлаждения доводят объем извлечения водой до 100 мл.

В. 1 г (точная навеска) молотого кофе заливают 100 мл воды, доводят до кипения, настаивают 5 мин, фильтруют через фильтровальную бумагу, охлаждают и доводят объем извлечения водой до 100 мл.

Титрование и расчет АОА проводят, как в примере 1.Б.

Источники информации
1. Ляшенко Н.И., Солодюк Г.Д. Методы количественного определения полифенолов в хмеле. Хмелеводство, вып. 2. - Киев: Урожай, 1980, - с. 57-64.

2. ГФ СССР XI издание, М.: Медицина, 1987, 1990, вып. 1, 2.

3. Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения. Материалы 3 международного съезда. С.-Пб., Пушкин (1999), с. 129.

4. Временная Фармакопейная Статья 42-2041-91 "Мирфазин".

5. Лурье Ю.Ю. Справочник по аналитической химии. - М.: Химия, 1971, - с. 292.

6. Вахонина Т.В., Душкова Е.С. Качество прополиса. Ценный продукт пчеловодства: прополис. Бухарест: Апимондия. - 1981, - с. 232-237 (прототип).

Изобретение может быть использовано в фармации, медицине, биологии и пищевой промышленности, позволяет проводить скрининг лекарственного растительного сырья, фитопрепаратов и биологически активных добавок к питанию с высокой антиокислительной активностью (АОА) для использования их в комплексной терапии свободно-радикальных патологий. 0,05 Н раствор перманганата калия в среде 0,24 М серной кислоты титруют при комнатной температуре анализируемой пробой до обесцвечивания раствора. Для количественной характеристики АОА препаратов (объектов) введена величина В, представляющая собой содержание суммы БАВ восстанавливающего характера в пересчете на кверцетин в 1 мл или 1 г препарата (объекта). Чем выше величина В, тем более высокой АОА обладает объект. Повышение надежности и точности оценки АОА достигается путем выбора оптимальных условий реакции и введения количественного показателя. 2 табл.

Способ определения антиокислительной активности биологически активных веществ, включающий взаимодействие анализируемой пробы с перманганатом калия до обесцвечивания последнего в водной сернокислой среде при комнатной температуре, отличающийся тем, что 0,05 Н раствор перманганата калия в 0,24 М растворе серной кислоты титруют раствором анализируемой пробы до обесцвечивания и расчет концентрации проводят в пересчете на кверцетин по формуле

где В - концентрация биологически активных веществ восстанавливающего характера исследуемого объекта, израсходованного на титрование 1 мл 0,05 Н раствора перманганата калия, мг/г;
С_k - концентрация кверцетина в растворе, израсходованном на титрование 1 мл 0,05 Н раствора перманганата калия, мг/мл;
V_k - объем раствора кверцетина, израсходованный на титрование 1 мл 0,05 Н раствора перманганата калия, мл;
V_о - объем исследуемого раствора, мл;
V_х - объем раствора исследуемого объекта, израсходованный на титрование 1 мл 0,05 Н раствора перманганата калия, мл;
m - масса навески исследуемого объекта, г.