СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОЛИФЕНОЛОВ ЧАЯ Российский патент 2014 года по МПК G01N33/02 

Изобретение относится к чайной промышленности и направлено на разработку новых ускоренных методов оценки качества сырья и готовой продукции.

Ближайшим к предлагаемому является способ определения содержания полифенолов чая [1], предусматривающий экстрагирование полифенолов из измельченной пробы листового чая 70%-ным раствором метанола при температуре 70°С, центрифугирование и декантирование жидкости, повторное экстрагирование полифенолов из нерастворимого остатка чая. Общая продолжительность двукратной экстракции и последующего отделения экстракта от нерастворимого остатка центрифугированием и декантирование жидкости составляет 80-90 мин. Содержание полифенолов в экстракте определяют колориметрическим методом с применением реактива Folin-Ciocalteu, в который входят фосфорно-вольфрамовые кислоты, окисляющие ОН-группы фенолов и образующие в результате реакции вольфрамовую синь. Взаимодействие полифенолов экстракта с реактивом Folin-Ciocalteu происходит в течение 60 мин. В качестве стандарта используют галловую кислоту. Для растворов галловой кислоты разной концентрации строят градуировочный график зависимости y=f(x), где у - оптическая плотность стандартных растворов галловой кислоты при длине волны 765 нм за вычетом оптической плотности холостой пробы, x - массовая концентрация галловой кислоты в стандартных растворах, мкг/ см³.

Массовую долю полифенолов в пробе чая ω_τ, %, вычисляют по формуле (1)

$${\omega }_{\tau }=\frac{(D_{sample}-D_{\mathrm{int}\text{}ercept})\cdot V_{sample}\cdot d\cdot 100}{S_{std}\cdot m_{sample}\cdot 10000\cdot W_{DMsample}},\text{ (1)}$$

где D_sample - оптическая плотность раствора;

D_intercept - оптическая плотность, соответствующая точке пересечения калибровочной зависимости с осью у;

V_sample - объем экстракта (10 см³), см³;

d - коэффициент разбавления, используемый для колориметрического анализа;

S_std - тангенс угла наклона градуировочной прямой;

m _sample масса пробы, г;

W_DMsample - массовая доля сухого вещества в пробе, %.

Недостатком этого способа является продолжительность, трудоемкость, большое количество этапов выполнения работы, использование для экстракции полифенолов токсичного реактива - метанола, не соответствие результата анализа выходу полифенолов из пробы чая в водный экстракт в условиях традиционного заваривания чая в заварном чайнике или чашке, так как в раствор метанола переходят как водорастворимые, так и водонерастворимые полифенолы чая.

Технический результат изобретения заключается в том, что предложенный метод определения полифенолов чая позволяет сократить продолжительность анализа, уменьшить количество основных операций и расход реактивов, повысить безопасность работы, получить достоверные данные о количестве полифенолов, поступающих в организм человека при потреблении чайного экстракта. Благодаря новому соотношению реагентов, используемых при взаимодействии полифенолов с реактивом Folin-Ciocalteu, продукт реакции - вольфрамовая синь - образуется в течение 1-2 мин, вместо 60 мин по прототипу, при этом величина оптической плотности окрашенного раствора не изменяется в течение 30-35 мин, что также удобно для анализа; кроме того, сокращение времени указанной реакции позволяет избежать возможного взаимодействия белков чая с реактивом Folin-Ciocalteu, на которое требуется более 30 мин.

Этот результат достигается тем, что предложенный способ определения полифенолов чая предусматривает экстрагирование полифенолов из измельченной пробы чая, определение содержания полифенолов в экстракте колориметрическим методом с применением реактива Folin-Ciocalteu, при этом полифенолы экстрагируют из измельченной пробы чая массой 1,0-1,5 г добавлением к ней 50-75 см³ дистиллированной воды с температурой 95-100°С, настаиванием в течение 5 мин при комнатной температуре и фильтрованием. Полученный экстракт разбавляют дистиллированной водой в 25 раз, отбирают 0,5-0,6 см³ разбавленного экстракта, добавляют к нему 3,0 см³ 0,5 М раствора Na₂CO₃ и 0,3 см³ реактива Folin-Ciocalteu и через 2-3 мин измеряют оптическую плотность раствора при длине волны 765 нм. Концентрацию полифенолов в разбавленном экстракте определяют по градуировочному графику зависимости оптической плотности раствора танина с молярной массой 400-500 г/моль от массовой концентрации танина в растворе. Количество полифенолов чая, перешедших в водный экстракт, выражают их массовой долей в анализируемой пробе чая X, % на сухое вещество, которую рассчитывают по формуле (2)

$$X=\frac{c\cdot 25\cdot 50\cdot 100\cdot 100}{m\cdot {\omega }_{св}}\text{ (2) }$$

где с - массовая концентрация полифенолов в разбавленном экстракте чая, мг/см³;

25 - кратность разведения исходного экстракта чая;

50 - общий объем исходного экстракта чая, см³;

m - масса пробы, мг;

ω_св - массовая доля сухого вещества в пробе, %.

Предложенный способ осуществляется следующим образом. Готовят 50 см³ рабочего раствора танина (1) с концентрацией 0,5 мг/см³. Используют танин с молярной массой 400-500 г/моль, что соответствует характеристике чайного танина [2]. Разбавляя рабочий раствор танина дистиллированной водой в пропорциях, указанных в табл.1, получают растворы танина меньшей концентрации.

Таблица 1 Растворы танина №раствора танина Объемы рабочего раствора танина (1) и воды, используемые для приготовления растворов танина Массовая концентрация танина в растворе, мг/ см³ 1 рабочий раствор танина (1) 0,500 2 5,0 см³ раствора (1) и 5,0 см³ воды 0,250 3 3,0 см³ раствора (1) и 7,0 см³ воды 0,150 4 1,5 см³ раствора (1) и 8,5 см³ воды 0,075 5 1,0 см³ раствора (1) и 9 см³ воды 0,050

В 5 пробирок вносят по 0,6 см³ каждого раствора танина, добавляют по 3 см³ 0,5 М раствора Nа₂СО₃, перемешивают и прибавляют по 0,3 см³ реактива Folin-Ciocalteu. Содержимое пробирок перемешивают и через 2-3 мин на спектрофотометре при длине волны 765 нм или на фотоэлектроколориметре при использовании светофильтра, обеспечивающего измерение при длине волны, ближайшей к 765 нм, измеряют оптическую плотность растворов против воды. Так же выполняют холостой опыт, в котором вместо раствора танина используют дистиллированную воду. Строят градуировочный график зависимости оптической плотности раствора танина за вычетом оптической плотности холостого опыта от массовой концентрации танина в растворе. Массовые концентрации танина в растворе, приведенные в таблице 1, позволяют получить градуировочный график линейной зависимости оптической плотности раствора танина от массовой концентрации танина в растворе. Если массовая концентрация танина в растворе меньше 0,05 мг/см³, величина оптической плотности раствора приближается к нулю, если массовая концентрация танина в растворе больше 0,50 мг/см³, величина оптической плотности раствора приближается к единице. В обоих случаях результаты анализа становятся недостоверными. Указанное соотношение реагентов - раствора танина, раствора Na₂CO₃, реактива Folin-Ciocalteu - получено в ходе лабораторных испытаний, оно обеспечивает практически мгновенное образование вольфрамовой сини и формирование устойчивой окраски раствора. При этом величина оптической плотности окрашенного раствора не изменяется в течение 30-35 мин, что также удобно для анализа. Другое соотношение реагентов замедляет реакцию.

Листовой чай измельчают по ИСО 1572 [3] и хранят в герметичных контейнерах, обеспечивая защиту от солнечного света. Далее берут пробу измельченного чая массой 1,0-1,5 г, переносят количественно в химический стакан вместимостью 150-200 см³, добавляют 50-75 см³ дистиллированной воды с температурой 95-100°С, перемешивают, настаивают в течение 5 мин при комнатной температуре и фильтруют. Соотношение массы пробы измельченного чая и воды (1,0-1,5 г и 50-75 см³), а также температура воды и продолжительность экстракции определены на основании технических рекомендаций заваривания чая при дегустационной оценке и при потреблении этого напитка [4]. При уменьшении массы пробы чая менее 1,0 г результат будет неточным из-за уменьшения объема чайной заварки, ускоренного ее охлаждения во время экстракции и вследствие этого снижения выхода полифенолов в экстракт. При увеличении массы пробы чая более 1,5 г выход полифенолов чая в экстракт не изменяется, а расход анализируемого образца чая возрастает.

Полученный экстракт чая разбавляют дистиллированной водой в 25 раз. Рекомендуемая степень разбавления исходного экстракта чая определена необходимостью получения концентрации полифенолов, при которой после действия на них реактива Folin-Ciocalteu достигается оптическая плотность раствора, соответствующая градуировочному графику. При разбавлении исходного экстракта чая более чем в 25 раз оптическая плотность раствора приближается к нулю, а при разбавлении менее чем в 25 раз - приближается к единице. В обоих случаях точность результатов понижается.

В пробирку переносят 0,5-0,6 см³ разбавленного экстракта чая, добавляют 3,0 см³ 0,5 М раствора Na₂CO₃, перемешивают и прибавляют 0,3 см³ реактива Folin-Ciocalteu. Содержимое пробирки перемешивают и через 2-3 мин на спектрофотометре при длине волны 765 нм или на фотоэлектроколориметре при использовании светофильтра, обеспечивающего измерение при длине волны, ближайшей к 765 нм, измеряют оптическую плотность раствора против воды. Используя градуировочный график, по величине оптической плотности разбавленного экстракта чая за вычетом оптической плотности холостой пробы находят концентрацию полифенолов (по танину) в разбавленном экстракте чая. Количество полифенолов чая, перешедших в водный экстракт, выражают их массовой долей в анализируемой пробе чая X, % на сухое вещество, которую рассчитывают по формуле (2)

$$X=\frac{c\cdot 25\cdot 50\cdot 100\cdot 100}{m\cdot {\omega }_{св}}$$

где с - массовая концентрация полифенолов в разбавленном экстракте чая, мг/ см³;

25 - кратность разведения исходного экстракта чая;

50 - общий объем исходного экстракта чая, см³;

m - масса пробы, мг;

ω_св - массовая доля сухого вещества в пробе, %.

Анализ проводят не менее чем в двух повторностях. За окончательный результат анализа принимают среднее арифметическое результатов параллельных определений. Результат вычислений округляют до первого десятичного знака.

Предложенный метод определения полифенолов чая позволит сократить время анализа и расход реактивов, повысить безопасность работы, получить достоверные данные о количестве полифенолов чая, переходящих в водный экстракт при заваривании чая для дегустационного анализа или потребления этого напитка.

Пример 1 (по прототипу). Готовят исходный стандартный раствор галловой кислоты с массовой концентрацией 1 мг/см³. Переносят исходный стандартный раствор галловой кислоты в объемах, указанных в табл.2, в мерные колбы вместимостью 100 см³, доводят до метки дистиллированной водой при постоянном перемешивании.

Таблица 2 Стандартные растворы галловой кислоты Галловая кислота, стандартный раствор Объем исходного стандартного раствора галловой кислоты, см³ Массовая концентрация галловой кислоты в стандартном растворе,
мкг/см³ А 1,0 10 В 2,0 20 С 3,0 30 D 4,0 40 Е 5,0 50

Листовой чай измельчают по ИСО 1572 [3] и хранят в герметичных контейнерах, обеспечивая защиту от солнечного света.

Пробирку с 70%-ным водным раствором метанола помещают на водяную баню с температурой 70°С и выдерживают 30 мин. В пробирку для экстрагирования переносят 0,200±0,001 г измельченного листового чая, после чего ее помещают на водяную баню с температурой 70°С. В пробирку для экстрагирования вносят 5,0 см³ прогретого водного раствора метанола, закрывают пробкой и перемешивают на шейкере. Продолжают нагревание пробирки для экстрагирования на водяной бане в течение 10 мин. Дополнительные перемешивания на шейкере проводят через 5 и 10 мин. Извлекают пробирку из водяной бани и охлаждают до комнатной температуры. Извлекают пробку, помещают пробирку в центрифугу и центрифугируют в течение 10 мин при частоте вращения 3500 об/мин. Декантируют жидкость в градуированную пробирку. Повторяют экстракцию. Объединяют экстракты, доводят объем до 10,0 см³ коллоидным водным раствором метанола и перемешивают. Приготовленный таким образом экстракт чая разбавляют дистиллированной водой в 100 раз. Помещают по 1,0 см³ стандартных растворов галловой кислоты А, В, С, D и Е в двух повторностях в отдельные градуированные пробирки. Вносят по 1,0 см³ дистиллированной воды в двух повторностях в отдельные градуированные пробирки для холостых проб. Вносят по 1,0 см³ разбавленного экстракта чая в двух повторностях в отдельные градуированные пробирки. В каждую из пробирок добавляют по 5,0 см³ водного раствора реактива Folin-Ciocalteu и перемешивают.Через 3-8 мин в каждую пробирку добавляют по 4,0 см³ 7,5%-ного водного раствора Na₂CO₃, закрывают пробирки пробками и перемешивают. Выдерживают растворы в течение 60 мин при комнатной температуре, с помощью спектрофотометра измеряют оптическую плотность растворов относительно воды при длине волны 765 нм.

Строят линейный градуировочный график зависимости y=f(x), где у - оптическая плотность стандартных растворов галловой кислоты за вычетом оптической плотности холостой пробы, x - массовая концентрация галловой кислоты в стандартных растворах, мкг/ см³.

Массовую долю полифенолов в пробе чая ω_τ, %, вычисляют по формуле(1)

$${\omega }_{\tau }=\frac{(D_{sample}-D_{\mathrm{int}\text{}ercept})\cdot V_{sample}\cdot d\cdot 100}{S_{std}\cdot m_{sample}\cdot 10000\cdot W_{DMsample}},$$

где D_sample - оптическая плотность раствора;

D_intercept - оптическая плотность, соответствующая точке пересечения калибровочной зависимости с осью у;

V_sample - объем экстракта (10 см³), см³;

d - коэффициент разбавления, используемый для колориметрического анализа;

S_std - тангенс угла наклона градуировочной прямой;

m_sample - масса пробы, г;

W_DMsample - массовая доля сухого вещества в пробе, %.

Анализ проводят в трех повторностях. Полученные результаты содержания полифенолов в анализируемых пробах чая составляют: ω_τ1 1=15,41%; ω_τ2=14,90%; ω_τ3=14,82%; ω_τ ср.=15,04%. Отклонения результатов от средней величины: δ=0,37%; δ₂=0,14%; δ₃=0,22%. Время, пошедшее на эксперимент, равно 220 мин. Количество основных операций - 7.

Пример 2 (предлагаемый). Готовят 50 см³ рабочего раствора танина (1) с концентрацией 0,5 мг/см³. Используют танин с молярной массой 485 г/моль. Рабочий раствор танина в пробирках разбавляют дистиллированной водой в следующих пропорциях:

1) рабочий раствор танина (0,500 мг/ см³);

2) 5,0 см³ раствора (1) и 5,0 см³ воды (0,250 мг/см³);

3) 3,0 см³ раствора (1) и 7,0 см³ воды (0,150 мг/см³);

4) 1,5 см³ раствора (1) и 8,5 см³ воды (0,075 мг/см³);

5) 1,0 см³ раствора (1) и 9 см³ воды (0,050 мг/см).

В 5 пробирок вносят по 0,6 см³ каждого раствора танина, добавляют по 3 см³ 0,5 М раствора Na₂CO₃, перемешивают и прибавляют по 0,3 см³ реактива Folin-Ciocalteu. Содержимое пробирок перемешивают и через 3 мин на спектрофотометре измеряют оптическую плотность растворов против воды при длине волны 765 нм. Так же выполняют холостой опыт, в котором вместо раствора танина используют дистиллированную воду. Строят градуировочный график зависимости оптической плотности раствора танина за вычетом оптической плотности холостого опыта от массовой концентрации танина в растворе.

Листовой чай измельчают по ИСО 1572 [3] и хранят в герметичных контейнерах, обеспечивая защиту от солнечного света. Берут пробу измельченного листового чая массой 1,0 г, переносят количественно в химический стакан вместимостью 150 см³, добавляют 50 см³ дистиллированной воды с температурой 95°С, перемешивают, настаивают в течение 5 мин при комнатной температуре и фильтруют.

Полученный экстракт чая разбавляют дистиллированной водой в 25 раз. В пробирку переносят 0,4 см³ разбавленного экстракта, добавляют 2,0 см³ 0,5 М раствора Na₂CO₃, перемешивают и прибавляют 0,2 см³ реактива Folin-Ciocalteu. Содержимое пробирки перемешивают и через 3 мин на фотоэлектроколориметре при длине волны 765 нм измеряют оптическую плотность раствора против воды. Используя градуировочный график, по величине оптической плотности разбавленного экстракта чая за вычетом оптической плотности холостой пробы находят концентрацию полифенолов (по танину) в разбавленном экстракте чая. Количество полифенолов чая, перешедших в водный экстракт, выражают их массовой долей в анализируемой пробе чая X, % на сухое вещество, которую рассчитывают по формуле (2)

$$X=\frac{c\cdot 25\cdot 50\cdot 100\cdot 100}{m\cdot {\omega }_{св}}$$

где с - массовая концентрация полифенолов в разбавленном экстракте чая, мг/ см³;

25 - кратность разведения исходного экстракта чая;

50 - общий объем исходного экстракта чая, см³;

m - масса пробы, мг;

ω_св - массовая доля сухого вещества в пробе, %.

Анализ проводят в трех повторностях. Полученные результаты количества полифенолов чая, перешедших в водный экстракт, составляют: ω_τ1=8,59%; ω_τ2=8,44%; ω_τ3=7,97%; ω_τ2ср.=8,33%. Отклонения результатов от средней величины: δ₁=0,26%; δ₂=0,11%; δ₃=0,36%. Время, пошедшее на эксперимент, равно 110 мин. Количество основных операций - 6.

Уменьшение количества полифенолов в примере 2 (по предлагаемому способу) по сравнению с примером 1 (по прототипу) обусловлено разными условиями экстракции.

Предлагаемый способ позволяет на 110 мин сократить время анализа полифенолов чая, уменьшить количество основных операций на 14,3%, снизить расход реактива Folin-Ciocalteu в 16 раз, получить достоверные данные о количестве полифенолов чая, переходящих в водный экстракт при заваривании чая для дегустационного анализа или потребления этого напитка.

Литература

1. ГОСТ Р ИСО 14502-1-2010. Чай. Метод определения общего содержания полифенолов.

2. Цоциашвили И.И., Бокучава М.А. Химия и технология чая. - М.: Агропромиздат, 1989. - 391 с.

3. ГОСТ 28550-90 (ИСО 1572-80). Чай. Метод приготовления измельченной пробы и определения сухих веществ.

4. Славянский А.А., Вовк Г.А., Жигалов М.С., Мойсеяк М.Б. Лабораторный практикум по технохимическому контролю чайного сырья и готовой продукции чайного производства. - М.: Издательский комплекс МГУПП, 2007. - 56 с.

Изобретение относится к чайной промышленности и может быть использовано при анализе черного и зеленого чая. Способ предусматривает экстрагирование полифенолов из измельченной пробы чая, определение концентрации полифенолов в экстракте колориметрическим методом с применением реактива Folin-Ciocalteu, причем при получении экстракта берут измельченную пробу чая массой 1,0-1,5 г и 50-75 см³ воды с температурой 95-100°С, настаивают в течение 5 мин при комнатной температуре и фильтруют, полученный экстракт разбавляют водой в 25 раз, отбирают 0,5-0,6 см³ разбавленного экстракта, добавляют к нему 3,0 см³ 0,5 М раствора Na₂CO₃ и 0,3 см³ реактива Folin-Ciocalteu и через 2-3 мин измеряют оптическую плотность раствора при длине волны 765 нм, концентрацию полифенолов в разбавленном экстракте определяют по градуировочному графику зависимости оптической плотности раствора танина от массовой концентрации танина в растворе, количество полифенолов чая, перешедших в водный экстракт, выражают их массовой долей в анализируемой пробе чая X, % на сухое вещество, которую рассчитывают по формуле. Изобретение обеспечивает сокращение времени анализа, снизить количество простых операций, сократить расход реактивов. 2 таб., 2 пр.

Способ определения полифенолов чая, предусматривающий экстрагирование полифенолов из измельченной пробы чая, определение содержания полифенолов в экстракте колориметрическим методом с применением реактива Folin-Ciocalteu, отличающийся тем, что полифенолы экстрагируют из измельченной пробы чая массой 1,0-1,5 г добавлением к ней 50-75 см³ воды с температурой 95-100°С, настаиванием в течение 5 мин при комнатной температуре и фильтрованием, полученный экстракт разбавляют водой в 25 раз, отбирают 0,5-0,6 см³ разбавленного экстракта, добавляют к нему 3,0 см³ 0,5 М раствора Na₂CO₃ и 0,3 см³ реактива Folin-Ciocalteu и через 2-3 мин измеряют оптическую плотность раствора на длине волны 765 нм, концентрацию полифенолов в разбавленном экстракте определяют по градуировочному графику зависимости оптической плотности раствора танина от массовой концентрации танина в растворе, количество полифенолов чая, перешедших в водный экстракт, выражают их массовой долей в анализируемой пробе чая X, % на сухое вещество, которую рассчитывают по формуле

где с - массовая концентрация полифенолов в разбавленном экстракте чая, мг/см³;
25 - кратность разведения исходного экстракта чая;
50 - общий объем исходного экстракта чая, см³;
m - масса пробы, мг;
ω_св - массовая доля сухого вещества в пробе, %.