СПОСОБЫ ИНАКТИВАЦИИ ВИРУСА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭКОЛОГИЧНЫХ ДЕТЕРГЕНТОВ Российский патент 2019 года по МПК C07K1/14 A61L2/18 A61K38/00 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По данной заявке испрашивается приоритет на основании предварительной патентной заявки США № 61/905075, поданной 15 ноября 2013 года, и предварительной патентной заявки США № 61/937284, поданной 7 февраля 2014 года, содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к способам инактивации вируса с использованием детергентов.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В биотехнологическом производстве фармацевтических активных веществ для разных целей необходимы вспомогательные вещества. Детергенты используют в конце фазы синтеза для лизиса продуцирующих клеток, для высвобождения продуктов синтеза для очистки, а также в качестве защиты от вирусного или бактериального загрязнения. После очистки нужных продуктов ростовую среду и буферы, используемые для очистки продукта, инактивируют и сливают в сточные воды. Такой слив может создавать экологическую проблему, оцениваемую на основании оценки экологического риска (ERA), создаваемого детергентом.

Современные протоколы для инактивации вируса в биотехнологическом производстве фармацевтических активных веществ часто основаны на использовании Triton X-100. Продуктом деградации Triton X-100 является октилфенол, экотоксин с доказанными эстрогенными эффектами. Установленные лимиты для сброса октилфенола составляют 0,01-0,1 частей на миллиард. Вследствие этого, применение Triton-X в биотехнологических процессах может потребовать использования сложных и дорогих средств для удаления октилфенола из сточных вод. Следовательно, необходим экологически чистый детергент для использования в производстве биологически активных веществ.

Все литературные источники, цитируемые в настоящем документе, включая патентные заявки и публикации, включены посредством ссылки в полном объеме.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к способам инактивации вируса в потоке исходных материалов продукта в процессе производства терапевтического полипептида, включающим стадию обработки потока исходных материалов детергентом, при этом детергент является экологически безопасным. Способ обеспечивает сохранение качества терапевтического полипептида, например, в сравнении со способом, в котором используют Triton X-100, или способом без использования детергента.

В некоторых вариантах осуществления сохранение качества терапевтического полипептидного продукта заключается в изменении содержания вариантов продукта не более чем на 5% от всего количества полипептида в потоке исходных материалов продукта. В некоторых вариантах осуществления содержание вариантов продукта не возрастает более чем на 5% от общего содержания полипептида в потоке исходных материалов продукта. В некоторых вариантах осуществления варианты продукта представляют собой варианты по размеру, варианты по заряду, окисленные варианты, дезамидированные варианты, гликированные варианты или варианты с измененными гликановыми профилями. В некоторых вариантах осуществления варианты продукта представляют собой кислые и/или щелочные варианты продукта. В некоторых вариантах осуществления изобретения обработка потока исходных материалов детергентом не приводит к увеличению фрагментации полипептида более чем на приблизительно 5%. В некоторых вариантах осуществления обработка потока исходных материалов детергентом не приводит к увеличению агрегации в потоке исходных материалов более чем на приблизительно 5%. В других вариантах осуществления обработка потока исходных материалов детергентом не приводит к снижению выхода полипептида в производственном процессе более чем на приблизительно 5%.

Изобретение относится к способам инактивации вируса в потоке исходных материалов продукта в процессе производства терапевтического полипептида, включающим стадию обработки потока исходных материалов детергентом, при этом экологически безопасный детергент добавляют к потоку исходных материалов до конечной концентрации от приблизительно 0,01% до приблизительно 10%. В некоторых вариантах осуществления детергент добавляют к потоку исходных материалов до конечной концентрации от приблизительно 0,3% до приблизительно 1%. В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов обрабатывают детергентом в течение периода времени от по меньшей мере приблизительно 1 минуты до по меньшей мере приблизительно 48 часов. В других вариантах осуществления поток исходных материалов обрабатывают детергентом в течение периода времени от по меньшей мере приблизительно 15 минут до по меньшей мере приблизительно 3 часов. В других вариантах осуществления поток исходных материалов обрабатывают детергентом в течение по меньшей мере приблизительно 1 часа. В некоторых вариантах осуществления изобретения поток исходных материалов обрабатывают детергентом при температуре от приблизительно 4°C до приблизительно 30°C. В других вариантах осуществления поток исходных материалов обрабатывают детергентом при температуре от приблизительно 15°C до приблизительно 20°C.

В некоторых вариантах осуществления изобретения детергент представляет собой неионный детергент или цвиттерионный детергент. В некоторых вариантах осуществления детергент имеет гидрофильно-липофильный баланс (ГЛБ) от приблизительно 12 до приблизительно 15.

В некоторых вариантах осуществления изобретения детергент не содержит или не образует октилфенол. В некоторых вариантах осуществления детергент не содержит или не образует пероксид.

В некоторых вариантах осуществления изобретения поток исходных материалов, содержащий детергент, имеет низкую мутность. В некоторых вариантах осуществления добавление детергента к потоку исходных материалов не приводит к увеличению мутности потока исходных материалов.

В некоторых вариантах осуществления изобретения при сбросе прогнозируемая концентрация в окружающей среде (PEC) детергента в приемном водоеме, возникающая в результате использования детергента, находится ниже уровня прогнозируемой безопасной концентрации (PNEC) детергента. В следующих вариантах осуществления PEC является меньше, чем PNEC.

В некоторых вариантах осуществления изобретения экологически чистый детергент содержит алкилглюкозид. В следующих вариантах осуществления алкилглюкозид представляет собой децилглюкозид. В других вариантах осуществления экологически безопасный детергент представляет собой этоксилат спирта. В других вариантах осуществления экологически безопасный детергент представляет собой алкиловый эфир полиэтиленгликоля. В некоторых вариантах осуществления экологически безопасный детергент имеет регистрационный номер CAS: CAS 9005-64-5, CAS 9005-65-6, CAS 126-43-8, 68515-73-1, CAS 58846-77-8, CAS 59122-55-3, CAS 110615-47-9, CAS 29836-26-8, CAS 64366-70-7, CAS 68937-66-6, CAS 69227-22-1, CAS 25322-68-3, CAS 27252-75-1, CAS 4292-10-8, CAS 132778-08-6, CAS 110615-47-9, CAS 68515-73-1 или CAS 68439-46-3.

В некоторых вариантах осуществления детергент содержит один или более сурфактантов. В следующих вариантах осуществления детергент содержит один или более сурфактантов, консервантов и хелатообразующих агентов.

В некоторых аспектах изобретение относится к способам инактивации вируса в потоке исходных материалов продукта в процессе производства терапевтического полипептида, включающим стадию обработки потока исходных материалов экологически чистым детергентом, при этом поток исходных материалов содержит собранную культуральную жидкость клеток. В некоторых вариантах осуществления детергент добавляют к собранной культуральной жидкости клеток. В других вариантах осуществления поток исходных материалов содержит пул захваченного или пул извлеченного продукта. В следующих вариантах осуществления пул захваченного или пул извлеченного продукта представляет собой пул после аффинной хроматографии. В других вариантах осуществления пул захваченного или пул извлеченного продукта представляет собой пул после белка A, пул после белка G или пул после белка L. В других вариантах осуществления пул захваченного или пул извлеченного продукта представляет собой пул после хроматографии смешанного типа. В следующих вариантах осуществления пул захваченного продукта представляет собой пул после CaptoAdhere.

В некоторых вариантах осуществления изобретения экологически безопасный детергент используют в сочетании с пеногасителем. В некоторых вариантах осуществления пеногаситель представляет собой симетикон.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам инактивации вируса в потоке исходных материалов продукта в процессе производства терапевтического полипептида, включающим стадию обработки потока исходных материалов экологически чистым детергентом, при этом вирус представляет собой оболочечный вирус. В некоторых вариантах осуществления вирус представляет собой ретровирус, герпесвирус, флавивирус, поксвирус, гепаднавирус, вирус гепатита, ортомиксовирус, парамиксовирус, рабдовирус или тогавирус. В некоторых вариантах осуществления логарифмический показатель снижения концентрации вируса (LRV) для детергента в потоке исходных материалов составляет более приблизительно единицы. В следующих вариантах осуществления вирусный показатель LRV составляет более приблизительно четырех. В некоторых вариантах осуществления LRV рассчитывают на основании анализа инфекционности. В следующих вариантах осуществления анализ инфекционности представляет собой анализ бляшкообразования или анализ TCID₅₀.

В некоторых вариантах осуществления изобретения способ дополнительно включает стадию фильтрования потока исходных материалов после добавления детергента. В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов фильтруют через период времени от по меньшей мере приблизительно 15 минут до по меньшей мере приблизительно 48 часов после добавления детергента. В следующих вариантах осуществления поток исходных материалов фильтруют через период времени от по меньшей мере приблизительно 1 часа до по меньшей мере приблизительно 3 часов после добавления детергента. В других вариантах осуществления поток исходных материалов фильтруют через приблизительно 1 час после добавления детергента. В некоторых вариантах осуществления фильтр представляет собой ультрафильтр или глубинный фильтр.

В некоторых вариантах осуществления изобретения поток исходных материалов подвергают хроматографии после добавления детергента. В некоторых вариантах осуществления хроматография представляет собой одну или более из аффинной хроматографии, ионообменной хроматографии, хроматографии гидрофобного взаимодействия, хроматографии на гидроксиапатите или хроматографии смешанного типа. В некоторых вариантах осуществления аффинная хроматография представляет собой хроматографию на основе белка A, хроматографию на основе белка G или хроматографию на основе белка L. В других вариантах осуществления ионообменная хроматография представляет собой анионообменную хроматографию или катионообменную хроматографию. В других вариантах осуществления хроматография смешанного типа представляет собой хроматографию CaptoAdhere.

В некоторых аспектах изобретение относится к способам инактивации вируса в потоке исходных материалов продукта в процессе производства терапевтического полипептида, включающим стадию обработки потока исходных материалов экологически безопасным детергентом, при этом терапевтический полипептид представляет собой антитело, иммуноадгезин, фермент, фактор роста, рецептор, гормон, регуляторный фактор, цитокин, Fc-слитый полипептид, антиген или связующее вещество. В следующих вариантах осуществления антитело представляет собой моноклональное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело, человеческое антитело, биспецифическое антитело или фрагмент антитела. В некоторых вариантах осуществления терапевтический полипептид получают в клетках млекопитающих. В некоторых вариантах осуществления линия клеток млекопитающего представляет собой клетки яичника китайского хомячка (CHO) или клетки почки новорожденного хомячка (BHK), клетки мышиной гибридомы или клетки мышиной миеломы.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фигуре 1 представлен анализ мутности при смешивании с детергентом контроля мАт1 HCCF без детергента при использовании различных способов смешивания; без смешивания (ромбы), с помощью якоря магнитной мешалки (квадраты) и верховой мешалки (треугольники).

На фигуре 2 представлен анализ мутности при смешивании с детергентом мАт1 HCCF, обработанных 1% полисорбатом 20 (вверху слева), 1% полисорбатом 20 с 0,3% TnBP (вверху справа), 1% полисорбатом 80 (внизу слева) и 1% полисорбатом 80 с 0,3% TnBP (внизу справа). Без смешивания (ромбы), якорь магнитной мешалки (квадраты) и верховая мешалка (треугольники), жирная черта (контроль HCCF - без смешивания).

На фигуре 3 представлен анализ мутности при смешивании с детергентом мАт1 HCCF, обработанных 1% SafeCare (вверху слева), 1% Ecosurf EH9 (вверху справа), 0,1M каприловой кислотой (внизу слева) и 1% децилполиглюкозидом (внизу справа). Без смешивания (ромбы), якорь магнитной мешалки (квадраты) и верховая мешалка (треугольники), жирная черта (контроль HCCF - без смешивания).

На фигуре 4 приведены пептидные карты мАт3 после инкубации с детергентами в течение ночи при температуре окружающей среды и очистки на белке A MAbSelect Sure.

На фигуре 5 показаны спектры ЯМР образцов для определения стабильности с 10% Triton CG-110, хранящихся в течение различных периодов времени вплоть до 59 дней при температуре 40°C.

На фигуре 6 показаны спектры ЯМР образцов для определения стабильности с маточным раствором 10% Ecosurf EH-9, хранящихся в течение различных периодов времени вплоть до 59 дней при температуре 40°C.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Изобретение относится к способу инактивации вируса в потоке исходных материалов продукта в процессе производства терапевтического полипептида с использованием экологически безопасных (экологичных) детергентов. Использование экологически безопасных детергентов не влияет отрицательно на качество терапевтического полипептидного продукта. Например, использование экологически безопасных детергентов не приводит к увеличению числа вариантов продукта, таких как, но без ограничения, варианты по размеру, включая фрагменты и агрегаты продукта, варианты по заряду, включая кислые и щелочные варианты, дезаминированные варианты и гликированные варианты. В некоторых аспектах использование экологически чистых детергентов не влияет отрицательно на очистку от возникающих в процессе примесей, таких как CHOP, нуклеиновые кислоты, выщелоченный белок A, варианты продукта, эндотоксин, вирусные загрязнения, компоненты среды для культивирования клеток и тому подобное.

I. Общие методы

Методы и процедуры, описанные или упомянутые в настоящем документе, специалисты в данной области, как правило, хорошо понимают и широко применяют с использованием общепринятой методологии, такой как, например, широко используемые методологии, описанные в сборниках Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3е издание (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003)); серии Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); и Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993).

II. Определения

Термин «детергент» относится к средству, которое может содержать соли длинноцепочечных алифатических оснований или кислот, или гидрофильные фрагменты, такие как сахара, и которое обладает как гидрофильными, так и гидрофобными свойствами. Обладая и гидрофильными, и гидрофобными свойствами, детергент может проявлять определенные качества. Используемые в настоящем документе детергенты обладают способностью разрушать оболочки вирусов и инактивировать вирусы. В некоторых примерах детергент может представлять собой композицию, содержащую сурфактант и одно или более других средств, таких как хелатообразующие агенты и консерванты.

«Сурфактант» или «поверхностно-активное средство» представляет собой соединение, как правило (но не обязательно), органическое соединение, которое содержит как гидрофобные, так и гидрофильные группы и, вследствие этого, является полурастворимым как в органических, так и в водных растворителях. Сурфактанты могут быть неионными, катионными или анионными.

Используемый в настоящем документе термин «экологически безопасное» вещество означает вещество, которое оказывает минимальное вредное воздействие на окружающую среду. Например, экологически безопасное вещество будет практически нетоксичным для животных и растений.

«Прогнозируемая концентрация в окружающей среде» или «PEC» представляет собой прогнозируемую концентрацию вещества в отходах производства, сбрасываемых в приемный водоем в окружающей среде. Например, прогнозируемая концентрация в окружающей среде детергента, используемого для инактивации вируса при получении терапевтического белка, представляет собой концентрацию детергента в потоке отходов, сбрасываемых в окружающую среду.

«Прогнозируемая безопасная концентрация» или «PNEC» представляет собой прогнозируемую концентрацию вещества в отходах производства, которая безопасна при сбросе в окружающую среду и не оказывает вредного воздействия, например, на биоту принимающей пресной воды и/или морской воды.

Термины «полипептид» и «белок» используют в настоящем документе взаимозаменяемо для обозначения полимеров любой длины из аминокислот. Полимер может быть линейным или разветвленным, он может содержать модифицированные аминокислоты, и в него могут быть включены не аминокислотные фрагменты. Термины также включают аминокислотный полимер, который был модифицирован естественным образом или за счет вмешательства человека; например, путем образования дисульфидных связей, гликозилирования, липидизации, ацетилирования, фосфорилирования, или любых других манипуляций или модификаций, таких как конъюгация с маркирующим компонентом. Определение также охватывает, например, полипептиды, содержащие один или более аналогов аминокислот (включая, например, неприродные аминокислоты и так далее), а также содержащие другие модификации, известные в данной области. Используемые в настоящем документе термины «полипептид» и «белок», в частности, включают антитела.

«Выделенный полипептид» означает полипептид, который был извлечен из клетки или культуры клеток, в которых он был экспрессирован.

Используемый в настоящем документе термин «вариант полипептида по заряду» относится к полипептиду, который был модифицирован из своего естественного состояния таким образом, что заряд полипептида был изменен. В некоторых примерах варианты по заряду являются более кислыми, чем исходный полипептид; то есть, имеют более низкое значение pI, чем исходный полипептид. В других примерах варианты по заряду являются более щелочными, чем исходный полипептид; то есть, имеют более высокое значение pI, чем исходный полипептид. Такие модификации могут быть искусственно созданы или являться результатом естественных процессов, таких как окисление, дезамидирование, C-концевой процессинг остатков лизина, N-концевое образование пироглутамата и гликирование. В некоторых примерах вариант полипептида по заряду представляет собой гликопротеин, в котором гликан, присоединенный к белку, модифицирован таким образом, что заряд гликопротеина изменен по сравнению с исходным гликопротеином, например, за счет добавления сиаловой кислоты или ее производных. Используемый в настоящем документе термин «вариант антитела по заряду» означает антитело или его фрагмент, которые были модифицированы из их естественного состояния таким образом, что заряд антитела или его фрагмента был изменен.

Используемый в настоящем документе термин «нуклеиновая кислота» относится к полимерам любой длины из нуклеотидов и включает ДНК и РНК. Нуклеотиды могут быть дезоксирибонуклеотидами, рибонуклеотидами, модифицированными нуклеотидами или основаниями, и/или их аналогами, или любым субстратом, который может быть включен в полимер при помощи ДНК- или РНК-полимеразы, или в процессе реакции синтеза. Полинуклеотид может содержать модифицированные нуклеотиды, например, метилированные нуклеотиды и их аналоги. В случае ее наличия, модификация в нуклеотидную структуру может быть внесена до или после сборки полимера.

«Выделенная нуклеиновая кислота» означает и включает не существующую в природе, рекомбинантную или существующую в природе последовательность, находящуюся вне, или выделенную из ее обычного окружения.

«Очищенный» полипептид означает, что полипептид имеет более высокую степень чистоты, то есть, что он существует в форме, которая является более чистой, чем та, которая имеет место в его природном окружении и/или сразу после того, как он был продуцирован и/или синтезирован, и/или амплифицирован в лабораторных условиях. «Чистота» является относительным термином и не обязательно означает абсолютную чистоту.

«Поток исходных материалов продукта» или, альтернативно, «поток исходных материалов» означает материал или раствор, исходно используемый в процессе очистки, который содержит интересующий терапевтический полипептид и который также может содержать различные примеси. Неограничивающие примеры могут включать, например, собранную культуральную жидкость клеток (HCCF) или собранный пул, содержащий интересующий терапевтический полипептид, после одной или более стадий процесса очистки.

Термин «антитело» или «антитела» используется в самом широком смысле и, в частности, включает, например, отдельные моноклональные антитела (включая агонистические, антагонистические и нейтрализующие антитела), композиции антител с полиэпитопной специфичностью, поликлональные антитела, одноцепочечные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), иммуноадгезины, а также фрагменты антител при условии, что они обладают желательной биологической или иммунологической активностью. В настоящем документе термин «иммуноглобулин» (Ig) используют взаимозаменяемо с термином «антитело».

«Фрагменты антител» включают часть полноразмерного антитела, как правило, его антигенсвязывающую или вариабельную область. Примеры фрагментов антител включают Fab, Fab’, F(ab’)₂, и Fv фрагменты; одноцепочечные молекулы антител; диатела; линейные антитела, а также мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.

Используемый в настоящем документе термин «моноклональное антитело» означает антитело, полученное из популяции по существу гомогенных антител, то есть, отдельные антитела, составляющие популяцию, идентичны за исключением возможных естественных мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными, будучи направленными против единственного антигенного сайта. Кроме того, в отличие от препаратов поликлональных антител, которые включают различные антитела, направленные против разных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты на антигене. Помимо их специфичности, моноклональные антитела имеют преимущество в том, что их можно синтезировать без примесей других антител. Определение «моноклональные» не подразумевает, что антитела должны быть получены каким-либо конкретным методом. Например, моноклональные антитела, полезные по настоящему изобретению, можно получать методом с использованием гибридом, впервые описанным в публикации Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), или можно получать с использованием методов рекомбинантной ДНК в бактериальных, эукариотических животных или растительных клетках (см., например, патент США № 4816567). «Моноклональные антитела» также можно выделять из фаговых библиотек антител с использованием методов, описанных, например, в публикациях Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) и Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991).

Моноклональные антитела по настоящему изобретению включают «химерные» антитела, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах у конкретного биологического вида или принадлежащих к конкретному классу или подклассу антител, в то время как остальная цепь(и) идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах у другого биологического вида или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, при условии, что они проявляют нужную биологическую активность (см. патент США № 4816567 и Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). Химерные антитела, представляющие интерес для настоящего изобретения, включают «приматизированные» антитела, содержащие антигенсвязывающие последовательности вариабельного домена приматов, отличных от человека (например, мартышки, человекообразной обезьяны и так далее), и последовательности константной области человека.

«Гуманизированные» антитела представляют собой формы антител, отличных от человеческих (например, кроличьих), которые представляют собой химерные антитела, содержащие минимальную последовательность, происходящую из антитела, отличного от человеческого. В основном, гуманизированные антитела представляют собой человеческие иммуноглобулины (реципиентное антитело), в которых остатки из гипервариабельной области реципиента заменены остатками из гипервариабельной области антител видов, отличных от человека (донорское антитело), таких как мышь, крыса, кролик или приматы, кроме человека, имеющими нужную специфичность, аффинность и функциональную возможность антитела. В некоторых случаях остатки каркасной области (FR) человеческого иммуноглобулина заменены соответствующими остатками, не принадлежащими человеку. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые отсутствуют в реципиентном антителе или в донорском антителе. Такие модификации выполняют для еще большего повышения эффективности антитела. Как правило, гуманизированное антитело содержит практически все из по меньшей мере одного, и как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или практически все из гипервариабельных петель соответствуют петлям иммуноглобулина, отличного от человеческого, и все или практически все из FR происходят из последовательности человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело, необязательно, также содержит по меньшей мере часть константной области (Fc) иммуноглобулина, как правило, константной области человеческого иммуноглобулина. Для более подробной информации см. публикации Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988) и Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992).

Термин «примеси» означает материалы, которые отличаются от нужного полипептидного продукта. Примесь включает, без ограничения: материалы клетки-хозяина, такие как CHOP; выщелоченный белок A; нуклеиновую кислоту; вариант, вариант по размеру, фрагмент, агрегат или производное нужного полипептида; другой полипептид; эндотоксин; вирусное загрязнение; компонент культуральной среды клеток и так далее.

«Ультрафильтрация» представляет собой вид мембранной фильтрации, при котором гидростатическое давление заставляет жидкость протекать через полупроницаемую мембрану. Суспендированные твердые вещества и высокомолекулярные растворенные вещества задерживаются, в то время как вода и низкомолекулярные растворенные вещества проходят через мембрану. В некоторых примерах ультрафильтрационные мембраны имеют размеры пор в диапазоне от 1 до 100 нм. Термины «ультрафильтрационная мембрана» и «ультрафильтрационный фильтр» можно использовать взаимозаменяемо.

«Задерживающий вирусы фильтр», «вирусный фильтр», «вирусная мембрана» или «задерживающая вирусы мембрана» является одним из видов ультрафильтрационного фильтра/мембраны, используемым для основанного на размерах удаления вирусов из водных растворов, содержащих вирусные частицы. В частности, задерживающая вирусы мембрана имеет размеры пор, достаточные для удержания вирусов, но все еще позволяющие нужному полипептидному продукту проходить через нее.

Используемый в настоящем документе термин «засорение» означает накопление и образование нежелательных материалов на поверхностях технологического оборудования. Засорение может быть охарактеризовано как сложное нестабильное состояние, инерция, проблема с передачей массы и тепла, при этом также могут иметь место химические, растворяющие, коррозионные и биологические процессы. Засорение может возникать вследствие отложения осадка, то есть, отложение осадка фосфата кальция.

Используемый в настоящем документе термин «занесенный агент» включает вирусы и бактерии (в том числе бактерии, которые могут проходить через фильтры квалификации «для стерилизации»). «Инфекционный агент» является одним из видов «занесенного агента».

Понятно, что аспекты и варианты осуществления изобретения, описанные в настоящем документе, охватывают «включающие», «состоящие из» и «состоящие практически из» аспекты и варианты осуществления.

Для целей настоящего изобретения, если четко не указано иначе, термины в единственном числе означают «один или более».

В настоящем документе употребляемое применительно к величине или параметру слово «приблизительно» включает (и описывает) варианты осуществления, относящиеся к данной величине или параметру как таковому. Например, при употреблении фразы «приблизительно X» подразумевают описание «X». Численные диапазоны включают числа, определяющие диапазон.

III. Способы по изобретению

Изобретение относится к способу инактивации вируса в потоке исходных материалов продукта в процессе производства терапевтического полипептида с использованием экологически чистых детергентов. Использование экологически чистых детергентов не влияет отрицательно на качество терапевтического полипептидного продукта, в то же время приводя к эффективной инактивации вирусных загрязнений в потоке исходных материалов. Например, использование экологически чистых детергентов не приводит к увеличению количества вариантов продукта, таких как, но без ограничения, варианты по размеру, включая фрагменты и агрегаты продукта, варианты по заряду, включая кислые и щелочные варианты, дезаминированные варианты и гликированные варианты.

Как правило, процесс производства терапевтического полипептида включает экспрессию полипептида в клетке-хозяине. В некоторых примерах клетки-хозяева лизируют для высвобождения полипептидов. В других примерах полипептид секретируется в среду. Собранную культуральную жидкость клеток, содержащую нужный полипептид, можно осветлять и подвергать одному или более видам хроматографии для очистки нужного полипептида от примесей. Хроматография может включать проточную хроматографию, при которой нужный продукт протекает через хроматографическую систему, а примеси задерживаются хроматографической системой, и/или хроматографию связывания и элюирования, при которой нужный продукт удерживается на хроматографической системе, а примеси протекают через хроматографическую систему. В какой-то момент процесса поток исходных материалов можно фильтровать для удаления вируса. Потоки исходных материалов могут проходить стадии ультрафильтрация и/или диафильтрации для концентрирования нужного полипептида и для формулирования нужного полипептида в фармацевтический препарат. Способы инактивации вируса с использованием экологически безопасного детергента по изобретению можно применять на любой стадии производственного процесса. В некоторых вариантах осуществления изобретения вирус инактивируют путем обработки HCCF экологически безопасным детергентом. В других способах по изобретению вирус инактивируют путем обработки пула захваченного или пула извлеченного продукта экологически безопасным детергентом. Пул захваченного и/или пул извлеченного продукта возникает при разделении потока исходных материалов, содержащего нужный продукт, на стадии разделения при очистке продукта, таком как хроматография, центрифугирование, фильтрование и тому подобное. В других способах по изобретению вирус инактивируют путем обработки потока исходных материалов продукта экологически безопасным детергентом до стадии фильтрования от вируса потока исходных материалов. В других способах по изобретению вирус инактивируют путем обработки потока исходных материалов продукта экологически чистым детергентом после стадии фильтрования от вируса потока исходных материалов.

Изобретение относится к способу инактивации вируса в потоке исходных материалов продукта в процессе производства терапевтического полипептида с использованием экологически безопасных детергентов, при этом качество продукта терапевтического полипептида сохраняется во время процесса, в то время как вирусные загрязнения эффективно инактивируются. В некоторых вариантах осуществления изобретения обработка потока исходных материалов в процессе производства терапевтического полипептида экологически безопасным детергентом для инактивации вируса в потоке исходных материалов не приводит к увеличению количества вариантов продукта из общего количества белка в потоке исходных материалов продукта в производственном процессе; например, по сравнению с производственным процессом без использования детергента или с использованием Triton X-100. В некоторых вариантах осуществления варианты продукта представляют собой любой один или более из вариантов по размеру, вариантов по заряду, окисленных вариантов, дезамидированных вариантов, гликированных вариантов или вариантов с измененными гликановыми профилями. В некоторых вариантах осуществления изобретения варианты продукта представляют собой варианты по размеру. Варианты по размеру включают варианты с меньшим размером, чем нужный продукт; например, в результате деградации продукта. В других примерах варианты по размеру являются более крупными, чем нужный продукт; например, в результате агрегации нужного продукта. В некоторых вариантах осуществления агрегация продукта представляет собой агрегацию двух или более полипептидов продукта в потоке исходных материалов. В некоторых вариантах осуществления агрегация продукта представляет собой агрегацию полипептида продукта с другими полипептидами в потоке исходных материалов. Специалист в данной области может легко определять образование вариантов по размеру. Например, наличие вариантов по размеру полипептидного продукта в потоке исходных материалов можно определять методом эксклюзионной хроматографии, электрофореза в геле или другими методами, позволяющими легко определять размер полипептида. В некоторых вариантах осуществления изобретения обработка потока исходных материалов в процессе производства терапевтического полипептида экологически чистым детергентом для инактивации вируса в потоке исходных материалов приводит к более чем приблизительно 5% изменению в содержании вариантов по размеру продукта из общего содержания белка в потоке исходных материалов продукта; например, по сравнению с производственным процессом без использования детергента или с использованием Triton X-100. В некоторых вариантах осуществления экологически безопасный детергент приводит к возрастанию менее чем на приблизительно 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,1% количества вариантов по размеру продукта из общего количества белка в потоке исходных материалов продукта; например, по сравнению с производственным процессом без использования экологически безопасного детергента; например, без использования детергента или с использованием Triton X-100.

Изобретение относится к способу инактивации вируса в потоке исходных материалов продукта в процессе производства терапевтического полипептида с использованием экологически безопасных детергентов, при этом качество терапевтического полипептидного продукта сохраняется во время процесса, в то время как вирусные загрязнения эффективно инактивируются. В некоторых вариантах осуществления изобретения обработка потока исходных материалов в процессе производства терапевтического полипептида экологически безопасным детергентом для инактивации вируса в потоке исходных материалов не приводит к увеличению количества вариантов продукта в производственном процессе; например, по сравнению с производственным процессом без использования детергента или с использованием Triton X-100. В некоторых вариантах осуществления варианты представляют собой варианты по заряду. Варианты по заряду полипептида могут включать кислые варианты полипептида и щелочные варианты исходного полипептида. Примеры кислых вариантов, то есть, вариантов со значением pI ниже, чем значение pI исходного полипептида, включают, но не ограничиваются ими, полипептиды, в которых один или более остатков глютамина и/или аспарагина дезамидированы. Примеры щелочных вариантов полипептида, то есть, вариантов со значением pI выше, чем значение pI исходного полипептида, включают, но не ограничиваются ими, варианты, в которых остаток аспарагиновой кислоты модифицирован в сукцинимидный фрагмент. Методы анализа полипептидов на наличие вариантов по заряду известны в данной области; например, методы pH-опосредованной ионообменной хроматографии или изоэлектрического фокусирования для определения гетерогенности по заряду (например, кИЭФ). В некоторых примерах терапевтический полипептидный продукт подвергают одному или более видам хроматографии после добавления детергента до анализа вариантов по заряду терапевтического полипептида. Например, антитело можно подвергать аффинной хроматографии, такой как хроматография на основе белка A, после обработки детергентом и до анализа вариантов по заряду (например, методом pH-опосредованной ионообменной хроматографии). В некоторых вариантах осуществления изобретения обработка потока исходных материалов в процессе производства терапевтического полипептида экологически чистым детергентом для инактивации вируса в потоке исходных материалов приводит к более чем приблизительно 5% изменению в содержании вариантов продукта из общего содержания белка в потоке исходных материалов продукта; например, по сравнению с производственным процессом без использования детергента или с использованием Triton X-100. В некоторых вариантах осуществления экологически безопасный детергент приводит к возрастанию менее чем на приблизительно 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,1% количества вариантов продукта из общего количества белка в потоке исходных материалов продукта по сравнению с производственным процессом без использования экологически безопасного детергента; например, без использования детергента или с использованием Triton X-100.

В некоторых вариантах осуществления изобретения варианты представляют собой дезамидированные варианты. Как описано выше, дезамидированный вариант включает полипептиды, в которых один или более остатков глютамина и/или аспарагина дезамидированы. В некоторых вариантах осуществления дезамидирование полипептидного продукта приводит к изменению заряда полипептида. Методы анализа полипептидов на наличие дезамидированных вариантов известны в данной области; например, методы pH-опосредованной ионообменной хроматографии или изоэлектрического фокусирования. В некоторых примерах терапевтический полипептидный продукт подвергают одному или более видам хроматографии после добавления детергента до анализа дезамидированных вариантов терапевтического полипептида. Например, антитело можно подвергать аффинной хроматографии, такой как хроматография на основе белка A, после обработки детергентом и до анализа дезамидированных вариантов (например, методом pH-опосредованной ионообменной хроматографии или изоэлектрического фокусирования). В некоторых вариантах осуществления изобретения обработка потока исходных материалов в процессе производства терапевтического полипептида экологически чистым детергентом для инактивации вируса в потоке исходных материалов приводит к более чем приблизительно 5% изменению в содержании дезамидированных вариантов продукта из общего содержания белка в потоке исходных материалов продукта; например, по сравнению с производственным процессом без использования детергента или с использованием Triton X-100. В некоторых вариантах осуществления экологически чистый детергент приводит к возрастанию менее чем на приблизительно 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,1% количества дезамидированных вариантов продукта из общего количества белка в потоке исходных материалов продукта по сравнению с производственным процессом без использования экологически безопасного детергента; например, без использования детергента или с использованием Triton X-100.

В некоторых вариантах осуществления изобретения варианты представляют собой окисленные варианты. Окисленный вариант включает полипептиды, в которых один или более аминокислотных остатков, способных реагировать с кислородом, таких как метионин, цистеин и тирозин, были окислены. В некоторых вариантах осуществления окисление полипептидного продукта приводит к изменению заряда полипептида. Методы анализа полипептидов на наличие окисленных вариантов известны в данной области. Например, уровень окисления конкретного полипептида можно определять методом ЖХ-масс-спектроскопии. В некоторых примерах терапевтический полипептидный продукт подвергают одному или более видам хроматографии после добавления детергента до анализа окисленных вариантов терапевтического полипептида. Например, антитело можно подвергать аффинной хроматографии, такой как хроматография на основе белка A, после обработки детергентом и до анализа окисленных вариантов. В некоторых вариантах осуществления изобретения обработка потока исходных материалов в процессе производства терапевтического полипептида экологически чистым детергентом для инактивации вируса в потоке исходных материалов приводит к более чем приблизительно 5% изменению в содержании окисленных вариантов продукта из общего содержания белка в потоке исходных материалов продукта; например, по сравнению с производственным процессом без использования детергента или с использованием Triton X-100. В некоторых вариантах осуществления экологически безопасный детергент приводит к возрастанию менее чем на приблизительно 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,1% количества окисленных вариантов продукта из общего количества белка в потоке исходных материалов продукта по сравнению с производственным процессом без использования экологически безопасного детергента; например, без использования детергента или с использованием Triton X-100.

В некоторых вариантах осуществления изобретения обработка потока исходных материалов в процессе производства терапевтического полипептида экологически безопасным детергентом для инактивации вируса в потоке исходных материалов не приводит к изменению гликирования терапевтического полипептидного продукта; например, по сравнению с производственным процессом без использования детергента или с использованием Triton X-100. Гликирование представляет собой механизм образования кислых вариантов за счет образования различных видов ковалентных аддуктов, гликированием является, например, когда глюкоза или лактоза может взаимодействовать с первичным амином остатка лизина в процессе производства в богатой глюкозой культуральной среде или в процессе хранения в случае, если в препарате присутствует восстанавливающий сахар (Lyubarskay Y, et al., (2006) Anal Biochem.348: 24-39; Huang L, et al., (2005) Anal Chem. 77: 1432-1439). Характеризацию гликированного материала можно осуществлять методами секвенирования с использованием анализа пептидного картирования, жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХ-МС) и тандемной масс-спектрометрии (МС/МС). В некоторых примерах терапевтический полипептидный продукт подвергают одному или более видам хроматографии после добавления детергента до характеризации гликированного материала. Например, гликированное антитело можно подвергать аффинной хроматографии, такой как хроматография на основе белка A, после обработки детергентом и до анализа гликирования (например, методом ЖХ-МС или МС/МС). В некоторых вариантах осуществления использование экологически чистого детергента для инактивации вируса в потоке исходных материалов продукта в процессе производства терапевтического полипептида не изменяет гликирование терапевтического полипептида. В некоторых вариантах осуществления гликирование исходного полипептида не изменяется более чем на приблизительно 5% по сравнению с процессом производства терапевтического полипептида с использованием Triton X-100 или по сравнению с процессом производства терапевтического полипептида без использования детергента. В некоторых вариантах осуществления экологически безопасный детергент приводит к изменению менее чем на приблизительно 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,1% в гликировании продукта по сравнению с производственным процессом без использования экологически безопасного детергента; например, без использования детергента или с использованием Triton X-100.

В некоторых вариантах осуществления изобретения обработка потока исходных материалов в процессе производства терапевтического полипептида экологически безопасным детергентом для инактивации вируса в потоке исходных материалов не приводит к изменению паттерна гликирования терапевтического полипептидного продукта; например, по сравнению с производственным процессом без использования детергента или с использованием Triton X-100. В некоторых вариантах осуществления изобретения варианты продукта представляют собой гликированные варианты. Гликозилирование представляет собой часто встречающуюся пост-трансляционную модификацию, заключающуюся в том, что одна или более моносахаридных единиц связываются с полипептидом. Три основных типа гликанов представляют собой N-связанный, O-связанный и гликозилфосфатидилинозитол. Примеры гликозилированных терапевтических полипептидов включают моноклональные антитела, в которых один консервативный сайт N-связанного гликозилирования имеет место на остатке Asn-297 цепи Fc. Гликановая структура в этом сайте играет роль в активации комплемента и аффинности к рецептору. В некоторых вариантах осуществления изобретения использование экологически безопасного детергента для инактивации вируса в потоке исходных материалов продукта в процессе производства терапевтического полипептида не приводит к изменению паттерна гликирования терапевтического полипептида. Например, методы определения паттерна гликозилирования полипептида, такого как антитело, известны в данной области; например, см. вебсайт chem.agilent.com/Library/applications/5990-9774EN.pdf. В некоторых примерах терапевтический полипептидный продукт подвергают одному или более видам хроматографии после добавления детергента до характеризации паттерна гликирования терапевтического полипептида. Например, гликированное антитело можно подвергать аффинной хроматографии, такой как хроматография на основе белка A, после обработки детергентом и до анализа гликирования (например, методом ЖХ-МС или МС/МС). В некоторых вариантах осуществления гликирование терапевтического полипептида (например, антитела) не изменяется более чем приблизительно на 5% по сравнению с процессом производства терапевтического полипептида с использованием Triton X-100 или по сравнению с процессом производства терапевтического полипептида без использования детергента. В некоторых вариантах осуществления экологически безопасный детергент приводит к изменению менее чем на приблизительно 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,1% в паттерне гликирования продукта по сравнению с производственным процессом без использования экологически безопасного детергента; например, без использования детергента или с использованием Triton X-100.

В некоторых вариантах осуществления изобретения обработка потока исходных материалов в процессе производства терапевтического полипептида экологически безопасным детергентом для инактивации вируса в потоке исходных материалов не приводит к снижению выхода терапевтического полипептидного продукта в процессе производства. Например, обработка потока исходных материалов экологически безопасным детергентом не приводит к снижению выхода терапевтического полипептидного продукта в процессе производства по сравнению с процессом производства терапевтического полипептида с использованием Triton X-100 для инактивации вируса или процессом производства терапевтического полипептида, в котором не используют детергент. В некоторых вариантах осуществления выход терапевтического полипептидного продукта (например, антитела) не снижается более чем на приблизительно 5% по сравнению с процессом производства терапевтического полипептида с использованием Triton X-100 или по сравнению с процессом производства терапевтического полипептида без использования детергента. В некоторых вариантах осуществления экологически безопасный детергент приводит к снижению менее чем на приблизительно 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,1% выхода продукта по сравнению с производственным процессом без использования экологически чистого детергента; например, без использования детергента или с использованием Triton X-100.

В некоторых вариантах осуществления изобретения обработка потока исходных материалов в процессе производства терапевтического полипептида экологически безопасным детергентом для инактивации вируса в потоке исходных материалов не приводит к изменению степени очистки от возникающих в процессе примесей во время производственного процесса. Например, обработка потока исходных материалов экологически безопасным детергентом не приводит к изменению степени очистки от примесей в процессе производства по сравнению с процессом производства терапевтического полипептида с использованием Triton X-100 для инактивации вируса или процессом производства терапевтического полипептида, в котором не используют детергент. В некоторых вариантах осуществления использование экологически безопасного детергента не приводит к изменению степени очистки от возникающих в процессе примесей на конкретной стадии производственного процесса, такой как стадия хроматографии, стадия фильтрования, стадия концентрирования и тому подобное. В некоторых вариантах осуществления использование экологически безопасного детергента не приводит к изменению степени очистки от возникающих в процессе примесей на всем протяжении процесса производства терапевтического полипептида. Возникающие в процессе примеси включают CHOP, нуклеиновые кислоты, выщелоченный белок A, полипептиды, отличные от нужного полипептида, эндотоксин, вирусное загрязнение, компонент культуральной среды клеток, а также варианты, фрагменты, агрегаты или производные нужного полипептида.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу инактивации вируса в потоке исходных материалов продукта в процессе производства терапевтического полипептида с использованием экологически безопасных детергентов, в котором детергент добавляют к потоку исходных материалов до конечной концентрации от приблизительно 0,01% до приблизительно 10%. В некоторых вариантах осуществления детергент добавляют к потоку исходных материалов до конечной концентрации от приблизительно 0,3% до приблизительно 1%. В некоторых вариантах осуществления детергент добавляют к потоку исходных материалов до конечной концентрации приблизительно 0,3%. В некоторых вариантах осуществления детергент добавляют к потоку исходных материалов до конечной концентрации более чем приблизительно 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1%, 2%, 03%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% или 10%. В некоторых вариантах осуществления качество терапевтического полипептидного продукта сохраняется. В некоторых вариантах осуществления вирусные загрязнения эффективно инактивируются экологически безопасным детергентом.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу инактивации вируса в потоке исходных материалов продукта в процессе производства терапевтического полипептида с использованием экологически безопасных детергентов, в котором поток исходных материалов обрабатывают детергентом в течение периода времени от приблизительно 1 минуты до приблизительно 48 часов. В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов обрабатывают детергентом в течение периода времени от приблизительно 15 минут до приблизительно трех часов. В некоторых вариантах осуществления детергент добавляют к потоку исходных материалов до конечной концентрации от приблизительно 0,3% до приблизительно 1%. В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов обрабатывают детергентом в течение приблизительно одного часа. В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов обрабатывают детергентом в течение периода времени более чем приблизительно 1 минута, 5 минут, 15 минут, 30 минут, 45 минут, 1 час, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 6 часов, 9 часов, 12 часов, 16 часов, 20 часов, 24 часа, 30 часов, 36 часов, 42 часа или 48 часов. В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов обрабатывают детергентом в течение периода времени приблизительно от 1 минуты до 5 минут, от 5 минут до 15 минут, от 15 минут до 30 минут, от 30 минут до 45 минут, от 45 минут до 1 часа, от 1 часа до 2 часов, от 2 часов до 3 часов, от 3 часов до 4 часов, от 4 часов до 5 часов, от 5 часов до 6 часов, от 6 часов до 9 часов, от 9 часов до 12 часов, от 12 часов до 16 часов, от 16 часов до 20 часов, от 20 часов до 24 часов, от 24 часов до 30 часов, от 30 часов до 36 часов, от 36 часов до 42 часов или от 42 часов до 48 часов. В некоторых вариантах осуществления качество терапевтического полипептидного продукта сохраняется. В некоторых вариантах осуществления вирусные загрязнения эффективно инактивируются экологически безопасным детергентом.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу инактивации вируса в потоке исходных материалов продукта в процессе производства терапевтического полипептида с использованием экологически безопасных детергентов, в котором поток исходных материалов обрабатывают детергентом при температуре от приблизительно 4°C до приблизительно 30°C. В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов обрабатывают детергентом при температуре от приблизительно 10°C до приблизительно 25°C. В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов обрабатывают детергентом при температуре от приблизительно 15°C до приблизительно 20°C. В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов обрабатывают детергентом при температуре приблизительно 20°C. В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов обрабатывают детергентом приблизительно при температуре окружающей среды. В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов обрабатывают детергентом при температуре приблизительно 4°C, 5°C, 10°C, 15°C, 20°C, 25°C или 30°C. В некоторых вариантах осуществления качество терапевтического полипептидного продукта сохраняется. В некоторых вариантах осуществления вирусные загрязнения эффективно инактивируются экологически безопасным детергентом.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу инактивации вируса в потоке исходных материалов продукта в процессе производства терапевтического полипептида с использованием экологически безопасных детергентов, в котором поток исходных материалов, содержащий экологически безопасный детергент, имеет низкую мутность. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу инактивации вируса в потоке исходных материалов продукта в процессе производства терапевтического полипептида с использованием экологически безопасных детергентов, в котором добавление детергента не влияет на мутность потока исходных материалов; например, по сравнению с производственным процессом без использования детергента или производственным процессом, в котором Triton X-100 используют для инактивации вируса. Методы определения мутности потока исходных материалов известны в данной области; например, с использованием спектрометра HP с кюветой, имеющей длину оптического пути 1 см. Мутность рассчитывают как среднее поглощение при 340-360 нм. В некоторых вариантах осуществления мутность потока исходных материалов не возрастает более чем на приблизительно 5% по сравнению с процессом производства терапевтического полипептида с использованием Triton X-100 или по сравнению с процессом производства терапевтического полипептида без использования детергента. В некоторых вариантах осуществления экологически безопасный детергент приводит к повышению менее чем на приблизительно 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,1% мутности потока исходных материалов по сравнению с производственным процессом без экологически безопасного детергента; например, без использования детергента или с использованием Triton X-100.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу инактивации вируса в потоке исходных материалов продукта в процессе производства терапевтического полипептида с использованием экологически безопасных детергентов, в котором поток исходных материалов представляет собой собранную культуральную жидкость клеток. В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов содержит пул захваченного или пул извлеченного продукта. В некоторых вариантах осуществления пул захваченного или пул извлеченного продукта представляет собой пул после аффинной хроматографии. В некоторых вариантах осуществления пул захваченного или пул извлеченного продукта представляет собой пул после белка A, пул после белка G или пул после белка L. В некоторых вариантах осуществления пул захваченного или пул извлеченного продукта представляет собой пул после хроматографии смешанного типа. В некоторых вариантах осуществления пул захваченного продукта представляет собой пул после CaptoAdhere.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу инактивации вируса в потоке исходных материалов продукта в процессе производства терапевтического полипептида с использованием экологически чистых детергентов, в котором поток исходных материалов фильтруют после добавления экологически безопасного детергента. В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов фильтруют через период времени от по меньшей мере приблизительно 15 минут до по меньшей мере приблизительно 48 часов после добавления детергента. В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов фильтруют через период времени от по меньшей мере приблизительно 1 часа до по меньшей мере приблизительно 3 часов после добавления детергента. В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов фильтруют через приблизительно 1 час после добавления детергента. В некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов фильтруют через по меньшей мере приблизительно 15 минут, 30 минут, 45 минут, 1 час, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 6 часов, 12 часов, 18 часов, 20 часов, 24 часа, 30 часов, 36 часов, 42 часа или 48 часов после добавления детергента. В некоторых вариантах осуществления фильтр представляет собой ультрафильтр или глубинный фильтр.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу инактивации вируса в потоке исходных материалов продукта в процессе производства терапевтического полипептида с использованием экологически безопасных детергентов, в котором поток исходных материалов подвергают хроматографии после добавления детергента. В некоторых вариантах осуществления хроматография представляет собой одну или более из аффинной хроматографии, ионообменной хроматографии (например, катионообменной и/или анионообменной), хроматографии гидрофобного взаимодействия, хроматографии на гидроксиапатите или хроматографии смешанного типа. Примеры материалов для аффинной хроматографии включают, но не ограничиваются ими, материалы для хроматографии, дериватизированные белком A или белком G. Примеры материала для аффинной хроматографии включают, но не ограничиваются ими, Prosep-VA, Prosep-VA Ultra Plus, Protein A sepharose fast flow, Tyopearl Protein A, MAbSelect, MAbSelect SuRe и MAbSelect SuRe LX. В некоторых вариантах осуществления вышеперечисленного материал для аффинной хроматографии представляет собой колонку для аффинной хроматографии. В некоторых вариантах осуществления вышеперечисленного материал для аффинной хроматографии представляет собой мембрану для аффинной хроматографии. Примеры материалов для анионообменной хроматографии включают, но не ограничиваются ими, Poros HQ 50, Poros PI 50, Poros D, Mustang Q, Q Sepharose FF и DEAE Sepharose. Примеры материалов для катионообменной хроматографии включают, но не ограничиваются ими, Mustang S, Sartobind S, SO3 Monolith, S Ceramic HyperD, Poros XS, Poros HS50, Poros HS20, SPSFF, SP-Sepharose XL (SPXL), CM Sepharose Fast Flow, Capto S, Fractogel Se HiCap, Fractogel SO3 или Fractogel COO. Примеры материалов для хроматографии гидрофобного взаимодействия (ХГВ) включают, но не ограничиваются ими, Toyopearl hexyl 650, Toyopear butyl 650, Toyopearl phenyl 650, Toyopearl ether 650, Source, Resource, Sepharose Hi-Trap, Octyl sepharose, phenyl sepharose. Примеры материала для хроматографии на гидроксиапатите включают, но не ограничиваются ими, HA Ultrogel и CHT hydroxyapatite. Примеры материалов для хроматографии смешанного типа включают, но не ограничиваются ими, Capto Adhere, QMA, MEP Hypercel, HEA Hypercel, PPA Hypercel, Capto MMC.

Экологически безопасные детергенты

Изобретение относится к способам инактивации вируса в потоке исходных материалов продукта в процессе производства терапевтического полипептида с использованием экологически безопасных (экологичных) детергентов. Использование экологически безопасных детергентов не влияет отрицательно на качество терапевтического полипептидного продукта. В некоторых вариантах осуществления детергент представляет собой неионный детергент или цвиттерионный детергент.

В некоторых вариантах осуществления детергент имеет гидрофильно-липофильный баланс (ГЛБ) от приблизительно 12 до приблизительно 15. В некоторых вариантах осуществления ГЛБ составляет от приблизительно 12 до приблизительно 14, от приблизительно 12 до приблизительно 13, от приблизительно 13 до приблизительно 14, от приблизительно 14 до приблизительно 15, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14 или приблизительно 15.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам инактивации вируса в потоке исходных материалов продукта в процессе производства терапевтического полипептида с использованием экологически безопасного детергента в сочетании с пеногасителем. Пеногасители известны в данной области. В некоторых вариантах осуществления пеногаситель представляет собой симетикон.

В некоторых вариантах осуществления изобретения экологически безопасный детергент представляет собой алкилглюкозид. В следующих вариантах осуществления алкилглюкозид представляет собой децилглюкозид. В других вариантах осуществления экологически безопасный детергент представляет собой этоксилат спирта. В других вариантах осуществления экологически безопасный детергент представляет собой алкиловый эфир полиэтиленгликоля.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам инактивации вируса в потоке исходных материалов продукта в процессе производства терапевтического полипептида с использованием экологически безопасных детергентов, в которых экологически безопасный детергент представляет собой Tween 20 (регистрационный номер CAS: CAS 9005-64-5), Tween 80 (регистрационный номер CAS: 9005-65-6), TBP (регистрационный номер CAS: 126-43-8), децилполиглюкозид (регистрационный номер CAS: 68515-73-1), децил-β-D-глюкопиранозид (регистрационный номер CAS: 58846-77-8), н-децил-β-D-глюкопиранозид (регистрационный номер CAS: 59122-55-3), лаурилглюкозид (регистрационный номер CAS: 110615-47-9), н-октил-β-D-глюкопиранозид (регистрационный номер CAS: 29836-26-8), EcoSurf EH-6 (регистрационный номер CAS: 64366-70-7), EcoSurf EH-9 (регистрационный номер CAS: 64366-70-7), EcoSurf SA-7 или EcoSurf SA-9 (регистрационный номер CAS: 68937-66-6, регистрационный номер CAS: 69227-22-1, регистрационный номер CAS: 25322-68-3), Natsurf 265 (регистрационный номер CAS: 27252-75-1), Lubrizol (регистрационный номер CAS: 4292-10-8), APG 325N (регистрационный номер CAS: 132778-08-6), Mackol DG (регистрационный номер CAS: 110615-47-9), Triton CG110 (регистрационный номер CAS: 68515-73-1) или Tomodol 900 (регистрационный номер CAS: 68439-46-3).

Способы определения того, является ли детергент экологически безопасным в условиях производственного процесса по изобретению, известны в данной области. Например, Организацией экономического сотрудничества и развития предоставлено руководство по определению химической безопасности. Это руководство можно найти, например, на вебсайте oecd.org/chemicalsafety/testing/oecdguidelinesforthetestingofchemicals.htm. Примеры из данного руководства приведены ниже.

Тест на возможные нарушения репродуктивной функции Daphnia magna - OECD 211.

Основной задачей данного теста является оценка эффекта химических веществ на репродуктивную функцию Daphnia magna. Для этого молодых самок дафний (животные-родители) в возрасте менее 24 часов на момент начала тестирования подвергают воздействию тестируемого вещества, добавленного в воду, в диапазоне концентраций. Продолжительность теста составляет 21 день. После завершения теста оценивают общее количество произведенного живого потомства. Репродуктивную функцию животных-родителей можно выражать несколькими способами (например, в виде числа живых потомков, произведенных в расчете на одно животное в сутки с первого дня, когда обнаруживают потомство), однако эти данные должны быть приведены в дополнение к общему количеству живого потомства, произведенного до окончания исследования. Вследствие особенности дизайна данного полустатического теста по сравнению с другими руководствами OECD по тестированию репродуктивной функции беспозвоночных животных, можно также подсчитывать количество живых потомков, произведенных каждым отдельным животным-родителем. В отличие от других тестов OECD на оценку репродуктивной функции беспозвоночных животных, это позволяет в случае случайной и/или самопроизвольной гибели животного-родителя в период тестирования исключать из экспериментальных данных произведенное им потомство. Таким образом, если в продублированных экспериментах имеет место смертность подвергнутых воздействию родителей, следует обращать внимание на то, отличается ли смертность концентрационной зависимостью, например, существует ли значительная регрессия ответа в зависимости от концентрации тестируемого вещества с положительным наклоном кривой (для этого можно использовать такой статистический тест, как тест на тренд Кохрана-Армитажа). Если смертность не носит зависимый от концентрации характер, тогда экспериментальные дубли с гибелью родителей следует исключать из анализа результатов теста. Если смертность носит зависимый от концентрации характер, родительскую смертность следует рассматривать как следствие воздействия тестируемого вещества и экспериментальные дубли не следует исключать из анализа. Если животное-родитель погибает во время теста, то есть, случайно от неправильного обращения или несчастного случая, либо непреднамеренно в результате необъяснимого происшествия, не связанного с эффектом тестируемого вещества, или оказывается самцом, тогда экспериментальный дубль исключают из анализа. Токсичный эффект тестируемого вещества на репродуктивную функцию выражают в виде ECx, подгоняя данные под соответствующую модель путем нелинейной регрессии для оценки концентрации, которая вызвала бы x % снижения репродуктивной функции, соответственно, или альтернативно, в виде величины NOEC/LOEC (OECD 2006, Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment Number 54. OECD, Paris). Тестируемые концентрации предпочтительно должны охватывать наименьшую из используемых эффективных концентраций (например, EC₁₀), это означает, что данное значение рассчитывают путем интерполяции, а не экстраполяции.

Тест на ингибирование роста пресноводных водорослей и цианобактерий - OECD 201

Задачей данного теста является определение эффектов вещества на рост пресноводных микроводорослей и/или цианобактерий. Экспоненциально растущие тестируемые организмы подвергают воздействию тестируемого вещества в периодической культуре на протяжении периода времени, как правило, 72 часа. Несмотря на относительно короткую продолжительность теста, можно оценивать эффекты на протяжении жизни нескольких поколений.

Системным ответом является уменьшение роста в ряде культур водорослей (тестируемых единиц), подвергнутых воздействию тестируемого вещества в различных концентрациях. Ответ оценивают как функцию воздействующей концентрации в сравнении со средним ростом дубля, не подвергнутых воздействию контрольных культур. Для полного проявления системного ответа на токсические эффекты (оптимальная чувствительность) культурам позволяют неограниченно экспоненциально расти в условиях достаточного снабжения питательными веществами и непрерывного освещения в течение достаточного периода времени для измерения уменьшения удельной скорости роста.

Рост и ингибирование роста количественно определяют на основании измерений биомассы водорослей с течением времени. Биомассу водорослей определяют как сухую массу на единицу объема, например, мг водорослей/литр тестируемого раствора. Однако сухую массу трудно измерять и, следовательно, используют суррогатные параметры. Из этих суррогатных параметров чаще всего используют количество клеток. Другие суррогатные параметры включают объем клеток, флуоресценцию, оптическую плотность и так далее. Коэффициент пересчета измеренного суррогатного параметра в биомассу должен быть известен.

Тестируемой конечной точкой является ингибирование роста, выражаемое в виде логарифмического увеличения биомассы (средняя удельная скорость роста) на протяжении периода воздействия. На основании средних удельных скоростей роста, определенных в ряде тестируемых растворов, определяют концентрацию, приводящую к определенному x % ингибирования скорости роста (например, 50%) и выражают в виде E_rC_x (например, E_rC₅₀).

Дополнительной переменной ответа, используемой в данном руководстве, является выход, который в некоторых странах должен удовлетворять определенным регуляторным требованиям. Его определяют как биомассу в конце периода воздействия за вычетом биомассы в начале периода воздействия. На основании выхода, определенного в ряде тестируемых растворов, рассчитывают концентрацию, приводящую к определенному x % ингибирования выхода (например, 50%) и выражают в виде EyCx (например, EyC₅₀).

Кроме того, можно статистически определять наименьшую концентрацию для наблюдаемого эффекта (LOEC) и концентрацию без наблюдаемого эффекта (NOEC).

Тест на острую иммобилизацию Daphnia sp. - OECD 202

Молодых дафний в возрасте менее 24 часов на момент начала теста подвергают воздействию тестируемого вещества в диапазоне концентраций в течение периода времени 48 часов. Иммобилизацию определяют через 24 часа и 48 часов и сравнивают с контрольными значениями. Результаты анализируют для расчета EC₅₀ через 48 часов. Определение EC₅₀ через 24 часа является необязательным.

Тест на острую токсичность для рыб - OECD 203

Рыб подвергают воздействию тестируемого вещества, предпочтительно, в течение периода времени 96 часов. Смертность определяют через 24, 48, 72 и 96 часов.

Тест на ингибирование дыхания активного ила (окисление углерода и аммония) - OECD 209

Частоту дыхания образцов активного ила, залитого синтетическими сточными водами, измеряют в закрытой ячейке, содержащей кислородный электрод, после контакта в течение 3 часов. С учетом сценария реальной продолжительности воздействия подходящим может быть более продолжительное время контакта. Если тестируемое вещество быстро деградирует, например, абиотически путем гидролиза, или является летучим и концентрацию невозможно поддерживать надлежащим образом, можно дополнительно использовать более короткий период воздействия, например, 30 минут. Чувствительность каждой партии активного ила следует проверять с использованием подходящего эталонного вещества в день эксперимента. Данный тест, как правило, используют для определения EC_x (например, EC₅₀) тестируемого вещества и/или концентрации без наблюдаемого эффекта (NOEC).

Ингибирование поглощения кислорода микроорганизмами, окисляющими органический углерод, можно отличать от ингибирования поглощения кислорода микроорганизмами, окисляющими аммоний, путем измерения скорости поглощения кислорода в отсутствие и в присутствии N-аллилтиомочевины, специфического ингибитора окисления аммония до нитрита бактериями первой фазы нитрификации. В этом случае процент ингибирования скорости поглощения кислорода рассчитывают путем сравнения скорости поглощения кислорода в присутствии тестируемого вещества со средней скоростью поглощения кислорода соответствующих контролей, не содержащих тестируемого вещества, как в присутствии, так и в отсутствие специфического ингибитора, N-аллилтиомочевины.

Любое поглощение кислорода, возникающее вследствие абиотических процессов, можно обнаруживать путем определения скорости в смесях тестируемого вещества, синтетической среды сточных вод и воды без активного ила.

Полная биоразлагаемость - OECD 301

Раствор или суспензию тестируемого вещества в минеральной среде инокулируют и инкубируют в аэробных условиях в темноте или при рассеянном освещении. Количество растворенного органического углерода (DOC) в тестируемом растворе за счет инокулята следует сохранять насколько возможно низким по сравнению с количеством органического углерода за счет тестируемого вещества. Делают поправку на эндогенную активность инокулята путем параллельного анализа холостых проб с инокулятом но без тестируемого вещества, хотя эндогенная активность клеток в присутствии химического вещества не будет точно соответствовать активности в эндогенном контроле. Параллельно тестируют эталонное соединение для проверки работы системы.

Как правило, после деградации определяют такие параметры, как DOC, продуцирование CO₂ и поглощение кислорода, и проводят измерения через достаточно короткие интервалы времени, чтобы суметь определить начало и окончание биодеградации. При использовании автоматических респирометров измерение производится непрерывно. DOC иногда измеряют в дополнение к другому параметру, однако, как правило, это выполняют только в начале и в конце теста. Также можно использовать определенный химический анализ для оценки первичной деградации тестируемого вещества и для определения концентрации любых образующихся промежуточных соединений.

Как правило, тест проводят в течение 28 дней. Однако тесты можно завершать до истечения 28 дней, то есть, как только кривая биодеградации достигнет плато при по меньшей мере трех определениях. Тесты также можно продолжать и после 28 дней, если кривая показывает, что биодеградация началась, но плато не было достигнуто ко дню 28, однако в таких случаях химическое вещество нельзя классифицировать как полностью биоразлагаемое.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам инактивации вируса в потоке исходных материалов продукта в процессе производства терапевтического полипептида с использованием экологически безопасных детергентов, при этом детергент не содержит или не образует пероксид. Методы определения содержания пероксида в детергенте известны в данной области. Например, можно использовать колориметрический тест на пероксид EMD Millipore для определения уровня пероксида в детергенте. В некоторых вариантах осуществления изобретения детергент не содержит пероксид, если уровень пероксида в детергенте составляет менее чем приблизительно 0,5 промилле, 0,4 промилле, 0,3 промилле, 0,2 промилле или 0,1 промилле.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам инактивации вируса в потоке исходных материалов продукта в процессе производства терапевтического полипептида с использованием экологически безопасных детергентов, при этом детергент не содержит или не образует октилфенол. Октилфенол может быть продуктом деградации Triton X-100. В некоторых вариантах осуществления изобретения поток исходных материалов, который будет слит в систему для приема сточных вод, содержит октилфенол в концентрации менее чем приблизительно 0,1 мкг/л, 0,09 мкг/л, 0,08 мкг/л, 0,07 мкг/л, 0,06 мкг/л, 0,05 мкг/л, 0,04 мкг/л, 0,03 мкг/л, 0,02 мкг/л и 0,01 мкг/л. Специалист в данной области понимает, что влияние на окружающую среду детергента в системе сточных вод может различаться, если сточные воды сбрасываются в пресную воду или в морскую воду. Например, в некоторых вариантах осуществления поток исходных материалов, который будет слит в систему для приема сточных вод, содержит октилфенол в концентрации менее чем приблизительно 0,1 мкг/л для сброса в пресную воду и менее чем приблизительно 0,01 мкг/л для сброса в морскую воду.

В некоторых вариантах осуществления изобретения прогнозируемая концентрация в окружающей среде (PEC) детергента в потоке отходов после процесса производства терапевтического полипептида представляет собой прогнозируемую концентрацию детергента в отходах производства, сбрасываемых в приемный водоем в окружающей среде. В некоторых вариантах осуществления изобретения прогнозируемая безопасная концентрация (PNEC) представляет собой прогнозируемую концентрацию детергента в отходах производства, которая безопасна при сбросе в окружающую среду и не оказывает вредного воздействия, например, на биоту принимающей пресной воды и/или морской воды. В некоторых вариантах осуществления изобретения PEC составляет менее чем PNEC. В некоторых вариантах осуществления изобретения PEC превышает PNEC приблизительно в 0,5 раза, 1 раз, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз, 20 раз, 30 раз, 40 раз, 50 раз или 100 раз.

В некоторых вариантах осуществления изобретения экологически безопасный детергент содержит сурфактант и один или более дополнительных компонентов. В некоторых вариантах осуществления детергент содержит сурфактант и один или более хелатообразующих агентов и/или консервантов. В некоторых вариантах осуществления хелатообразующий агент представляет собой этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА).

Инактивация вируса

Изобретение относится к способам инактивации вируса в потоке исходных материалов продукта, включающим обработку потока исходных материалов экологически безопасным детергентом. Вирус может быть любым вирусом, описанным в настоящем документе (например, оболочечным вирусом), и поток исходных материалов может быть любым потоком исходных материалов, описанным в настоящем документе, таким как собранная культуральная жидкость клеток (HCCF), пул захваченного или пул извлеченного продукта. Вирус, инактивируемый в потоке исходных материалов, может быть любым вирусом, который актуален в промышленном масштабе при производстве продуктов (например, полипептидов, клеток, тканей). Актуальные в промышленном масштабе вирусы известны специалистам в данной области. Неограничивающие примеры актуальных в промышленном масштабе вирусов включают ретровирус, герпесвирус, флавивирус, поксвирус, гепаднавирус, вирус гепатита, ортомиксовирус, парамиксовирус, рабдовирус или тогавирус. В любом варианте осуществления изобретения вирус выбирают из группы, состоящей из аденовируса, вируса африканской чумы свиней, аренавируса, артеривируса, астровируса, бакуловируса, баднавируса, барнавируса, бирнавируса, бромвируса, буньявируса, калицивируса, капилловируса, карлавируса, каулимовируса, цирковируса, клостеровируса, комовируса, коронавируса, котриковируса, цистовируса, дельтавируса, диантовируса, энамовируса, филовируса, флавивируса, фуровируса, фуселловируса, геминивируса, гепаднавируса, герпесвируса, гордеивируса, гиповируса, идеавируса, иновируса, иридовируса, левивируса, липотриксвируса, лютеовируса, макломовируса, марафивовируса, микровируса, миовируса, некровируса, нодавируса, ортомиксовируса, паповавируса, парамиксовируса, партитивируса, парвовируса, фикоднавируса, пикорнавируса, пламавируса, подовируса, полиднавируса, потексвируса, потивируса, поксвируса, реовируса, ретровируса, рабдовируса, ризидиовируса, секвевируса, сифовируса, собемовируса, тективируса, тенуивируса, тетравируса, тобамовируса, тобравируса, тогавируса, томбусвируса, тотивируса, триховируса, тумовируса и умбравируса. В одном из вариантов осуществления изобретение относится к способам инактивации субвирусного агента в потоке исходных материалов, включающим обработку потока исходных материалов экологически безопасным детергентом. В некоторых аспектах субвирусный агент представляет собой вироид или сателлит. В другом варианте осуществления изобретение относится к способам инактивации вирусоподобного агента в потоке исходных материалов, включающим обработку потока исходных материалов экологически безопасным детергентом.

Инактивацию вируса в потоке исходных материалов можно количественно определять методами, известными в данной области. В некоторых вариантах осуществления изобретения инактивацию вируса выражают в виде логарифмического показателя снижения концентрации вируса (LRV). LRV рассчитывают следующим образом:

LRV=log₁₀ × (общая концентрация вируса в потоке исходных материалов после обработки детергентом/общая концентрация вируса в потоке исходных материалов до обработки детергентом).

В некоторых вариантах осуществления изобретения LRV для экологически безопасного детергента в потоке исходных материалов превышает приблизительно 1. В некоторых вариантах осуществления изобретения LRV для экологически безопасного детергента в потоке исходных материалов превышает приблизительно 4. В некоторых вариантах осуществления изобретения LRV для экологически безопасного детергента в потоке исходных материалов превышает приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6. В некоторых вариантах осуществления изобретения LRV для экологически безопасного детергента в потоке исходных материалов составляет приблизительно 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 2-3, 2-4, 2-5, 3-4, 3-5, 3-6, 4-5, 4-6 или 5-6.

Методы измерения активности вируса известны в данной области. Примеры включают, но не ограничиваются ими, анализы TCID₅₀ (то есть, определение средней инфекционной дозы в тканевой культуре, которая производит патологические изменения в 50% инокулированных клеточных культур) и анализы бляшкообразования. Другие известные методы могут включать, например, анализ трансформации, который можно использовать для определения титров биологической активности не образующих бляшки вирусов, обладающих способностью вызывать трансформацию клеточного роста; или флуоресцентный анализ образования фокусов, основанный на использовании методов окрашивания с помощью антител для обнаружения вирусных антигенов в монослое инфицированных клеток; или анализ титрования в конечной точке, который можно использовать для определения титров многих вирусов, включая вирусы, которые не инфицируют клетки в монослое (в качестве альтернативы анализу бляшкообразования); или анализы вирусных ферментов, в которых определяют кодируемые вирусами ферменты, такие как обратные транскриптазы или вирусные протеазы.

Полипептиды по изобретению

Полипептиды, получаемые с использованием производственных процессов и способов, описанных в настоящем документе, и присутствующие в композициях, предложенных по настоящему изобретению, могут быть гомологичными для клетки-хозяина, используемой для получения полипептида, или, предпочтительно, могут быть экзогенными, это означает, что они являются гетерологичными, то есть, чужеродными для используемой клетки-хозяина, например, человеческий белок, продуцируемый клеткой яичника китайского хомячка, или дрожжевой полипептид, продуцируемый клеткой млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления линия клеток млекопитающего представляет собой клетки яичника китайского хомячка (CHO) или клетки почки новорожденного хомячка (BHK), клетки мышиной гибридомы или клетки мышиной миеломы. В одном варианте осуществления полипептид представляет собой полипептид млекопитающего (такой как антитело), непосредственно секретируемый в среду клеткой-хозяином. В другом варианте осуществления полипептид высвобождается в среду в результате лизиса клеток, содержащих выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид.

Любой полипептид, который может экспрессироваться в клетке-хозяине, может быть получен в соответствии с настоящим изобретением и может присутствовать в описанных композициях. Полипептид может экспрессироваться с гена, который является эндогенным для клетки-хозяина, или с гена, который введен в клетку-хозяина методами генетической инженерии. Полипептид может быть полипептидом, существующим в природе, или, альтернативно, может иметь последовательность, которая была сконструирована или отобрана рукой человека. Сконструированный полипептид может быть собран из сегментов другого полипептида, которые отдельно существуют в природе, или может содержать один или более сегментов, не существующих в природе.

Полипептиды, которые может быть желательно экспрессировать в соответствии с настоящим изобретением, часто будут выбраны на основании интересующей биологической или химической активности. Например, настоящее изобретение можно использовать для экспрессии интересующего с фармацевтической или коммерческой точки зрения фермента, рецептора, антитела, гормона, регуляторного фактора, антигена, связующего вещества, цитокина, Fc-слитого полипептида, антигена, иммуноадгезина и так далее.

Различные полипептиды могут быть получены способами, предложенными в настоящем документе, и присутствовать в композициях, предложенных в настоящем документе. Примеры бактериальных полипептидов включают, например, щелочную фосфатазу и β-лактамазу. Примеры полипептидов млекопитающих включают такие молекулы, как ренин, гормон роста, в том числе человеческий гормон роста, бычий гормон роста; рилизинг-фактор гормона роста; паратиреоидный гормон; тиреоид-стимулирующий гормон; липопротеины; альфа-1-антитрипсин; A-цепь инсулина; B-цепь инсулина; проинсулин; фолликулостимулирующий гормон; кальцитонин; лютеинизирующий гормон; глюкагон; факторы свертывания крови, такие как фактор VIIIC, фактор IX, тканевой фактор, и фактор фон Виллебранда; антикоагулирующие факторы, такие как белок C; предсердный натрийуретический фактор; легочный сурфактант; активатор плазминогена, такой как урокиназный или человеческий мочевой или тканевой активатор плазминогена (t-PA); бомбезин; тромбин; гемопоэтический фактор роста; фактор некроза опухолей-альфа и -бета; энкефалинaза; RANTES (экспрессируемый и секретируемый нормальными T-клетками при активации); человеческий макрофагальный воспалительный белок (MIP-1-альфа); сывороточный альбумин, такой как человеческий сывороточный альбумин; ингибирующее вещество Мюллера; A-цепь релаксина; B-цепь релаксина; прорелаксин; мышиный гонадотропин-ассоциированный пептид; микробный белок, такой как бета-лактамаза; ДНКаза; ингибин; активин; фактор роста эндотелия сосудов (VEGF); рецепторы для гормонов или факторов роста; интегрин; белок A или D; ревматоидные факторы; нейротрофический фактор, такой как нейротрофический фактор мозга (BDNF), нейтрофин-3, -4, -5 или -6 (NT-3, NT-4, NT-5 или NT-6), или фактор роста нервов, такой как NGF-бета; фактор роста тромбоцитов (PDGF); фактор роста фибробластов, такой как aFGF и bFGF; эпидермальный фактор роста (EGF); трансформирующий фактор роста (TGF), такой как TGF-альфа и TGF-бета, включая TGF-бета 1, TGF-бета 2, TGF-бета 3, TGF-бета 4 или TGF-бета 5; инсулиноподобный фактор роста-I и -II (IGF-I и IGF-II); дез(1-3)-IGF-I (IGF-I мозга), белки, связывающие инсулиноподобный фактор роста; CD белки, такие как CD-3, CD-4, CD-8 и CD-19; эритропоэтин; остеоиндуктивные факторы; иммунотоксины; костный морфогенетический белок (BMP); интерферон, такой как интерферон-альфа, -бета и -гамма; колониестимулирующие факторы (CSF), например, M-CSF, GM-CSF и G-CSF; интерлейкины (IL), например, IL-1 - IL-10; супероксиддисмутаза; T-клеточные рецепторы; поверхностные мембранные белки; фактор, ускоряющий распад; вирусный антиген, такой как, например, часть оболочки вируса СПИДа; транспортные белки; «хоминг»-рецепторы; направляющие; регуляторные белки; антитела; а также фрагменты любых из вышеперечисленных полипептидов.

Исходные материалы будут содержать по меньшей мере один белок, который в одном варианте осуществления представляет собой антитело. Основная единица 4-цепочечного антитела представляет собой гетеротетрамерный гликопротеин, состоящий из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (H) цепей (IgM антитело состоит из 5 основных гетеротетрамерных единиц наряду с дополнительным полипептидом, называемым J-цепью, и таким образом, содержит 10 антигенсвязывающих сайтов, в то время как секретируемые IgA антитела способны к полимеризации, с образованием поливалентных комплексов, содержащих 2-5 основных 4-цепочечных единиц вместе с J-цепью). В случае IgG 4-цепочечная единица, как правило, имеет массу приблизительно 150000 дальтон. Каждая L-цепь связана с H-цепью одной ковалентной дисульфидной связью, в то время как H-цепи связаны друг с другом одной или более дисульфидными связями в зависимости от изотипа H-цепи. Каждая H и L-цепь также содержит через регулярные промежутки внутрицепочечные дисульфидные мосты. Каждая H-цепь имеет на N-конце вариабельный домен (VH), за которым следуют три константных домена (CH) для каждой из α и γ-цепей и четыре CH домена для μ и ε изотипов. Каждая L-цепь имеет на N-конце вариабельный домен (VL), за которым следует константный домен (CL) на другом конце. VL совпадает с VH, и CL совпадает с первым константным доменом тяжелой цепи (CH1). Считают, что конкретные аминокислотные остатки образуют поверхность раздела между вариабельными доменами легкой цепи и тяжелой цепи. Спаренные VH и VL вместе образуют один антигенсвязывающий сайт. Для получения информации о структуре и свойствах различных классов антител см., например, сборник Basic and Clinical Immunology, 8е издание, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, страницу 71 и главу 6.

L-цепь у любого биологического вида позвоночных можно отнести к одному из двух четко различающихся типов, называемых каппа и лямбда, на основании аминокислотных последовательностей их константных доменов. На основании аминокислотных последовательностей константного домена их тяжелых цепей (CH) иммуноглобулины можно отнести к разным классам или изотипам. Существует пять классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, имеющих тяжелые цепи, обозначенные α, δ, ε, γ и μ, соответственно. Классы γ и α дополнительно подразделяют на подклассы на основании относительно незначительных различий в последовательности и функции CH, например, у человека экспрессируются следующие подклассы: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2.

При расщеплении антител папаином получают два идентичных антигенсвязывающих фрагмента, называемых «Fab»-фрагментами, и остальной «Fc»-фрагмент, обозначение, отражающее его способность легко кристаллизоваться. Fab-фрагмент состоит из полной L-цепи с доменом вариабельной области H-цепи (VH) и первым константным доменом одной тяжелой цепи (CH1). Каждый Fab-фрагмент является одновалентным в отношении связывания антигена, то есть, он имеет один антигенсвязывающий сайт. При обработке антитела пепсином получают один большой F(ab’)₂-фрагмент, приблизительно соответствующий двум связанным дисульфидными связями Fab-фрагментам, который имеет двухвалентную антигенсвязывающую активность и все-еще способен перекрестно связывать антиген. Fab’-фрагменты отличаются от Fab-фрагментов наличием дополнительных нескольких остатков на карбоксильном конце домена CH1, включая один или более остатков цистеина из шарнирной области антитела. В настоящем документе Fab’-SH является обозначением для Fab’, в котором остаток(ки) цистеина константных доменов имеют свободную тиоловую группу. F(ab’)₂-фрагменты антител исходно были получены в виде пар Fab’-фрагментов, имеющих остатки цистеина между ними. Также известны и другие варианты химического спаривания фрагментов антител.

Fc-фрагмент содержит карбокси-концевые части обеих H-цепей, удерживаемые вместе дисульфидными связями. Эффекторные функции антител определяются последовательностями в Fc-области, которая также является частью, узнаваемой Fc-рецепторами (FcR), расположенными на некоторых видах клеток.

«Fv» представляет собой минимальный фрагмент антитела, который содержит полный узнающий и связывающий антиген сайт. Этот фрагмент состоит из димера домена вариабельной области одной тяжелой и одной легкой цепи в тесной нековалентной ассоциации. В результате сворачивания этих двух доменов возникают шесть гипервариабельных петель (по 3 петли от каждой из H и L-цепи), которые предоставляют аминокислотные остатки для связывания антигена и придают антигенсвязывающую специфичность антителу. Однако даже один вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три CDR, специфичные для антигена) обладает способностью узнавать и связывать антиген, хотя и с более низкой аффинностью, чем целый связывающий сайт.

«Одноцепочечные Fv», также сокращенно обозначаемые «sFv» или «scFv», представляют собой фрагменты антитела, содержащие домены VH и VL антитела, соединенные в одной полипептидной цепи. Предпочтительно, полипептид sFv дополнительно содержит полипептидный линкер между доменами VH и VL, который позволяет sFv образовывать структуру, необходимую для связывания антигена. Для получения информации о sFv, см. Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); Antibody Engineering, 2е издание (C. Borrebaeck, ed., Oxford University Press, 1995.

Термин «диатела» относится к небольшим фрагментам антител, полученным за счет конструирования sFv фрагментов (см. предшествующий параграф) с короткими линкерами (приблизительно 5-10 остатков) между доменами VH и VL так, что достигается межцепочечное, но не внутрицепочечное спаривание V-доменов, с образованием двухвалентного фрагмента, то есть, фрагмента, имеющего два антигенсвязывающих сайта. Биспецифические диатела представляют собой гетеродимеры из двух «кроссоверных» sFv фрагментов, в которых домены VH и VL двух антител присутствуют на разных полипептидных цепях. Диатела описаны более подробно, например, в EP 404097; WO 93/11161 и Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993).

«Гуманизированные» формы не принадлежащих человеку антител (например, антител грызунов) представляют собой химерные антитела, содержащие минимальную последовательность, происходящую из антитела, отличного от человеческого. В основном, гуманизированные антитела представляют собой человеческие иммуноглобулины (реципиентное антитело), в которых остатки из гипервариабельной области реципиента заменены остатками из гипервариабельной области видов, отличных от человека (донорское антитело), таких как мышь, крыса, кролик или приматы, кроме человека, имеющими нужную специфичность, аффинность и функциональную возможность антитела. В некоторых случаях остатки каркасной области (FR) человеческого иммуноглобулина заменены соответствующими остатками, не принадлежащими человеку. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые отсутствуют в реципиентном антителе или в донорском антителе. Такие модификации выполняют для еще большего повышения эффективности антитела. Как правило, гуманизированное антитело содержит практически все из по меньшей мере одного, и как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или практически все из гипервариабельных петель соответствуют петлям иммуноглобулина, отличного от человеческого, и все или практически все из FR происходят из последовательности человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело, необязательно, также содержит по меньшей мере часть константной области (Fc) иммуноглобулина, как правило, константной области человеческого иммуноглобулина. Для получения более подробной информации см. публикации Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988) и Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992), Abs и так далее.

Способы получения полипептидов

Клетки

Для предложенных способов и композиций можно использовать любые клетки, которые подходят для выращивания и/или продуцирования полипептида (например, антитела) в среде, описанной в настоящем документе, включая клетки животных, дрожжей или насекомых. В одном аспекте клетка для способов и композиций представляет собой любую клетку или тип клеток млекопитающего, которые подходят для культивирования и для экспрессии полипептидов. Таким образом, для приведенных в настоящем документе способов (например, способов инактивации вируса в культуральной среде клеток) и композиций можно использовать клетку любого подходящего типа, включая животную клетку. В одном аспекте для способов и композиций используют клетку млекопитающего. Для способов и композиций также можно использовать клетки гибридомы. В одном варианте осуществления клетка млекопитающего представляет собой не гибридомную клетку млекопитающего, которая была трансформирована экзогенной выделенной нуклеиновой кислотой, кодирующей нужный полипептид, такой как антитело, фрагмент антитела (включая лиганд-связывающий фрагмент) и химерные антитела. В одном варианте осуществления для способов и композиций используют клетки млекопитающих, выбранные из группы, состоящей из человеческих ретинобластов (PER.C6 (CruCell, Leiden, The Netherlands)); линии клеток CV1 почки обезьяны, трансформированных SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); линии клеток эмбриональной почки человека (клетки 293 или 293, субклонированные для роста в суспензионной культуре, Graham et al., J. Gen Virol., 36: 59 (1977)); клеток почки новорожденного хомячка (BHK, ATCC CCL 10); клеток яичника китайского хомячка/-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980)); мышиных клеток Сертоли (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251 (1980)); клеток почки обезьяны (CV1 ATCC CCL 70); клеток почки африканской зеленой мартышки (VERO-76, ATCC CRL-1 587); человеческих клеток цервикальной карциномы (HeLa, ATCC CCL 2); клеток почки собаки (MDCK, ATCC CCL 34); клеток печени крысы линии Buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); человеческих клеток легкого (W138, ATCC CCL 75); человеческих клеток печени (Hep G2, HB 8065); клеток опухоли молочной железы мышей (MMT 060562, ATCC CCL51); клеток TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383: 44-68 (1982)); клеток MRC 5; клеток FS4 и клеток линии гепатомы человека (Hep G2). В конкретном варианте осуществления для способов и композиций используют клетки CHO. В конкретном варианте осуществления используют культивирование линии клеток CHO и экспрессию полипептидов (например, антител) в клетках линии CHO. Полипептиды (например, антитела) могут секретироваться в среду, описанную в настоящем документе, из которой полипептиды могут быть выделены и/или очищены, или полипептид может высвобождаться в среду, описанную в настоящем документе, в результате лизиса клетки, содержащей выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид.

Способы, векторы и клетки-хозяева, подходящие для синтеза интересующего полипептида в культуре рекомбинантных клеток позвоночных, известны в данной области и описаны, например, в публикациях Gething et al., Nature, 293: 620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281: 40-46 (1979); Levinson et al.; EP 117060 и EP 117058. Особенно полезной плазмидой для экспрессии полипептида в культуре клеток млекопитающих является pRK5 (EP публикация № 307247) или pSVI6B (PCT публикация № WO 91/08291, опубликованная 13 июня 1991 г.).

Клетки-хозяева трансформируют экспрессионными или клонирующими векторами и культивируют в питательных средах, модифицированных соответствующим образом для индукции промоторов, отбора трансформантов или амплификации генов, кодирующих нужные последовательности. Для клеток млекопитающих предпочтительным является метод осаждения фосфатом кальция, описанный в публикации Graham and van der Erb, Virology, 52: 456-457 (1978), или метод с использованием липофектамина™ (Gibco BRL) Hawley-Nelson, Focus 15: 73 (1193). Общие аспекты трансформации системы клеток-хозяев млекопитающих известны в данной области и описаны, например, Axel в патенте США № 4399216, выпущенном 16 августа 1983 г. Для получения информации о различных методах трансформации клеток млекопитающих см., например, Keown et al., Methods in Enzymology (1989), Keown et al., Methods in Enzymology, 185: 527-537 (1990) и Mansour et al., Nature, 336: 348-352 (1988).

Для способов и композиций также предусмотрено использование гибридом, секретирующих моноклональные антитела в культуре клеток. Моноклональные антитела получают путем извлечения иммунных клеток (как правило, клеток селезенки или лимфоцитов из ткани лимфатических узлов) иммунизированных животных и иммортализации клеток общепринятым способом, например, путем слияния с клетками миеломы или путем опосредованной вирусом Эпштейна-Барр (EB) трансформации, и скрининга на клоны, экспрессирующие нужное антитело. Метод гибридом, впервые описанный в публикации Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol., 6: 511 (1976), и также описанный в публикации Hammerling et al., In: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y., pp. 563-681 (1981), широко применяется для получения гибридных линий клеток, секретирующих на высоком уровне моноклональные антитела против многих конкретных антигенов.

Полипептиды

Полипептиды, продуцируемые с использованием композиций (например, в клетках) и способов, подробно описанных в настоящем документе, и присутствующие в композициях, описанных в настоящем документе, могут быть гомологичными для клетки-хозяина, или предпочтительно, могут быть экзогенными, это означает, что они являются гетерологичными, то есть, чужеродными для используемой клетки-хозяина, например, человеческий белок, продуцируемый клеткой яичника китайского хомячка, или дрожжевой полипептид, продуцируемый клеткой млекопитающего. В одном варианте осуществления полипептид представляет собой полипептид млекопитающего (например, антитело), непосредственно секретируемый в среду клеткой-хозяином. В другом варианте осуществления полипептид высвобождается в среду в результате лизиса клетки, содержащей выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид.

В одном варианте осуществления полипептид представляет собой последовательность аминокислот, длина цепи которой достаточна для образования на высоком уровне третичных и/или четвертичных структур. В одном аспекте полипептид будет иметь молекулярную массу по меньшей мере приблизительно 5-20 кДа, альтернативно, по меньшей мере приблизительно 15-20 кДа, предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 20 кДа.

Любой полипептид, который может экспрессироваться в клетке-хозяине, может быть получен в соответствии с настоящим изобретением и может присутствовать в описанных композициях. Полипептид может экспрессироваться с гена, который является эндогенным для клетки-хозяина, или с гена, который введен в клетку-хозяина методами генетической инженерии. Полипептид может быть полипептидом, существующим в природе, или, альтернативно, может иметь последовательность, которая была сконструирована или отобрана рукой человека. Сконструированный полипептид может быть собран из сегментов другого полипептида, которые отдельно существуют в природе, или может содержать один или более сегментов, не существующих в природе.

Полипептиды, которые может быть желательно экспрессировать в соответствии с настоящим изобретением, часто будут выбраны на основании интересующей биологической или химической активности. Примеры полипептидов по изобретению приведены выше.

Например, настоящее изобретение можно использовать для экспрессии интересующего с фармацевтической или коммерческой точки зрения фермента, рецептора, антитела, гормона, регуляторного фактора, антигена, связующего вещества и так далее.

Рост клеток и продуцирование полипептида

Как правило, клетки объединяют (приводят в контакт) с любой из сред для культивирования клеток, описанных в настоящем документе, при наличии одного или более условий, стимулирующих рост, поддержание клеток и/или продуцирование полипептида. В способах выращивания клеток и продуцирования полипептида используют емкость для культивирования (биореактор), содержащий клетки и среду для культивирования клеток. Емкость для культивирования может быть из любого материала, подходящего для культивирования клеток, включая стекло, пластмассу или металл. Как правило, емкость для культивирования будет иметь объем по меньшей мере 1 литр и может иметь объем 10, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 8000, 10000 литров или более. Условия культивирования, которые могут быть скорректированы в процессе культивирования, включают, но не ограничиваются ими, pH и температуру.

Клеточную культуру, как правило, поддерживают в начальной фазе роста в условиях, способствующих выживанию, росту и жизнеспособности (поддержанию) клеточной культуры. Точные условия будут варьироваться в зависимости от типа клеток, организма, из которого клетки были получены, а также природы и характера экспрессируемого полипептида.

Температуру клеточной культуры в начальной фазе роста выбирают, главным образом, на основании диапазона температур, при которых клеточная культура остается жизнеспособной. Например, во время начальной фазы роста клетки CHO хорошо растут при температуре 37°C. Как правило, большинство клеток млекопитающих хорошо растут в диапазоне температур от 25°C до 42°C. Предпочтительно, клетки млекопитающих хорошо растут в диапазоне температур приблизительно от 35°C до 40°C. Специалисты в данной области могут выбирать подходящую температуру или температуры, при которых следует выращивать клетки, в зависимости от потребности клеток и производственных требований.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения температуру в начальной фазе роста поддерживают на уровне одной постоянной температуры. В другом варианте осуществления температуру в начальной фазе роста поддерживают в пределах диапазона температур. Например, температуру можно постоянно повышать или понижать в процессе начальной фазы роста. Альтернативно, температуру можно повышать или понижать на дискретные значения в разные моменты времени на протяжении начальной фазы роста. Специалист в данной области может определить, следует ли использовать одну или разные температуры, а также следует ли корректировать температуру постоянно или на дискретные значения.

Клетки можно выращивать в начальной фазе роста в течение большего или меньшего количества времени. В одном варианте осуществления клетки выращивают в течение периода времени, достаточного для достижения плотности жизнеспособных клеток, которая составляет определенный процент от максимальной плотности жизнеспособных клеток, которую клетки в конечном итоге достигли бы при непотревоженном росте. Например, клетки можно выращивать в течение периода времени, достаточного для достижения нужной плотности жизнеспособных клеток, составляющей 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99 процентов от максимальной плотности жизнеспособных клеток.

В другом варианте осуществления клеткам позволяют расти в течение определенного периода времени. Например, в зависимости от исходной концентрации клеточной культуры, температуры, при которой клетки выращивают, и присущей клеткам скорости роста клетки можно выращивать в течение 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более дней. В некоторых случаях клеткам можно позволять расти в течение месяца или более.

Культуру клеток можно перемешивать или встряхивать в течение начальной фазы культивирования для увеличения снабжения кислородом и равномерного обеспечения питательными веществами клеток. В соответствии с настоящим изобретением специалист в данной области понимает, что может быть полезно контролировать или регулировать некоторые внутренние условия в биореакторе в течение начальной фазы роста, включая, но без ограничения, pH, температуру, снабжение кислородом и так далее. Например, pH можно контролировать, добавляя соответствующее количество кислоты или основания, и снабжение кислородом можно контролировать с помощью барботирующих устройств, хорошо известных в данной области.

Начальный этап культивирования представляет собой фазу роста, в которой условия культивирования периодической клеточной культуры модифицируют для усиления роста рекомбинантных клеток, чтобы получить систему посевных ферментеров. Фаза роста, как правило, означает период экспоненциального роста, когда клетки обычно быстро делятся, например, растут. Во время этой фазы клетки культивируют в течение периода времени, как правило, от 1 до 4 дней, например, 1, 2, 3 или 4 дня, и в таких условиях, что рост клеток является оптимальным. Ростовой цикл клетки-хозяина можно определять для конкретной клетки-хозяина методами, известными специалистам в данной области.

В фазе роста базовую культуральную среду и клетки можно вносить в емкость для культивирования периодически. В одном аспекте культуральная среда содержит менее приблизительно 5% или менее 1% или менее 0,1% сыворотки и других животных белков. Однако сыворотку и животные белки можно использовать при необходимости. В конкретном варианте осуществления базовая среда имеет значение pH от приблизительно pH 5,0 до приблизительно pH 6,9 во время обработки HTST для инактивации вируса. В одном аспекте pH базовой среды снижают до значения от приблизительно pH 5,0 до приблизительно pH 6,9 во время обработки HTST для инактивации вируса до фазы продуцирования полипептида в клеточной культуре. В следующем аспекте pH среды затем доводят до значения от приблизительно pH 6,9 до приблизительно pH 7,2 для фазы продуцирования полипептида в клеточной культуре. В следующем аспекте pH среды затем доводят до значения от приблизительно pH 6,9 до приблизительно pH 7,2 после обработки HTST для фазы продуцирования полипептида в клеточной культуре. В другом конкретном варианте осуществления в базовой среде ограничено содержание общего количества фосфата и кальция до менее чем приблизительно 10 мМ во время обработки HTST для инактивации вируса. В одном аспекте общее количество фосфата и кальция в среде ограничено до менее чем приблизительно 10 мМ во время обработки HTST для инактивации вируса до фазы продуцирования полипептида в клеточной культуре. В следующем аспекте общее количество фосфата и кальция в среде затем поднимают до уровня, достаточного для продуцирования полипептида во время фазы продуцирования полипептида в клеточной культуре. В другом варианте осуществления базовая среда имеет значение pH от приблизительно pH 5,0 до приблизительно pH 6,9 и общее количество фосфата и кальция менее приблизительно 10 мМ во время обработки HTST для инактивации вируса. В одном аспекте pH базовой среды снижают до значения от приблизительно pH 5,0 до приблизительно pH 6,9, и общее количество содержащихся фосфата и кальция составляет менее приблизительно 10 мМ во время обработки HTST для инактивации вируса до фазы продуцирования полипептида в клеточной культуре. В следующем аспекте pH среды затем доводят до значения от приблизительно pH 6,9 до приблизительно pH 7,2 и общее количество фосфата и кальция в среде увеличивают до уровня, достаточного для продуцирования полипептида во время фазы продуцирования полипептида в клеточной культуре. В любом из аспектов базовая среда представляет собой среду определенного химического состава. В любом из аспектов базовая среда представляет собой среду не определенного химического состава. Можно использовать аминокислоты, витамины, следовые элементы и другие компоненты среды в количестве, соответствующем однократным или двукратным диапазонам, указанным в Европейском патенте EP 307247 или патенте США № 6180401, полное содержание данных документов включено в настоящий документ посредством ссылки.

Альтернативно, коммерчески доступные среды, такие как среда Хэма F10 (Sigma), минимальная поддерживающая среда ([MEM], Sigma), RPMI-1640 (Sigma) и модифицированная по методу Дульбекко среда Игла ([DMEM], Sigma), подходят для культивирования животных клеток и могут быть дополнены определенными химическими компонентами сред, перечисленными в настоящем документе (например, путем использования предоставленного набора). Кроме того, любую из сред, описанных в публикациях Ham and Wallace, Meth. Enz., 58: 44 (1979), Barnes and Sato, Anal. Biochem., 102: 255 (1980), патентах США №№ 4767704, 4657866, 4927762 или 4560655, WO 90/03430, WO 87/00195, патенте США № Re. 30985 или патенте США № 5122469, полное содержание всех из которых включено в настоящий документ посредством ссылки, можно использовать в качестве культуральной среды для клеток-хозяев, каждую из них можно дополнять определенными химическими компонентами сред, перечисленными в настоящем документе (например, путем использования предоставленного набора).

Любые среды, указанные в настоящем документе, также можно дополнять по мере необходимости гормонами и/или другими факторами роста (такими как инсулин, трансферрин или эпидермальный фактор роста), ионами (такими как натрий, хлорид, кальций, магний и фосфат), буферами (такими как HEPES), нуклеозидами (такими как аденозин и тимидин), следовыми элементами (определяемыми как неорганические соединения, как правило, присутствующие в конечных концентрациях, находящихся в микромолярном диапазоне), металлическими микроэлементами (такими как железо и медь), а также глюкозой или эквивалентным источником энергии. Любые другие необходимые добавки также можно включать в соответствующих концентрациях, которые известны специалистам в данной области.

В определенный момент роста клетки могут образовывать инокулят для инокуляции культуральной среды в начале культивирования в фазе образования продукта. Альтернативно, фаза образования продукта может без перерыва следовать за фазой роста. За фазой роста клеток, как правило, следует фаза продуцирования полипептида.

Во время фазы продуцирования полипептида клеточную культуру можно поддерживать при другой совокупности условий культивирования (по сравнению с фазой роста), способствующих жизнеспособности и выживаемости клеточной культуры и подходящих для экспрессии нужного полипептида. Например, во время последующей фазы образования продукта клетки CHO хорошо экспрессируют рекомбинантные полипептиды и белки в пределах диапазона температур от 25°C до 35°C. Можно использовать несколько дискретных смен температуры для увеличения плотности или жизнеспособности клеток, или для увеличения экспрессии рекомбинантного полипептида или белка. Используемый в настоящем документе термин «фаза продуцирования полипептида» или «фаза экспрессии белка» могут относиться к фазе культивирования клеток, в которой культивируемые клетки продуцируют биологическое лекарственное средство (например, полипептид).

Клетки можно поддерживать в последующей фазе образования продукта до достижения нужной плотности клеток или титра продукта. В одном варианте осуществления клетки поддерживают в последующей фазе образования продукта до достижения максимального титра рекомбинантного полипептида. В других вариантах осуществления культивируемые клетки можно собирать до достижения этого момента. Например, клетки можно поддерживать в течение периода времени, достаточного для достижения плотности жизнеспособных клеток, составляющей 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99 процентов от максимальной плотности жизнеспособных клеток. В некоторых случаях может быть желательно, чтобы плотность жизнеспособных клеток достигала максимума, а затем позволять плотности жизнеспособных клеток снижаться до некоторого уровня, прежде чем собирать культивируемые клетки.

В некоторых случаях может быть полезно или необходимо дополнять культуральную среду клеток во время последующей фазы продуцирования полипептида питательными добавками или другими компонентами среды, которые были истощены или метаболизированы клетками. Например, может быть полезно дополнять культуральную среду клеток питательными добавками или другими компонентами среды, которые были истощены, как установлено при мониторинге клеточной культуры. В некоторых аспектах один или более компонентов, истощенных до последующей фазы образования продукта, включают кальций, фосфат, железо и медь. В некоторых аспектах добавляемые компоненты среды включают кальций, фосфат, железо и медь. Альтернативно или дополнительно, может быть полезно или необходимо дополнять культуральную среду клеток перед последующей фазой продуцирования полипептида. В некоторых аспектах культуральную среду клеток дополняют одним или более компонентами среды, включая кальций, фосфат, железо и медь, перед последующей фазой образования продукта. В качестве неограничивающих примеров, может быть полезно или необходимо дополнять культуральную среду клеток гормонами и/или другими факторами роста, в частности, ионами (такими как натрий, хлорид, кальций, магний и фосфат), буферами, витаминами, нуклеозидами или нуклеотидами, следовыми элементами (неорганическими соединениями, как правило, присутствующими в очень низких конечных концентрациях), металлическими микроэлементами (такими как железо и медь), аминокислотами, липидами, либо глюкозой или другими источниками энергии. Используемый в настоящем документе термин «питательная среда» или «продукционная среда» относится к культуральной среде клеток, используемой в процессе фазы продуцирования полипептида в клеточной культуре.

IV. Иллюстративные варианты осуществления

1. Способ инактивации вируса в потоке исходных материалов продукта в процессе производства терапевтического полипептида, включающий этап обработки потока исходных материалов детергентом, при этом детергент является экологически безопасным.

2. Способ по варианту осуществления 1, позволяющий сохранять качество терапевтического полипептидного продукта по сравнению со способом с использованием Triton X-100 или способом без использования детергента.

3. Способ по варианту осуществления 2, в котором сохранение качества терапевтического полипептидного продукта заключается в изменении содержания вариантов продукта не более чем на 5% от всего количества полипептида в потоке исходных материалов продукта.

4. Способ по варианту осуществления 3, в котором содержание вариантов продукта не возрастает более чем на 5% от общего содержания полипептида в потоке исходных материалов продукта.

5. Способ по варианту осуществления 3 или 4, в котором варианты продукта представляют собой варианты по размеру, варианты по заряду, окисленные варианты, дезамидированные варианты, гликированные варианты или варианты с измененными гликановыми профилями.

6. Способ по любому из вариантов осуществления 3-5, в котором варианты продукта представляют собой кислые и/или щелочные варианты продукта.

7. Способ по любому из вариантов осуществления 1-6, в котором обработка потока исходных материалов детергентом не приводит к увеличению фрагментации полипептида более чем на приблизительно 5%. Это может быть измерено методом эксклюзионной хроматографии (ЭХ).

8. Способ по любому из вариантов осуществления 1-7, в котором обработка потока исходных материалов детергентом не приводит к увеличению агрегации в потоке исходных материалов более чем на приблизительно 5%. Это может быть измерено методом ЭХ.

9. Способ по любому из вариантов осуществления 1-8, в котором обработка потока исходных материалов детергентом не приводит к снижению выхода полипептида в производственном процессе более чем на приблизительно 5%. Это может быть измерено методом ЭХ.

10. Способ по любому из вариантов осуществления 1-9, в котором детергент добавляют к потоку исходных материалов до конечной концентрации от приблизительно 0,01% до приблизительно 10%.

11. Способ по любому из вариантов осуществления 1-10, в котором детергент добавляют к потоку исходных материалов до конечной концентрации от приблизительно 0,3% до приблизительно 1%.

12. Способ по любому из вариантов осуществления 1-11, в котором поток исходных материалов обрабатывают детергентом в течение периода времени от по меньшей мере приблизительно 1 минуты до по меньшей мере приблизительно 48 часов.

13. Способ по любому из вариантов осуществления 1-12, в котором поток исходных материалов обрабатывают детергентом в течение периода времени от по меньшей мере приблизительно 15 минут до по меньшей мере приблизительно 3 часов.

14. Способ по любому из вариантов осуществления 1-13, в котором поток исходных материалов обрабатывают детергентом в течение по меньшей мере приблизительно 1 часа.

15. Способ по любому из вариантов осуществления 1-14, в котором поток исходных материалов обрабатывают детергентом при температуре от приблизительно 4°C до приблизительно 30°C.

16. Способ по любому из вариантов осуществления 1-15, в котором поток исходных материалов обрабатывают детергентом при температуре от приблизительно 15°C до приблизительно 20°C.

17. Способ по любому из вариантов осуществления 1-16, в котором детергент представляет собой неионный детергент или цвиттерионный детергент.

18. Способ по любому из вариантов осуществления 1-17, в котором детергент имеет гидрофильно-липофильный баланс (ГЛБ) от приблизительно 12 до приблизительно 15.

19. Способ по любому из вариантов осуществления 1-18, в котором детергент не содержит или не образует октилфенол.

20. Способ по любому из вариантов осуществления 1-19, в котором детергент не содержит или не образует пероксид.

21. Способ по любому из вариантов осуществления 1-20, в котором поток исходных материалов, содержащий детергент, имеет низкую мутность. Это может быть измерено по среднему поглощению в пределах 340-360 нм.

22. Способ по любому из вариантов осуществления 1-21, в котором добавление детергента к потоку исходных материалов не приводит к увеличению мутности потока исходных материалов. Это может быть измерено по среднему поглощению в пределах 340-360 нм.

23. Способ по любому из вариантов осуществления 1-22, в котором при сбросе прогнозируемая концентрация в окружающей среде (PEC) детергента в приемном водоеме, возникающая в результате использования детергента, находится ниже уровня прогнозируемой безопасной концентрации (PNEC) детергента.

24. Способ по варианту осуществления 23, в котором PEC является меньше, чем PNEC.

25. Способ по любому из вариантов осуществления 1-24, в котором экологически безопасный детергент содержит алкилглюкозид.

26. Способ по варианту осуществления 25, в котором алкилглюкозид представляет собой децилглюкозид.

27. Способ по любому из вариантов осуществления 1-24, в котором экологически безопасный детергент представляет собой этоксилат спирта.

28. Способ по любому из вариантов осуществления 1-24, в котором экологически безопасный детергент представляет собой алкиловый эфир полиэтиленгликоля.

29. Способ по любому из вариантов осуществления 1-24, в котором экологически безопасный детергент имеет регистрационный номер CAS: CAS 9005-64-5, CAS 9005-65-6, CAS 126-43-8, 68515-73-1, CAS 58846-77-8, CAS 59122-55-3, CAS 110615-47-9, CAS 29836-26-8, CAS 64366-70-7, CAS 68937-66-6, CAS 69227-22-1, CAS 25322-68-3, CAS 27252-75-1, CAS 4292-10-8, CAS 132778-08-6, CAS 110615-47-9, CAS 68515-73-1 или CAS 68439-46-3.

30. Способ по любому из вариантов осуществления 1-29, в котором детергент содержит один или более сурфактантов.

31. Способ по любому из вариантов осуществления 1-30, в котором детергент содержит один или более сурфактантов, консервантов и хелатообразующих агентов.

32. Способ по любому из вариантов осуществления 1-31, в котором поток исходных материалов содержит собранную культуральную жидкость клеток.

33. Способ по варианту осуществления 32, в котором детергент добавляют к собранной культуральной жидкости клеток.

34. Способ по любому из вариантов осуществления 1-33, в котором поток исходных материалов содержит пул захваченного или пул извлеченного продукта.

35. Способ по варианту осуществления 34, в котором пул захваченного или пул извлеченного продукта представляет собой пул после аффинной хроматографии.

36. Способ по варианту осуществления 34 или 35, в котором пул захваченного или пул извлеченного продукта представляет собой пул после белка A, пул после белка G или пул после белка L.

37. Способ по варианту осуществления 34, в котором пул захваченного или пул извлеченного продукта представляет собой пул после хроматографии смешанного типа.

38. Способ по варианту осуществления 34 или 37, в котором пул захваченного продукта представляет собой пул после CaptoAdhere.

39. Способ по любому из вариантов осуществления 1-38, в котором детергент используют в сочетании с пеногасителем.

40. Способ по варианту осуществления 39, в котором пеногаситель представляет собой симетикон.

41. Способ по любому из вариантов осуществления 1-40, в котором вирус представляет собой оболочечный вирус.

42. Способ по любому из вариантов осуществления 1-41, в котором вирус представляет собой ретровирус, герпесвирус, флавивирус, поксвирус, гепаднавирус, вирус гепатита, ортомиксовирус, парамиксовирус, рабдовирус или тогавирус.

43. Способ по любому из вариантов осуществления 1-42, в котором логарифмический показатель снижения концентрации вируса (LRV) для детергента в потоке исходных материалов составляет более приблизительно единицы.

44. Способ по любому из вариантов осуществления 1-43, в котором вирусный показатель LRV составляет более приблизительно четырех.

45. Способ по варианту осуществления 43 или 44, в котором LRV рассчитывают на основании анализа инфекционности.

46. Способ по варианту осуществления 45, в котором анализ инфекционности представляет собой анализ бляшкообразования или анализ TCID₅₀.

47. Способ по любому из вариантов осуществления 1-46, дополнительно включающий стадию фильтрования потока исходных материалов после добавления детергента.

48. Способ по варианту осуществления 47, в котором поток исходных материалов фильтруют через период времени от по меньшей мере приблизительно 15 минут до по меньшей мере приблизительно 48 часов после добавления детергента.

49. Способ по варианту осуществления 47 или 48, в котором поток исходных материалов фильтруют через период времени от по меньшей мере приблизительно 1 часа до по меньшей мере приблизительно 3 часов после добавления детергента.

50. Способ по любому из вариантов осуществления 47-49, в котором поток исходных материалов фильтруют через приблизительно 1 час после добавления детергента.

51. Способ по любому из вариантов осуществления 47-50, в котором фильтр представляет собой ультрафильтр или глубинный фильтр.

52. Способ по любому из вариантов осуществления 1-51, в котором поток исходных материалов подвергают хроматографии после добавления детергента.

53. Способ по варианту осуществления 52, в котором хроматография представляет собой одну или более из аффинной хроматографии, ионообменной хроматографии, хроматографии гидрофобного взаимодействия, хроматографии на гидроксиапатите или хроматографии смешанного типа.

54. Способ по варианту осуществления 53, в котором аффинная хроматография представляет собой хроматографию на основе белка A, хроматографию на основе белка G или хроматографию на основе белка L.

55. Способ по варианту осуществления 53, в котором ионообменная хроматография представляет собой анионообменную хроматографию или катионообменную хроматографию.

56. Способ по варианту осуществления 53, в котором хроматография смешанного типа представляет собой хроматографию CaptoAdhere.

57. Способ по любому из вариантов осуществления 1-56, в котором терапевтический полипептид представляет собой антитело, иммуноадгезин, фермент, фактор роста, рецептор, гормон, регуляторный фактор, цитокин, Fc-слитый полипептид, антиген или связующее вещество.

58. Способ по варианту осуществления 57, в котором антитело представляет собой моноклональные антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело, человеческое антитело, биспецифическое антитело или фрагмент антитела.

59. Способ по любому из вариантов осуществления 1-57, в котором терапевтический полипептид получают в клетках млекопитающих.

60. Способ по варианту осуществления 59, в котором линия клеток млекопитающего представляет собой клетки яичника китайского хомячка (CHO) или клетки почки новорожденного хомячка (BHK), клетки мышиной гибридомы или клетки мышиной миеломы.

Каждый признак, раскрытый в данной спецификации, может быть заменен альтернативным признаком, служащим той же самой, эквивалентной или аналогичной цели. Таким образом, если специально не указано иное, каждый раскрытый признак является лишь примером из общей серии эквивалентных или аналогичных признаков.

Все литературные источники, приведенные в настоящем документе, включены в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме и для всех целей.

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры приведены для иллюстрации, но не для ограничения изобретения.

Пример 1: Оценка детергентов

Проводили скрининг ряда детергентов с целью замены Triton X-100 в способах очистки терапевтических полипептидов и инактивации занесенных агентов, таких как оболочечные вирусы. Критерии для альтернативных детергентов включали, но не ограничивались ими, неионную или цвиттерионную природу детергента, пригодность отходов для удаления, надежность инактивации вируса, стоимость, безопасность/OSHA, растворимость, вязкость, гидрофильно-липофильный баланс, составляющий ~12-15, доступность и источник материалов, влияние на процесс и качество продукта, а также стабильность сырья ≥24 месяцев. Примеры оцениваемых детергентов приведены в таблице 1.

Таблица 1.
Примеры оцениваемых детергентов Используемые в индустрии переработки плазмы и/или одобренные для GMP исходные материалы Алкил глюкозиды «Экологически чистые» Разные другие Три-н-бутил фосфат
(TnBP, CAS 126-73-8) Смесь полиглюкозидов
(CAS 68515-73-1, 58846-77-8, 110615-47-9) SafeCare 1000 Tergitol L64
(CAS 9003-11-6) Полисорбат 20
(CAS 9005-64-5) ± TnBP Triton CG-100 (каприлил/децил-глюкозид, CAS 68515-73-1) Natsurf 265
(CAS 27252-75-1) Каприловая кислота
(CAS 124-07-2) Полисорбат 80
(CAS 9005-64-6) ± TnBP Mackol DG (лаурилглюкозид, CAS 110615-47-9) Ecosurf EH3
Ecosurf EH6
Ecosurf EH9
(CAS 64366-70-7) Chembetaine LEC (CAS 4292-10-8) Triton X-100
(CAS 9002-93-1) APG 325N (CAS 132778-08-6) Ecosurf SA7
Ecosurf SA9
(CAS 68937-66-6, CAS 69227-22-1, CAS 25322-68-3 н-октилглюкозид
(CAS 29836-26-8) Lutensol M5
Lutensol XL
(CAS 166736-08-9)
Lutensol XP
(CAS 160875-66-1) н-децил-бета-D-глюкопиранозид
(CAS 59122-55-3) Tomadol 900
(CAS 68439-46-3)

Для оценки детергентов использовали несколько раундов скрининга.

Раунд 1: Детергенты-кандидаты добавляли к водным растворам моноклональных антител (мАт) до конечной концентрации вплоть до 1% (по объему) на три часа при температуре окружающей среды. В данных исследованиях использовали три полипептидных раствора. Раствор мАт1 HCCF представлял собой собранную культуральную жидкость клеток, полученную при производстве мАт1; раствор мАт3 HCCF представлял собой собранную культуральную жидкость клеток, полученную при производстве мАт3, и раствор мАт3 MSS представлял собой скорректированную объединенную фракцию (пул) после хроматографии на основе белка A препарата мАт3. Детергенты оценивали с точки зрения их влияния на смешивание, мутность, выход продукта и качество продукта.

Изучение смешиваемости: тестируемыми детергентами были: 1% полисорбат 20 ± TnBP, 1% полисорбат 80 ± TnBP, 1% SafeCare 1000, 1% Ecosurf EH-9, 1% Ecosurf EH-6, 1% Ecosurf EH-3, 1% Ecosurf SA9, 1% Ecosurf SA7, 0,1M каприлат, 0,5% или 1% полиглюкозид и 1% Triton X-100. Результаты сравнивали с контролем, в который не добавляли детергент.

Образцы для изучения мутности отбирали в установленные временные точки 0 ч, 1 ч, 2 ч, 3 ч, после фильтрования, 1 ч после фильтрования и после отстаивания в течение ночи. Растворы фильтровали через 0,2-мкм фильтр после времени последнего смешивания.

Образцы анализировали путем очистки на PhyTip белке A с последующей эксклюзионной хроматографией (ЭХ), методом капиллярного изоэлектрического фокусирования с детекцией непосредственно в капилляре (кИЭФ) на гетерогенность заряда и методом капиллярного электрофореза на содержание гликана. Эксклюзионная хроматография выявляет наличие низкомолекулярных соединений (например, продуктов деградации) и высокомолекулярных соединений (например, агрегатов). кИЭФ выявляет варианты по заряду (например, кислые варианты по заряду и щелочные варианты по заряду). Капиллярный электрофорез выявляет гликановую структуру. Уровни белков клеток яичника китайского хомячка (CHOP) тестировали в анализе ELISA собственной разработки для определения нескольких продуктов. Концентрацию мАт1 или мАт3 измеряли в HCCF методом ВЭЖХ на основе белка A, используя поглощение при 280 нм для корректировки пулов после белка A.

На фигуре 1 представлен анализ мутности при смешивании с детергентом контроля мАт1 HCCF, не содержащего детергент, с использованием различных способов смешивания. Мутность необработанной смешанной HCCF была на низком уровне, что оставалось неизменным в процессе смешивания, фильтрования и инкубации в течение ночи. Анализ мутности при смешивании с детергентом мАт1 HCCF при обработке 1% полисорбатом 20 (вверху слева), 1% полисорбатом 20 с 0,3% TnBP (вверху справа), 1% полисорбатом 80 (внизу слева) и 1% полисорбатом 80 с 0,3% TnBP (внизу справа) представлен на фигуре 2. Мутность возрастала и вновь возвращалась в прежнее состояние после фильтрования в случае HCCF, обработанной полисорбатом 20 ± TNBP или полисорбатом 80 ± TNBP. Анализ мутности при смешивании с детергентом мАт1 HCCF при обработке 1% SafeCare (вверху слева), 1% Ecosurf EH-9 (вверху справа), 0,1M каприлатом (внизу слева) и 1% полиглюкозидом (внизу справа) представлен на фигуре 3. Мутность возрастала при добавлении и смешивании с SafeCare или каприлатом, однако мутность не возвращалась в прежнее состояние после фильтрования и инкубации в течение ночи. Никакого увеличения мутности не наблюдали в условиях тестирования с Ecosurf EH-9 или полиглюкозидом.

Результаты влияния смешивания с детергентом на качество продукта мАт1 HCCF приведены в таблице 2. Увеличение количества высокомолекулярных соединений наблюдали в случае полисорбата 20 и полисорбата 80 с TnBP. Снижение выхода и уменьшение содержания CHOP наблюдали в случае каприлата. Никаких изменений в отношении гликана или CHOP не наблюдали в случае других детергентов (данные не представлены).

Таблица 2.
Изучение влияния смешивания с детергентом на качество продукта мАт1 HCCF. Мутность HCCF ЭХ кИЭФ Детергент +/- %ВМС %НМС %кислых %основных %щелочных Контроль HCCF - 7,5 0,1 35,1 62,6 2,3 1% Ecosurf EH-9 - 7,4 0,1 35,8 62,2 2,0 1% SafeCare 1000 + 7,4 0,1 35,2 62,5 2,3 0,1M каприлат +++ н/и н/и н/и н/и н/и 1% полиглюкозид - 7,3 0,1 36,3 61,5 2,2 1% полисорбат 20 ++ 7,3 0,1 35,0 62,5 2,5 1% полисорбат 20 +
TnBP ++ 11,8 0,1 33,1 34,9 2,0 1% полисорбат 80 ++ 7,5 0,2 33,7 64,1 2,2 1% полисорбат 80 +
TnBP ++ 9,7 0,1 35,0 62,8 2,1

Результаты воздействия детергента в течение трех часов на мутность мАт3 HCCF и пула мАт3 MSS приведены в таблице 3. Существенную мутность наблюдали в случае условий с Ecosurf EH-3 и каприлатом, незначительную мутность - в случае полисорбата 20 или 80 с TnBP и SafeCare.

Таблица 3.
Скрининг детергентов с использованием мАт3: HCCF или скорректированного пула после белка A (MSS) Детергент Мутность HCCF Мутность пула MSS 1% Ecosurf EH-3 +++ +++ 1% Ecosurf EH-6 - - 1% Ecosurf EH-9 - - 1% Ecosurf SA-7 - - 1% Ecosurf SA-9 - - 1% SafeCare 1000 + + 0,5% полиглюкозид - - 0,1M каприлат ++ ++ 1% Triton X-100 - - 1% полисорбат 20 +
TnBP + + 1% полисорбат 80 +
TnBP + + 1% WFI
(отрицательный контроль) - -

В таблице 4 приведены результаты для CHOP и ДНК при скрининге детергентов с использованием мАт3 HCCF и скорректированных пулов после белка A. Не наблюдали никакого влияния, за исключением того, что CHOP и ДНК выпадали в осадок в HCCF, и пулы после белка A (ProA) в случае каприлата демонстрировали снижение выхода продукта на 40%. Никакого снижения выхода продукта не было отмечено в случае других протестированных детергентов (данные не представлены).

Таблица 4.
Скрининг детергентов с использованием мАт3 HCCF и скорректированных пулов после белка A Тестируемый детергент HCCF + детергент Скорр. пул после ProA + детергент CHOP (промилле) ДНК (промилле) CHOP (промилле) ДНК (промилле) Ecosurf EH3 143639 365 2158 3,9 Ecosurf EH6 143865 448 2201 4,1 Ecosurf EH9 155112 418 2352 4,3 Ecosurf SA7 151383 483 2360 5,0 Ecosurf SA9 151115 465 2326 4,6 1% SafeCare 1000 153469 380 2275 3,8 0,5% полиглюкозид 165355 328 2239 3,1 0,1M каприлат 12642 <ПКО 600 0,002 1% Triton X-100 146646 261 2545 2,1 1% полисорбат 20 +
TnBP 144016 223 2229 2,6 1% полисорбат 80 +
TnBP 130486 248 2009 2,4 1% WFI (отрицательный контроль) 138286 396 2298 3,6

В таблице 5 приведены результаты ЭХ при скрининге детергентов с использованием мАт3: HCCF или скорректированного пула после ProA. Обработку детергентом проводили в течение трех часов при температуре окружающей среды. Никакого существенного изменения в ВМС или НМС не наблюдали, за исключением того, что в обработанной каприловой кислотой HCCF имело место уменьшение количества ВМС до 0,8%.

Таблица 5.
Скрининг детергентов с использованием мАт3:HCCF и скорректированного пула после белка A Используемый детергент HCCF + детергент Скорр. пул после
ProA + детергент ЭХ-ВМС (%) ЭХ-основ (%) ЭХ-НМС (%) ЭХ-ВМС (%) ЭХ- основ. (%) ЭХ-НМС (%) Ecosurf EH3 2,1 97,8 0,1 1,8 97,8 0,1 Ecosurf EH6 2,1 97,7 0,2 2,1 97,8 0,1 Ecosurf EH9 2,0 97,8 0,2 2,1 97,8 0,1 Ecosurf SA7 2,2 97,6 0,1 2,1 97,8 0,1 Ecosurf SA9 2,1 97,8 0,1 2,0 97,8 0,1 1% SafeCare 1000 2,0 97,9 0,2 1,9 98,0 0,1 0,5% полиглюкозид 2,1 97,8 0,2 1,9 97,9 0,1 0,1M каприлат 0,8 99,1 0,1 1,8 98,1 0,1 1% Triton X-100 2,2 97,7 0,1 2,3 97,6 0,1 1% полисорбат 20 + TnBP 2,1 97,7 0,2 2,1 97,8 0,1 1% полисорбат 80 + TnBP 2,2 97,7 0,1 2,0 97,9 0,1 1% WFI
(отрицательный контроль) 2,1 97,8 0,1 1,8 98,0 0,1

В таблице 6 приведены результаты кИЭФ при скрининге детергентов с использованием мАт3 HCCF или скорректированного пула после ProA. Обработку детергентом проводили в течение трех часов при температуре окружающей среды. Никакой разницы в содержании вариантов по заряду не было отмечено, за исключением уменьшения кислотного пика, возрастания основного пика в случае обработанного Ecosurf SA-9 пула после ProA. Это могло быть результатом обращения с образцами, и условия с этим детергентом были вновь протестированы в последующем эксперименте с мАт3, при этом не было обнаружено изменений профиля заряда.

Таблица 6.
Скрининг детергентов с использованием мАт3:HCCF и скорректированного пула после ProA Используемый детергент HCCF + детергент Скорр. пул после
ProA + детергент кИЭФ- кисл. (%) кИЭФ- основ. (%) кИЭФ- щелоч (%) кИЭФ- кисл. (%) кИЭФ- основ. (%) кИЭФ- щелоч. (%) Ecosurf EH3 59,4 37,8 2,81 50,7 46,0 3,29 Ecosurf EH6 59,3 38,0 2,64 51,8 44,9 3,27 Ecosurf EH9 59,6 37,9 2,52 51,4 45,0 3,53 Ecosurf SA7 59,3 38,2 2,48 51,6 45,2 3,22 Ecosurf SA9 59,8 37,8 2,43 15,7 84,3 0 1% SafeCare 1000 59,4 38,0 2,59 52,3 44,4 3,34 0,5% полиглюкозид 59,8 37,3 2,91 51,4 45,3 3,32 0,1M каприлат 57,5 39,8 2,71 52,0 44,6 3,38 1% Triton X-100 59,8 37,6 2,65 51,1 45,4 3,51 1% полисорбат 20 + TnBP 59,5 38,0 2,60 51,5 45,1 3,43 1% полисорбат 80 + TnBP 59,6 37,5 2,86 50,7 45,6 3,69 1% WFI
(отрицательный контроль) 59,8 37,4 2,85 51,7 44,8 3,58

Каприлат и EcoSurf EH-3 были изъяты из дальнейшего скрининга из-за образования осадка и снижения выхода продукта.

Раунд 2: Детергенты-кандидаты добавляли к водным растворам моноклональных антител (мАт) до конечной концентрации 1% (по объему) на ночь при температуре окружающей среды. Детергенты оценивали в отношении их влияния на хроматографические показатели, стадийный выход продукта и влияния на качество продукта с использованием мАт3. Качество продукта тестировали с использованием ЭХ ВЭЖХ для количественного определения вариантов по размеру (ВМС и НМС) и ИОХ (с обработкой карбоксипептидазой) для количественного определения вариантов по заряду. Гликирование определяли с использованием боронат-аффинной хроматографии, как описано Zhang с соавторами (Analytical Chem. 2008, 80: 2379-2390). Также использовали триптическое пептидное картирование для выявления других изменений в белке, таких как окисление или дезамидирование. Очистку от возникающих в процессе примесей измеряли с использованием CHOP ELISA для определения нескольких продуктов, ELISA для выщелоченного белка A (LpA) и TaqMan ПЦР-анализа для количественного определения ДНК.

В таблице 7 приведены результаты оценки детергентов с использованием мАт3 HCCF в условиях обработки в течение ночи детергентом с последующей очисткой методом хроматографии на основе белка A MabSelect SuRe. Нетипичную хроматограмму и низкий стадийных выход продукта на MabSelect SuRe наблюдали в случае образца, обработанного Ecosurf SA7. Не наблюдали существенного влияния на очистку от CHOP или ДНК. Уровни ДНК в обработанной детергентом HCCF различались, что может указывать на некоторые помехи, которые создает детергент в образце для анализа ДНК. Это будет изучено далее с окончательными детергентами-кандидатами. Уровни выщелоченного белка A были сопоставимы в случае всех протестированных детергентов. Никаких изменений в профилях гликирования не было отмечено ни для одного из протестированных детергентов.

Таблица 7.
Оценка детергентов с использованием мАт3 HCCF. Детергент Выход
% CHOP (промилле) ДНК (промилле) LpA (промилле) % гликирования* HCCF Пул ProA HCCF Пул ProA Пул ProA Пул ProA Полисорбат 80 86 150380 2259 1254 13 15 25,5 SafeCare 1000 88 123859 1537 398 5 13 25,3 Полиглюкозид 88 135515 1719 605 6 16 25,5 Ecosurf EH6 90 129500 1951 77 3 17 23,5 Ecosurf EH9 88 112562 1971 737 8 14 24,2 Ecosurf SA7 61 97186 2439 682 7 15 23,4 Ecosurf SA9 85 130769 1969 638 10 14 24,9 WFI (отрицательный контроль) 84 138909 2136 134 6 15 23,7

На фигуре 4 представлены пептидные карты нейтрализованных после белка A пулов мАт3 после инкубации с детергентами в течение ночи при температуре окружающей среды и очистки на MabSelectSuRe. Никакой разницы в качестве продукта не наблюдали ни для одного из детергентов, что определяли методом триптического пептидного картирования.

В таблице 8 приведены результаты анализа методами ЭХ и ИОХ мАт3 HCCF после воздействия в течение ночи детергентов-кандидатов. Образцы после ИОХ обрабатывали карбоксипептидазой B (CpB) перед анализом. Никакого влияние на качество продукта не было обнаружено ни для одного из детергентов.

Таблица 8.
Оценка детергентов с использованием мАт3 HCCF. Нативная ЭХ ИОХ (с CpB) Детергент ВМС1 Димер Основной пик Fab НМС1 кислые основные щелочные Полисорбат 80 0,4 1,6 96,7 0,7 0,6 35,3 57,1 7,6 SafeCare 1000 0,3 1,6 96,8 0,8 0,5 35,6 56,8 7,5 Полиглюкозид 0,3 1,6 96,8 0,7 0,6 35,0 57,2 7,7 Ecosurf EH6 0,3 1,6 96,8 0,7 0,6 35,2 57,2 7,7 Ecosurf EH9 0,3 1,6 96,8 0,7 0,5 35,1 57,1 7,8 Ecosurf SA7 0,3 1,5 97,1 0,7 0,4 36,9 55,1 8,0 Ecosurf SA9 0,3 1,6 96,8 0,8 0,5 36,8 55,4 7,8 WFI (отриц. контроль) 0,4 1,6 96,7 0,8 0,6 37,0 55,3 7,7

Ecosurf SA-7 был исключен из дальнейшего скрининга из-за нетипичной хроматограммы и низкого выхода. Полиглюкозид представлял собой смесь алкил глюкозидов и для дальнейших исследований был заменен на отдельные алкил глюкозиды.

Раунд 3: Детергенты-кандидаты добавляли в водные растворы моноклональных антител (мАт) до конечной концентрации 1% (по объему) на ночь при температуре окружающей среды. В этих исследованиях использовали растворы полипептидов мАт1 HCCF, мАт1 MSS, мАт3 и мАт2 HCCF. Детергенты оценивали в отношении их влияния на мутность, влияния на качество продукта и возможность удаления детергента после хроматографии на основе белка A.

МАт1, мАт2 и мАт3 HCCF инкубировали с 1% (по объему) детергентом при температуре окружающей среды в течение ночи. Затем мАт1 очищали хроматографией MabSelect SuRe. Объединенные фракции (пулы) анализировали методами ЭХ, кИЭФ и ЯМР для проверки очистки от детергента. Результаты определения мутности, выхода с MabSelect SuRE и качества продукта в скорректированных пулах после белка A приведены в таблице 9. HCCF, обработанная 1% полисорбатом + 0,3% TnBP, отличалась сильной мутностью и низким выходом после хроматографии на основе белка A MabSelect SuRe. Эти условия также приводили к образованию больших количеств ВМС. Обработанный Lutensol XP90 образец имел приблизительно на 4% более высокие уровни кислых вариантов по сравнению с контролем.

Таблица 9.
Оценка детергентов с использованием мАт1 1,3 HCCF Детергент Мутность HCCF Выход MSS ЭХ кИЭФ +/- (%) %ВМС %основных %кислых %основных %щелочных Контроль HCCF - 93 8,3 91,7 39,46 58,99 1,55 Ecosurf EH9 - 94 8,5 91,5 41,37 57,5 1,12 Tomadol 900 - 97 8,2 91,8 39,11 59,43 1,47 Triton CG-110 - 107 7,4 92,6 38,09 60,08 1,83 APG 325N - 97 8,3 91,6 37,78 60,55 1,67 Lutensol XP90 - 98 8,5 91,4 44,12 54,33 1,55 Полисорбат 80 + 0,3% TNBP +++ 43 94,1 5,5 н/испыт. н/испыт. н/испыт.

Очистку от детергента во время хроматографии на основе белка A оценивали методом ЯМР с использованием нейтрализованных пулов после белка A, и результаты приведены в таблице 10. При хроматографии на основе белка A очистка приводила к очень низким уровням всех детергентов.

Таблица 10.
Оценка детергентов в ЯМР-анализе с использованием мАт1 HCCF. Детергент Количественное определения детергента методом ЯМР в нейтрализованном пуле после белка A (мкг/мл) Ecosurf EH9 <2 Tomadol 900 <2 Triton CG-110 2,17 APG 325N <2 Lutensol XP90 <2

Аналогичный анализ проводили в случае очистки на PhyTip белке A с последующей ЭХ-ВЭЖХ, кИЭФ и КЭ для определения гликанов с использованием мАт3 HCCF (таблица 11) и мАт2 HCCF (таблица 12).

Таблица 11.
Оценка детергентов с использованием мАт3 HCCF. Детергент Мутность HCCF ЭХ кИЭФ +/- %ВМС %основных %кислых %основных %щелочных APG 325N - 1,5 0,1 57,9 37,7 4,4 Ecosurf EH9 - 1,4 0,1 58,3 38,5 3,2 Triton CG-110 - 1,6 0,1 59,1 37,8 3,1 Tomadol 900 - 1,4 0,1 58,2 38,7 3,1 Lutensol XP90 - 1,4 0,1 58,4 38,3 3,3 Tergitol L64 - 1,4 0,1 59,5 38,3 2,2 WFI (отрицательный контроль) - 1,3 0,1 59,6 36,7 3,7

Никакой мутности или существенных изменений качества продукта в сравнении с контролем не наблюдали для мАт3 ни с одним из протестированных детергентов. Не наблюдали никаких изменений в распределении гликанов (данные не представлены).

Таблица 12.
Оценка детергентов с использованием мАт2 HCCF. Детергент Мутность HCCF ЭХ кИЭФ +/- %ВМС %основных %кислых %основных %щелочных APG 325N - 2,0 0,1 35,7 49,3 15,0 Ecosurf EH9 - 2,0 0,1 33,8 52,1 14,1 Triton CG-110 - 2,0 0,1 35,8 49,2 15,0 Tomadol 900 - 1,9 0,1 34,1 51,5 14,4 Lutensol XP90 - 2,0 0,1 36,9 49,6 13,5 Tergitol L64 - 2,0 0,1 36,1 49,7 14,2 WFI (отрица-тельный контроль) - 2,0 0,1 33,3 53,4 13,3

Никакой мутности или существенных изменений качества продукта в сравнении с контролем не наблюдали для мАт2 ни с одним из протестированных детергентов. Несколько более высокий процент кислых соединений наблюдали в случае Lutensol XP90 и Tergitol L64. Изменения в распределении гликанов отсутствовали (данные не представлены).

Из данного раунда тестирования полисорбат 80 + TnBP был удален из-за мутности и влияния на качество продукта мАт1.

Детергенты также оценивали с точки зрения инактивации вируса (XMuLV) в мАт1 HCCF при температуре 20°C. Детергент добавляли к мАт1 HCCF до конечной концентрации 0,3%. В содержащий детергент материал вносили 5% по объему XMuLV. Образцы инкубировали в течение периода времени от 30 минут до 6 часов при температуре 20°C и анализировали на присутствие ксенотропного вируса мышиного лейкоза (XMuLV), модельного ретровируса. Присутствие XMuLV определяли в анализе TCID₅₀ с использованием индикаторных клеток PG-4. Результаты инактивации вируса представлены в виде логарифмического показателя снижения концентрации вируса (LRV) и приведены в таблице 13.

Таблица 13.
Инактивация XMuLV с использованием мАт1 HCCF^a
при температуре 20°C Детергент Время 0,5 1 2 3 6 1% полисорбат 80 н/и 3,3 н/и 5,7 н/и 1% полисорбат 80
(пул после белка A) 0,4 0,9 1,2 1,1 н/и 2% полисорбат 80
(пул после белка A) 0,7 0,7 1,2 1,0 н/и 1% полисорбат 80 + 0,3% TNBP н/и 5,2 н/и ≥5,5 н/и 1% полисорбат 20 1,0 1,4 н/и 2,3 4,5 2% полисорбат 20 0,6 0,7 н/и 2,2 5,6 1% полисорбат 20 + 0,3% TNBP н/и ≥5,7 н/и н/и н/и 1% TnBP н/и 2,9 н/и 3,1 н/и 1% полиглюкозид н/и ≥5,1 н/и ≥5,1 н/и 0,1M каприлат
pH 7,6 н/и н/и ≥6,0 ≥6,0 н/и 0,1M каприлат
pH 5,0 н/и н/и ≥5,1 ≥5,1 н/и 0,03M каприлат
pH 7,6 н/и н/и 0,21 0,30 н/и 0,03M каприлат
pH 4,5 н/и н/и ≥5,0 ≥5,0 н/и SafeCare 1000
0,5% н/и н/и ≥5,1 5,7 н/и SafeCare 1000
1,0% н/и н/и ≥5,5 ≥5,5 н/и SafeCare 1000
2,0% н/и н/и ≥5,2 ≥5,2 н/и SafeCare 1000
1,0% SC/растворитель 70/30 н/и н/и ≥5,2 ≥5,2 н/и 1% Ecosurf EH-6 н/и н/и ≥4,7 ≥4,7 н/и 1% Ecosurf EH-9 н/и н/и ≥5,1 ≥5,1 н/и ^aИспользуемым исходным материалом была HCCF, если не указано иначе.

Инактивация XMuLV была менее эффективной в случае полисорбата 80, полисорбата 20 или только TnBP. Образование осадка было отмечено в образцах с каприлатом.

Полисорбат 80 с растворителем и без него оценивали на инактивацию вируса (XMuLV) в пуле более позднего этапа процесса с использованием пула рБелок1 CaptoAdhere при комнатной температуре. Результаты инактивации XMuLV приведены в таблице 14. Эффективной инактивации XMuLV достигали через 1 час в случае одного только полисорбата 80. Полную инактивацию вируса наблюдали в пределах 5 минут в случае полисорбата 80 с растворителем.

Таблица 14.
Инактивация XMuLV полисорбатом 80 с растворителем и без растворителя в пуле рБелок1 CaptoAdhere при комнатной температуре. Время (мин) 1% полисорбат 80 1% полисорбат 80 + 0,3% TNBP LRV Анализ 1 Анализ 2 Анализ 1 Анализ 2 5 ,45 н/и ≥3,1 ≥4,8 10 ,57 н/и ≥3,1 ≥4,8 15 ,82 н/и ≥3,1 н/и 30 2,1 н/и ≥3,1 н/и 60 ≥3,4 ≥4,5 ≥3,1 н/и 90 ≥3,4 ≥4,5 ≥3,1 н/и 120 ≥3,4 ≥5,0 ≥3,1 н/и н/и=не испытано

Результаты инактивации XMuLV в мАт2 HCCF детергентами-кандидатами представлены в таблице 15. Полная и эффективная инактивация вируса была достигнута через 1 час при температуре 20°C в случае всех протестированных детергентов в концентрациях 0,5% и 1%.

Таблица 15.
Инактивация вируса в мАт3 при температуре 20°C. 20°C, 1 час Детергент 1% Детергент 0,5% Детергент Triton CG-110 ≥5,6 ≥5,7 APG 325N ≥5,4 ≥5,5 Lutensol XP90 ≥5,1 ≥5,2 Tomadol 900 ≥4,8 ≥4,9 Ecosurf EH-6 ≥4,8 н/и Ecosurf EH-9 н/и ≥4,9 н/и=не испытано

Результаты инактивации XMuLV в мАт2 HCCF и рБелок1 HCCF детергентами-кандидатами в концентрациях 0,3% и 0,5% и при более низкой температуре 12°C представлены в таблице 16. Эффективная инактивация вируса была достигнута через 1 час при температуре 12°C в случае всех протестированных детергентов в концентрациях 0,3% и 0,5%, за исключением Tergitol L64, который был неэффективен. Таким образом, Tergitol L64 был исключен из дальнейшего изучения.

Таблица 16.
Инактивация XMuLV в мАт2 и рБелок1 при более низкой температуре и концентрации детергента 12°C, 0,5% детергент мAт2 рБелок1 Детергент 1 час 3 часа 1 час 3 часа Triton CG-110 ≥5,4 ≥5,4 ≥5,9 5,9 APG 325N ≥5,2 ≥5,2 ≥5,7 ≥5,7 Lutensol XP90 ≥4,9 5,2 ≥5,4 ≥5,4 Tomadol 900 ≥4,6 ≥4,6 ≥5,1 ≥5,1 Ecosurf EH-9 ≥4,6 ≥4,6 ≥5,1 ≥5,1 Tergitol L64 н/и н/и 0,0 0,2 12°C, 0,3% детергент Triton CG-110 6,0 н/и ≥5,5 ≥5,5 APG 325N 5,5 н/и 5,9 5,9 Lutensol XP90 ≥6,0 н/и ≥5,6 ≥5,6 Tomadol 900 н/и н/и н/и н/и Ecosurf EH-9 5,8 н/и 5,0 н/и Tergitol L64 н/и н/и н/и н/и н/и=не испытано

Результаты инактивации XMuLV в рБелок2 HCCF с использованием различных концентраций Triton CG-110 приведены в таблице 17. Наблюдали зависимую от концентрации инактивацию вируса. При концентрации 0,05% Triton CG-110 инактивация была неэффективной, при этом были получены значения LRV менее 1.

Таблица 17
Инактивация XMuLV в рБелок2 HCCF при температуре 12°C в течение 1 часа Концентрация Triton CG-110 (%) LRV 0,05 0,1 0,10 1,1 0,15 2,3 0,20 3,6 0,25 5,8 0,30 ≥5,4 0,35 ≥5,4 0,40 5,8

Пример 2. Использование симетикона для подавления вспенивания: влияние на инактивацию вируса

Оценивали использование симетикона для уменьшения проблемы вспенивания в случае Triton CG110 с точки зрения влияния на инактивацию вируса.

Детергент (0,3%) добавляли к рБелок3 HCCF с симетиконом, пеногасителем, в конечной концентрации 0,1% или без него. Образцы оценивали с точки зрения инактивации вируса (XMuLV). Результаты приведены в таблице 18. Симетикон в концентрации 0,1% на оказывал влияния на инактивацию XMuLV детергентом Triton CG110.

Таблица 18.
Использование симетикона для подавления вспенивания не оказывает влияния на инактивацию вируса детергентом Triton CG110. Временная точка Детергент
без симетикона Детергент +
0,1% симетикон T=0
(исходный титр вируса) 7,4 TCID₅₀ 7,31 TCID₅₀ T=30 мин 5,84 LRV ≥5,43 LRV T=60 мин 5,84 LRV ≥5,43 LRV

Также оценивали способность детергентов инактивировать другие оболочечные вирусы. Детергент добавляли к рБелок1 HCCF до конечной концентрации 0,3%. В содержащий детергент материал вносили 5% (по объему) отдельно каждого вируса. Образцы инкубировали в течение 1 часа и/или 3 часов при температуре 12°C и анализировали на присутствие XMuLV, псевдовируса бешенства (PRV) или вируса вирусной диареи крупного рогатого скота (BVDV). Присутствие вирусов определяли с использованием клеточных анализов инфекционности. XMuLV определяли в анализе TCID₅₀ с использованием индикаторных клеток PG-4. Присутствие PRV и BVDV определяли в анализе бляшкообразования с использованием индикаторных клеток CV-1 и BT, соответственно. Результаты приведены в таблице 19. APG325N и Triton CG110 обеспечивали эффективную инактивацию всех трех вирусов.

Таблица 19.
Вирусная инактивация оболочечных вирусов в рБелок1 при температуре 12°C в течение 1 часа Вирус Семейство Размер (нм) Устойчивость к физико-химической обработке Время Детергент Ecosurf
EH-9 APG 325N Lutensol XP90 Triton CG110 X-MuLV Ретровирусы 80-110 низкая 1 час 5,0 5,9 >5,6 >5,5 3 часа н/и 5,9 >5,6 >5,5 PRV Герпесвирусы 150-200 средняя 1 час 0,2 >5,1 0,1 6,1 BVDV Флавивирусы 50-70 низкая 1 час 5,8 >6,5 >6,4 >6,5

Способность Triton CG110 и Ecosurf EH-9 к инактивации оболочечных вирусов сравнивали с таковой у Triton X-100. Triton CG110, Triton X-100 или Ecosurf EH-9 добавляли к рБелок2 HCCF в конечной концентрации 0,3%. В содержащий детергент материал вносили 5% (по объему) отдельно PRV и BVDV. Образцы инкубировали в течение 30 минут и 1 часа при температуре 20°C и анализировали на присутствие псевдовируса бешенства (PRV) или вируса вирусной диареи крупного рогатого скота (BVDV) в анализе бляшкообразования. Определяли логарифмический показатель снижения концентрации вируса. Результаты приведены в таблице 20.

Таблица 20.
Инактивация вируса с использованием Triton X-100, Triton CG110 и Ecosurf EH-9 при температуре 20°C; 0,3% детергент в рБелок2 HCCF Вирус Время (мин) Triton X-100 Triton CG110 Ecosurf EH-9 Анализ 1 Анализ 2 Анализ 1 Анализ 2 Анализ 1 Анализ 2 PRV 30 >5,8 >5,3 5,7 >6,3 >5,7 >5,2 60 >5,8 >5,3 5,9 5,9 >5,7 >5,2 BVDV 30 5,4 5,5 >6,4 5,9 >6,0 6,0 60 >5,4 >5,5 >6,4 >6,5 5,7 5,7

Ecosurf EH-9 и Triton CG110 обеспечивали эффективную инактивацию сопоставимо с Triton X-100.

Пример 3. Скрининг с дополнительными молекулами

Детергенты с симетиконом, или без него, подвергали дополнительному скринингу в отношении качества продукта. Тестировали следующие условия.

1. Контрольная HCCF (без детергента)

2. HCCF + 0,1% симетикон

3. HCCF + Ecosurf EH9

4. HCCF + 0,7% Triton CG110

5. HCCF + 0,7% Triton CG110 + 0,1% симетикон.

Образцы инкубировали при температуре окружающей среды в течение 15 часов и затем хранили при температуре 2-8°C. Образцы анализировали на качество продукта после очистки на Phytip белке A методами ЭХ, кИЭФ и анализа гликанов. HCCF включала мАт4, мАт5, мАт6, мАт7, мАт3, мАт8 и мАт9 HCCF. Результаты приведены в таблицах 21-26.

Результаты обработки детергентом ± симетикон мАт4 HCCF приведены в таблице 21. Никакого влияния на качество продукта не было отмечено в случае всех тестируемых условий. Изменение гликанов отсутствовало (данные не представлены).

Таблица 21.
Скрининг дополнительных молекул: влияние на качество продукта мАт4 Детергент Симетикон ЭХ
ВМС (%) ЭХ
основные (%) ЭХ
НМС (%) кИЭФ
кислые (%) кИЭФ
основные (%) кИЭФ
щелочные (%) Контроль ----- 1,09 98,7 0,26 40,78 55,45 3,77 Контроль 0,1% 1,13 98,6 0,27 40,89 55,74 3,37 Ecosurf EH-9 ----- 1,11 98,6 0,26 41,06 56,47 2,47 Triton CG-110 ----- 1,10 98,6 0,28 39,56 57,89 2,55 Triton CG-110 0,1% 1,15 98,6 0,28 36,84 60,86 2,3

Результаты обработки детергентом ± симетикон мАт5 HCCF приведены в таблице 22. Никакого влияния на качество продукта не было отмечено в случае всех тестируемых условий. Изменение гликанов отсутствовало (данные не представлены).

Таблица 22.
Скрининг дополнительных молекул: влияние на качество продукта мАт5 Детергент Симе-тикон ЭХ
ВМС (%) ЭХ
основные (%) ЭХ
НМС (%) кИЭФ
кислые (%) кИЭФ
основные (%) кИЭФ
щелочные (%) Контроль ----- 3,59 96,4 0,04 37,48 59,66 2,86 Контроль 0,1% 3,61 96,3 0,04 36,28 60,49 3,23 Ecosurf EH-9 ----- 3,56 96,4 0,05 35,42 61,75 2,83 Triton CG-110 ----- 3,35 96,6 0,04 36,17 61,31 2,52 Triton CG-110 0,1% 3,37 96,6 0,04 36,54 60,4 3,07

Результаты обработки детергентом ± симетикон мАт6 HCCF приведены в таблице 23. Никакого влияния на качество продукта не было отмечено в случае всех тестируемых условий. Изменение гликанов отсутствовало (данные не представлены).

Таблица 23.
Скрининг дополнительных молекул: влияние на качество продукта мАт6 Детергент Симетикон ЭХ
ВМС (%) ЭХ
основные (%) ЭХ
НМС (%) кИЭФ
кислые (%) кИЭФ
основные (%) кИЭФ
щелочные (%) Контроль ----- 1,62 97,8 0,58 32,85 65,08 2,07 Контроль 0,1% 1,70 97,7 0,57 34,07 63,89 2,04 Ecosurf EH-9 ----- 1,58 97,8 0,60 34,55 63,36 2,09 Triton CG-110 ----- 1,59 97,8 0,57 35,19 62,67 2,15 Triton CG-110 0,1% 1,78 97,6 0,58 33,31 64,41 2,29

Результаты обработки детергентом ± симетикон мАт7 HCCF приведены в таблице 24. Никакого существенного влияния на качество продукта не было отмечено в случае всех тестируемых условий. Несколько более высокий % кислых и более низкий % щелочных вариантов наблюдали в случае образцов, обработанных Triton CG-110. Изменение гликанов отсутствовало (данные не представлены).

Таблица 24.
Скрининг дополнительных молекул: влияние на качество продукта мАт7 Детергент Симетикон ЭХ
ВМС (%) ЭХ
основные (%) ЭХ
НМС (%) кИЭФ
кислые (%) кИЭФ
основные (%) кИЭФ
щелочные (%) Контроль ----- 3,75 96,2 0,03 30,62 66,1 3,28 Контроль 0,1% 3,82 96,2 0,02 31,67 65,17 3,16 Ecosurf EH-9 ----- 3,82 96,2 0,02 31,71 64,02 4,27 Triton CG-110 ----- 3,78 96,2 0,02 35,39 63,18 1,43 Triton CG-110 0,1% 3,77 96,2 0,02 32,48 65,69 1,83

Результаты обработки детергентом ± симетикон мАт8 HCCF приведены в таблице 25. Никакого влияния на качество продукта не было отмечено в случае всех тестируемых условий. Изменение гликанов отсутствовало (данные не представлены).

Таблица 25.
Скрининг дополнительных молекул: влияние на качество продукта мАт8 Детергент Симетикон ЭХ
ВМС (%) ЭХ
основные (%) ЭХ
НМС (%) кИЭФ
кислые (%) кИЭФ
основные (%) кИЭФ
щелочные (%) Контроль ----- 2,07 97,8 0,15 28,96 60,5 10,54 Контроль 0,1% 2,10 97,7 0,15 28,2 61,26 10,54 Ecosurf EH-9 ----- 2,06 97,8 0,16 28,04 61,51 10,45 Triton CG-110 ----- 2,04 97,8 0,16 28,67 60,96 10,37 Triton CG-110 0,1% 2,05 97,8 0,15 28,31 61,28 10,41

Результаты обработки детергентом ± симетикон мАт9 HCCF приведены в таблице 26. Никакого влияния на качество продукта не было отмечено в случае всех тестируемых условий. Изменение гликанов отсутствовало (данные не представлены).

Таблица 26.
Скрининг дополнительных молекул: влияние на качество продукта мАт9 Детергент Симетикон ЭХ
ВМС (%) ЭХ
основные (%) ЭХ
НМС (%) кИЭФ
кислые (%) кИЭФ
основные (%) кИЭФ
щелочные (%) Контроль ----- 6,76 93,0 0,25 44,65 41,07 14,29 Контроль 0,1% 6,95 92,9 0,14 42,2 43,11 14,69 Ecosurf EH-9 ----- 6,74 93,1 0,11 43,98 42,37 13,65 Triton CG-110 ----- 6,71 93,2 0,12 42,21 41,98 15,81 Triton CG-110 0,1% 6,76 93,1 0,12 44,64 42,76 12,6

Пример 4. Исследование барботирования

Четыре рассматриваемых детергента оценивали на вспенивание и эффективность симетикона в отношении подавления вспенивания.

Оцениваемые детергенты включали APG 325, Triton CG110, Ecosurf EH9 и Lutensol XP 90. Детергент (0,5%) добавляли к HCCF в двухлитровом ферментере. Растворы перемешивали со скоростью 50 об/мин. Ферментеры либо барботировали, либо не барботировали обычным воздухом со скоростью 10 стандартных кубических сантиметров в минуту (скс/мин). Пеногаситель, 1% симетикон, добавляли в количестве 2 мл/л культуры.

Ecosurf EH9 отличался меньшим вспениванием и образованием пузырей меньшего размера, чем алкил глюкозидные детергенты. При добавлении пеногасителя вся пена исчезала, и новая пена не образовывалась на протяжении 72 часов.

Triton CG110 приводил к образованию крупных воздушных пузырей. Добавление пеногасителя приводило к уменьшению, но не полному исчезновению пены. Новая пена не образовывалась на протяжении 72 часов.

APG 325N отличался быстрым образованием пены с крупными воздушными пузырями, которая выступала из сосуда. Добавление пеногасителя оказывало минимальный эффект на пену, и новая пена образовывалась после добавления пеногасителя. Напротив, при добавлении APG 325N к HCCF, которая не была барботирована, пены образовывалось мало, или она отсутствовала.

Пример 5. Стабильность двух детергентов.

Нестабильность Ecosurf EH9 была отмечена при анализе ЯМР. 10% маточный раствор Ecosurf EH9 выдерживали при комнатной температуре и при температуре 40°C и анализировали методом ЯМР в дни 0, 7, 15 и 36. Результаты приведены в таблице 17. Была обнаружена деградация и образование ароматических соединений.

Нестабильность Ecosurf EH9 была отмечена при ЯМР анализе. 10% маточные растворы Ecosurf EH-9 и Triton CG-110 выдерживали при комнатной температуре и при температуре 40°C и анализировали методом ЯМР в дни 0, 7, 15, 30 и 59. Результаты количественного определения продуктов деградации Ecosurf EH-9 приведены в таблице 27. Деградация и образование ароматических соединений были обнаружены в случае Ecosurf EH-9. На фигурах 5 и 6 приведены спектры ЯМР для испытываемых на стабильность образцов Triton CG-110 и Ecosurf EH-9, соответственно. Triton CG-110 является стабильным, незначительно изменяясь на протяжении срока вплоть до 59 дней. Напротив, образование продуктов деградации во время хранения раствора Ecosurf EH-9 можно было наглядно продемонстрировать.

Таблица 27.
Нестабильность Ecosurf EH9. Образец Всего деградировано (мкг/мл) Общее содержание ароматических соединений (мкг/мл) День 0 40°C 98,9 1,0 День 7 40°C 234,5 50,5 День 15 40°C 392,9 106,5 День 36 40°C 630,1 174,9 День 36
Комнатная температура 115,1 8,8

Кроме того, Ecosurf EH9 и Triton CG110 анализировали на образование пероксида в 10% (по объему) водном маточном растворе детергента на протяжении восьми недель. Использовали колориметрический тест на пероксид EMD Millipore 1.10001.0001. Результаты, выраженные в промилле, приведены в таблице 28. Исходные материалы и маточные растворы хранили при температуре окружающей среды и защищали от света обертыванием в фольгу. Исходный материал Ecosurf EH9 был открыт и повторно запечатан приблизительно за восемь месяцев до этого. Пероксид был обнаружен в исходном материале Ecosurf EH9 и 10% маточных растворах. Никакого поддающегося обнаружению пероксида (<0,5 промилле) не было найдено в маточных растворах Triton CG110 через восемь недель.

Таблица 28.
Образование пероксида (промилле). Детергент Лот # Коммен-
тарий T=0
4/18/13 T=2 недели T=4 недели T=6 недель T=8 недель Ecosurf EH9 A прозрачная фаза <0,5 ~2 Ecosurf EH9 A фаза осадка <0,5 ~2-3 Ecosurf EH9 A смесь <0,5 ~2 Ecosurf EH9 B открытый RM* ~0,5 ~2 ~4-5 ~5 ~7-8 Ecosurf EH9 B запеча-танный RM <0,5 ~4-5 Ecosurf EH9 C <0,5 ~0,5 Ecosurf EH9 D <0,5 ~4-5 Triton CG110 A открытый RM* <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 Triton CG110 B <0,5 <0,5 <0,5

Пример 6. Оценка EHS детергентов.

Оценивали двадцать один материал-кандидат в отношении влияния на здоровье и гигиену окружающей среды (EHS). Каждый материал был изучен для определения его основных физических и токсикологических характеристик. Эта информация относительно EHS была получена от производителей и из правительственных документов, и в сводной форме представлена в таблице 29.

Таблица 29.
Анализируемые детергенты Материал Общие характеристики Биоразлагаемость Данные по экотоксичности
(водная токсичность) Tween 20 (Полиоксиэтилен (20) монолаурат)
CAS #9005-64-5) Прозрачная желтая жидкость, неионный сурфактант, растворим в воде¹
Химическая формула: C₅₈H₁₁₄O₂₆
C₁₈H₃₄O₆(C₂H₄O)_n
MW:1227,54 г/моль Данные отсутствуют.
Плохая биоразлагаемость в соответствии с тестом Roche на первичную биоразлагаемость (OECD 302): 40% удаление TOC ко дню 28;
анаэробно разлагаемый Избегать сброса в окружающую среду
Данные по долгосрочной экотоксичности не доступны;
Хроническая токсичность неионных сурфактантов, как правило, проявляется в концентрациях > 0,1 мг/л.
Tween 20 может быть более токсичным, чем Tween 80
Данные для пресной воды:
EC₅₀ ≤100 мг/л 3 недели Selenastrum capricornutum
острая NOEC 10 мг/л (наивысшая тестированная концентрация, предел чувствительности теста) 48 ч Daphnia magna OECD 202
LC₅₀ 350 мг/л 1 д Poecilia reticulata
хроническая NOEC 10 мг/л (наивысшая тестированная концентрация, предел чувствительности теста) 21 д Daphnia magna OECD репро
предварительная острая PNEC для пресной воды 0,1 мг/л, обратите внимание, что результаты не надежны из-за данных по водорослям и рыбе;
невозможно вывести хроническую PNEC, поскольку отсутствуют данные по хронической NOEC для водорослей (или хронической NOEC для рыбы)
данные для морской воды:
острая LC₅₀ 1447 мг/л 1 д Artemia sp. (морские),
хроническая NOEC 10 мг/л разные (12 видов) морские микроводоросли (зеленые водоросли и цианобактерии) 10-12 д
хроническая NOEC 20 мг/л ~2 д, Sphaerechinus granularis (тест на эмбрионах-личинках морского ежа, обычно рассматривается как хроническая
предварительная хроническая PNEC для морской воды 0,2 мг/л, потребуется третья группа организмов для надежного определения PNEC для морской воды Tween 80 (Полиоксиэтилен (20) монолаурат)
(CAS #9005-65-6) Прозрачная жидкость желтого или янтарного цвета, неионный сурфактант, растворим в воде¹
Химическая формула: C₆₄H₁₂₄O₂₆
MW:1309,68 г/моль Данные отсутствуют.
Плохая биоразлагаемость в соответствии с тестом Roche на первичную биоразлагаемость (OECD 302): 50% удаление TOC ко дню 28;
анаэробно разлагаемый Данные по долгосрочной экотоксичности не доступны;
Хроническая токсичность неионных сурфактантов, как правило, проявляется в концентрациях >0,1 мг/л.
Tween 20 может быть более токсичным, чем Tween 80
Данные для пресной воды:
NOEC для водорослей 2 мг/л Chlorella vulgaris 96 ч;
EC₁₀ для водорослей(~NOEC) 6,99 мг/л Scenedesmus quadricauda 96 ч;
EC₅₀ ≥100 мг/л, ?NOEC 100 мг/л? 3 недели Selenastrum capricornutum
хроническая NOEC 100 мг/л 4 д Gloeocapsa (цианобактерия)
хроническая NOEC 250 мг/л 96 ч Tetrahymena pyriformis
NOEC смертности, но не репродуктивный параметр (L)OEC 10000 мг/л одна тестированная концентрация 16 д Oryzias latipes
данные по острой PNEC отсутствуют из-за недоступности ракообразных (дафний);
данные по хронической PNEC для пресной воды отсутствуют, поскольку Tetrahymena обычно не используют для выведения PNEC и 16-д тест на рыбе в действительности не является хроническим и соответствует LOEC
Данные для морской воды:
хроническая NOEC 10 мг/л разные (12 видов) морские микроводоросли 10-12 д
хроническая NOEC 20 мг/л ~2 д, Sphaerechinus granularis (тест на эмбрионах-личинках морского ежа, обычно рассматривается как хроническая
предварительная хроническая PNEC для морской воды 0,2 мг/л, потребуется третья или четвертая группа организмов для надежного определения PNEC для морской воды Трибутилфосфат (TBP)
CAS # 126-73-8) Желтая жидкость
Слегка растворим в воде
Фосфорорганическое соединение
Химическая формула: (C₄H₉O)₃PO
MW: 266,32 г/моль В воде, считается, что TBP адсорбируется на отложениях или твердых частицах и биологически разлагается
Сообщают о полной биодеградации в пределах от 0 до 100% в течение срока вплоть до 28 дней, возможно, по меньшей мере первично биоразлагаемый;
Показана адаптация при регулярном сбросе в POTW (>3 раз в неделю) предположительно полностью биоразлагаемый [3]
Биоконцентрирование не ожидается.2
Коэффициент биоконцентрирования 5-50, разные виды рыб, 14-38 дней, не биоаккумулируется Водные организмы.1
Данные по экотоксичности:1
Пресная вода:
96-час LC₅₀: 5 мг/л для радужной форели (Oncorhynchus mykiss)
96-час LC₅₀: 8,18 мг/л для толстоголового гольяна (Pimephales promelas) (поток во время теста)
96-час LC₅₀: 11,8 мг/л для полосатого данио (Brachydanio rerio) (статический тест)
96-час LC₅₀: 4,5 мг/л для японской медаки (Oryzias latipes)
Дополнительные данные по экотоксичности²
Водоросли:
72-час EC₅₀: 1,1 мг/л для биомассы в Scenedesmus subspicatus
48-час EC₅₀: 5-10 мг/л для Chlorella emersonii,
Хроническая токсичность:
NOEC: 0,82 мг/л (95-дневное исследование на ранней стадии жизни) для рыбы Какой рыбы, существует приблизительно 25000 видов?
NOEC: 0,87 мг/л (21-дневное исследование) для Daphnia magna?
NOEC: 0,37 мг/л для водорослей (биомасса в Scenedesmus) зеленые водоросли,
Дополнительные доступные данные, пожалуйста, документируйте все для правильного вывода PNEC, однако определенная хроническая PNEC для пресной воды составляет 0,037 мг/л
экстраполированная PNEC для морской воды 0,0037 мг/л (неточно) Safe Care1000
(SC-1000) Детергент растительного происхождения светло-янтарного цвета с pH приблизительно 10.
Растворим в воде.
Неионный этоксилат линейного спирта. Гидрофильно-липофильный баланс (HLB): 13,85 в пользу водной фазы.
MW: 224 г/моль
Биологический комплексообразователь, заменяющий ЭДТА. Имидо-сукцинат натрия Биоразлагаемый в концентрации 10 мг/л (67,5% ко дню 6) в течение 28-дневного периода. Не биоразлагаемый в концентрации 20 мг/л (37%) через 28 дней.2
Поскольку максимальное суточное использование ограничено POTW исходная концентрация примеси не выше 10 мг/л Считается нетоксичным веществом в водном окружении согласно MSDS.
Данные по экотоксичности:3
96-ч LC₅₀: ?? 66,5 мкг/л ?? для толстоголового гольяна (пресная вода);
96-ч LC₅₀: 26,4 мг/л для
Menidia beryllina (позвоночное животное, одобренное EPA для тестирования острой и хронической токсичности (морское)
48-час LC₅₀: 15,2 мг/л для Mysidopsis bahia (креветка, используемая в качестве водного тестируемого организма в соленой воде)
Не обнаружено других данных по экотоксичности, недостаточно для выведения PNEC Децил полиглюкозид
(CAS#68515-73-1) Светло-желтая жидкость, мягкий неионный сурфактант.
Растворим в воде.
Он (CAS #68515-73-1) принадлежит к более крупной химической группе алкил полиглюкозидных (APG) сурфактантов. Примерами являются децилглюкозид (C₁₆H₃₂O₆, CAS#58846-77-8), лаурилглюкозид (C₁₈H₃₆O₆, CAS#110615-47-9)
APGs не содержат фосфатов, алкилфенолэтоксилатов (APE), парадихлорбензола, 1,4-диоксана, гипохлорита натрия, NTA или натрий-ЭДТА 1.
Используется в косметических препаратах, включая детский шампунь, и в продуктах для чувствительной кожи APG сурфактанты являются полностью биоразлагаемыми (модифицированные скрининговые тесты OECD).
APG биологически разлагаются в канализационных системах.1
Алкил глюкозиды (C6, C8, C10 и C12) являются полностью биоразлагаемыми как в тесте «закрытой бутылки», так и в модифицированных скрининговых тестах OECD
Алкил полиглюкозиды (смеси) являются полностью биоразлагаемыми как в тесте «закрытой бутылки», так и в модифицированных скрининговых тестах OECD Данные не доступны
Не обнаружено других данных по экотоксичности
Алкил глюкозиды (C6, C8, C10) острая EC₅₀ >500 мг/л и C12 EC₅₀ >100 мг/л (> растворимость в воде), 24 ч Daphnia magna, большая токсичность для более гидрофобных веществ (обратите внимание: 24 ч, недостаточная продолжительность)
(Алкил глюкозиды нет данных по хронической токсичности)
Алкил полиглюкозиды (смеси) острая EC₅₀ в диапазоне от 37 до 137 мг/л 24 ч Dapnhia magna, большая токсичность для более гидрофобных смесей ((обратите внимание: 24 ч, недостаточная продолжительность)
Алкилполиглюкозиды (смеси) хроническая NOEC в диапазоне от 1,4 до 4,3 мг/л 21 д Daphnia magna, большая токсичность для более гидрофобных смесей
Недостаточно данных для PNEC
морские светоизлучающие бактерии (очень чувствительный вид, в настоящее время используется не часто, обычно не используется для выведения PNEC):
Алкил глюкозиды острая EC50: C6=490 мг/л; C8=11,7 мг/л; C10=7,9 мг/л; C12=8,8 мг/л), 30 мин Photobacterium phosphoreum, большая токсичность для более гидрофобных веществ
Алкил полиглюкозиды острая EC₅₀ в диапазоне от 5,9 до 16 мг/л, 30 мин Photobacterium phosphoreum, большая токсичность для более гидрофобных веществ
Недостаточно данных для PNEC Децил-бета-D глюкопиранозид
(CAS#58846-77-8)
также
н-децил-бета-D глюкопиранозид
с CAS#59122-55-3 Неионный детергент
Белый гранулированный порошок
Химическая формула: C₁₆H₃₂O₆
MW:320,42 г/моль
Обычно используется в шампунях, гелях для душа и красителях для волос. Данные не доступны Данные не доступны
Не обнаружено других данных по экотоксичности для обоих веществ
См. выше Лаурил глюкозид
(CAS#110615-47-9)
Также называемый додецил глюкозид Мягкий сурфактант
Мутная вязкая жидкость¹
Химическая формула: C₁₈H₃₆O₆
MW:348,47 г/моль
Он является близко родственным для децилглюкозида, его используют в косметике и получают из глюкозы и лаурилового спирта, используют в продуктах личной гигиены (например, очищающих средствах и шампунях). Данные не доступны Данные не доступны
Нет других данных по экотоксичности
См. выше н-октил глюкозид
(CAS#29836-26-8)
также называемый (октил-β-D-глюкопиранозид) Неионный детергент
Белый гранулированный порошок
Химическая формула: C₁₄H₂₈O₆ Данные не доступны Данные не доступны
Нет других данных по экотоксичности
См. выше Ecosurf EH-6
Ecosurf EH-9
(CAS#64366-70-7)
[2-этилгексанол EO-PO неионный сурфактант, >99% (64366-70-7)] Желтая жидкость, диспергируемая в воде
Состоит на более чем 99% из 2-этилгексанол EO-PO неионного сурфактанта.
Гидрофильно-липофильный баланс (HLB) для EH9: 12,5 Полностью биоразлагаемый согласно OECD 301F (более 60% при 28-д экспозиции).1
Первичная биоразлагаемость (OECD 302C) подтверждена³
Данные по полной биоразлагаемости сопоставимы с DOW MSDS³ Сообщается о водной токсичности в виде EC₅₀ или LC₅₀ (острой): от 10 до 100 мг/л.
Острая токсичность:
48-ч EC₅₀: 72,1 мг/л для водяной блохи Daphnia magna
72-ч EC₅₀: 31,9-97,7 мг/л (среднее геометрическое 55,8 мг/л) для зеленых водорослей (Desmodesmus subspicatus)
Хроническая токсичность:
21-дневная NOEC: 31,6 мг/л для водяной блохи Daphnia magna (OECD 211)
72-ч EC₁₀: 14,3 мг/л для водорослей (OECD 201)
хроническая PNEC для пресной воды 0,28 мг/л (обратите внимание: все еще некоторая неопределенность, поскольку доступны данные только по двум организмам)
Экстраполированная PNEC для морской воды 0,028 мг/л Ecosurf SA-7
Ecosurf SA-9
[спирты, C6-C12, этоксилированные пропоксилированные, 55-80% (68937-66-6); спирты, C10-16, этоксилированные-пропоксилированные, 15-40% (69227-22-1); поли(этиленоксид), 1-2% (25322-68-3)] Модифицированное масло семян, этоксилат спирта с 7 группами этиленоксида и 9 группами этиленоксида, соответственно. Полностью биоразлагаемый согласно OECD 301F (более 60% при 28-д экспозиции). Сообщается о водной токсичности в виде EC₅₀ или LC₅₀ (острой): от 10 до 100 мг/л.
Острая токсичность:
48-ч EC₅₀: 1,45-1,79 мг/л для водяной блохи Daphnia magna
72-ч EC₅₀: 1,45-1,75 мг/л для зеленых водорослей (Desmodesmus subspicatus)
Не обнаружено других данных по экотоксичности, недостаточно для выведения PNEC Lutensol XL
XL40, XL50, XL60, XL70, XL80 и XL90
(BASF) Разветвленные неионные сурфактанты, алкиловые эфиры полиэтиленгликоля на основе C10-спирта Гербе и этиленоксида.
Числовая часть названия продукта указывает на общую степень этоксилирования.
XL40, XL50, XL60, XL70, XL80 и XL90 являются прозрачными или мутными жидкостями при комнатной температуре. XL100 и XL140 представляют собой мягкую бесцветную или слегка желтоватую пасту при 23ºC.
XL79, XL89 and XL99 являются прозрачными жидкостями при комнатной температуре.
Растворимость в дистиллированной или питьевой воде варьируется от образования прозрачного раствора до нерастворимого состояния в зависимости от продукта.
Диапазон pH (5% водного раствора): 7
Диапазон средней MW: 380-860 г/моль Свыше 60% биоразложения ко дню 28 (метод OECD 301B - образование CO₂ относительно теоретического значения).
Обратите внимание: это не обязательно означает, что вещество полностью биоразлагаемое в соответствии со всеми критериями, однако оно является первично биоразлагаемым Острая токсичность для водных беспозвоночных (Daphnia magna): 48-ч EC₅₀: 1-10 мг/л для XL40 - XL50, 10-100 мг/л для XL60 - XL1001
Токсичность для водных растений (зеленые водоросли): 72-ч EC₅₀: 10-100 мг/л для XL40 - XL1001
Не обнаружено других данных по экотоксичности, недостаточно для выведения PNEC
Lutensol XL90: LC₅₀ >500 мг/л номинальная концентрация 96 ч Pimephales promelas [Alpha Analytical Labs, 12.05.2011]
острая PNEC для пресной воды Lutensol XL90=0,01 мг/л, только на основании диапазона для водорослей и дафний (10-100 мг/л для обоих)
экстраполированная острая PNEC для морской воды Lutensol XL90=0,001 мг/л Lutensol XP
XP30, XP40, XP50, XP60, XP69, XP70, XP79, XP80, XP89, XP90, XP99, XP100
И XP140. Сурфактанты Lutensol XP представляют собой алкиловые эфиры полиэтиленгликоля на основе C10-спирта Гербе и этиленоксида.
Числовая часть названия продукта указывает на общую степень этоксилирования (например, XP30 имеет 3 ЭО группы).
XP30, XP40, XP50, XP60, XP70, XP80 и XP90 являются прозрачными или мутными жидкостями при комнатной температуре. XP100 и XP140 представляют собой мягкую бесцветную или слегка желтоватую пасту при 23ºC.
XP69, XP79, XP89 и XP99 являются прозрачными жидкостями при комнатной температуре.
Растворимость в дистиллированной или питьевой воде варьируется от образования прозрачного раствора до нерастворимого состояния в зависимости от продукта.
Диапазон pH (5% водного раствора): 7
Диапазон средней MW: 290-750 г/моль Свыше 60% биоразложения ко дню 28 (метод OECD 301B - образование CO₂ относительно теоретического значения).1
Обратите внимание: это не обязательно означает, что вещество полностью биоразлагаемое в соответствии со всеми критериями, однако оно является первично биоразлагаемым Острая токсичность для водных беспозвоночных (Daphnia magna): 48-ч EC₅₀: 1-10 мг/л для XP40 - XP50, 10-100 мг/л для XP60 - XP100, >100 мг/л для XP1401
Токсичность для водных растений (зеленые водоросли): 72-ч EC₅₀: 10-100 мг/л для XP40 - XP100, свыше 100 мг/л для XP1401
Не обнаружено других данных по экотоксичности, недостаточно для выведения PNEC
Lutensol XP90: LC50 >500 мг/л номинальная концентрация 96 ч Pimephales promelas [Alpha Analytical Labs, 12.05.2011]
острая PNEC для пресной воды Lutensol XP90=0,01 мг/л, только на основании диапазона для водорослей и дафний (10-100 мг/л для обоих)
экстраполированная острая PNEC для морской воды Lutensol XP90=0,001 мг/л Inoterra RAC Неионный сурфактант, используемый в ополаскивателях.
Прозрачная или желтая жидкость,
Растворим в воде
pH: приблизительно 7 Полностью биоразлагаемый
≥90% по данным модифицированного теста OECD 303A
>60% согласно OECD 301B1 Продукт не содержит органически связанных галогенов.
Острая токсичность для водных беспозвоночных (Daphnia magna): 48-ч EC₅₀: 10-100 мг/л.1
Токсичность для водных растений (зеленые водоросли): 72-ч EC₅₀: 10-100 мг/л (OECD 201)
Не обнаружено других данных по экотоксичности, недостаточно для выведения PNEC Natsurf 265
(CAS#27252-75-1) Неионный сурфактант
Прозрачная или мутноватая жидкость/
Частично растворим в воде
pH: 5,5-7,0
Стабилен
Опасные продукты разложения включает оксиды углерода Данные не доступны Данные не доступны
Не обнаружено других данных по экотоксичности, недостаточно для выведения PNEC Сурфактант Chembetaine LEC [лаурамидопропил бетаин, 32% (4292-10-8),
(Lubrizol)] Сурфактант Chembetaine LEC представляет собой высокочистый слабо окрашенный сурфактант, имеющий отличные характеристики пенообразования и вязкости.1
Бледно-желтая прозрачная жидкость.
Растворим в воде
pH: 8-9
Используется в увлажняющих шампунях. В конечном итоге биоразлагаемый
лаурамидопропил бетаин:
полностью биоразлагаемый Данные не доступны
Не обнаружено других данных по экотоксичности APG 325N
(CAS#132778-08-6)
также называемый децил/ундецил глюкозид Желтоватая или прозрачная жидкость
Водный раствор алкил полиглюкозидов на основе синтетического жирного спирта C9-C11.
pH: 7-9,5, Растворим в воде.
Принадлежит к алкидполиглюкозидным детергентам, используется в чистящих средствах для твердой поверхности. В соответствии с MSDS, биоразлагаемый до по меньшей мере 90% в среднем согласно обязательным стандартам ЕС для детергентов 82/242 (неионные сурфактанты) и 82/243/EEC (анионные сурфактанты). Острая токсичность: LC₅₀ > 1-10 мг/л для рыбы
Острая бактериальная токсичность: EC₀> 100 мг/л (чистого продукта)
Не обнаружено других данных по экотоксичности, недостаточно для выведения PNEC
APG325N: LC₅₀ >500 мг/л номинальная концентрация 96 ч Pimephales promelas [Alpha Analytical Labs, 12.05.2011] Mackol DG
(CAS#110615-47-9) Желтая вязкая жидкость с характерным запахом
Состав: 53-57% D- глюкопиранозы, олигомерный, децилоктилгликозид и более 47% воды
Растворим в воде
Удельная масса: 1,1
pH: 3-5 при 100% весовых%
Используется в шампунях, моющих средствах для тела, гелях для душа, очищающих средствах для лица Не обнаружено других данных по экотоксичности Triton CG-110
(CAS#68515-73-1) Коричневая жидкость
также называемый алкилполиглюкозид
Неионный сурфактант
Состав: 58-62% D- глюкопиранозы, олигомерный, децилоктил гликозид и более 38% воды
Растворим в воде
Удельная масса: 1,15
pH: 5,8
Молекулярная масса не известна
Применение: чистящие средства для стекла, сильнощелочные детергенты, чистящие средства в процессе обработки пищевых и молочных продуктов, продукты личной гигиены: шампуни, мыла, кремы для кожи, лосьоны, средства для ручного мытья посуды Считается полностью биоразлагаемым
>60% в соответствии с OECD 301F и OECD 311
>70% в соответствии с OECD 303A Для этого семейства материалов: Считаются нетоксичными для водных организмов в плане острой токсичности.
LC₅₀/EC₅₀/LL₅₀> 100 мг/л
96-ч LC₅₀ (статическая): 190-198 мг/л для толстоголового гольяна
48-ч EC₅₀ (иммобилизация):150-294 мг/л для водяной блохи Daphnia m.
72-ч ErC₅₀ (ингибирование скорости роста): 189 мг/л для зеленых водорослей (Pseudokirchneriella subspicatus)
EC₅₀ 20 мг/л 48 ч Daphnia magna
EC₅₀ 21 мг/л 72 ч Selenastrum capricornutum
острая PNEC для пресной воды 0,02 мг/л
экстраполированная PNEC для морской воды 0,002 мг/л Tomadol@900
(CAS# 68439-46-3) Прозрачная жидкость со слабым запахом
Неионный сурфактант Состав: 100% этоксилат спирта
не содержит фенольные соединения3
Слегка растворим в воде, может образовывать гель
Удельная масса: 0,98
pH (1% водн.): 6,5
Молекулярная масса: 460 г/моль Классифицирован в руководстве EPA как полностью биоразлагаемый Водная токсичность1:
дафния: 1-10 мг/л
рыба: 1-10 мг/л
Основано на сравнении с аналогичными продуктами
Водная токсичность4:
Пресная вода:
48-ч EC₅₀: 5,3 мг/л для дафний
96-ч LC₅₀: 8,5 мг/л для толстоголового гольяна
LC₅₀ >5 мг/л номинальная концентрация (500 мг 1% водного раствора на литр) 96 ч Pimephales promelas
хроническая NOEC 1,01 мг/л 28 дней Pimephales promelas тест на ранних стадиях жизни
хроническая NOEC 2,04 мг/л 30 д на нескольких группах беспозвоночных организмов (Copepoda, Cladocera, Annelida, Nematoda, Diptera, Amphipoda) в потоке мезокосма
замечания по токсичности для водорослей в классе веществ, EC₅₀ от 0,05 до 50 мг/л, но не пригодно для выведения PNEC
Хроническая PNEC для пресной воды 0,02 мг/л, на основании более чем двух групп организмов, но не первичных продуцентов, следовательно, будет крайне полезно провести тесты на рост водорослей и цианобактерий.

Пять из материалов-кандидатов были выбраны для дальнейшего изучения экотоксичности:

Ecosurf EH-9

Triton CG-110

Tomadol

APG 325

Lutensol XP-90

Целью изучения экотоксичности было установление для каждого материала-кандидата наивысшей концентрации, при которой материал-кандидат не будет представлять существенной опасности для водных организмов. Эта концентрация называется прогнозируемой безопасной концентрацией (PNEC), и методы, используемые для получения конкретных значений PNEC для материалов-кандидатов, подробно описаны в Техническом руководящем документе (TGD) Европейского Союза по оценке риска, 2003.

Для определения PNEC каждый из данных пяти материалов-кандидатов оценивали с использованием методов тестирования Организации экономического сотрудничества и развития (OECD) для определения ингибирования дыхания активного ила (OECD 209), ингибирования роста водорослей (OECD 201), острой иммобилизации дафний (OECD 202), возможного нарушения репродуктивной функции дафний (OECD 211) и острой токсичности для рыбы (OECD 203).

В этих исследованиях были определены как PNEC для очистных сооружений, принимающих производственные сточные воды, PNEC_STP, так и PNEC для приемного водоема, PNEC_RW.

Использование материалов-кандидатов на производственных площадках приведет к созданию концентрации материалов-кандидатов как в очистных сооружениях, называемой прогнозируемой концентрацией в окружающей среде для очистных сооружений (PEC_STP), так и в приемных водоемах, называемой прогнозируемой концентрацией в окружающей среде для приемных водоемов (PEC_RW). В очистных сооружениях также происходит удаление части материалов-кандидатов из сточных вод, количества, которое было рассчитано для каждого из материалов-кандидатов в процессе тестирования с использованием теста OECD на полную биоразлагаемость (OECD 301F).

Данное сравнение показателей PEC с показателями PNEC для пяти материалов-кандидатов позволяет создать полезный профиль экологической чистоты. Материал-кандидат считался экологически чистым, если его величина PEC была ниже, чем его величина PNEC.

Изобретение относится к медицине и касается инактивации вируса в потоке исходных материалов продукта в процессе производства терапевтического полипептида. Способ включает этап обработки потока исходных материалов детергентом, при этом детергент является экологически безопасным. Экологически безопасный детергент имеет регистрационный номер CAS: CAS 68515-73-1, CAS 58846-77-8, CAS 59122-55-3, CAS 110615-47-9, CAS 64366-70-7, CAS 68937-66-6, CAS 69227-22-1, CAS 27252-75-1 или CAS 132778-08-6. Использование экологически безопасного детергента не влияет отрицательно на качество продукта, при этом эффективно инактивируя вирус в потоке исходных материалов. 54 з.п. ф-лы, 6 ил., 29 табл., 6 пр.

1. Способ инактивации вируса в потоке исходных материалов продукта в процессе производства терапевтического полипептида, включающий этап обработки потока исходных материалов детергентом, при этом детергент является экологически безопасным, где экологически безопасный детергент имеет регистрационный номер CAS: CAS 68515-73-1, CAS 58846-77-8, CAS 59122-55-3, CAS 110615-47-9, CAS 64366-70-7, CAS 68937-66-6, CAS 69227-22-1, CAS 27252-75-1 или CAS 132778-08-6.

2. Способ по п. 1, позволяющий сохранять качество терапевтического полипептидного продукта по сравнению со способом с использованием Triton X-100 или способом без использования детергента.

3. Способ по п. 2, в котором сохранение качества терапевтического полипептидного продукта заключается в изменении содержания вариантов продукта не более чем на 5% от всего количества полипептида в потоке исходных материалов продукта.

4. Способ по п. 3, в котором содержание вариантов продукта не возрастает более чем на 5% от общего содержания полипептида в потоке исходных материалов продукта.

5. Способ по п. 3, в котором варианты продукта представляют собой варианты по размеру, варианты по заряду, окисленные варианты, дезамидированные варианты, гликированные варианты или варианты с измененными гликановыми профилями.

6. Способ по любому из пп. 3-5, в котором варианты продукта представляют собой кислые и/или щелочные варианты продукта.

7. Способ по любому из пп. 1-5, в котором обработка потока исходных материалов детергентом не приводит к увеличению фрагментации полипептида более чем на 5%.

8. Способ по любому из пп. 1-5, в котором обработка потока исходных материалов детергентом не приводит к увеличению агрегации в потоке исходных материалов более чем на 5%.

9. Способ по любому из пп. 1-5, в котором обработка потока исходных материалов детергентом не приводит к снижению выхода полипептида в производственном процессе более чем на 5%.

10. Способ по любому из пп. 1-5, в котором детергент добавляют к потоку исходных материалов до конечной концентрации от 0,01% до 10%.

11. Способ по любому из пп. 1-5, в котором детергент добавляют к потоку исходных материалов до конечной концентрации от 0,3% до 1%.

12. Способ по любому из пп. 1-5, в котором поток исходных материалов обрабатывают детергентом в течение периода времени от по меньшей мере 1 минуты до по меньшей мере 48 часов.

13. Способ по любому из пп. 1-5, в котором поток исходных материалов обрабатывают детергентом в течение периода времени от по меньшей мере 15 минут до по меньшей мере 3 часов.

14. Способ по любому из пп. 1-5, в котором поток исходных материалов обрабатывают детергентом в течение по меньшей мере 1 часа.

15. Способ по любому из пп. 1-5, в котором поток исходных материалов обрабатывают детергентом при температуре от 4°C до 30°C.

16. Способ по любому из пп. 1-5, в котором поток исходных материалов обрабатывают детергентом при температуре от 15°C до 20°C.

17. Способ по любому из пп. 1-5, в котором детергент представляет собой неионный детергент или цвиттерионный детергент.

18. Способ по любому из пп. 1-5, в котором детергент имеет гидрофильно-липофильный баланс (ГЛБ) от 12 до 15.

19. Способ по любому из пп. 1-5, в котором детергент не содержит или не образует октилфенол.

20. Способ по любому из пп. 1-5, в котором детергент не содержит или не образует пероксид.

21. Способ по любому из пп. 1-5, в котором поток исходных материалов, содержащий детергент, имеет низкую мутность.

22. Способ по любому из пп. 1-5, в котором добавление детергента к потоку исходных материалов не приводит к увеличению мутности потока исходных материалов.

23. Способ по любому из пп. 1-5, в котором при сбросе прогнозируемая концентрация в окружающей среде (PEC) детергента в приемном водоеме, возникающая в результате использования детергента, находится ниже уровня прогнозируемой безопасной концентрации (PNEC) детергента.

24. Способ по п. 23, в котором PEC является меньше, чем PNEC.

25. Способ по любому из пп. 1-5, в котором детергент содержит один или более сурфактантов.

26. Способ по любому из пп. 1-5, в котором детергент содержит один или более сурфактантов, консервантов и хелатообразующих агентов.

27. Способ по любому из пп. 1-5, в котором поток исходных материалов содержит собранную культуральную жидкость клеток.

28. Способ по п. 27, в котором детергент добавляют к собранной культуральной жидкости клеток.

29. Способ по любому из пп. 1-5, в котором поток исходных материалов содержит пул захваченного или пул извлеченного продукта.

30. Способ по п. 29, в котором пул захваченного или пул извлеченного продукта представляет собой пул после аффинной хроматографии.

31. Способ по п. 29, в котором пул захваченного или пул извлеченного продукта представляет собой пул после белка A, пул после белка G или пул после белка L.

32. Способ по п. 29, в котором пул захваченного или пул извлеченного продукта представляет собой пул после хроматографии смешанного типа.

33. Способ по п. 29, в котором пул захваченного продукта представляет собой пул после CaptoAdhere.

34. Способ по любому из пп. 1-5, в котором детергент используют в сочетании с пеногасителем.

35. Способ по п. 34, в котором пеногаситель представляет собой симетикон.

36. Способ по любому из пп. 1-5, в котором вирус представляет собой оболочечный вирус.

37. Способ по любому из пп. 1-5, в котором вирус представляет собой ретровирус, герпесвирус, флавивирус, поксвирус, гепаднавирус, вирус гепатита, ортомиксовирус, парамиксовирус, рабдовирус или тогавирус.

38. Способ по любому из пп. 1-5, в котором логарифмический показатель снижения концентрации вируса (LRV) для детергента в потоке исходных материалов составляет более единицы.

39. Способ по любому из пп. 1-5, в котором вирусный показатель LRV составляет более четырех.

40. Способ по п. 38, в котором LRV рассчитывают на основании анализа инфекционности.

41. Способ по п. 40, в котором анализ инфекционности представляет собой анализ бляшкообразования или анализ TCID₅₀.

42. Способ по любому из пп. 1-5, дополнительно включающий стадию фильтрования потока исходных материалов после добавления детергента.

43. Способ по п. 42, в котором поток исходных материалов фильтруют через период времени от по меньшей мере 15 минут до по меньшей мере 48 часов после добавления детергента.

44. Способ по п. 42, в котором поток исходных материалов фильтруют через период времени от по меньшей мере 1 часа до по меньшей мере 3 часов после добавления детергента.

45. Способ по п. 42, в котором поток исходных материалов фильтруют через 1 час после добавления детергента.

46. Способ по п. 42, в котором фильтр представляет собой ультрафильтр или глубинный фильтр.

47. Способ по любому из пп. 1-5, в котором поток исходных материалов подвергают хроматографии после добавления детергента.

48. Способ по п. 47, в котором хроматография представляет собой одну или более из аффинной хроматографии, ионообменной хроматографии, хроматографии гидрофобного взаимодействия, хроматографии на гидроксиапатите или хроматографии смешанного типа.

49. Способ по п. 48, в котором аффинная хроматография представляет собой хроматографию на основе белка A, хроматографию на основе белка G или хроматографию на основе белка L.

50. Способ по п. 48, в котором ионообменная хроматография представляет собой анионообменную хроматографию или катионообменную хроматографию.

51. Способ по п. 48, в котором хроматография смешанного типа представляет собой хроматографию CaptoAdhere.

52. Способ по любому из пп. 1-5, в котором терапевтический полипептид представляет собой антитело, иммуноадгезин, фермент, фактор роста, рецептор, гормон, регуляторный фактор, цитокин, Fc-слитый полипептид, антиген или связующее вещество.

53. Способ по п. 52, в котором антитело представляет собой моноклональное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело, человеческое антитело, биспецифическое антитело или фрагмент антитела.

54. Способ по любому из пп. 1-5, в котором терапевтический полипептид получают в клетках млекопитающих.

55. Способ по п. 54, в котором линия клеток млекопитающего представляет собой клетки яичника китайского хомячка (CHO) или клетки почки новорожденного хомячка (BHK), клетки мышиной гибридомы или клетки мышиной миеломы.