4-(2,4-ДИМЕТОКСИФЕНИЛ)-2-(2-ГИДРОКСИФЕНИЛ)-5,6-ДИГИДРО-4Н-БЕНЗО[H]ХРОМЕН-3-КАРБОНОВАЯ КИСЛОТА, ОБЛАДАЮЩАЯ ЦИТОТОКСИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2019 года по МПК C07D311/92 A61K31/352 A61P35/00 

Изобретение относится к области органической химии, конкретно - к получению 4-(2,4-диметоксифенил)-2-(2-гидроксифенил)-5,6-дигидро-4Н-бензо[h]хромен-3-карбоновой кислоты, обладающей цитотоксической активностью, в частности - способностью подавлять метаболическую активность клеточных линий почки эмбрионов свиньи, несущих онковирусы А и С (SPEV), глиомы крысы (С6), раковой опухоли шейки матки человека (HeLa), и может быть перспективно в медицинской практике для лечения раковых заболеваний.

Известны соединения, проявляющие цитотоксическую активность по отношению ко многим видам опухолевых клеток.

К таким соединениям относятся алкалоид ряда комбретастатин А-4 и его производные, а также 4-арилкумарины и другие. Однако, каждый из них имеет недостатки.

Недостатком комбретастатина А-4 (см., например, патент США №4996237, по кл. МПК С07С 43/23, C07D 317/64, А61К 31/075, опубл. 26.02.1991) и его производных (см. заявку США №2009186857, по кл. МПК А61К 31/66, опубл. 23.07.2009) является низкая эффективность за счет нежелательных побочных эффектов при применении in vivo вследствие их самопроизвольного превращения из активной цис-формы в неактивную транс-форму (Curr. Opin. Pharmacol., 2001, 1,370).

4-Арилкумарины проявляют низкую антипролиферацинную и апоптозиндуцирующую активность по сравнению с производными комбретастатина и колхицина (J. Med. Chem. 2003, 46, 5437; J. Med. Chem. 2011, 54, 3153).

Известно также соединение диэтил (3,5-бис(арилиден)-4-оксопиперидин-1-ил)(арил) метилфосфоната формулы

где R¹=H, F, OMe; R²=H, F,

обладающее антипролиферативными свойствами и низкой острой токсичностью для лечения онкологических заболеваний, включая рабдомиосаркому, карциному кишечника, аденокарциному молочной железы (см. патент РФ №2603194 по кл. МПК C07F 9/59, опуб.27.11.2016).

Известны также халконы, проявляющие цитотоксические свойства (см. Shih Н. et al. Rational design, synthesis and structure-activity relationships of antitumor (E)-2-benzylidene-l-tetralones and (E)-2-benzylidene-l-indanones // Bioorganic & medicinal chemistry letters. - 2000. - T. 10. - №. 5. - C. 487-490). Анализ противоопухолевой активности 2-(R-бензилиден)-3,4-дигидронафтален-1(2Н)-онов, проведенный на клеточной линии Jukart (Т-лимфобластная лейкемия человека) показал, что значения концентрации полумаксимального ингибирования IC₅₀ зависят от характера радикала в ароматическом кольце.

Так, соединения формулы

где R представляет собой 3'-ОСН₃, или 3'-Cl, или 3'-NO₂, или 3'-СН₃; или 3',5'-ОСН₃, или 3',5'-СН₃; или 3',5'-Cl, или 3',5'-NO₂, показали хорошие результаты. Значение IC₅₀ колебалось в пределах от 2 до 19 мМ (в зависимости от радикала).

Кроме этого, противоопухолевая активность соединений 2-(R-бензилиден)-3,4-дигидронафтален-1(2Н)-онов, где R представляет собой 3'-ОСН₃, или 3'-Cl, или 3'-NO₂, или 3'-СН₃, 4'-ОСН₃ была исследована и на других клеточных линиях - на лейкозных мышиных клетках Р388 (лимфоидная неоплазма мышей) и L 1210 (лимфатическая лейкемия), а также на человеческих клетках Molt 4/С8 и СЕМ Т-лимфоцитах (Т-лимфобластная лейкемия).

Известны также замещенные соединения (см. патент РФ №2203883 по кл. МПК С07С 49/84, опуб. 10.05.2003) общей формулы

где Ar - фенил, который может быть незамещенным, либо замещенным одним, двумя либо тремя заместителями, независимо выбираемыми из числа Cl, Br, F, -ОМе, NO₂, CF₃, С_1-4 низшего алкила, -NMe₂, -NEt₂, -SCH₃, -NHCOCH₃; 2-тиенил, 2-фурил; 3-пиридил; 4-пиридил либо 3-индолил; R - -OCH₂R₁, где R₁ выбирают из числа -СН=СМе₂, -СМе=СН₂, -С≡СН; при условии, что в случае, когда Ar представляет собой фенил, С₄-алкилфенил, 4-метоксифенил или 3,4-диметоксифенил, R может быть любым за исключением 3-метил-2-бутенилоксигруппы.

Упомянутые соединения обладают антипролиферативной активностью как в отношении чувствительных раковых клеток, так и клеток, устойчивых к традиционным химиотерапевтическим лекарственным препаратам.

Изобретение направлено на решение проблемы расширения арсенала средств, обладающих цитотоксическим действием, которые могут быть использованы в качестве активных компонентов противоопухолевых лекарственных средств.

Заявляемая проблема решается тем, что арилиденовое производное 3,4-дигидро-1(2Н)-нафталенона, обладающее цитотоксической активностью, представляет собой соединение формулы

Заявляемое соединение: 4-(2,4-Диметоксифенил)-2-(2-гидроксифенил)-5,6-дигидро-4Н-бензо[h]хромен-3-карбоновая кислота синтезировано одностадийным технологичным методом в результате трехкомпонентной реакции 3,4-дигидронафтален-1(2Н)-она, 2,4-диметоксибензальдегида и 4-гидроксикумарина(4-гидрокси-2Н-хромен-2-она) в уксусной кислоте в присутствии пиперидина при микроволновой активации (мощность 600 Вт). Последняя приводит к раскрытию лактонного фрагмента гибридного интермедиата. Такого рода превращение дает основание для механизма реакции через образование 2-(2,4-диметоксибензилиден)-3,4-дигидронафтален-1(2Н)-она (соединения по первому варианту, где R₁ =R₂ =ОСН3), которое является базовым для формирования 4-(2,4-диметоксифенил)-2-(2-гидроксифенил)-5,6-дигидро-4Н-бензо[h]хромен-3 -карбоновой кислоты.

Изобретение иллюстрируется чертежами, где представлены графики метаболической активности клеточных линий при воздействии на них заявляемого соединения, при этом:

- на фиг. 1 представлен график метаболической активности клеточной линии С6;

- на фиг. 2 представлен график метаболической активности клеточной линии SPEV;

- на фиг. 3 представлен график метаболической активности клеточной линии HELA.

Получение нового соединения и испытание его цитотоксической активности иллюстрируется следующим примером.

Пример. Синтез 4-(2,4-диметоксифенил)-2-(2-гидроксифенил)-5,6-дигидро-4Н-бензо[h]хромен-3-карбоновой кислоты.

К 1.19 г (7.5 ммоль) 2,4-диметоксибензальдегида добавляют 1.00 г (7.5 ммоль) 3,4-дигидронафтален-1(2Н)-она и 1.15 г (7.5 ммоль) 4-гидрокси-2Н-хромен-2-она. К полученной смеси прибавляют 0.5 мл ледяной уксусной кислоты для гомогенизации и 0.1 мл катализатора пиперидина. Реакционную смесь подвергают воздействию микроволнового излучения мощностью 600 Вт в течение 45 минут. Образовавшиеся кристаллы обрабатывают гексаном, промывают водой и сушат. Получают 2,27 г (66.4%) 4-(2,4-диметоксифенил)-2-(2-гидроксифенил)-5,6-дигидро-4Н-бензо[h]хромен-3-карбоновой кислоты, Т.пл. 50-51°С. Спектр ЯМР ¹H (CDCl₃), δ, м.д.: 2.97 (т, 2Н, СН_2(тетр)), 3.06 (т, 2Н, СН_2(тетр)), 3.85 (с, 6Н, ОСН₃), 5.36 (с. 1Н, ОН), 5.61 (с. 1Н, СН), 6.45-8.22 (м. 11Н, Ar). Найдено, %: С 73.39, Н 5.41. C₂₈H₂₄O₆. Вычислено, %: С 73.67, Н 5.30.

Цитотоксичность 4-(2,4-диметоксифенил)-2-(2-гидроксифенил)-5,6-дигидро-4Н-бензо[h]хромен-3-карбоновой кислоты определяли с помощью МТТ-теста на культурах клеток почек эмбрионов свиньи, несущих онковирусы А и С (SPEV), клеток глиомы крысы (С6) и раковой опухоли шейки матки человека (HeLa). В основе МТТ-теста лежит способность живых клеток восстанавливать желтый бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-тетразолия (МТТ) в пурпурно-синие внутриклеточные кристаллы МТТ-формазана, растворимые в ДМСО. Уменьшение оптической плотности опытных проб по сравнению с контрольными, регистрируемое на планшетном спектрофотометре, свидетельствует о цитотоксическом действии изучаемых веществ на клетки.

Клетки линий SPEV, С6 (глиома) и HeLa клон 11, суспендированные в питательной среде, вносили в лунки 96-луночных полистироловьгх планшетов (в одну лунку вносили 200 мкл среды и примерно 50000 клеток соответствующей линии). Питательная среда представляла собой среду ДМЕМ с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, а также антибиотиков пенициллина (50 м.ед./мл) и стрептомицина (50 мкг/мл) для предотвращения бактериальной контаминации. Культуры выращивали в атмосфере СО₂-инкубатора в течение 2-х суток до образования монослоя клеток с 70%-ой плотностью насыщения.

Тестируемые вещества растворяли в ДМСО до наибольшей концентрации. Предельная концентрация соединения 1 составила 55,56 мг/мл, соединения 2-50 мг/мл, а соединения 3-52,63 мг/мл.

После 48 часов инкубации к культурам клеток добавляли методом раститровки различные концентрации исследуемых соединений. Каждую концентрацию применяли в трех повторностях. В качестве начального разведения образцов использовали разведение 1:100 в питательной среде. В контрольные лунки добавляли растворитель ДМСО в концентрации 1%. Планшеты с внесенными соединениями снова помещали в СО₂-инкубатор на 24 часа.

Для определения дыхательной активности реактив МТТ растворяли в забуференном физиологическом растворе до концентрации 1 мг/мл.

После 72 часов инкубации клеточных линий с тестируемыми веществами лунки планшетов освобождали от среды и вносили в них по 100 мкл раствора МТТ. Планшеты помещали на 1 час в CO₂-инкубатор, затем жидкость из лунок удаляли, вносили в них по 200 мкл раствора ДМСО и инкубировали 10 мин при 37С° в термостате.

С помощью спектрофотометра планшетного формата определяли оптическую плотность полученных образцов при длине волны 540 нм и вычитали измеренное фоновое поглощение при длине волны 690 нм. Дыхательную активность контрольных образцов принимали за 100%.

В Таблице и на фиг. 1, 2, 3 представлены результаты определения метаболической активности клеточных линий С6, SPEV и HeLa при воздействии на них заявляемого соединения в максимальной использованной концентрации.

Из приведенных данных следует, что заявляемое соединение 4-(2,4-диметоксифенил)-2-(2-гидроксифенил)-5,6-дигидро-4Н-бензо[h]хромен-3-карбоновая кислота в максимальной использованной концентрации подавляет метаболическую активность клеточных линии С6, SPEV и HeLa

Таким образом, заявляемое соединение может быть перспективно для создания препаратов, направленных на лечение раковых заболеваний.

Настоящее изобретение относится к 4-(2,4-диметоксифенил)-2-(2-гидроксифенил)-5,6-дигидро-4Н-бензо[h]хромен-3-карбоновой кислоте указанной формулы, обладающей цитотоксической активностью. 1 табл., 3 ил., 1 пр.

4-(2,4-диметоксифенил)-2-(2-гидроксифенил)-5,6-дигидро-4Н-бензо[h]хромен-3-карбоновая кислота, обладающая цитотоксической активностью, формулы