СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ЦИТОТОКСИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2020 года по МПК A61K31/192 C07C15/27 A61P35/00 A61P35/02 

Изобретение относится к области органической химии, а именно - к средствам, обладающим цитотоксической активностью, в частности - способностью подавлять метаболическую активность клеточных линий почки эмбрионов свиньи, несущих онковирусы А и С (SPEV), глиомы крысы (С6), раковой опухоли шейки матки человека (HeLa), и может быть перспективно в медицинской практике для лечения раковых заболеваний.

Известны соединения, проявляющие цитотоксическую активность по отношению ко многим видам опухолевых клеток.

К таким соединениям относятся алкалоид ряда комбретастатин A-4 и его производные, а также 4-арилкумарины и другие. Однако, каждый из них имеет недостатки.

Недостатком комбретастатина A-4 (см., например, патент США № 4996237, по кл. МПК С07С 43/23, C07D 317/64, А61К 31/075, опубл.26.02.1991) и его производных (см. заявку США № 2009186857, по кл. МПК A61K 31/66, опубл. 23.07.2009) является низкая эффективность за счет нежелательных побочных эффектов при применении in vivo вследствие их самопроизвольного превращения из активной цис-формы в неактивную транс-форму (Curr. Opin. Pharmacol., 2001, 1,370).

4-Aрилкумарины проявляют низкую антипролиферацинную и апоптозиндуцирующую активность по сравнению с производными комбретастатина и колхицина (J. Med. Chem. 2003, 46, 5437; J. Med. Chem. 2011, 54, 3153).

Известно также соединение диэтил (3,5-бис(арилиден)-4-оксопиперидин-1-ил)(арил) метилфосфонатa формулы

где R¹=Н, F, ОМе; R²=Н, F,

обладающее антипролиферативными свойствами и низкой острой токсичностью для лечения онкологических заболеваний, включая рабдомиосаркому, карциному кишечника, аденокарциному молочной железы (см. патент РФ №2603194 по кл. МПК C07F 9/59, опуб.27.11.2016).

Известны также халконы, проявляющие цитотоксические свойства (см. Shih H. et al. Rational design, synthesis and structure-activity relationships of antitumor (E)-2-benzylidene-1-tetralones and (E)-2-benzylidene-1-indanones //Bioorganic & medicinal chemistry letters. - 2000. - Т. 10. - №. 5. - С. 487-490). Анализ противоопухолевой активности 2-(R-бензилиден)-3,4-дигидронафтален-1(2Н)-онов, проведенный на клеточной линии Jukart (Т-лимфобластная лейкемия человека) показал, что значения концентрации полумаксимального ингибирования IC₅₀ зависят от характера радикала в ароматическом кольце. Так, соединения формулы

где R представляет собой 3’-OCH₃, или 3’-Cl, или 3’-NO₂, или 3’-CH₃, или 3’,5’-OCH₃, или 3’,5’-CH₃, или 3’,5’-Cl, или 3’,5’-NO_2, показали хорошие результаты. Значение IC₅₀ колебалось в пределах от 2 до 19 мМ (в зависимости от радикала).

Кроме этого, противоопухолевая активность соединений 2-(R-бензилиден)-3,4-дигидронафтален-1(2Н)-онов, где R представляет собой 3’-OCH_3, или 3’-Cl, или 3’-NO₂, или 3’-CH_3, 4’-OCH₃ была исследована и на других клеточных линиях - на лейкозных мышиных клетках Р388 (лимфоидная неоплазма мышей) и L 1210 (лимфатическая лейкемия), а также на человеческих клетках Molt 4/C8 и CEM T-лимфоцитах (Т-лимфобластная лейкемия).

Известны также замещенные соединения (см. патент РФ №2203883 по кл. МПК С07С49/84, опуб. 10.05.2003) общей формулы

где Ar - фенил, который может быть незамещенным, либо замещенным одним, двумя либо тремя заместителями, независимо выбираемыми из числа Cl, Br, F, -OMe, NO₂, CF₃, C_1-4 низшего алкила, -NMe₂, -NEt₂, -SCH₃, -NHCOCH₃; 2-тиенил, 2-фурил; 3-пиридил; 4-пиридил либо 3-индолил; R - -OCH₂R₁, где R₁ выбирают из числа -СН= СМе₂, -СМе=СН₂, -C≡CH; при условии, что в случае, когда Ar представляет собой фенил, С₄-алкилфенил, 4-метоксифенил или 3,4-диметоксифенил, R может быть любым за исключением 3-метил-2-бутенилоксигруппы.

Упомянутые соединения обладают антипролиферативной активностью как в отношении чувствительных раковых клеток, так и клеток, устойчивых к традиционным химиотерапевтическим лекарственным препаратам.

Изобретение направлено на решение проблемы расширения арсенала средств, обладающих цитотоксическим действием, которые могут быть использованы в качестве активных компонентов противоопухолевых лекарственных средств.

Заявляемая проблема решается применением 2-(4-карбоксибензилиден)-3,4-дигидронафтален-1(2Н)-она в качестве средства, обладающего цитотоксической активностью.

Соединение 2-(4-карбоксибензилиден)-3,4-дигидронафтален-1(2Н)-он было получено с использованием микроволновой активации (излучение мощностью 600 Вт) (см. А.Л.Иванова и др. Арилидентетрагидронафталиноны в реакциях с С-нуклеофилами. ХХ Молодёжная школа-конференция по органической химии, 18-21 сентыбря 2017, Казань. Тезтсы докладов, 2017, стр. 139).

Соединение было получено путём проведения реакции 3,4-дигидронафтален-1(2H)-она и 4-формилбензойной кислоты.

Изобретение иллюстрируется чертежами, где представлены графики метаболической активности клеточных линий при воздействии на них соединения 2-(4-карбоксибензилиден)-3,4-дигидронафтален-1(2Н)-она, при этом:

- на фиг. 1 представлен график метаболической активности клеточной линии С6;

- на фиг. 2 представлен график метаболической активности клеточной линии SPEV;

- на фиг. 3 представлен график метаболической активности клеточной линии HELA.

Получение соединения и испытание его цитотоксической активности иллюстрируется следующими примерами.

Пример. Синтез 2-(4-карбоксибензилиден)-3,4-дигидронафтален-1(2Н)-она

К 1.07 г (7.5 ммоль) 4-формилбензойной кислоты (77) добавляют 1.00 мл (7.5 ммоль) 3,4-дигидронафтален-1(2H)-она (57) и 0.1 мл пиперидина в 0.5 мл ледяной уксусной кислоты. Реакционную смесь подвергают воздействию микроволнового излучения мощностью 600 Вт в течение 30 минут. Образовавшиеся кристаллы обрабатывают изопропиловым спиртом, промывают водой и сушат. Получают 1,65 г (87.3%) 2-(4-карбоксибензилиден)-3,4-дигидронафтален-1(2Н)-она, Т. пл. 163-164 °C. Спектр ЯМР¹Н (ацетон-d₆), δ, м.д.:3.03 (т. 2Н, СН_2(тетр)), 3.18 (т. 2Н, СН_2(тетр)), 7.90 (с. 1Н, Н_вин),7.38-8.15 (м. 9Н, Ar). Найдено, %: С 77.43, Н5.13.C₁₈H₁₄O₃. Вычислено, %: С77.68, Н 5.07.

Цитотоксичность 2-(4-карбоксибензилиден)-3,4-дигидронафтален-1(2Н)-она определяли с помощью МТТ-теста на культурах клеток почек эмбрионов свиньи, несущих онковирусы А и С (SPEV), клеток глиомы крысы (С6) и раковой опухоли шейки матки человека (HeLa). В основе МТТ-теста лежит способность живых клеток восстанавливать желтый бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-тетразолия (МТТ) в пурпурно-синие внутриклеточные кристаллы МТТ-формазана, растворимые в ДМСО. Уменьшение оптической плотности опытных проб по сравнению с контрольными, регистрируемое на планшетном спектрофотометре, свидетельствует о цитотоксическом действии изучаемых веществ на клетки.

Клетки линий SPEV, С6 (глиома) и HeLa клон 11, суспендированные в питательной среде, вносили в лунки 96-луночных полистироловых планшетов (в одну лунку вносили 200 мкл среды и примерно 50000 клеток соответствующей линии). Питательная среда представляла собой среду ДМЕМ с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, а также антибиотиков пенициллина (50 м.ед./мл) и стрептомицина (50 мкг/мл) для предотвращения бактериальной контаминации. Культуры выращивали в атмосфере СО₂-инкубатора в течение 2-х суток до образования монослоя клеток с 70%-ой плотностью насыщения.

Тестируемые вещества растворяли в ДМСО до наибольшей концентрации. Предельная концентрация соединения 1 составила 55,56 мг/мл, соединения 2 - 50 мг/мл, а соединения 3 - 52,63 мг/мл.

После 48 часов инкубации к культурам клеток добавляли методом раститровки различные концентрации исследуемых соединений. Каждую концентрацию применяли в трех повторностях. В качестве начального разведения образцов использовали разведение 1:100 в питательной среде. В контрольные лунки добавляли растворитель ДМСО в концентрации 1%. Планшеты с внесенными соединениями снова помещали в СО₂-инкубатор на 24 часа.

Для определения дыхательной активности реактив МТТ растворяли в забуференном физиологическом растворе до концентрации 1 мг/мл.

После 72 часов инкубации клеточных линий с тестируемыми веществами лунки планшетов освобождали от среды и вносили в них по 100 мкл раствора МТТ. Планшеты помещали на 1 час в СО₂-инкубатор, затем жидкость из лунок удаляли, вносили в них по 200 мкл раствора ДМСО и инкубировали 10 мин при 37°С в термостате.

С помощью спектрофотометра планшетного формата определяли оптическую плотность полученных образцов при длине волны 540 нм и вычитали измеренное фоновое поглощение при длине волны 690 нм. Дыхательную активность контрольных образцов принимали за 100%.

В Таблице и на фиг. 1, 2, 3 представлены результаты определения метаболической активности клеточных линий C6, SPEV и HeLа при воздействии на них 2-(4-карбоксибензилиден)-3,4-дигидронафтален-1(2Н)-она в максимальной использованной концентрации.

Таблица. Влияние 2-(4-карбоксибензилиден)-3,4-дигидронафтален-1(2Н)-она на метаболическую активность клеточных линий C6, SPEV и HeLa.

№ соединения Концентрация, мкг/мл Метаболическая активность клеточных линий, % С6 SPEV HeLa 1 555.6 93.6 2.9 3.4

Из приведенных данных следует, что соединение 2-(4-карбоксибензилиден)-3,4-дигидронафтален-1(2Н)-он в максимальной использованной концентрации практически полностью подавляет метаболическую активность клеточных линии SPEV и HeLa (до 2.9% и 3.4%, соответственно).

Проведенный нами виртуальный скрининг биологической активности полученных структур при помощи программы PASS также подтвердил вероятность проявления противоопухолевой (Ра = 70%) и антилейкемической (Ра = 71%) активности.

Изобретение относится к области органической химии и фармации. Предложено применение 2-(4-карбоксибензилиден)-3,4-дигидронафтален-1(2Н)-она в качестве средства, обладающего цитотоксической активностью. Технический результат: соединение подавляло метаболическую активность клеточных линий почки эмбрионов свиньи, несущих онковирусы А и С (SPEV), глиомы крысы (С6), раковой опухоли шейки матки человека (HeLa). Изобретение может быть перспективно в медицинской практике для лечения раковых заболеваний и в получении средств, обладающих цитотоксическим действием, которые могут быть использованы в качестве активных компонентов противоопухолевых лекарственных средств, в том числе против лейкемии. 3 ил., 1 табл.

Применение 2-(4-карбоксибензилиден)-3,4-дигидронафтален-1(2Н)-она в качестве средства, обладающего цитотоксической активностью.