Способ подавления роста опухолей глиального происхождения Российский патент 2019 года по МПК A61K31/00 A61P35/00 

Изобретение относится к области медицины и касается препарата подавления роста опухолей глиального происхождения.

Согласно данным ВОЗ второй основной причиной смертности в экономически развитых странах являются онкологические заболевания. Несмотря на внедрение высокотехнологичных методов лечения этой патологии, заболеваемость злокачественными опухолями не имеет тенденций к снижению и продолжает расти. Среди различных форм новообразований можно выделить группу опухолей, которые практически не поддаются лечению. К этой группе опухолей относят и глиомы - новообразования, развивающиеся из нормальных астроцитов головного мозга. Глиобластома является одной из наиболее часто встречающихся форм глиом (около 80%) и характеризуется высокой агрессивностью и значительным снижением качества жизни больных во время болезни и ее лечения. Медиана выживаемости у пациентов с этим диагнозом составляет всего около 15 месяцев, даже в условиях интенсивной терапии. Таким образом, несмотря на достаточно низкую встречаемость, высокая патогенность глиобластомы требует поиска новых соединений и разработки новых подходов к лечению.

Современная принятая схема лечения злокачественных опухолей головного мозга включает в себя хирургическое удаление опухолевой ткани настолько, насколько это возможно без серьезных повреждений здоровых тканей мозга, а также радиотерапию и химиотерапию, направленные на уничтожение оставшихся раковых клеток. Стандартный курс химиотерапии, который назначается после резекции опухолевой ткани и в сочетании с радиотерапией, состоит из ежедневного приема темозоломида. Этот протокол предоставляет лучший результат в условиях общей выживаемости: 27.2% доживают до 2 лет, 16.0% до 3 лет, 12.1% до 4 лет, и 9.8% до 5 лет с приемом темозоломида, против, 10.9, 4.4, 3.0 и 1.9% с одной радиотерапией (коэффициент риска 0.6, 95% доверительный интервал 0.5-0.7; p<0.001).

Изобретение решает задачу подавления (ингибирования) роста опухолей глиального происхождения.

Задача решается тем, что в качестве препарата, ингибирующего рост опухоли, используют суспензию на основе наноразмерных частиц гидроксида марганца (II) (НЧ MnO).

Описан способ подавления роста опухолей глиального происхождения, включающий инъекцию препарата на основе гидроксида марганца (II), состоящего из глобул, имеющих в водном растворе бимодальное распределение по размерам с максимумами в районе 7-9 nm и 26-32 nm.

Препарат получают путем гидролиза растворимых солей Mn(II) при рН раствора 8,0-8,6, для синтеза препарата в качестве щелочного агента для проведения гидролиза солей Mn(II) используют растворы гидроксидов или карбонатов щелочных металлов.

По данным рентгеноструктурного анализа после высушивания на воздухе содержит марганец в форме Mn₃O₄.

Сущность изобретения иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Наночастицы гидроксида марганца (НЧ MnO) готовят методом гидролиза путем медленного добавления в водный раствор MnSO₄ (0,5М) раствора NaOH (1М) при температуре 20°С и энергичном перемешивании на магнитной мешалке. Вливание щелочи прекращают при достижении значения рН=8.4 и сохранении этого значения в течение 5 мин при отклонениях не более 0,1 ед. рН. Суспензию наночастиц отмывают водой (20-кратным по объему избытком) с отделением от растворителя центрифугированием. Процедуру повторяют 5 раз, затем наночастицы оставляют в дистиллированной воде.

На Фигуре 1 приведены данные измерения распределения частиц НЧ MnO по размерам методом малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР) в водной суспензии.

Используют дифрактометр S3 MICRO (HECUS) с точечной коллимацией и медным излучением (Cu Kα, 50W). Измерения рентгенограмм проводят в интервале векторов q от 0.01 до 0.6 , где q=4πsinθ/λ.

Максимумы в распределении частиц наблюдают в районе 8 и 30 nm.

Исследование микроструктуры НЧ MnO осуществляют методом просвечивающей электронной микроскопии высокого разрешения (ПЭМВР) - на электронном микроскопе JEM 2010 (JEOL, Japan) с ускоряющим напряжением 200 кВ и предельным разрешением по решетке 0.14 нм. Прибор оснащен энергодисперсионным спектрометром рентгеновского характеристического излучения (EDX) XFlash (Bruker, Germany) с полупроводниковым Si-детектором с разрешением по энергии 130 эВ. Запись изображений осуществляют с помощью матрицы Soft Imaging System (Germany). В процессе приготовления образцов НЧ MnO наносят на графит и высушивают на воздухе. На Фигуре 2 приведено электронно-микроскопическое изображение и параметры кристаллической решетки НЧ MnO на поверхности графита.

Полученные значения межплоскостных расстояний свидетельствуют об образовании в процессе высушивания на воздухе препаратов НЧ MnO кристаллов MnO₂ (Manganese Oxide Ramsdellite. Formula: Mn O₂ PDF. Number: 42-1316).

На образование частиц MnO₂ при высушивании исходных НЧ MnO на воздухе, указывают (подтверждают) и данные рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии. РФС. Спектры измеряют на фотоэлектронном спектрометре фирмы SPECS (Германия) с использованием монохроматизированного излучения AlKα (hν=1486,74 эВ, 200 Вт). Шкалу энергий связи (Е_св) предварительно калибруют по положению пиков основных уровней Au4f_7/2 (84,0 эВ) и Cu2p_3/2 (932,67 эВ).

На спектрах РФС наблюдают пик Mn2P со значением энергии связи 642,1 eV, соответствующий соединению MnO₂ (J.F. Moulder, W.F. Stickle, Р.Е. Sobol, K.D. Bomben, ed. by J. Chastain. Handbook of X-Ray Photoelectron Spectroscopy, Perkin-Elmer, Eden Prairie, Minnesota, 1992).

Определение противоопухолевых свойств НЧ MnO на мышах с ксенографтами глиобластомы.

Исследование выполнено на самцах мышей линии SCID (SHO-PrkdcscidHrhr) SPF статуса в возрасте 6-7 недель. Животных содержат в Центре генетических ресурсов лабораторных животных на базе ЦКП «SPF-виварий» Института цитологии и генетики СО РАН однополыми семейными группами по 2-5 особей в индивидуально вентилируемых клетках (IVC) системы OptiMice (AnimalCareSystems) в контролируемых условиях, при температуре 22-26°С, относительной влажности 30-60% и световом режиме свет/темнота: 14/10 с рассветом в 01:00. Корм Ssniff (Германия) и воду после обратного осмоса, обогащенную минеральной смесью Северянка (Санкт-Петербург), животным предоставляют adlibitum.

В течение эксперимента состояние мышей регистрируют ежедневно. Запланированную эвтаназию осуществляют передозировкой СО₂. Все манипуляции с животными проводят в соответствии с международными правилами работы с животными (European Communities Counsil Directive (86/609 EEC).

Введение клеток U-87MG животным и формирование опухолевого узла.

За 2-3 недели до начала эксперимента культуру клеток глиомы U-87MG, размораживают и культивируют в течение 5-7 пассажей. Перед инокуляцией клетки опухоли снимают с подложки раствором трипсин\версен и после 5 мин центрифугирования при 1000 об\мин осадок тщательно ресуспендируют в среде без сыворотки, доводя до концентрации 10⁸ клеток в 1 мл. Для получения солидной опухоли мышам в лопаточную область подкожно вводят по 10 млн клеток глиобластомы U87MG в объеме 100 мкл среды DMEM/F12 без сыворотки. Далее 3 раза в неделю животных осматривают и при необходимости проводят пальпацию места инокуляции клеток для детектирования опухолевого узла. При появлении характерного уплотнения штангенциркулем измеряют в мм его длину (наибольший диаметр опухоли) и ширину (наименьший диаметр опухоли). Объем опухоли (V) вычисляют по формуле: V=(a×b²)×0,52, где а - наибольший диаметр опухоли, b - наименьший диаметр опухоли.

По достижению опухолями объемов 250-300 мкл мышам начинают вводить подкожно, под опухоль или рядом с ней, 3 раза в неделю исследуемые растворы в объеме 200 мкл. Животным из контрольной группы вводят раствор, используемый для разведения тестируемых наночастиц. Изменение состояния мышей в течение эксперимента оценивают ежедневно, начиная с 1 суток после введения НЧ MnO, и 3 раза в неделю регистрируют размеры и внешний вид опухолевого узла.

Для исследования противоопухолевых свойств НЧ MnO животным (самцам мышей линии scid) вводят примерно по 50 мкг Mn в одно животное (1,92 мг/кг) один раз в день, три раза в неделю от 20 до 41 дня.

За период наблюдения, начиная с даты первого введения НЧ MnO и до 28 суток, средние объемы ксенографтов в экспериментальной группе не достигают объема 1000 мкл, и уменьшаются до практически нулевых значений на 38-41 сутки. На 48 сутки от инокуляции клеток средние объемы в контрольной и опытной группах составляют 5050 и 211 мм, соответственно.

Проведенные сравнительные исследования эффективности НЧ MnO и темозоломида, показывают, что начиная с 18 суток после первого введения препаратов, наблюдается достоверно более эффективное угнетение роста опухоли, полученной введением подкожно клеток глиобластомы человека U87 самцам линии scid при введении НЧ MnO (р<0.05), по сравнению с животными, которым вводят только темозоломид. На Фигуре 3 приведены графики изменения объемов опухолей, полученных подкожным введением клеток глиобластомы человека U87 самцам мышей линии scid в зависимости от примененных препаратов.

Пример 2

Демонстрирует возможность применения гидроксида лития (LiOH, 1М) в качестве щелочного агента для синтеза НЧ MnO. Синтез НЧ MnO, измерения физических свойств частиц и их противоопухолевых свойств проводят аналогично примеру 1. Используемые препараты имеют рН 8,0. Максимумы в распределении частиц по данным МУРР наблюдают в районе 7 и 26 nm. На 48 сутки от инокуляции клеток средние объемы опухоли в опытной группе составляют 180 мм.

Пример 3

Демонстрирует возможность применения хлорида марганца (MnCl₂, 0,5М) вместо MnSO₄ для синтеза НЧ MnO. Синтез НЧ MnO, измерение их физических параметров и противоопухолевых свойств проводят аналогично примеру 1. Используемые препараты имеют рН 8,6. Максимумы в распределении частиц по данным МУРР наблюдают в районе 8 и 30 nm. На 48 сутки от инокуляции клеток средние объемы опухоли в опытной группе составляют 300 мм³.

Пример 4

Демонстрирует возможность применения карбоната натрия (Na₂CO₃, 0,5М) в качестве щелочного агента для синтеза НЧ MnO. Синтез НЧ MnO, измерения физических свойств частиц и их противоопухолевых свойств проводят аналогично примеру 1. Используемые препараты имеют рН 8,0. Максимумы в распределении частиц по данным МУРР наблюдают в районе 9 и 32 nm. На 48 сутки от инокуляции клеток средние объемы опухоли в опытной группе составляют 180 мм.

Изобретение относится к области медицины, а именно к онкологии, и может быть использовано для лечения опухолей глиального происхождения. Способ включает инъекцию препарата на основе гидроксида марганца(II), состоящего из глобул, имеющих в водном растворе бимодальное распределение по размерам с максимумами в районе 7-9 nm и 26-32 nm. Препарат получают путем гидролиза растворимых солей Mn(II) при рН раствора 8,0-8,6. Использование изобретения позволяет эффективно подавить рост опухоли глиального происхождения. 2 з.п. ф-лы, 3 ил., 4 пр.

1. Способ подавления роста опухолей глиального происхождения, включающий инъекцию препарата на основе гидроксида марганца(II), состоящего из глобул, имеющих в водном растворе бимодальное распределение по размерам с максимумами в районе 7-9 nm и 26-32 nm.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что препарат получают путем гидролиза растворимых солей Mn(II) при рН раствора 8,0-8,6.

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что для синтеза препарата в качестве щелочного агента для проведения гидролиза солей Mn(II) используют растворы гидроксидов или карбонатов щелочных металлов.