Средство, обладающее противоопухолевой активностью Российский патент 2024 года по МПК A61K9/14 A61K9/08 A61K31/352 A61K33/32 A61K31/724 A61P35/00 

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, фармакологии, медицине и ветеринарии, в частности фармакологии и онкологии, и может быть использовано для замедления прогрессирования развития опухолей, и непосредственно касается средств, обладающих противоопухолевой активностью.

В медицине известны немногочисленные примеры применения комплексных соединений марганца (II) (ионов Mn²⁺) при лечении патологических состояний, вызываемых присутствием кислородсодержащих свободных радикалов в организме, например, окислительного стресса. Известно, что хелаты металлов, в частности, ионов Mn²⁺ с дипиридоксином и аминополикарбоновой кислотой являются эффективными при лечении или предупреждении антрациклин-индуцируемой кардиотоксичности, токсичности, вызванной облучением, ишемических поражений и атеросклероза или, с общей точки зрения, каждого состояния, вызванного присутствием кислородсодержащих свободных радикалов, то есть окислительного стресса у людей и животных [Карлссон Я.-О., Андерссон Р. Фармацевтические композиции и терапевтические способы, в которых применяется комбинация комплексного соединения марганца и соединения в форме, не являющейся марганцевым комплексом //RU 2563825 С2. - 20.09.2015.- Бюл. №26]. Показано применение таких соединений для защиты клеток при лечении рака [Karlsson J.O.G., Kurz Т., Andersson R. Compounds for use in the treatment of cancer // WO 2009/078794 A1.- 25.06.2009; Alexandre J., Nicco C, Chereau Ch., Laurent A., Weill В., Goldwasser F., Batteux F. Improvement of the Therapeutic Index of Anticancer Drugs by the Superoxide Dismutase Mimic Mangafodipir // Journal of the National Cancer Institute, February 15, 2006. Vol.98, No. 4, P. 236-244. DOI: 10.1093/jnci/djj049], когда увеличение гибели раковых клеток и выживание нормальных клеток были вызваны СОД-миметической активностью мангафодипира (дипиридоксилдифосфат марганца), которая абсолютно зависит от окислительно-восстановительной активности ионов Mn²⁺.

Антиканцерогенная активность миметиков СОД впервые была описана в 1983 г. [Kensler T.W., Bush D.M., Kozumbo W.J. Inhibition of Tumor Promotion by a Biomimetic Superoxide Dismutase // Science. 1983. Vol.221, P. 75 - 77]. Таким образом, было показано, что антиоксидантные свойства молекулы обусловливают наличие у нее противоопухолевой активности.

В качестве эффективных антиоксидантов зарекомендовали себя природные фенольные соединения, а именно флавоноиды [Bors, W., Saran, М. Radical scavenging by flavonoid antioxidants // Free Radical Research. 1987, Vol.2, Iss. 4-6, P. 289-294]. Благодаря своим хелатирующим свойствам, они могут влиять на сорбцию металлов в процессе питания у человека и животных и воздействовать на баланс металлов в организме и клеточный окислительный статус [Костюк В.А., Потапович А.И. Биорадикалы и биоантиоксиданты: Монография. - Мн.: БГУ, 2004. - 174 с]. В основе антирадикальной активности флавоноидов лежит способность к хелатообразованию с ионами металлов, и высокая способность к переносу электронов, что химически объясняется присутствием гидроксильных групп в молекуле.

В этой связи актуальным является поиск новых эффективных противоопухолевых препаратов из числа комплексных (хелатированных) производных флавоноидов. Фармакологические эффекты марганца и флавоноидов могут способствовать проявлению сочетанной противоопухолевой активности у их соединений [Stalin Selvaraj, Sridharan Krishnaswamy, Venkappayya Devashya, Swaminathan Sethuraman, and Uma Maheswari Krishnan. Flavonoid-Metal Ion Complexes: A Novel Class of Therapeutic Agents // Medicinal Research Reviews, 2014. Vol.34, No. 4, P. 677-702].

В качестве прототипа заявляемого средства рассматривается комплексное соединение марганца (II) с 4'-метокси-5,7-дигидроксиизофлавоном со стехиометрическим соотношением Met:L (1:2), где Met - марганец (II), L - депротонированный 4'-O-метокси-5,7-дигидроксиизофлавон, полученный в среде этанола, с содержанием Mn²⁺ 8,86%.

Данное соединение обладает более высокими эффектами ингибирования роста экспериментальных опухолей, чем отдельно свободные изофлавон и ион Mn²⁺, и по эффективности превосходит цитостатический антинеопластический лекарственный препарат - цисплатин (цис-диаминдихлорплатина) [Chen X., Tang L.-J., Sun Y.-N., Qiu P.-H., Liang G. Syntheses, characterization and antitumor activities of transition metal complexes with isoflavone // Journal of Inorganic Biochemistry. 2010. Vol.104. P. 379-384].

В экспериментах in vitro выявлена высокая противоопухолевая активность и селективность данного комплексного соединения против пяти линий раковых клеток человека, состоящих из карциномы легкого А549, клеток HeLa, гепатоцеллюлярной карциномы HepG2, аденокарциномы толстой кишки SW620 и клеток рака молочной железы MDA-MB-435. Действие соединения связано с индуцированием процессов апоптоза и акцентировано на неспецифическую фазу остановки клеточного цикла.

Недостатком данного прототипа является использование в качестве органического лиганда (L) изофлавона, получаемого в несколько трудоемких стадий, включающих синтез промежуточного дезоксибензоина, его выделение и очистку, и далее непосредственно получение изофлавона, его выделение, очистку и перекристаллизацию. При этом используются высокотоксичные органические растворители такие, как диметилформамид, ацетоацетат и метанол.

В Иркутском институте химии им. А.Е. Фаворского СО РАН разработано хелатное комплексное соединение марганца (II) соответствующих солей с флавоноидом природного происхождения (+)-дигидрокверцетином (ДКВ) (общей формулы Met:L(H₂O)_n, где Met - марганец (II), L - депротонированный (+)-дигидрокверцетин, n - количество молекул связанной воды со стехиометрическим соотношением Met:L (1:1) с содержанием ионов Mn²⁺ 14%) (ДКВ-Mn). Его строение подтверждено результатами элементного анализа, данными РФА, ИК-спектроскопии и ЭПР-спектрометрии [Столповская Е.В., Трофимова Н.Н., Бабкин В.А., Хуцишвили С.С., Житов Р.Г., Чупарина Е.В., Мальцев А.С. Исследование и оптимизация реакции комплексообразования ионов марганца (II) с дигидрокверцетином в водной среде // Химия растительного сырья. 2020. №3. С.47-56].

Дигидрокверцетин, относящийся к довольно ограниченной по числу представителей группе флаванонов, является промышленно доступным биофлавоноидом, получаемым из древесины лиственницы сибирской и даурской и имеющий государственную регистрацию в качестве фармацевтической субстанции [ФС-000388 Государственный реестр лекарственных средств Российской Федерации [Электронный ресурс]. Режим доступа: http://grls.rosminzdrav.ru/Default.aspx]. Скрининг его фармакологической активности показал антиоксидантные и капилляропротекторные свойства в сочетании с противовоспалительным, гастро- и гепатопротекторным, гиполипидемическим, диуретическим и радиопротекторным действиями [Биомасса лиственницы: от химического состава до инновационных продуктов / В.А. Бабкин, Л.А. Остроухова, Н.Н. Трофимова // отв. редактор А.А. Семенов. - Новосибирск: Изд-во СО РАН, 2011. - 236 с]. Дигидрокверцетин обладает высокой степенью биологической доступности и довольно интенсивным проникновением в периферические ткани [Плотников М.Б., Тюкавкина Н.А., Плотникова Т.М. Лекарственные препараты на основе диквертина. - Томск: Изд-во Том. ун-та, 2005. - 228 с], что может обеспечить хорошую биосовместимость хелатных соединений, получаемых на его основе.

Отличительной особенностью хелатного комплексного соединения ДКВ-Mn следует отметить:

1. Экономически выгодное в промышленных масштабах производство, т.к. исходное соединение - дигидрокверцетин, является коммерчески доступным продуктом, получаемым из возобновляемого растительного сырья.

2. При получении хелатного комплексного соединения не используются токсичные органические растворители и дополнительные реагенты, так как весь синтез и очистка от примесей осуществляется только с применением воды.

Хелатное комплексное соединение ДКВ-Mn практически нерастворимо в воде. Поэтому для разработки активной субстанции на его основе был применен общеизвестный в фармацевтической практике метод сорастирания, используемый для получения молекулярных комплексов включения типа «гость-хозяин». В качестве «хозяина» предпочтительно использовать β-циклодекстрин (β-ЦД), являющийся доступным коммерческим продуктом. Получение молекулярного комплекса включения ДКВ-Mn - β-ЦД осуществляли при молярном соотношении «гость:хозяин» 1:1 в «плуговом» миксере. Полученная активная фармацевтическая субстанция на основе молекулярного комплекса включения ДКВ-Mn-β-ЦД представляет собой мелкодисперсный порошок темно-коричневого цвета с размером частиц до 28 мкм (рис. 1), умеренно растворимый в воде (1:100), 1% водный раствор которого обладает низкой осмотической активностью (до 20 мОсм/кг).

На рис. 1. размер частиц молекулярного комплекса включения ДКВ-Mn-β-ЦЦ (ув. × 100).

Учитывая физико-химические и потенциальные противоопухолевые свойства субстанции ДКВ-Mn-β-ЦД, ее рациональной лекарственной формой является порошок для приготовления инъекционных растворов.

Поэтому целью данного изобретения является разработка высокоэффективного фармакологического средства, обладающего противоопухолевой активностью, в виде порошка для парентерального применения.

Технический результат достигается тем, что лекарственная форма для парентерального применения, обладающая противоопухолевой активностью, представляет собой комплект для приготовления инъекционного раствора, состоящий из 5% раствора глюкозы для инъекций и мелкодисперсного порошка молекулярного комплекса включения ДКВ-Mn-β-ЦД. Для его применения раствор готовят ех tempore, добавляя к мелкодисперсному порошку молекулярного комплекса включения ДКВ-Mn-β-ЦД 5% раствор глюкозы для инъекций.

Следующие примеры иллюстрируют изобретение:

Пример 1. В круглодонной колбе смешивали водные растворы ДКВ с концентрацией 0,025 моль/л и Mn(CH₃COO)₂ × 4H₂O с концентрацией 0,038 моль/л по Mn²⁺ при постоянном перемешивании в течение 15 мин (t = +70°С, рН = 7,5 - 7,7). После остывания раствора до комнатной температуры надосадочную жидкость декантировали, а осадок промывали горячей водой до исчезновения в смывах ацетат-иона и непрореагировавшего ДКВ. Полученную мелкодисперсную суспензию замораживали при t=-40°С и подвергали сублимации при t ≤ -55°С не более 3 часов.

Выход хелатного комплексного соединения на основе ионов Mn²⁺ и ДКВ со стехиометрическим соотношением Met:L (1:1) с содержанием ионов Mn²⁺ 14% (ДКВ-Mn) составил 95%.

В «плуговой» миксер к β-ЦД загружали хелатное комплексное соединение ДКВ-Mn в молярном соотношении 1:1. Перемешивали в течение 1 часа при скорости вращения 300 об/мин.

Выход молекулярного комплекса включения ДКВ-Mn-β-ЦД составил 98%.

Пример 2. В кругл од онной колбе смешивали водные растворы ДКВ с концентрацией 0,02 моль/л и MnCl₂ × 4H₂O с концентрацией 0,03 моль/л по Mn²⁺ при постоянном перемешивании в течение 15 мин (t = +70°С, рН=7,7 -7,9). После остывания раствора до комнатной температуры надосадочную жидкость декантировали, а осадок промывали горячей водой до исчезновения в смывах хлорид-иона и непрореагировавшего ДКВ. Полученную мелкодисперсную суспензию замораживали при t = -40°С и подвергали сублимации при t ≤ -55°С не более 3 часов.

Выход хелатного комплексного соединения на основе ионов Mn²⁺ и ДКВ со стехиометрическим соотношением Met:L (1:1) с содержанием ионов Mn²⁺14% составил 90,3%.

В «плуговой» миксер к β-ЦД загружали хелатное комплексное соединение ДКВ-Mn в молярном соотношении 1:1. Перемешивали в течение 1 часа при скорости вращения 250 об/мин.

Выход молекулярного комплекса включения ДКВ-Mn-β-ЦД составил 98,5%.

Пример 3. В круглодонной колбе смешивали водные растворы ДКВ с концентрацией 0,03 моль/л и MnSO₄×5H₂O с концентрацией 0,045 моль/л по Mn²⁺ при постоянном перемешивании в течение 15 мин (t = +70°С, рН=7,5 -7,7). После остывания раствора до комнатной температуры надосадочную жидкость декантировали, а осадок промывали горячей водой до исчезновения в смывах сульфат-иона и непрореагировавшего ДКВ. Полученную мелкодисперсную суспензию замораживали при t = -40°С и подвергали сублимации при t ≤ -55°С не более 3 часов.

Выход хелатного комплексного соединения на основе ионов Mn²⁺ и ДКВ со стехиометрическим соотношением Met:L (1:1) с содержанием ионов Mn²⁺ 14% составил 82%.

В «плуговой» миксер к β-ЦД загружали хелатное комплексное соединение ДКВ-Mn в молярном соотношении 1:1. Перемешивали в течение 1 часа при скорости вращения 350 об/мин.

Выход молекулярного комплекса включения ДКВ-Mn-β-ЦД составил 97%.

Пример 4.

Изучение фармакологической активности действия молекулярного комплекса включения ДКВ-Mn-β-ЦД.

Эксперименты проведены в осенне-зимний период на белых беспородных мышах-самцах (n=80, m=20 - 25 г), разводимых в виварии ФГБНУ Иркутский научный центр хирургии и травматологии. Культура перепрививаемого штамма асцитной аденокарциномы Эрлиха получена в питомнике ФГУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» (Россия, Новосибирская область, поселок Кольцово), ветеринарный сертификат 254 №0336050 от 28 июля 2010 г.

Все исследования выполнены в соответствии с этическими требованиями по работе с экспериментальными животными [ГОСТ 33044-2014 Принципы надлежащей лабораторной практики. [Электронное издание]. Режим доступа: https://docs.cntd.ru/document/1200115791: Directive 2010/63/EU of the European parliament and of the council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes // Off. J. Eur. Union. 2010. - Vol.L276. Iss. 53. P. 33-79]. На проведение исследования получено разрешение комитета по этике ФГБНУ Иркутского научного центра хирургии и травматологии №9 от 16.12.2021 г.

Экспериментальным животным внутрибрюшинно вводили культуру перепрививаемого штамма асцитной аденокарциномы Эрлиха (АКЭ) в дозе 3×10⁶ клеток в 0,2 мл 5% растворе глюкозы для инъекций. Контрольной группе вводили только культуру перепрививаемого штамма АКЭ. Опытной группе (ДКВ-Mn-β-ЦД) через 24 часа после перепрививки АКЭ однократно внутрибрюшинно вводили раствор молекулярного комплекса включения ДКВ-Mn-β-ЦД в 5% растворе глюкозы для инъекций в дозе по иону Mn²⁺ 0,1 мг / мышь.

Оценивали показатели: объем асцитной жидкости опухоли (мл), количество клеток (млн / мл), торможение роста опухоли в (%) [Хабриев Р.У. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ: второе изд., перераб. и доп.- М.: Медицина, 2005. - 832 с].

Десять мышей из каждой группы выведены на десятые сутки после перепрививки АКЭ и десять оставлены для оценки критерия продолжительности жизни [Инжеваткин Е.В. Практикум по экспериментальной онкологии на примере асцитной карциномы Эрлиха: Метод, разработка / Краснояр. гос. ун-т; Красноярск, 2004. - 10 с].

Изучали морфологические изменения в печени, сальнике, передней брюшной стенке экспериментальных групп.

День забора биоматериала определяли периодом логарифмического увеличения числа клеток (лог-фаза роста опухоли) после появления опухоли в организме, которым явился 10-й день с момента прививки. Органы экспериментальных животных для патоморфологического анализа заливали в парафин, готовили срезы. Результаты представлены в таблице 1.

Исследуемый молекулярный комплекс включения ДКВ-Mn-β-ЦД обладает противоопухолевой активностью, что продемонстрировано на модели перевиваемой асцитной карциномы Эрлиха: установлено достоверное снижение объема асцитной жидкости на 35% по сравнению с контролем, а также концентрации опухолевых клеток. Их количество составило в среднем 230 млн /мл, а в контроле - 295 млн /мл, общее торможение развития опухоли достигало 35%.

При анализе основных морфологических изменений в париетальной и висцеральной брюшине мышей было выявлено, что у животных контрольной группы брюшина была отечной, с наличием в ней лимфоцитов, макрофагов, нейтрофилов и массивным прилеганием слоя атипичных опухолевых клеток аденокарциномы (рис. 2). У животных опытной группы ДКВ-Mn -β-ЦД подобные признаки были выражены менее значительно (рис. 3).

На рис. 2. Представлена группа контроля с асцитной аденокарциномой Эрлиха (10 сутки, окраска гематоксилин-эозином, ув. ×200), где А) Сальник с ростом асцитной карциномы Эрлиха, Б) Рост асцитной карциномы Эрлиха в толще брюшины, В) Рост асцитной карциномы Эрлиха (печень, желчный пузырь).

На рис. 3. Представлена группа с асцитной карциномой Эрлиха и ДКВ-Mn-β-ЦД (10 сутки, окраска гематоксилин-эозином, ув. ×200), где А) Ограниченный рост карциномы Эрлиха в сальнике, Б) Ограниченный рост карциномы Эрлиха в брюшине, В) Незначительный рост карциномы Эрлиха на капсуле печени.

Пролонгированность действия молекулярного комплекса включения ДКВ-Mn-β-ЦД подтверждается его токсическим эффектом по отношению к опухолевым клеткам на протяжении 10 суток после однократного внутрибрюшинного введения.

Таким образом, исследуемый молекулярный комплекс включения ДКВ-Mn-β-ЦД обладает противоопухолевой активностью.

Изобретение относится к области фармацевтики и медицины, а именно к комплекту для приготовления инъекционного раствора, обладающего противоопухолевой активностью, состоящему из 5% раствора глюкозы для инъекций и порошка активной фармацевтической субстанции в виде молекулярного комплекса включения в β-циклодекстрин по типу «гость:хозяин» при молярном соотношении 1:1 хелатного комплексного соединения марганца (II) с флавоноидом природного происхождения (+)-дигидрокверцетином общей формулы Met:L со стехиометрическим соотношением 1:1 с содержанием ионов Mn²⁺ 14%, где Met - марганец (II), L -депротонированный (+)-дигидрокверцетин. Технический результат заключается в противоопухолевой активности инъекционного раствора, приготовляемого из порошка. 3 ил., 1 табл., 4 пр.

Комплект для приготовления инъекционного раствора, обладающего противоопухолевой активностью, выполненного в виде лекарственной формы для парентерального применения, состоящий из 5% раствора глюкозы для инъекций и порошка активной фармацевтической субстанции в виде молекулярного комплекса включения в β-циклодекстрин по типу «гость:хозяин» при молярном соотношении 1:1 хелатного комплексного соединения марганца (II) с флавоноидом природного происхождения (+)-дигидрокверцетином общей формулы Met:L со стехиометрическим соотношением 1:1 с содержанием ионов Mn²⁺ 14%, где Met - марганец (II), L -депротонированный (+)-дигидрокверцетин.