СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ БИОПАТАГЕНОВ В ВОЗДУХЕ Российский патент 2019 года по МПК G01N33/00 

Область техники, к которой относится изобретение.

Изобретение относится к области исследований или анализа воздуха на наличие в нем биопатогенов, для защиты человека или животных от вредного воздействия бактерий, вирусов, генетических векторов и объектов нанотехнологий.

В данном описании использованы следующие термины:

АКДБ - Автоматический анализатор биопатогенов

НК - нуклеиновые кислоты

ИА - иммунологический анализатор

ПЦР - диагностика (полимеразная цепная реакция) - высокоточный метод диагностики многочисленных инфекций, который основывается на исследовании генетического материала человека (ДНК и РНК)

АСП - автоматический сигнализатор специальных примесей.

Уровень техники.

Из уровня техники известен способ без пробоотборного мониторинга воздуха, включающий зондирование пространства импульсным когерентным излучением в УФ-области и регистрацию спектрального хода интенсивности флуоресценции белоксодержащих веществ. При этом дополнительно осуществляют селективную оценку нормированных величин интенсивностей флуоресценции белоксодержащих веществ и помеховых примесей на различных длинах волн возбуждения в пределах спектрального хода флуоресценции по отношению к интенсивности на длине волны 284 нм.

Также из уровня техники известен автоматический сигнализатор специальных примесей (АСП), предназначенный для непрерывного контроля атмосферного воздуха с целью обнаружения в нем аэрозолей специальных примесей (бактерий, риккетсий, вирусов).

В состав АСП входят: датчик; преобразователь напряжения 13 В в 26 В (блок питания) или электрический кабель; звуковой сигнализатор; КИС зимний и летний; ЗИП; документация (http://www.mil.bv/print.php?ELEMENT_ID=7857&clear_cache=Y).

Кроме того известны способ детектирования наличия аналита в жидком образце, способ детектирования наличия патогена в образце цельной крови, способ детектирования наличия вируса в образце цельной крови, способ детектирования присутствия нуклеиновой кислоты-мишени в образце цельной крови, способ детектирования наличия организмов, относящихся к видам Candida в жидком образце, системы для детектирования одного или более аналитов нуклеиновой кислоты в жидком образце и сменного картриджа для размещения реагентов для анализа и расходных материалов в системе. Представленные изобретения характеризуются тем, что при своем осуществлении используют магнитные частицы, имеющие средний диаметр в интервале от 700 нм до 950 нм, значение релаксивности Т₂ на одну частицу, составляющее от 1×10⁹ до 1×10¹² ммоль^-1 сек^-1, и имеют связывающие остатки на своей поверхности, причем данные связывающие остатки действуют, изменяя агрегацию магнитных частиц в присутствии аналита. Изобретения обеспечивают мультиплексное детектирование нескольких типов различных молекул и могут быть использованы в клинической практике (RU 2653451 08.05.2018).

Наряду с вышеуказанным известен способ детектирования биологических частиц в аэрозоле. Для этого частицы аэрозоля осаждают на поверхность субстрата. Облучают поверхность с осажденным образцом источником света. Детектируют на нескольких длинах волн эмиссию флуоресценции и фосфоресценции образца с выделением сигнала фосфоресценции с задержкой во времени между актом возбуждения и актом приема сигнала эмиссии. Определяют биологические частицы по соотношению сигналов флуоресценции и фосфоресценции. При этом в процессе осаждения контролируют концентрацию частиц аэрозоля на поверхности субстрата по уровню сигнала рассеяния поверхности субстрата с частицами, который сравнивают с заданным предельным значением уровня рассеяния, определяемого с учетом разрешающей способности оптической системы детектирования сигналов, которую принимают эквивалентной максимальному размеру искомых частиц. При достижении заданного уровня рассеяния осаждение частиц прекращают и детектируют эмиссию флуоресценции и фосфоресценции каждой частицы отдельно (RU 2495426 10.10.2013).

Однако ранее известные способы выявления патогенов в воздухе имеют следующие недостатки: длительное время проведения анализа: 4 и более часов (в зависимости от режима эксплуатации), невозможность выявления охватить максимально возможный спектр потенциальных биопатогенов в воздухе, как содержащих нуклеиновые кислоты (вирусы, бактерии), так и не содержащих.

Осуществление изобретения.

Заявленный способ включает следующие приемы: сбор аэрозольные частиц, перевод их в жидкое состояние, последующий анализ отобранной пробы параллельно двумя независимыми методами: с помощью мультиплексного иммунологического анализа и ПЦР в режиме реального времени на одноразовом чипе, при этом применение двух методов анализа позволяет охватить максимально возможный спектр потенциальных биопатогенов в воздухе, как содержащих нуклеиновые кислоты (вирусы, бактерии), так и не содержащие. При этом число одновременно детектируемых мишеней может составлять более 80.

Задачей способа является повышение точности определения биопатогенов в воздухе, быстрое выявление биопатогенов воздухе, за 2 часа - более 80 детектируемых мишеней.

Технический результат настоящего изобретения заключается в повышении точности и ускорении определения биопатогенов воздухе до 80 детектируемых мишеней, а также в том, чтобы максимально охватить возможный спектр потенциальных биопатогенов в воздухе, как содержащих нуклеиновые кислоты (вирусы, бактерии), так и не содержащих.

Кроме того, контроль безопасности аэрозоля является чрезвычайно актуальной задачей на текущем этапе развития общества. Жизнь в современных мегаполисах и теснота экономических связей между странами дает патогеном с аэрозольным механизмом передачи колоссальные возможности для инициации пандемий. Решением проблемы могли бы стать способы выявления биопатогенов в воздухе общественных местах, которые могут выявлять возбудителей инфекционных заболеваний до момента массового заражения людей. Ранняя информация о распространении в окружающей среде патогенов, с учетом латентного периода, может сократить время реакции системы здравоохранения на несколько суток, а в случае своевременного принятия мер - решительно уменьшить число людей, подвергшихся заражению.

Раскрытие изобретения.

Указанный технический результат реализуется за счет следующих приемов способа выявления биопатогенов в воздухе. Анализ воздуха, осуществляют в несколько этапов. Так, на первом этапе выполняют сбора аэрозольной пробы. Затем переводят ее в жидкую фазу. После чего пробу в жидкой форме обрабатывают ультразвуком с целью разрушения клеточных стенок биологических объектов и высвобождения нуклеиновых кислот (НК) и антигенов, пригодных для дальнейшего анализа, в раствор. На следующем этапе - втором, раствор после обработки ультразвуком разделяется на три потока: 1 - пробоподготовка для иммунологического анализа, 2 - пробоподготовка для ПЦР-анализа и проба для архива. На третьем этапе параллельно друг другу выполняют пробоподготовки разделенной пробы для иммунологического анализа (ИА) и ПЦР-реакции. На четвертом этапе после выполнения всех операций пробоподготовки, суспензии из подготовленных проб для анализа направляют в иммунологический анализатор и блок ПЦР для дальнейшего анализ.

Указанный способ может быть осуществлен посредством автоматического анализатора биопатогенов в воздухе, который может быть представлен в следующем виде и представляет собой комплекс оборудования, размещенный в едином металлическом корпусе рамной конструкции (фиг. 1). Компоновка прибора выполнена в виде двух отсеков. В верхнем отсеке (2) находятся все узлы и подсистемы, непосредственно контактирующие с биологическими образцами и реагентами - от устройства сбора аэрозоля до ПЦР - и иммунологического анализаторов. В этом отсеке поддерживается контролируемый температурно-влажностный режим. В нижнем отсеке (3) расположено все вспомогательное оборудование и управляющая электроника: источники и распределители питания, резервные аккумуляторные батареи, холодильная установка, управляющий компьютер и блоки автоматики. Холодильная установка обеспечивает охлаждение оборотной воды до температуры +4°С; эта вода, в частности, используется для охлаждения реагентов, чтобы обеспечить автономность прибора на протяжении 7 дней. Система пробоподготовки автоматического анализатора биопатогенов в воздухе построена по закрытой схеме.

Процесс анализа воздуха начинается со сбора аэрозольной пробы и ее перевода в жидкую фазу. За сбор воздуха может быть осуществлен импактором - прибором, который создает поток всасываемого воздуха до 4 м³ в минуту и способный концентрировать аэрозольные частицы в диапазоне от 0.3 до 10 мкм приблизительно в 10 раз. Перевод аэрозольной пробы может быть осуществлен посредством коллектора аэрозоля, построенного по принципу водяного циклона. Поле чего жидкость передается на следующие стадии обработки. Обрабатывают пробу в жидкой фазе ультразвуком, для обработки ультразвуком может быть использован ультразвуковой гомогенизатор. После обработки ультразвуком, раствор пробы разделяется на три потока: 1 - пробоподготовка для иммунологического анализа, 2 - пробоподготовка для ПЦР-анализа и архива.

При этом система пробоподготовки может быть построена по закрытой схеме (см. фиг. 2), которая включает импактор (1), коллектор аэрозоля (5), ультразвуковой гомогенизатор (6), первый клапан ротационного типа (К1), блок выделения НК (8), содержащий: резервуар с реагентами для выделения НК (8а), третий ротационный клапан (К3), реактор выделения НК (8b), блок пробоподготовки ИА (9), включающий: резервуар с микросферами, антителами и красителями (9а), второй ротационный клапан (К2) и реактор ИА (9b); резервуар, содержащий промывочные жидкости (7) такие как: буфер, или спирт 70%, или гипохлорит, или щелочь; иммунологический анализатор (10); резервуар с реагентами ПЦР (12); ПЦР анализатор (13); архив проб (11); резервуар для охлаждаемой оборотной водой (14); резервуар жидкости предназначенной для слива (15). При этом при необходимости выполняю 16 - охлаждение или 17 - нагрев и/или осуществляют воздействие 18 - магнитом и/или 19 - перемешивание.

Для движения жидкостей в данной схеме в предусмотрены автоматические шприцевые насосы. Рабочей жидкостью во всех насосах является дистиллированная вода. Для управления потоками жидкостей используются клапаны ротационного типа (на фиг. 2 - К1-К3), изготовленные из химически инертных материалов, допускающих промывку щелочным раствором, раствором гипохлорита натрия и этиловым спиртом. Гидравлические соединения выполнены трубками из фторполимера ЭТФЭ (сополимер этилен-тетрафторэтилен), также допускающих промывку перечисленными выше растворами. Промывка всей системы пробоподготовки выполняется после каждого забора пробы и каждого анализа, согласно протоколу работы прибора.

Осуществление изобретения.

Способ выявления биопатогенов в воздухе осуществляют следующим образом.

Этап 1. Выполняют отбор аэрозольной пробы, переводят ее в жидкую фазу. Затем пробу в жидкой фазе обрабатывают ультразвуком, с целью разрушения клеточных стенок биологических объектов и высвобождения нуклеиновых кислот и антигенов, пригодных для дальнейшего анализа, в раствор. При этом для предотвращения излишнего нагрева пробы, пробу охлаждают оборотной водой.

Этап 2. После обработки ультразвуком, раствор пробы разделяется на три потока: 1 - пробоподготовка для иммунологического анализа, 2 - пробоподготовка для ПЦР-анализа и архива. При этом архив может быть представлен набором охлаждаемых емкостей, в которые по очереди помещается 1 мл пробы при каждом измерении. В случае если анализ в дальнейшем не обнаружил патогенных агентов в пробе, емкости промываются и используются повторно. При положительном результате анализа, проба из архива может быть дополнительно проверена независимыми методами.

Этап 3. Выполняют пробоподготовки для иммунологического анализа (ИА) и ПЦР-анализа. Пробоподготовка для ИА включает в себя инкубацию пробы с магнитными микросферами, биотинилированными антителами флуоресцентными метками (коньюгаты стрептовидин-фикоэритрин, SAPE), а также, соответствующие промывки. Эти операции могут быть выполнены в реакторе ИА, представляющем собой емкость из полипропилена объемом 1,5 мл в которой, поддерживается необходимая температура (как правило, 37-38°С; эта вода, в частности, используется для охлаждения реагентов, чтобы С). При помощи электромеханического привода, к данной емкости может подводиться кольцевой постоянный магнит, удерживающий магнитные частицы во время промывок. Реактор установлен на валу орбитальной мешалки, способной приводить его в движение на скоростях до 1500 об/мин. Реагенты для пробоподготовки ИА (магнитные микросферы, антитела, SAPE) хранятся при 4'С; для чего может быть использована охлаждаемая платформа, установленная на валу орбитальной мешалки. Пробоподготовка ПЦР-анализа состоит в выделении и очистке нуклеиновых кислот (НК) из раствора пробы. Принцип выделения НК основан на использовании магнитных частиц. Выделение НК происходит в реакторе, конструкция которого аналогична реактору пробоподготовки ИА. Следует отметить, что операции пробоподготовки ИА и ПЦР выполняются параллельно, что позволяет сократить полное время анализа пробы двумя методами.

Этап 4. после выполнения всех операций пробоподготовки, суспензии из реакторов направляют в иммунологический анализатор и блок ПЦР для дальнейшего анализ.

Таким образом, за счет определенной последовательности и этапности проведения анализа проб воздуха с целью выявления биопатогенов, выполнения забора аэрозольной пробы, переведении ее в жидкую фаза, обработка пробы в жидкой фазе ультразвуком, последующее разделение пробы на три части, параллельное проведение пробоподготовок для анализа ИА и ПЦР-анализа, последующее выполнение анализов ИА и ПЦР обеспечивает выполнение достигаемого технического результата - повышение точности и ускорение определения биопатогенов воздухе до 80 детектируемых мишеней, а также максимальный охват возможного спектра потенциальных биопатогенов в воздухе, как содержащих нуклеиновые кислоты (вирусы, бактерии), так и не содержащих.

Промышленная применимость.

Способ выявления биопатогенов в воздухе может быть осуществлен специалистом на практике и при осуществлении обеспечивает реализацию заявленного назначения. Возможность осуществления на практике следует из того, что для каждого признака, включенного в формулу изобретения на основании описания, известен материальный эквивалент, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «промышленная применимость» для изобретения и критерию «полнота раскрытия» для изобретения.

Способ выявления биопатогенов в воздухе может быть использован в общественных местах, и позволяет выявлять возбудителей инфекционных заболеваний до момента массового заражения людей. Ранняя информация о распространении в окружающей среде патогенов, с учетом латентного периода, может сократить время реакции системы здравоохранения на несколько суток, а в случае своевременного принятия мер - решительно уменьшить число людей, подвергшихся заражению.

Изобретение относится к экологии, а именно к выявлению биопатогенов в воздухе. Выявление выполняется поэтапно, так на первом этапе после отбора аэрозольной пробы, переводят ее в жидкую фазу, затем пробу в жидкой фазе обрабатывают ультразвуком. На втором этапе проба разделяется на три потока: 1 - пробоподготовка для иммунологического анализа, 2 - пробоподготовка для ПЦР-анализа и архива. На третьем этапе выполняют параллельно две пробоподготовки для иммунологического анализа (ИА) и ПЦР-анализа. На четвертом этапе суспензии из подготовленных проб для анализа направляют в иммунологический анализатор и блок ПЦР для дальнейшего анализа. Изобретение позволяет повысить точность и ускорить определение биопатогенов в воздухе до 80 детектируемых мишеней с максимальным охватом возможных спектров потенциальных биопатогенов в воздухе - вирусов, бактерий, токсинов. 2 з.п. ф-лы, 2 ил.

1. Способ выявления биопатогенов в воздухе, включающий отбор аэрозольной пробы, отличающийся тем, что способ выполняют поэтапно, так на первом этапе после отбора аэрозольной пробы, переводят ее в жидкую фазу, затем пробу в жидкой фазе обрабатывают ультразвуком; на втором этапе пробу разделяют на три потока: 1 - пробоподготовка для иммунологического анализа, 2 - пробоподготовка для ПЦР-анализа и архива; на третьем этапе выполняют параллельно две пробоподготовки для иммунологического анализа (ИА) и ПЦР-анализа, на четвертом этапе суспензии из подготовленных проб для анализа направляют в иммунологический анализатор и блок ПЦР для дальнейшего анализа.

2. Способ выявления биопатогенов в воздухе по п. 1, отличающийся тем, что при пробоподготовке для ИА проводят инкубацию пробы с магнитными микросферами, биотинилированными антителами флуоресцентными метками.

3. Способ выявления биопатогенов в воздухе по п. 1, отличающийся тем, что пробоподготовка ПЦР-анализа состоит в выделении и очистке нуклеиновых кислот (НК) из раствора пробы, при этом принцип выделения НК основан на использовании магнитных частиц.