Наборы олигонуклеотидов для выявления ДНК бактерии Helicobacter pylori в клиническом материале методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени Российский патент 2025 года по МПК C12Q1/68 G01N33/58 

Изобретение относится к области медицины, в частности к молекулярно-генетической диагностике в области гастроэнтерологии. Предложено три набора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых ДНК-зондов, каждый из которых может быть независимо использован для идентификации ДНК бактерии Helicobacter pylori в клиническом материале методом полимеразной цепной реакцией в реальном времени (ПЦР-РВ). Изобретение может быть использовано в клинико-лабораторной диагностике и в научно-исследовательских целях.

Helicobacter pylori – грамотрицательная спиралевидная микроаэрофильная жгутиковая бактерия, способная к адаптации к экстремально кислым условиям желудочной среды, вызывающая хронический активный гастрит у всех инфицированных [Camilo V., Sugiyama T., Touati E. Pathogenesis of Helicobacter pylori infection // Helicobacter. 2017. Vol. 22. Suppl. 1. DOI: https://doi.org/10.1111/hel.12405]. Helicobacter pylori передается от человека к человеку, чаще всего в детском возрасте, преимущественно фекально-оральным путем [Бордин Д.С., Шенгелия М.И., Иванова В.А., Войнован И.Н. Helicobacter pylori, клиническое значение и принципы диагностики // Инфекционные болезни: Новости. Мнения. Обучение. 2022. № 1 (40). DOI: https://doi.org/10.33029/2305-3496-2022-11-1-119-129].

Известно, что Helicobacter pylori колонизирует слизистую оболочку желудка (СОЖ), и у многих инфицированных людей вызывает хронический гастрит, который может прогрессировать до развития язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, атрофического гастрита, MALT-лимфомы (MALT – mucosa-associated lymphoid tissue; лимфома из лимфоидной ткани, ассоциированной со слизистыми оболочками) и аденокарциномы желудка [FitzGerald R., Smith S.M. An Overview of Helicobacter pylori Infection // Methods in Molecular Biology. 2021. Vol. 2283. P. 1–14. DOI: https://doi.org/10.1007/978-1-0716-1302-3_1]. Имеются данные, связывающие Helicobacter pylori с развитием эссенциальной железодефицитной анемии, идиопатической тромбоцитопенической пурпуры и дефицитом витамина В12 [Шептулин А.А. Основные положения согласительного совещания «Маастрихт-VI» (2022) по диагностике и лечению инфекции Helicobacter pylori // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 2022. №32 (5). C. 70–74. DOI: https://doi.org/10.22416/1382-4376-2022-32-5-70-74]. Профилактика этих болезней базируется на раннем выявлении и лечении хеликобактериоза.

Эффективная диагностика Helicobacter pylori требует комбинирования различных методов, таких как гистологический анализ биоптатов СОЖ и двенадцатиперстной кишки, бактериологический метод, С-уреазный дыхательный тест и анализ кала на антиген Helicobacter pylori. Также весьма широко распространенным способом выявления Helicobacter pylori является использование молекулярно-генетических методов, в том числе ПЦР-РВ. Применение ПЦР-РВ в комплексе с классическими методами диагностики позволяет значительно снизить количество ложноположительных результатов. Метод демонстрирует чувствительность и специфичность до 95% [Szymczak A., Ferenc S., Majewska J., Miernikiewicz P. et al. Application of 16S rRNA gene sequencing in Helicobacter pylori detection // PeerJ. 2020. Vol. 8. P. e9099. DOI: https://doi.org/10.7717/peerj.9099].

Наиболее близкими аналогами в России являются наборы реагентов для выявления ДНК Helicobacter pylori методом полимеразной цепной реакции «Helicobacter pylori», производства ООО «ДНК-Технология ТС» и «РеалБест ДНК Helicobacter pylori», производства АО «Вектор-Бест». Однако в перечень совместимых регистрирующих амплификаторов для работы данных наборов включены только приборы производства «Bio-Rad» (США), ООО «НПО ДНК-Технология» (Россия) и «Qiagen» (Германия).

Известен способ выявления ДНК Helicobacter pylori, описанный в патенте KR100846494B1, однако для выявления используется регион гена cagA (не 16S rRNA и 23S rRNA) и для детекции ампликонов используются не флуоресцентные зонды, а гель-электрофорез, тем самым повышается вероятность контаминации ампликонами, что может привести к получению ложноположительных результатов.

Техническим результатом является создание наборов олигонуклеотидов, которые могут независимо использоваться для выявления ДНК Helicobacter pylori.

Целью настоящего изобретения является разработка набора уникальных высокоспецифичных олигодезоксирибонуклеотидных праймеров для детекции бактерии Helicobacter pylori методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени в клиническом материале с учетом возможности использования расширенного перечня совместимых амплификаторов.

Поставленная задача решается подбором олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда для идентификации ДНК бактерии Helicobacter pylori методом полимеразной цепной реакции с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени. Всего подобрано 3 комплекта (набора), дающих схожие аналитические и диагностические характеристики в ПЦР-РВ, со следующими структурами у первого набора: прямой праймер HP_F_N1 (SEQ ID NO 4): 5'-CGGGATGCTTAATGCGTTAGC-3', обратный праймер HP_R_N1 (SEQ ID NO 5): 5'-GCTGGAACATTACTGACGCTGATT-3', флуоресцентно-меченый ДНК-зонд HP_P_N1 (SEQ ID NO 6): 5'-FAM-ACTAAGCCCTCCAACAACTAGCATCCATC-BHQ1-3'; у второго набора: прямой праймер HP_23S_F1n(60) (SEQ ID NO 7): 5`-GAAGGTTAAGAGGATGCGTC-3`, обратный праймер HP_23S_R3(60.9) (SEQ ID NO 8): 5`-AATCTCTGGTTGAGACAGCT-3`, флуоресцентно-меченый ДНК-зонд HP_23S_P2-1 (SEQ ID NO 3): 5`-FAM-TTGAAGCCCGAGTAAACGGCGGC-BHQ1-3'; у третьего набора: прямой праймер HP_23S_F2-5 (SEQ ID NO 1): 5`-TCAGTCGCAAGATGAAGCGT-3`, обратный праймер HP_23S_R3 (SEQ ID NO 2): 5`-GAATCTCTGGTTGAGACAGCTCC-3`, флуоресцентно-меченый ДНК-зонд HP_23S_P2-1 (SEQ ID NO 3): 5`-FAM-TTGAAGCCCGAGTAAACGGCGGC-BHQ1-3'.

Каждый из наборов олигонуклеотидов может быть независимо использован для выявления ДНК Helicobacter pylori в ходе ПЦР.

Для применения каждого из наборов олигонуклеотидов требуется приготовление ПЦР-смеси (общий объем – 25 мкл), включающей:

прямой праймер в концентрации 0,4 мкМ,

обратный праймер в концентрации 0,4 мкМ,

зонд в концентрации 0,2 мкМ,

ПЦР-буфер, содержащий растворы солей, термостабильную ДНК-полимеразу с «горячим стартом», дезоксинуклеотидтрифосфаты (дНТФ);

ДНК-матрица (15 мкл).

Для контроля прохождения реакций в постановке используются положительный контрольный образец (ПКО) и отрицательный контрольный образец (ОКО). ПКО представляет собой раствор плазмидной ДНК с синтетической вставкой амплифицируемых фрагментов ДНК: специфичные фрагменты генома бактерии Helicobacter pylori. ОКО представляет собой деионизированную воду, свободную от ДНКаз. ОКО проходит этап выделения НК с добавлением ВКО.

Данный набор применяется следующим образом.

1. Провести выделение ДНК из биологического материала (СОЖ, фекалии, слюна) с использованием специализированных наборов для выделения ДНК (наборы реагентов для пробоподготовки, не является предметом данного патента); в ходе этой процедуры из биологического материала выделяется ДНК, которую в свою очередь используют для ПЦР;

2. Подготовить необходимое количество пробирок на 0,1–0,2 мл для ПЦР (количество пробирок определяется исходя из количества исследуемых образцов + 1 пробирка для ОКО + 1 пробирка для ПКО);

3. В отдельной одноразовой стерильной пробирке типа Эппендорф объемом 1,5-2,0 мл приготовить реакционную смесь, состоящую из олигонуклеотидов и ПЦР-буфера;

4. В каждую пробирку для ПЦР внести по 10 мкл приготовленной реакционной смеси;

5. Внести в соответствующие пробирки для исследуемых образцов по 15 мкл выделенной ДНК. В пробирки с ПКО и ОКО препарат ДНК не вносится;

6. Внести в соответствующие пробирки ПКО и ОКО;

7. Перемешать содержимое пробирок, после чего произвести сброс капель со стенок с помощью краткого центрифугирования в течение 1–3 секунд на микроцентрифуге-вортексе;

8. Установить пробирки в реакционный модуль прибора для ПЦР в «реальном времени». Амплификация проводится согласно следующей программе: 1 цикл: 95°C 2 минуты; 5 циклов: 95°C 15 секунд, 64°C 20 секунд; 40 циклов: 95°C 15 минут, 64°C 20 секунд (на этом этапе необходима детекция флуоресцентного сигнала по каналу FAM/Green). В качестве приборов для ПЦР можно использовать: CFX96 («BioRad», США), «ДТпрайм» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия), Rotor-Gene Q («Qiagen», Германия), QuantStudio 5 («Thermo Fisher Scientific», США), Gentier 96 («Tianlong», КНР).

После проведения амплификации и детекции продуктов амплификации в режиме реального времени приступают к интерпретации результатов. Результат считается положительным, то есть ДНК Helicobacter pylori обнаружена в исследуемом образце, при росте уровня флуоресценции в соответствующих пробирках; при этом кривые роста флуоресценции должны иметь S-образную форму, а также иметь пересечение с пороговой линией до 40-го цикла амплификации.

Рекомендуется проведение выделения ДНК в день сбора клинического материала. Для биоптатов допускается транспортирование и хранение при температуре от 2 °С до 8 °С не более 24 ч. В случае невозможности доставки материала в лабораторию в течение суток допускается однократное замораживание материала.

Для фекалий требуется предварительная обработка проб. При исследовании нативных фекалий без предшествующего замораживания готовят фекальную суспензию (при водянистой консистенции фекалий суспензию не готовят) из 0,8 мл фосфатного буфера (или стерильного изотонического раствора натрия хлорида) и 0,1 г (0,1 мл) фекалий. При невозможности исследования материала в течение суток и/или необходимости длительного хранения к 10–20%-ной суспензии фекалий в фосфатном буфере (или стерильном изотоническом растворе натрия хлорида) добавляют глицерин в конечной концентрации 10–15%. Подготовленные таким образом пробы замораживают только после тщательной гомогенизации и экспозиции с глицерином в течение 30–40 минут.

Следует понимать, что специалист в данной области техники может без дополнительных экспериментов, с учетом настоящего описания, применить настоящее изобретение на практике в полном объеме. Следовательно, приведенное в данном контексте описание изобретения представлено для иллюстрации, не уменьшающей объем притязаний.

Клинический пример №1

В гастроэнтерологическое отделение КФТ Клиник ФГБОУ ВО «Самарский государственный медицинский университет» Минздрава России поступил пациент Г.А.Н. в возрасте 27 лет с жалобами на боли в эпигастрии, чувство тошноты. В процессе эзофагогастродуоденоскопии в антральном отделе желудка были обнаружены множественные свежие эрозии, слизистая отёчная, взят биопсийный материал. В результате проведенных эндоскопического и цитологического исследований был подтвержден диагноз - пилорический хеликобактериоз. Биопсийный материал исследован гистологически (средняя обсемененность Helicobacter pylori). Также у пациента Г.А.Н. были собраны фекалии.

Из биопсийного материала после обработки протеиназой К произведена экстракция нуклеиновых кислот набором реагентов для выделения нуклеиновых кислот из биологического материала НК-сорбент для диагностики in vitro в варианте исполнения «Tissue» (ООО НПФ «Литех», Россия). Из образцов фекалий после пробоподготовки (приготовления фекальной суспензии из 0,8 мл фосфатного буфера (или стерильного изотонического раствора натрия хлорида) и 0,1 г (0,1 мл) фекалий) произведена экстракция нуклеиновых кислот комплектом реагентов для выделения нуклеиновых кислот ПРОБА-НК (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия). Полученные образцы ДНК в объеме 15 мкл были добавлены в микропробирки с подготовленными в них реакционными смесями для первого набора праймеров в объеме 10 мкл, была проведена полимеразная цепная реакция с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени на амплификаторе «ДТпрайм» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия).

Состав первого набора праймеров: прямой праймер HP_F_N1 (SEQ ID NO 4): 5'-CGGGATGCTTAATGCGTTAGC-3', обратный праймер HP_R_N1 (SEQ ID NO 5): 5'-GCTGGAACATTACTGACGCTGATT-3', флуоресцентно-меченый ДНК-зонд HP_P_N1 (SEQ ID NO 6): 5'-FAM-ACTAAGCCCTCCAACAACTAGCATCCATC-BHQ1-3'.

Амплификация проводилась согласно программе: 1 цикл: 95°C 2 минуты; 5 циклов: 95°C 15 секунд, 64°C 20 секунд; 40 циклов: 95°C 15 минут, 64°C 20 секунд (на этом этапе необходима детекция флуоресцентного сигнала по каналу FAM/Green). При исследовании результатов, был зафиксирован рост уровня флуоресценции в соответствующих пробирках, при этом кривые роста флуоресценции имели S-образную форму, имели пересечение с пороговой линией на 25-м цикле амплификации. Следовательно, ДНК Helicobacter pylori обнаружена в исследуемых образцах, что подтверждает диагноз.

Клинический пример №2

В гастроэнтерологическое отделение КФТ Клиник ФГБОУ ВО «Самарский государственный медицинский университет» Минздрава России поступил пациент Ч.А.В. в возрасте 35 лет с жалобами на боли в эпигастрии, однократную рвоту. В процессе эзофагогастродуоденоскопии были обнаружены свежие множественные эрозии в антральном отделе желудка, слизистая отёчная, неярко гиперемирована, взят биопсийный материал. В результате проведенных эндоскопического и цитологического исследований был подтвержден диагноз - пилорический хеликобактериоз. Биопсийный материал исследовали гистологически (низкая обсемененность Helicobacter pylori). Также у пациента Ч.А.В. были собраны фекалии.

Из биопсийного материала после обработки протеиназой К произведена экстракция нуклеиновых кислот набором реагентов для выделения нуклеиновых кислот из биологического материала НК-сорбент для диагностики in vitro в варианте исполнения «Tissue» (ООО НПФ «Литех», Россия). Из образцов фекалий после пробоподготовки (приготовление фекальной суспензии из 0,8 мл фосфатного буфера (или стерильного изотонического раствора натрия хлорида) и 0,1 г (0,1 мл) фекалий) произведена экстракция нуклеиновых кислот комплектом реагентов для выделения нуклеиновых кислот ПРОБА-НК (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия). Полученные образцы ДНК в объеме 15 мкл были добавлены в микропробирки с подготовленными в них реакционными смесями для второго набора праймеров в объеме 10 мкл, была проведена полимеразная цепная реакция с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени на амплификаторе «ДТпрайм» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия).

Состав второго набора праймеров: прямой праймер HP_23S_F1n(60) (SEQ ID NO 7): 5`-GAAGGTTAAGAGGATGCGTC-3`, обратный праймер HP_23S_R3(60.9) (SEQ ID NO 8): 5`-AATCTCTGGTTGAGACAGCT-3`, флуоресцентно-меченый ДНК-зонд HP_23S_P2-1 (SEQ ID NO 3): 5`-FAM-TTGAAGCCCGAGTAAACGGCGGC-BHQ1-3'.

Амплификация проводилась согласно программе: 1 цикл: 95°C 2 минуты; 5 циклов: 95°C 15 секунд, 64°C 20 секунд; 40 циклов: 95°C 15 минут, 64°C 20 секунд (на этом этапе необходима детекция флуоресцентного сигнала по каналу FAM/Green). При исследовании результатов, был зафиксирован рост уровня флуоресценции в соответствующих пробирках, при этом кривые роста флуоресценции имели S-образную форму, имели пересечение с пороговой линией на 27-м цикле амплификации. Следовательно, ДНК Helicobacter pylori обнаружена в исследуемых образцах, что подтверждает диагноз.

Клинический пример №3

В гастроэнтерологическое отделение КФТ Клиник ФГБОУ ВО «Самарский государственный медицинский университет» Минздрава России поступил пациент Ш.В.Р. в возрасте 56 лет с жалобами на чувство изжоги, чувство «тяжести» и боли в эпигастрии. В процессе эзофагогастродуоденоскопии была обнаружены выраженные эрозии в антральном отделе желудка, слизистая отёчная, диффузно гиперемирована с участками дистрофии, взят биопсийный материал. В результате проведенных эндоскопического и цитологического исследований был подтвержден диагноз - пилорический хеликобактериоз. Биопсийный материал исследовали гистологически (высокая обсемененность Helicobacter pylori). Также у пациента Ш.В.Р. были собраны фекалии.

Из биопсийного материала после обработки протеиназой К произведена экстракция нуклеиновых кислот набором реагентов для выделения нуклеиновых кислот из биологического материала НК-сорбент для диагностики in vitro в варианте исполнения «Tissue» (ООО НПФ «Литех», Россия). Из образцов фекалий после пробоподготовки (приготовление фекальной суспензии из 0,8 мл фосфатного буфера (или стерильного изотонического раствора натрия хлорида) и 0,1 г (0,1 мл) фекалий) произведена экстракция нуклеиновых кислот комплектом реагентов для выделения нуклеиновых кислот ПРОБА-НК (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия). Полученные образцы ДНК в объеме 15 мкл были добавлены в микропробирки с подготовленными в них реакционными смесями для третьего набора праймеров в объеме 10 мкл, была проведена полимеразная цепная реакция с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени на амплификаторе «ДТпрайм» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия).

Состав третьего набора праймеров: прямой праймер HP_23S_F2-5 (SEQ ID NO 1): 5`-TCAGTCGCAAGATGAAGCGT-3`, обратный праймер HP_23S_R3 (SEQ ID NO 2): 5`-GAATCTCTGGTTGAGACAGCTCC-3`, флуоресцентно-меченый ДНК-зонд HP_23S_P2-1 (SEQ ID NO 3): 5`-FAM-TTGAAGCCCGAGTAAACGGCGGC-BHQ1-3'.

Амплификация проводилась согласно программе: 1 цикл: 95°C 2 минуты; 5 циклов: 95°C 15 секунд, 64°C 20 секунд; 40 циклов: 95°C 15 минут, 64°C 20 секунд (на этом этапе необходима детекция флуоресцентного сигнала по каналу FAM/Green). При исследовании результатов, был зафиксирован рост уровня флуоресценции в соответствующих пробирках, при этом кривые роста флуоресценции имели S-образную форму, имели пересечение с пороговой линией на 23-м цикле амплификации. Следовательно, ДНК Helicobacter pylori обнаружена в исследуемых образцах, что подтверждает диагноз.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing originalFreeTextLanguageCode="ru"

nonEnglishFreeTextLanguageCode="ru" dtdVersion="V1_3"

fileName="04-02-25 Набор праймеров.xml" softwareName="WIPO Sequence"

softwareVersion="2.3.0" productionDate="2025-02-04">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2024103594</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2024-02-13</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное

бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Самарский

государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения

Российской Федерации</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Federal State Budgetary Educational Institution

of Higher Education «Samara State Medical University» of the Ministry

of Healthcare of the Russian Federation</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Сустретов Алексей

Сергеевич</InventorName>

<InventorNameLatin>Sustretov Aleksey Sergeevich</InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Наборы олигонуклеотидов для

выявления ДНК бактерии Helicobacter pylori в клиническом материале

методом полимеразной цепной реакции в режиме реального

времени</InventionTitle>

<InventionTitle languageCode="en">Sets of oligonucleotides for the

detection of Helicobacter pylori DNA in clinical samples using

real-time polymerase chain reaction</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>8</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q21">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tcagtcgcaagatgaagcgt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q28">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gaatctctggttgagacagctcc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q25">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q26">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>fluorescent dye FAM</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>флуоресцентный краситель

FAM</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>23</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q27">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>fluorescence quencher

BHQ1</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>гаситель флуоресценции

BHQ1</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ttgaagcccgagtaaacggcggc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q30">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cgggatgcttaatgcgttagc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="5">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q32">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gctggaacattactgacgctgatt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="6">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>29</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..29</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q35">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q36">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>fluorescent dye FAM</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>флуоресцентный краситель

FAM</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>29</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q37">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>fluorescence quencher

BHQ1</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>гаситель флуоресценции

BHQ1</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>actaagccctccaacaactagcatccatc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="7">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q39">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gaaggttaagaggatgcgtc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="8">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q41">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>aatctctggttgagacagct</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к набору олигодезоксирибонуклеотидных праймеров. Указанный набор предназначен для идентификации ДНК бактерии Helicobacter pylori в клиническом материале методом полимеразной цепной реакции в реальном времени и содержит прямой праймер с последовательностью SEQ ID NO: 1, обратный праймер с последовательностью SEQ ID NO: 2 и флуоресцентно-меченый ДНК-зонд с последовательностью SEQ ID NO: 3. Настоящее изобретение обеспечивает набор олигонуклеотидов, который позволяет эффективно выявлять ДНК Helicobacter pylori. 3 пр.

Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров для идентификации ДНК бактерии Helicobacter pylori в клиническом материале методом полимеразной цепной реакции в реальном времени, который содержит:

прямой праймер HP_23S_F2-5 (SEQ ID NO: 1): 5`-TCAGTCGCAAGATGAAGCGT-3`,

обратный праймер HP_23S_R3 (SEQ ID NO: 2): 5`-GAATCTCTGGTTGAGACAGCTCC-3`,

флуоресцентно-меченый ДНК-зонд HP_23S_P2-1 (SEQ ID NO: 3): 5`-FAM-TTGAAGCCCGAGTAAACGGCGGC-BHQ1-3'.