СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНОТИПА ЧЕЛОВЕКА ПО МУТАЦИИ с.1236GA В 11 ЭКЗОНЕ ГЕНА DPYD Российский патент 2019 года по МПК C12N15/00 

Описание патента на изобретение RU2709645C1

Предложенный способ относится к области биотехнологии, молекулярной биологии и генетики, и может быть использован для определения генотипа человека по мутации c.1236G>A (p.E412E, rs556038477) в 11 экзоне гена DPYD (ENST00000370192.7, RefSeq NM_000110) с отнесением исследуемого образца к гомозиготе по «дикому типу» или гетерозиготе по диагностируемому аллельному варианту.

Фармакогенетическое тестирование с целью прогноза развития токсических и побочных эффектов при проведении лекарственного лечения является одним из активно развивающихся направлений в ДНК-тестировании и постепенно занимает свое место во многих клинических рекомендациях по лечению злокачественных новообразований. Разработка и внедрение способа тестирования полиморфных вариантов в гене DPYD, одобренного FDA (Food and Drug Administration) и включенного в рекомендации ESMO (European Society of Clinical Oncology) для прогнозирования токсичности химиотерапии при лечении ряда злокачественных новообразований, является одним из приоритетных направлений в фармакогенетическом тестировании.

Ген DPYD кодирует фермент дигидропиримидиндегидрогеназу, функциональная недостаточность которой, приводит к развитию 5-фторурацил-ассоциированной токсичности (OMIM 274270) при назначении 5-фторурацила и капецитабина («Кселода»). ДНК-диагностика, основанная на определении генотипа человека по мутациям и полиморфизмам в гене DPYD, необходима для прогнозирования развития осложнений, ассоциированных с приемом данных лекарственных препаратов, коррекции дозы и схемы проводимого лечения.

Широко распространен способ определения полиморфных вариантов и мутаций в гене DPYD с помощью секвенирования по Сэнгеру всей кодирующей последовательности гена DPYD (Kuilenburg, A. Analysis of severely affected patients with dihydropyrimidine dehydrogenase defeciency reveals large intragenic rearrangements of DPYD and a de novo interstitial deletion del(1)(p13.3p21.3) / Kuilenburg A., Meijer J., Mul A. et al. // Hum.Genet. - 2009. - V.125. - P.589-590).

Недостатки: трудоемкость, высокая стоимость проведения исследования.

Известен способ генотипирования полиморфных вариантов в гене DPYD, основанный на применении метода ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени (Real-time PCR) (Deenen, M. Relationship between Single Nucleotide Polymorphisms and Haplotypes in DPYD and Toxicity and Efficacy of Capecitabine in Advanced Colorectal Cancer / Deenen, M., Tol J., Burylo A. et al. // Clin. Cancer Res. - V. 17. - P. 3455-3468).

Недостатки: высокая стоимость проведения исследования.

Известен способ определения полиморфных вариантов в гене DPYD, основанный на гибридизации на чипах с применением аллель-специфичных зондов (т.н. SNP-array) (Rosmarin, D. Genetic Markers of Toxicity From Capecitabine and Other Fluorouracil-Based Regimens: Investigation in the QUASAR2 Study, Systematic Review and Meta-Analysis / Dan R., Palles C., Church D. et al. // Journal of clinical oncology. - 2014. - V. 32).

Недостатки: трудоемкость, высокая стоимость проведения исследования, потребность совместимого оборудования.

Известен способ ДНК-тестирования мутаций в гене DPYD с помощью ПЦР с последующим анализом длины рестрикционных фрагментов, т.н. ПДРФ-анализ (Restriction Fragment Length Polymorphism - RFLP analysis) (Uzunkoy, A. Investigation of IVS14+1G>A polymorphism of DPYD gene in a group of Turkish patients with colorectal cancer / Uzunkoy A., Dilmec F., Ozgonul A. et al. // Anticancer Res. - 2007. - V. 27. - P. 3899-3902).

Недостатки: трудоемкость, времязатратность.

Одним из способов диагностики мутаций в гене DPYD является высокоэффективная жидкостная хроматография (Ezzeldin, H. Denaturing high performance liquid chromatography analysis of the DPYD gene in patients with lethal 5-fluorouracil toxicity / Ezzeldin, H.,Johnson MR, Okamoto, Y. et al. // Clin. Cancer Res. - 2003. - V. 1. - P. 3021-3028).

Недостатки: трудоемкость, высокая стоимость проведения исследования, потребность совместимого оборудования.

Задачей заявляемого изобретения является разработка оптимального способа определения генотипа человека по мутации c.1236G/A в 11 экзоне гена DPYD, ответственного за развитие токсических побочных эффектов при назначении 5-фторурацила и его аналогов.

Задача решается путем подбора специфичных оригинальных олигонуклеотидyных последовательностей, образующих короткий фрагмент ДНК, который включает фрагмент гена DPYD с искомым вариантом, и оптимизации ПЦР с помощью адаптированного оригинального буфера для Taq-полимеразы. Высокая специфичность заявляемого способа диагностики мутации c.1236G/A достигается за счет оригинального дизайна олигонуклеотидов, позволяющих получить короткий целевой фрагмент гена.

Техническим результатом заявляемого изобретения является широкая доступность, высокая чувствительность и специфичность при низкой стоимости исследования. Реакционные смеси включают специфичные оригинальные последовательности олигонуклеотидов, а также адаптированный буфер для Taq-полимеразы, позволяющий повысить чувствительность метода. Изобретение позволяет снизить затраты на молекулярно-генетическое исследование, повысить его доступность и точность тестирования за счет применения оригинальных олигонуклеотидных последовательностей и оптимизированных реакционных смесей.

Технический результат достигается путем подбора специфичных оригинальных последовательностей олигонуклеотидов, оптимизации условий проведения ПЦР с использованием оригинального состава буфера для Taq-полимеразы, отработки технических условий для проведения HRM-анализа.

Последовательность специфичных оригинальных олигонуклеотидов приведена в Перечне последовательности олигонуклеотидов

Копия перечня последовательностей, представленная на машиночитаемом носителе, идентична перечню последовательностей в печатной форме.

Используются последовательности олигонуклеотидов:

SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2.

Подбор последовательностей олигонуклеотидов включает: дизайн олинуклеотидов, строго комплементарных целевой последовательности ДНК. Длина образуемого фрагмента ДНК составляет 91 пара нуклеотидов.

Состав буфера для Taq-полимеразы: Трис-HCl 67 mM, (NH4)2SO166 mM, tween-20 0,1%, глицерин 1%, рН 8,7;

- Режим проведения ПЦР:

1 этап: денатурация при t=95° С в течение 5 мин

2 этап: 50 циклов ПЦР

- денатурация при t=95° С в течение 15 сек

- отжиг олигонуклеотидов при t=58° С в течение 15 сек

- элонгация при t=72° С в течение 40 сек

3 этап: элонгация при t=72° в течение 2 мин.

4 этап: плавление продуктов ПЦР при t=72° - 95° C

5 этап: охлаждение и хранение при t=95° - 12° C.

Детекция флуоресцентного сигнала осуществляется как во время отжига олигонуклеотидов на каждом цикле ПЦР, так и при плавлении продуктов ПЦР с частотой 45 на 1 0C.

Изобретение иллюстрируется чертежом, на котором представлено графическое изображение образцов ДНК с различными генотипами по мутации c.1236G>A.

Изобретение иллюстрируется примерами 1 и 2.

Пример 1.

Ф.И.О.: Пациент М.

Возраст: 1964 г.р.

Диагноз: Cr. сигмовидной кишки.

Выполнено молекулярно-генетическое исследование по заявляемому способу - анализ последовательности кодирующей части гена дигидропиримидиндегидрогеназы (DPYD) на предмет наличия герминальной мутации c.1236G>A (p.Е412Е, rs556038477), ассоциированной с повышенной токсичностью при назначении 5-фторурацила и капецитабина («Кселода») в процессе ПХТ.

Результат: При исследовании ДНК, выделенной из лимфоцитов периферической крови, герминальных мутаций в 11 экзоне гена DPYD не выявлено.

Пример 2.

Ф.И.О.: Пациент К.

Возраст: 1957 г.р.

Диагноз: Cr. желудка.

Выполнено молекулярно-генетическое исследование по заявляемому способу - анализ последовательности кодирующей части гена дигидропиримидиндегидрогеназы (DPYD) на предмет наличия герминальной мутации c.1236G>A (p.Е412Е, rs556038477), ассоциированной с повышенной токсичностью при назначении 5-фторурацила и капецитабина («Кселода») в процессе ПХТ.

Результат: При исследовании ДНК, выделенной из лимфоцитов периферической крови, в 11 экзоне гена DPYD выявлена герминальная мутация c.1236G>A (p.Е412Е, rs556038477) в гетерозиготном состоянии.

Выявленная герминальная мутация c.1236G>A в гене DPYD зарегистрирована в международных базах данных dbSNP и Ensembl.genome как высоко-патогенный клинически значимый вариант, ассоциированный с высоким риском развития токсичности при использовании 5-фторурацила и капецитабина («Кселода»).

Похожие патенты RU2709645C1

название год авторы номер документа
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНОТИПА ЧЕЛОВЕКА ПО МУТАЦИИ c.496AG B 6 ЭКЗОНЕ ГЕНА DPYD 2019
  • Любченко Людмила Николаевна
  • Семьянихина Александра Владимировна
  • Поспехова Наталья Ивановна
  • Головина Дарья Андреевна
  • Сафронова Вера Михайловна
  • Мамедли Заман Заур Оглы
  • Мещеряков Андрей Альбертович
  • Филиппова Маргарита Геннадьевна
  • Стилиди Иван Сократович
RU2701375C1
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНОТИПА ЧЕЛОВЕКА ПО МУТАЦИИ IVS14+1GA B 14 ИНТРОНЕ ГЕНА DPYD 2019
  • Любченко Людмила Николаевна
  • Стилиди Иван Сократович
  • Мамедли Заман Заур Оглы
  • Поспехова Наталья Ивановна
  • Семьянихина Александра Владимировна
  • Филиппова Маргарита Геннадьевна
  • Чаплыгин Евгений Юрьевич
RU2709710C1
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНОТИПА ЧЕЛОВЕКА ПО ПОЛИМОРФИЗМУ UGT1A1*6/*28 В ПРОМОТЕРНОЙ ОБЛАСТИ ГЕНА UGT1A1 2019
  • Любченко Людмила Николаевна
  • Семьянихина Александра Владимировна
  • Поспехова Наталья Ивановна
  • Головина Дарья Андреевна
  • Сафронова Вера Михайловна
  • Мамедли Заман Заур Оглы
  • Мещеряков Андрей Альбертович
  • Филиппова Маргарита Геннадьевна
  • Стилиди Иван Сократович
RU2703805C1
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ОПУХОЛИ ЛЕГКОГО К ТЕРАПИИ ИНГИБИТОРАМИ ТИРОЗИНКИНАЗ 2012
  • Иевлева Аглая Геннадиевна
  • Митюшкина Наталья Владимировна
  • Полторацкий Артем Николаевич
  • Янус Григорий Аркадьевич
  • Зайцева Ольга Александровна
  • Яцук Ольга Станиславовна
  • Иванцов Александр Олегович
  • Орлов Сергей Владимирович
  • Новик Виктор Иванович
  • Того Александр Викторович
  • Имянитов Евгений Наумович
RU2499994C1
Способ анализа терминальных мутаций в генах BRCA1, BRCA2, ATM и PALB2 с использованием мультиплексной ПЦР и последующей гибридизацией с олигонуклеотидным биологическим микрочипом (биочипом) 2020
  • Тюляндин Сергей Алексеевич
  • Емельянова Марина Александровна
  • Покатаев Илья Анатольевич
  • Фесенко Денис Олегович
  • Абрамов Иван Сергеевич
  • Хомич Дарья Александровна
  • Заседателев Александр Сергеевич
RU2729360C1
НАБОР ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ГЕРМИНАЛЬНЫХ МУТАЦИЙ В ГЕНЕ RET, АССОЦИИРОВАННЫХ С НАСЛЕДСТВЕННОЙ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТЬЮ К РАКУ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ 2013
  • Любченко Людмила Николаевна
  • Наседкина Татьяна Васильевна
  • Амосенко Фаина Аркадьевна
  • Абрамов Иван Сергеевич
  • Филиппова Маргарита Геннадьевна
RU2524433C1
Способ определения мутаций в гене CALR методом анализа кривых плавления у больных хроническими миелопролиферативными заболеваниями 2019
  • Кесаева Лаура Артуровна
  • Финашутина Юлия Павловна
  • Тихонова Вера Вячеславовна
  • Солопова Ольга Николаевна
  • Касаткина Наталья Николаевна
  • Лыжко Наталья Александровна
  • Мисюрин Андрей Витальевич
RU2722077C1
Способ диагностики варианта SOPH c.5741G>A в гене NBAS 2024
  • Жожиков Леонид Русланович
  • Васильев Филипп Филиппович
  • Данилова Анастасия Лукична
  • Гурьев Анатолий Арсенович
  • Максимова Анастасия Анатольевна
  • Сухомясова Айталина Лукична
  • Максимова Надежда Романовна
RU2819985C1
Способ диагностики мукополисахаридоз-плюс синдрома 2022
  • Васильев Филипп Филиппович
  • Максимова Надежда Романовна
  • Сухомясова Айталина Лукична
  • Новгородова Сайына Николаевна
  • Гуринова Елизавета Егоровна
  • Степанова Светлана Кимовна
RU2798695C1
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ОПУХОЛИ У ПАЦИЕНТОВ С РАКОМ ЛЕГКОГО К ТЕРАПИИ ГЕФИТИНИБОМ 2010
  • Того Александр Викторович
  • Иевлева Аглая Геннадьевна
  • Соколенко Анна Петровна
  • Суспицын Евгений Николаевич
  • Митюшкина Наталья Владимировна
  • Янус Григорий Аркадьевич
  • Городнова Татьяна Владимировна
  • Зайцева Ольга Александровна
  • Яцук Ольга Станиславовна
  • Моисеенко Федор Владимирович
  • Проценко Светлана Анатольевна
  • Иванцов Александр Олегович
  • Мацко Дмитрий Евгеньевич
  • Левченко Евгений Владимирович
  • Моисеенко Владимир Михайлович
  • Имянитов Евгений Наумович
RU2454464C2

Иллюстрации к изобретению RU 2 709 645 C1

Реферат патента 2019 года СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНОТИПА ЧЕЛОВЕКА ПО МУТАЦИИ с.1236GA В 11 ЭКЗОНЕ ГЕНА DPYD

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ, заключающийся в применении специфичных олигонуклеотидных последовательностей с регистрацией результатов ЦПР в режиме реального времени с использованием метода анализа кривых плавления (HRM). Реакционные смеси включают специфичные праймеры, а также адаптированный буфер для Taq-полимеразы, позволяющий повысить чувствительность метода. Изобретение позволяет снизить затраты на молекулярно-генетическое исследование, повысить его доступность и точность тестирования за счет применения оригинальных олигонуклеотидных последовательностей и оптимизированных реакционных смесей. 1 ил., 2 пр.

Формула изобретения RU 2 709 645 C1

Способ определения генотипа человека по мутации c.1236G>A в 11 экзоне гена DPYD, включающий проведение ПЦР в режиме реального времени с детекцией результатов с помощью метода анализа кривых плавления (HRM), отличающийся использованием специфичных последовательностей олигонуклеотидов SEQ ID NO 1 и SEQ ID NO 2 и оптимизацией ПЦР с помощью применения адаптированного буфера для Taq-полимеразы состава: Трис-HCl 67 mM, (NH4)2SO4 166 mM, tween-20 0,1%, глицерин 1%, рН 8,7.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2019 года RU2709645C1

UZUNKOY A., tt al., Investigation of IVS14+1G>A Polymorphism of DPYD Gene in a;Group of Turkish patients with colorectal cancer, Anticancer Res., v.27, p.3899-3902
KUILENBURG, A
et al., Analysis of severely affected patients with dihydropyrimidine dehydrogenase defeciency reveals large intragenic rearrangements of DPYD and a de novo

RU 2 709 645 C1

Авторы

Любченко Людмила Николаевна

Семьянихина Александра Владимировна

Поспехова Наталья Ивановна

Головина Дарья Андреевна

Сафронова Вера Михайловна

Мамедли Заман Заур Оглы

Мещеряков Андрей Альбертович

Филиппова Маргарита Геннадьевна

Стилиди Иван Сократович

Даты

2019-12-19Публикация

2019-03-26Подача