Способ определения мутаций в гене CALR методом анализа кривых плавления у больных хроническими миелопролиферативными заболеваниями Российский патент 2020 года по МПК C12Q1/6804 

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для диагностики выявления хронических миелопролиферативных заболеваний (ХМПЗ), и касается способа определения мутаций в гене кальретикулина (CALR). С 2016 года молекулярно-генетические исследования для определения соматических мутаций в гене кальретикулина (CALR) включены в клинические рекомендации ВОЗ в качестве одних из основных диагностических критериев миелопролиферативных заболеваний (МПЗ) [Arber DA, Orazi A, Hasserjian R, Thiele J, Borowitz MJ, Le Beau MM et al. The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute leukemia. Blood. 2016; 127(20): 2391-405]. Примерно в 25% - 35% случаев эссенциальной тромбоцитемии (ЭТ) и первичного миелофиброза (ПМФ) обнаруживаются мутации в гене CALR. Пациенты при ЭТ и ПМФ с мутациями гена CALR имеют лучшую общую выживаемость по сравнению с теми, у кого не выявлено данной мутации.

Ген CALR расположен на коротком плече 19 хромосомы и состоит из 9 экзонов. Кальретикулин (CALR, идентификационный номер NG_029662.1) является Са2+- связывающим белком, расположенным преимущественно в эндоплазматическом ретикулуме. Двумя основными функциями CALR являются шаперонная функция и функция регулирования кальциевого гемостаза. Как шаперон, он участвует в фолдинге и контроле синтеза гликопротеинов, вовлечен в регуляцию Са2+- зависимых сигнальных процессов, в том числе апоптоз клеток, их миграцию, адгезию и множество других клеточных функций. Клинически значимые для МПЗ мутации в гене CALR вызывают сдвиг рамки считывания и обрыв терминального С-участка синтезируемой пептидной цепочки. В результате у образующегося белка отсутствует аминокислотная последовательность «возврата-задержки» Lys-Asp-Glu-Leu, ответственная за удержание кальретикулина в эндоплазматическом ретикулуме. Показано, что в таком «укороченном» варианте кальретикулин способен выступать в качестве «нефизиологического» стимулятора рецепторов тромбопоэтина, тем самым провоцируя гиперактивацию сигнального пути MPL-JAK2-STAT и вызывая избыточную пролиферацию мегакариобластов. Наиболее часто в 9-м экзоне CALR встречаются мутация I типа: делецияс.1092_1143del52bp - 53-65%, и II типа: инсерция c.1154_1155insTTGTC - 32%, в остальных 3-15% случаев определяются редкие типы мутаций. В связи с тем, что делеции в отличие от инсерций сопровождаются утратой существенной части Са2+- связывающей области белка, I тип мутаций характеризуется также и снижением мобилизации цитоплазматического Са2+ в ответ на активационные стимулы. Пациенты с мутациями в гене CALR отличаются ранним началом заболевания, имеют более высокие значения тромбоцитоза, но при этом меньший риск развития серьезных тромботических и геморрагических осложнений.

На данный момент мутации в гене CALR могут быть идентифицированы с помощью молекулярно-генетических методов диагностики: секвенирование ДНК, ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ), оригинальной ПЦР с электрофоретической детекцией.

Известно одновременное исследование всех возможных мутаций в ДНК с использованием методов секвенирования ДНК [Langabeer SE, Andrikovics Н, Asp J, et al. Molecular diagnostics of myeloproliferative neoplasms. Eur J Haematol. 2015, 95:270-279] и микрочипов.

Известен способ, который заключается в использовании аллель-специфичных праймеров с регистрацией результатов ПЦР в режиме реального времени с использованием флуоресцентно-меченных проб. Реакционная смесь включает праймеры, отличающиеся для каждого аллеля, и общие для двух аллелей праймер и пробу, а также общий флуоресцентный зонд [RU, п. 2445373, МПК C12Q 1/68, опубл. 20.03.2012 г., бюл. №8).

Известен способ диагностики Ph-негативных миелопролиферативных новообразований, представляющий собой мультиплексный вариант полимеразной цепной реакции с участием специфичных праймеров и зондов (RU 2679653 С1, МПК C12Q 1/68 (2019.02), опубл. 12.02.2019, бюл. №5).

Каждый из этих методов имеет разную чувствительность и эффективность. Предел чувствительности метода секвенирования по Сэнгеру 10-25%, а ПЦР- РВ и ПЦР с электрофоретической детекцией- 5-10% [1) Jones AV, Ward D, Lyon M, Leung W, Callaway A, Chase A, Dent CL, White HE, Drexler HG, Nangalia J, Mattocks C, Cross NC. Evaluation of methods to detect CALR mutations in myeloproliferative neoplasms. Leuk Res 2015; 39(1): 82-87. Available at: https://www.lrjournal.com/article/S0145-2126(14)00371-3/abstract (Aug. 2018); 2) Luo W, Zhongxin Yu Z. Ca/reticulin (CALR) mutation in myeloproliferative neoplasms (MPNs). Stem Cell Investig 2015; 2: 16. available at: http://sci.amegroups.com/article/view/7264/8051 (Aug. 2018)]. Секвенирование является достаточно точным методом, но при этом дорогостоящим и требует много времени на подготовку, не говоря уже о последующем трудоемком аналитическом этапе. Помимо этого, аллель- специфическая ПЦР-РВ позволяет определить лишь те мутации, на которые непосредственно отжигается праймер, также, как и мультиплексный вариант. Аллель-специфическая ПЦР с последующей электрофоретической детекцией позволяет определить мутации всего гена, но при низкой аллельной нагрузке повышается вероятность ложноотрицательных результатов.

Анализ кривых плавления имеет ряд преимуществ перед существующими аналогами, прежде всего выражающихся в высокой чувствительности/ специфичности (до 100%) и возможности совмещения полимеразной реакции с самим этапом детекции мутаций. Принцип метода основан на дифференциации образцов ДНК, несущих потенциальные мутации, по форме или сдвигу кривых плавления. Анализ кривых плавления широко представлен в клинической лабораторной диагностике из-за его чувствительности (предел чувствительности до 5%), низкой стоимости и быстроты. Протокол анализа кривых плавления может быть завершен в течение нескольких часов после выделения ДНК из полученного биологического материала. Более распространенные типы мутаций можно идентифицировать без дополнительных исследований, поскольку любой дефект гена (точечная мутация, делеция, инсерция) имеет свой индивидуальный вид кривой плавления. При этом образцы, показавшие нормальный результат по анализу кривых плавления, могут не исследоваться дальше, так как либо не имеют мутаций вообще, либо доля клеток с мутациями настолько мала, что не может быть детектирована.

Задачей заявляемого изобретения является создание простого и высокочувствительного метода скрининга мутаций в гене CALR, который можно использовать в клинической диагностике.

Технический результат заявляемого изобретения состоит в том, что создан способ определения мутации в гене CALR у больных хроническими миелопролиферативными заболеваниями, который обладает более высокой чувствительностью и специфичностью определения мутантного клона за более короткое время.

Сущность способа состоит в следующем: способ определения мутаций в гене CALR основан на постановке реакции анализа кривых плавления. Способ содержит праймеры, покрывающие 9-й экзон гена CALR с прилежащими участками интронов (прямой праймер SEQ ID NO: 1, обратный праймер SEQ ID NO: 2). В качестве объекта исследования использовали ДНК из лейкоцитов, полученную с помощью набора реагентов «ДНК-экстракт» («ГеноТехнология», Москва) согласно инструкции производителя, выделенной из образцов крови больных хроническими миелопролиферативными заболеваниями. Нуклеотидные последовательности праймеров, используемые для проведения детекции, представлены в Перечне последовательностей.

Представленный перечень последовательностей идентичен перечню последовательностей на электронном носителе.

В качестве праймеров для определения мутаций в гене CALR использовали систему, состоящую из прямого праймера SEQ ID NO: 1, и обратного праймера SEQ ID NO: 2.

В обычной лабораторной практике метод анализа кривых плавления способен обнаруживать мутации CALR при достаточно низкой аллельной нагрузке. Метод включает следующие этапы:

1. Получение ДНК из лейкоцитов с помощью набора реагентов «ДНК-экстракт» («ГеноТехнология», Москва) согласно инструкции производителя.

2. Амплификацию фрагмента ДНК с помощью праймеров SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2. Для постановки анализа кривых плавления использовали 10-100 нг ДНК исследуемого образца.

3. Анализ исследуемого образца проводили с образцами кривых плавления здоровых доноров (CALR дикого типа), один положительный контроль с мутацией 1-го типа и один положительный контроль с мутацией 2-го типа, а также отрицательный контроль- вода, которые должны быть включены в каждый эксперимент. Постановку анализа кривых плавления производили в конечном объеме 20 мкл с помощью флуоресцентного красителя 5Х ПЦР-буфер-SybrGreen..

Способ осуществляется следующим образом:

1. Выделение тотальной ДНК из клинических образцов. ДНК выделяли из лейкоцитов с помощью набора реагентов «ДНК-экстракт» («ГеноТехнология», Москва) согласно инструкции производителя. Этот способ позволяет получить наибольшее количество ДНК из биологического материала.

2. Анализ кривых плавления на определение мутаций в гене CALR проводили на приборе Light Cycler*96 (ROCHE). Объем реакционной смеси для теста- 20 мкл. В качестве флуоресцентного красителя использовали 5Х ПЦР-буфер-SybrGreen (Evrogen)-, 1 ед. Taq-полимеразы («Sileks»), 200 нМ каждого праймера, вода. Общий объем рассчитывался по формуле: 20 мкл × (N+1), где N - число реакций (пробирок, лунок).

Смесь праймеров для определения мутаций в гене CALR представляла собой 5 мкМ водный раствор смеси олигонуклеотидов (производства «ДНК-Синтез», Россия, или аналогичный).

В качестве флуоресцентного красителя использовали 5Х ПЦР-буфер-SybrGreen (Evrogen). Тип флюорофора- SybrGreen.

Вода представляла собой деионизованную воду с удельным сопротивлением не менее 18 Мом/см.

ДНК-полимераза представляла собой раствор термостабильной ДНК-полимеразы происхождения Thermus aquaticus, обладающей 5'->3' экзонуклеазной активностью, с ферментативной активностью 5 Ед/мкл в буфере для хранения (производства «Силекс», Россия, или аналогичный).

Положительные контроли включали контрольные пробы, содержащие здоровых доноров (CALR дикого типа), один положительный контроль с мутацией 1-го типа и один положительный контроль с мутацией 2-го типа, а также отрицательный контроль-вода.

Температурные условия реакции амплификации: реакционная смесь была подвергнута первоначальной денатурации при 95°С в течение 10 минут с последующими 45 циклами, состоящими из денатурации при 95°С в течение 10 секунд, отжига при 58°С в течение 20 сек. Программа кривой плавления включала денатурацию при 95°С на 1 мин, повторное насыщение при 40°С в течение 1 мин и плавления от 67°С до 95°С, с рампой 4,4°С в секунду. Тип флюорофора: SYBR Green.

По значениям кривых плавления мутации 1-го и 2-го типов можно идентифицировать без дополнительных исследований, поскольку любой дефект гена (точечная мутация, делеция, инсерция) имеет свой индивидуальный вид кривой плавления. В постановку входят несколько контролей- положительные(мутации 1-й 2-го типов) и отрицательные (здоровые доноры- норма), а также вода в качестве контроля кантоминации. По ним идет сравнение всех исследуемых образцов. Образцы, показавшие нормальный результат по анализу кривых плавления, могут не исследоваться дальше, так как либо не имеют мутаций вообще, либо доля клеток с мутациями настолько мала, что не может быть детектирована. Для более точной и качественной постановки реакции каждый образец ставили в двух повторах. Протокол анализа кривых плавления может быть завершен в течение нескольких часов после выделения ДНК из полученного биологического материала.

Технология анализа кривых плавления с высокой степенью разрешения является простым и высокочувствительным методом скрининга мутаций в гене CALR, который можно использовать в клинической диагностике.

--->

Перечень последовательностей.

<110> Federal State Budgetary Institution «N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology» under Ministry of Health of Russia, Moscow, 115478, Kashirskoye shosse, 24.

<120> Способ определения мутаций в гене CALR методом кривых плавления у больных хроническими миелопролиферативными заболеваниями.

<160> NUMBER OF SEQ ID NOS: 2

<210> SEQ ID NO 1

<211> LENGTH: 23

<212> TYPE: PCR-primer

<213> ORGANISM: Artificial Sequence

<223> OTHER INFORMATION: forward primer CALR F1

<400> SEQUENCE: 1

CTG CAG GCA GCA GAG AAA CAA AT 23

<210> SEQ ID NO 2

<211> LENGTH: 22

<212> TYPE: PCR-primer

<213> ORGANISM: Artificial Sequence

<223> OTHER INFORMATION: reverse primer CALR R1

<400> SEQUENCE: 2

GGG ACA TCT TCC TCC TCA TCT T 22

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Заявляемый способ включает постановку анализа кривых плавления с использованием ДНК, выделенной из образцов крови больных хроническими миелопролиферативными заболеваниями. Изобретение включает в себя праймеры, покрывающие 9-й экзон гена CALR с прилежащими участками интронов: CALR-F1, CALR-R1. Способ позволяет выявить не только самые распространенные мутации гена CALR (мутация I типа: делеция с. 1092_1143del52bp; мутация II типа: инсерция c.1154_1155insTTGTC), но и нетипичные. Изобретение позволяет получить качественный результат в более короткие сроки.

Способ определения мутаций в гене CALR у больных хроническими миелопролиферативными заболеваниями методом анализа кривых плавления, отличающийся тем, что применяют одну стадию ПЦР для определения мутаций в гене CALR; используют праймеры, покрывающие 9-й экзон гена CALR с прилежащими участками интронов, состоящие из прямого праймера SEQ ID NO: 1 и обратного праймера SEQ ID NO: 2.