СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-МЕТИОНИНА Российский патент 2019 года по МПК C12P13/12 

[0001] Настоящее изобретение относится к способу получения L-метионина ферментативной реакцией между предшественником L-метионина, диметилдисульфидом (DMDS) и водородом. Изобретение относится также к двухстадийному способу получения L-метионина ферментативной реакцией между предшественником L-метионина и метилмеркаптаном, причем метилмеркаптан получают ферментативным гидрогенолизом DMDS с водородом.

[0002] Метионин представляет собой одну из незаменимых аминокислот в организме человека и широко применяется в качестве добавки для питания животных. Его применяют также в качестве исходного вещества для фармацевтических препаратов. Метионин выступает в качестве предшественника таких соединений, как холин (лецитин) и креатин. Он является также исходным веществом для синтеза цистеина и таурина.

[0003] S-аденозил-L-метионин (SAM) представляет собой производное соединение L-метионина и вовлечен в синтез различных нейротрансмиттеров в головном мозге. L-метионин и/или SAM ингибирует накопление липидов в организме и улучшает кровообращение в головном мозге, в сердце и в почках. L-метионин может быть использован также для облегчения расщепления, детоксикации и экскреции токсичных веществ или тяжелых металлов, таких как свинец. Он обладает противовоспалительным действием в отношении костей и болезней суставов и также представляет собой существенное питательное вещество для волос, противодействующее их преждевременному и нежелательному выпадению.

[0004] Метионин известен давно и его получают в промышленном масштабе химическими способами исходя из сырья, поступающего от нефтехимических предприятий, соответственно, например, описанию FR 2903690, WO 2008006977, US 2009318715, US 5990349, JP 19660043158 и WO 9408957. Без учета того факта, что эти способы получения не вписываются в процесс экологически перспективного развития, эти химические способы обладают недостатком, состоящим в получении смеси двух энантиомеров L и D в равных частях.

[0005] В литературных источниках были предложены полностью биологические синтезы бактериальной ферментацией с указанием преимущества, состоящего в отсутствии продуцирования L-энантиомера метионина, соответственно, например, описанию WO 07077041, WO 09043372, WO 10020290 и WO 10020681. Тем не менее, отсутствие до настоящего времени промышленной реализации в крупном масштабе позволяет предполагать, что эксплуатационные характеристики и/или себестоимость этих способов остаются неудовлетворительными.

[0006] Компанией "CJ Cheil-Jedang" и заявителем совместно были успешно реализованы в промышленном масштабе смешанные химико-биологические способы, в которых предшественник L-метионина получали бактериальной ферментацией и затем приводили в ферментативное взаимодействие с метилмеркаптаном для получения исключительно L-метионина (см. WO 2008013432 и/или WO 2013029690). В этих, хотя и очень высокопроизводительных, способах требуется осуществлять синтез in situ метилмеркаптана, в котором требуется осуществлять синтез водорода конверсией метана с водяным паром, синтез сероводорода гидрированием серы и синтез метилмеркаптана исходя из метанола и сероводорода, то есть требуется очень значительный парк оборудования, мало сопоставимый при реализации в промышленном масштабе с достаточно небольшим повышением годового производства по сравнению с уже существующим.

[0007] Таким образом, существует потребность в получении L-метионина смешанным способом, в котором парк оборудования, требуемый для синтеза метилмеркаптана, будет меньше, чем в случае синтеза исходя из водорода, сероводорода и метанола. В настоящем изобретении описывается именно этот аспект.

[0008] В настоящем изобретении предлагается на практике заменить метилмеркаптан в технологическом процессе, описанном далее (WO 2008013432 и/или WO 2013029690), диметилдисульфидом (DMDS):

[0009] В данном случае метилмеркаптан (MeSH) используют непосредственно на второй стадии. В настоящем изобретении предлагается заменить метилмеркаптан продуктом ферментативного гидрогенолиза диметилдисульфида на предварительной стадии или комбинировать совокупность реагентов в реакции по "однореакторной технологии", в случае которой из глюкозы и DMDS продуцируется L-метионин.

[0010] Касательно синтеза метилмеркаптана исходя из диметилдисульфида представленные далее элементы можно найти на предшествующем уровне техники.

[0011] В EP 0649837 предложен способ синтеза метилмеркаптана каталитическим гидрогенолизом с сульфидами переходных металлов исходя из диметилдисульфида с водородом. В этом способе, хотя и являющимся эффективным, требуются относительно высокие температуры около 200°C для достижения производительности, представляющей интерес в промышленном масштабе.

[0012] Специалистам в данной области техники известно также, что метилмеркаптан можно получать подкислением водного раствора метилмеркаптида натрия (CH₃SNa). У этого способа имеется большой недостаток, состоящий в образовании большого количества солей, таких как хлорид натрия или сульфат натрия, в зависимости от того, применяют ли соляную или серную кислоту. Образующиеся водные солевые растворы часто очень трудно поддаются переработке, а остаточные количества веществ со зловонным запахом делают этот способ трудно реализуемым в промышленном масштабе.

[0013] К настоящему времени было найдено, что метилмеркаптан можно получать ферментативным восстановлением диметилдисульфида (DMDS) на предварительной стадии синтеза L-метионина, и неожиданным образом было найдено также, что это ферментативное восстановление DMDS можно осуществлять в ходе синтеза L-метионина.

[0014] Таким образом, целью настоящего изобретения является способ получения L-метионина, аналогичный способу, предложенному в международных заявках WO 2008013432 и/или WO 2013029690, и позволяющий отказаться от манипуляций с метилмеркаптаном или по меньшей мере уменьшить их объем, генерируя метилмеркаптан по реакции ферментативного катализа DMDS непосредственно перед использованием этого метилмеркаптана в синтезе метионина или генерируя метилмеркаптан по реакции ферментативного катализа DMDS in situ в реакторе синтеза L-метионина.

[0015] В частности, первой целью настоящего изобретения является способ получения L-метионина, включающий по меньшей мере стадии:

a) получения смеси, содержащей:

1) диметилдисульфид (DMDS);

2) каталитическое количество аминокислоты, содержащей тиольную группу, или пептида с тиольной группой;

3) каталитическое количество фермента, катализирующего реакцию восстановления дисульфидного мостика аминокислоты, содержащей тиольную группу, или пептида с тиольной группой;

4) водород;

5) каталитическое количество фермента, катализирующего реакцию отщепления водорода;

6) каталитическое количество кофактора, являющегося общим для обоих ферментов каталитической системы (дегидрогеназы и редуктазы);

b) осуществления ферментативной реакции для получения метилмеркаптана (CH₃SH);

c) введения предшественника L-метионина и взаимодействия этого предшественника с метилмеркаптаном, образовавшимся на стадии b), и

d) выделения и в случае необходимости очистки образовавшегося L-метионина.

[0016] Компоненты, указанные на стадии a), могут быть введены в любом порядке (порядок введения на стадии a) не является строгим). В варианте осуществления настоящего изобретения аминокислота, содержащая тиольную группу, и/или пептид, содержащий тиольную группу, может находиться в форме дисульфида этой аминокислоты и/или этого пептида соответственно, например глутатион может находиться в форме дисульфида глутатиона.

[0017] В общем случае, фермент, катализирующий восстановление дисульфидного мостика, образованного между двумя остатками аминокислоты, содержащей тиольную группу, или пептида с тиольной группой, представляет собой редуктазу. Термин "редуктаза" в дальнейшем описании употребляют для пояснения настоящего изобретения. Аналогичным образом, фермент, катализирующий реакцию отщепления водорода, в общем случае называют дегидрогеназой и в дальнейшем описании для пояснения настоящего изобретения употребляют термин "дегидрогеназа".

[0018] Среди кофакторов, являющихся общими для обоих ферментов, катализирующих восстановление и дегидрирование, (редуктазы и дегидрогеназы) в качестве неограничительных примеров можно назвать флавиновые кофакторы и никотиновые кофакторы. Предпочтительно применяют никотиновые кофакторы и более предпочтительно никотинамидадениндинуклеотид (NAD) или еще более предпочтительно никотинамидадениндинуклеотидфосфат (NADPH). Перечисленные кофакторы преимущественно применяют в их восстановленных формах (например, NADPH, H+) и/или окисленных формах (например, NADP+), то есть они могут быть прибавлены к реакционной смеси в этих восстановленных и/или окисленных формах.

[0019] Организация и порядок введения компонентов с 1) по 6) на стадии a) могут быть реализованы различным образом. Ферментативную реакцию на стадии b) инициируют прибавлением одного из компонентов каталитической системы к смеси на стадии a): фермента или одного из соединений, вводимых в стехиометрическом количестве (дисульфида или органического соединения-восстановителя), или одного из соединений, вводимых в каталитическом количестве (аминокислоты, содержащей тиольную группу, или пептида с тиольной группой, или дисульфида, соответствующего указанному тиолу или пептиду, или также кофактора).

[0020] Таким образом, согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения способ получения L-метионина включает по меньшей мере стадии:

a') получения смеси, содержащей:

- диметилдисульфид (DMDS);

- каталитическое количество аминокислоты, содержащей тиольную группу, или пептида с тиольной группой;

- каталитическое количество редуктазы, соответствующей аминокислоте, содержащей тиольную группу, или пептиду с тиольной группой;

- каталитическое количество NADPH;

b') введения водорода с каталитическим количеством дегидрогеназы;

c') осуществления ферментативной реакции для получения метилмеркаптана (CH₃SH);

d') взаимодействия предшественника L-метионина с метилмеркаптаном, образовавшимся на стадии c'), и

e') выделения и в случае необходимости очистки образовавшегося L-метионина.

[0021] Согласно способу по настоящему изобретению метилмеркаптан, в общем случае образующийся в газообразном состоянии, непосредственно приводят в контакт с предшественником метионина соответственно дальнейшему описанию.

[0022] Способ синтеза L-метионина по настоящему изобретению прежде всего основан на ферментативном восстановлении диметилдисульфида водородом согласно следующей реакции:

[0023] К настоящему времени было найдено, что эта реакция легко катализируется ферментативной системой, в которую входит аминокислота с тиольной группой или пептид с тиольной группой, например глутатион, в форме комплекса "(аминокислота или пептид)/соответствующая редуктаза", регенерируемого водородом, соответственно приведенному далее описанию фиг. 1.

[0024] Таким образом, согласно пояснению фиг. 1 пептид (в примере показан глутатион) восстанавливает диметилдисульфид до метилмеркаптана, превращаясь в пептид с дисульфидным мостиком (показан дисульфид глутатиона). Редуктаза как фермент (показана глутатионредуктаза, EC 1.8.1.7 или EC 1.6.4.2) восстанавливает пептид (глутатион), и этот же фермент регенерируется окислительно-восстановительным ферментативным комплексом, хорошо известным специалистам в данной области техники, например комплексом "NADPH/NADP+" (никотинадениндинуклеотидфосфатом (в восстановленной и окисленной форме)). В свою очередь, NADP+ регенерируют водородом до NADPH при посредстве фермента "дегидрогеназа" (EC 1.12.1.5). Протоны, высвобождаемые водородом, не накапливаются, поскольку они взаимодействуют с глутатионредуктазой, которая образует HS-R-S^- после реакции с NADPH, а образовавшаяся меркаптидная функциональная группа становится функциональной меркаптогруппой.

[0025] Согласно более предпочтительному варианту осуществления система "глутатион/дисульфид глутатиона", ассоциированная с глутатионредуктазой, позволяет согласно настоящему изобретению восстанавливать DMDS до метилмеркаптана.

[0026] Глутатион представляет собой трипептид, широко применяемый в биологии. Это соединение в восстановленной (глутатион) или окисленной (дисульфид глутатиона) форме образует окислительно-восстановительную пару, имеющую важное значение в клетках. В частности, глутатион является жизненно важным для обезвреживания тяжелых металлов в организме. Так, например, в WO 05107723 описана композиция, в которой глутатион применяют для получения хелатирующего препарата, в US 4657856 указано, что глутатион позволяет также разрушать пероксиды за счет глутатионпероксидазы, например превращать H₂O₂ в H₂O. Наконец, глутатион позволяет также разрушать дисульфидные мостики, содержащиеся в белках (Rona Chandrawati, "Triggered Cargo Release by Encapsulated Enzymatic Catalysis in Capsosomes", Nano Lett, (2011), vol. 11, 4958-4963).

[0027] Согласно способу по настоящему изобретению каталитическое количество аминокислоты, содержащей тиольную группу, или пептида с тиольной группой, применяют для получения метилмеркаптана исходя из диметилдисульфида.

[0028] Среди аминокислот, содержащих тиольную группу и приемлемых для применения в способе по настоящему изобретению, в качестве неограничительных примеров можно назвать цистеин и гомоцистеин. Используемые ферментативные окислительно-восстановительные системы, которые могут регенерировать каталитический цикл таким образом, в этом случае представляют собой системы "цистеин/цистеинредуктаза" (EC 1.8.1.6) и "гомоцистеин/гомоцистеинредуктаза".

[0029] Предпочтительным может быть вариант использования гомоцистеина, поскольку эта аминокислота может быть получена исходя из OAHS (предшественника L-метионина), сероводорода (H₂S) и фермента, катализирующего реакцию, ведущую к образованию метионина. Таким образом, очень малое количество H₂S в реакционной смеси создает in situ цикл, эквивалентный циклу с глутатионом.

[0030] Среди пептидов, содержащих тиольную группу и приемлемых для применения в способе по настоящему изобретению, в качестве неограничительных примеров можно назвать глутатион и тиоредоксин. Таким образом, система "глутатион/глутатионредуктаза", описанная ранее, может быть заменена системой "тиоредоксин (CAS № 52500-60-4)/тиоредоксинредуктаза (EC 1.8.1.9 или EC 1.6.4.5)".

[0031] Глутатион и система "глутатион/глутатионредуктаза" являются наиболее предпочтительными по настоящему изобретению по причине легкости обеспечения этими соединениями и их стоимости.

[0032] В способе по настоящему изобретению водород может быть введен в реакционную смесь любым средством, известным специалистам в данной области техники, например барботированием через реакционную смесь, которая преимущественно представляет собой водно-органическую реакционную смесь. Давление водорода в реакторе соответствует давлению реакционной смеси, указанному далее.

[0033] Применяемый фермент представляет собой дегидрогеназу, которая также хорошо известна специалистам в данной области техники.

[0034] Согласно способу по настоящему изобретению в случае, когда ферментативное восстановление DMDS осуществляют в реакторе, отделенном от синтеза L-метионина, в стехиометрическом количестве используют только DMDS и водород, а все другие компоненты (глутатион, кофактор (например, NADPH) и оба фермента) используют в каталитическом количестве. В случае, когда реакцию ферментативного восстановления DMDS осуществляют совместно с синтезом L-метионина в одном реакторе, называемом реактором "однореакторной технологии", предшественник L-метионина также вводят в стехиометрическом количестве, в то время как дополнительные реагенты этого синтеза, такие как пиридоксальфосфат (PLP) и специфический для этой реакции фермент, вводятт в каталитических количествах.

[0035] Значения концентраций пиридоксальфосфата и фермента, являющегося специфическим для предпочтительных предшественников, можно найти в международных заявках WO 2008013432 и/или WO 2013029690.

[0036] Преимущества, обеспечиваемые синтезом с ферментативным катализом метилмеркаптана исходя из диметилдисульфида, превосходят преимущества, обеспечиваемые способом с 2 последовательными стадиями или способом по "однореакторной технологии". Среди этих преимуществ можно назвать возможность работать с водным или водно-органическим раствором в очень мягких условиях по температуре и давлению и при значении pH, близком к нейтральному. Все эти условия типичны для способа, называемого "зеленым" или "экологически перспективным", и полностью совместимы с получением L-метионина соответственно описанию международных заявок WO 2008013432 и/или WO 2013029690.

[0037] Другое преимущество в случае, когда в способе используют диметилдисульфид, состоит в том, что образующийся метилмеркаптан, который в условиях реакции находится в газообразном состоянии, выходит из реакционной смеси по мере своего образования совместно с водородом, не прореагировавшим в силу возможных обстоятельств. Следовательно, он может быть использован непосредственно после выхода из реактора на следующей технологической стадии, если непрореагировавший водород не мешает этому использованию.

[0038] Следовательно, метилмеркаптан может быть непосредственно использован после выхода из реактора в синтезе L-метионина соответственно, например, описанию WO 2008013432 и/или WO 2013029690, то есть исходя, например, из O-ацетил-L-гомосерина или O-сукцинил-L-гомосерина и ферментов, таких как O-ацетил-L-гомосеринсульфгидрилаза или O-сукцинил-L-гомосеринсульфгидрилаза соответственно.

[0039] В ином случае специалисты в данной области техники могут легко отделить непрореагировавший водород от метилмеркаптана. Метилмеркаптан также может быть легко сжижен способами техники низких температур, например, при необходимости выделить его или отделить.

[0040] Уходящие газы, содержащие водород и метилмеркаптан, в случае потребности и в случае необходимости могут быть возвращены в первый реактор (ферментативное восстановление DMDS) после прохождения через второй реактор (синтез L-метионина), если метилмеркаптан не полностью превратился в L-метионин. Следовательно, способ по настоящему изобретению представляет собой способ синтеза L-метионина на 2 последовательных ферментативных стадиях исходя из предшественника L-метионина и DMDS.

[0041] Также можно осуществлять синтез L-метионина в одном и том же реакторе. В этом случае к системе ферментативного восстановления DMDS (см. указанную ранее стадию a)) прибавляют все реагенты, необходимые для синтеза L-метионина, и закрывают реактор для избежания выброса метилмеркаптана, образующегося при ферментативном восстановлении DMDS in situ. При этом метилмеркаптан взаимодействует с предшественником L-метионина с образованием L-метионина. Таким образом, способ по настоящему изобретению представляет собой способ прямого синтеза L-метионина исходя из предшественника L-метионина и DMDS соответственно показанному на приведенной далее фиг. 2, т.е. синтез исходя из OAHS, DMDS и водорода.

[0042] Диметилдисульфид (DMDS) может быть получен в другом месте исходя из метилмеркаптана и окислителя, такого как, например, кислород, сера или пероксид водорода, или также исходя из диметилсульфата и дисульфида натрия. DMDS может поступать также из смеси под названием "DiSulfide Oils" (DSO, дисульфидные масла), очищенной, например, перегонкой с реагентной обработкой соответственно описанию заявки WO 2014033399.

[0043] Восстановление ферментативным катализом DMDS может рассматриваться как способ, позволяющий избегать транспортировки метилмеркаптана от места его получения по существующим промышленным коммуникациям к месту его использования, если места являются разными. На практике, метилмеркаптан при комнатной температуре представляет собой токсичный газ с сильным зловонным запахом, что чрезвычайно усложняет его транспортировку, в настоящее время очень строго регламентированную в отличие от DMDS. Таким образом, DMDS может быть использован для получения метилмеркаптана непосредственно по месту его применения в синтезе L-метионина с уменьшением таким образом недостатков, связанных с токсичностью и запахом этого соединения, а также промышленных рисков, связанных с этим.

[0044] В случае способа синтеза, осуществляемого на 2 последовательных стадиях, причем DMDS потребляется в реакции, а метилмеркаптан выходит из реакционной смеси по мере своего образования совместно с непревращенным водородом или без него, при условии подачи в непрерывном режиме водорода и DMDS ни одно из соединений не накапливается. Следовательно, не требуется рециркулировать каталитическую систему, принимая во внимание соединения, входящие в реактор и выходящие из него.

[0045] Согласно одному из вариантов осуществления в способ по настоящему изобретению входит получение метилмеркаптана ферментативным восстановлением DMDS и затем осуществление реакции образовавшегося метилмеркаптана с предшественником L-метионина для получения L-метионина. В этом случае в способ по настоящему изобретению входят по меньшей мере следующие стадии:

стадия 1: получение предшественника L-метионина, например, бактериальной ферментацией глюкозы (см. WO 2008013432 и/или WO 2013029690);

стадия 2: ферментативное восстановление DMDS в реакторе R1 с образованием метилмеркаптана, который с водородом, не прореагировавшим в силу возможных обстоятельств, выходит из реактора R1 (см. указанные ранее стадии с a) по c));

стадия 3: ферментативный синтез L-метионина в реакторе R2 исходя из предшественника со стадии 1 и метилмеркаптана со стадии 2 (см. указанную ранее стадию d));

стадия 4 (в случае необходимости): возврат непрореагировавшего водорода на стадию 2 и рециркуляция метилмеркаптана на стадию 2 или стадию 3, и

стадия 5: выделение и в случае необходимости очистка образовавшегося L-метионина (см. указанную ранее стадию e)).

[0046] Описание условий, приемлемых для стадии 1, можно найти в международных заявках WO 2008013432 и/или WO 2013029690.

[0047] Температура осуществления реакции на стадии 2 находится в интервале от 10 до 50°C, предпочтительно от 15 до 45°C и более предпочтительно от 20 до 40°C.

[0048] Значение pH реакционной смеси может находиться в интервале от 5 до 9, предпочтительно от 6 до 8,5, более предпочтительно от 6 до 8 и еще более предпочтительно от 7,0 до 8,0. Наиболее предпочтительно следует выбирать значение pH среды, установленное буферным раствором в интервале значений pH от 7,5 до 8,0. Согласно другому предпочтительному варианту осуществления выбирают значение pH среды, установленное буферным раствором в интервале значений pH от 6,5 до 7,5.

[0049] Давление, устанавливаемое при осуществлении реакции, может находиться в интервале от давления ниже атмосферного до давления в несколько бар (в несколько сотен кПа) в зависимости от используемых реагентов и материалов. Предпочтительно может быть установлено давление в интервале от атмосферного до давления 20 бар (2 МПа) и наиболее предпочтительно следует работать при давлении в интервале от атмосферного до давления 3 бар (300 кПа).

[0050] Касательно идеальных условий для стадии 3 можно сослаться на международную заявку WO 2013029690.

[0051] Согласно другой модели (другому варианту) реализации способ по настоящему изобретению осуществляют в одном и том же реакторе (по "однореакторной технологии") и в этом случае он включает по меньшей мере следующие стадии:

стадия 1': получение предшественника L-метионина, например, бактериальной ферментацией и предпочтительно, но не ограничительным образом ферментацией глюкозы (аналогично указанной ранее стадии 1);

стадия 2': ферментативное восстановление DMDS в реакторе R1 с образованием in situ метилмеркаптана и совместный ферментативный синтез L-метионина в том же самом реакторе исходя из предшественника, полученного на стадии 1';

стадия 3' (в случае необходимости): возврат водорода и метилмеркаптана в реактор R1 на уровне стадии 2, и

стадия 4': выделение и в случае необходимости очистка образовавшегося L-метионина (см. указанную ранее стадию e)).

[0052] Описание условий, приемлемых для стадии 1', можно найти в международных заявках WO 2008013432 и/или WO 2013029690.

[0053] Для стадии 2' рабочие условия приведены далее.

[0054] Температура осуществления реакции находится в интервале от 10 до 50°C, предпочтительно от 15 до 45°C и более предпочтительно от 20 до 40°C.

[0055] Значение pH реакционной смеси преимущественно находится в интервале от 6 до 8 и предпочтительно от 6,2 до 7,5.

[0056] Давление, устанавливаемое при осуществлении реакции по "однореакторной технологии", предпочтительно может находиться в интервале от давления ниже атмосферного до давления в несколько бар (в несколько сотен кПа) в зависимости от используемых реагентов и материалов. Предпочтительно может быть установлено давление в интервале от атмосферного до давления 20 бар (2 МПа) и наиболее предпочтительно следует работать при давлении в интервале от атмосферного до давления 3 бар (300 кПа).

[0057] Молярное соотношение "DMDS/предшественник L-метионина" находится в интервале от 0,1 до 10 и в общем случае от 0,5 до 5, при этом молярное соотношение предпочтительно соответствует стехиометрическому соотношению (молярное соотношение=0,5), но может иметь большее значение, если это оказывает положительное влияние на кинетику реакции.

[0058] Согласно тому или иному варианту по настоящему изобретению способ может быть осуществлен в периодическом или непрерывном режиме в стеклянном или металлическом реакторе при заданных рабочих условиях и применяемых реагентах. Согласно одному из вариантов осуществления способ по настоящему изобретению представляет собой полунепрерывный способ, в котором водород вводят по мере его потребления в реакции.

[0059] Согласно тому или иному варианту способа по настоящему изобретению идеальное молярное соотношение "водород/DMDS" соответствует стехиометрическому соотношению (молярное соотношение=1), но может изменяться от 0,01 до 100, если специалистами в данной области техники будет замечена какая-либо необходимость, например, в том, чтобы водород вводить в непрерывном режиме, а DMDS вводить в реактор при пуске. Это молярное соотношение предпочтительно выбирают в интервале от 1 до 20 относительно совокупности реакционной смеси в целом.

[0060] Непревращенный водород может рециркулироваться от выхода из реактора к его входу до полного исчерпания. Также можно рассматривать рециркуляцию водорода и метилмеркаптана до тех пор, пока водород полностью не прореагирует с DMDS. В этой конфигурации газы на выходе из реактора R2 (или из единственного реактора, когда реакцию осуществляют по "однореакторной технологии") содержат почти исключительно метилмеркаптан.

[0061] Компоненты, содержащиеся в каталитическом количестве в смеси, полученной на указанной ранее стадии a), (аминокислота, содержащая тиольную группу, или пептид с тиольной группой, или также дисульфид, соответствующий указанным аминокислоте или пептиду, редуктаза, дегидрогеназа, кофактор (например, NADPH)) могут быть без затруднений приобретены в коммерческой сети или получены способами, хорошо известными специалистам в данной области техники. Эти компоненты могут находиться в твердом или жидком виде и в порядке особого преимущества могут быть растворены в воде для использования в способе по настоящему изобретению. Применяемые ферменты также могут быть привиты к подложке (в случае ферментов, нанесенных на подложку).

[0062] Водный раствор ферментативного комплекса, содержащего аминокислоту или пептид, также может быть реализован способами, известными специалистам в данной области техники, например, пропиткой клеток, которые могут содержать эти компоненты. Этот водный раствор, состав которого представлен в приведенном далее примере 1, может быть использован с содержанием по массе в интервале от 0,01 до 20% по отношению к общей массе реакционной смеси. Предпочтительно может быть принято содержание в интервале от 0,5 до 10%.

[0063] Значения концентраций пиридоксальфосфата и фермента, являющегося специфическим для предпочтительных предшественников L-метионина, можно найти в международных заявках WO 2008013432 и/или WO 2013029690.

[0064] Настоящее изобретение можно лучше понять при чтении приведенных далее примеров, которые не ограничивают объем патентной охраны настоящего изобретения. Все представленные далее испытания были осуществлены в анаэробных условиях.

ПРИМЕР 1. Способ с 2 последовательными стадиями

[0065] В реактор R1, содержавший 150 мл водного раствора со значением pH, доведенным буферным раствором до 7,8, вносили 10 мл ферментативного комплекса с глутатионом (Aldrich). Раствор ферментативного комплекса содержал 185 мг (0,6 ммоль) глутатиона, 200 ед. глутатионредуктазы, 50 мг (0,06 ммоль) NADPH и 200 ед. дегидрогеназы. Реакционную смесь доводили до 35°C при механическом перемешивании. Первый отбор проб осуществляли в момент времени t=0. Далее диметилдисульфид (9,4 г, 0,1 моль) вносили в бюретку и вводили по каплям в реактор.

[0066] В то же самое время в реактор вводили барботированием поток водорода с расходом 4 л·ч^-1 (при измерении в нормальных условиях по температуре и давлению). Реакцию осуществляли при атмосферном давлении.

[0067] Анализ способом газовой хроматографии газов, выходящих из реактора, показал по существу только присутствие водорода и метилмеркаптана (и следовое количество воды). DMDS и водород (с молярным соотношением "водород/DMDS" относительно совокупности реакционной смеси=10,7) вводили в течение 6 часов, при этом конечный анализ реакционной смеси способом газовой хроматографии подтвердил отсутствие метилмеркаптана, который был вытеснен из реактора избытком водорода. Эти газы, уходящие из реактора R1, направляли непосредственно в реактор R2.

[0068] Параллельно во второй реактор R2, содержавший 75 мл фосфатного буферного раствора с концентрацией 0,1 моль·л^-1 и pH=6,60, вводили 5 г O-ацетил-L-гомосерина (OAHS) (O-ацетил-L-гомосерин был синтезирован исходя из L-гомосерина и уксусного ангидрида согласно публикации Sadamu Nagai "Synthesis of O-acetyl-L-homoserine, Academie Press, (1971), vol. 17, p. 423-424". Раствор доводили до 35°C при механическом перемешивании.

[0069] Перед началом реакции осуществляли отбор (t=0) 1 мл реакционной смеси. Раствор пиридоксальфосфата (1,6 ммоль, 0,4 г) и O-ацетил-L-гомосеринсульфгидрилазы (0,6 г) растворяли в 10 мл воды и затем вносили в реактор.

[0070] Метилмеркаптан вводили в реактор R1 по ходу реакции и преимущественно подавали с избытком водорода или также тогда, когда водород вводили в стехиометрическом соотношении или в соотношении меньше стехиометрического по отношению к DMDS. Метилмеркаптан предпочтительно подавали с потоком инертного газа, например с потоком азота. Реакция начиналась сразу. Образование L-метионина и исчезновение OAHS контролировали способом ВЭЖХ. Газы, уходящие из реактора R2, улавливали 20%-м водным раствором едкого натра (гидроксида натрия). Анализы показали, что 42% OAHS было превращено в L-метионин, а избыток DMDS был превращен в метилмеркаптан, обнаруженный в ловушке с гидроксидом натрия.

ПРИМЕР 2. Способ по "однореакторной технологии"

[0071] В реактор, содержавший 150 мл фосфатного буферного раствора с концентрацией 0,2 моль·л^-1 и pH=7, вносили 10 мл ферментативного комплекса, 5 г (31 ммоль) O-ацетил-L-гомосерина (OAHS, O-ацетил-L-гомосерин был синтезирован исходя из L-гомосерина и уксусного ангидрида согласно публикации Sadamu Nagai "Synthesis of O-acetyl-L-homoserine, Academie Press, (1971), vol. 17, p. 423-424"). Раствор ферментативного комплекса содержал 185 мг (0,6 ммоль) глутатиона, 200 ед. глутатионредуктазы, 50 мг (0,06 ммоль) NADPH, 200 ед. дегидрогеназы, 0,4 г (1,6 ммоль) пиридоксальфосфата и 0,6 г O-ацетил-L-гомосеринсульфгидрилазы.

[0072] Реакционную смесь доводили до 35°C при механическом перемешивании. Первый отбор проб осуществляли в момент времени t=0. Далее диметилдисульфид (3 г, 32 ммоль) вносили в бюретку и вводили по каплям, водород вводили с расходом 4 л/ч; реакция начиналась сразу. Ход реакции контролировали способом ВЭЖХ для отслеживаниия исчезновения OAHS и образования L-метионина. Через 6 часов 12% OAHS было превращено в L-метионин, что демонстрирует возможность получения L-метионина способом по "однореакторной технологии" исходя из предшественника L-метионина, DMDS и водорода.

ПРИМЕР 3. Способ по "однореакторной технологии"

[0073] В реактор, содержавший 70 мл фосфатного буферного раствора с концентрацией 0,1 моль·л^-1 и pH=6,8, вводили 10 мл ферментативного комплекса, 5 г (31 ммоль) O-ацетил-L-гомосерина (OAHS, O-ацетил-L-гомосерин был синтезирован исходя из L-гомосерина и уксусного ангидрида согласно публикации Sadamu Nagai "Synthesis of O-acetyl-L-homoserine, Academie Press, (1971), vol. 17, p. 423-424").

[0074] Раствор ферментативного комплекса содержал 200 мг глутатиона (0,65 моль), 500 ед. глутатионредуктазы, 100 мг NADPH (0,13 моль), 50 ед. дегидрогеназы, 400 мг (1,6 ммоль) пиридоксальфосфата, 2 г O-ацетил-L-гомосерина, а также 0,6 г O-ацетил-L-гомосеринсульфгидрилазы.

[0075] Дегидрогеназу получали исходя из культуры микроорганизмов (согласно статье Biller и соавт. "Fermentation Hyperthermophiler Mikroorganismen am Beispiel von Pyrococcus Furiosus, Shaker Verlag, Maastricht/Herzogenrath, 2002") способами, хорошо известными специалистам в данной области техники.

[0076] Реакционную смесь доводили до 35°C при механическом перемешивании и продувке азотом. Первый отбор проб осуществляли в момент времени t=0. Далее шприцем вводили 20 г (0,22 моль) диметилдисульфида. В то же самое время в реакционную смесь вводили барботированием поток водорода с расходом 4 л·ч^-1 (при измерении в нормальных условиях по температуре и давлению). Начавшуюся реакцию осуществляли при атмосферном давлении в течение 18 часов. Ход реакции контролировали способом ВЭЖХ для отслеживаниия исчезновения OAHS и образования L-метионина. К концу реакции 27% OAHS было превращено в L-метионин, что демонстрирует возможность получения L-метионина способом по "однореакторной технологии" исходя из предшественника L-метионина, DMDS и водорода.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения L-метионина. Способ включает получение смеси, содержащей диметилдисульфид, каталитическое количество содержащей тиольную группу аминокислоты или пептида с тиольной группой, каталитическое количество редуктазы, водород, каталитическое количество дегидрогеназы, каталитическое количество кофактора, осуществление ферментативной реакции для получения метилмеркаптана, введение предшественника L-метионина для взаимодействия с метилмеркаптаном и выделения L-метионина. Изобретение обеспечивает получения L-метионина с уменьшенным для этого необходимым парком оборудования и с отказом от манипуляций с метилмеркаптаном. 13 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 пр.

1. Способ получения L-метионина, включающий по меньшей мере стадии:

a) получения смеси, содержащей:

1) диметилдисульфид;

2) каталитическое количество аминокислоты, содержащей тиольную группу, или пептида с тиольной группой;

3) каталитическое количество фермента, катализирующего реакцию восстановления дисульфидного мостика аминокислоты, содержащей тиольную группу, или пептида с тиольной группой, причем указанный фермент представляет собой редуктазу;

4) водород;

5) каталитическое количество фермента, катализирующего реакцию отщепления водорода, причем указанный фермент представляет собой дегидрогеназу;

6) каталитическое количество кофактора, являющегося общим для обоих ферментов каталитической системы;

b) осуществления ферментативной реакции для получения метилмеркаптана;

c) введения предшественника L-метионина и взаимодействия этого предшественника с метилмеркаптаном, образовавшимся на стадии b), и

d) выделения образовавшегося L-метионина.

2. Способ по п.1, включающий по меньшей мере стадии:

a') получения смеси, содержащей:

- диметилдисульфид;

- каталитическое количество аминокислоты, содержащей тиольную группу, или пептида с тиольной группой;

- каталитическое количество редуктазы, соответствующей аминокислоте, содержащей тиольную группу, или пептиду с тиольной группой;

- каталитическое количество NADPH;

b') введения водорода с каталитическим количеством дегидрогеназы;

c') осуществления ферментативной реакции для получения метилмеркаптана;

d') взаимодействия предшественника L-метионина с метилмеркаптаном, образовавшимся на стадии c'), и

e') выделения и в случае необходимости очистки образовавшегося L-метионина.

3. Способ по п.1 или 2, в котором метилмеркаптан приводят непосредственно в контакт с предшественником метионина.

4. Способ по любому из пп. 1-3, в котором аминокислоту, содержащую тиольную группу, или пептид, содержащий тиольную группу, выбирают из цистеина, гомоцистеина, глутатиона и тиоредоксина.

5. Способ по любому из пп. 1-4, в котором предшественник L-метионина выбирают из O-ацетил-L-гомосерина и O-сукцинил-L-гомосерина.

6. Способ по любому из пп. 1-5, в котором водород вводят барботированием через реакционную смесь.

7. Способ по любому из пп. 1-6, включающий получение метилмеркаптана ферментативным восстановлением DMDS и затем осуществление реакции образовавшегося метилмеркаптана с предшественником L-метионина для получения L-метионина.

8. Способ по п.7, включающий по меньшей мере следующие стадии:

стадия 1: получение предшественника L-метионина;

стадия 2: ферментативное восстановление DMDS в реакторе R1 с образованием метилмеркаптана, который с водородом, не прореагировавшим в силу возможных обстоятельств, выходит из реактора R1;

стадия 3: ферментативный синтез L-метионина в реакторе R2 исходя из предшественника со стадии 1 и метилмеркаптана со стадии 2;

стадия 4 (в случае необходимости): возврат непрореагировавшего водорода на стадию 2 и рециркуляция метилмеркаптана на стадию 2 или стадию 3 и

стадия 5: выделение и в случае необходимости очистка образовавшегося L-метионина.

9. Способ по любому из пп. 1-6, в котором синтез метилмеркаптана исходя из DMDS и синтез L-метионина исходя из этого метилмеркаптана осуществляют в одном и том же реакторе.

10. Способ по п.9, включающий по меньшей мере следующие стадии:

стадия 1': получение предшественника L-метионина;

стадия 2': ферментативное восстановление DMDS в реакторе R1 с образованием in situ метилмеркаптана и совместный ферментативный синтез L-метионина в том же самом реакторе исходя из предшественника, полученного на стадии 1';

стадия 3' (в случае необходимости): возврат водорода и метилмеркаптана в реактор R1 на уровне стадии 2,и

стадия 4': выделение и в случае необходимости очистка образовавшегося L-метионина.

11. Способ по любому из пп. 1-10, осуществляемый в периодическом или непрерывном режиме.

12. Способ по любому из пп. 1-11, в котором идеальное молярное соотношение "водород/DMDS" изменяется от 0,01 до 100 и предпочтительно от 1 до 20 относительно совокупности реакционной смеси.

13. Способ по любому из пп. 1-12, в котором молярное соотношение "DMDS/предшественник L-метионина" находится в интервале от 0,1 до 10 и в общем случае от 0,5 до 5, при этом молярное соотношение предпочтительно соответствует стехиометрическому соотношению (молярное соотношение=0,5).

14. Способ по любому из пп. 1-13, в котором температура ферментативной реакции находится в интервале от 10 до 50°C, предпочтительно от 15 до 45°C и более предпочтительно от 20 до 40°C.