СПОСОБ СИНТЕЗА ФУНКЦИОНАЛИЗИРОВАННОГО ЦИКЛИЧЕСКОГО ДИТИОКАРБАМАТА Российский патент 2023 года по МПК C07D279/06 C07D277/56 C07C329/00 C12P17/14 C07B45/00 

Изобретение относится к области циклических дитиокарбаматов и более конкретно, к способу синтеза циклических дитиокарбаматов, и более конкретно, функционализированных циклических дитиокарбаматов.

Дитиокарбаматы являются органическими соединениями, которые могут применяться в качестве радикальных предшественников, промежуточных соединений в органическом синтезе, вулканизирующих агентов, хелатирующих агентов или ферментных ингибиторов. Области их применения варьируются, и они могут быть включены в композиции фунгицидов, гербицидов, пестицидов или инсектицидов в сельскохозяйственном секторе, и они могут применяться в полимерной промышленности или в фармацевтической промышленности для лечения заболеваний, таких как рак или ВИЧ.

Благодаря множеству применений дитиокарбаматов, существует множество разных методик для их синтеза.

Таким образом, в статье Entesar A. Hassan, ʺDithiocarbamates as precursors in organic chemistry, synthesis and usesʺ, Phosphorus, Sulfur and Silicon, vol. 189, (2014), страницы 300-323, описаны разные способы синтеза дитиокарбаматов. Дано описание, например, синтеза N,N-диалкилдитиокарбамата взаимодействием соли дитиокарбамата с алкилгалогенидом или с диалкилфосфатом, или добавлением электрон-дефицитных олефинов. В указанной статье также описано получение дитиокарбаматов ацилированием аминов с хлордитиоформиатом. Получение циклических дитиокарбаматов взаимодействием дисульфидов с (i) 2-аминоэтанолом, 2-аминоэтилсульфатом и 2-аминоэтилгалогенидом, (ii) первичными аминами и 1,2-дибромэтаном в присутствии основания, (iii) азиридинами и (iv) 2-иминотиазолидинами также описано. Циклические дитиокарбаматы также могут быть получены циклизацией β-гидроксиалкилдитиокарбаматов обработкой мезилхлоридом в пиридине, или, альтернативно, циклизацией 2-алкиламинометантиола с тиофосгеном в присутствии основания.

Более того, в заявке на патент CN 103804258 описан синтез дитиокарбаматов из карбамида и сероуглерода и в заявке на патент CN 103804257 описано получение диэтилдитиокарбаматов также из карбамида и сероуглерода.

В заявке на патент US 2046876 описан синтез N-диарилдитиокарбаматов добавлением сероуглерода к диариламиновым производным.

Понятно, что из-за множества возможных применений дитиокарбаматов, существует возрастающая потребность в новых дитиокарбаматах, в частности, в новых функционализированных дитиокарбаматов, более конкретно, для применения в полимеризации (а именно, для необязательной прививки на органическую подложку), для применения в девулканизации и подобных, но также и более конкретно, в новых оптически активных дитиокарбаматах для множества применений в лекарственных средствах, биологии и подобных.

Также понятно из описания способов синтеза, что также существует потребность в синтезе дитиокарбаматов методами, которые могут быть описаны как долговечные, т.е. которые могут проводиться при умеренной температуре и давлении, в водном растворе со значениями pH, близкими к нейтральности, и с применением исходных материалов возобновляемого происхождения, и которые в целом более экологически чистые.

Было обнаружено, что возможно достигнуть целей, указанных выше, полностью или, по крайней мере, частично, проведением способа в соответствии с данным изобретением и как описано ниже. Другие цели будут очевидными из продолжения описания данного изобретения, которое следует.

Таким образом, и согласно первому аспекту, данное изобретение относится к способу синтеза функционализированного циклического дитиокарбамата формулы (I):

в которой

- R₁ является водородом или ароматической или не ароматической, линейной или циклической, насыщенной или ненасыщенной, разветвленной или не разветвленной, углеводородной цепью, включающей 1-20 атомов углерода, и которая может включать один или более гетероатомов, выбранных из O, S, N, P и Si;

- X является -C(=O)- или -CH₂- или -CN;

- R₂ (i) не существует (если X является -CN), (ii) является водородом, (iii) или -OR₃, где R₃ является водородом или ароматической или не ароматической, линейной или циклической, насыщенной или ненасыщенной, разветвленной или не разветвленной, углеводородной цепью, включающей 1-20 атомов углерода, и которая может включать один или более гетероатомов, выбранных из O, S, N, P и Si, (iv) или -NR₄R₅, где R₄ и R₅, которые являются одинаковыми или разными, являются водородом или ароматической или не ароматической, линейной или циклической, насыщенной или ненасыщенной, разветвленной или не разветвленной, углеводородной цепью, включающей 1-20 атомов углерода, и которая может включать один или более гетероатомов, выбранных из O, S, N, P и Si;

- n равно 0, 1 или 2, предпочтительно, 1; и

- * является асимметрическим атомом углерода;

где указанный способ включает стадии:

a/ получения, по крайней мере, одного соединения формулы (II):

в которой

- n, R₁, R₂, X и * такие, как определены ранее,

- G является либо (i) R₆-C(=O)-O-CH₂-, либо (ii) (R₇O)(R₈O)-P(=O)-O-CH₂-, либо (iii) R₇O-SO₂-O-CH₂-;

- R₆ является водородом или ароматической или не ароматической, линейной или циклической, насыщенной или ненасыщенной, разветвленной или не разветвленной, углеводородной цепью, включающей 1-20 атомов углерода, и которая может включать один или более гетероатомов, выбранных из O, S, N, P и Si;

- R₇ и R₈, которые могут быть одинаковыми или разными, выбирают, независимо друг от друга, из протона H, щелочного металла, щелочноземельного металла или аммония, предпочтительно, протона H или щелочного металла, и более предпочтительно, протона H или Na;

b/ получения, по крайней мере, одного неорганического тритиокарбоната;

c/ реакции между, по крайней мере, указанным соединением формулы (II) и, по крайней мере, указанным неорганическим тритиокарбонатом в присутствии, по крайней мере, одного фермента, выбранного из сульфгидратов и, предпочтительно, сульфгидрилазы, ассоциированной с указанным соединением формулы (II);

d/ получения, по крайней мере, одного функционализированного циклического дитиокарбамата формулы (I);

e/ разделения и выделения, по крайней мере, одного указанного циклического дитиокарбамата формулы (I);

f/ необязательной дополнительной функционализации функционализированного циклического дитиокарбамата формулы (I), полученного на стадии d/ или e/;

стадии a/ и b/ необязательно проводят одновременно.

Было обнаружено, что конфигурация асимметрического атома углерода сохраняется в течение реакции. В качестве другого преимущества, необходимо отметить, что функционализированный циклический дитиокарбамат формулы (I), полученный способом в соответствии с данным изобретением, является энантиомерно чистым дитиокарбаматом.

Термин "функционализированный циклический дитиокарбамат" означает любой тип циклического дитиокарбамата формулы (I), атома азота которого несет функциональную группу (за исключением варианта, где R₁ является атомом водорода) и/или атом углерода которого как α к атому азота несет функциональную группу (за исключением варианта, где -X- является -CH₂- и где R₂ является атомом водорода).

Изобретение будет более понятно в свете описания и примеров, которые следуют, но никаким образом не ограничено указанными примерами.

Согласно одному варианту изобретения, R₁ является атомом водорода.

Согласно другому варианту изобретения, -X- является -C(=O)-.

Согласно еще одному варианту изобретения, R₂ является -OR₃, где R₃ является атомом водорода.

Согласно другому варианту изобретения, n равно 0.

Согласно еще одному варианту изобретения, n равно 1.

Согласно предпочтительному варианту изобретения, в формуле (I), R₁ является атомом водорода, -X- является -C(=O)-, R₂ является -OR₃, где R₃ является водородом, n равно 0 и соединение формулы (I) является L-рафанузаминовой кислотой.

Согласно другому предпочтительному варианту изобретения, в формуле (I), R₁ является атомом водорода, -X- является -C(=O)-, R₂ является -OR₃, где R₃ является атомом водорода, n равно 1 и соединение формулы (I) является L-гоморафанузаминовой кислотой.

Согласно предпочтительному варианту изобретения, в формуле (II), R₁ является атомом водорода, -X- является -C(=O)-, R₂ является -OR₃, где R₃ является атомом водорода, n равно 0 и соединение формулы (II) является производным L-серина.

Производное L-серина, применяемое в способе в соответствии с данным изобретением, может быть выбрано, например и без ограничений, из O-фосфо-L-серина, O-сукцинил-L-серина, O-ацетил-L-серина, O-ацетоацетил-L-серина, O-пропио-L-серина, O-кумароил-L-серина, O-малонил-L-серина, O-гидроксиметилглутарил-L-серина, O-пимелил-L-серина и O-сульфато-L-серина.

Предпочтительно, производное L-серина выбирают из O-фосфо-L-серина, O-сукцинил-L-серина, O-ацетил-L-серина и O-сульфато-L-серина.

Наиболее предпочтительно, производным L-серина является O-ацетил-L-серин.

Согласно другому предпочтительному варианту изобретения, в формуле (II) R₁ является атомом водорода, X является C=O функциональной группой, R₂ является -OR₃, где R₃ является водородом, n равно 1 и соединение формулы (II) является производным L-гомосерина.

Производное L-гомосерина, применяемое в способе в соответствии с данным изобретением, может быть выбрано, например и без ограничений, из O-фосфо-L-гомосерина, O-сукцинил-L-гомосерина, O-ацетил-L-гомосерина, O-ацетоацетил-L-гомосерина, O-пропио-L-гомосерина, O-кумароил-L-гомосерина, O-малонил-L-гомосерина, O-гидроксиметилглутарил-L-гомосерина, O-пимелил-L-гомосерина и O-сульфато-L-гомосерина.

Предпочтительно, производное L-гомосерина выбирают из O-фосфо-L-гомосерина, O-сукцинил-L-гомосерина, O-ацетил-L-гомосерина и O-сульфато-L-гомосерина.

Наиболее предпочтительно, производным L-гомосерина является O-ацетил-L-гомосерин (OAHS).

Производное L-серина и L-гомосерина либо коммерчески доступно, либо его получают методами, известными специалисту в данной области техники.

Оно может быть получено, например, ферментированием возобновляемого исходного материала. Возобновляемый исходный материал может быть выбран из глюкозы, сахарозы, крахмала, мелассы, глицерина и биоэтанола, предпочтительно, глюкозы.

Производное L-серина также может быть получено ацетилированием L-серина, где сам L-серин возможно получают ферментированием возобновляемого исходного материала. Возобновляемый исходный материал может быть выбран из глюкозы, сахарозы, крахмала, мелассы, глицерина и биоэтанола, предпочтительно, глюкозы.

Производное L-гомосерина также может быть получено ацетилированием L-гомосерина, где сам L-гомосерин возможно получают ферментированием возобновляемого исходного материала. Возобновляемый исходный материал может быть выбран из глюкозы, сахарозы, крахмала, мелассы, глицерина и биоэтанола, предпочтительно, глюкозы.

Неорганический тритиокарбонат, применяемый в способе в соответствии с данным изобретением, может быть выбран из тритиокарбоната щелочного металла, тритиокарбоната щелочноземельного металла и тритиокарбоната аммония.

Предпочтительно, неорганический тритиокарбонат выбирают из тритиокарбоната натрия, тритиокарбоната калия, тритиокарбоната кальция и тритиокарбоната аммония.

Особенно предпочтительно, неорганическим тритиокарбонатом является тритиокарбонат натрия.

Во время проведения способа в соответствии с данным изобретением, реакцию между, по крайней мере, указанным соединением формулы (II) и, по крайней мере, указанным неорганическим тритиокарбонатом проводят в присутствии, по крайней мере, одного фермента, где указанный фермент предпочтительно является сульфгидрилазой, ассоциированной с указанным соединением формулы (II).

Таким образом, если соединением формулы (II) является производное L-серина, применяемый фермент может быть выбран из O-фосфо-L-серинсульфгидрилазы, O-сукцинил-L-серинсульфгидрилазы, O-ацетил-L-серинсульфгидрилазы, O-ацетоацетил-L-серинсульфгидрилазы, O-пропио-L-серинсульфгидрилазы, O-кумароил-L-серинсульфгидрилазы, O-малонил-L-серинсульфгидрилазы, O-гидроксиметилглутарил-L-серинсульфгидрилазы, O-пимелил-L-серинсульфгидрилазы и O-сульфато-L-серинсульфгидрилазы.

Предпочтительно, фермент, ассоциированный с производным L-серина, выбирают из O-фосфо-L-серинсульфгидрилазы, O-сукцинил-L-серинсульфгидрилазы, O-ацетил-L-серинсульфгидрилазы и O-сульфато-L-серинсульфгидрилазы.

Наиболее предпочтительно, ферментом, ассоциированным с производным L-серина, является O-ацетил-L-серинсульфгидрилаза.

Более того, если соединением формулы (II) является производное L-гомосерина, применяемый фермент может быть выбран из O-фосфо-L-гомосеринсульфгидрилазы, O-сукцинил-L-гомосеринсульфгидрилазы, O-ацетил-L-гомосеринсульфгидрилазы, O-ацетоацетил-L-гомосеринсульфгидрилазы, O-пропио-L-гомосеринсульфгидрилазы, O-кумароил-L-гомосеринсульфгидрилазы, O-малонил-L-гомосеринсульфгидрилазы, O-гидроксиметилглутарил-L-гомосеринсульфгидрилазы, O-пимелил-L-гомосеринсульфгидрилазы и O-сульфато-L-гомосеринсульфгидрилазы.

Предпочтительно, фермент, ассоциированный с производным L-гомосерина, выбирают из O-фосфо-L-гомосеринсульфгидрилазы, O-сукцинил-L-гомосеринсульфгидрилазы, O-ацетил-L-гомосеринсульфгидрилазы и O-сульфато-L-гомосеринсульфгидрилазы.

Наиболее предпочтительно, ферментом, ассоциированным с производным L-гомосерина, является O-ацетил-L-гомосеринсульфгидрилаза.

Эти ферменты имеют оптимальное функционирование, как хорошо известно специалисту в данной области техники, если их применяют в присутствии кофактора, например, пиридоксаль 5'-фосфата (PLP).

Фермент и его ассоциированный кофактор обычно растворяют в воде до добавления в реакционную среду. Доля фермента относительно массы соединения формулы (II), будет составлять от 0,1% до 10% массовых, предпочтительно, от 1% до 5% массовых, и количество кофактора относительно соединения формулы (II) будет составлять от 0,1% до 10% массовых, предпочтительно, от 0,5% до 5% массовых.

Что касается синтетической среды, температуры и условий pH, можно сделать ссылку на те, которые описаны в заявках на патент WO 2008/013432 и WO 2013/029690.

Таким образом, pH реакции предпочтительно составляет 5-8, предпочтительно, 6-7,5, и более предпочтительно, 6,2-7,2. Указанные pH зависят от рабочего предела фермента и могут регулироваться в соответствии с оптимальными условиями для фермента, добавлением основного тритиокарбоната или добавлением разбавленной серной кислоты или разбавленного аммиака. Предпочтительно, pH доводят регулированием добавления основного тритиокарбоната.

Таким образом, температура во время реакции составляет 10°C-45°C, предпочтительно, 20°C-40°C, и более предпочтительно, 25°C-35°C. Указанные температуры выбирают согласно рабочему пределу фермента.

Реакция проходит в водной среде в присутствии органических растворителей, если эти растворители совместимы с применяемыми ферментами. Предпочтительно, реакция проходит в водной среде.

Реакция может проводиться периодически, полунепрерывно или непрерывно. Любой тип реактора, известный специалисту в данной области техники, может подходить для реакций этого типа.

Согласно одному варианту изобретения, разделение и выделение полученного дитиокарбамата может проводиться по любой методике, известной специалисту в данной области техники, в частности, осаждением и фильтрацией.

Необязательная стадия f/ способа в соответствии с данным изобретением делает возможным получение дополнительных функций, которые отличаются от полученных на стадии d/ или на стадии e/.

Это возможно потому, что функционализированный циклический дитиокарбамат формулы (I), полученный в конце стадии d/ или в конце стадии e/, может снова быть функционализирован во время этой стадии f/. Например, если X-R₂ является карбоксильной функциональностью, указанная функциональность может быть эстерифицирована, восстановлена до альдегида, восстановлена до спирта и затем этерифицирована, амидирована, нитрилирована или подобное. Все функциональности могут быть получены методами, хорошо известными специалисту в данной области техники, в зависимости от конечного предполагаемого применения дитиокарбамата.

Таким образом, функционализированный циклический дитиокарбамат формулы (I), полученный в конце стадии d/ или e/, может быть подвергнут одной или более дополнительным химическим реакциям для получения одного или более дитиокарбаматов с разными функциями, где указанными химическими реакциями являются все реакции, известным специалистам в данной области техники.

Согласно одному варианту изобретения, при контакте производного L-серина, такого как O-ацетил-L-серин, фермента, такого как O-ацетил-L-серинсульфгидрилаза, кофактора, такого как пиридоксаль 5'-фосфат (PLP) и основного тритиокарбоната, такого как тритиокарбонат натрия, неожиданно оказывается, что одним из основных полученных продуктов является циклический дитиокарбамат, соответствующий наименованию L-рафанузаминовая кислота, где рафанузаминовая кислота представлена формулой:

Согласно другому варианту изобретения, производное L-гомосерина, такое как O-ацетил-L-гомосерин, фермент, такой как O-ацетил-L-гомосеринсульфгидрилаза, кофактор, такой как пиридоксаль 5'-фосфат (PLP) и основной тритиокарбонат, такой как тритиокарбонат натрия, подвергают контакту. Неожиданно оказывается, что одним из основных полученных продуктов является циклический дитиокарбамат, соответствующий наименованию L-гоморафанузаминовая кислота (циклический высший гомолог L-рафанузаминовой кислоты), где гоморафанузаминовая кислота представлена формулой:

Было отмечено, что синтез дитиокарбамата может сопровождаться образованием меркаптана формулы (III): HS-CH₂(CH₂)_n-C*H(NHR₁)-X-R₂, в котором n, R₁, R₂, X и * такие, как определены ранее. Этот меркаптан преимущественно может служить исходным материалом для синтеза дитиокарбамата взаимодействием с сероуглеродом в основной среде.

Например, в случае синтеза гоморафанузаминовой кислоты, полученным меркаптаном гомоцистеин, который взаимодействует с сероуглеродом по следующей схеме:

Соединение в квадратных скобках является промежуточным соединением, которое появляется в процессе. Это соединение, а также его другие соли щелочного металла, щелочноземельного металла или аммония, является новым и, в связи с этим, являются частью данного изобретения. Эти соединения далее называют "тритиокарбонаты" ("тритиокарбонат натрия", если противоионом является ион натрия) гомоцистеина.

В более общем смысле, промежуточным соединением может быть соединение формулы (IV):

в котором R₁, R₂, X, * и n такие, как определены ранее, и X₂ является группой щелочного металла, щелочноземельного металла или аммония, предпочтительно, Na, K, NH₄ или Ca, более предпочтительно, Na.

Согласно другому предпочтительному варианту изобретения, сероуглерод может добавляться непрерывно или периодически в течение реакции.

Добавление сероуглерода делает возможным значительно повысить выход синтеза дитиокарбамата.

Согласно предпочтительному варианту изобретения, производным L-серина является O-ацетил-L-серин, тритиокарбонатом является тритиокарбонат натрия и применяемым ферментом является O-ацетил-L-серинсульфгидрилаза.

Согласно предпочтительному варианту изобретения, функционализированным циклическим дитиокарбаматом формулы (I), полученным в соответствии с данным изобретением, является L-рафанузаминовая кислота.

Согласно другому предпочтительному варианту изобретения, производным L-гомосерина является O-ацетил-L-гомосерин, тритиокарбонатом является тритиокарбонат натрия и применяемым ферментом является O-ацетил-L-гомосеринсульфгидрилаза.

Согласно предпочтительному варианту изобретения, функционализированным циклическим дитиокарбаматом формулы (I), полученным в соответствии с данным изобретением, является L-гоморафанузаминовая кислота.

Как указано выше, конфигурация асимметрического атома углерода сохраняется в течение реакции. Это делает возможным получением конкретного энантиомера, что может быть преимущественным для определенных применений, а именно, в области медицины или фармацевтики.

Более того, карбоновая кислота, присутствующая в функционализированном дитиокарбамате формулы (I), может сделать возможным "присоединение" множества соединений или молекул, делая возможным прививку на органическую или неорганическую подложку.

Функционализированные циклические дитиокарбаматы формулы (I), полученные способом в соответствии с данным изобретением, могут применяться в качестве радикальных предшественников, промежуточных соединений в органическом синтезе, вулканизирующих агентов, хелатирующих агентов или ферментных ингибиторов. Область их применения варьируется, и они могут быть включены, например, в композицию фунгицидов, гербицидов, пестицидов или инсектицидов в сельскохозяйственном секторе, и они могут применяться в полимерной промышленности, а еще в фармацевтической промышленности в лечении заболеваний, таких как рак и ВИЧ.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Ферментный синтез L-гоморафанузаминовой кислоты

Стадия 1:

O-Ацетил-L-гомосерин (OAHS) синтезируют из L-гомосерина и уксусного ангидрида согласно Sadamu Nagai, "Synthesis of O-acetyl-L-homoserine", Academic Press (1971), vol. 17, pages 423-424.

Стадия 2:

10 г (62 ммоль) OAHS, синтезированного выше, помещают в 140 мл дистиллированной воды в термостатируемом 250 мл стеклянном реакторе. Раствор доводят до 35°C при механическом перемешивании. pH реакционной среды составляет 4,8. Перед добавлением фермента, pH устанавливают 6,5 несколькими каплями раствора тритиокарбоната натрия (4,78 г; 31 ммоль, растворенного в 20 мл дистиллированной воды). Берут образец 1 мл реакционной среды (в t=0). Раствор пиридоксаль 5'-фосфата (10 ммоль, 0,4 г) и фермента O-ацетил-L-гомосеринсульфгидрилазы (0,6 г) растворяют в 10 мл воды и затем добавляют в реактор.

Начинается реакция, которая приводит к снижению pH. Реакционную среду поддерживают при pH 6,5 медленным добавлением тритиокарбоната натрия через капельную воронку. Образцы (1 мл) отбирают во время реакции. Анализ потенциометрическим титрованием, ТСХ, ВЭЖХ и СЭЖХ/УФ-масс показывает постепенное исчезновение реагентов (OAHS и Na₂CS₃) и постепенное появление, во все более значительных количествах, следующего соединения:

Это промежуточное соединение, в свою очередь, постепенно исчезает с получением эквимолярных количеств:

- L-гоморафанузаминовой кислоты (функционализированного циклического дитиокарбамата)

- и L-гомоцистеина

Единственными другими продуктами, наблюдаемыми после исчезновения OAHS, являются следы гомосерина (гидролиз OAHS).

Стадия 3: Разделение и выделение дитиокарбамата:

Реакционную среду концентрируют частичным выпариванием воды (чтобы избежать осаждение ацетата натрия, присутствующего в реакционной среде) при пониженном давлении при 30°C. Осадок образуется, так как дитиокарбамат является наименее растворимым из соединений, присутствующих в реакционной среде. После фильтрации и сушки получают 4,9 г дитиокарбамата. Общей выделенный выход дитиокарбамата составляет 45% (4,9 г полученных из 11 г теоретически ожидаемого). Дополнительный анализ этого сухого продукта показал, что это твердое вещество содержит только следы гомоцистеина.

Пример 2: Синтез дитиокарбамата (без фермента или кофермента)

Пример 1 повторяют, единственным отличием является то, что раствор пиридоксаль 5'-фосфата (10 ммоль; 0,4 г) и фермента O-ацетил-L-гомосеринсульфгидрилазы (0,6 г), растворенных в 10 мл воды, не добавляют в реактор. Оказывается, что реакция не начинается, и что невозможно непрерывно добавляют раствор тритиокарбоната, пытаясь сохранить pH 6,5. При повышении до pH 8 и затем до pH 12 добавлением раствора тритиокарбоната натрия, единственной наблюдаемой реакцией является начало гидролиза OAHS до гомосерина. Этот пример показывает, что синтез дитиокарбоната должен быть катализирован ферментом, чтобы быть эффективным.

Пример 3: Ферментный синтез дитиокарбамата (с добавлением CS₂ в конце реакции)

Стадия 1:

O-Ацетил-L-гомосерин (OAHS) синтезируют из L-гомосерина согласно протоколу, взятому в литературе (Sadamu Nagai, "Synthesis of O-acetyl-L-homoserine", Academic Press (1971), vol. 17, pages 423-424).

Стадия 2:

10 г (62 ммоль) OAHS помещают в 140 мл дистиллированной воды в термостатируемом 250 мл стеклянном реакторе. Раствор доводят до 35°C при механическом перемешивании. pH реакционной среды составляет 4,8. До добавления фермента, pH устанавливают 6,5 добавлением нескольких капель раствора тритиокарбоната натрия (общее количество, добавленное в течение реакции, составляет 4,78 г, т.е. 31 ммоль, растворенных в 20 мл дистиллированной воды). Берут образец 1 мл реакционной среды (в t=0).

Готовят раствор 10 мл дистиллированной воды, содержащей 400 мкл раствора пиридоксаль 5'-фосфата (10 ммоль/л) и 0,6 г фермента (O-ацетил-L-гомосеринсульфгидрилазы). Снижение pH, показывающее образование уксусной кислоты, делает возможным установить, что реакция началась. Необходимо поддерживать реакционную среду при pH равном 6,5. Для этого раствор тритиокарбоната натрия медленно добавляют через капельную воронку. Образцы (1 мл) берут во время реакции.

Когда анализ потенциометрическим титрованием показывает 50% превращение OAHS в гомоцистеин, 1,87 мл сероуглерода (31 ммоль) добавляют в реакционную среду. pH реакционной среды доводят до 10 1M раствором гидроксида натрия. Реакционную среду затем доводят до 50°C. Потенциометрический анализ показывает исчезновение цистеина. Раствор хлористоводородной кислоты (2N) затем применяют для снижения до 5 pH реакционной среды.

Дополнительный анализ ТСХ, ВЭЖХ и СЭЖХ/УФ-масс показывает образование основного продукта, L-гоморафанузаминовой кислоты.

Единственными другими продуктами, наблюдаемыми после полного исчезновения OAHS, являются следы гомосерина (гидролиз OAHS), а также следы гомоцистеина.

Стадия 3: Разделение и выделение дитиокарбамата

Реакционную среду концентрируют частичным выпариванием воды (чтобы избежать осаждение ацетата натрия и других солей, присутствующих в реакционной среде) при пониженном давлении при 30°C. Осадок образуется, так как дитиокарбамат является наименее растворимым в воде. После фильтрации и сушки получают 9,2 г дитиокарбамата. Общей выделенный выход дитиокарбамата составляет 9,2 г полученных из 11 г теоретически ожидаемого, т.е. 84%.

Пример 4: Ферментный синтез дитиокарбамата (с добавлением CS₂ во время реакции)

Стадия 1:

O-Ацетил-L-гомосерин (OAHS) синтезируют из L-гомосерина согласно протоколу, взятому в литературе (источник: Sadamu Nagai, "Synthesis of O-acetyl-L-homoserine", Academic Press (1971), vol. 17, pages 423-424).

Стадия 2:

10 г (61 ммоль) OAHS, синтезированного ранее, помещают в 140 мл дистиллированной воды в термостатируемом 250 мл стеклянном реакторе. Раствор доводят до 35°C при механическом перемешивании. pH реакционной среды составляет 4,8. До добавления фермента, pH устанавливают 7,2 добавлением нескольких капель раствора тритиокарбоната натрия и сероуглерода (4,78 г, тритиокарбоната, 31 ммоль, 1,87 мл сероуглерода; 31 ммоль растворяют в 20 мл дистиллированной воды).

Берут образец 1 мл реакционной среды (в t=0). Готовят раствор 10 мл дистиллированной воды, содержащей 400 мкл раствора пиридоксаль 5'-фосфата (10 ммоль/л) и 0,6 г фермента (O-ацетил-L-гомосеринсульфгидрилазы). Снижение pH, показывающее образование уксусной кислоты, делает возможным установить, что реакция началась. Необходимо поддерживать реакционную среду при pH равном 7,2. Для этого раствор тритиокарбоната натрия медленно добавляют через капельную воронку. Образцы (1 мл) берут во время реакции. Анализы потенциометрическим титрованием, ТСХ, ВЭЖХ и СЭЖХ/УФ-масс (после дериватизации) показывают постепенное исчезновение реагентов (OAHS и Na₂S₃) и постепенное появление, в возрастающих количествах, L-гоморафанузаминовой кислоты. Когда весь OAHS прореагирует, pH среды снижается до 5 с применением 2M раствора хлористоводородной кислоты.

Получают L-гоморафанузаминовую кислоту (дитиокарбамат).

Дериватизацию для СЭЖХ/УФ-масс способа проводят способом, описанным в примере 1.

Единственными другими продуктами, наблюдаемыми после полного исчезновения OAHS, являются следы гомосерина (гидролиз OAHS), а также следы гомоцистеина.

Стадия 3: Разделение и выделение дитиокарбамата

Реакционную среду концентрируют частичным выпариванием воды (чтобы избежать осаждение ацетата натрия и других солей, присутствующих в реакционной среде) при пониженном давлении при 30°C. Осадок образуется, так как дитиокарбамат является наименее растворимым в воде. После фильтрации и сушки получают 8,3 г дитиокарбамата. Общей выделенный выход дитиокарбамата составляет 8,3 г полученных из 11 г теоретически ожидаемого, т.е. 75,4%.

Изобретение относится к способу синтеза функционализированных циклических дитиокарбаматов формулы (I) взаимодействием соединения формулы (II): G-(CH₂)_n-C*H(NHR₁)-X-R₂ с неорганическим тритиокарбаматом в присутствии фермента семейства сульфгидрилаз. Технический результат: разработан новый способ синтеза циклических дитиокарбаматов формулы (I), который может проводиться при умеренной температуре и давлении, в водном растворе со значениями pH, близкими к нейтральности, и с применением экологически чистых исходных материалов. 3 н. и 10 з. п. ф-лы, 3 пр.

1. Способ синтеза функционализированного циклического дитиокарбамата формулы (I):

(I)

в которой

- R₁ является водородом или ароматической или неароматической, линейной или циклической, насыщенной или ненасыщенной, разветвленной или неразветвленной углеводородной цепью, включающей 1-20 атомов углерода, и которая может включать один или более гетероатомов, выбранных из O, S, N, P и Si;

- X является -C(=O)-, или -CH₂-, или -CN;

- R₂ (i) не существует (если X является -CN), (ii) является водородом, (iii) или -OR₃, где R₃ является водородом или ароматической или неароматической, линейной или циклической, насыщенной или ненасыщенной, разветвленной или неразветвленной углеводородной цепью, включающей 1-20 атомов углерода, и которая может включать один или более гетероатомов, выбранных из O, S, N, P и Si, (iv) или -NR₄R₅, где R₄ и R₅, которые являются одинаковыми или разными, являются водородом или ароматической или неароматической, линейной или циклической, насыщенной или ненасыщенной, разветвленной или неразветвленной углеводородной цепью, включающей 1-20 атомов углерода, и которая может включать один или более гетероатомов, выбранных из O, S, N, P и Si;

- n равно 0, 1 или 2, предпочтительно 1; и

- * является асимметрическим атомом углерода;

где указанный способ включает стадии:

a) получения соединения формулы (II):

G-(CH₂)_n-C*H(NHR₁)-X-R₂, (II)

в которой

- n, R₁, R₂, X и * такие, как определены ранее,

- G является либо (i) R₆-C(=O)-O-CH₂-, либо (ii) (R₇O)(R₈O)-P(=O)-O-CH₂-, либо (iii) R₇O-SO₂-O-CH₂-;

- R₆ является водородом или ароматической или неароматической, линейной или циклической, насыщенной или ненасыщенной, разветвленной или неразветвленной углеводородной цепью, включающей 1-20 атомов углерода, и которая может включать один или более гетероатомов, выбранных из O, S, N, P и Si;

- R₇ и R₈, которые могут быть одинаковыми или разными, выбирают, независимо друг от друга, из протона H, щелочного металла, щелочноземельного металла или аммония, предпочтительно протона H или щелочного металла и более предпочтительно протона H или Na;

b) получения неорганического тритиокарбоната;

c) реакции между указанным соединением формулы (II) и указанным неорганическим тритиокарбонатом в присутствии сульфгидрилазы, ассоциированной с указанным соединением формулы (II);

d) получения, по крайней мере, одного функционализированного циклического дитиокарбамата формулы (I);

e) разделения и выделения, по крайней мере, одного указанного циклического дитиокарбамата формулы (I);

стадии a) и b) необязательно проводят одновременно.

2. Способ по п. 1, в котором функционализированный циклический дитиокарбамат формулы (I) энантиомерно чист.

3. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором функционализированным циклическим дитиокарбаматом формулы (I) является L-рафанузаминовая кислота или L-гоморафанузаминовая кислота.

4. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором соединение формулы (II) выбирают из производных L-серина и L-гомосерина.

5. Способ по п. 4, в котором производное L-серина выбирают из O-фосфо-L-серина, O-сукцинил-L-серина, O-ацетил-L-серина, O-ацетоацетил-L-серина, O-пропио-L-серина, O-кумароил-L-серина, O-малонил-L-серина, O-гидроксиметилглутарил-L-серина, O-пимелил-L-серина и O-сульфато-L-серина, предпочтительно O-фосфо-L-серина, O-сукцинил-L-серина, O-ацетил-L-серина и O-сульфато-L-серина, и более конкретно O-ацетил-L-серина.

6. Способ по п. 4, в котором производное L-гомосерина выбирают из O-сукцинил-L-гомосерина, O-ацетил-L-гомосерина, O-ацетоацетил-L-гомосерина, пропио-L-гомосерина, O-кумароил-L-гомосерина, O-малонил-L-гомосерина, O-гидроксиметилглутарил-L-гомосерина, O-пимелил-L-гомосерина, O-фосфо-L-гомосерина и O-сульфато-L-гомосерина, предпочтительно O-сукцинил-L-гомосерина, O-ацетил-L-гомосерина, O-фосфогомосерина и O-сульфато-L-гомосерина, и более конкретно O-ацетил-L-гомосерина.

7. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором сульфгидрилазу выбирают из сульфгидрилаз, ассоциированных с производным L-серина, и сульфгидрилаз, ассоциированных с производными L-гомосерина.

8. Способ по п. 7, в котором сульфгидрилазу, ассоциированную с производным L-серина, выбирают из O-фосфо-L-серинсульфгидрилазы, O-сукцинил-L-серинсульфгидрилазы, O-ацетил-L-серинсульфгидрилазы, O-ацетоацетил-L-серинсульфгидрилазы, O-пропио-L-серинсульфгидрилазы, O-кумароил-L-серинсульфгидрилазы, O-малонил-L-серинсульфгидрилазы, O-гидроксиметилглутарил-L-серинсульфгидрилазы, O-пимелил-L-серинсульфгидрилазы и O-сульфато-L-серинсульфгидрилазы, предпочтительно O-фосфо-L-серинсульфгидрилазы, O-сукцинил-L-серинсульфгидрилазы, O-ацетил-L-серинсульфгидрилазы и O-сульфато-L-серинсульфгидрилазы, и более конкретно O-ацетил-L-серинсульфгидрилазы.

9. Способ по п. 7, в котором сульфгидрилазу, ассоциированную с производным L-гомосерина, выбирают из O-фосфо-L-гомосеринсульфгидрилазы, O-сукцинил-L-гомосеринсульфгидрилазы, O-ацетил-L-гомосеринсульфгидрилазы, O-ацетоацетил-L-гомосеринсульфгидрилазы, O-пропио-L-гомосеринсульфгидрилазы, O-кумароил-L-гомосеринсульфгидрилазы, O-малонил-L-гомосеринсульфгидрилазы, O-гидроксиметилглутарил-L-гомосеринсульфгидрилазы, O-пимелил-L-гомосеринсульфгидрилазы и O-сульфато-L-гомосеринсульфгидрилазы, предпочтительно O-фосфогомосеринсульфгидрилазы, O-сукцинил-L-гомосеринсульфгидрилазы, O-ацетил-L-гомосеринсульфгидрилазы и O-сульфато-L-гомосеринсульфгидрилазы, и более предпочтительно O-ацетил-L-гомосеринсульфгидрилазы.

10. Способ по одному из представленных выше пунктов, в котором неорганический тритиокарбонат выбирают из тритиокарбоната щелочного металла, тритиокарбоната щелочноземельного металла и тритиокарбоната аммония, предпочтительно тритиокарбоната натрия, тритиокарбоната калия, тритиокарбоната кальция и тритиокарбоната аммония, и более предпочтительно тритиокарбоната натрия.

11. Способ по любому из предыдущих пунктов, включающий необязательную стадию f) дополнительной функционализации функционализированного циклического дитиокарбамата формулы (I), полученного на стадии d) или на стадии e).

12. L-гоморафанузаминовая кислота, полученная способом, описанным в пп. 1-11.

13. Гомоцистеин тритиокарбоната формулы (IV):

X₂⁺S^--C=(S)-S-CH₂-(CH₂)_nC*H(NHR₁)-X-R₂, (IV)

в котором R₁, R₂, X, * и n такие, как определены в п. 1, и X₂ является группой щелочного металла, щелочноземельного металла или аммония, предпочтительно Na, K, NH₄ или Ca, более предпочтительно Na.