СПОСОБ ОТБОРА IN VITRO КИСЛОТОВЫНОСЛИВЫХ ФОРМ КЛЕВЕРА ЛУГОВОГО (TRIFOLIUM PRATENSE L.) Российский патент 2020 года по МПК A01H1/04 

Изобретение относится к области сельского хозяйства и может быть использовано в селекции растений для получения кислотовыносливых форм клевера лугового, в исследованиях по физиологии и генетике растений.

Известен способ отбора кислотоустойчивых форм клевера лугового методом рулонной культуры [1].

К недостаткам данного способа можно отнести следующее. Способ ограничен отбором кислотоустойчивых форм, но не содержит сведений о вегетативном размножении полученных форм и не обеспечивает длительное сохранение ценных кислотоустойчивых форм, что снижает воспроизводимость контролируемых скрещиваний и проведение генетических исследований признака кислотоустойчивости у такого строгого перекрестно-опыляемого растения, как клевер луговой.

В литературе имеются сведения о способе отбора кислотоустойчивых форм клевера лугового по рН клеточного сока [2].

К недостаткам данного способа следует отнести то, что он не содержит сведения о микроразмножении ценных кислотоустойчивых генотипов клевера лугового. Это не позволяет длительно сохранять отобранные формы.

Известен способ отбора in vitro кислотоустойчивых форм клевера лугового [3]. К недостаткам данного способа можно отнести следующее. Число кислотоустойчивых форм в популяциях сортообразцов, отобранных данным способом (образец 30 ВИК 7) варьирует и может не превышать 7,4%. Это значительно обедняет популяцию по другим, не менее ценным селекционным признакам (высокая семенная и кормовая продуктивность, раннеспелость, устойчивость к болезням), не коррелирующих с признаком кислотоустойчивости.

Цель изобретения - разработка способа отбора in vitro кислотовыносливых форм клевера лугового.

В предлагаемом способе поставленная цель достигается получением морфогенной ткани путем субкультивирования эпикотилей проростков без корней и с корнями менее 4-5 мм с селективной питательной агаризованной среды Гамборга В₅ с 2 мг/л 6-бензиламинопурина и 100 мг/л Al³⁺ на среду того же состава, но без Al³⁺. Оценку кислотовыносливости морфогенной ткани проводят по индексу роста (не ниже 5,0) через 3-4 недели повторного культивирования эксплантов (кусочки морфогенной ткани) на селективной среде с 100 мг/л Al³⁺ и способности образовавшихся из морфогенной ткани растений-регенерантов выживать после 3-4 скашиваний в грунтовой теплице в течение не менее 3-х лет вегетации.

Способ осуществляется следующим образом: из сортообразцов клевера лугового с низкой устойчивостью к почвенной кислотности проводили отбор in vitro генотипов, выдерживающих концентрацию селективного фактора Al³⁺ 100 мг/л в питательной среде Гамборга В₅. Среду и соль алюминия стерилизовали раздельно автоклавированием в течение 30 минут при 1,25 атм., а затем смешивали в стерильных условиях до момента застывания среды.

Морфогенную ткань получали путем субкультивирования эпикотилей проростков без корней и с корнями менее 4-5 мм с селективной питательной агаризованной среды Гамборга В₅ с 2 мг/л 6-бензиламинопурина и 100 мг/л Al³⁺ на среду того же состава, но без Al³⁺. Индекс роста определяли через 3-4 недели после повторного культивирования эксплантов (кусочки морфогенной ткани) на питательной агаризованной среде Гамборга В₅ с 100 мг/л Al³⁺. Изучали морфобиологические показатели растений-регенерантов клевера лугового, образовавшихся в морфогенной ткани с различным индексом роста на селективной среде Гамборга В₅ с 100 мг/л Al³⁺ и выживших после 3-4 скашиваний в течение 3 лет вегетации в грунтовой теплице.

Пример 1.

Изучение токсического влияния Al³⁺ на корнеобразовательную способность проростков клевера лугового в культуре in vitro.

Исследования проводили на F₂ потомстве растений клевера лугового с низкой кислотоустойчивостью (табл. 1). Число генотипов с корнями ≥4 мм на селективной агаризованной среде Гамборга В₅ с 100 мг/л Al³ было незначительным у F₂I 0,9; у F₂II 18,3 и у F₂III 7,4, что составляло 2,1; 59,2 и 23,9 процентов к контролю (среда без Al³⁺) соответственно.

Наибольшее число проростков в популяциях F₂ потомства при проращивании на среде с 100 мг/л Al³⁺ было без корней и с корнями менее 4,0 мм (31,1 и 7,1 у F₂I; 20,7 и 11,0 у F₂II и 32,0 и 10,6 у F₂III), т.е. 444,3% и 788,9% у F₂I; 279,7% 94,0% у F₂II; 400,0% и 96,4% у F₂III по отношению к контролю (среда без Al³⁺).

В связи с низким числом кислотоустойчивых генотипов клевера лугового, отобранных ранее разработанным способом, возникла необходимость в дальнейших исследованиях по увеличению числа генотипов клевера лугового для селекции на кислотовыносливость.

Пример 2.

Проводили сравнительную оценку кислотовыносливости in vitro трех популяций F₂ генотипов клевера лугового (F₂I, F₂II, F₂III). Для чего асептически выращенные экспланты клевера лугового после взвешивания культивировали 3-4 недели на агаризованной среде Гамборга В₅ с 2 мг/л 6-бензиламинопурина с 0 (контроль), 50 и 100 мг/л Al³⁺ до образования морфогенной ткани с побегами. При определении индекса роста (ИР) получены следующие результаты (табл. 2). Наибольший ИР на селективной среде с 100 мг/л Al³⁺ отмечался у морфогенной ткани F₂I (в среднем 7,3 при 41,0% к контролю (среда без Al³⁺), наименьший - у F₂III (в среднем 2,9 при 37,1% к контролю).

Побеги с корнями, образовавшиеся в морфогенной ткани клевера лугового с индексом роста не ниже 5,0 высаживали из чашек Петри в кассеты для выращивания растений с почвой (рН 4,1), а затем в почву с нормальной кислотностью в грунтовой теплице при индивидуальном стоянии.

Пример 3.

Проводили сравнительное изучение морфобиологических показателей в вегетационном опыте F₂ поколения растений-регенерантов клевера лугового, полученных из морфогенной ткани с различным индексом роста на селективной среде с 100 мг/л Al³⁺. Число выживших растений-регенерантов клевера лугового, полученных из морфогенной ткани с индексом роста не менее 5 после трех скашиваний в течение трех лет вегетации в вегетационном опыте на почве с нормальной кислотностью составляет F₂I 84,1%; у F₂II - 89,1%; F₂III - 69,3%, что значительно превышает этот показатель у растений-регенерантов, полученных из морфогенной ткани с ИР ниже 5 (F₂I - в 4,1 раза; F₂II - 6,2 раза; F₂III - 3,8 раза) (табл. 3). При этом эти растения превосходят и по высоте в 2,5-5,9 раза, в 2,0-4,3 раза по числу стеблей и в 2,5-2,6 раза по числу соцветий.

Все это свидетельствует о том, что растения-регенеранты клевера лугового, полученные из морфогенной ткани с ИР не менее 5,0 обладают большей кислотовыносливостью, чем полученные из морфогенной ткани с ИР ниже 5,0.

Таким образом, разработанный способ позволяет проводить отбор in vitro кислотовыносливых форм клевера лугового по индексу роста морфогенной ткани, что значительно увеличивает число генотипов клевера лугового, способных преодолевать токсическое влияние Al³⁺ и повышенной кислотности среды и формировать растения с высокой кормовой и семенной продуктивностью.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Онучина О.Л., Тумасова М.И. Методы и результаты селекции клевера лугового на повышенную кислотоустойчивость // Кормопроизводство. - 2007. -№4. - с. 27-28.

2. Пат. 2138154 РФ, МПК А01Н 1/04. Способ отбора кислотоустойчивых форм клевера лугового / Новоселов М.Ю., Пайвин С.Г. (РФ) - №9810620/13; заявлено 15.01.1998; опубл. 27.09.1999. - Бюл. №27. - 5 с.

3. Пат. 2583304 РФ. МПК А01Н 1/04. Способ отбора in vitro кислотоустойчивых форм клевера лугового / Солодкая Л.А., Агафодорова М.Н., Лапотышкина Л.И. (РФ) - №2014151553/10; заявлено 19.12.2014; опубл. 10.05.2016. - Бюл. №13.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ отбора in vitro кислотовыносливых форм клевера лугового, включающий культивирование на питательной среде Гамборга В₅ морфогенной культуры клевера лугового, полученной путем проращивания семян и культивирования проростков на питательной агаризованной среде Гамборга В₅ с 2 мг/л 6-бензиламинопурина и 100 мг/л Al³⁺, где морфогенную ткань получают путем субкультивирования эпикотилей проростков без корней и с корнями менее 4-5 мм с селективной питательной агаризованной среды Гамборга В₅ с 2 мг/л 6-бензиламинопурина и 100 мг/л Al³⁺ на среду того же состава, но без Al³⁺, а оценку кислотовыносливости морфогенной ткани проводят по индексу роста (не ниже 5,0) через 3-4 недели повторного культивирования эксплантов (кусочки морфогенной ткани) на селективной среде с 100 мг/л Al³⁺ и способности образовавшихся из морфогенной ткани растений-регенерантов выживать после 3-4 скашиваний в грунтовой теплице в течение не менее 3 лет вегетации. Изобретение позволяет отобрать растения-регенеранты с большей кислотовыносливостью. 3 табл., 3 пр.

Способ отбора in vitro кислотовыносливых форм клевера лугового, включающий культивирование на питательной среде Гамборга В₅ морфогенной культуры клевера лугового, полученной путем проращивания семян и культивирования проростков на питательной агаризованной среде Гамборга В₅ с 2 мг/л 6-бензиламинопурина и 100 мг/л Al³⁺, отличающийся тем, что морфогенную ткань получают путем субкультивирования эпикотилей проростков без корней и с корнями менее 4-5 мм с селективной питательной агаризованной среды Гамборга В₅ с 2 мг/л 6-бензиламинопурина и 100 мг/л Al³⁺ на среду того же состава, но без Al³⁺, а оценку кислотовыносливости морфогенной ткани проводят по индексу роста (не ниже 5,0) через 3-4 недели повторного культивирования эксплантов (кусочки морфогенной ткани) на селективной среде с 100 мг/л Al³⁺ и способности образовавшихся из морфогенной ткани растений-регенерантов выживать после 3-4 скашиваний в грунтовой теплице в течение не менее 3-х лет вегетации.