Способ регенерации растений клевера IN VIтRо Советский патент 1981 года по МПК A01G7/00 

Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано iB селекции и семеноводстве растений, в частности в селекции на клеточном уровне и для ускоренного размножения и оздоровления селекционного материала, в исследованиях по фитопатологии, физиологии и генетике растени Известны способы регенерации растений из клеток суспензионных культур клевера белого (Trifoeium repens L.) и люцерны-(наиболее близкого к клеверу рода семейства бобовых). В соответствии с этими способами регенерацию растений осуществляют посредством получения каллусов из проростков клевера белого и листьев люцерны на агаризованных питательных средах с последующей дезинтеграцией каллусной ткани на клетки и клеточные агрегаты в жидких питательных средах размножения образовавшихся клеточных популяций и формирования дифференцированных структур (почки, эмбриоиды а затем растений-регенерантов 1 и . Однако эти способы оказались неприемлемыми для клевера лугового (trifptium pratense L- ), что связано со специфическими требованиями каждого вида растений к условиям, способствующим регенерации. Кроме того, получение каллусов из проростков приводит к потере исходных форм и затрудняет оценку селекционного ма териала. Известен также способ регенерации растений клевера лугового из каллусной ткани, полученной из листовых эксплантатов, на агаризованных питательных средах 3. Однако этот способ неприменим для клеточной селекции и не позволяет получать большое число регенерантов в расчете на 1 эксплантат (в среднем получают 25 растений). Целью изобретения является увеличение выхода регенерантов. Поставленная цель достигается тем, что каллусы получают из листьев посредством культивирования эксплантатов на модифицированной агаризованной среде в которую дополнительно вводят итаконовую кислоту, каллусную .ткань помещают в жидкую среду Bg с кинетином и повышенной концентрацией тиамина - НСв, а образовавшиеся клеточные суспензии кульг

гивируют в жидкой среде В без гормонов, сформировавшиеся в cycneHStH проэмбриоиды культивируют на агаризованной среде Bg- без гормонов до .образования эмбриогеиной ткани, проростков и растений-регенерантов.

Причем итаконовую кислоту вводяч в агаризованную модифицированную среду Гамборга Bg. в количестве 2--4 мг/л.

Содержание тиамина - НСв в жидкой среде Гамборга В. составляет 2025 мг/л.

Количество кинетина в жидкой среде Гамборга В составляет 0,20,8 мг/л.

Способ осуществляется следующим образом.

Семена культивируегвлх сортов и гибридов клевера лугового обрабаты- вают 30 мин в концентрированной серной кислоте (скарификация и стерилизация) , затем промывают стерильной дистиллированной водой до нейтральной реакции и выдерживают в течение ч в темноте при 22±1С. Наклюнувшиеся семена помещают на агаризованную среду Bj- с уменьшенной вдвое концентрацией всех входящих в нее компонентов (1/2 Ъ) и инкубируют в закрытых прозрачных сосудах при

11юминесцентном освещении 8-10 тыс.лк и при фотопериоде 16 ч/сут, температуре 22il°C и относительной влажности воздуха 80+10% до образования растений с 6-7 листьями. Часть тройg чатых листьев используют для получения каллусов, а растения с оставшимися 2-3 листьями высаживают в почву. .

На листочках, предназначенных

o для получения каллусов, делают ряд надрезов вдоль жилок, помещают на питательную среду Вд-, в которую дополнительно вводят 6000-8000 мг/л агар - агара или бактоагара, 200300 мг/л нитрата аммония и 2-4 мг/л

s итаконовой кислоты, содержание сахарозы увеличивают до 25000 30000 мг/л, железа (ГГ) сернокислого (РеЗОд- ) до 70-100 мг/л, трилона Б (Ка2.ЭДТА) до 90-130 мг/л

0 и вносят следукедие фитЬгормоны; 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д) 5-6 мг/л, кинетин 6-10 мг/я и ci-нафтилуксусную кислоту (НУК) 0,1-0,5 мг/л, рН реды доводят до 5 .5,8-6,0.

Состав среды Eg- (Gamborg et аВ., 1968) при рН 5,5 представлен в табл. 1.

Таблица 1

Материал инкубируют 12-14 дней |при непрерывном освещении люминесцентными лампами (освещенность 8,010,0 тыс. лк) г I температуре 22 + 1С и относительной влажности воздуха

95i5%.

В случае появления на листочках бактериальной или грибной инфекции их удаляют с частью прилегающей к ним Питательной среды.

Образовавшиеся каллусы использую Для получения клеточных суспензий, помещая их в жидкую питательную среду Рг с 0,2-0,8 мг/л кинетина и 20-25 мг/л тиамина - НСЕ, (на каждый мл среды вносят 15-25 мг каллусной ткани). Материал инкубируют на встряхивающих аппаратах с числом колебаний 100-125 мин при освещенности 3-4 тыс о лк и температуре 24+2°С. Через 8-10 суток суспензии субкультивируют путем добавления к 3-5 объемам свежей среды без гормонов 1-го объема суспензии. Через 2-3 недели в Суспензии образуются проэмбриоиды (незрелые соматические зародыши), которые пересаживают на агаризованную среду 1/2 В без гормонов. Через 8-10 суток из проэмбриидов образуется эмбриогенная ткань, которую пассируют на свежую среду того же состава. После 12-14 дней культивирования масса пересаженной

ткани увеличивается в 14-16 раз, и в ней развиваются проростки, которые через 2-3 недели образуют растениярегенеранты. Разросшуюся эмбриогенную ткань субкультивируют с 10-12дневным интервалом с целью получения новых проростков, в конце каждого цикла выращивания образовавшиеся проростки переносят на агаризованную среду 1/2 Вр без гормонов. Через 2-3 недели из проростков формируются растения-регенеранты с 4-5 листьями и корнями. Регенеранты пересаживают в почву и выращивают 14-16 дней под прозрачной синтетической пленкой (для предотвращения десикации), а затем в обычных условиях.

П р и м е р. Проводили регенерацию растений иЗ клеток суспензион80

б,45±0,14 342±24,4 530+10,0

3,60+0,17 180+17,6 330+18,7 .98

Разность между вариантами с итаконовой кислотой и контролем без итаконовой кислоты достоверна при Р 0,0.1.

Полученные каллусы помещают в жидкую питательную среду с 0,5 мг/л кинетина и 20 мг/л тиамина из расчета 20 мг ткани на 1 мл среды и инкубируют на аппарате АВУ-1 (аппарат универсальный для встряхивания жидкости в колбах и пробирках) при 100-125 колебаниях в минуту и амплитуде колебаний 20-30 мм. В течение 8-10 дней из каллусов образуются суспензии, содержащие в среднем 300 тыс. клеток/мл.

Для получения проэмбриоидов из клеток суспензионных культур к 4 объемам свежей среды без гормонов добавляли 1 объем суспензии. Через 2 недели в суспензии сформировались зеленые проэмбриоиды (10 штук в каждом мл среды), которые после пересаки на среду без гормонов образовали

ных культур клевера лугового сорта ВИК-7. При этом получены следующие результаты: 80% листовых эксплантатов на среде с тремя фитогормонами: 5 мг/л 2,4-Д 4- 8 мг/л кинетика J +0,5 мг/л НУК и итаконовой кислотой (3 мг/л) через 2 недели образуют каллусы со средней массой 530±10 мг. Итаконовая кислота (ненасыщенная двухосновная карбоновая кислота HOOC-CH,j-(J-COOH является продуктом

снг

обмена веществ некоторых плесневых грибов, например AspergiCCuj itaconlcus, в культуре тканей используется впервые) стимулирует интенсивное

5 развитие каллусов у растений сорта ВИК-7 и у полученных из этого сорта регенерантов (табл. 2).

;Т а б л и ц а

82,2

53,0

50,0 91,7

эмбриогенную ткань. В этой ткани через 2 недели сформировались проростки, а затем растения-регенеранты. Разросшуюся эмбриогенную ткань

5 пересаживают с 10 дневным интервалом на свежую среду 1/2 В5-. В конце кг1Ждого цикла выращивания в ткани формируются новые проростки (по 150 шт на 500 мг пересаженной ткани), ко0торые переносят на среду того же состава. Через 2 недели проростки образуют растения-регенеранты с 4-5 листьями и корнями. Последние высаживают в почву и выращивают 2

5 недели под полиэтиленовой пленкой, а затем в обычных условиях. Полученные растения-регенеранты свободны от фитопатогенной инфекции, нормально ростут и развиваются, цветут и завязывают семена. Весь процесс

О регенерации от получения каллусов до высадки растений-регенерантог в почву занимает в среднем три месяца. Выход регенерантов в расчете на 1 эксплантат (листочек) составляет: без субкультивирования эмбриогенной ткани - 7 тыс. растений, а при 2-кратном субкультивировании 1 млн,

Использование изобретения позволяет быстро размножать и оздоравливать селекционный материал, обра- батывать мутагенами многочисленные клеточные популяции и проводить эффективный отбор ценных генотипов методами клеточной селекции, получая из отобранных форм растения-регенеранты.

Формула изобретения

вводят кинетин, полученные клеточные суспензии пересаживают в жидкую среду Гамборга В5 без гормонов, а образовавшиеся из клеток проэмбриоиды выращивают на агаризованной среде , Гамборга Вр- без гормонов с регулярным субкультивированием образовавшейся из них амбриогенной ткани и пересадкой сформировавшихся в этой ткани проростков на среду Гамборга В, без гормонов.

0

5

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

5 pgantCet regeneration from cuCtures of &adino cCover and soybean.- PhysioC . PC ant, p. 39, 129134, 1977.

0 № 721036, кл. А 01 Н 3/00, 1978.

3.Авторское свидетельство СССР № 721035, кл. А 01 Н 3/00, 1978.