СПОСОБ ОЦЕНКИ И ОТБОРА IN VITRO ОБРАЗЦОВ КЛЕВЕРА ЛУГОВОГО С ПОВЫШЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТЬЮ К КИСЛОТНОСТИ СРЕДЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ Российский патент 2024 года по МПК A01H1/04 

Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано в селекции растений для оценки и отбора кислотоустойчивых образцов клевера лугового, в исследованиях по генетике и молекулярно-генетическому анализу перспективного материала.

Известен способ отбора in vitro кислотоустойчивых форм клевера лугового[1], включающий культивирование морфогенной культуры клевера лугового на питательной среде Гамборга В₅. В способе морфогенную культуру получают путем проращивания семян и культивированием полученных проростков на питательной агаризованной среде Гамборга В₅ с 2,0 мг/л 6-бензиламинопурина и 100 мг/л Al³⁺при субкультивировании на среду того же состава, но без добавления Al³⁺ эпикотелей проростков, образовавших корешки не менее 4-5 мм на селективной среде с 100 мг/л Al³⁺, при этом в качестве кислотоустойчивых растений клевера лугового отбирают растения с длиной корней не менее 50 мм.

Недостатком данного способа является то, что он ограничен отбором отдельных кислотоустойчивых генотипов, способных формировать в селективных условиях корневую систему более 50 мм, превышающих таковую у неустойчивых генотипов.

Известен также способ отбора in vitro кислотовыносливых форм клевера лугового [2], включающий культивирование на питательной среде Гамборга В₅ морфогенной культуры клевера лугового, полученной путем проращивания семян и культивирования проростков на питательной агаризованной среде Гамборга В₅ с 2 мг/л 6-бензиламинопурина и 100 мг/л Al³⁺. В способе морфогенную ткань получают путем субкультивирования эпикотилей проростков без корней и с корнями менее 4-5 мм с селективной питательной агаризованной среды Гамборга В₅ с 2 мг/л 6-бензиламинопурина и 100 мг/л Al³⁺на среду того же состава, но без Al³⁺, а оценку кислотовыносливости морфогенной ткани проводят по индексу роста (не ниже 5,0) через 3-4 недели повторного культивирования эксплантов (кусочки морфогенной ткани) на селективной среде с 100 мг/л Al³⁺и способности образовавшихся из морфогенной ткани растений-регенерантов выживать после 3-4 скашиваний в грунтовой теплице в течение не менее 3-х лет вегетации.

Способ ограничен исследованиями на уровне морфогенной ткани с различным индексом роста у генотипов с разной степенью кислотовыносливости, но не позволяющий выявлять генетическую природу признака.

Цель исследований - разработка способа оценки и отбора in vitro образцов клевера лугового с повышенной устойчивостью к кислотности среды с использованием молекулярно-генетических технологий.

Поставленная цель в способе оценки и отбора in vitro образцов клевера лугового с повышенной устойчивостью к кислотности среды с использованием молекулярно-генетических технологий достигается проращиванием семян и культивированием полученных проростков на питательной среде Гамборга В₅ с 2,0 мг/л БАП (бензиламинопурина) и различной концентрацией Al³⁺ и без него. Семена проращивают на фильтровальной бумаге с добавлением различных концентраций Al³⁺ и без него и последующего культивирования в течение 30 дней полученных проростков с эпикотилями и корнями без получения морфогенной ткани, а оценку кислотоустойчивости проводят на основе различий в характере амплификации при ПЦР-анализе ДНК, выделенной из общей навески 30 проростков каждого варианта и кислотоустойчивости к Al³⁺ популяций F₁ растений каждого образца.

На фиг. 1 представлены балк-образцы (смесь проростков 30 генотипов) геномной ДНК клевера лугового. Лунки: 1 - ВИК7 (H₂O); 2-ВИК7 (50 Al³⁺); 3 - №236 (H₂O); 4 - №236 (50 Al⁺³); 5 - №211 (H₂O); 6 - №211 (50 Al⁺³); 7 - №211 (100 Al³⁺); на фиг. 2 представлена электрофореграмма продуктов амплификации образцов клевера с разными комбинациями маркеров по системе REMAP. Лунки: 1 - ВИК7 (H₂O); 2-ВИК7 (50 Al⁺³); 3 - №236 (H₂O); 4 - №236 (50 Al⁺³); 5 - №211 (H₂O); 6 - №211 (50 Al⁺³); 7 - №211 (100 Al⁺³); 8 - контроль, вода; М - маркер молекулярного веса.

Способ осуществляется следующим образом: семена 7 образцов клевера лугового (30 - ВИК7), 236 и 211 с различной устойчивостью к почвенной кислотности в полевых условиях проращивали на фильтровальной бумаге в чашках Петри с 50 мл жидкой питательной среды Гамборга В₅ с 2,0 мг/л БАП (6-бензиламинопурина) с добавлением Al³⁺в различной концентрации и без него до формирования проростков с корнями. Оценку кислотоустойчивости проводили на основе различий в характере амплификации при ПЦР-анализе ДНК, выделенной из 30 проростков каждого образца.

Оставшуюся часть проростков каждого образца F₁ сначала высаживали в кассеты с почвой рН 4,6 и культивировали до формирования растений с 5-7 листочками, затем пересаживали в почву с нормальной кислотностью и выращивали до получения семян F₂.

Пример 1.

Молекулярно-генетический анализ проростков F₁ образцов клевера лугового.

Для анализа взято 7 образцов: №1 (30) - ВИК7 -50 мг/л Al³⁺; №2 (30) - ВИК7(к) - H₂O; №3 - 236 - 50 мг/л Al³⁺; №4 - 236 - H₂O; №5 - 211 - H₂O; №6 - 211 - 50 мг/л Al³⁺; №7 - 211 - 100 мг/л Al³⁺.

Качество и количественный выход ДНК, выделенной из 30 проростков каждого образца (балк-анализ) SDS-методом экстракции, определяли с помощью электрофореза в агарозном геле и измерением концентрации и оптической плотности растворов на спектрофотометре Nano Spectrophotometer "Nabi", (фиг. 1).

По результатам REMAP-анализа образец 211 (100 Al³⁺) выделялся среди других экспериментальных образцов наличием ампликона размером 270 п.н. с комбинацией праймеров PawS6+MS17 (фиг. 2, б, лунка 7), который отсутствовал у этой же формы, культивируемой на воде и с добавлением 50 мг/л Al³⁺.

Пример 2.

НСР₀₅ длины проростков F₁30 (50 Al³⁺)* и F₁211 (50 Al³⁺)* 0,34 мм НСР₀₅ длины проростков F₂30 (50 Al³⁺)** и F₂211 (50 Al³⁺)** 1,16 мм НСР₀₅ длины проростков F₁211 (50 Al³⁺)* и F₂211 (50 Al³⁺)** 0,44 мм НСР₀₅ длины проростков F₁211 (100 Al³⁺)*** и F₂211 (100 Al³⁺)*** 0,74 мм

Существенной разницы по длине проростков в вариантах на средах без Al³⁺не обнаружено.

В варианте с 100 мг/л Al³⁺ все проростки образцов F₁(30) и F₂(30) погибли. Длина проростков образца F₁211 и F₂211 с 50 мг/л Al³⁺ существенно превышала таковую у образца 30 как в поколении F₁ так и F₂ соответственно. Длина проростков у образца F₂211 клевера лугового в варианте с 50 мг/л Al³⁺ существенно превышала таковую у F₁211.

Длина проростков F₂211, полученных на среде с 100 мг/л Al³⁺ существенно превышала (НСР₀₅0,74 мм) длину исходных F₁211 проростков, что свидетельствует об эффективности разработанной нами селективной системы отбора с 100 мг/л Al³⁺.

В представленных результатах исследований размер образовавшихся проростками корешков, как и в ранее разработанном способе [1], зависел от генотипа и концентрации селективного фактора (Al³⁺) (табл. 2).

НСР₀₅ длины корешков F₁30 (50 Al³⁺)* и F₁211 (50 Al³⁺)* 0,57 мм НСР₀₅ длины корешков F₂30 (50 Al³⁺)** и F₂211 (50 Al³⁺)** 0,55 мм НСР₀₅ длины корешков F₁211 (100 Al³⁺)*** и F₂211 (100 Al³⁺)*** 0,39 мм

Длина корешков у проростков F₂211 при отборе на селективной среде с 100 мг/л Al³⁺существенно превышала этот показатель у исходной популяции. Кроме того, эти результаты соответствуют данным исследований по молекулярно-генетическому анализу изучаемых образцов, а эффективность подтверждается также результатами молекулярно-генетического анализа изучаемых образцов с использованием REMAP-системы и наличия ампликона размером 270 п.н. у устойчивой формы 211 (100 мг/л Al³⁺), (фиг. 2, б, лунка 7), отсутствующей у других образцов с комбинацией PawS6+MS17.

Таким образом, разработанный способ позволяет оценивать и отбирать популяции образцов клевера лугового с повышенной кислотоустойчивостью. Кроме того, в дальнейших исследованиях проведение клонирования и секвенирования фрагмента амплификации 270 п.н. у устойчивой формы 211 (100 мг/л Al³⁺) позволит охарактеризовать последовательность нуклеотидов в целевом фрагменте, формирующим отличие этого образца от других вариантов по признаку кислотоустойчивости.

Источники информации

1. Патент 2583304 РФ МПК А01Н 1/04. Способ отбора in vitro кислотоустойчивых форм клевера лугового / Солодкая Л.А. (RU), Агафодорова М.Н. (RU), Лапотышкина Л.И. (RU) - 2014151553/10; заявлено 19.12.2014; опубл. 10.05.2016. Бюл. №13.

2. Патент 2711781 РФ МПК А01Н 1/04. Способ отбора in vitro кислотовыносливых форм клевера лугового (Trifolium pratense L.) / Солодкая Л.А. (RU), Агафодорова М.Н. (RU), Лапотышкина Л.И. (RU) - 2019102885; заявлено 01.02.19; опубл.22.01.2020. Бюл. №3.

Изобретение относится к области биотехнологии. Способ осуществляется следующим образом: проводят проращивание семян, различающихся по кислотоустойчивости образцов клевера лугового в чашках Петри на фильтровальной бумаге, смоченной питательной средой Гамборга В₅ с 2,0 мг/л БАП (6-бензиламинопурина) с добавлением различных концентраций Al³⁺и без него и культивированием в течение 30 дней до формирования проростков с эпикотилями и корнями без получения морфогенной ткани. ДНК выделяют SDS-методом экстракции из общей навески 30 проростков с эпикотилями и корнями каждого образца (балк-образец). Оценку кислотоустойчивости проводят на основе сравнительного анализа различий в характере амплификации ДНК и кислотоустойчивости популяций F₁ растений каждого образца. Изобретение позволяет оценить и отобрать in vitro образцы клевера лугового с повышенной устойчивостью к кислотности среды с использованием молекулярно-генетических технологий. 2 ил., 2 табл., 2 пр.

Способ оценки и отбора in vitro образцов клевера лугового с повышенной устойчивостью к кислотности среды с использованием молекулярно-генетических технологий, включающий проращивание семян и культивирование полученных проростков на питательной среде Гамборга В₅ с 2,0 мг/л БАП (бензиламинопурина) и различной концентрацией Аl³⁺ и без него, отличающийся тем, что семена проращивают на фильтровальной бумаге с добавлением различных концентраций Аl³⁺ и без него и последующего культивирования в течение 30 дней полученных проростков с эпикотилями и корнями без получения морфогенной ткани, а эффективность оценки и отбора in vitro образцов клевера лугового с повышенной устойчивостью к кислотности среды подтверждается результатами молекулярно-генетического анализа изучаемых образцов с использованием REMAP - системы и наличия ампликона размером 270 п.н. у устойчивой формы 211 (100 мг/л Аl³⁺), отсутствующей у других образцов с комбинацией PawS6+MS17 при ПЦР-анализе ДНК, выделенной из общей навески 30 проростков каждого варианта популяций F₁ растений каждого образца, образующих на среде с 100 мг/л Аl³⁺корешки длиной не менее 5 мм.