Способ коррекции ишемии головного мозга субстанцией рапиталама в эксперименте Российский патент 2020 года по МПК G09B23/28 A61K31/165 A61P9/10 

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии и неврологии.

По известным литературным источникам - увеличение концентрации внутриклеточного Са²⁺ является результатом избыточного накопления глутамата во внеклеточном пространстве. Гибель нейронов происходит после последовательности биохимических реакций, которая получила название эксайтотоксичности. За этим следует дисбаланс между глутаматергическим возбуждением и ГАМК-эргическим торможением. В результате несвоевременной активации тормозных механизмов продолжается накопление внеклеточного глутамата, гибель нейронов, что приводит к более тяжелым проявлениям ишемии головного мозга [Domin H, Przykaza L, Jantas D, Kozniewska E, Boguszewski PM, Smialowska M (2016) Neuroprotective potential of the group III mGlu receptor agonist ACPT-I in animal models of ischemic stroke: In vitro and in vivo studies. Neuropharmacology 102: 276-294].

Наиболее вероятными механизмами нейропротекции являются ингибирование продукции глутамата в черной субстанции, что в свою очередь защищает от глутамат-опосредованной эксайтотоксичности и снижение воспалительных эффектов [Avdeeva NV, Sidorova SA, Gudyrev OS, Osipova OA, Golubev IV (2019) Mechanism of neuroprotective effect of mGluR4 agonists. Research Results in Pharmacology 5(2): 43-47].

Предполагается, что препараты, влияющие на mGluR4 рецепторы, имеют потенциал при лечении болезни Паркинсона, аутизма и мозжечковой атаксии [Power EM, Empson RM (2014) Functional contributions of glutamate transporters at the parallel fibre to Purkinje neuron synapse-relevance for the progression of cerebellar ataxia. Cerebellum and Ataxias 1: 3]. В галоперидоловой и резерпиновой моделях паркинсонизма введение агонистов mGluR4 приводило к уменьшению симптомов [Niswender CM, Conn PJ (2010) Metabotropic glutamate receptors: physiology, pharmacology, and disease. Annual Review of Pharmacology and Toxicology 50: 295-322].

Актуальным является поиск высокоэффективных препаратов для лечения ишемии головного мозга [Спасов A.A., Федорчук В.Ю., Гурова Н.A. и др. Методологический подход для изучения нейропротекторной активности в эксперименте. Ведомости научного центра экспертизы средств медицинского применения. 2014; 4: 39-45]. Перспективным представляется исследование субстанции рапиталама для коррекции ишемии головного мозга в эксперименте в лечебных целях, являющегося модулятором mGluR4 рецепторов. Рапиталам представляет собой N-[(4-chlorophenyl)methyl]-1,6-dihydro-4-methoxy-1-(2-methylphenyl)-6-oxo-3-pyridazinecarboxamide, С20Н18ClN3O3 [Авдеева, Н.В. Исследование некоторых аспектов мутагенного действия фармацевтической субстанции лекарственного средства - Рапиталам. Авдеева Н.В., Корокин М.В., Покровский М.В. Современные проблемы науки и образования. 2017. № 3. С. 136].

Известен способ коррекции тремора в эксперименте (патент на изобретение RU 2678977, публ. 05.02.2019), включающий однократное ежедневное внутрижелудочное введение крысам корригирующего агента в дозе 10 мг/кг в течение 10 дней, а в последний день эксперимента однократное внутрибрюшинное введение оксотреморина в дозе 1,5 мг/кг в объёме 0,5 мл/кг через 30 минут после введения корригирующего агента. При этом в качестве корригирующего агента используют субстанцию лекарственного средства Рапиталам, который является модулятором mGluR4 рецепторов. Изобретение приводит к выраженной коррекции оксотреморин-индуцированного тремора, подтверждаемой длительностью латентного периода и тремора, суммарной оценкой выраженности тремора в баллах и процентом животных с тремором в группе, с учетом его длительности.

В данном изобретении отсутствует информация о возможности коррекции ишемии головного мозга субстанцией рапиталама в эксперименте.

Известен способ профилактики церебральной ишемии (патент на изобретение RU 2696203, публ. 31.07.2019), включающий воспроизведение четырехсосудистой модели патологии и введение крысам-самцам линии Wistar 2-амино-5-этил-1,3,4-тиадиазолия глицилглицина в дозе 50 мг/кг, который вводят однократно за 60 минут до эксперимента внутрижелудочно через зонд в качестве прекондиционирующего агента, а через 60 минут проводят моделирование церебральной ишемии путем коагуляции двух вертебральных артерий и временной окклюзии двух общих сонных артерий.

Основным недостатком способа является то, что в нем описана только профилактика церебральной ишемии путем прекондиционирования 2-амино-5-этил-1,3,4-тиадиазолия глицилглицином на крысах линии Wistar и нет данных по коррекции 2-амино-5-этил-1,3,4-тиадиазолия глицилглицином ишемических повреждений головного мозга после моделирования патологии (посткондиционирование), что гораздо чаще встречается в практике. Помимо этого, не приведены данные по применению 2-амино-5-этил-1,3,4-тиадиазолия глицилглицина для лечения церебральной ишемии.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является эффективный способ коррекции ишемии головного мозга субстанцией рапиталама в эксперименте, обладающего направленным действием на mGluR4 рецепторы, основанным на ингибировании продукции глутамата в черной субстанции, которая в свою очередь защищает от глутамат-опосредованной эксайтотоксичности и снижении воспалительных эффектов [Avdeeva NV, Sidorova SA, Gudyrev OS, Osipova OA, Golubev IV (2019) Mechanism of neuroprotective effect of mGluR4 agonists. Research Results in Pharmacology 5(2): 43-47].

Задачей предлагаемого изобретения является создание эффективного способа коррекции ишемии головного мозга субстанцией рапиталама в эксперименте, являющегося модулятором mGluR4 рецепторов.

Поставленная задача достигается тем, что предложен способ коррекции ишемии головного мозга субстанцией рапиталама в эксперименте, включающий воспроизведение четырехсосудистой модели ишемии головного мозга путем коагуляции двух вертебральных артерий и временной окклюзии двух общих сонных артерий и введение крысам-самцам линии Wistar фармакологического агента, причем в качестве фармакологического агента используют субстанцию рапиталама в дозе 10 мг/кг, вводимую внутрибрюшинно за 30 мин. до моделирования патологии в первый день эксперимента и после моделирования ишемии головного мозга ежедневно внутрибрюшинно в течение 14 суток суммарно.

Основным преимуществом предлагаемого способа является то, что:

- в качестве церебропротектора с лечебной целью вводят субстанцию рапиталама, являющегося модулятором mGluR4 рецепторов.

- эффективность субстанции оценивается всесторонне: исследуются неврологический дефицит животного, поведенческие реакции, уровень двух специфических маркеров повреждения головного мозга S100b и NSE.

- с помощью электроэнцефалографии (ЭЭГ) производится контроль правильно выполненной модели патологии.

- способ приводит к выраженной коррекции ишемических повреждений головного мозга в эксперименте на крысах-самцах линии Wistar при выбранном режиме введения субстанции рапиталама.

Способ обеспечивает выраженную коррекцию ишемии головного мозга путем направленного действия рапиталама на mGluR4 рецепторы, в результате чего происходит ингибирование продукции глутамата в черной субстанции, защита от глутамат-опосредованной эксайтотоксичности и угнетение воспалительных эффектов.

СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЯЕТСЯ СЛЕДУЮЩИМ ОБРАЗОМ

Эксперимент выполнен на 40 половозрелых самцах крыс линии Wistar 5-6-месячного возраста массой 180-210 г. Содержание животных соответствовало всем правилам лабораторной практики при проведении доклинических исследований на территории РФ. Животные содержались в стандартных условиях, соответствующих санитарным правилам (№ 1045-73), утвержденным МЗ СССР 06.04.73 г. по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев) и ГОСТ Р 53434-2009. Вивисекцию проводили по этическим принципам обращения с лабораторными животными «European Convention for the Protection of Vertebral Animals Used for Experimental and Other Scientific Purposes. CETS No.123».

В эксперимент вошло 4 группы крыс: 1) интактные (n=10), 2) ложнооперированные (n=10), 3) с тотальной церебральной ишемией (n=10), 4) с тотальной церебральной ишемией и введением рапиталама в дозе 10 мг/кг внутрибрюшинно за 30 мин. до моделирования патологии в первый день эксперимента и после моделирования церебральной ишемии ежедневно в течение 14 суток (n=10).

Наркотизацию животных выполняли внутрибрюшинным введением золетила 60 мг/кг и хлоралгидрата 150 мг/кг.

Все эксперименты были выполнены в соответствии с методическими рекомендациями по доклиническому изучению лекарственных средств при нарушениях мозгового кровообращения. В работе была использована модель патологии, при которой осуществляли временную окклюзию двух общих сонных артерий на 4 минуты, с предварительной коагуляцией двух вертебральных артерий. Оценка адекватности выполнения окклюзии артерий, кровоснабжающих мозг, осуществлялась с помощью регистрации электрической активности головного мозга животного на приборе Biopac Systems Inc. MP150 EEG100C [Tadalafil as an agent of pharmacological preconditioning in ischemic - reperfusion brain injury / Martynova O.V. // Research result: pharmacology and clinical pharmacology. - 2017. - Vol.3, №3. - Р. 20-36].

Метод осуществляли при помощи программы AcqKnowledge 4.2. Критерием правильно выполненной методики являлось уменьшение амплитуды ЭЭГ.

Протокол исследования включал следующие этапы: моделирование ишемии головного мозга; оценку ЭЭГ животного; оценку поведенческих реакций (до моделирования патологии и на 2, 7 и 14 сут. после моделирования патологии); неврологического дефицита на 1, 3, 7 и 14 сут после моделирования патологии; определение уровня S100b и NSE на 3 сутки после моделирования патологии.

О выраженности церебропротекторного эффекта судили по тяжести неврологического дефицита, поведенческого статуса, уровню специфических маркеров повреждения головного мозга S100b и NSE.

Для всех данных была применена описательная статистика. Полученные данные проверены на нормальность распределения. С помощью критерия Шапиро-Уилка определяли тип распределения. В случае нормального распределения были подсчитаны среднее значение (M) и стандартная ошибка среднего (m). В случаях ненормального распределения были рассчитаны медиана (Me) и квартильный размах (QR). Межгрупповые различия анализировались параметрическими (t-критерий Стьюдента) или непараметрическими (критерий Манна-Уитни) методами, в зависимости от типа распределения. Различия были определены при 0,05 уровне значимости. Статистический анализ выполнен с помощью программного обеспечения Statistica 10.0.

ПРИМЕР КОНКРЕТНОГО ВЫПОЛНЕНИЯ

Для оценки неврологического статуса крыс использовали несколько методов:

1. Балльную шкалу оценки инсульта McGraw в модификации И.В. Ганнушкиной, результаты которой представлены в таблице 1. Внутри группы крыс с признаками неврологического дефицита подразделяли на животных с легкой, средней и тяжелой симптоматикой неврологического дефицита. Если у животного присутствовало несколько признаков неврологического дефицита, то баллы суммировали. За контроль принимали данные, полученные от животных с тотальной ишемией головного мозга. При оценке выраженности неврологического дефицита по McGraw в модификации И.В. Ганнушкиной на первые сутки после моделирования патологии в контрольной группе наблюдался неврологический дефицит средней степени тяжести (2,73 ± 0,14 балла). У животных регистрировались вялость и замедленность движений, тремор, наличие полуптозов и птозов глаз, слабость конечностей, манежные движения, паралич задней левой лапы. В группе с введением субстанции рапиталама на первые сутки после моделирования ишемии выявлено достоверно более низкое значение неврологического дефицита, чем в контрольной группе (p<0,05). В группе с введением субстанции рапиталама на 3 сутки значение достоверно отличалось от контрольной группы (p<0,05). В контрольной группе на 7 и 14 сутки сохранялся паралич задней левой конечности и полуптоз, птоз правого глаза. В группе с введением рапиталама на 7 и 14 сутки сохранялся лишь полуптоз правого глаза. Активность животных нарастала более стремительно в группе с рапиталамом.

Таблица 1

Влияние субстанции рапиталама на динамику тяжести неврологических нарушений по McGraw в модификации И.В. Ганнушкиной при коррекции ишемии головного мозга в эксперименте, баллы (М±m; n=10)

Период Группы Интактные Ложнооперированные Контроль Коррекция рапиталамом,
10 мг/кг 1 сут 0 0 2,73±0,14 1,53±0,26* 3 сут 0 0 1,28±0,19 0,88±0,35* 7 сут 0 0 0,85±0,30 0,68±0,26 14 сут 0 0 0,51±0,24 0,36±0,22

Примечание: * - р<0,05 в сравнении с контрольной группой животных.

При анализе поведенческих реакций крыс с введением рапиталама в тесте «Приподнятый крестообразный лабиринт (ПКЛ) выявлено, что животные ведут себя активнее, чем крысы контрольной группы. Уже на 2 сутки эксперимента в группе с введением рапиталама наблюдается статистически значимые изменения следующих параметров: снижение времени пребывания в тёмном рукаве ПКЛ, увеличение времени пребывания животных в светлом рукаве ПКЛ, увеличение количества стоек. Количество свешиваний в ПКЛ достоверно увеличивалось на 2 сутки эксперимента в группах с введением рапиталама в дозе 10 мг/кг по сравнению со значениями контрольной группы (р<0,05). На 7-е и 14-е сутки наблюдается статистически значимое улучшение всех изучаемых параметров в группе с рапиталамом по сравнению с контрольной группой (р<0,05) (таблица 2).

Таблица 2

Влияние субстанции рапиталама на поведенческую активность животных в тесте «Приподнятый крестообразный лабиринт» при коррекции ишемии головного мозга в эксперименте (М±m; n=10)

Критерий Период Группы Интактные Ложнооперированные Контроль Коррекция рапиталамом,
10 мг/кг Темный рукав, t 2 сут. 153,2±2,0 154,1±2,2 169,4±1,5 158,6±1,7* 7 сут. 153,2±1,8 153,6±1,7 165,6±2,4 155,8±2,4* 14 сут. 154,5±1,8 155,5±2,0 164,8±2,6 158,6±1,7* Светлый рукав, t 2 сут. 23,8±1,7 24,1±1,5 11,6±1,7 18,2±0,8* 7 сут. 23,8±1,5 23,4±1,3 12,7±1,0 20,5±1,2* 14 сут. 22,8±1,6 22,2±1,4 13,7±1,3 21,5±1,0* Стойки, шт. 2 сут. 10,0±0,5 10,4±0,8 4,6±0,33 7,1±0,3* 7 сут. 9,9±0,6 9,2±0,6 5,3±0,2 8,0±0,4* 14 сут. 9,8±0,7 9,4±0,8 5,6±0,3 8,7±0,4* Свешивания, шт. 2 сут. 4,8±0,4 4,8±0,5 1,5±0,3 2,0±0,2* 7 сут. 4,9±0,2 4,6±0,3 1,7±0,2 2,9±0,3* 14 сут. 5,0±0,5 5,2±0,4 1,8±0,2 3,9±0,5*

Примечание: * - р<0,05 в сравнении с контрольной группой животных.

Результаты теста актиметрии представлены в таблице 3.

Таблица 3

Влияние субстанции рапиталама на поведенческую активность животных в тесте актиметрии при коррекции ишемии головного мозга в эксперименте (М±m; n=10)

Критерий Период Группы Интактные Ложнооперированные Контроль Коррекция рапиталамом,
10 мг/кг Общая активность, у.е. 2 сут. 940,07
±25,94 932,11
±22,03 410,41
±27,9 453,20
±18,86 7 сут. 945,83
±18,77 941,15
±17,01 414,56
±25,87 459,69
±23,76 14 сут. 943,80
±19,6 932,46
±13,5 419,9
±13,0 490,4
±14,2* Стериотипы движения, у.е. 2 сут. 77,02
±2,82 75,05
±2,99 29,47
±2,75 35,65
±3,35* 7 сут. 77,26
±1,45 78,56
±3,09 30,41
±2,28 41,13
±3,04* 14 сут. 78,0
±2,8 78,9
±2,5 30,9
±1,8 45,3
±2,1* Макси-мальная скорость, у.е. 2 сут. 43,18
±2,18 44,67
±3,02 22,25
±2,45 26,71
±3,34 7 сут. 43,62
±2,53 41,32
±2,88 22,78
±2,39 30,94
±2,36* 14 сут. 43,74
±1,61 44,05
±2,63 22,81
±2,04 35,19
±2,71* Общая дистанция, у.е. 2 сут. 2220,4
±101,1 2206,8
±98,2 772,17
±31,01 805,97
±23,75 7 сут. 2289,8
±120,9 2198,1
±114,1 774,0
±25,5 846,6
±29,7* 14 сут. 2329,9
±182,5 2300,3
±167,5 780,4
±18,4 1671,0
±180,7* Время отдыха, у.е. 2 сут. 89,81
±5,39 91,09
±6,90 196,39
±6,08 157,08
±4,73* 7 сут. 89,8
±3,5 90,8
±3,7 190,3
±4,7 149,6
±5,6* 14 сут. 89,8
±4,0 89,8
±4,2 185,0
±6,4 120,9
±7,2*

Примечание: * - р<0,05 в сравнении с контрольной группой животных.

В связи с тем, что оптимальная концентрация S100b и NSE наблюдается во временном промежутке с 24 часов до 72 часов, кровь брали на 3-и сутки после моделирования патологии. Результаты исследования на биохимические маркёры повреждения головного мозга представлены в таблице 4.

Таблица 4

Влияние субстанции рапиталама на концентрацию биохимических маркёров повреждения головного мозга в крови крыс при коррекции ишемии головного мозга в эксперименте (M±m; n=10)

Показатели Группы Интактные Ложнооперированные Контроль Коррекция рапиталамом,
10 мг/кг S100b мкг/л 0,725±0,17 0,698±0,14 1,981±0,21 0,660±0,07* NSE нг/мл 0,364±0,10 0,301±0,08 0,541±0,11 0,252±0,04*

Примечание: * - р<0,05 в сравнении с контрольной группой животных.

Таким образом, в предлагаемом способе введение субстанции рапиталама в дозе 10 мг/кг внутрибрюшинно за 30 мин. до моделирования патологии в первый день эксперимента и после моделирования ишемии головного мозга ежедневно в течение 14 суток в лечебных целях приводит к выраженной коррекции ишемии головного мозга.

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии и неврологии, и может быть использовано для лечения ишемии головного мозга. Способ включает воспроизведение четырехсосудистой модели ишемии головного мозга путем коагуляции двух вертебральных артерий и временной окклюзии двух общих сонных артерий. При этом крысам-самцам линии Wistar внутрибрюшинно вводят субстанцию рапиталама в дозе 10 мг/кг за 30 мин до моделирования патологии в первый день эксперимента и после моделирования ишемии головного мозга ежедневно в течение 14 суток. Способ обеспечивает выраженную коррекцию ишемии головного мозга путем направленного действия рапиталама на mGluR4 рецепторы, в результате чего происходит ингибирование продукции глутамата в черной субстанции, защита от глутамат-опосредованной эксайтотоксичности и угнетение воспалительных эффектов. 4 табл., 1 пр.

Способ коррекции ишемии головного мозга субстанцией рапиталама в эксперименте, включающий воспроизведение четырехсосудистой модели ишемии головного мозга путем коагуляции двух вертебральных артерий и временной окклюзии двух общих сонных артерий и введение крысам-самцам линии Wistar фармакологического агента, отличающийся тем, что в качестве фармакологического агента используют субстанцию рапиталама в дозе 10 мг/кг, вводимую внутрибрюшинно за 30 мин до моделирования патологии в первый день эксперимента и после моделирования ишемии головного мозга ежедневно внутрибрюшинно в течение 14 суток суммарно.