СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ ИШЕМИИ СЕТЧАТКИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ Российский патент 2015 года по МПК G09B23/28 A61K31/435 A61P27/02 

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии и офтальмологии.

По известным литературным источникам ишемия сетчатки является ведущим звеном в патогенезе ряда сосудистых заболеваний глазного дна и может привести к инвалидизации (Нероев В.В. Ишемия сетчатки и оксид азота // Вестник Российской Академии медицинских наук. - 2003. №5. - С.37-40). Профилактика и коррекция ишемических заболеваний сетчатки является актуальной проблемой, которую можно решить с помощью фармакологического прекондиционирования, суть которого состоит в активации эндогенных защитных механизмов, снижающих степень повреждения при последующем длительном ишемическом эпизоде (Колесник И.М. Фармакологическое прекондиционирование эритропоэтином - новые возможности оптимизации выживаемости ишемизированных тканей // Курский научно-практический вестник “Человек и его здоровье”. - 2010. №3. - С.32-36).

Известен способ коррекции диборнолом острой ишемической ретинопатии в эксперименте (Цой Ю.Р. Влияние диборнола на морфофункциональное строение сетчатки крыс при моделировании тотальной транзиторной ишемии головного мозга // Всероссийская 69-я итоговая научная студенческая конференция, посвященная 200-летию со дня рождения Н.И. Пирогова (Томск, 11-13 мая 2010 г.): сборник статей / под ред. В.В. Новицкого, Л.М. Огородовой. - Томск: Сибирский государственный медицинский университет, 2010. - С.376-378), который характеризуется тем, что эксперименты проведены на 30 белых половозрелых крысах-самках линии Wistar массой 230-250 г. Животные были разделены на 3 группы. Крысам первой группы (n=10) воспроизводили тотальную транзиторную ишемию головного мозга (ИГМ) по методу W.A. Pulsineli. За 1 сутки до моделирования тотальной транзиторной ИГМ у наркотизированных крыс (этаминал-натрий 60 мг/кг) производили термокоагуляцию обеих вертебральных артерий на уровне первого шейного позвонка. ИГМ воспроизводили под эфирным наркозом путем пережатия общих сонных артерий в течение 30 мин. Состоятельность модели оценивали по побледнению видимой части сосудистой оболочки глаза, расширению зрачков, развитию гипервентиляции. Реперфузию проводили снятием окклюдеров, после чего рану ушивали. Крысам второй группы (n=10) вводили диборнол в дозе 100 мг/кг в 1 мл крахмальной слизи один раз в сутки в течение 7 дней. Контрольная группа (n=10) - интактные животные, содержавшиеся в идентичных с экспериментальными условиях вивариях. Материалом исследования служили сетчатки крыс, изъятые после их умерщвления.

Основным недостатком способа является то, что модель тотальной транзиторной ишемии головного мозга не является специфичной для исследования коррекции острой ишемической ретинопатии, так как помимо сетчатки ишемии подвергаются головной мозг, мягкие ткани головы, что приводит к развитию массивного постреперфузионного повреждения тканей и органов с возможностью развития краш-синдрома. Помимо этого использование данной модели не исключает наличия коллатерального кровообращения между бассейном общей сонной и подключичной артерий.

Известен способ эндотелио- и кардиопротекции фармакологическим прекондиционированием никорандилом в дозе 4 мг/кг при моделировании дефицита оксида азота, согласно описанию экспериментальных исследований в диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук на тему: «Использование фармакологического прекондиционирования никорандилом для коррекции эндотелиальной дисфункции на модели L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота (экспериментальное исследование)» Старосельцевой О.А. Опыты проводили на белых крысах-самцах линии Wistar массой 250-300 г. N-нитро-L-аргинин метиловый эфир (L-NAME) вводили ежедневно один раз в сутки внутрибрюшинно в дозе 25 мг/кг в течение 7 суток. При моделировании -NAME-индуцированного дефицита NO проводилось изучение эндотелиопротективного действия фармакологического прекондиционирования никорандилом. Никорандил вводили в дозе 4 мг/кг в виде раствора внутрижелудочно через зонд 2 раза в сутки в течение 7 дней непосредственно перед введением L-NAME.

Основным недостатком способа является то, что в модель эндотелиальной дисфункции включают только животных-самцов из-за наличия циклического гормонального фона у самок. За счет эндотелиопротекторных свойств эстрогенов нарушается чистота эксперимента при оценке эндотелиотропных свойств препаратов, в частности, никорандила.

Кроме того, в исследовании выявлены только эндотелио- и кардиопротективные свойства фармакологического прекондиционирования никорандилом.

Наиболее близким к заявленному решению является способ профилактики ишемии сетчатки в эксперименте, описанный в работе DEMIR Т. et al. Trimetazidine for prevention of induced ischemia and reperfusion of guinea pig retina. Clin http://Ophthalmol.-2010.-Feb. №2(4), 21-26, реф., включающий моделирование ишемии сетчатки с последующей реперфузией, при этом используют триметазидин для защиты от ишемии сетчатки глаза.

Недостатком способа является сложность исполнения эксперимента.

Задачей предлагаемого изобретения является создание эффективного способа профилактики ишемии сетчатки в эксперименте, включающего прекондиционирующий агент никорандил.

Поставленная задача достигается тем, что предложен способ профилактики ишемии сетчатки в эксперименте, включающий фармакологическое прекондиционирование, причем для этого используют никорандил в дозе 0,86 мг/кг массы тела, который вводят лабораторному животному однократно в виде крахмального раствора внутрижелудочно через зонд, а через 30 минут проводят моделирование ишемии сетчатки путем оказания механического давления 110 мм рт.ст. на переднюю камеру глаза в течение 30 минут.

Основными преимуществами предлагаемого способа является то, что:

- введение никорандила в дозе 0,86 мг/кг массы тела животного однократно приводит к выраженной коррекции ишемии сетчатки, так как никорандил открывает АТФ-зависимые К+-каналы и в дальнейшем индуцирует механизмы метаболической адаптации, за счет чего реализуется эффект прекондиционирования;

- воспроизводят модель ишемии сетчатки через 30 минут после введения никорандила путем оказания механического давления (110 мм рт.ст.) на переднюю камеру глаза в течение 30 минут в 1-й день эксперимента, которая является специфичной для исследования коррекции ишемических ретинопатии, так как ишемии подвергаются только ткани глаза без вовлечения мягких тканей головы и головного мозга.

Кроме того, противоишемическое действие фармакологического прекондиционирования никорандилом при моделировании ишемии сетчатки выявлено на животных обоих полов.

Регистрацию уровня микроциркуляции в сетчатке проводили через 72 часа реперфузии после моделирования ишемии сетчатки.

СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЯЕТСЯ СЛЕДУЮЩИМ ОБРАЗОМ

Опыты проведены на 40 белых лабораторных крысах обоих полов массой 180-220 г. Каждая группа включала 10 крыс. Первая группа - группа интактных животных, вторая группа - с ишемией сетчатки (контроль), третья группа - с дистантным ишемическим прекондиционированием (ДИП); четвертая группа - с фармакологическим прекондиционированием никорандилом.

Моделирование ишемии сетчатки производили путем оказания механического давления (110 мм рт.ст.) на переднюю камеру глаза в течение 30 минут в 1-й день эксперимента. Подтверждением формирования ишемии служило отсутствие глазного кровотока (побеление глаза лабораторного животного).

В третьей группе животных ДИП проводили в 1 день эксперимента 10-минутным пережатием бедренной артерии за 40 мин до моделирования ишемии сетчатки, после чего следовал 30-минутный эпизод реперфузии. ДИП проводили путем наложения жгута на проксимальную треть бедра. Контролем правильности наложения жгута служило отсутствие пульса на артерии голени.

В четвертой группе животных за 30 мин до моделирования патологии вводили никорандил в дозе 0,86 мг/кг массы тела животного (терапевтическая доза получена в результате переноса доз с человека на крысу с использованием формулы межвидового переноса и коэффициента пересчета доз для разных видов животных в зависимости от массы тела по Улановой И.П.) однократно внутрижелудочно (через зонд) в виде крахмального раствора. За 15 мин до моделирования ишемии осуществляли наркотизацию внутрибрюшинным введением раствора хлоралгидрата в дозе 300 мг/кг массы тела животного.

О выраженности противоишемического эффекта судили по уровню микроциркуляции в сетчатке крыс при помощи лазер-Доплер флоуметра Biopac-systems МР-150 и датчика игольчатого типа TSD-144 (США) на 72 час реперфузии после моделирования патологии. Для этого под наркозом животное фиксировали и производили регистрацию уровня микроциркуляции в сетчатке в десяти точках по окружности склеры.

При статистической обработке данных рассчитывается среднее значение, величина стандартного отклонения. Различия считаются достоверными при p<0,05.

ПРИМЕР КОНКРЕТНОГО ВЫПОЛНЕНИЯ

Оценку микроциркуляции проводили при помощи лазер-Доплер флоуметра Biopac-systems МР-150 и датчика TSD-144 (США). Для этого под наркозом (хлоралгидрат 300 мг/кг массы тела животного, внутрибрюшинно) животное фиксировали и производили регистрацию уровня микроциркуляции в сетчатке в десяти точках по окружности склеры с шагом 1 мм. Запись кривой уровня микроциркуляции проводили в течение 20 секунд в каждой точке. Из полученных десяти значений выводили среднее, которое вносили в протокол и принимали за уровень микроциркуляции в сетчатке у данного животного. Из 10 полученных значений выводили среднее, которое принимали за уровень микроциркуляции в сетчатке в данной группе животных.

Результаты оценки уровня микроциркуляции в сетчатке крыс на 72 час реперфузии после моделирования ишемии сетчатки и ее коррекции никорандилом в дозе 0,86 мг/кг массы тела животного представлены в таблице.

Таблица Результаты оценки уровня микроциркуляции в сетчатке крыс на 72 час реперфузии (M ±m), п.е. (перфузионные единицы) Интактные (n=10) 743,9±5,0 Ишемия сетчатки (n=10) 353,3±11,7∗ Коррекция ДИП (n=10) 638,5±15,8∗∗ Коррекция никорандилом, 0,86 мг/кг (n=10) 705,2±15,5∗∗ Примечание: ∗ - p<0,05 в сравнении с группой интактных животных; ∗∗ - p<0,05 в сравнении с группой животных с ишемией сетчатки

Уровень микроциркуляции в сетчатке интактных крыс составил 743,9±5,0 п.е. (перфузионных единиц). Уровень микроциркуляции после моделирования ишемии в группе контроля составил на 72 час реперфузии 353,3±11,7 п.е., что достоверно ниже значения в группе интактных животных (p<0,001). На фоне коррекции патологии ДИП уровень микроциркуляции в сетчатке на 72 час реперфузии достоверно возрастает до 638,5±15,8 п.е. (p<0,001) по сравнению с группой контроля. При коррекции ишемии сетчатки никорандилом уровень микроциркуляции в группе возрастает до 705,2±15,5 п.е. и достоверно отличается от значений в группе контроля (p<0,001).

Таким образом, предложенный способ является эффективным для профилактики ишемии сетчатки. Полученные результаты свидетельствуют о выраженной коррекции ишемических повреждений глаза в условиях модели ишемии сетчатки при системном введении никорандила обоеполым белым лабораторным крысам. Выявлены противоишемические эффекты фармакологического прекондиционирования никорандилом при моделировании ишемии сетчатки за счет открытия АТФ-зависимых K+-каналов и дальнейшего включения механизмов метаболической адаптации.

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии и офтальмологии, и может быть использовано для профилактики ишемических состояний сетчатки. Для этого в условиях моделирования указанной патологии проводят фармакологическое прекондиционирование. Для этого используют никорандил в дозе 0,86 мг/кг массы тела, который вводят лабораторному животному однократно в виде крахмального раствора внутрижелудочно через зонд. Через 30 минут проводят моделирование ишемии сетчатки путем оказания механического давления 110 мм рт.ст. на переднюю камеру глаза в течение 30 минут. Способ обеспечивает выраженную коррекцию ишемических повреждений глаза за счет открытия АТФ-зависимых K+-каналов и дальнейшего включения механизмов метаболической адаптации. 1 пр., 1 табл.

Способ профилактики ишемии сетчатки в эксперименте, включающий фармакологическое прекондиционирование, отличающийся тем, что для этого используют никорандил в дозе 0,86 мг/кг массы тела, который вводят лабораторному животному однократно в виде крахмального раствора внутрижелудочно через зонд, а через 30 минут проводят моделирование ишемии сетчатки путем оказания механического давления 110 мм рт.ст. на переднюю камеру глаза в течение 30 минут.