Способ децеллюризации легкого для получения внеклеточного матрикса Российский патент 2020 года по МПК G09B23/28 

Описание патента на изобретение RU2713803C1

Изобретение относится к медицине, а именно к регенеративной медицине, и может быть использовано для получения внеклеточных матриксов органов и тканей, применяемых в реконструктивной хирургии для замены или поддержания функций пораженных органов и тканей.

Внеклеточный матрикс (ВКМ), который используется в тканевой инженерии, может быть получен различными способами децеллюризации. Известные способы децеллюризации предполагают последовательную многоэтапную обработку ткани растворами детергентов и/или ферментов /1, Hoshiba, Т., Lu, Н., Kawazoe, N. and Chen, G. (2010). Decellularized matrices for tissue engineering. Expert Opinion on Biological Therapy, 10(12), pp. 1717-1728. doi: 10.1517/14712598.2010.534079/. Способы децеллюризации различаются по длительности воздействия и концентрации реагентов, а также способами их введения. Наиболее часто используют такие детергенты, как додецилсульфат натрия, Triton Х-100, дезоксихолат натрия, трипсин в смеси с этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА). Децеллюризация осуществляется по следующим схемам: используемую ткань помещают в емкость с реагентом, обеспечивая постоянное перемешивание, или осуществляют перфузию легкого реагентами через кровеносные сосуды.

Существуют различные способы децеллюризации легкого, однако, известные способы обладают рядом недостатков: из обрабатываемой ткани не удаляются все клетки, остаются их ядра или возникают механические повреждения целостности ВКМ.

Известен способ децеллюризации легких /2, см. патент RU 2547799/, заключающийся в постоянной, соответствующей физиологическим параметрам, вентиляции легких атмосферным воздухом через трахею. При этом, в течение 24 часов производится перфузия легких путем последовательного введения через легочную артерию децеллюризирующих растворов: фосфатного буфера, 1% водного раствора дезоксихолата натрия, свиной панкреатической ДНКазы I, очищенной воды с равной продолжительностью времени воздействия.

Недостатки данного метода заключаются в сложности проведения катетеризации легочной артерии у мелких лабораторных животных, а также необходимости использования химических реагентов с высокой стоимостью, таких как ДНКаза и дезоксихолат натрия, что существенно затрудняет проведение данного метода.

Прототипом является способ децеллюризации ткани легкого мыши /3, Nonaka, P., Uriarte, J., Campillo, N., Melo, E., Navajas, D., R. and Oliveira, L. (2014). Mechanical properties of mouse lungs along organ decellularization by sodium dodecyl sulfate. Respiratory Physiology & Neurobiology, 200, pp. 1-5. http://dx.doi.org/10.1016/j.resp.2014.04.008/. Данный способ состоит из отмывания комплекса легкого и трахеи от остатков крови, 4 циклов заморозки при -80°С и разморозки при комнатной тепературе, по 10 минут каждый цикл. После чего последовательно через трахею в легкие вводится 2 мл фосфатно-солевого буфера 6-8 раз, 2,5 мл деионизированной воды 6-8 раз, и 2,5 мл 1% раствора додецил сульфата натрия. Далее комплекс органов помещается на 24 часа, последовательно в 1% додецилсульфата натрия при комнатной температуре, затем в фосфатный буфер при постоянном перемешивании при комнатной температуре. После чего легкие перекладываются в чистый раствор фосфатно-солевого буфера для последующего хранения при 4°С.

Основными недостатками данного способа являются недостаточная степень удаления клеток и элементов клеток из ткани, низкая эффективность использования одного агента для децеллюризации, и высокий риск контаминации ткани, из-за длительности протокола и отказа от антибиотиков.

Техническая проблема, решаемая данным изобретением, состоит в создании способа, позволяющего максимально эффективно удалять клеточные структуры из тканей легкого, при этом сохраняя целостность общей структуры ВКМ, снижая риск его контаминации микроорганизмами.

Сущность изобретения заключается в том, что в способе децеллюризации легкого для получения внеклеточного матрикса, включающем четыре цикла заморозки при -80°С и разморозки при 37°С, по 10 минут каждый цикл, и последовательного промывания правого и левого легких через трахею растворами: 2,5 мл денонсированной воды 6-8 раз, 2 мл фосфатно-солевого буфера + пенициллин/стрептомицин 5%, 6-8 раз, и 5 мл 1% раствора додецил сульфата натрия, с последующим помещением комплекса органов на 24 часа - первые сутки, в 150 мл 1% раствора додецилсульфата натрия при постоянном перемешивании, в первые сутки образец помещается в 150 мл 1% раствора додецилсульфата натрия при 37°С, а затем - на следующие 24 часа - вторые сутки, образец помещается в 150 мл 1% раствора додецилсульфата натрия + 0,5% этилендиаминтетрауксусной кислоты, при 37°С и постоянном перемешивании, после чего - в раствор фосфатно-солевого буфера + пенициллин/стрептомицин 5% при 4°С, где образец может храниться в течение двух недель до использования.

Способ децеллюризации комплекса из двух легких осуществляется следующим образом. Приготавливают раствор №1 - 1% раствор додецилсульфата натрия на деионизированной воде, емкость помещается в термостат при 37°С до полного растворения додецилсульфата натрия. Приготавливают раствор №2 - 1% раствор додецилсульфата натрия + 0,5% ЭДТА в деионизированной воде, емкость помещается в термостат при 37°С до полного растворения веществ. Приготавливают раствор №3 - 150 мл раствора фосфатно-солевого буфера + пенициллин/стрептомицин 5%. Производится забор комплекса органов крысы, состоящего из трахеи и обоих легких. После чего комплекс подвергается четырем циклам заморозки при -80°С и разморозки при 37°С, по 10 минут каждый цикл. Далее легкие промываются путем введения фосфатно-солевого буфера + пенициллин/стрептомицин 5%. через трахею 6-8 раз по 2 мл. Следующим этапом, легкие промываются путем введения деионизированной воды по 2,5 мл 6-8 раз через трахею. После завершения промывания, в легкие, через трахею медленно вводится 5 мл 1% додецилсульфата натрия, раствор должен наполнить легкие. Далее комплекс помещается в 150 мл 1% раствор додецилсульфата натрия, на 24 ч. (первые сутки), с постоянным перемешиванием при 37°С. После обработки детергентом, легкие извлекаются и промываются путем введения 15 мл фосфатно-солевого буфера через трахею. Следующим этапом органы помещаются в 1% раствор додецилсульфата натрия + 0,5% ЭДТА, на 24 ч.(вторые сутки), при постоянном перемешивании раствора при 37°С. Завершающим этапом является помещения комплекса из легких и трахеи в фосфатно-солевой буфер + пенициллин/стрептомицин 5% и при 4°С. В данном растворе легкие могут храниться в течение двух недель перед использованием.

Изобретение было проверено путем гистологического анализа с использованием окраски гематоксилин-эозина и проведения сканирующей электронной микроскопии полученных децеллюризированных образцов. Окраска с помощью гематоксилина/эозина на световой микроскопии показывает 99,9% удаление клеток и их ядер из тканей легкого. Данные электронной микроскопии демонстрируют сохранение структуры ВКМ легкого, без признаков нарушения его целостности. Признаки бактериальной контаминации отсутствуют.

Технический результат от использования способа - получение децеллюризированного комплекса органов, не содержащего клеточных элементов и нуклеиновых кислот, состоящего из трахеи, правого и левого легкого, который в дальнейшем может использоваться для приготовления 3D биологических каркасов с последующей культивацией различных адгезионных клеточных культур.

Похожие патенты RU2713803C1

название год авторы номер документа
Способ получения биоинженерного трансплантата для пластики дефекта передней брюшной стенки 2022
  • Магомедрасулова Асият Абдулнасировна
  • Черных Александр Васильевич
  • Шевцов Артём Николаевич
RU2792542C1
СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ БИОИНЖЕНЕРНОГО КАРКАСА СЕРДЦА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ НА КРЫСЕ 2014
  • Маккиарини Паоло
  • Губарева Елена Александровна
  • Сотниченко Александр Сергеевич
  • Гилевич Ирина Валерьевна
  • Юнгеблут Филипп
RU2550286C1
СПОСОБ УСКОРЕННОЙ ДЕЦЕЛЛЮЛЯРИЗАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ТКАНИ ИЛИ ОРГАНА 2019
  • Паршин Владимир Дмитриевич
  • Люндуп Алексей Валерьевич
  • Крашенинников Михаил Евгеньевич
  • Барановский Денис Станиславович
  • Лебедев Георгий Владиславович
  • Клабуков Илья Дмитриевич
  • Балясин Максим Витальевич
  • Демченко Анна Гасымовна
  • Берсенева Дарья Артемовна
RU2714327C1
СПОСОБ ДЕЦЕЛЛЮЛЯРИЗАЦИИ ДЕРМЫ СВИНЬИ ДЛЯ РЕКОНСТРУКТИВНОЙ ПЛАСТИЧЕСКОЙ ХИРУРГИИ 2022
  • Мелконян Карина Игоревна
  • Веревкин Александр Александрович
  • Русинова Татьяна Викторовна
  • Асякина Алевтина Сергеевна
  • Козмай Яна Андреевна
RU2791987C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЦЕЛЛЮЛЯРНОГО ДЕРМАЛЬНОГО МАТРИКСА 2019
  • Гилевич Ирина Валериевна
  • Сотниченко Александр Сергеевич
  • Мелконян Карина Игоревна
  • Юцкевич Яна Андреевна
  • Богданов Сергей Борисович
  • Каракулев Антон Владимирович
  • Порханов Владимир Алексеевич
RU2717088C1
БИОРЕЗОРБИРУЕМЫЙ БИОЛОГИЧЕСКИЙ МАТРИКС ДЛЯ ЗАМЕЩЕНИЯ ДЕФЕКТОВ КОСТНОЙ ТКАНИ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ 2017
  • Веремеев Алексей Владимирович
  • Кутихин Антон Геннадиевич
  • Нестеренко Владимир Георгиевич
  • Болгарин Роман Николаевич
RU2665962C1
УДАЛЕНИЕ И ВОССТАНОВЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ КЛЕТОК В ОРГАНАХ И ТКАНЯХ 2012
  • Отт Харальд
  • Тэйлор Дорис
RU2635478C9
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕСКЛЕТОЧНОГО МАТРИКСА АМНИОТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ ДЛЯ ПОСЛЕДУЮЩЕЙ РЕКОНСТРУКЦИИ ДЕФЕКТОВ ТКАНЕЙ 2020
  • Самойлов Александр Сергеевич
  • Астрелина Татьяна Алексеевна
  • Брумберг Валентин Андреевич
  • Брунчуков Виталий Андреевич
  • Кобзева Ирина Владимировна
  • Маливанова Татьяна Федоровна
  • Осташкин Александр Станиславович
RU2751353C1
Способ получения тканеспецифического матрикса для тканевой инженерии хряща 2019
  • Севастьянов Виктор Иванович
  • Басок Юлия Борисовна
  • Немец Евгений Абрамович
  • Кирсанова Людмила Анфилофьевна
  • Кириллова Александра Дмитриевна
  • Готье Сергей Владимирович
RU2716577C1
СПОСОБ ДЕЦЕЛЛЮЛЯРИЗАЦИИ КРОВЕНОСНЫХ СОСУДОВ МАЛОГО КАЛИБРА 2012
  • Насрединов Артем Сергеевич
RU2504334C1

Реферат патента 2020 года Способ децеллюризации легкого для получения внеклеточного матрикса

Изобретение относится к медицине, а именно к регенеративной медицине, и может быть использовано для получения внеклеточных матриксов органов и тканей, применяемых в реконструктивной хирургии для замены или поддержания функций пораженных органов и тканей. Способ децеллюризации легкого крысы для получения внеклеточного матрикса (ВКМ) включает четыре цикла заморозки при -80°С и последовательное промывание правого и левого легких через трахею 2,5 мл деионизированной воды 6-8 раз, 2 мл фосфатно-солевого буфера с 5% раствором пенициллина и стрептомицина, 6-8 раз и 5 мл 1% раствора додецилсульфата натрия. Разморозку проводят при 37°С. Затем на вторые сутки образец помещается в 150 мл 1% раствора додецилсульфата натрия с 0,5% этилендиаминтетрауксусной кислотой, при 37°С и постоянном перемешивании, после чего в раствор фосфатно-солевого буфера с 5% раствором пенициллина и стрептомицина при 4°С, где образец хранится в течение двух недель до использования. Способ обеспечивает максимально эффективное удаление клеточных структур из тканей легкого, при этом сохраняя целостность общей структуры ВКМ, снижая риск его контаминации микроорганизмами за счет промывания и использования растворов антибиотиков.

Формула изобретения RU 2 713 803 C1

Способ децеллюризации легкого для получения внеклеточного матрикса, включающий четыре цикла заморозки при -80°С и разморозки при 37°С, по 10 минут каждый цикл и последовательного промывания правого и левого легких через трахею растворами: 2,5 мл деионизированной воды 6-8 раз, 2 мл фосфатно-солевого буфера + пенициллин/стрептомицин 5%, 6-8 раз и 5 мл 1% раствора додецил сульфата натрия, с последующим помещением комплекса органов на 24 часа - первые сутки, в 150 мл 1% раствора додецилсульфата натрия при постоянном перемешивании, отличающийся тем, что в первые сутки образец помещается в 150 мл 1% раствора додецилсульфата натрия при 37°С, а затем - на следующие 24 часа - вторые сутки, образец помещается в 150 мл 1% раствора додецилсульфата натрия + 0,5% этилендиаминтетрауксусной кислоты, при 37°С и постоянном перемешивании, после чего - в раствор фосфатно-солевого буфера + пенициллин/стрептомицин 5% при 4°С, где образец может храниться в течение двух недель до использования.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2020 года RU2713803C1

Nonaka P/ et all., Mechanical properties of mouse lungs along organ decellularization by sodium dodecyl sulfate
Respiratory Physiology & Neurobiology, 200, pp
Печь для непрерывного получения сернистого натрия 1921
  • Настюков А.М.
  • Настюков К.И.
SU1A1
Печь-кухня, могущая работать, как самостоятельно, так и в комбинации с разного рода нагревательными приборами 1921
  • Богач В.И.
SU10A1
СПОСОБ СОЗДАНИЯ БИОИНЖЕНЕРНОГО КАРКАСА ЛЕГКОГО КРЫСЫ 2013
  • Маккиарини Паоло
  • Губарева Елена Александровна
  • Куевда Елена Вячеславовна
  • Гилевич Ирина Валерьевна
  • Юнгеблут Филипп
RU2547799C1
СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ БИОИНЖЕНЕРНОГО КАРКАСА СЕРДЦА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ НА КРЫСЕ 2014
  • Маккиарини Паоло
  • Губарева Елена Александровна
  • Сотниченко Александр Сергеевич
  • Гилевич Ирина Валерьевна
  • Юнгеблут Филипп
RU2550286C1
СПОСОБ ДЕЦЕЛЛЮЛЯРИЗАЦИИ КРОВЕНОСНЫХ СОСУДОВ МАЛОГО КАЛИБРА 2012
  • Насрединов Артем Сергеевич
RU2504334C1
СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ДЕРМАЛЬНОГО МАТРИКСА 2013
  • Хубутия Могели Шалвович
  • Андреев Юлий Вадимович
  • Боровкова Наталья Валерьевна
  • Хватов Валерий Борисович
  • Миронов Александр Сергеевич
  • Жиркова Елена Александровна
  • Пономарев Иван Николаевич
  • Волков Константин Сергеевич
  • Шугай Светлана Викторовна
  • Конюшко Ольга Ивановна
  • Макаров Максим Сергеевич
RU2524619C2
БИОРЕЗОРБИРУЕМЫЙ БИОЛОГИЧЕСКИЙ МАТРИКС ДЛЯ ЗАМЕЩЕНИЯ ДЕФЕКТОВ КОСТНОЙ ТКАНИ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ 2017
  • Веремеев Алексей Владимирович
  • Кутихин Антон Геннадиевич
  • Нестеренко Владимир Георгиевич
  • Болгарин Роман Николаевич
RU2665962C1

RU 2 713 803 C1

Авторы

Яценко Антон Андреевич

Кушнарев Владимир Андреевич

Устинов Егор Михайлович

Леонов Денис Викторович

Даты

2020-02-07Публикация

2019-01-10Подача