ТРЕХМЕРНЫЙ ПОРИСТЫЙ КОМПОЗИТНЫЙ МАТЕРИАЛ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2020 года по МПК A61K31/722 A61L27/20 A61L27/22 A61L27/40 A61L27/46 A61L27/56 A61P19/00 

Предлагаемая группа изобретений относится к химии высокомолекулярных соединений, касается трехмерного пористого композиционного материала и способа его получения, который может быть использован как в качестве компонента костных скаффолдов, так и в качестве каркаса для регенерации ткани in vitro и/или in vivo, в качестве каркасов для регенерации тканей, замещения дефектов костной ткани, гемостатических материалов, раневых покрытий, матриц для тканевой инженерии или в других применениях. Кроме того, предлагаемый материал может быть тромбогенными и может использоваться для контроля кровотечения на участках имплантатов.

В области биоматериалов (компонентов костных скаффолдов, каркасов для регенерации тканей, гемостатических материалов, раневых покрытий, матриц для тканевой инженерии) находят широкое применение пористые трехмерные структуры на основе биосовместимых полимеров.

Поликатионный полисахарид хитозан, продукт деацетилирования хитина, представляет собой биосовместимый и биоразлагаемый полимер. Хитозан может использоваться в различных формах, таких как пленки, гидрогели, трехмерные пористые структуры, нановолокна, но для формирования данных структур хитозан предварительно растворяют в водном растворе кислоты, в результате чего, хитозан переходит в солевую форму.

Известно несколько способов получения трехмерной пористой структуры биосовместимого полимера.

Например, известны трехмерные пористые полисахаридные матрицы, способные индуцировать минерализацию ткани в костном участке, а также в не костном участке, в отсутствие стволовых клеток или факторов роста (US 20130224277 А1, кл. A61L 27/46, A61L 27/56, опубл. 29.08.3013 г.). Способ получения пористого полисахаридного каркаса включает приготовление щелочного водного раствора, содержащего, по меньшей мере, один полисахарид, сшивающий агент и порогенный агент, превращение раствора в гидрогель путем помещения указанного раствора при температуре от около 4°С до около 80°С в течение времени, достаточного для поперечной сшивки указанного количества полисахарида, погружение указанного гидрогеля в растворитель, предпочтительно водный раствор, и промывание пористого полученного полисахаридного каркаса, щелочной водный раствор дополнительно содержит гидроксиапатит, предпочтительно наногидроксиапатит. Полисахарид выбирают из группы, включающей декстран, пуллулан, агар, альгиновая кислота, крахмал, гиалуроновая кислота, инулин, гепарин, фукоидан, хитозан и их смеси.

Недостатками известного изобретения является то, что используемые в качестве сшивающих агентов вещества не являются биосовместимыми, а также малая доступность используемых компонентов.

Также, известен пористый каркас для тканевой инженерии и способ его получения (WO 2013103183 А1, кл. A61L 27/56, A61L 27/20, A61L 27/22, A61L 27/40, опубл. 11.07.2013 г.), который является биосовместимым и биоразлагаемым, может быть использован для трансплантации, для аутологичной замены кости. Пористый каркас для тканевой инженерии содержит хитозан/гидроксиапатит-амилопектин (хитозан/Нар-АР), имеет связанную пористую структуру из-за поперечных связей, образованных между хитозаном, гидроксиапатитом и амилопектином. Соответственно, клеточная пролиферация и размножение клеток очень высоки. Также, обеспечивается превосходная термостойкость, механическая прочность и биосовместимость. При этом молекулярная масса хитозана составляет 200 ~ 350 кДа, степень деацетилирования составляет от 85 до 95%, пористость строительных скаффолдов составляет от 85 до 95%, размер пор каркаса составляет 60 ~ 500 мкм. Изготовление каркасов для инженерии пористой ткани с использованием способа сушки вымораживанием осуществляют следующим образом. Растворяют хитозан в растворе уксусной кислоты, добавляют гидроксида апатита к раствору хитозана, добавляют к раствору амилопектина. Проводят лиофилизацию в течение 24-48 часов. Дополнительно проводят ультразвуковую обработку в течение 0,5-2 часов и погружение в основной раствор до нейтрального значения рН.

Недостатком указанного материала является высокая скорость биодеградации одного из компонентов (амилопектина). Получение указанного материала является длительным и энергозатратным.

Известны биомиметические каркасы хитозана и способ модуляции их внутренних свойств, таких как жесткость, эластичность, устойчивость к механическим воздействиям, пористость, биодеградация и абсорбция экссудатов (WO 2011151225 А1, кл. A61L 15/28, A61L 15/42, опубл. 08.12.2011 г.). Слоистый каркас из хитозана, содержит, по меньшей мере, два сплавленных слоя, причем, по меньшей мере, один из сплавленных слоев содержит мембрану из нановолокна хитозана, а другой сплавленный слой содержит пористый поддерживающий слой хитозана. При этом мембрана из нановолокна хитозана электрораспределяется на пористом поддерживающем слое. Слоистый каркас из хитозана характеризуется хорошей адгезией между пористым и нановолоконным слоями, настраиваемой пористостью слоя нановолокон путем настройки расстояния между нановолокнами, стабильные нановолокна и пористая морфология даже при погружении в воду или другие растворители. Слоистые каркасы с электроформованным хитозаном могут быть использованы в качестве повязки на рану, в тканевой инженерии или для биомедицинских применений.

Однако, стоит отметить сложность технологии получения каркаса, требующей сочетания процессов сушки, вымораживания, смачивания и электроспиннинга. Кроме того, состав каркаса обеспечивается только хитозаном (и для улучшения способности полисахарида к электропрядению в состав может быть введен полиэтиленоксид), что ограничивает возможности материала в биоактивности, увеличении прочности (поскольку хитозан известен своими низкими физико-химическими свойствами).

В задачу группы изобретений положено создание трехмерного пористого композитного материала на основе хитозана, который можно заселять клетками фибробластов для использования в качестве компонентов костных скаффолдов, в качестве каркасов для регенерации тканей, замещения дефектов костной ткани, гемостатических материалов, раневых покрытий, матриц для тканевой инженерии.

Техническим результатом от использования группы изобретений является повышение остеокондуктивности, пористости, прочности, биоразлагаемости, а также упрощение изготовления.

Поставленная задача достигается тем, что трехмерный пористый композитный материал содержит композиционный каркас, имеющий в качестве полимерной матрицы соль хитозана, такую как лактат хитозана, или хлорид хитозана, или ацетат хитозана, и парный полимер, в качестве которого используется коллаген, или хондроитин сульфат, или хитин, при следующем соотношении компонентов, масс. %: соль хитозана - 50-33,3; парный полимер - 50-66,7; дополнительно содержит гентамицин в концентрации 0,5-1 мас. %.

Поставленная задача достигается также тем, что способ получения трехмерного пористого композиционного материала включает растворение хитозана в водном растворе кислоты, в качестве которой используют или уксусную, или соляную, или молочную кислоту, добавление парного полимера, в качестве которого используют или коллаген, или хондроитин сульфат, или хитин, после получения однородной системы, при перемешивании добавляют вспениватель, в качестве которого используют или гидрокарбонат натрия, или гидрокарбонат калия, или гидрокарбонат аммония, проводят промывку образца до нейтрального рН и сушат до постоянной массы при температуре 15-65°С, при этом компоненты используют при следующее соотношение, масс. %: хитозан - 1-5, парный полимер - 1-6, кислота - 0,5-6, вспениватель - 1,5-4,5, вода - остальное; используют хитозан со степенью деацетилирования 55- 85% и молекулярной массой 13000-1000000; дополнительно добавляют гентамицин в концентрации 0,5-1 мас. %.

На фиг. 1 представлена фотография поверхности пленки хитозана модифицированного хондроитинсульфатом после 24 часов инкубации фибробластов.

На фиг. 2 представлена фотография поверхности пленки хитозана модифицированного хитином после 24 часов инкубации фибробластов.

На фиг. 3 представлена фотография поверхности пленки хитозана модифицированного коллагеном после 24 часов инкубации фибробластов.

На фиг. 4 представлена фотография поверхности пленки немодифицированного хитозана после 24 часов инкубации фибробластов.

На фиг. 5 представлена микрофотография образца на основе хитозана, модифицированном коллагеном.

На фиг. 6 представлена микрофотография образца на основе хитозана модифицированного хитином.

Трехмерный пористый композитный материал содержит соль хитозана, например, лактат, или хлорид, или ацетат (соли, соответственно, молочной, соляной и уксусной кислоты) и парный полимер, в качестве которого используется или коллаген, или хондроитин сульфат, или хитин, при следующем соотношении, мас. %: соль хитозана - 50-33,3, парный полимер - 50-66,7.

В предлагаемом изобретении основной матрицей при образовании данного пористого материала является хитозан. Хитозан представляет собой линейный аминополисахарид, имеющий повторяющиеся звенья β-D-глюкозамина (2-амино-2-дезокси-β-D-глюкана), которые связаны друг с другом через (1 → 4) связь. Помимо хитозана могут быть использованы его производные, полученные модификацией хитозана, которые, также, могут быть использованы в дополнение к хитозану, способному растворяться в разбавленном водном кислотном растворе. Производные хитозана могут включать водорастворимый хитозан, полученный путем равномерного деацетилирования хитина и способный растворяться в деионизированной воде, производное N-ацилхитозана, полученное путем N-ацилирования, и производное N-карбоксиалкилхитозана. Хитозан, используемый в настоящем изобретении, может иметь степень деацетилирования 55-85% и молекулярную массу 13000-1000000.

Кроме хитозана в состав пористого материала включен парный полимер, например, коллаген, или хитин, или хондроитин сульфат, поскольку данные высокомолекулярные соединения обладают биологической активностью. Коллаген и хондроитин сульфат участвуют в образовании соединительной ткани организма. Добавление хондроитинсульфата в состав композиции способствует усилению остеокондуктивности при использовании в реконструкции поврежденных тканей (фиг. 1). Добавление коллагена в состав композиции обеспечивав повышение эластичности и усиление остеокондуктивности (фиг. 2). Добавление хитина в состав композиции используется для повышения прочности и усиления остеокондуктивности (фиг. 3, табл. 1).

Предлагаемый трехмерный пористый композитный материал с помощью предлагаемого способа получают следующим образом.

Растворяют хитозан в водном растворе кислоты, например, уксусной, или соляной, или молочной. К полученному раствору добавляют парный полимер, например, коллаген, или хондроитин сульфат, или хитин. После получения однородной системы, при перемешивании добавляют вспениватель, например, гидрокарбонат натрия, или гидрокарбонат калия, или гидрокарбонат аммония. Затем проводят промывку образца до нейтрального рН и сушат до постоянной массы при температуре 15-65°С. Получение материала осуществляют при следующем соотношении компонентов, масс. %:

хитозан 1-5,

парный полимер - 1-6,

кислота - 0,3-6,

вспениватель - 1,5-4,5,

вода - остальное.

Для придания бактерицидного эффекта в композицию могут вводить, например, гентамицин в концентрации 0,5-1 мас. %.

Полученный материал характеризуется:

- наличием открытой пористости более 90% объема и высокой пористостью материала с диаметром пор 40-350 мкм для обеспечения пролиферации клеток,

- высокими механическими свойствами - предел прочности пористого каркаса 25-30 Мпа;

- хорошей остеодуктивностью;

- биоразлагаемостью.

Микроразмерные поры обеспечивают миграцию клеток, формирование сосудов и диффузию питательных веществ и кислорода, обеспечивая остеокондуктивность, повышенную адгезию клеток фибробластов к поверхности композитного материала, способность к регенерации при имплантации материала.

На фиг. 1-3 (по сравнению с фиг. 4) видно, что при культивировании фибробластов человека клеточной линии hTERT BJ-5ta на поверхности предлагаемого материала после 24 часов инкубации наблюдается их равномерное распределение на поверхности, рост и деление, что указывает на высокую степень их адгезии к материалу, а также на остеокондуктивность трехмерного пористого композитного материала.

На фиг. 1-6 видно, что полученные образцы обладают пористостью с диаметром пор от 40 до 300 мкм. Пористая структура, также, является открытой, а такой размер пор обеспечивает рост фибробластов с последующим заполнением пор клетками организма (рост фибробластов представлен на фиг. 1-4). Это позволяет использовать данный трехмерный пористый композитный материал для регенерации тканей, компонентов костных скаффолдов, замещения дефектов костной ткани, гемостатических материалов, раневых покрытий, матриц для тканевой инженерии.

В табл. 1 представлены физико-механические свойства пленок трехмерного композитного материала на основе хитозана, а также хитозана, модифицированного хитином. Как видно из таблицы 1, добавление хитина приводит к увеличению прочности, с соответствующим уменьшением эластичности.

Исследование биоразлагаемости было проведено на белых нелинейных крысах-самках трехмесячного возраста массой 150-200 г. Полученные образцы были имплантированы экспериментальным животным в межлопаточную область спины. Все процедуры на лабораторных животных осуществлялись в соответствии с требованиями Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 18 марта 1986); Правил лабораторной практики в Российской Федерации (приказ МЗ РФ №267 от 19.06.2003). Биоразлагаемость материала оценивали по изменению массы имплантируемых образцов. Масса образцов изменялась с 5.01±0.7 при имплантации до 2.2±0.5 за три недели. При этом в ходе эксперимента у животных не наблюдалось отторжения имплантированного материала, показатели биохимии крови свидетельствовали об отсутствии воспалительной реакции или стресса, что свидетельствует о высокой способности трехмерного пористого композитного материала к биоразлагаемости.

Примеры, подтверждающие осуществление предлагаемой группы изобретений представлены в таблице 2.

Трехмерный пористый композитный материал может быть загружен биологически активными добавками, такими как антибиотики, лекарственные средства или другие полезные добавки. Например, в случае, когда материал включает в себя антибиотик (например, гентамицин), тем самым ингибируется развитие инфекции. Все варианты осуществления трехмерного пористого композитного материала, содержащие в своем составе гентамицин обладают бактерицидными свойствами и могут ингибировать рост микроорганизмов в месте имплантации и рядом с ним. Для подтверждения данных выводов полученные образцы материала подвергли бактериологическим испытаниям. В качестве тест культур использовали следующие виды бактерий: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus. Для оценки бактерицидной активности исследуемые образцы помещали в чашки Петри на поверхности агаризованной питательной среды. В питательную среду вводили тест-культуры бактерий. О наличии бактерицидной активности судили по зоне ингибирования роста тест-культур бактерий, которая образуется вокруг исследуемых композиций (таблица 3). Образец считается бактерицидным с зоной ингибирования больше 8 мм.

Группа изобретений относится к химии высокомолекулярных соединений и касается трехмерного пористого композиционного материала и способа его получения. Трехмерный пористый композитный материал характеризуется тем, что содержит композиционный каркас, имеющий в качестве полимерной матрицы соль хитозана, и парный полимер, выбранный из коллагена, или хондроитин сульфата, или хитина. Способ получения трехмерного пористого композиционного материала характеризуется тем, что растворяют хитозан в водном растворе кислоты, добавляют коллаген, или хондроитин сульфат, или хитин. После получения однородной системы при перемешивании добавляют вспениватель, в качестве которого используют или гидрокарбонат натрия, или гидрокарбонат калия, или гидрокарбонат аммония, проводят промывку образца до нейтрального рН и сушат. Группа изобретений позволяет повышать остеокондуктивность, пористость, прочность, биоразлагаемость композиционного материала. Композиционный материал может быть использован в качестве компонентов костных скаффолдов, каркаса для регенерации ткани in vitro и/или in vivo, каркасов для регенерации тканей, замещения дефектов костной ткани, гемостатических материалов, раневых покрытий, матриц для тканевой инженерии. 2 н. и 3 з.п. ф-лы., 3 табл., 6 ил.

1. Трехмерный пористый композитный материал содержит композиционный каркас, имеющий в качестве полимерной матрицы соль хитозана, такую как лактат хитозана, или хлорид хитозана, или ацетат хитозана, и парный полимер, в качестве которого используется коллаген, или хондроитин сульфат, или хитин, при следующем соотношении компонентов, масс. %:

соль хитозана - 50-33,3;

парный полимер - 50-66,7.

2. Материал по п. 1, отличающийся тем, что дополнительно содержит гентамицин в концентрации 0,5-1 мас. %.

3. Способ получения трехмерного пористого композиционного материала включает растворение хитозана в водном растворе кислоты, в качестве которой используют или уксусную, или соляную, или молочную кислоту, добавление парного полимера, в качестве которого используют или коллаген, или хондроитин сульфат, или хитин, после получения однородной системы при перемешивании добавляют вспениватель, в качестве которого используют или гидрокарбонат натрия, или гидрокарбонат калия, или гидрокарбонат аммония, проводят промывку образца до нейтрального рН и сушат до постоянной массы при температуре 15-65°С, при этом компоненты используют при следующем соотношение, масс. %:

хитозан - 1-5,

парный полимер - 1-6,

кислота - 0,5-6,

вспениватель - 1,5-4,5,

вода - остальное.

4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что используют хитозан со степенью деацетилирования 55-85% и молекулярной массой 13000-1000000.

5. Способ по п. 3, отличающийся тем, что дополнительно добавляют гентамицин в концентрации 0,5-1 мас. %.