КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ ДУБИЛЬНЫЕ КИСЛОТЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2020 года по МПК A61K35/64 C07H13/08 C07H1/08 A61P3/04 A61P3/06 A61P3/10 A61P25/00 A61P25/04 A61P25/18 A61P25/22 A61P25/24 A61P25/28 

Родственная заявка

В настоящей заявке PCT испрашивается приоритет предварительной заявки США No. 62/313946, поданной 28 марта, 2016, и предварительной заявки США No. 62/458216, поданной 13 февраля, 2017, содержание которых во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Предпосылки создания изобретения

Таннины представляют собой группу природных соединений, присутствующих в различных растениях, например, Rhus chinensis, Rhus javanica, Rhus semialata, Rhus coriaria, Rhus potaninii, Rhus punjabensis var. sinica (Diels) Rehder & E.H. Wilson, Camellia sinensis, Berry, Bixa orellana, Vitis vinifera, Punica granatum, Quercus infectoria, Quercus cerris, Acacia mearnsii, Pseudotsuga menziesii, Caesalpinia spinosa, Fagus hayata Palib. ex Hayata или Machilus thunbergii Sieb. & Zucc. и т.п. Существует три основных класса таннинов, включая гидролизуемые таннины (также известные как дубильные кислоты), конденсированные таннины и флоротаннины, содержащие галловую кислоту, флавон и флороглюцинол, соответственно, как основные компоненты. Таннины широко применяются в качестве одного из типов промышленного клея для склеивания ДСП и для производства антикоррозийной грунтовки или смол. Было также высказано предположение, что таннины могут оказывать различное влияние на здоровье человека.

D-аминокислота-оксидаза (DAAO) представляет собой пероксисомный фермент, который окисляет D-аминокислоты до соответствующих иминокислот. Сообщалось, что DAAO участвует в метаболизме D-аминокислот головного мозга, включая D-серин, и в регуляции глутаматергической нейротрансмиссии. Таким образом, DAAO является мишенью при лечении расстройств центральной нервной системы (ЦНС), которые ассоциируются с D-серином и/или глутаматергической нейротрансмиссией.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение основано на обнаружении того факта, что дубильные кислоты, а в частности, дубильные кислоты, имеющие более, чем три галлоильных группы, эффективно ингибируют активность DAAO. Таким образом, композиции, содержащие такие дубильные кислоты, являются эффективными для лечения заболеваний и расстройств, ассоциированных с DAAO и/или с глутаматергической нейротрансмиссией, таких как ожирение, диабет, гиперлипидемия и расстройства ЦНС.

В соответствии с этим, в одном из своих аспектов, настоящее изобретение относится к композиции (например, к фармацевтической композиции, к продукту для здорового питания или к продукту для лечебного питания), которая включает: (i) смесь дубильных кислот или их фармацевтически приемлемой соли и (ii) носитель, где указанная композиция, в основном, не содержит дубильных кислот, имеющих менее, чем четыре галлоильных группы. В некоторых примерах, смесь дубильных кислот в композиции содержит дубильные кислоты, имеющие 4-10 галлоильных групп (например, 5-10 галлоильных групп, 5-12 галлоильных групп или 8-12 галлоильных групп). В некоторых примерах, смесь дубильных кислот составляет по меньшей мере 95% по массе всех дубильных кислот, содержащихся в композиции. В некоторых примерах, описанными здесь дубильными кислотами являются дубильные кислоты, присутствующие только в композиции.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанная здесь композиция может содержать не более, чем 20% (например, <15%, <10% или <5%) дубильных кислот, 1-5 галлоильных групп. Альтернативно или дополнительно, композиция может содержать по меньшей мере 50% (например, >60%, >70% или >80%) дубильных кислот, имеющих 6-12 галлоильных групп (например, 8-12 галлоильных групп).

В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанная здесь дубильная кислота происходит по меньшей мере от растительного источника, включая, но не ограничиваясь ими, Rhus chinensis, Rhus javanica, Rhus semialata, Rhus coriaria, Rhus potaninii, Rhus punjabensis var. sinica (Diels) Rehder & E.H. Wilson, Camellia sinensis, Berry, Bixa orellana, Vitis vinifera, Punica granatum, Quercus infectoria, Quercus cerris, Acacia mearnsii, Pseudotsuga menziesii, Caesalpinia spinosa, Fagus hayata Palib. ex Hayata или Machilus thunbergii Sieb. & Zucc.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанная здесь дубильная кислота происходит по меньшей мере от растительного источника, который может представлять собой Rhus chinensis, Rhus javanica, Rhus semialata, Rhus coriaria, Rhus potaninii, Rhus punjabensis var. sinica (Diels) Rehder & E.H. Wilson.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанная здесь дубильная кислота происходит по меньшей мере от растительного источника, требующего присутствия гнездящихся насекомых, включая, но не ограничиваясь ими, Andricus kollari, Andricus fecundatrix, Andricus quercuscalicis, Andricus quercuscalicis, Biorhiza pallida, Neuroterus quercusbaccarum, Neuroterus albipes, Neuroterus numismalis, Cynips quercusfolii, Melaphis chinensis (Bell), Melaphis peitan Tsai et Tang, Nurudea sinica Tsai et Tang, Nurudea shiraii matsumura, Nurudea rosea Matsumura, Meitanaphis elongallis Tsai et Tang, Macrorhinarium ensigallis Tsai et Tang, Macrorhinarium ovagallis Tsai et Tang, Floraphis meitanensis Tsai et Tang, Meitanaphis flavogallis Tang, Kaburagia rhusicola Takagi, Kaburagia ovatihuicola Xiang, Kaburagia ensigallis Tsai et Tang, Kaburagia ovogallis, Kaburagia thusicola Takagi, Meitanaphis microgallis Xiang или Floraphis choui Xiang.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанная здесь дубильная кислота происходит по меньшей мере от растительного источника, требующего присутствия гнездящихся насекомых, включая, но не ограничиваясь ими, Melaphis chinensis (Bell), Melaphis peitan Tsai et Tang, Nurudea sinica Tsai et Tang, Nurudea shiraii matsumura, Nurudea rosea Matsumura, Meitanaphis elongallis Tsai et Tang, Macrorhinarium ensigallis Tsai et Tang, Macrorhinarium ovagallis Tsai et Tang, Floraphis meitanensis Tsai et Tang, Meitanaphis flavogallis Tang, Kaburagia rhusicola Takagi, Kaburagia ovatihuicola Xiang, Kaburagia ensigallis Tsai et Tang, Kaburagia ovogallis, Kaburagia thusicola Takagi, Meitanaphis microgallis Xiang, или Floraphis choui Xiang.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанная дубильная кислота происходит от чернильных орешков, выбранных из китайских чернильных орешков, имеющих колоколообразную форму, роговидных чернильных орешков, жестких мечевидных чернильных орешков, мечевидных яйцеобразных чернильных орешков и чернильных орешков в виде соцветий, находящихся по меньшей мере на растительном источнике, требующем присутствия гнездящихся насекомых.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к композиции, включающей (i) дубильную кислоту или ее приемлемую соль и (ii) носитель, где дубильная кислота содержит 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 галлоильных групп. Дубильная кислота может составлять по меньшей мере 90% (масс/масс) от всех дубильных кислот, содержащихся в композиции. В некоторых примерах, дубильная кислота составляет по меньшей мере 95% по массе всех дубильных кислот, содержащихся в композиции.

Настоящее изобретение также относится к способам получения описанной здесь композиции дубильных кислот. Такой способ может включать: (i) получение чернильных орешков из растения (например, из любых растительных источников, описанных в настоящей заявке); (ii) измельчение чернильных орешков с получением чернильных орешков в форме порошка; (iii) экстракцию порошка чернильных орешков первым растворителем с получением первого экстракта дубильной кислоты и (iv) контактирование экстракта дубильной кислоты с углем, CaSO₄, MgSO₄ или с их комбинациями для удаления веществ, абсорбируемых на угле или осаждаемых CaSO₄ или MgSO₄, с получением первой композиции дубильной кислоты. Этот способ может также включать, но необязательно, (v) растворение первой композиции дубильной кислоты во втором растворителе с образованием раствора, (vi) добавление метиленхлорида (CH₂Cl₂) или дихлорэтана к раствору, и (vii) сбор полученных таким образом твердых веществ с получением второй композиции дубильной кислоты. Примерами первого растворителя, используемого в стадии (iii), являются, но не ограничиваются ими, ацетон, метилэтилкетон, этилацетат, этанол, изопропанол, тетрагидрофуран, 1,4-диоксан, гексан или их комбинации. Примерами второго растворителя, используемого в стадии (v), являются, но не ограничиваются ими, ацетон, ацетонитрил, этилацетат, метилэтилкетон или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления изобретения, любой из описанных здесь способов получения может дополнительно включать стадию удаления дубильных кислот, имеющих 2-5 галлоильных групп, с получением обогащенного экстракта дубильной кислоты. Стадия удаления может быть осуществлена путем смешивания первого экстракта дубильной кислоты с растворителем, который может представлять собой комбинацию (i) любого из растворителей, таких как ацетон, ацетонитрил, метилэтилкетон или этилацетат, и (ii) любого из растворителей, таких как пентан, гексан или гептан, с образованием двух органических слоев и сбора масляного слоя с получением обогащенного экстракта дубильной кислоты. В некоторых случаях, растворитель содержит метилэтилкетон/гексан или этилацетат/гексан. В некоторых примерах, стадия удаления может быть осуществлена после стадии (iii) и до стадии (iv).

В некоторых вариантах осуществления изобретения, любой из описанных здесь способов получения может дополнительно включать, перед стадией (iii) и после стадии (ii), пропускание порошка чернильных орешков через сито размером 20-60 меш.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, любой из описанных здесь композиций является фармацевтическая композиция, содержащая фармацевтически приемлемый носитель. Такая фармацевтическая композиция может дополнительно содержать второе терапевтическое средство.

В некоторых примерах, второе терапевтическое средство представляет собой средство против ожирения, которое включает, но не ограничивается ими, орлистат, лоркасерин, сибутрамин, римонабант, метформин, эксенатид, пралинтид, фентермин, фенфлурамин, топирамат дексфенфлурамина, динитрофенол, бупропион и зонизамид.

В других примерах, второе терапевтическое средство представляет собой средство для лечения расстройства центральной нервной системы (ЦНС). Таким средством может быть антидепрессант, антипсихотическое средство, психостимулятор, стабилизатор настроения, анксиолитическое средство, средство для лечения гиперактивности, ассоциированной с дефицитом внимания (ADHD), или средство для лечения болезни Альцгеймера (БА).

Примерами антипсихотических лекарственных средств являются, но не ограничиваются ими, бутирофенон, фенотиазин, флуфеназин, перфеназин, прохлорперазин, тиоридазин, трифлуоперазин, мезоридазин, промазин, трифлупромазин, левомепромазин, прометазин, тиоксантен, хлорпротиксен, флупентиксол, тиотиксен, зуклопентиксол, клозапин, оланзапин, рисперидон, кветиапин, зипразидон, амисульприд, азенапин, палиперидон, арипипразол, ламотригин, мемантин, каннабидиол, LY2140023, дроперидол, пимозид, бутаперазин, карфеназин, ремоксиприд, пиперацетазин, сульпирид, акампросат и тетрабеназин.

Антидепрессантами могут быть ингибиторы моноаминоксидазы (MAOI), трициклические антидепрессанты (TCA), тетрациклические антидепрессанты (TeCA), селективные ингибиторы повторного поглощения серотонина (SSRI), норадренергические и специфические серотонергические антидепрессанты (NASSA), ингибиторы повторного поглощения норэпинефрина (норадреналина), ингибиторы повторного поглощения норэпинефрина-допамина или ингибиторы повторного поглощения серотонина-норэпинефрина (SNRI). Примерами являются, но не ограничиваются ими, флуоксетин, пароксетин, эсциталопрам, циталопрам, сертралин, флувоксамин, венлафаксин, милнаципран, дулоксетин, миртазапин, миансерин, ребоксетин, бупропион, амитриптилин, нортриптилин, протриптилин, дезипрамин, тримипрамин, амоксапин, бупропион, кломипрамин, дезипрамин, доксепин, изокарбоксазид, транилципромин, тразодон, нефазодон, фенелзин, ламатрогин, литий, топирамат, габапентин, карбамазепин, оксакарбазепин, валпроат, мапротилин, брофаромин, гепирон, моклобемид, изониазид и ипрониазид.

Любая из описанных здесь фармацевтических композиций может быть приготовлена для перорального введения или для парентерального введения.

В других вариантах осуществления изобретения, композиция представляет собой продукт для здорового питания (например, натуральная композиция) или продукт для лечебного питания, которые могут содержать пищевой носитель. Такие композиции могут быть приготовлены в виде таблетки, капсулы, мягкой жевательной резинки или геля.

В еще одном своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания или расстройства, ассоциированного с DAAO, где указанный способ включает введение индивидууму, нуждающемуся в этом, эффективного количества композиции (например, фармацевтической композиции, продукта для здорового питания или продукта для лечебного питания), которая включает: (i) одну или более дубильных кислот или их фармацевтически приемлемые соли и (ii) фармацевтически приемлемый носитель, где фармацевтическая композиция, по существу, не содержит конденсированных танинов и/или флоротаннинов. В некоторых вариантах осуществления изобретения, целевым заболеванием, подвергаемым лечению описанным здесь способом, является расстройство ЦНС, которое может представлять собой боли, психоз, тревожное состояние, депрессию, суицидальные мысли и/или поведение, аутизм, БНС, мании, синдром Туретта, деменцию и поведенческие и психологические симптомы деменции (ППСД).

В некоторых вариантах осуществления изобретения, композицией, применяемой в описанном здесь способе лечения, могут быть любые фармацевтические композиции, продукты для здорового питания и/или продукты для лечебного питания, описанные в настоящей заявке. Такая композиция может быть использована для лечения ожирения. В некоторых примерах, индивидуумом, нуждающимся в лечении, является пациент, страдающий ожирением, или пациент с подозрением на ожирение. В других примерах, индивидуумом является человек, который проходил или проходит лечение по поводу ожирения.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанная здесь композиция предназначена для применения в лечении расстройства центральной нервной системы (ЦНС). Репрезентативными расстройствами ЦНС являются, но не ограничиваются ими, ADHD, шизофрения, боли, депрессия, суицидальные наклонности и/или поведение, биполярное расстройство, тик, посттравматическое стрессовое расстройство, тревожное состояние, социальное тревожное состояние, паническое расстройство, аутизм, синдром Аспергера, болезнь навязчивых состояний (БНС), нарушение способности к обучению, синдром Туретта, легкое когнитивное расстройство, деменция, сосудистая деменция, многоочаговая деменция, болезнь Альцгеймера, лобно-височная деменция, деменция, вызываемая тельцами Леви, болезнь Паркинсона, болезнь Гентингтона, боковой амиотрофический склероз, ночной энурез, блефароспазм и не-эпилептический припадок. В некоторых примерах, индивидуумом, нуждающимся в лечении, является человек, страдающий расстройством ЦНС, или человек с подозрением на расстройство ЦНС. В других примерах, индивидуумом является пациент, который проходил или проходит лечение расстройства ЦНС.

В объем настоящего изобретения также входят: (i) любые описанные здесь композиции, содержащие дубильную кислоту (например, фармацевтические композиции, продукты для здорового питания или продукты для лечебного питания) и предназначенные для лечения заболевания/расстройства, ассоциированного с DAAO и/или глутаматергической нейротрансмиссией, такого как описанные здесь заболевания, или для лечения ожирения, гиперлипидемии, диабета или расстройства ЦНС, и (ii) применение такой композиции в производстве лекарственных средств для лечения любых целевых заболеваний/расстройств, включая описанные здесь заболевания/расстройства.

Подробное описание одного или более вариантов осуществления изобретения приводится ниже. Другие признаки или преимущества настоящего изобретения будут очевидны из нижеследующего описания чертежей и подробного описания нескольких вариантов осуществления изобретения, а также из прилагаемой формулы изобретения.

Краткое описание чертежей

Нижеследующие чертежи являются частью описания настоящей заявки и включены для дополнительной иллстрации некоторых аспектов настоящего изобретения, которое будет более понятным со ссылкой на один или более этих чертежей в комбинации с подробным описанием конкретных вариантов осуществления изобретения, приведенных в настоящей заявке.

На фигуре 1 представлена блок-схема, где показано, что дубильные кислоты принадлежат к группе кислот, ингибирующих D-аминокислота-оксидазу (DAAO).

На фигуре 2 представлена блок-схема, иллюстрирующая анти-DAAO активности дубильных кислот с различным количеством галлоильных групп при 300 нM. 3 галлоильных группы обладают незначительной активностью. Дубильные кислоты с 4 или более галлоильными группами обладают более высокой активностью в ингибировании DAAO по сравнению с дубильными кислотами, имеющими 3 галлоильных группы. Чем выше число галлоильных групп, тем выше активность в ингибировании DAAO.

На фигуре 3 схематически проиллюстрирован репрезентативный протокол подтверждения активности дубильных кислот в отношении улучшения основных поведенческих функций, тревожных состояний, депрессии, памяти, сенсомоторных стробимпульсов и когнитивного поведения. Мышам вводили либо носитель в качестве контроля, либо дубильные кислоты в концентрации 10 мг/кг или 30 мг/кг путем ежедневной инъекции. Массу тела обработанной мыши измеряли каждый день. Поведенческие тесты проводили на дни, когда инъекции не вводили.

На фигуре 4 представлена блок-схема, иллюстрирующая изменение массы тела мышей, обработанных носителем-контролем и дубильными кислотами, в различных указанных дозах в течение всего периода обработки. Дубильная кислота в концентрации 10 мг/кг прекращает увеличение массы тела, а в концентрации 30 мг/кг снижает массу тела.

На фигуре 5 представлена блок-схема, иллюстрирующая снижение спонтанной двигательной активности мышей после введения повторных инъекций дубильных кислот или носителя-контроля.

На фигуре 6 представлена блок-схема, указывающая на то, что дубильные кислоты (Merck Millipore, Germany), при их однократном введении с помощью перорального зонда в указанных различных дозах, приводят к дозозависимому снижению двигательной активности мышей.

На фигуре 7 представлены диаграммы, иллюстрирующие улучшение поведения, подобного поведению при тревожных состояниях у мышей, после введения повторных инъекций дубильных кислот и носителя-контроля. Панель A: длительность аверсивного поведения для каждой группы. Панель B: расстояние до раздражающего объекта для каждой группы. Панель C: число рисков, оцениваемых для каждой группы.

На фигуре 8 представлена блок-схема, иллюстрирующая улучшение восстановления пространственной памяти у мышей после введения повторных инъекций дубильных кислот и носителя-контроля.

На фигуре 9 схематически проиллюстрирован репрезентативный экспериментальный протокол подтверждения эффектов дубильных кислот у мышей, обработанных MK801, как описано в Примере 3. Спонтанную двигательную активность и сенсомоторную функцию каждой мыши, обработанной либо дубильными кислотами, либо носителем-контролем, тестировали путем проведения испытания в «открытом поле» и испытания методом предымпульсного ингибирования, соответственно, где интервал между испытаниями составлял по меньшей мере 1 неделю. За 20 минут до введения MK801 (или носителя), каждой мыши вводили дубильные кислоты (или носитель). Кроме того, за 20 минут до проведения поведенческих тестов, каждой мыши вводили MK801 (или носитель).

На фигуре 10 представлена блок-схема, иллюстрирующая эффект одноразового перорального введения дубильных кислот в отношении снижения MK801-индуцированной гиперактивности в зависимости от от дозы.

На фигуре 11 представлена блок-схема, иллюстрирующая эффекты дубильных кислот в отношении улучшения предымпульсного ингибирования в зависимости от дозы.

На фигуре 12 представлена блок-схема, иллюстрирующая улучшение эффектов дубильных кислот, происходящих от различных источников, в отношении предымпульсного ингибирования.

На фигуре 13 схематически проиллюстрирован репрезентативный экспериментальный протокол подтверждения эффектов дубильных кислот у мышей, обработанных MK801, как описано в Примере 3. Спонтанную двигательную активность и сенсомоторную функцию каждой мыши, обработанной либо дубильными кислотами, либо носителем-контролем, в дополнение к MK801, тестировали путем проведения испытания в «открытом поле» и испытания методом предымпульсного ингибирования, в лабиринте Барнса и в тесте на предпочтительность сахарозы, где интервал между испытаниями составлял по меньшей мере 1 неделю. За 20 минут до инъекции MK801 (или носителя), каждой мыши вводили дубильную кислоту (или носитель) путем внутрибрюшинной инъекции. Кроме того, за 20 минут до проведения поведенческих тестов, каждой мыши вводили MK801 (или носитель) путем i.p. инъекции.

На фигуре 14 представлена блок-схема, иллюстрирующая эффекты дубильных кислот в отношении снижения MK801-индуцированной гиперактивности в зависимости от дозы.

На фигуре 15 представлена блок-схема, иллюстрирующая эффекты дубильных кислот в отношении снижения MK801-нарушенного предымпульсного ингибирования в зависимости от дозы.

На фигуре 16 представлена блок-схема, иллюстрирующая эффекты дубильных кислот в отношении улучшения MK-801-нарушенной рабочей памяти в зависимости от дозы в лабиринте Барнса.

На фигуре 17 представлена блок-схема, иллюстрирующая эффекты дубильных кислот в отношении улучшения MK-801-нарушенной предпочтительности сахарозы в зависимости от дозы.

На фигуре 18 схематически проиллюстрирован репрезентативный экспериментальный протокол подтверждения эффектов дубильных кислот у мышей в тесте фон Фрея. Дубильные кислоты (или носитель) вводили каждой мыши путем i.p.-инъекции.

На фигуре 19 представлена блок-схема, иллюстрирующая увеличение болевого порога отдергивания лапы в течение определенного периода времени после инъекции дубильных кислот или носителя-контроля (PBS).

На фигуре 20 представлена диаграмма, иллюстрирующая ВЭЖХ-хроматограмму композиции, содержащей дубильную кислоту от Ouercus infectoria.

На фигуре 21 представлена диаграмма, иллюстрирующая ВЭЖХ-хроматограмму композиции, содержащей дубильную кислоту от Rhus chinensis.

На фигуре 22 представлена диаграмма, иллюстрирующая ВЭЖХ-хроматограмму композиции, содержащей дубильную кислоту от Rhus chinensis.

На фигуре 23 представлена диаграмма, иллюстрирующая DAAO-ингибирующую активность дубильных кислот, экстрагированных из различных указанных растительных источников.

Подробное описание изобретения

Дубильные кислоты принадлежат к подсемейству таннинов, присутствующих в различных растениях. Дубильные кислоты, экстрагированные из растений, представляют собой смесь сложных эфиров полигаллоилглюкозы или полигаллоилхинной кислоты, содержащих 2-12 галлоильных групп. Ниже представлена структура репрезентативной молекулы дубильной кислоты, содержащей 10 галлоильных групп, связанных с глюкозной группой.

Исторически сложилось так, что дубильные кислоты использовались в качестве антидота для нейтрализации ядов, а также для лечения кратковременных состояний, таких как кровотечение, сыпи и другие болезненные состояния.

Настоящее изобретение основано на обнаружении того факта, что дубильные кислоты, а в частности, дубильные кислоты, имеющие четыре или более галлоильных групп, обнаруживают сильную ингибирующую активность против DAAO, которая, как известно, ассоциируется с различными заболеваниями и расстройствами, такими как ожирение, гиперлипидемия, диабет и расстройства ЦНС. Настоящие исследования также показали, что дубильные кислоты могут быть с успехом использованы для снижения массы тела и улучшения основных поведенческий функций, снижения гиперактивности, тревожности, депрессии, сенсомоторных стробимпульсов, болевого порога, а также улучшения памяти и когнитивного поведения у мышей-моделей. Кроме того, дубильные кислоты оказывают протективное и блокирующее действие на мышей, обработанных МК801, то есть, антагонистом рецептора N-метил-D-аспартата (рецептора NMDA). Рецептором NMDA является глутаматный рецептор и белок ионных каналов, экспрессируемый на нервных клетках и играющий важную роль в регуляции синаптической пластичности, репарации, развития нервных тканей и способности к обучению и функции памяти.

В соответствии с этим, настоящее изобретение относится к композициям, содержащим дубильную кислоту, к наборам и к способам их применения для улучшения основных функций, снижения гиперактивности, тревожности, депрессии, устранения суицидальных наклонностей и/или поведения, ослабления сенсомоторных стробимпульсов, снижения болевого порога, а также улучшения памяти и когнитивного поведения у индивидуума, нуждающегося в лечении, и/или для лечения заболеваний и расстройств, ассоциированных с DAAO, таких как ожирение и расстройства ЦНС.

I. Композиции, содержащие дубильную кислоту, и наборы, содержащие такие композиции

В одном из своих аспектов, настоящее изобретение относится к композициям, например, к фармацевтическим композициям, продуктам для здорового питания, таким как натуральные композиции, и к продуктам для лечебного питания, которые содержат одну или более дубильных кислот и носитель, например, фармацевтический приемлемый носитель и/или пищевой носитель. Такие носители, природные или не встречающиеся в природе (синтетические), могут сообщать дубильным кислотам в композиции различные преимущества, например, повышать in vitro и/или in vivo стабильность дубильных кислот, повышать биодоступность дубильных кислот, повышать биологическую активность дубильных кислот, и/или уменьшать побочные эффекты. Подходящими носителями являются, но не ограничиваются ими, разбавители, наполнители, соли, буферы, стабилизаторы, солюбилизаторы, забуферивающие агенты, консерванты или их комбинации. В некоторых примерах, носитель может содержать бензоат, такой как бензоат натрия.

(А) Содержание дубильных кислот

Описанные здесь композиции содержат одну или более дубильных кислот или их фармацевтически приемлемые соли. Термин «фармацевтически приемлемые соли» означает относительно нетоксичные неорганические или органические основно-аддитивные соли дубильных кислот. Эти соли могут быть получены in situ при введении носителя или в процессе приготовления лекарственной формы, или путем отдельной реакции взаимодействия одной или более дубильных кислот с подходящим органическим или неорганическим основанием, и выделения полученной таким образом соли в процессе последующей очистки. Подходящими неорганическими основаниями являются, но не ограничиваются ими, гидроксид натрия, гидроксид бария, гидроксид железа (II), гидроксид железа (III), гидроксид магния, гидроксид кальция, гидроксид алюминия, гидроксид аммония, гидроксид калия, гидроксид цезия или гидроксид лития. Подходящими органическими основаниями являются, но не ограничиваются ими, пиридин, метиламин, имидазол, бензимидазол, гистидин, фосфазеновые основания или гидроксид органического катиона, такой как гидроксид четвертичного аммония и гидроксид фосфония. См., например, Berge et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66: 1-19.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, дубильные кислоты, содержащиеся в композициях, представляют собой смесь дубильных кислот, имеющих различное число галлоильных групп, например, 2-12, 4-12, 4-10, 5-10, 5-12, 6-12 или 8-12 галлоильных групп или их фармацевтически приемлемые соли. В некоторых примерах, смесь дубильных кислот содержит дубильные кислоты, имеющие по меньшей мере 4 галлоильных группы (например, 4-12, 4-10, 4-9, или 4-7 галлоильных групп) или их фармацевтически приемлемые соли. Дубильные кислоты в композиции могут, в основном, но необязательно, не содержать дубильных кислот, имеющих 3 или менее галлоильных групп. Используемый здесь термин «по существу, не содержит» дубильных кислот, имеющих 3 или менее галлоильных групп, означает, что общее количество таких дубильных кислот в композиции составляет не более 10% по массе. В некоторых примерах, общее количество дубильных кислот, имеющих 3 или менее галлоильных групп в описанных здесь композициях, может быть менее, чем 8%, 5%, 2%, 1% или меньше. В некоторых примерах, композиция абсолютно не содержит дубильных кислот, имеющих 3 или менее галлоильных групп.

Любая из описанных здесь композиций может содержать не более, чем 20% (например, не более чем 18%, 15%, 12%, 10%, 5% или менее) дубильных кислот с 1-5 галлоильными группами. Альтернативно или дополнительно, композиция может содержать не менее чем 50% (например, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или более) дубильных кислот с 6-12 галлоильными группами или с 8-12 галлоильными группами. В одном конкретном примере, композиция содержит не более 18% дубильных кислот, имеющих 1-5 галлоильных групп, и не менее 60% дубильных кислот, имеющих 6-12 галлоильных групп. В другом примере, композиция содержит не более 15% дубильных кислот с 1-5 галлоильными группами и не менее 70% дубильных кислот с 6-12 галлоильными группами. В еще одном примере, композиция содержит не более 12% дубильных кислот с 1-5 галлоильными группами и не менее 80% дубильных кислот с 6-12 галлоильными группами. Альтернативно, композиция содержит не более 10% дубильных кислот, имеющих 1-5 галлоильных групп и не менее 90% дубильных кислот с 6-12 галлоильными группами.

Дубильная кислота или смесь дубильных кислот, применяемые для получения описанных здесь композиций, могут быть получены стандартными методами. Так, например, смесь дубильных кислот может быть экстрагирована или выделена по меньшей мере из подходящего растительного источника, включая, но не ограничиваясь ими, Rhus chinensis, Rhus javanica, Rhus semialata, Rhus coriaria, Rhus potaninii, Rhus punjabensis var. sinica (Diels) Rehder & E.H. Wilson, Camellia sinensis, Berry, Bixa orellana, Vitis vinifera, Punica granatum, Quercus infectoria, Quercus cerris, Acacia mearnsii, Pseudotsuga menziesii, Caesalpinia spinosa, Fagus hayata Palib. ex Hayata, или Machilus thunbergii Sieb. & Zucc. В некоторых вариантах осуществления изобретения, дубильную кислоту или смесь дубильных кислот, содержащихся в описанной здесь композиции, экстрагируют из Rhus chinensis, Rhus javanica, Rhus semialata, Rhus coriaria, Rhus potaninii или Rhus punjabensis var. sinica (Diels) Rehder & E.H. Wilson.

При этом, может потребоваться описанный здесь растительный источник с гнездящимися на нем насекомыми, включая, но не ограничиваясь ими, Andricus kollari, Andricus fecundatrix, Andricus quercuscalicis, Andricus quercuscalicis, Biorhiza pallida, Neuroterus quercusbaccarum, Neuroterus albipes, Neuroterus numismalis, Cynips quercusfolii, Melaphis chinensis (Bell), Melaphis peitan Tsai et Tang, Nurudea sinica Tsai et Tang, Nurudea shiraii Matsumura, Nurudea rosea Matsumura, Meitanaphis elongallis Tsai et Tang, Macrorhinarium ensigallis Tsai et Tang, Macrorhinarium ovagallis Tsai et Tang, Floraphis meitanensis Tsai et Tang, Meitanaphis flavogallis Tang, Kaburagia rhusicola Takagi, Kaburagia ovatihuicola Xiang, Kaburagia ensigallis Tsai et Tang, Kaburagia ovogallis, Kaburagia thusicola Takagi, Meitanaphis microgallis Xiang, and Floraphis choui Xiang.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанную здесь дубильную кислоту или смесь дубильных кислот эктрагируют из чернильных орешков, включая, но не ограничиваясь ими, китайские чернильные орешки, имеющие колоколообразную форму, роговидные чернильные орешки, жесткие мечевидные чернильные орешки, мечевидные яйцеобразные чернильные орешки и чернильные орешки в виде соцветий, находящиеся по меньшей мере на растительном источнике, требующем присутствия описанных здесь гнездящихся насекомых.

В других вариантах осуществления изобретения, дубильные кислоты, содержащиеся в описанных здесь композициях, представляют собой, в основном, гомогенную популяцию. Такая популяция дубильных кислот может содержать дубильную кислоту, имеющую определенное число галлоильных групп, например, любое число от 3 до 12 (включая 3 и 12) галлоильных групп, или ее фармацевтически приемлемую соль. Используемый здесь термин «в основном, гомогенный» означает, что дубильная кислота, имеющая определенное число галлоильных групп, составляет по меньшей мере 85% (например, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или более) по массе всех дубильных кислот, содержащихся в композиции. В некоторых примерах, в основном, гомогенная популяция дубильных кислот содержит дубильные кислоты, имеющие 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 галлоильных групп. Такие, в основном, гомогенные популяции дубильных кислот могут быть выделены из смеси дубильных кислот, имеющих различное число галлоильных групп (например, описанных в настоящей заявке), стандартным методом, например, с помощью хроматографии.

Экстракт дубильных кислот может быть подвергнут одной или более процедурам очистки, например, гель-фильтрации, фракционированию, распределению, перекриатллизации и хроматографии (например, ВЭДХ) или их комбинациям. См., например, примеры, представленные ниже. Альтернативно, дубильная кислота или смесь дубильных кислот могут быть получены путем химического синтеза рутинным методом.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанная здесь композиция дубильных кислот может быть получена следующим образом. Чернильные орешки, выделенные из подходящего растительного источника, например, описанного в настоящей заявке, могут быть получены рутинными методами. Чернильные орешки могут быть измельчены с образованием порошка. В некоторых примерах, порошок чернильных орешков может быть пропущен через сито подходящего размера (например, 20 меш, 30 меш, 40 меш, 50 меш или 60 меш) с получением тонкодисперсного порошка чернильных орешков.

Для экстракции дубильных кислот из любого описанного здесь порошка чернильных орешков может быть затем использован подходящий растворитель. Используемый здесь термин «растворитель» означает жидкость, которая может растворять одно или более растворимых веществ. Растворитель может включать чистую популяцию вещества, которое растворяет представляющее интерес растворимое вещество. Альтернативно, используемым здесь растворителем может быть смесь нескольких веществ для растворения растворимого вещества. В качестве подходящего растворителя для экстракции дубильных кислот служит ацетон, ацетонитрил, метилэтилкетон, этилацетат, этанол, изопропанол, тетрагидрофуран, 1,4-диоксан, пентан, гексан, гептан или их комбинация. Для экстракции содержимого дубильной кислоты, порошок чернильных орешков может быть помещен в растворитель в подходящем объеме. Образованная таким образом смесь может быть перемешана при подходящей температуре (например, при комнатной температуре) в течение подходящего периода времени (например, 6-18 часов, 6-12 часов, 12-18 часов, 18-24 часов). Полученный раствор может быть затем отфильтровали и концентрирован рутинным методом (например, путем выпаривания в вакууме).

Концентрированная композиция, содержащая дубильные кислоты, может быть затем смешана с углем, CaSO₄, MgSO₄ или их комбинациями для удаления нежелательных веществ (например, веществ, которые могут абсорбироваться на угле или осаждаться CaSO₄ и/или MgSO₄). В некоторых примерах, любые композиции, содержащие дубильную кислоту и полученные в предыдущих стадиях, могут быть сначала смешаны с углем в течение подходящего периода времени (например, путем перемешивания при комнатной температуре в течение 1-24 часов). Затем к смеси могут быть добавлены CaSO₄ и/или MgSO₄ с последующим их перемешиванием при подходящей температуре (например, при комнатной температуре) в течение подходящего периода времени (например, от 30 минут до 6 часов). После этого, смесь может быть отфильтрована, например, через слой целита, промыта подходящим растворителем (например, ацетоном, ацетонитрилом, метилэтилкетоном, этилацетатом, этанолом или их комбинацией), и концентрирована рутинным методом с получением композиции дубильных кислот. В других примерах, любые композиции, содержащие дубильную кислоту и полученные в предыдущих стадиях, могут быть сначала смешаны с углем в течение подходящего периода времени (например, путем перемешивания при комнатной температуре в течение 1-24 часов, например, 6-12 часов или 12-18 часов). Затем уголь может быть удален из смеси с образованием раствора. К раствору могут быть добавлены CaSO₄ и/или MgSO₄ с последующим их перемешиванием при подходящей температуре (например, при комнатной температуре) в течение подходящего периода времени (например, от 30 минут до 6 часов, например, от 30 минут до 2 часов или до 1 часа). После этого, смесь может быть отфильтрована, например, через слой целита, промыта подходящим растворителем (например, ацетоном, ацетонитрилом, метилэтилкетоном, этилацетатом, этанолом или их комбинацией), и концентрирована рутинным методом с получением композиции дубильных кислот.

При необходимости, способ получения описанной здесь композиции дубильных кислот может также включать стадию уменьшения числа или удаления дубильных кислот, имеющих 2-5 галлоильных групп (2-5G), стадию обогащения дубильных кислот, имеющих 6-12 галлоильных групп (6-12G), или обе эти стадии.

Для удаления дубильных кислот, имеющих 2-5G, неочищенная композиция дубильных кислот может быть смешана с подходящим растворителем с получением смеси, которая может быть инкубирована (например, перемешана) в течение подходящего периода времени (например, 6-18 часов) при подходящей температуре (например, при комнатной температуре) с образованием двух органических слоев. Дубильные кислоты, имеющие менее чем 5G, могут быть растворены в верхнем слое. Дубильные кислоты, имеющие более, чем 5G, могут оставаться в масляном слое (в нижнем слое) в виде твердых веществ. Масляный слой, обогащенный дубильными кислотами, имеющими большое количество галлоильных групп, может быть затем собран. При необходимости, масляный слой может быть концентрирован, и полученные таким образом твердые вещества могут быть растворены в соответствующем растворителе. Подходящими растворителями для удаления дубильных кислот, имеющих менее 5G, являются, но не ограничиваются ими, смеси любого одного из растворителей группы (i) и любого одного из растворителей группы (ii), перечисленных ниже:

(i) ацетона, ацетонитрила, метилэтилкетона или этилацетата; и

(ii) пентана, гексана или гептана.

Полученный раствор может быть подвергнут обработке углем, CaSO₄ и/или MgSO₄ для удаления нежелательных веществ, описанных в настоящей заявке.

Для обогащения дубильных кислот, имеющих большое количество галлоильных групп (например, 6-12G), композиция, содержащая дубильную кислоту, может быть сначала растворена в подходящем растворителе, таком как ацетон, ацетонитрил, метилэтилкетон или этилацетат. Полученный таким образом раствор может быть перемешан, а затем к этому раствору медленно по каплям могут быть добавлены СН₂Cl₂ или дихлорэтан для осаждения нужных дубильных кислот. Затем, твердые вещества могут быть собраны рутинным методом (например, путем фильтрации и/или сушки) с получением обогащенной композиции дубильных кислот.

Ниже представлены некоторые примеры, которые приводятся лишь в иллюстративных целях и не рассматриваются как ограничение объема изобретения.

- Способ, включающий: (i) измельчение чернильных орешков подходящего растительного источника с получением неочищенного порошка чернильных орешков; (ii) пропускание неочищенного порошка чернильных орешков через сито 40 меш с получением тонкодисперсного порошка чернильных орешков; (iii) растворение тонкодисперсного порошка чернильных орешков в подходящем растворителе (например, в ацетоне, ацетонитриле, метилэтилкетоне (МЕК), этилацетате (EtOAc), этаноле (EtOH), изопропаноле (IPA), тетрагидрофуране (ТГФ), 1,4-диоксане или в их комбинации) и перемешивание образованной таким образом смеси при 20-45°C в течение 3-24 часов; (iv) фильтрацию и концентрирование полученного раствора с образованием твердых остатков; (v) смешивание твердых остатков с растворителем (например, с 20%-60% метилэтилкетоном/гексаном или с 30-50% метилэтилкетоном/гексаном), при 20-45°C в течение 3-24 часов с образованием двух органических слоев; (vi) сбор и концентрирование масляного слоя стадии (v); (vii) растворение полученных таким образом остатков в подходящем растворителе (например, в ацетоне, ацетонитриле, метилэтилкетоне, этилацетате, этаноле или в их комбинации) с получением раствора; (viii) перемешивание раствора, полученного в (vii), в присутствии угля в течение 1-24 часов; (ix) перемешивание смеси, полученной в (viii), в присутствии CaSO₄ или MgSO₄; (x) удаление угля и CaSO₄ или MgSO₄ из смеси (ix) рутинным методом; (xi) концентрирование фильтрата (х); (xii) растворение остатка (xi) в в подходящем растворителе (например, в ацетоне, ацетонитриле, метилэтилкетоне, этилацетате или в их комбинации); (xiii) добавление метиленхлорида или дихлорэтана в раствор (xii) и (xiv) сбор и сушку твердого вещества, полученного в (xiii).

- Способ, включающий: (i) измельчение чернильных орешков подходящего растения с получением неочищенного порошка чернильных орешков; (ii) пропускание неочищенного порошка чернильных орешков (i) через сито 40 меш с получением тонкодисперсного порошка чернильных орешков; (iii) растворение тонкодисперсного порошка чернильных орешков в подходящем растворителе (например, в ацетоне, ацетонитриле, метилэтилкетоне, этилацетате, этаноле, изопропаноле, тетрагидрофуране, 1,4-диоксане или в их комбинации) и перемешивание полученного раствора при 20-45°C в течение 3-24 часов; (iv) фильтрацию раствора; (v) добавление подходящего растворителя (например, пентана, гексана, гептана или их комбинации) к раствору (iv) и перемешивание в течение 3-24 часов с получением двух органических слоев; (vi) сбор и концентрирование масляного слоя стадии (v); (vii) растворение остатка (vi) в подходящем растворителе (например, в ацетоне, ацетонитриле, метилэтилкетоне, этилацетате, этаноле или в их комбинации); (viii) перемешивание раствора (vii) в присутствии угля в течение 1-24 часов (например, 6-12 часов или 12-18 часов); (ix) перемешивание смеси (viii) в присутствии CaSO₄ или MgSO₄; (x) удаление угля и CaSO₄ или MgSO₄ из смеси (ix) рутинным методом; (xi) концентрирование фильтрата (х); (xii) растворение остатка (xi) в подходящем растворителе (например, в ацетоне, ацетонитриле, метилэтилкетоне, этилацетате, этаноле или в их комбинации); (xiii) добавление метиленхлорида или дихлорэтана в раствор (xii); и (xiv) сбор и сушку твердого вещества, полученного в (xiii).

- Способ, включающий: (i) измельчение чернильных орешков подходящего растения с получением неочищенного порошка чернильных орешков; (ii) пропускание неочищенного порошка чернильных орешков (i) через сито 40 меш с получением тонкодисперсного порошка чернильных орешков; (iii) растворение тонкодисперсного порошка чернильных орешков в подходящем растворителе (например, в ацетоне, ацетонитриле, метилэтилкетоне, этилацетате, этаноле, изопропаноле, тетрагидрофуране, 1,4-диоксане или в их комбинации) и перемешивание при 20-45°C в течение 3-24 часов; (iv) фильтрацию раствора (iii); (v) добавление подходящего растворителя (например, пентана, гексана, гептана или их комбинации) к раствору (iv) и перемешивание в течение 3-24 часов с получением двух органических слоев; (vi) сбор масляного слоя (v); (vii) разведение масляного слоя (vi) подходящим растворителем (например, ацетоном, ацетонитрилом, метилэтилкетоном, этилацетатом, этанолом или их комбинацией); (viii) перемешивание раствора (vii) в присутствии угля в течение 1-24 часов (например, 6-12 часов или 12-18 часов); (ix) перемешивание смеси (viii) в присутствии CaSO₄ или MgSO₄; (x) удаление угля и CaSO₄ или MgSO₄ из смеси (ix) рутинным методом; (xi) концентрирование фильтрата (х); (xii) растворение остатка (xi) в подходящем растворителе (например, в ацетоне, ацетонитриле, метилэтилкетоне, этилацетате, этаноле или в их комбинации); (xiii) добавление метиленхлорида или дихлорэтана в раствор (xii); и (xiv) сбор и сушку твердого вещества, полученного в (xiii).

- Способ, включающий: (i) измельчение чернильных орешков подходящего растения с получением неочищенного порошка чернильных орешков; (ii) пропускание неочищенного порошка чернильных орешков (i) через сито 40 меш с получением тонкодисперсного порошка чернильных орешков; (iii) растворение тонкодисперсного порошка чернильных орешков в подходящем растворителе (например, в ацетоне, ацетонитриле, метилэтилкетоне, этилацетате, этаноле, изопропаноле, тетрагидрофуране, 1,4-диоксане или в их комбинации) и перемешивание при 20-45°C в течение 3-24 часов; (iv) перемешивание раствора (iii) в присутствии угля в течение 1-24 часов (например, 6-12 часов или 12-18 часов); (v) перемешивание смеси (iv) в присутствии CaSO₄ или MgSO₄; (vi) удаление угля и CaSO₄ или MgSO₄ из смеси (v) рутинным методом; (vii) концентрирование фильтрата (vi); (viii) растворение остатка (vii) в подходящем растворителе (например, в ацетоне, ацетонитриле, метилэтилкетоне, этилацетате, этаноле или в их комбинации); (ix) добавление метиленхлорида или дихлорэтана в раствор (viii); и (x) сбор и сушку твердого вещества, полученного в (ix).

- Способ, включающий: (i) измельчение чернильных орешков подходящего растения с получением неочищенного порошка чернильных орешков; (ii) пропускание неочищенного порошка чернильных орешков (i) через сито 40 меш с получением тонкодисперсного порошка чернильных орешков; (iii) растворение тонкодисперсного порошка чернильных орешков в подходящем растворителе (например, в ацетоне, ацетонитриле, метилэтилкетоне, этилацетате, этаноле, изопропаноле, тетрагидрофуране, 1,4-диоксане или в их комбинации) и перемешивание при 20-45°C в течение 3-24 часов; (iv) перемешивание раствора (iii) в присутствии угля в течение 1-24 часов (например, 6-12 часов или 12-18 часов); (v) перемешивание смеси (iv) в присутствии CaSO₄ или MgSO₄; (vi) удаление угля и CaSO₄ или MgSO₄ из смеси (v) рутинным методом; (vii) снижение объема фильтрата (vi) приблизительно до 1/10-1/100 от первоначального объема; (ix) добавление метиленхлорида или дихлорэтана в раствор (vii) и (х) сбор и сушку твердого вещества, полученного в (ix).

- Способ, включающий: (i) измельчение чернильных орешков подходящего растения с получением неочищенного порошка чернильных орешков; (ii) пропускание неочищенного порошка чернильных орешков (i) через сито 40 меш с получением тонкодисперсного порошка чернильных орешков; (iii) растворение тонкодисперсного порошка чернильных орешков в подходящем растворителе (например, в ацетоне, ацетонитриле, метилэтилкетоне, этилацетате, этаноле, изопропаноле, тетрагидрофуране, 1,4-диоксане или в их комбинации) и перемешивание при 20-45°C в течение 3-24 часов; (iv) фильтрацию раствора (iii); (v) перемешивание фильтрата (iv) в присутствии угля в течение 1-24 часов (например, 6-12 часов или 12-18 часов); (vi) перемешивание смеси (v) в присутствии CaSO₄ или MgSO₄; (vii) удаление угля и CaSO₄ или MgSO₄ из смеси (vi); (viii) концентрирование фильтрата (vii) рутинным методом; (ix) растворение остатка (viii) в подходящем растворителе (например, в ацетоне, ацетонитриле, метилэтилкетоне, этилацетате, этаноле или в их комбинации); (x) добавление метиленхлорида или дихлорэтана в раствор (ix); и (xi) сбор и сушку твердого вещества, полученного в (x).

- Способ, включающий: (i) измельчение чернильных орешков подходящего растения с получением неочищенного порошка чернильных орешков; (ii) пропускание неочищенного порошка чернильных орешков (i) через сито 40 меш с получением тонкодисперсного порошка чернильных орешков; (iii) помещение раствора тонкодисперсного порошка чернильных орешков (ii) в растворитель (например, в 50-30% метилэтилкетон/гексан) и перемешивание полученной таким образом смеси при комнатной температуре в течение 3-24 часов; (iv) фильтрацию раствора (iii); (v) растворение твердого вещества, собранного в (iv), в подходящем растворителе (например, в ацетоне, ацетонитриле, метилэтилкетоне, этилацетате, этаноле, изопропаноле, тетрагидрофуране, 1,4-диоксане или в их комбинации) и перемешивание раствора при 20-45°C в течение 3-24 часов; (vi) фильтрацию раствора (v); (vii) перемешивание фильтрата (vi) в присутствии угля в течение 1-24 часов; (viii) перемешивание смеси (vii) в присутствии CaSO₄ или MgSO₄; (ix) удаление угля и CaSO₄ или MgSO₄ из смеси (viii) рутинным методом; (х) концентрирование фильтрата (ix); (xi) растворение остатка (x) в подходящем растворителе (например, в ацетоне, ацетонитриле, метилэтилкетоне, этилацетате, этаноле или в их комбинации); (xii) добавление метиленхлорида или дихлорэтана в раствор (xi); и (xiii) сбор и сушку твердого вещества, полученного в (xii).

- Способ, включающий: (i) измельчение чернильных орешков подходящего растения с получением неочищенного порошка чернильных орешков; (ii) пропускание неочищенного порошка чернильных орешков (i) через сито 40 меш с получением тонкодисперсного порошка чернильных орешков; (iii) помещение тонкодисперсного порошка чернильных орешков (ii) в растворитель (например, в 20-60%, например, в 30-50% метилэтилкетон/гексан) и перемешивание полученного таким образом раствора при комнатной температуре в течение 3-24 часов; (iv) фильтрацию раствора (iii); (v) растворение твердого вещества, собранного в (iv), в подходящем растворителе (например, в ацетоне, ацетонитриле, метилэтилкетоне, этилацетате, этаноле, изопропаноле, тетрагидрофуране, 1,4-диоксане или в их комбинации) и перемешивание раствора при 20-45°C в течение 3-24 часов; (vi) перемешивание фильтрата (v) в присутствии угля в течение 1-24 часов (например, 6-12 или 12-18 часов); (vii) перемешивание смеси (vi) в присутствии CaSO₄ или MgSO₄; (viii) удаление угля и CaSO₄ или MgSO₄ из смеси (vii); (ix) уменьшение объема фильтрата (viii) приблизительно до 1/10 до 1/100 от исходного объема; (х) растворение остатка (ix) в подходящем растворителе (например, в ацетоне, ацетонитриле, метилэтилкетоне, этилацетате, этаноле или в их комбинации); (xi) добавление метиленхлорида или дихлорэтана в раствор (х) и (xii) сбор и сушку твердого вещества, полученного в (xi).

(B) Фармацевтические композиции

В некоторых вариантах осуществления изобретения, одна или более описанных здесь дубильных кислот (например, смесь дубильных кислот или, по существу, гомогенная популяция дубильных кислот, имеющих определенное число галлоильных групп, как описано в настоящей заявке) могут быть смешаны с фармацевтически приемлемым носителем (наполнителем) с образованием фармацевтической композиции, которая может быть использована для лечения любых описаных здесь целевых заболеваний. В некоторых вариантах осуществления изобретения, популяция дубильных кислот в композиции, по существу, не содержит конденсированных танинов и/или флоротаннинов. Термин «приемлемый» означает, что носитель должен быть совместим с активным ингредиентом композиции (и, предпочтительно, способен стабилизировать активный ингредиент) и не оказывать какого-либо негативного воздействия на индивидуума, подвергаемого лечению. Фармацевтически приемлемые наполнители (носители), включая буферы, хорошо известны специалистам в данной области. См., например, Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover.

Фармацевтически приемлемыми носителями являются разбавители, наполнители, соли, буферы, стабилизаторы, солюбилизаторы и другие материалы, хорошо известные специалистам. Репрезентативные фармацевтически приемлемые носители для дубильных кислот или их солей описаны, в частности, в патенте США № 5211657. Такие препараты обычно содержат соли, забуферивающие агенты, консерванты, совместимые носители и, необязательно, другие терапевтические агенты. При использовании в медицине, соли должны быть фармацевтически приемлемыми, однако, для получения фармацевтически приемлемых солей могут быть использованы фармацевтически неприемлемые соли, и эти соли не входят в объем настоящего изобретения. Такими фармакологически и фармацевтически приемлемыми солями являются, но не ограничиваются ими, соли, полученные из подходящего неорганического основания (например, гидроксида натрия, гидроксида бария, гидроксида железа (II), гидроксида железа (III), гидроксида магния, гидроксида кальция, гидроксида алюминия, гидроксиад аммония, гидроксида калия, гидроксида цезия или гидроксида лития) или подходящего органического основания (например, пиридина, метиламина, имидазола, бензимидазола, гистидина, фосфазеновых оснований или гидроксида органического катиона, такого как четвертичный гидроксид аммония и гидроксид фосфония). Кроме того, фармацевтически приемлемые соли могут быть получены в виде солей щелочных или щелочно-земельных металлов, таких как соли лития, натрия, калия или кальция.

Описанные здесь фармацевтические композиции, содержащие дубильные кислоты, могут включать фармацевтически приемлемые носители, наполнители или стабилизаторы в виде лиофилизированных препаратов или водных растворов. Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover. Приемлемые носители, наполнители или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозах и концентрациях и могут содержать буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония, хлорид бензэтония; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол; бензоаты, сорбат и м-крезол); низкомолекулярные полипептиды (имеющие приблизительно менее, чем 10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин, серин, аланин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозы, маннозу или декстраны; хелатообразующие агенты, такие как EDTA; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; металлические комплексы (например, комплексы Zn-белок); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN^TM, PLURONICS^TM или полиэтиленгликоль (ПЭГ).

В других примерах, описанная здесь фармацевтическая композиция может быть приготовлена в виде лекарственной формы с пролонгированным высвобождением. Подходящими примерами препаратов с пролонгированным высвобождением являются полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащих дубильные кислоты, где указанные матрицы получены в виде сформованных изделий, например, пленок или микрокапсул. Примерами матриц с пролонгированным высвобождением являются сложные полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат) или поливиниловый спирт), полилактиды (патент США № 3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и 7-этил-L-глутамата, неразлагаемый этилен-винилацетат, разлагаемые сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты, такие как LUPRON DEPOT^TM (инъецируемые микросферы, состоящие из сополимера молочной кислоты-гликолевой кислоты и ацетата лейпролида), изобутират ацетата сахарозы и поли-D-(-)-3-гидроксимасляная кислота.

Фармацевтические композиции, используемые для введения in vivoх, должны быть стерильными. Это легко достигается, например, путем фильтрации через стерильные фильтрующие мембраны. Терапевтические композиции, как правило, помещают в контейнер, имеющий стерильное входное отверстие, например, в пакет с раствором для внутривенного введения или флакон, имеющий пробку, прокалываемую иглой для подкожной инъекции.

Описанные здесь фармацевтические композиции могут быть приготовлены в виде унифицированных лекарственных форм, таких как таблетки, пилюли, капсулы, порошки, гранулы, растворы или суспензии, или суппозитории, например, для перорального, парентерального или ректального введения, или введения путем ингаляции или инсуффляции, или интратекального или интрацеребрального введения.

Для получения твердых композиций, таких как таблетки, основной активный ингредиент может быть смешан с фармацевтическим носителем, например, со стнадартными ингредиентами для таблетирования, такими как кукурузный крахмал, лактоза, сахароза, сорбит, тальк, стеариновая кислота, стеарат магния, дифосфат кальция или камеди, и с другими фармацевтическими разбавителями, например, с водой, с образованием предварительной твердой композиции, содержащей гомогенную смесь соединения согласно изобретению или ее нетоксичной фармацевтически приемлемой соли. Термин «гомогенные предварительные композиции» означает, что активный ингредиент равномерно распределен по всей композиции, так, что эта композиция может быть легко разделена в равной степени на эффективные унифицированные лекарственные формы, такие как таблетки, драже и капсулы. Затем эту предварительную твердую композицию разделяют на унифицированные лекарственные формы описанного выше типа, содержащие от 0,1 и приблизительно до 500 мг активного ингредиента согласно изобретению. На таблетки или драже новой композиции может быть нанесено покрытие, либо они могут быть компаундированы с получением лекарственной формы, обладающей преимущественно пролонгированным действием. Так, например, таблетка или драже может содержать внутренний дозированный и наружный дозированный компонент, причем последний компонент находится в форме оболочки поверх первого. Два компонента могут быть разделены энтеросолюбильным слоем, который служит для предотвращения разложения в желудке и позволяет внутреннему компоненту проходить в двенадцатиперстную кишку неповрежденным или задерживаться при выделении. Для таких энтеросолюбильных слоев или покрытий могут быть использованы различные материалы, включая различные полимерные кислоты и смеси полимерных кислот с такими соединениями, как шеллак, цетиловый спирт и ацетат целлюлозы.

Подходящими поверхностно-активными веществами являются, в частности, неионные агенты, такие как полиоксиэтиленсорбитаны (например, Твин™ 20, 40, 60, 80 или 85) и другие сорбитаны (например, Спан™ 20, 40, 60, 80 или 85). Композиции с поверхностно-активным веществом обычно включают от 0,05 до 5%, а иногда от 0,1 до 2,5% поверхностно-активного вещества. Следует отметить, что, при необходимости, могут быть добавлены и другие ингредиенты, например, маннит или другие фармацевтически приемлемые носители.

Подходящие эмульсии могут быть получены с использованием коммерчески доступных жировых эмульсий, таких как Intralipid™, Liposyn™, Infonutrol™, Lipofundin™ и Lipiphysan™. Активный ингредиент может быть либо растворен в предварительно смешанной эмульсионной композиции либо, альтернативно, он может быть растворен в масле (например, в соевом масле, в сафлоровом масле, в масле семян хлопчатника, в кунжутном масле, в кукурузном масле или в миндальном масле), и эта эмульсия образуется при смешивании с фосфолипидом (например, с яичными фосфолипидами, соевыми фосфолипидами или соевым лецитином) и водой. Следует отметить, что для регуляции тоничности эмульсии могут быть добавлены и другие ингредиенты например, глицерин или глюкоза. Подходящие эмульсии обычно содержат до 20%, например, от 5 до 20% масла.

Фармацевтические композиции для ингаляции или инсуффляции включают растворы и суспензии в фармацевтически приемлемых водных или органических растворителях или их смеси и порошки. Жидкие или твердые композиции могут содержать подходящие фармацевтически приемлемые наполнители, описанные выше. В некоторых вариантах осуществления изобретения, композиции вводят перорально или интраназально с помощью респиратора для достижения локального или системного эффекта.

Композиции в предпочтительно стерильных фармацевтически приемлемых растворителях могут быть подвергнуты распылению с применением газов. Распыленные растворы можно вдыхать непосредственно из распыляющего устройства, либо распыляющее устройство может быть прикреплено к лицевой маске, тенту или устройству для перемежающегося положительного давления на выдохе во время ингаляции. Композиции в виде раствора, суспензии или порошка могут быть введены, предпочтительно, перорально или интраназально из устройств для доставки препарата соответствующим образом.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, любые фармацевтические композиции, содержащие дубильные кислоты, могут также включать второй терапевтический агент исходя из целей терапевтического применения данной композиции.

В некоторых примерах, вторым терапевтическим агентом является средство против ожирения, включая, но не ограничиваясь этим, орлистат, лоркасерин, сибутрамин, римонабант, метформин, экзенатид, пралинтид, фентермин, фенфлурамин, топирамат дексфенфлурамина, динитрофенол, бупропион и зонизамид.

В других примерах, вторым терапевтическим средством является средство для лечения заболевания/расстройства ЦНС. Таким терапевтическим средством может быть антипсихотическое средство. Репрезентативными антипсихотическими средствами являются, но не ограничиваются ими, бутирофенон (например, галоперидол (HALDOL™), фенотиазин (например, хлорпромазин (THORAZINE™), флуфеназин (PROLIXIN™), перфеназин (TRILAFON™), прохлорперазин (COMPAZINE™), тиоридазин (MELLARIL™), трифторперазин (STELAZINE™), мезоридазин, промазин, трифторпромазин (VESPRIN™), левомепромазин (NOZINAN™), прометазин (PHENERGAN™), тиоксантин (например, хлорпротиксен, флупентиксол (DEPIXOL™, FLUANXOL™), тиотиксен (NAVANE™), зуклопентиксол (CLOPIXOL™, ACUPHASE™), клозапин (CLOZARIL™), оланзапин (ZYPREXA™), рисперидон (RISPERDAL™, RISPERDAL CONSTA™), кветиапин (SEROQUEL™), зипразидон (GEODON™), амисульприд (SOLIAN™), азенапин, палиперидон (INVEGA^®), арипипразол (ABILIFY™), частичные агонисты допамина (BIFEPRUNOX™, NORCLOZAPINE™ (ACP-104)), ламотригин (LAMICTAL™), тетрабеназин (NITOMAN™, XENAZINE™), каннабидиол, LY2140023 и т.п.).

Альтернативно, вторым терапевтическим средством может быть антидепрессант и/или стабилизатор настроения. В некоторых вариантах осуществления изобретения, антидепрессант включает ингибитор моноаминоксидазы (MAOI), трициклический антидепрессант (TCA), тетрациклический антидепрессант (TeCA), селективный ингибитор повторного поглощения серотонина (SSRI), ноадренергический и специфический серотонергический антидепрессант (NASSA), ингибитор повторного поглощения норэпинефрина (норадреналина), ингибитор повторного поглощения норэпинефрина-допамина и/или ингибитор повторного поглощения серотонина-норэпинефрина (SNRI). Репрезентативными SSRI являются флуоксетин (PROZAC™^M), пароксетин (PAXIL™, SEROXAT™), эсциталопрам (LEXAPRO™, ESIPRAM™), циталопрам (CELEXA™), сетралин (ZOLOFT™), флуоксамин (LUVOX™)). Репрезентативными SNRI являются венлафаксин (EFFEXOR™), милнаципрам и дулоксетин (CYMBALTA™). Другими антидепрессантами являются норадренергический и специфический серотонергический антидепрессант (NASSA) (например, миртазапин (AVANZA™, ZISPIN™, REMERON™) или миансерин, ингибитор повторного поглощения норэпинефрина (норадреналина) (NRI) (например, ребокситин (EDRONAX™)), ингибиторы повторного поглощения норэпинефрина-допамина (например, бупропион (WELLBUTRIN™, ZYBAN™)), амитриптилин, нортиптилин, протриптилин, дезипрамин, имипрамин, тримипрамин, амоксапин, бупропион, бупропион SR, кломипрамин, доксепин, изокарбоксазид, венлафаксин XR, транилципромин, тразодон, нефазодон, фенелзин, ламатрогин, литий, топирамат, габапентин, карбамазепин, оксакарбазепин, вальпорат, мапротилин, миртазапин, брофаромин, гепирон, моклобемид, изониазид, ипрониазид и т.п.

В других примерах, вторым терапевтическим агентом может быть средство для лечения ADD и/или ADHD. Подходящими лекарственными средствами для лечения ADHD являются, но не ограничиваются ими, амфетамин, модафинил, дезоксин, метамфетамин, кокаин, ареколин, дексметилфенидат (фокалин, фокалин XR), декстроамфетамин (декседрин, Dexedrine Spansules, декстроамфетамин ER, декстростат), метилфенидат (Concerta, Daytrana, метадат CD, метадат ER, метилин, метилин ER, риталин, риталин-LA, риталин-SR), димезилат лисдексамфетамина (Vyvanse), смешанные соли амфетамина (Adderall, Adderall XR), атомоксетин (Strattera), гидрохлорид клонидина (Catapres), гидрохлорид гуанфацина (Tenex), ареколин и пемолин.

Кроме того, вторым терапевтическим агентом может быть средство для лечения когнитивного расстройства и/или состояния, характеризующегося нейродегенерацией (например, болезни Альцгеймера или болезни Паркинсона). Такими терапевтическими средствами являются, но не ограничиваются ими, такрин, ривастигмин, мемантин (AXURA™, AKATINOL™, NAMENDA™, EBIXA™, ABIXA™), донепезил (Aricept™), физостигмин, никотин, ареколин, гуперзин альфа, селегилин, Rilutek™ (рилузол), витамин С, витамин Е, каротиноиды, гинкго двухлопастный и т.п.

(C) Продукты для здорового питания

В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанные здесь композиции, содержащие дубильную кислоту, могут представлять собой продукт для здорового питания, который может представлять собой жидкие и твердые/полутвердые продукты любых видов, используемые для питания людей и животных, для улучшения базовых поведенческих функций, для снижения гиперактивности, тревожности, депрессии, устранения суицидальных наклонностей и/или поведения, ослабления сенсомоторных стробимпульсов, снижения болевого порога, а также улучшения памяти и когнитивного поведения или для лечения любых описанных здесь целевых заболеваний (например, ожирения или расстройства ЦНС, включая описанные здесь заболевания). Продуктом для здорового питания может быть пищевой продукт (например, напитки на основе чая, соки, безалкогольные напитки, кофе, молоко, желе, печенье, крупы, шоколад, закуски-снеки, растительные экстракты, молочные продукты (например, мороженое и йогурт)), пищевые/диетические добавки или натуральные препараты.

Описанный здесь продукт для здорового питания, содержащий одну или более дубильных кислот (например, описанную здесь смесь дубильной кислоты, или, по существу, гомогенную популяцию дубильных кислот, имеющих определенное число галлоильных групп, также описанных в настоящей заявке), может включать один или более пищевых носителей, которые сообщают дубильным кислотам в описанном здесь продукте одно или более ценных свойств. Примерами пищевых носителей являются крахмал, циклодекстрин, мальтодекстрин, метилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза, ксантановая камедь и их водные растворы. Другими примерами являются растворители, дисперсионные среды, агенты для нанесения покрытия, поверхностно-активные вещества, антиоксиданты, консерванты (например, антибактериальные агенты, противогрибковые агенты), изотонические агенты, агенты, замедляющие абсорбцию, стабилизаторы, гели, связующие вещества, наполнители, дезинтегрирующие агенты, лубриканты, подсластители, ароматизаторы, красители, такие как вещества и их комбинации, известные специалистам в данной области. В некоторых примерах, описанные здесь продукты для здорового питания могут дополнительно включать нейропротекторные вещества, такие как рыбий жир, льняное масло и/или бензоат.

В некоторых примерах, продуктом для здорового питания является натуральная композиция, которая представляют собой композицию, содержащую компоненты, происходящие от пищевых источников и сообшающие пищевым продуктам, помимо их основной питательной ценности, дополнительные полезные для здоровья свойства. Описанная здесь натуральная композиция содержит описанную здесь дубильную кислоту (например, смесь дубильных кислот или, по существу, гомогенную популяцию дубильных кислот, как описано в настоящей заявке) и дополнительные ингредиенты и добавки, которые улучшают здоровье и/или повышают стабильность и биоактивность дубильных кислот.

Действие натуральных композиций может быть быстрым и/или кратковременным, либо они могут способствовать достижению долгосрочных целей в области здравоохранения, как описано в настоящей заявке, например, улучшению базовых поведенческих функций, снижению гиперактивности, тревожности, депрессии, ослаблению сенсомоторных импульсов, снижению болевого порога, а также улучшению памяти и когнитивного поведения, например, у индивидуума, который страдает заболеваниями, ассоциированными с DAAO, такими как расстройства ЦНС, или у индивидуума с риском развития таких заболеваний, или у индивидуума с ожирением или с риском развития ожирения. Натуральные композиции могут содержаться в пищевых продуктах, например, в виде пищевой добавки или фармацевтического препарата. В качестве пищевой добавки могут быть включены дополнительные питательные вещества, такие как витамины, микроэлементы или аминокислоты. Композиция также может представлять собой напиток или пищевой продукт, например, чай, безалкогольный напиток, сок, молоко, кофе, печенье, крупы, шоколад и закуски-снэки. При необходимости, композиция может быть подслащена путем добавления подсластителя, такого как сорбит, маннит, гидрогенизированный глюкозный сироп и гидрогенизированный гидролизат крахмала, кукурузный сироп с высоким содержанием фруктозы, тростниковый сахар, сахар из сахарной свеклы, пектин или сукралоза.

Описанная здесь натуральная композиция может быть приготовлена в форме раствора. Так, например, натуральная композиция может быть приготовлена в среде, такой как буфер, растворитель, разбавитель, инертный носитель, масло или крем. В некоторых примерах, препарат присутствует в водном растворе, который содержит, но необязательно, безводный сорастворитель, такой как спирт. Натуральная композиция может быть также приготовлена в форме порошка, пасты, желе, капсулы или таблетки. Лактоза и кукурузный крахмал обычно используются в качестве разбавителей для капсул и в качестве носителей для таблеток. Лубриканты, такие как стеарат магния, обычно добавляют для приготовления таблеток.

Продукты для здорового питания могут быть приготовлены для их введения подходящим способом, например, для перорального введения. Для перорального введения, композиция может быть приготовлена в форме, например, таблеток или капсул, получаемых стандартными способами с добавлением приемлемых наполнителей, таких как связующие агенты (например, крахмал кукурузы, набухающий в холодной воде, поливинилпирролидон или гидроксипропилметилцеллюлоза), наполнители (например, лактоза, микрокристаллическая целлюлоза или гидрофосфат кальция), лубриканты (например, стеарат магния, тальк или диоксид кремния); дезинтеграторы (например, картофельный крахмал или гликолят натрий-содержащего крахмала) или смачивающие агенты (например, лаурилсульфат натрия). На таблетки могут быть нанесены покрытия методами, хорошо известными специалистам в данной области. Также могут быть использованы снэки и другие жевательные препараты.

В некоторых примерах, продукт для здорового питания может быть приготовлен в жидкой форме, и один или несколько пищевых носителей могут представлять собой растворитель или дисперсионную среду, которая содержит, без каких-либо ограничений, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль), липиды (например, триглицериды, растительные масла, липосомы) или их комбинации. Подходящая текучесть может поддерживаться, например, благодаря использованию материалов для покрытия, таких как лецитин; путем поддержания требуемого размера частиц благодаря диспергированию в носителях, таких как, например, жидкий полиол или липиды, и с использованием поверхностно-активных веществ, таких как, например, гидроксипропилцеллюлоза или их комбинации. Во многих случаях, будет целесообразно включить изотонический агент, такой как, например, сахара, хлорид натрия или их комбинации.

Жидкие препараты для перорального введения могут иметь форму, например, растворов, сиропов или суспензий, либо они могут быть приготовлены в виде сухого продукта для смешивания с водой или другим приемлемым носителем перед употреблением. В одном варианте осуществления изобретения, жидкие препараты могут быть приготовлены для их введения с фруктовым соком. Такие жидкие препараты могут быть получены стандартными методами с фармацевтически приемлемыми добавками, такими как суспендирующие агенты (например, сироп из сорбита, производные целлюлозы или гидрогенизированные пищевые жиры); эмульгаторы (например, лецитин или аравийская камедь); безводные носители (например, миндальное масло, сложные эфиры жиров, этиловый спирт или фракционированные растительные масла) и консерванты (например, метил- или пропил-п-гидроксибензоаты, бензоат или сорбат).

Описанные здесь продукты для здорового питания могут дополнительно содержать один или более других терапевтических средств, включая средства, описанные в настоящей заявке.

(D) Продукты для лечебного питания

Настоящее изобретение также относится к композициям продуктов для лечебного питания, к их применению для улучшения базовых поведенческих функций, снижения гиперактивности, тревожности, депрессии, ослабления сенсомоторных стробимпульсов, снижения болевого порога, а также улучшения памяти и/или когнитивных функций, и/или для лечения описанного здесь целевого заболевания (например, ожирения или расстройства ЦНС). Продукт для лечебного питания представляет собой пищевой продукт, приготовленный так, чтобы его можно было употреблять в пищу или вводить энтерально. Такой пищевой продукт обычно принимают под наблюдением врача в качестве специальной диетотерапии целевого заболевания, такого, как заболевание, описанное в настоящей заявке. В некоторых случаях, такую композицию для лечебного питания специально приготавливают и обрабатывают (в отличие от природного пищевого продукта, используемого в натуральном виде) для приема пациентами, нуждающимися в лечении (например, пациентами, которые страдают заболеванием, или которым требуется употребление продукта в качестве основного активного агента для ослабления симптомов заболевания или состояния с помощью специальной диетотерапии). В некоторых примерах, описанная здесь композиция для лечебного питания является не единственной из композиций, которые могут быть просто рекомендованы врачом как часть общей диеты для ослабления симптомов заболевания или состояния или для снижения риска их развития.

Любая из описанных здесь композиций для лечебного питания, содержащих одну или более молекул дубильной кислоты или ее солей и по меньшей мере один носитель (например, описанные в настоящей заявке), может быть приготовлена в форме жидкого раствора; порошка, брикета, облатки, суспензии в соответствующей жидкости или в подходящей эмульсии, как описано ниже. По меньшей мере один носитель, который может быть либо природным, либо синтетическим (не-природным) будет сообщать дубильной кислоте, присутствующей в композиции, одно или более из дополнительных свойств, таких как, например, стабильность, биодоступность и/или биологическая активность. Для приготовления композиции для лечебного питания могут быть использованы любые описанные здесь носители. В некоторых вариантах осуществления изобретения, композиция для лечебного питания может также включать один или несколько дополнительных ингредиентов, выбранных из группы, включающей, но не ограничивающейся ими, натуральные ароматизаторы, искусственные ароматизаторы, основные и дополнительные микроэлементы, обычные микроэлементы, витамины, овес, орехи, специи, молоко, яйца, соль, муку, лецитин, ксантановую камедь и/или подсластители. Композиция для лечебного питания может быть помещена в подходящий контейнер, который может дополнительно содержать по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент, такой как агент, описанный в настоящей заявке.

(E) Наборы

Настоящее изобретение также относится к наборам для использования в целях улучшения базовых поведенческих функций, снижения гиперактивности, тревожности, депрессии, ослабления сенсомоторных стробимпульсов, снижения болевого порога, а также улучшения памяти и/или когнитивных функций, и/или для лечения описанного здесь целевого заболевания (например, ожирения или расстройства ЦНС). Такие наборы могут включать один или более контейнеров, включающих описанную здесь композицию, содержащую дубильную кислоту, и необязательно один или более других терапевтических агентов, также описанных в настоящей заявке.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, набор может включать инструкции по применению в соответствии с любым из описанных здесь способов. Включенные в набор инструкции могут содержать, например, описание введения композиции, содержащей дубильную кислоту, и необязательно, описание введения другого(их) терапевтического(их) агента(ов) для улучшения базовых поведенческих функций, снижения гиперактивности, тревожности, депрессии, ослабления сенсомоторных стробимпульсов, снижения болевого порога, а также улучшения памяти и/или когнитивных функций, или для лечения описанного здесь целевого заболевания. Набор может дополнительно включать описание отбора индивидуума, нуждающегося в лечении, исходя из установления наличия у этого индивидуума данного заболевания или риска развития этого заболевания. В других вариантах осуществления изобретения, инструкции включают описание введения одного или более агентов согласно изобретению индивидууму с риском развития заболевания или индивидууму, нуждающемуся в улучшении базовых поведенческих функций, снижении гиперактивности, тревожности, депрессии, ослаблении сенсомоторных стробимпульсов, снижении болевого порога и улучшении памяти и/или когнитивных функций.

Инструкции по применению композиции, содержащей дубильную кислоту для достижения нужных терапевтических эффектов, обычно включают информацию о дозах, схемах введения доз и способе введения доз для нужного лечения. Контейнеры могут представлять собой унифицированные дозы, объемные упаковки (например, упаковки для многократного применения) или субъединичные дозы. Инструкции, поставляемые в наборах согласно изобретению, обычно представляют собой письменные инструкции на этикетке или на вкладыше в упаковку (например, на бумажном листе, вложенном в упаковку), но эти инстукции могут быть также представлены в электронном виде (например, инструкции, имеющиеся на магнитном или оптическом диске для хранения).

На этикетке или вкладыше в упаковку может быть указано, что композиция используется для достижения желаемых терапевтических целей. Инструкции могут быть представлены для осуществления любого из описанных здесь способов.

Наборы согласно изобретению находятся в соответствующей упаковке. Подходящая упаковка включает, но не ограничиваются ими, флаконы, бутыли, банки, гибкие упаковки (например, запечатанные пакеты Милара или пластиковые пакеты) и т.п. Также предполагается, упаковки могут быть использованы в комбинации с конкретным устройством, таким как ингалятор, устройство для интраназального введения (например, распылитель) или инфузионное устройство, такое как мининасос. Набор может иметь стерильное входное отверстие (например, контейнер может представлять собой пакет с раствором для внутривенного введения или флакон, имеющий пробку, прокалываемую иглой для подкожных инъекций). Контейнер может также иметь стерильное входное отверстие (например, контейнер может представлять собой пакет с раствором для внутривенного введения или флакон, имеющий пробку, прокалываемую иглой для подкожных инъекций).

Наборы могут, но необязательно, содержать и другие компоненты, такие как буферы и пояснительную информацию. Обычно, набор включает в себя контейнер и этикетку или вкладыш(ы), находящиеся в упаковке или наклеенные на упаковку. В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к промышленным изделиям, включающим содержимое наборов, описанных выше.

II. Применение композиций, содержащих дубильную кислоту

Любая из описанных здесь композиций, содержащих дубильные кислоты, могут быть использованы для улучшения основных поведенческих функций, снижения гиперактивности, тревожности, депрессии, устранения суицидальных наклонностей и/или поведения, ослабления сенсомоторных стробимпульсов, снижения болевого порога, а также улучшения памяти и/или когнитивных функций у индивидуума, нуждающегося в лечении. Такие композиции могут быть также использованы для лечения заболеваний или расстройств, ассоциированных с DAAO, таких как расстройство центральной нервной системы (например, расстройства, описанные в настоящей заявке). Эти композиции могут быть также использованы для лечения ожирения.

Используемый здесь термин «лечение» означает применение или введение композиции, включающей один или более активных агентов индивидууму, нуждающемуся в лечении, например, имеющему целевое заболевание или расстройство, симптом заболевания/расстройства или предрасположенность к данному заболеванию/расстройству, в целях лечения, исцеления, облегчения, ослабления, изменения динамики течения или устранения расстройства, симптомов заболевания или предрасположенности к заболеванию или расстройству.

Ослабление целевого заболевания/расстройства включает замедление развития или прогрессирования заболевания или уменьшение его тяжести. Ослабление заболевания необязательно требует проведения лечебных процедур. Используемый здесь термин «замедление» развития целевого заболевания или расстройства означает отсрочку, предотвращение, приостановку, задержку, стабилизацию и/или замедление прогрессирования заболевания. Это замедление может происходить с различными периодами времени, в зависимости от истории болезни и/или от индивидуума, нуждающегося в лечении. Метод, который «замедляет» или ослабляет развитие заболевания или задерживает начало этого заболевания, представляет собой метод, который уменьшает вероятность развития одного или более симптомов заболевания в определенный период времени и/или уменьшает тяжесть симптомов в определенный период времени по сравнению с эффектами без применения этого метода. Такое сравнение обычно проводят на основе клинических исследований с участием пациентов в количестве, достаточном для получения статистически значимого результата.

«Развитие» или «прогрессирование» заболевания означает начальные проявления и/или последующее прогрессирование заболевания. Развитие заболевания может быть обнаружено и диагностировано стандартными клиническими методами, хорошо известными специалистам. Однако развитие заболевания также означает прогрессирование, которое может быть недетектируемым. В соответствии с настоящим изобретением, термин «развитие» или «прогрессирование» означает биологическое течение симптомов. Термин «развитие» включает возникновение, рецидив и начало заболевания. Используемый здесь термин «начало» или «возникновение» целевого заболевания или расстройства включает начало развития и/или рецидив заболевания.

Для достижения любых описанных здесь нужных терапевтических эффектов, эффективное количество композиции, содержащей дубильную кислоту, может быть введено индивидууму, нуждающемуся в лечении, подходящим методом.

Используемые здесь термины «субъект», «индивидуум» и «пациент» являются синонимами и относятся к млекопитающему, нуждающемуся в лечении и/или подвергаемому лечению. Такими индивидуумами могут быть человек, а также другие млекопитающие, а в частности, млекопитающие, используемые в качестве лабораторных моделей человеческих заболеваний, например, мыши, крысы, кролики, собаки и т.п.

Человеком, который нуждается в лечении, может быть пациент, страдающий целевым заболеванием/расстройством, таким как расстройство ЦНС, ожирение, диабет или гиперлипидемия, или индивидуум с риском развития такого заболевания или расстройства или с подозрением на такое заболевание или расстройство. Индивидуум, страдающий целевым заболеванием/расстройством, может быть идентифицирован с помощью обычного медицинского обследования, например, лабораторных анализов, тестов на функционирование органов и/или поведенческих тестов. Индивидуум с подозрением на любое такое целевое заболевание/расстройство может иметь один или более симптомов этого заболевания/расстройства. Индивидуумом с риском развития заболевания/расстройства может быть индивидуум, у которого имеются один или более факторов риска этого заболевания/расстройства, например, генетический фактор. В некоторых случаях, таким человеком является ребенок с подозрением или риском развития расстройства ЦНС, встречающегося у детей, такого как гиперактивность, ассоциированная с дефицитом внимания (ADHD), аутизм, синдром Аспергера, синдром навязчивых состояний, депрессия, психоз, хронические боли и нарушение способности к обучению.

Описанные здесь способы и композиции могут быть применены для лечения расстройства ЦНС. Репрезентативными расстройствами ЦНС, которые могут быть подвергнуты лечению с применением описанных здесь способов и композиций, являются гиперактивность, ассоциированная с дефицитом внимания (ADHD), шизофрения, боли, депрессия, суицидальные наклонности и/или поведение, биполярное расстройство, тик, посттравматическое стрессовое расстройство, тревожное состояние, социальное тревожное состояние, паническое расстройство, аутизм, синдром Аспергера, болезнь навязчивых состояний, нарушение способности к обучению, синдром Туретта, легкое когнитивное расстройство, деменция, сосудистая деменция, нейродегенеративное расстройство (например, болезнь Альцгеймера или болезнь Паркинсона, лобно-височная деменция, болезнь Гентингтона), ночной энурез, блефароспазм, не-эпилептический припадок, психоз, мании, церебральная малярия и поведенческие и психологические симптомы деменции (ППСД).

Используемый здесь термин «эффективное количество» означает количество каждого активного агента (например, смеси дубильной кислоты или, по существу, гомогенной популяции дубильных кислот, описанных в настоящей заявке), необходимые для достижения терапевтического эффекта у индивидуума, либо отдельно, либо в комбинации с одним или более другими активными агентами, такими как один или более других описанных здесь терапевтических средств. В некоторых вариантах осуществления изобретения, терапевтический эффект означает ингибирование активности DAAO (например, по меньшей мере на 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или более) у индивидуума. В некоторых вариантах осуществления изобретения, терапевтическим эффектом является улучшение базовых поведенческих функций, снижение гиперактивности, тревожности, депрессии, ослабление сенсомоторных стробимпульсов, снижение болевого порога, а также улучшение памяти и/или когнитивных функций. В некоторых вариантах осуществления изобретения, терапевтическим эффектом является ослабление одного или более симптомов, ассоциированных с любыми описанными здесь расстройствами ЦНС. Альтернативно или дополнительно, терапевтическим эффектом является сохранение или снижение массы тела индивидуума.

Определение количества описанной здесь композиции, достаточного для достижения терапевтического эффекта, будет очевидно для специалиста в данной области. Как известно специалистам, эффективное количество может варьироваться в зависимости от конкретного состояния, подвергаемого лечению, тяжести состояния, индивидуальных параметров пациента, включая возраст, физическое состояние, размер, пол и массу, продолжительности лечения, характера сопутствующей терапии (если она проводится), конкретного пути введения, генетических факторов и т.п., входящих в компетенцию практического врача. Эти факторы хорошо известны специалистам и могут быть определены с помощью не более, чем рутинных экспериментов. Обычно и предпочтительно, чтобы максимальная доза отдельно используемых компонентов или их комбинаций составляла наибольшую безопасную дозу в соответствии с оценкой специалиста в данной области.

Определенный вклад в вычисление дозы могут вносить эмпирические факторы, такие, как время полужизни. Частота введения может быть определена и скорректирована в течение всего курса терапии, и, как правило, но не обязательно, она может быть оценена исходя из назначенного курса лечения и/или подавления и/или ослабления и/или замедления развития целевого заболевания/расстройства. Альтернативно, могут быть использованы, если это необходимо, препараты для пролонгированного высвобождения описанной здесь композиции. Различные препараты и устройства для достижения пролонгированного высвобождения известны специалистам.

Обычно, для введения любых композиций, репрезентативная суточная доза может составлять приблизительно от 0,1 мкг/кг и до 3 мкг/кг, 30 мкг/кг, 300 мкг/кг, 3 мг/кг, 30 мг/кг и 100 мг/кг или более, в зависимости от указанных выше факторов. При повторных введениях в течение нескольких дней или более, в зависимости от состояния, лечение продолжают до желаемого подавления симптомов или до тех пор, пока не будут достигнуты терапевтические уровни, достаточные для ослабления целевого заболевания или расстройства или его симптомов. Репрезентативная схема введения доз включает введение одной или более начальных доз с подходящими интервалаами в течение подходящего периода времени. При необходимости, индивидууму может быть введено множество поддерживающих доз с подходящими интервалами в течение подходящего периода времени. Однако, могут быть применены и другие схемы введения доз, в зависимости от характера фармакокинетического разложения, который должен быть установлен практическим врачом. Так, например, рассматривается введение дозы от одного до четырех раз в день или в неделю. В некоторых вариантах осуществления изобретения может быть использована доза, составляющая приблизительно от 3 мкг/мг до 2 мг/кг (например, приблизительно 3 мкг/мг, приблизительно 10 мкг/мг, приблизительно 30 мкг/мг, приблизительно 100 мкг/мг, приблизительно 300 мкг/мг, приблизительно 1 мг/кг и приблизительно 2 мг/кг). В некоторых вариантах осуществления изобретения, частота введения доз может составлять три раза в день, два раза в день, один раз в день, через день, один раз в неделю, один раз в 2 недели, один раз в 4 недели, один раз в 2 месяца или один раз в 3 месяца. Схема введения доз может варьироваться в зависимости от времени.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, для взрослого пациента с нормальным весом, вводимая доза может составлять приблизительно от 0,3 до 50,00 мг/кг/день (например, от 0,5 до 40 мг/кг/день, 1-30 мг/кг/день, 5-30 мг/кг/день или 10-20 мг/кг/день). Конкретная схема введения лекарственного средства, то есть доза, сроки и повторное введение будет зависеть от конкретного индивидуума и его истории болезни, а также от свойств отдельных агентов (таких как время полужизни и другие факторы, хорошо известные специалистам).

В соответствии с настоящим изобретением, подходящая доза описанной здесь композиции, содержащей дубильную кислоту, будет зависеть от конкретно используемой дубильной кислоты или смеси дубильных кислот, и/или другого активного ингредиента, от типа и тяжести заболевания/расстройства, от того, вводят ли композицию в профилактических или в терапевтических целях, от предшествующей терапии, истории болезни пациента и реакции на ингибитор DAAO, а также по усмотрению лечащего врача. Обычно, врач будет вводить композицию до тех пор, пока доза не будет давать желаемый результат.

Для введения композиции (например, фармацевтической композиции, композиции для здорового питания, натуральной композиции или композиции для лечебного питания) индивидууму могут быть применены стандартные методы, известные специалистам-медикам, в зависимости от типа заболевания, подвергаемого лечению, или области поражения. Эта композиция может быть также введена другими стандартными методами, например, перорально, парентерально, путем ингаляции спрея, местно, ректально, интраназально, трансбуккально, вагинально или через имплантированный резервуар. Используемый здесь термин «парентеральный» включает методы подкожной, внутрикожной, внутривенной, внутримышечной, внутрисуставной, внутриартериальной, интрасиновиальной, интрастернальной, интратекальной инъекции или инфузии, а также инъекции или инфузии в участок поражения и во внутричерепную область. Кроме того, введение индивидууму может быть осуществлено методами с использованием инъецируемых депо-препаратов и биологически разлагаемых материалов, вводимых в течение одной недели, полутора недель (или двух недель) 1, 3 или 6 месяцев. В некоторых примерах, фармацевтическую композицию вводят в глаза или в стекловидное тело.

Инъецируемые композиции могут содержать различные носители, такие как растительные масла, диметиллактамид, диметилформамид, этиллактат, этилкарбонат, изопропилмиристат, этанол и полиолы (глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль и т.п.). Для внутривенного введения, растворимые в воде антитела могут быть введены капельным методом посредством вливания фармацевтического препарата, содержащего дубильные кислоты и физиологически приемлемый наполнитель. Физиологически приемлемыми наполнителями могут быть, например, 5% декстроза, 0,9% физиологический раствор, раствор Рингера или другие подходящие наполнители. Внутримышечные препараты, например, стерильный препарат фармацевтически приемлемой растворимой соли дубильных кислот, могут быть растворены и введены в фармацевтическом наполнителе, таком как вода для инъекций, 0,9% физиологический раствор или 5% раствор глюкозы.

В одном из вариантов осуществления изобретения, композицию, содержащую дубильную кислоту, вводят методом сайт-специфической или нацеленной местной доставки. Примеры методов сайт-специфической или нацеленной местной доставки включают введение различных имплантируемых депо-источников композиций, содержащих дубильную кислоту, или катетеров для местной доставки, таких как инфузионные катетеры, постоянный катетер или катетер с иглой, синтетические трансплантаты, адвентициальное обертывание, шунты и стенты или другие имплантируемые устройства, сайт-специфические носители, прямые инъекции или прямое нанесение. См., например, публикацию РСТ No. WO 00/53211 и патент США. No. 5981568.

Эффективность лечения целевого заболевания/расстройства может быть оценена методами, хорошо известными специалистам.

III. Комбинированная терапия

Настоящее изобретение также относится к комбинированной терапии с использованием любых описанных здесь композиций, содержащих дубильную кислоту, и второго терапевтического агента, описанного в настоящей заявке. Используемый здесь термин «комбинированная терапия» включает введение этих агентов (например, композиции, содержащей дубильную кислоту и средства для лечения расстройства ЦНС или ожирения) последовательно, то есть, где каждый терапевтический агент вводят в различные периоды времени, а также введение этих терапевтических агентов, или по меньшей мере двух из этих агентов, в основном, одновременно. Последовательное или, по существу, одновременное введение каждого агента может быть осуществлено любым подходящим способом, включая, но не ограничиваясь ими, пероральное введение, внутривенное введение, внутримышечное введение, подкожное введение и прямое поглощение через ткани слизистой оболочки. Эти агенты могут быть введены одним и тем же способом или различными способами. Так, например, первый агент (например, композиция, содержащая дубильную кислоту) может быть введен перорально, а второй агент (например, средство для лечения расстройства ЦНС или ожирения) может быть введен внутривенно.

Используемый здесь термин «последовательно» означает, если это не оговорено особо, регулярную последовательность или регулярный порядок введения, например, если схема введения доз включает введение композиции, содержащей дубильную кислоту, и средства для лечения расстройства ЦНС или ожирения, то последовательная схема введения доз может включать введение композиции, содержащей дубильную кислоту, до, во время, почти во время или после введения средства для лечения расстройства ЦНС или ожирения, но оба эти агента будут введены в обычной последовательности или в обычном порядке. Термин «отдельно» означает, если это не оговорено особо, отдельное введение одного и другого препарата. Термин «одновременно», если это не оговорено особо, означает, что введение происходит или осуществляется в одно и то же время, то есть, агенты согласно изобретению вводят одновременно. Термин «по существу, одновременно» означает, что агенты вводят с интервалом в несколько минут (например, с интервалом в 10 минут), и включает совместное введение, а также последовательное введение, но только если это введение происходит подряд, в течение короткого периода времени (например, в течение периода времи, которое потребуется практическому врачу для отдельного введения двух соединений). Используемые здесь термины «одновременное введение» и «по существу, одновременное введение» являются синонимами. Последовательное введение означает раздельное введение описанных здесь агентов в различные периоды времени.

Комбинированная терапия может также охватывать введение описанных здесь агентов (например, композиции, содержащей дубильную кислоту и средства для лечения расстройства ЦНС или ожирения) в дополнительной комбинации с другими биологически активными ингредиентами (например, с другим средством для лечения расстройства ЦНС) или одновременно с проведением немедикаментозной терапии (например, хирургической операции).

Следует отметить, что для лечения целевого заболевания, любая комбинация композиции, содержащей дубильную кислоту, и второго терапевтического агента (например, средства для лечения расстройства ЦНС или ожирения) может быть введена в любой последовательности. Описанные здесь комбинации могут быть выбраны на основе ряда факторов, включая, но не ограничиваясь ими, эффективность ингибирования DAAO, улучшение базовых поведенческих функций, снижение гиперактивности, тревожности, депрессии, ослабление сенсомоторных стробимпульсов, снижение болевого порога, а также улучшение памяти и/или когнитивных функций и/или ослабление по меньшей мере одного симптома целевого заболевания или эффективность уменьшения побочных эффектов другого агента этой комбинации. Так, например, описанная здесь комбинированная терапия может снижать любые побочные эффекты, ассоциированные с каждым отдельным членом комбинации, например, побочный эффект, ассоциированный со вторым терапевтическим агентом.

IV. Общие методы

Настоящее изобретение может быть осуществлено, если это не оговорено особо, стандартными методами, применяемыми в области нейронаук, молекулярной биологии (включая рекомбинантные методы), микробиологии, биологии клетки, биохимии и иммунологии, описанными в литературе. Такие методы подробно описаны в таких публикациях, как Current protocol in Neuroscience (Developmental Editor: Eric Prager, Online ISBN: 9780471142300, DOI: 10.1002/0471142301); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995).

Очевидно, что специалист в данной области может применить настоящее изобретение исходя из вышеуказанного описания без излишнего экспериментирования. Следовательно, конкретные варианты осуществления изобретения приводятся лишь в иллюстративных целях, и никоим образом не рассматриваются как ограничение объема изобретения. Все цитируемые здесь публикации во всей своей полноте и во всех целях вводятся в настоящее описание посредством ссылки.

Пример 1. Идентификация активных групп дубильной кислоты и определение их эффективности для лечения расстройств центральной нервной системы (ЦНС)

Активность дубильных кислот для ингибирования D-аминокислота-оксидазы (DAAO) определяли следующим образом.

Активность DAAO определяли in vitro путем оценки ингибирования катаболизма известного субстрата, D-пролина. Сначала, к маточному раствору DAAO добавляли кофактор FAD (40 М). Для проведения анализа, потенциальные ингибиторы дубильной(ых) кислоты (кислот) смешивали с реакционной смесью, содержащей забуференный фосфатом физиологический раствор (137 мМ NaCl, 3 мМ KCl, 10 мМ Na₂HPO₄, 2 мМ NaH₂PO₄, рН 7,4), пероксидазу хрена (5 ед/мл), о-фенилендиамин (OPD, 0,03%) и 0,6 г человеческой (или свиной) DAAO, и инкубировали приблизительно в течение 5 минут. После предварительного инкубирования добавляли 40 мМ D-пролина в качестве субстрата, и реакционную смесь оставляли на 10 минут. OPD окисляли до 2,3-диаминофеназина (DAP) посредством пероксидазы хрена. Поглощение DAP измеряли на длине волны 453 нм с помощью спектрофотометрии. Анализ проводили путем серийных разведений ингибиторов с определением IC₅₀ и анализировали с помощью программы Prism (GraphPad Software). В этом анализе, данные спектрофотометрии использовали в стандартном уравнении для определения концентрации 50% ингибирования (IC₅₀). Все ферментативные анализы проводили при комнатной температуре в 96-луночном планшете.

Как показано на фигуре 1, дубильные кислоты, как группа, обнаруживали сильную активность в ингибировании D-аминокислота-оксидазы (DAAO) с величиной IC₅₀ 5,47 мкМ.

DAAO-ингибирующие активности подгрупп дубильных кислот (имеющих определенное число галлоильных групп) были определены следующим образом. Фракции дубильной кислоты, имеющие различное число галлоильных групп, разделяли на обращенно-фазовой колонке (LiChroprep^® RP-18) с подвижной фазой ацетонитрила и дистиллированной воды с градиентным элюированием. DAAO-ингибирующую активность каждой фракции дубильной кислоты при 80 мкМ (таблица 1) и 300 нМ (фигура 2, таблица 2) анализировали вышеописанным методом с использованием дистиллированной воды и 10%-ного водного раствора ДМСО в качестве «пустого» контроля и с использованием бензоата натрия в качестве позитивного контроля.

Таблица 1. DAAO-ингибирующая активность отдельных дубильных кислот

DAAO-ингибирующая активность Образцы (80 мкМ) (%) ср. кв.откл. H₂O 100,00 1,01 10% ДМСО 100,00 1,97 Бензоат натрия 38,05 0,46 Фракция 7 (2 галлоильных группы) 24,35 0,72 Фракция 9 (2 галлоильных группы) 26,42 0,20 Фракция 13 (3 галлоильных группы) 13,17 0,20 Фракция 15 (4 галлоильных группы) 6,71 0,14 Фракция 19 (5 галлоильных групп) 5,62 0,17 Фракция 20 (6 галлоильных групп) 5,63 0,30 Фракция 22 (7 галлоильных групп) 5,16 0,36 Фракция 24 (8-9 галлоильных групп) 7,45 0,13

В Таблице 1 показана DAAO-ингибирующая активность дубильных кислот с различным числом галлоильных групп. Дубильные кислоты с четырьмя или более галлоильными группами обнаруживали гораздо большую DAAO-ингибирующую активность по сравнению с дубильными кислотами, имеющими менее 4 галлоильных групп. Все анализы на DAAO осуществляли с использованием 80 мкМ дубильных кислот.

Таблица 2. DAAO-ингибирующая активность отдельных дубильных кислот

Образец (300 нМ) Относительная активность (%) ср. кв.откл. Контроль 100,00 4,74 3G 99,25 5,01 4G 83,67 4,55 5G 60,41 3,62 6G 54,19 1,81 7G 44,60 1,39 8G 48,23 1,17 9G 27,92 1,36 10G 19,25 5,13

В Таблице 2 показана DAAO-ингибирующая активность дубильных кислот с различным числом галлоильных групп при 300 нМ. 3 галлоильных группы имели слабую активность, а большее число галлоильных групп обнаруживало значительно большую DAAO-ингибирующую активность. (G=число галлоильных групп).

Ниже, в Таблице 3 показана IC50 (мкМ) для DAAO-ингибирующей активности дубильных кислот с различным числом галлоильных групп. IC₅₀ определяли для каждой дубильной кислоты с различным числом галлоильных групп, и было показано, что сильной активностью обладают дубильные кислоты с более, чем 3 галлоильными группами. Дубильные кислоты с четырьмя или более галлоильными группами обнаруживали гораздо меньшую IC50 и обладали более сильной DAAO-ингибирующей активностью, чем дубильные кислоты, имеющие менее 4 галлоильных групп. (G=число галлоильных групп).

Таблица 3. Активность отдельных дубильных кислот

3G 4G 5G 6G 7G 8G 9G 10G IC₅₀ (мкM) 8,474 1,576 0,496 0,375 0,256 0,337 0,240 0,215 Ср. кв.ош. 0,031 0,020 0,019 0,014 0,014 0,012 0,011 0,008

Следовательно, очистка дубильных кислот с более, чем 3 галлоильными группами, по сравнению со смесью дубильных кислот, способствует повышению активности, на что указывает снижение IC₅₀ (Таблица 4). Результаты показали, что дубильные кислоты, имеющие более, чем 3 галлоильных группы (например, 4-10), обладают более высокой DAAO-ингибирующей активностью, чем дубильные кислоты, имеющие 3 и менее галлоильных групп.

Таблица 4. Очистка дубильной кислоты с 4-9 галлоильными группами (4-9 G), по сравнению со смесью дубильных кислот, способствует повышению активности.

Образец Дубильные кислоты 4-9 G IC₅₀ (мкг/мл) 0,515 0,361 ср. кв.откл. 0,020 0,017

Пример 2. Влияние дубильной кислоты на основные поведенческие функции и когнитивную способность

Целью данного исследования является подтверждение влияния нескольких доз дубильных кислот на основной метаболизм, поведенческие функции и когнитивные функции. В этом эксперименте, массу тела, спонтанную двигательную активность, тревожное поведение, пространственное обучение и память, депрессивное поведение и сенсомоторную функцию каждой мыши оценивали после повторных инъекций или перорального введения дубильных кислот. Эти действия, как известно, опосредуются рецептором NMDA. (Wu et al., PNAS, 110 (36):14765-70 (2013); Furuya et al.,, Eur J Pharmacol, 364 (2-3): 133-140 [1999]; Lai et al., Curr Pharm Des, 20(32):5139-5150 [2014]; McLamb et al., Pharmacol Biochem Behav, 37(1):41-45 [1990]; Vardigan et al., Pharmacol Biochem Behav, 95(2):223-229 [2010]; Wiley et al, Eur J Pharmacol, 294(1):101-107 [1995]; Wu et al., Psychopharmacology (Berl), 177 (3): 256-263 [2005]). Репрезентативная иллюстрация данного исследования показана на фигуре 3.

Методы и материалы

Животные и условия их содержания

Самцов мышей C57BL/6J содержали группами (3-5 мышей на клетку) со свободным доступом к пище и воде в вентилируемых полисульфоном клетках (Alternative Design, AR, USA) в помещениях для животных. Группы животных содержались при суточном цикле день/ночь=12/12 часов при температуре 22 ± 2°C, и все поведенческие исследования проводили в темноте. Все животные, используемые в данном исследовании, являются взрослыми мышами (в возрасте по меньшей мере 2,5 месяцев).

Повторные инъекции дубильной кислоты

Дубильные кислоты закупали у Sigma (Sigma-Aldrich, USA). Взрослых мышей произвольно распределяли на три группы: (1) контрольную группу, (2) группу обработки дубильной кислотой (10 мг/кг) и (3) группу обработки дубильной кислотой (30 мг/кг), соответственно, где в качестве контроля использовали носитель (PBS), а обработку проводили с использованием дубильной кислоты в дозе 10 мг/кг и 30 мг/кг. За две недели до проведения поведенческих тестов, всем мышам каждый день внутрибрюшинно вводили (i.p.) либо контроль-носитель, либо дубильную кислоту. Массу тела каждой мыши, служащую показателем ее физического развития и метаболизма, регистрировали в день инъекции.

Исследование влияния повторных инъекций дубильной кислоты на основные поведенческие и когнитивные функции мышей

Всех мышей, обработанных либо контролем-носителем, либо дубильной кислотой, как описано выше, тестировали последовательно за 5 испытаний: (1) испытание «открытое поле» для проведения теста на спонтанную двигательную активность, (2) испытание на тревожное поведение в каскадном лабиринте плюс, (3) испытание на пространственное обучение и память в лабиринте Барнса, (4) испытание на депрессивное поведение по повисшему хвосту и (5) испытание на сенсомоторную функцию посредством предымпульсного ингибирования. Интервал времени между различными испытаниями составлял по меньшей мере 1 неделю. Для минимизации эффектов переноса, испытания осуществляли последовательно для того, чтобы более стрессовое испытание не предшествовало менее стрессовому. Эти процедуры описаны в публикации Current protocol in Neuroscience (Developmental Editor: Eric Prager, Online ISBN: 9780471142300, DOI: 10.1002/0471142301), содержание которой во всех целях вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Результаты

Физическое развитие и снижение массы

В период проведения повторных инъекций, масса тела у группы, которой вводили дубильную кислоту (10 мг/кг), возрастала, но на меньшем уровне, чем у контрольной группы, тогда как масса тела у группы, которой вводили дубильную кислоту (30 мг/кг), была значительно меньше, чем у контрольной группы. См. фигуру 4.

Спонтанная двигательная активность

Испытание «открытое поле» представляет собой новый общий метод оценки индуцированного исследовательского поведения и общей активности у мышей и крыс. В этом исследовании, мышей помещали в клетку PLEXIGLAS^® (37,5 см × 21,5 см × 18 см) при освещенности 50-65 люкс. Их спонтанную двигательную активность оценивали оценивали в течение 60 минут с использованием системы видеонаблюдения Ethovision (Noldus Information Technology, the Netherlands). Расстояние передвижения каждой мыши оценивали как индекс двигательной активности. Как показано на фигуре 5, дубильные кислоты способствовали уменьшению расстояния передвижения обработанных мышей в зависимости от дозы.

Был проведен аналогичный эксперимент, в котором мышам перорально вводили одну дозу 10 мг/кг, 30 мг/кг, 100 мг/кг, 300 мг/кг и 600 мг/кг, и их двигательную активность измеряли в течение 30 минут, 60 минут, 90 минут и 120 минут. При всех тестируемых дозах, дубильные кислоты вызывали снижение двигательной активности обработанных мышей по сравнению с мышами, обработанными контрольным носителем. Результаты представлены на фигуре 6.

Тревожное поведение

Каскадный лабиринт плюс, состоящий из двух открытых коридоров и двух закрытых коридоров, использовали для оценки инстинктивно беспокойного поведения. Лабиринт был приподнят на 50 см от пола и имел два открытых коридора (каждый длиной 50 см и шириной 10 см), два закрытых коридора плюс высокие стены 45 см без крыши (каждый длиной 50 см и шириной 10 см) и центральную платформу квадратной формы (10 × 10 см). Каждую мышь помещали на центральную платформу и поворачивали мордой по направлению к одному из закрытых коридоров для наблюдения при освещенности 50-65 люкс в течение 5 минут. Время, затраченное на прохождение каждой части лабиринта и пройденное расстояние каждой части лабиринта регистрировали с использованием системы видеонаблюдения Ethovision (Noldus Information Technology, the Netherlands).

Длительность аверсивного поведения для каждой группы показана на фигуре 7, панель A. По сравнению с контрольной группой, у группы, которой вводили дубильную кислоту (30 мг/кг), наблюдалось аверсивное поведение с продолжительностью на маргинальном уровне, тогда как у группы, которой вводили дубильную кислоту (10 мг/кг), такого поведения не наблюдалось. Расстояние до раздражающего объекта для каждой группы показано на фигуре 7, панель B. У группы, которой вводили дубильную кислоту (30 мг/кг), наблюдалось значительно большее расстояние до раздражающего объекта по сравнению с контрольной группой. Число оценок риска для каждой группы указано на фигуре 7, Панель C. По сравнению с контрольной группой, у обеих групп, которым вводили дубильную кислоту, наблюдались значительно меньшие степени риска (все р <0,05).

Пространственное обучение и память

Мышей тестировали в лабиринте Барнса для оценки их пространственного обучения и памяти, как описано ранее (Barnes, J. Comp. Physiol. Psychol., 93 (1): 74-104 [1979]). Испытательная аппаратура представляла собой приподнятую (на 50 см над полом) круглую пластину PLEXIGLAS^® (100 см в диаметре) с 20 отверстиями (7 см в диаметре, 7 см между отверстиями), равномерно расположенными по периметру. Мышей тренировали на платформе для идентификации побега из коробки (25 × 8 × 6 см), спрятанной за целевым отверстием, которое было выбрано в качестве аналога скрытой платформы при испытании в водном лабиринте Морриса. Расположение целевого отверстия было выбрано для каждой мыши, но произвольным образом. Мыши были первоначально размещены в центре пластины, покрытой непрозрачным цилиндром, и этот цилиндр удаляли через 10 секунд после начала испытания с одновременно подаваемым раздражающим звуком (440 Гц, 85 дБ) и включением света (100 люкс). Мыши были обучены так, чтобы они находили целевое отверстие в соответствии с окружающим визуальными подсказками и могли убежать от воздействия раздражающего звука в течение трех учебных испытаний, проводимых 3 дня подряд. Пространственную память измеряли с помощью «пробного теста». Все учебные испытания и пробные исследования были сняты на видео в течение 3 минут. Затем проводили анализ на запоздалось побега в обучающих испытаниях и вычисляли процент времени в различных квадрантах (мишени, влево, вправо и напротив) во время пробного теста. В пробном тесте, у группы, которой вводили дубильную кислоту (30 мг/кг), наблюдалось явное предпочтение целевой зоны, тогда как у других групп, этого не наблюдалось, как показано на фигуре 8.

Основной метаболизм, поведенческие функции и когнитивные модели поведения у мышей, обработанных дубильными кислотами, вводимыми в несколько инъекций в различных дозах, исследовали в экспериментах, описанных в Примере 2. Таким образом, было сделано три основных вывода.

Во-первых, масса тела мышей, обработанных дубильной кислотой (30 мг/кг), уменьшилась. У этой группы мышей также наблюдалась более низкая спонтанная двигательная активность в открытом поле. Испытания в открытом поле проводили для проверки двигательной активности, индуцированной новой средой, и общих двигательных функций (Powell et al., Biol Psychiatry, 59(12):1198-1207 [2006]; van den Buuse, Schizophr Bull, 36(2):246-270 [2010]). Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, авторы лишь отмечают, что пониженная двигательная активность у мышей, которым вводили повторные инъекции дубильных кислот, может быть обусловлена более быстрым привыканием к новой среде.

Во-вторых, тревожное поведение у мышей, обработанных дубильной кислотой, в каскадном лабиринте плюс, снижалось. Испытание в каскадном лабиринте плюс представляет собой мышиную модель для скринига предполагаемого анксиолитических или анксиогенных соединений (Rodgers et al., Braz J Med Biol Res, 30(3):289-304 [1997]; Steimer, Dialogues Clin Neurosci, 13(4):495-506 [2011]). Увеличение времени, затраченного на прохождение открытых коридоров, указывает на меньшую тревогу в лабиринте плюс. В этом эксперименте, у мышей, которым вводили повторные инъекции, наблюдалось не только увеличение времени, затрачиваемого на прохождение открытых коридоров, но также и увеличение расстояния перемещения в открытых коридорах и снижние оценки риска. Эти результаты подтверждают, что повторные инъекции дубильной кислоты приводят к ослаблению тревожного поведения в каскадном лабиринте плюс.

В-третьих, у мышей, которым вводили повторные инъекции дубильной кислоты, наблюдалось улучшение пространственной памяти в лабиринте Барнса. Лабиринт Барнса используется в испытаниях для оценки когнитивной функции у мышей, особенно в испытаниях на пространственное обучение и память (Rosenfeld et al., J Vis Exp, (84):e51194 [2014]). Исходя из более глубокого понимания конкретных когнитивных функциональных областей проводится все большее число клинических исследований, где подчеркивается влияние когнитивных нарушений в развитии многих психических заболеваний, включая шизофрению, деменцию, болезнь Альцгеймера, депрессию и синдром навязчивых состояний (OCD) и т.п. (Kirova et al., Biomed Res Int, 748212 [2015]; Lai et al., Curr Pharm Des, 20(32):5139-5150 [2014]; Okasha et al., Acta Psychiatr Scand, 101(4):281-285 [2000]; Rosenblat et al., Int J Neuropsychopharmacol, pii: pyv082 [2015]; Terry et al., Ann Neurol, 30(4):572-580 [1991]). В пробном тесте (в фазе восстановления памяти), у группы, которой вводили дубильную кислоту (30 мг/кг на группу), наблюдалось предпочтение целевой зоны. Эти данные со всей очевидностью показали, что повторные инъекции высокой дозы дубильной кислоты приводили к улучшению когнитивной функции у нормальных мышей. Кроме того, передача сигнала рецептора NMDA, рассматривается как важная роль в процессе обучения и консолидации памяти (Newcomer et al., Hippocampus, 11(5):529-542 [2001]; Rezvani, Animal Models of Cognitive Impairment, 1(4) [2006]). Таким образом, повторные инъекции дубильной кислоты могут улучшать когнитивную функцию посредством передачи NMDA-сигнала у мышей.

Таким образом, результаты этого исследования показали, что дубильные кислоты могут быть эффективными в снижении массы и улучшении базовой поведенческой функции, снижении гиперактивности, тревожности, памяти и/или когнитивного поведения. Так, например, большой процент детей с ADHD имеет коморбидное расстройство обучения, которое также может быть устранено с помощью дубильной кислоты, учитывая ее влияние на обучение и память.

Пример 3. Защитное и протективное действие инъекций дубильной кислоты на МК801-обработанных мышей

Целью этого эксперимента является оценка потенциальных механизмов действия дубильных кислот при лечении расстройств ЦНС с использованием MK801, то есть, хорошо известного антагониста рецептора NMDA. Дубильные кислоты и МК801 вводили мышам путем внутрибрюшинной (i.p.) инъекции перед проведением поведенческих тестов (например, в открытом поле и методом предымпульсного ингибирования), соответственно.

Протокол эксперимента

Этот эксперимент был разработан для характеризации механизма действия дубильной кислоты. МК801, также известный как дизоцилпин, представляет собой антагонист рецептора NMDA (Kovacic et al., Oxid Med Cell Longev, 3(1):13-22 [2010]). Он был использован во многих аспектах симптомов заболеваний центральных нервной системы, индуцированных недостаточной функцией NMDA, включая стереотипное поведение, ангедонию, нарушение способности к обучению и нарушение памяти, ухудшение рабочей памяти и аномальные сенсомоторные функции (Furuya et al., Eur J Pharmacol, 364(2-3):133-140 [1999]; McLamb et al., Pharmacol Biochem Behav, 37(1):41-45 [1990]; Vardigan et al., Pharmacol Biochem Behav, 95(2):223-229 [2010]; White et al., Pharmacol Biochem Behav, 59(3):613-617 [1998]; Wu et al., Psychopharmacology (Berl), 177(3):256-263 [2005]). Целью этих экспериментов является оценка влияния дубильных кислот на мышей с недостаточной функцией рецептора NMDA. Репрезентативный протокол эксперимента представлен на фигуре 9.

Методы и материалы

Животные и условия их содержания

Самцов мышей C57BL/6J содержали группами (3-5 мышей на клетку) со свободным доступом к пище и воде в вентилируемых полисульфоном клетках (Alternative Design, AR, USA) в помещениях для животных. Группы животных содержались при суточном цикле день/ночь=12/12 часов при температуре 22 ± 2°C, и все поведенческие исследования проводили в темноте. Все животные, используемые в данном исследовании, являются взрослыми мышами (в возрасте по меньшей мере 2,5 месяцев).

Введение лекарственного средства

Мыши были произвольно распределены на шесть групп:

Группа 1: контроль, PBS+физиологический раствор;

Группа 2: PBS+МК801;

Группа 3: дубильная кислота (10 мг/кг)+МК801;

Группа 4: дубильная кислота (15 мг/кг)+МК801;

Группа 5: дубильной кислоты (20 мг/кг)+МК801; и

Группа 6: дубильная кислота (30 мг/кг)+МК801.

Каждой мыши в группах 2-6 вводили однократную дозу МК-801 (Sigma-Aldrich, USA), растворенного в нормальном физиологическом растворе (0,1 мг/кг, i.p.) за 20 минут до проведения поведенческих тестов. Каждой мыши в группах 3-6 вводили однократную дозу дубильных кислот (Sigma-Aldrich, USA), растворенных в PBS, 10, 15, 20 или 30 мг/кг, i.p., за 20 минут до введения МК801.

Оценка влияния введения дубильной кислоты на мышей, обработанных МК801

Все мыши в данном исследовании были протестированы в испытании «открытое поле» и методом предымпульсного ингибирования, где период времени между этими двумя испытаниями составлял по меньшей мере 1 неделю. Дополнительную группу мышей использовали для оценки влияния различных источников дубильной кислоты на предымпульсное ингибирование.

Результаты

Влияние дубильной кислоты на двигательную активность мышей, обработанных MK801

По сравнению с контрольной группой (группа 1), у группы, обработанной МК801 (группа 2), наблюдалась двигательная гиперактивность. У группы, которой вводили дубильную кислоту в дозе 10, 20 и 30 мг/кг (группы 3, 5 и 6), наблюдалась более низкая двигательная активность, чем у контрольной группы, как показано на фигуре 10. По сравнению с группой, обработанной МК801 (группа 2), у всех групп, которым вводили дубильные кислоты, наблюдалось снижение двигательной активности, как показано на фигуре 10.

Влияние дубильных кислот на предымпульсное ингибирование у мышей, обработанных MK801 - сенсомоторная функция

Невнимательность имеет тенденцию быть автоматической и быстрой и действует за пределами сознательного восприятия, тогда как сконцентрированное внимание имеет ограниченные ресурсы, требует больше усилий и проявляется более медленно. Общим показателем невнимательности является предымпульсное ингибирование. Эта парадигма широко рассматривалась для мышиных моделей нескольких психических заболеваний (например, шизофрении, болезни Альцгеймера), так как симптомы этих заболеваний проявляются так же, как и у человека (Arguello et al., Neuron, 52(1):179-196 [2006]; Lai et al., Curr Pharm Des, 20(32):5139-5150 [2014]; McCool et al., Brain Res, 994(1):99-106 [2003]).

Предымпульсное ингибирование используется в качестве показателя сенсомоторной функции, достигаемой с использованием аппарата SR-LAB, вызывающего испуг (San Diego Instruments, San Diego, CA, USA). При фоновом шуме 72 дБ, каждый сеанс состоял из 5-минутного периода аккумуляции с последующими 64 испытаниями в четырех блоках. Испытание с одним импульсом (PA) длилось 40 мс, со взрывом белого шума в 120 дБ. В испытаниях с предымпульсом (рр)+импульс, предымпульсный раздражитель белого шума 20 мс 78 дБ (PP6), 82 дБ (PP10) и 90 дБ (PP18) подавались в течение 100 мс до подачи 40 мс-импульса 120 дБ. Испытание без раздражителя (NS) проводили только при фоновом шуме. Начальный и последний блоки состояли из шести испытаний PA, соответственно. Два средних блока состояли из PA, PP+импульс и испытание NS. Эти испытания проводили псевдослучайным образом и были разделены почти одинаковыми интервалами в среднем по 15 секунд, (варьирующимися от 10 до 20 с). Процент предымпульсного ингибирования оценивали по следующей формуле: % PPI=100 × [(оценка PA) - (оценка pp-P)]/(оценка PA), где оценка PA означает усредненную величину PA в срединих блоках. Дубильная кислота способствовала улучшению предымпульсного ингибирования, как указано на фигурах 11 и 12 и зависела от дозы, как показано на фигуре 11.

При предымпульсной интенсивности 78 дБ, никаких существенных различий для 6 групп не обнаруживалось. При предымпульсной интенсивности 82 дБ, группы, которым вводили МК801 и дубильную кислоту (10 мг/кг), не отличались от контрольной группы. По сравнению с контрольной группой, у группы, которой вводили дубильную кислоту (15 мг/кг), наблюдался несколько более высокий процент предымпульсного ингибирования, а у групп, которым вводили дубильную кислоту (20 мг/кг) и дубильную кислоту (30 мг/кг), наблюдались значительно более высокие проценты предымпульсного ингибирования. Что касается предымпульсной интенсивности при 90 дБ, то по сравнению с контрольной группой, у групп, которым вводили дубильную кислоту (15 мг/кг), дубильную кислоту (20 мг/кг) и дубильную кислоту (30 мг/кг), наблюдались значительно более высокие проценты предымпульсного ингибирования по сравнению с контрольной группой, но такие результаты не наблюдались у групп, которым вводили МК801 и дубильную кислоту (10 мг/кг), как показано на фигуре 11.

Влияние другого источника дубильной кислоты на предымпульсное ингибирование у мышей, обработанных МК801

Целью этого эксперимента является оценка влияния различных источников дубильных кислот на предымпульсное ингибирование. В этом исследовании были использованы дубильные кислоты, закупленные у компании Sigma-Aldrich (источник А) и у Spectrum, USA (источник В) при 15 мг/кг.

Что касается предымпульсной интенсивности 78 дБ и 82 дБ, то у мышей, обработанных дубильными кислотами от двух источников, у контрольной группы или у группы, обработанной МК801, каких-либо значимых различий не наблюдалось. Что касается предымпульсной интенсивности 90 дБ, то у обеих групп, обработанных дубильной кислотой, наблюдались значительно более высокие проценты предымпульсного ингибирования по сравнению с контрольной группой, но у группы, обработанной МК801, таких результатов не наблюдалось. Результаты, полученные у мышей, обработанных дубильными кислотами от источника А и источника B, были одинаковыми, как показано на фигуре 12.

Хотя симптомы психоза являются сложными для наблюдения и измерения на животных-моделях, однако, может быть протестировано поведение, родственное психозу, включая психомоторное возбуждение, симптомы возбуждения, сенсорное стробирование и чувствительность к психомиметикам, таким как МК801 (Arguello et al., Neuron, 52(1): 179-196 [2006]; Lai et al., Curr Pharm Des, 20(32):5139-5150 [2014]). У мышей, параметры, связанные с двигательной гиперактивностью и изменением двигательной активности, индуцированным новым объектом (либо нарушение привыкания к новому объекту, либо повышенное исследовательское поведение) в испытании «открытое поле», могут быть использованы для оценки психомоторного возбуждения и симптомов возбуждения, соответственно (Lai et al., Curr Pharm Des, 20(32):5139-5150 [2014]; Powell et al., Biol Psychiatry, 59(12):1198-1207 [2006]; Vardigan et al., Pharmacol Biochem Behav, 95(2):223-229 [2010]). В настоящем исследовании, введение дубильной кислоты путем i.p.-введения или перорального (р.о.) введения, приводило к отмене/блокированию МК801-индуцированной двигательной гиперактивности в открытом поле. Этот результат показал, что дубильные кислоты являются потенциальным терапевтическим средством для лечения симптомов психоза (например, бреда и галлюцинаций).

В испытании посредством предымпульсного ингибирования, 15 мг/кг дубильной кислоты было достаточно для повышения сенсомоторной функции у мышей, обработанных МК-801. Кроме того, различные источники дубильной кислоты не влияют на усиление сенсомоторной функции в испытании посредством предымпульсного ингибирования. Дефицит в предымпульсном ингибировании в мышиных моделях обычно рассматривается как шизофренический эндофенотип, так как такой дефицит может быть аналогичным образом идентифицирован у человека (Arguello et al., Neuron, 52(1):179-196 [2006]; Geyer et al., Schizophr Bull, 13(4):643-668 [1987]; Lai et al., Curr Pharm Des, 20(32):5139-5150 [2014]). Дефицит в предымпульсном ингибировании был также обнаружен и при других заболеваниях центральной нервной системы, включая расстройство аутистического спектра (McAlonan et al., Brain, 125(Pt 7):1594-1606 [2002]), синдром навязчивых состояний, болезнь Гентингтона, ночной энурез, дефицит внимания, синдром Туретта, блефароспазм, не-эпилептические припадки, синдром посттравматического стресса (Braff et al., Psychopharmacology (Berl), 156(2-3):234-258 [2001]), паническое расстройство, биполярное расстройство, слабую деменцию Альцгеймера, деменцию, ассоциированную с тельцами Леви и комбинированное расстройство, включающее гиперактивность при дефиците внимания и тики (Giakoumaki et al., Biol Psychiatry, 62(12):1418-1422 [2007]; Ludewig et al., Depress Anxiety, 15(2):55-60 [2002]; Perriol et al., J Neurol Neurosurg Psychiatry, 76(1):106-108 [2005]; Ueki et al., Psychiatry Clin Neurosci, 60(1):55-62 [2006]).

Таким образом, дубильные кислоты являются перспективным терапевтическим средством для лечения различных расстройств ЦНС. Кроме того, дубильные кислоты уменьшают как спонтанную, так и МК-801-индуцированную гиперактивность, что указывает на то, что дубильные кислоты могут служить в качестве терапевтического средства для ослабления симптомов ADHD и ассоциированных с ним расстройств.

Кроме того, было обнаружено, что дубильные кислоты могут снижать массу тела у обработанных ими мышей, что свидетельствует о том, что дубильные кислоты являются эффективными для снижения массы тела и/или для лечения ожирения и связанных с ним расстройств.

Пример 4. Защитное и протективное действие перорального введения дубильной кислоты на МК801-обработанных мышей

Целью этого эксперимента является оценка потенциальных механизмов действия дубильных кислот при лечении расстройств ЦНС с использованием MK801, то есть, хорошо известного антагониста рецептора NMDA. Дубильные кислоты и МК801 вводили мышам перорально (p.o.) через зонд и путем внутрибрюшинной (i.p.) инъекции перед проведением поведенческих тестов (например, в открытом поле, методом предымпульсного ингибирования, в лабиринте Барнса и в испытании на предпочтение сахарозы), соответственно.

Протокол эксперимента

Этот эксперимент был разработан для характеризации механизма действия дубильной кислоты. МК801, также известный как дизоцилпин, представляет собой антагонист рецептора NMDA (Kovacic et al., Oxid Med Cell Longev, 3(1):13-22 [2010]). Он был использован во многих аспектах симптомов заболеваний центральной нервной системы, индуцированных недостаточной функцией NMDA, включая стереотипное поведение, ангедонию, нарушение способности к обучению и нарушение памяти, ухудшение рабочей памяти и аномальные сенсомоторные функции (Furuya et al., Eur J Pharmacol, 364(2-3):133-140 [1999]; McLamb et al., Pharmacol Biochem Behav, 37(1):41-45 [1990]; Vardigan et al., Pharmacol Biochem Behav, 95(2):223-229 [2010]; White et al., Pharmacol Biochem Behav, 59(3):613-617 [1998]; Wu et al., Psychopharmacology (Berl), 177(3):256-263 [2005]). Целью этих экспериментов является оценка влияния дубильных кислот на мышей с недостаточной функцией рецептора NMDA. Репрезентативный протокол эксперимента представлен на фигуре 13.

Методы и материалы

Животные и условия их содержания

Самцов мышей C57BL/6J содержали группами (3-5 мышей на клетку) со свободным доступом к пище и воде в вентилируемых полисульфоном клетках (Alternative Design, AR, USA) в помещениях для животных. Группы животных содержались при суточном цикле день/ночь=12/12 часов при температуре 22 ± 2°C, и все поведенческие исследования проводили в темноте. Все животные, используемые в данном исследовании, являются взрослыми мышами (в возрасте по меньшей мере 2,5 месяцев).

Введение лекарственного средства

Мыши были произвольно распределены на пять групп:

Группа 1: контроль, PBS+физиологический раствор;

Группа 2: PBS+МК801;

Группа 3: дубильная кислота (10 мг/кг)+МК801;

Группа 4: дубильная кислота (30 мг/кг)+МК801;

Группа 5: дубильная кислота (100 мг/кг)+МК801.

Каждой мыши в группах 2-5 вводили однократную дозу МК-801 (Sigma-Aldrich, USA), растворенного в нормальном физиологическом растворе 0,1 мг/кг, для испытания «в открытом поле» и в лабиринте Барнса, и 0,2 мг/кг, для испытания методом предымпульсного ингибирования, и в тесте на предпочтение сахарозы, i.p.) за 20 минут до проведения поведенческих тестов. Каждой мыши в группах 2-5 вводили однократную дозу дубильных кислот (Sigma-Aldrich, USA), растворенных в PBS, 10, 30 или 100 мг/кг, p.o. за 20 минут до введения МК801.

Результаты

Оценка влияния введения дубильной кислоты на мышей, обработанных МК801

Все мыши в данном исследовании были протестированы в испытании «открытое поле», методом предымпульсного ингибирования, в лабиринте Барнса и в тесте на предпочтение сахарозы, где период времени между этими испытаниями составлял по меньшей мере 1 неделю.

Влияние перорального введения дубильной кислоты на двигательную активность MK801-обработанных мышей

В этом испытании, дубильные кислоты вводили перорально за 20 минут до инъекции МК801 (0,1 мг/кг). Как показано на фигуре 14, МК801 индуцировала гиперактивность, а дубильные кислоты предотвращали MK801-индуцированную гиперактивность в зависимости от дозы.

Влияние дубильных кислот на предымпульсное ингибирование у МК801-обработанных мышей

По сравнению с контрольной группой, МК801 (0,2 мг/кг) индуцировала устойчивый дефицит предымпульсного ингибирования. При интенсивности предымпульсов 78 дБ и 82 дБ, дубильная кислота (10, 30 и 100 мг/кг) не устраняла/не блокировала MK801-индуцированный дефицит предымпульсного ингибирования. В случае интенсивности предымпульса 90 дБ, по сравнению с МК801-обработанной группой, дубильная кислота (30 мг/кг) и дубильная кислота (100 мг/кг) оказывала значительное блокирующее/протективное действие на МК801-индуцированный дефицит предымпульсного ингибирования. Однако, такие результаты не наблюдались у групп, обработанных МК801 и дубильной кислотой (10 мг/кг), как показано на фигуре 15.

Влияние дубильных кислот на пространственное обучение и память у MK801-обработанных мышей

В испытании в лабиринте Барнса, дубильная кислота улучшала восстановление памяти у МК801-обработанных мышей в зависимости от дозы, как показано на фигуре 16.

Влияние дубильных кислот на депрессивное поведение (ангедонию) у МК-801-обработанных мышей

По сравнению с контрольной группой, у группы МК801-обработанных мышей не обнаруживалось предпочтения к раствору сахарозы (2%). По сравнению с группой МК801-обработанных мышей, у мышей, обработанных дубильной кислотой, 30 мг/кг и 100 мг/кг, наблюдалось блокирующее/протективное действие на МК801-индуцированное поведение депрессивного типа (ангедонию), как показано на фигуре 17.

Пример 5. Аналгезирующие эффекты дубильной кислоты у мышей

Целью этого эксперимента является оценка аналгезирующих эффектов дубильной кислоты у мышей. Дубильные кислоты вводили мышам путем внутрибрюшинных (i.p.) инъекций перед проведением поведенческих тестов (т.е., теста фон Фрея).

Протокол эксперимента

Другую группу использовали для теста фон Фрея (типичного анализа на болевые ощущения). Пороги отдергивания лап каждой мыши оценивали до введения лекарственных средств и через 30, 60, 90 и 120 минут после введения лекарственных средств, как показано на фигуре 22.

Методы и материалы

Животные и условия их содержания

Самцов мышей C57BL/6J содержали группами (5 мышей на клетку) со свободным доступом к пище и воде в вентилируемых полисульфоном клетках (Alternative Design, AR, USA) в помещениях для животных. Группы животных содержались при суточном цикле день/ночь=12/12 часов при температуре 22 ± 2°C, и все поведенческие исследования проводили в темноте. Все животные, используемые в данном исследовании, являются взрослыми мышами (в возрасте по меньшей мере 8 недель).

Введение лекарственного средства

Мыши были произвольно распределены на две группы:

Группа 1: контроль, PBS; и

Группа 2: дубильная кислота (15 мг/кг).

Каждой мыши в группе 1 вводили однократную дозу PBS в качестве контроля-носителя путем i.p.-инъекции. Каждой мыши в группе 2 вводили однократную дозу дубильных кислот (Merck Millipore, Germany), растворенных в 15 мг/кг PBS, i.p.

Результаты

Аналгезирующие эффекты инъекции дубильной кислоты у мышей

По существу, никаких различий между группами обнаружено не было. По сравнению с PBS-контролем, болевой порог у группы 2 был значительно выше через 30 минут, 60 минут и 90 минут после инъекции лекарственного средства, как показано на фигуре 19.

Пример 6. Сравнение различных композиций дубильной кислоты

Было проведено сравнение состава и активности, ингибирующей D-аминокислота-оксидазу (DAAO), для 3 коммерчески доступных дубильных кислот от разных поставщиков.

Протокол эксперимента

Состав 3 коммерчески доступных дубильных кислот определяли с помощью ВЭЖХ, а их DAAO-ингибирующие активности определяли методом, описанным в примере 1.

Методы и материалы

Условия ВЭЖХ

- Оборудование: Колонка Agilent 1260: Atlantis T3 150* 4,6 мм, 30 мкм

- Подвижная фаза А: вода+0,1% трифторуксусная кислота

- Подвижная фаза B: метанол: ацетонитрил 2:8 (об/об)

- Температура колонки: 25°С

- Детектор: DAD 280 нм

- Скорость потока: 1,5 мл/мин

- Препарат образца: 10 мг/мл

- Объем впрыска: 10 мкл

- Разбавитель: вода

- Градиент:

Время (мин) 0 10 25 26 34 36 40 A% 100 81 78 75 73 5 5 B% 0 19 22 25 27 95 95

Результаты

Композиции:

ВЭЖХ-хроматограммы 3 дубильных кислот от различных растительных источников представлены на фигурах 20-22.

DAAO-ингибирующая активность:

DAAO-ингибирующая активность 3 коммерчески доступных дубильных кислот и их состав представлены в таблице 5.

Таблица 5. Ингибирующая активность 3 коммерчески доступных дубильных кислот от различных растительных источников

Растительный источник Quercus infectoria Rhus chinensis Rhus chinensis Поставщик Поставщик #1 Поставщик #2 Поставщик #3 IC₅₀ (мкг/мл) 0,601 0,424 0,336 IC₅₀ ср. кв.ош. 0,007 0,005 0,006 2-5G% 50,86% 16,32% 7,25% 6-12G% 49,14% 83,68% 92,76% 8-12G% 21,17% 61,19% 78,16%

Дубильные кислоты, экстрагированные из Rhus chinensis, имеют гораздо больший процент 6-12G и гораздо меньший процент 2-5G, чем дубильные кислоты, экстрагированные из Quercus infectoria.

Пример 7. Экстракция дубильной кислоты из чернильных орешков различных растительных источников для сравнения

Дубильные кислоты были экстрагированы из чернильных орешков различных растительных источников, как указано, и была исследована их активность, ингибирующая D-аминокислота-оксидазу (DAAO).

Методы

Метод измельчения чернильных орешков

Чернильные орешки, продуцирующие дубильную кислоту и выделенные из подходящего растительного источника (см. ниже Таблицу 6), измельчали с помощью механической дробилки и просеивали через сито 40 меш с получением тонкодисперсного порошка чернильных орешков.

Метод экстракции тонкодисперсного порошка чернильных орешков

Тонкодисперсный порошок чернильных орешков (20,0 г) помещали в 200,0 мл подходящего растворителя (например, ацетона, ацетонитрила, метилэтилкетона (МЕК), этилацетата (EtOAc), этанола (EtOH), изопропанола, тетрагидрофурана или 1,4-диоксана). Полученную таким образом смесь перемешивали либо при комнатной температуре, либо при 40°С в течение ночи. Полученный раствор фильтровали, и фильтрат концентрировали в вакууме с получением композиции, содержащей дубильные кислоты.

Результаты

DAAO-ингибирующая активность:

DAAO-ингибирующая активность дубильных кислот, экстрагированных из чернильных орешков различных растительных источников вышеупомянутым методом, приводится в Таблице 6. Сравнение различных диаметров чернильных орешков и их IC₅₀ DAAO проиллюстрировано на фигуре 23.

Таблица 6. Ингибирующая активность дубильных кислот, экстрагированных из чернильных орешков различных растительных источников

Растительный источник Quercus infectoria Rhus chinensis Rhus chinensis Rhus potaninii Rhus potaninii Диаметр чернильных орешков 3-4 см 3-4 см 6-7 см 4-5 см 6-7 см Экстрагирующий растворитель MEK MEK MEK MEK MEK Температура экстракции КТ КТ КТ КТ КТ IC₅₀ (мкг/мл) 0,679 0,393-0,424 0,441-0,553 0,560-0,724 0,718

Как показано в Таблице 6 и на фигуре 23, чернильные орешки от Rhus chinensis или Rhus potaninii имеют более низкие IC₅₀ DAAO (более сильное ингибирование), чем чернильные орешки от Quercus infectoria. Кроме того, более мелкие чернильные орешки от Rhus chinensis (диаметром 3-4 см) и Rhus potaninii (диаметром 4-5 см) имеют более низкие IC₅₀ по сравнению с более крупными чернильными орешками (диаметром 6-7 см), происходящими от тех же самых растительных источников.

Пример 8. Методы обогащения дубильной кислоты, экстрагированной из чернильных орешков от различных растительных источников

Дубильные кислоты, экстрагированные из чернильных орешков каждого описанного здесь растительного источника, обогащали как описано ниже. Была исследована их DAAO-ингибирующая активность.

Метод обогащения 1

Тонкодисперсный порошок чернильных орешков (20,0 г) помещали в 200,0 мл подходящего растворителя (ацетона, метилэтилкетона, этилацетата или этанола) и полученную таким образом смесь перемешивали либо при комнатной температуре, либо при 40°С в течение 12 часов. Полученный раствор фильтровали, и фильтрат концентрировали в вакууме с получением композиции, содержащей дубильные кислоты. Композицию смешивали с 50,0 мл 50- или 30%-ного раствора метилэтилкетона/гексана (50% или 30% метилэтилкетона в гексане). Полученную таким образом смесь дополнительно перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов, и полученные два органических слоя разделяли. Масляный слой (нижний слой) концентрировали в вакууме с получением неочищенного твердого вещества. Твердое вещество растворяли в 50,0 мл подходящего растворителя (ацетона, метилэтилкетона, этилацетата или этанола), и полученный раствор смешивали с углем (1,6 г). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов и к смеси добавляли CaSO₄ или MgSO₄ (2,5 г). Полученную таким образом смесь дополнительно перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут и фильтровали через слой целита, а затем промывали подходящим растворителем (ацетоном, метилэтилкетоном, этилацетатом или этанолом) (100 мл × 2) и концентрировали в вакууме. Полученный твердый продукт (содержащий дубильные кислоты) растворяли в ацетоне или в этилацетате (12,0 мл), а затем полученный таким образом раствор перемешивали и по каплям смешивали с CH₂Cl₂ (72,0 мл). Полученное таким образом твердое вещество собирали путем фильтрации и сушили в вакууме при 40°С в течение 2 часов с получением обогащенной твердой дубильной кислоты.

Метод обогащения 2

Тонкодисперсный порошок чернильных орешков (20,0 г) помещали в 200,0 мл подходящего растворителя (ацетона, метилэтилкетона, этилацетата, этанола) и перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов. Полученный таким образом раствор фильтровали, и собранный фильтрат смешивали с 200,0 мл гексана. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов, и полученные два органических слоя разделяли. Масляный слой (нижний слой) концентрировали в вакууме и полученное таким образом твердое вещество растворяли в 50,0 мл подходящего растворителя (ацетона, метилэтилкетона, этилацетата, этанола и т.п.). Полученный раствор смешивали с углем (1,6 г), а затем снова перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов. Полученную таким образом смесь снова смешивали с CaSO₄ или MgSO₄ (2,5 г) и перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Смесь фильтровали через слой целита, а затем промывали (ацетоном, метилэтилкетоном, этилацетатом, этанолом и т.п.) (100 мл × 2) и концентрировали в вакууме. Полученный таким образом неочищенный остаток растворяли в ацетоне или в этилацетате (12,0 мл), и полученный таким образом раствор перемешивали и медленно смешивали с CH₂Cl₂ (72,0 мл). Полученное таким образом твердое вещество собирали путем фильтрации и сушили в вакууме при 40°С в течение 2 часов с получением обогащенной композиции дубильной кислоты.

Метод обогащения 3

Тонкодисперсный порошок чернильных орешков (20,0 г) помещали в 200,0 мл растворителя (ацетона, метилэтилкетона, этилацетата или этанола) и перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов. Полученный раствор фильтровали, и фильтрат собирали. Затем фильтрат добавляли в 200,0 мл гексана. Полученную таким образом смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов, и полученные два органических слоя разделяли. Масляный слой (нижний слой) собирали и смешивали с 40,0 мл растворителя (ацетона, метилэтилкетона, этилацетата, этанола и т.п.) и с углем (1,6 г), а затем полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов. Затем смесь снова смешивали с CaSO₄ или MgSO₄ (2,5 г) и перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут, после чего фильтровали через слой целита и промывали растворителем (ацетоном, метилэтилкетоном, этилацетатом или этанолом) (100 мл × 2). Собранный фильтрат концентрировали в вакууме, и полученные твердые вещества растворяли в ацетоне или в этилацетате (12,0 мл). Полученный таким образом раствор перемешивали и по каплям смешивали с CH₂Cl₂ (72,0 мл). Полученное таким образом твердое вещество собирали путем фильтрации и сушили в вакууме при 40°С в течение 2 часов с получением обогащенной композиции дубильной кислоты.

Метод обогащения 4

Тонкодисперсный порошок чернильных орешков (20,0 г) помещали в 200,0 мл растворителя (ацетона, метилэтилкетона, этилацетата или этанола) с получением смеси, которую перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов. Эту смесь смешивали с углем (1,6 г), а затем перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов. Полученную смесь снова смешивали с CaSO₄ или MgSO₄ (2,5 г) и перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут, после чего фильтровали через слой целита и промывали растворителем (ацетоном, метилэтилкетоном, этилацетатом или этанолом) (100 мл × 2). Фильтрат концентрировали в вакууме, и полученный остаток растворяли в ацетоне или в этилацетате (12,0 мл), после чего полученный раствор перемешивали и медленно смешивали с CH₂Cl₂ (72,0 мл). Полученное таким образом твердое вещество собирали путем фильтрации и сушили в вакууме при 40°С в течение 2 часов с получением обогащенной композиции дубильной кислоты.

Метод обогащения 5

Тонкодисперсный порошок чернильных орешков (20,0 г) помещали в 200,0 мл растворителя (ацетона, метилэтилкетона, этилацетата или этанола) и полученную таким образом смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов. Эту смесь смешивали с углем (1,6 г), а затем перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов. Полученную смесь снова смешивали с CaSO₄ или MgSO₄ (2,5 г) и перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Смесь фильтровали через слой целита и промывали растворителем (ацетоном, метилэтилкетоном, этилацетатом или этанолом) (100 мл × 2). Фильтрат концентрировали приблизительно до 10-15 мл, и полученный остаток по каплям смешивали с CH₂Cl₂ (60~90 мл). Полученное таким образом твердое вещество собирали путем фильтрации и сушили в вакууме при 40°С в течение 2 часов с получением обогащенной композиции дубильной кислоты.

Метод обогащения 6

Тонкодисперсный порошок чернильных орешков (20,0 г) помещали в 200,0 мл растворителя (ацетона, метилэтилкетона, этилацетата или этанола), и полученный таким образом раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов, а затем фильтровали. Фильтрат собирали и смешивали с углем (1,6 г), а затем перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов. Полученную смесь снова смешивали с CaSO₄ или MgSO₄ (2,5 г) и перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Полученную смесь фильтровали через слой целита, промывали растворителем (ацетоном, метилэтилкетоном, этилацетатом или этанолом) (100 мл × 2), и объединенные фильтраты концентрировали путем выпаривания в вакууме. Полученное таким образом неочищенное твердое вещество растворяли в ацетоне или в этилацетате (12,0 мл), а затем раствор перемешивали и медленно смешивали с CH₂Cl₂ (72,0 мл). Полученное таким образом твердое вещество собирали путем фильтрации и сушили в вакууме при 40°С в течение 2 часов с получением обогащенной композиции дубильной кислоты.

Метод обогащения 7

Тонкодисперсный порошок чернильных орешков (20,0 г) помещали в 50,0 мл 50% или 30% раствора метилэтилкетона/гексана, и перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов. Полученную смесь фильтровали, и твердые вещества собирали. Затем твердые вещества смешивали с 200,0 мл растворителя (ацетона, метилэтилкетона, этилацетата или этанола). Полученную таким образом смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов, фильтровали и фильтрат собирали. Затем фильтрат смешивали с углем (1,6 г), и перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов. Полученную смесь снова смешивали с CaSO₄ или MgSO₄ (2,5 г) и перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут, затем фильтровали через слой целита, промывали растворителем (ацетоном, метилэтилкетоном, этилацетатом или этанолом) (100 мл × 2), и фильтрат концентрировали путем выпаривания в вакууме. Полученный таким образом остаток растворяли в ацетоне или в этилацетате (12,0 мл), а затем раствор перемешивали и по каплям смешивали с CH₂Cl₂ (72,0 мл). Полученное таким образом твердое вещество собирали путем фильтрации и сушили в вакууме при 40°С в течение 2 часов с получением обогащенной композиции дубильной кислоты.

Метод обогащения 8

Тонкодисперсный порошок чернильных орешков (20,0 г) помещали в 50,0 мл 50% или 30% раствора метилэтилкетона/гексана, и перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов. Раствор фильтровали, и собранное твердое вещество смешивали с 200,0 мл растворителя (ацетона, метилэтилкетона, этилацетата или этанола). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов и фильтровали, а затем собранный фильтрат смешивали с углем (1,6 г) и перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов. Полученную смесь снова смешивали с CaSO₄ или MgSO₄ (2,5 г) и перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем смесь фильтровали через слой целита, промывали растворителем (ацетоном, метилэтилкетоном, этилацетатом или этанолом) (100 мл × 2), и фильтрат концентрировали приблизительно до 10-15 мл. Полученный раствор медленно смешивали с CH₂Cl₂ (60~90 мл), и полученное таким образом твердое вещество собирали путем фильтрации и сушили в вакууме при 40°С в течение 2 часов с получением обогащенной композиции дубильной кислоты.

Метод обогащения 9

Тонкодисперсный порошок чернильных орешков (20,0 г) помещали в 200,0 мл растворителя (ацетона, метилэтилкетона, этилацетата или этанола), и перемешивали при 40-45°С в течение 12 часов. Раствор фильтровали, и собранный фильтрат помещали в 200,0 мл гексана. Полученную таким образом смесь снова перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов, и два полученных органических слоя разделяли. Масляный слой (нижний слой) собирали и смешивали с 40,0 мл растворителя (ацетона, метилэтилкетона, этилацетата или этанола), и полученный таким образом раствор смешивали с углем (1,6 г), а затем перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов. Затем смесь снова смешивали с CaSO₄ или MgSO₄ (2,5 г) и перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Смесь фильтровали через слой целита, промывали растворителем (ацетоном, метилэтилкетоном, этилацетатом или этанолом) (100 мл × 2), и фильтрат концентрировали в вакууме. Полученный таким образом остаток растворяли в ацетоне или в этилацетате (12,0 мл), после чего раствор перемешивали и по каплям смешивали с CH₂Cl₂ (72,0 мл). Полученное таким образом твердое вещество собирали путем фильтрации и сушили в вакууме при 40-45°С в течение 2 часов с получением обогащенной композиции дубильной кислоты.

Результаты

DAAO-ингибирующая активность:

DAAO-ингибирующая активность различных обогащенных дубильных кислот, экстрагированных из чернильных орешков различных растительных источников, проиллюстрирована в таблицах 7 и 8.

Таблица 7. Ингибирующая активность обогащенных дубильных кислот, экстрагированных из чернильных орешков различных растительных источников-1

Растительный источник Quercus infectoria Quercus infectoria Rhus chinensis Rhus chinensis Rhus chinensis Rhus chinensis Rhus chinensis Rhus chinensis Диаметр чернильных орешков 3-4 см 3-4 см 4-5 см 4-5 см 4-5 см 4-5 см 4-5 см 4-5 см Экстрагирующий растворитель MEK MEK MEK MEK MEK MEK MEK EtOH Температура экстракции КТ КТ КТ КТ КТ КТ КТ КТ Метод обогащения Нет 1 Нет 1 2 3 7 1 IC₅₀ (мкг/мл) 0,679 0,626 0,428 0,373 0,338 0,319 0,389 0,384

Как показано в таблице 7, все дубильные кислоты, обогащенные любыми описанными здесь методами получения, обнаруживали более низкие значения IC₅₀ (что указывает на более сильное ингибирование), чем необогащенные дубильные кислоты (только прямая экстракция, без удаления дубильных кислот с 2-5 галлоильными группами, без обработки углем и CaSO₄ или MgSO₄, и/или без дальнейшей обработки вторым растворителем и метиленхлоридом). Кроме того, методами обогащения 2 и 3 были получены обогащенные дубильные кислоты с самой низкой DAAO-ингибирующей IC₅₀, по сравнению с дубильными кислотами, полученными методами 1 и 7, тогда как методом обогащения 3 была получена обогащенная дубильная кислота, имеющая более низкое значение IC₅₀, чем дубильная кислота, полученная методом обогащения 2. Также показано, что дубильная кислота, полученная путем экстракции EtOH с последующим обогащением по методу 1, обнаруживала несколько более слабое ингибирование, чем дубильная кислота, полученная путем экстракции МЕК и тем же методом обогащения.

Таблица 8. Ингибирующая активность обогащенных дубильных кислот, экстрагированных из чернильных орешков различных растительных источников-2

Растительный источник Rhus chinensis Rhus chinensis Rhus chinensis Rhus chinensis Диаметр чернильных орешков 4-5 см 4-5 см 4-5 см 4-5 см Экстрагирующий растворитель MEK MEK MEK EtOAc Температура экстракции. КТ 40^oC 40^oC 40^oC Метод обогащения Нет Нет 3 3 IC₅₀ (мкг/мл) 0,428 0,449 0,361 0,337

Как показано в таблице 8, после экстракции этилацетатом (EtOAc) при температуре экстракции 40°С методом обогащения 3, была получена обогащенная дубильная кислота, имеющая гораздо более низкую DAAO-ингибирующую IC₅₀, чем дубильная кислота, экстрагированная МЕК при комнатной температуре, экстрагированная МЕК при 40°С, и экстрагированная МЕК при 40°С методом обогащения 3, соответственно. Кроме того, как показано в таблицах 6 и 8, чернильные орешки от Rhus chinensis с диаметром не более, чем 6 см, имеют более низкие величины IC₅₀, чем чернильные орешки с диаметром более 6 см.

Другие варианты осуществления изобретения

Все признаки, раскрытые в настояшем описании, могут быть объединены в любой комбинации. Каждый признак, раскрытый в настояшем описании, может быть заменен альтернативным признаком, служащим для достижения той же самой, эквивалентной или подобной цели. Таким образом, если это не оговорено особо, каждый раскрытый признак является лишь примером общей серии эквивалентных или подобных признаков.

Из приведенного выше описания, специалист в данной области может легко определить основные характеристики настоящего изобретения, и не выходя за рамки существа и объема изобретения, может внести в настоящее изобретение различные изменения и модификации для их адаптации к различным применениям и условиям. Таким образом, в объем настоящего изобретения также входят и другие варианты его осуществления.

Эквиваленты

Хотя некоторые варианты осуществления изобретения описаны и проиллюстрированы в настоящем описании, однако, для специалиста в данной области очевидно, что могут быть использованы различные другие средства и/или структуры для осуществления функции и/или получения результатов и/или одного или более из описанных здесь преимуществ, и каждый из таких вариантов и/или модификаций может входить в объем описанных здесь вариантов осуществления изобретения. Вообще говоря, для специалиста в данной области очевидно, что все описанные здесь параметры, размеры, материалы и конфигурации носят иллюстративный характер, и что фактические параметры, размеры, материалы и/или конфигурации будут зависеть от конкретного применения или применений настоящего изобретения. Специалистам в данной области известны, либо они могут самостоятельно определить путем не более, чем рутинного экспериментирования, многие эквиваленты описанных здесь конкретных вариантов осуществления изобретения. Таким образом, очевидно, что приведенные выше варианты осуществления изобретения приводятся лишь в качестве примеров, и что в объем прилагаемой формулы изобретения и ее эквивалентов, помимо конкретно описанных и заявленных вариантов, могут быть включены и другие варианты осуществления изобретения. Варианты осуществления настоящего изобретения относятся к каждому отдельному признаку, системе, изделию, материалу, набору и/или способу, описанным в настоящей заявке. Кроме того, в объем настоящего изобретения входит любая комбинация из двух или более таких признаков, систем, изделий, материалов, наборов и/или способов, если такие признаки, системы, изделия, материалы, наборы и/или способы не являются взаимно несовместимыми.

Все указанные и используемые здесь определения должны соответствовать определениям, данным в словаре, и определениям, используемым в документах, вводимых посредством ссылки, и/или должны иметь свое общепринятое значение.

Все цитируемые здесь документы, патенты и патентные заявки вводятся в настоящее описание посредством ссылки, а в некоторых случаях, они вводятся в настоящее описание во всей своей полноте посредством ссылки.

Неопределенные артикли «а» и «аn,» употребляемые в настоящем описании и в формуле изобретения, следует понимать как «по меньшей мере один», если явно не указано обратное.

Соединенные союзы «и/или», используемые в описании и в формуле изобретения, следует понимать как «любой элемент или оба элемента», то есть элементы, которые в некоторых случаях, присутствуют в сочетании друг с другом, а в других случаях они присутствуют раздельно. Множественные элементы, перечисленные с помощью союзов «и/или», следует толковать аналогичным образом, то есть, «один или более» из перечисленных элементов. Помимо элементов, в частности, определяемых как «и/или» могут, но необязательно, присутствовать и другие элементы, независимо от того, связаны они или не связаны с этими конкретно определенными элементами. Таким образом, в качестве неограничивающего примера, формулировка «A и/или В», если она используется в словосочетании, носящим инклюзивный смысл, таком как «содержащий», может означать, в одном варианте осуществления изобретения, только A (включая, но необязательно, другие элементы, но не B), в другом варианте осуществления, только В (включая, но необязательно, другие элементы, но не А), а в еще одном варианте изобретения, и А и В (включая, но необязательно, и другие элементы) и т.п.

Следует отметить, что используемый в описании и в формуле изобретения союз «или» имеет такой же смысл, как и словосочетание «и/или», определенное выше. Так, например, при разделении элементов в списке, «или» или «и/или» должны быть интерпретированы как включительно, т.е., включая по меньшей мере один, но также и более, чем один из ряда или списка элементов, и, но необязательно, дополнительные неуказанные элементы. Только выражения, четко указывающие на обратное, например, «только один из» или «точно один из», или, при использовании в формуле изобретения, «состоящей из» будут относиться к включению только одного элемента из ряда или списка элементов. Вообще говоря, используемый здесь союз «или» должен интерпретироваться только как указание на исключительные альтернативы (т.е., «один или другой, но не оба»), если за этими словами стоит указание на исключительность, такое как «либо», «один из», «только один из» или «точно один из». Словосочетание «состоящий, в основном, из», если оно используется в формуле изобретения, должно иметь свое обычное значение, употребляемое в области патентного права.

Словосочетание «по меньшей мере один», используемое в описании и в формуле изобретения со ссылкой на список из одного или более элементов, следует понимать, как по меньшей мере один элемент, выбранный из любых одного или более элементов в списке элементов, но не обязательно, включая по меньшей мере, один и каждый элемент, конкретно указанный в списке элементов, не исключая любые комбинации этих элементов в списке элементов. Это определение также допускает, что, помимо элементов, в частности, определяемых как «по меньшей мере один» могут, но необязательно, присутствовать и другие элементы, независимо от того, связаны они или не связаны с этими конкретно определенными элементами. Таким образом, в качестве неограничивающего примера, формулировка «по меньшей мере один из A и В» (или эквивалент «по меньшей мере один из A или В», или эквивалент «по меньшей мере один из A и/или В») может означать, в одном варианте осуществления изобретения, по меньшей мере один, включая, но необязательно, более, чем один A без В (включая, но необязательно, другие элементы, но не B), в другом варианте осуществления изобретения, по меньшей мере один, включая, но необязательно, более, чем один В без А (включая, но необязательно, другие элементы, но не А), а в еще одном варианте изобретения, по меньшей мере один, включая, но необязательно, более, чем один А и по меньшей мере один, включая, но необязательно, более, чем один В (включая, но необязательно, и другие элементы) и т.п.

Следует также отметить, что, если явно не указано обратное, то в любых заявленных здесь способах, включающих более чем одну стадию или процедуру, порядок этих стадий или процедур указанного способа не обязательно ограничивается порядком, в котором перечисляются эти стадии или процедуры указанного способа.

Группа изобретений относится к фармацевтической промышленности, а именно к средствам, ингибирующим активность оксидазы D-аминокислоты. Композиция для ингибирования активности оксидазы D-аминокислоты (DAAO), содержащая (i) дубильную кислоту или ее фармацевтически приемлемую соль и (ii) и фармацевтически приемлемый носитель, где дубильная кислота содержит 4,5,6,7,8,9,10,11 или 12 галлоильных групп и где дубильная кислота составляет по меньшей мере 90% по массе всех дубильных кислот, содержащихся в композиции. Способ лечения заболевания, связанного с активностью оксидазы D-аминокислоты (DAAO), которым является ожирение, гиперлипидемия, диабет или расстройство центральной нервной системы (ЦНС), включающий введение индивидууму, нуждающемуся в этом, эффективного количества композиции. Способ получения композиции дубильной кислоты, включающий: (i) получение чернильных орешков из растения; (ii) измельчение чернильных орешков с получением порошка чернильных орешков; (iii) экстракцию порошка чернильных орешков первым растворителем с получением первого экстракта дубильной кислоты; и (iv) контактирование экстракта дубильной кислоты с углем, CaSO₄, MgSO₄ или с их комбинациями для удаления веществ, абсорбируемых на угле или осаждаемых CaSO₄ или MgSO₄ с получением первой композиции дубильной кислоты, где первым растворителем является ацетон, ацетонитрил, метилэтилкетон, этилацетат, этанол, изопропанол, тетрагидрофуран, 1,4-диоксан, гексан или их комбинацию. Вышеописанная композиция имеет более высокую активность в ингибировании DAAO. 3 н. и 37 з.п. ф-лы, 23 ил., 8 табл., 8 пр.

1. Композиция для ингибирования активности оксидазы D-аминокислоты (DAAO), содержащая (i) дубильную кислоту или ее фармацевтически приемлемую соль и (ii) и фармацевтически приемлемый носитель, где дубильная кислота содержит 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 галлоильных групп и где дубильная кислота составляет по меньшей мере 90% по массе всех дубильных кислот, содержащихся в композиции.

2. Композиция по п. 1, где дубильная кислота имеет 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 галлоильных групп.

3. Композиция по п. 2, где дубильная кислота имеет 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 галлоильных групп.

4. Композиция по п. 3, где дубильная кислота имеет 8, 9, 10, 11 или 12 галлоильных групп.

5. Композиция по любому из пп. 1-4, где дубильная кислота составляет по меньшей мере 95% по массе всех дубильных кислот, содержащихся в композиции.

6. Композиция по любому из пп. 1-5, где дубильная кислота выделена по меньшей мере из растительного источника, выбранного из группы, состоящей из Rhus chinensis, Rhus javanica, Rhus semialata, Rhus coriaria, Rhus potaninii, Rhus punjabensis var. sinica (Diels) Rehder & E.H. Wilson, Camellia sinensis, Berry, Bixa orellana, Vitis vinifera, Punica granatum, Quercus infectoria, Quercus cerris, Acacia mearnsii, Pseudotsuga menziesii, Caesalpinia spinosa, Fagus hayata Palib. ex Hayata и Machilus thunbergii Sieb. & Zucc.

7. Композиция по любому из пп. 1-5, где дубильная кислота выделена по меньшей мере из растительного источника, выбранного из группы, состоящей из Rhus chinensis, Rhus javanica, Rhus semialata, Rhus coriaria, Rhus potaninii и Rhus punjabensis var. sinica (Diels) Rehder & E.H. Wilson.

8. Композиция по п. 7, где дубильная кислота выделена по меньшей мере из растительного источника, выбранного из Rhus chinensis, Rhus potaninii и Rhus punjabensis var. sinica (Diels) Rehder & E.H. Wilson.

9. Композиция по любому из пп. 1-5, где дубильная кислота выделена по меньшей мере из растительного источника, требующего присутствия гнездящихся насекомых, выбранных из группы, состоящей из Andricus kollari, Andricus fecundatrix, Andricus quercuscalicis, Andricus quercuscalicis, Biorhiza pallida, Neuroterus quercusbaccarum, Neuroterus albipes, Neuroterus numismalis, Cynips quercusfolii, Melaphis chinensis (Bell), Melaphis peitan Tsai et Tang, Nurudea sinica Tsai et Tang, Nurudea shiraii matsumura, Nurudea rosea Matsumura, Meitanaphis elongallis Tsai et Tang, Macrorhinarium ensigallis Tsai et Tang, Macrorhinarium ovagallis Tsai et Tang, Floraphis meitanensis Tsai et Tang, Meitanaphis flavogallis Tang, Kaburagia rhusicola Takagi, Kaburagia ovatihuicola Xiang, Kaburagia ensigallis Tsai et Tang, Kaburagia ovogallis, Kaburagia thusicola Takagi, Meitanaphis microgallis Xiang и Floraphis choui Xiang.

10. Композиция по любому из пп. 1-5, где дубильная кислота выделена по меньшей мере из растительного источника, требующего присутствия гнездящихся насекомых, выбранных из группы, состоящей из Melaphis chinensis (Bell), Melaphis peitan Tsai et Tang, Nurudea sinica Tsai et Tang, Nurudea shiraii matsumura, Nurudea rosea Matsumura, Meitanaphis elongallis Tsai et Tang, Macrorhinarium ensigallis Tsai et Tang, Macrorhinarium ovagallis Tsai et Tang, Floraphis meitanensis Tsai et Tang, Meitanaphis flavogallis Tang, Kaburagia rhusicola Takagi, Kaburagia ovatihuicola Xiang, Kaburagia ensigallis Tsai et Tang, Kaburagia ovogallis, Kaburagia thusicola Takagi, Meitanaphis microgallis Xiang и Floraphis choui Xiang.

11. Композиция по любому из пп. 1-5, где дубильная кислота выделена из чернильных орешков, выбранных из группы, состоящей из китайских чернильных орешков, имеющих колоколообразную форму; роговидных чернильных орешков; жестких мечевидных чернильных орешков; мечевидных яйцеобразных чернильных орешков; и чернильных орешков в виде соцветий, находящихся по меньшей мере на растительном источнике, требующем присутствия гнездящихся насекомых.

12. Композиция по любому из пп. 1-5, где дубильная кислота выделена из чернильных орешков, выбранных из группы, состоящей из китайских роговидных чернильных орешков, находящихся по меньшей мере на растительном источнике, требующем присутствия гнездящихся насекомых.

13. Композиция по п. 12, где чернильные орешки имеют диаметр в пределах 1-8 см.

14. Композиция по п. 13, где чернильные орешки имеют диаметр в пределах 2-6 см.

15. Композиция по любому из пп. 1-14, где композиция дополнительно включает второе терапевтическое средство, которым является средство против ожирения.

16. Композиция по п. 15, где средство против ожирения выбрано из группы, состоящей из орлистата, лоркасерина, сибутрамина, римонабанта, метформина, эксенатида, пралинтида, фентермина, фенфлурамина, топирамата дексфенфлурамина, динитрофенола, бупропиона и зонизамида.

17. Композиция по по любому из пп. 1-14, где композиция дополнительно включает второе терапевтическое средство, которым является средство для лечения расстройства центральной нервной системы (ЦНС).

18. Композиция по п. 17, где средство для лечения расстройства ЦНС выбрано из группы, состоящей из антидепрессанта, антипсихотического средства, психостимулятора, стабилизатора настроения, анксиолитического средства, средства для лечения гиперактивности, ассоциированной с дефицитом внимания (ADHD), или средства для лечения болезни Альцгеймера (БА).

19. Композиция по п. 18, где средством для лечения расстройства ЦНС является антипсихотическое средство, выбранное из группы, состоящей из бутирофенона, фенотиазина, флуфеназина, перфеназина, прохлорперазина, тиоридазина, трифлуоперазина, мезоридазина, промазина, трифлупромазина, левомепромазина, прометазина, тиоксантена, хлорпротиксена, флупентиксола, тиотиксена, зуклопентиксола, клозапина, оланзапина, рисперидона, кветиапина, зипразидона, амисульприда, азенапина, палиперидона, арипипразола, ламотригина, мемантина, каннабидиола, LY2140023, дроперидола, пимозида, бутаперазина, карфеназина, ремоксиприда, пиперацетазина, сульпирида, акампросата и тетрабеназина.

20. Композиция по п. 19, где средством для лечения расстройства ЦНС является антидепрессант, выбранный из группы, состоящей из ингибитора моноаминоксидазы (MAOI), трициклического антидепрессанта (TCA), тетрациклического антидепрессанта (TeCA), селективного ингибитора повторного поглощения серотонина (SSRI), норадренергического и специфического серотонергического антидепрессанта (NASSA), ингибитора повторного поглощения норэпинефрина (норадреналина), ингибитора повторного поглощения норэпинефрина-допамина или ингибитора повторного поглощения серотонина-норэпинефрина (SNRI).

21. Композиция по п. 20, где антидепрессант выбран из группы, состоящей из флуоксетина, пароксетина, эсциталопрама, циталопрама, сертралина, флувоксамина, венлафаксина, милнаципрана, дулоксетина, миртазапина, миансерина, ребоксетина, бупропиона, амитриптилина, нортриптилина, протриптилина, дезипрамина, тримипрамина, амоксапина, бупропиона, кломипрамина, дезипрамина, доксепина, изокарбоксазида, транилципромина, тразодона, нефазодона, фенелзина, ламатрогина, лития, топирамата, габапентина, карбамазепина, оксакарбазепина, валпроата, мапротилина, брофаромина, гепирона, моклобемида, изониазида и ипрониазида.

22. Композиция по любому из пп. 1-21, где указанная композиция приготовлена для перорального введения.

23. Композиция по любому из пп. 1-22, где указанной композицией является продукт для здорового питания или продукт для лечебного питания.

24. Композиция по любому из пп. 1-23, где указанной композицией является таблетка, капсула, мягкая жевательная резинка или гель.

25. Композиция по любому из пп. 1-24, где указанной композицией является фармацевтическая композиция, также содержащая фармацевтически приемлемый носитель.

26. Композиция по п. 25, где фармацевтическая композиция приготовлена для перорального введения или для парентерального введения.

27. Способ лечения заболевания, связанного с активностью оксидазы D-аминокислоты (DAAO), которым является ожирение, гиперлипидемия, диабет или расстройство центральной нервной системы (ЦНС), включающий введение индивидууму, нуждающемуся в этом, эффективного количества композиции по любому из пп. 1-26.

28. Способ по п. 27, где расстройство ЦНС выбрано из группы, состоящей из ADHD, нарушения способности к обучению, шизофрении, боли, депрессии, суицидальных наклонностей и/или поведения, биполярного расстройства, тика, посттравматического стрессового расстройства, тревожного состояния, социального тревожного состояния, панического расстройства, аутизма, синдрома Аспергера, болезни навязчивых состояний (БНС), нарушения способности к обучению, синдрома Туретта, легкого когнитивного расстройства, деменции, суицидальных наклонностей, поведенческого расстройства, ассоциированного с сосудистой деменцией, болезни Альцгеймера, лобно-височной деменции, болезни Паркинсона, болезни Гентингтона, ночного энуреза, блефароспазма, церебральной малярии и неэпилептического припадка.

29. Способ по п. 27, где индивидуумом является человек с ожирением или с подозрением на ожирение.

30. Способ по п. 29, где пациент проходил или проходит лечение по поводу ожирения.

31. Способ по п. 27 или 28, где индивидуумом является человек с расстройством ЦНС или с подозрением на расстройство ЦНС.

32. Способ по п. 31, где пациент проходил или проходит лечение по поводу расстройства ЦНС.

33. Способ получения композиции дубильной кислоты по п. 1, включающий:

(i) получение чернильных орешков из растения;

(ii) измельчение чернильных орешков с получением порошка чернильных орешков;

(iii) экстракцию порошка чернильных орешков первым растворителем с получением первого экстракта дубильной кислоты; и

(iv) контактирование экстракта дубильной кислоты с углем, CaSO₄, MgSO₄ или с их комбинациями для удаления веществ, абсорбируемых на угле или осаждаемых CaSO₄ или MgSO₄ с получением первой композиции дубильной кислоты, где первым растворителем является ацетон, ацетонитрил, метилэтилкетон, этилацетат, этанол, изопропанол, тетрагидрофуран, 1,4-диоксан, гексан или их комбинацию.

34. Способ по п. 33, который дополнительно включает (v) растворение первой композиции дубильной кислоты во втором растворителе с образованием раствора, (vi) добавление метиленхлорида (CH₂Cl₂) или дихлорэтана к раствору, и (vii) сбор полученных таким образом твердых веществ с получением второй композиции дубильной кислоты, где вторым растворителем является ацетон, ацетонитрил, этилацетат, метилэтилкетон или их комбинация.

35. Способ по п. 33 или 34, который дополнительно включает, после стадии (iii) и до стадии (iv), удаление из первого экстракта дубильной кислоты дубильных кислот, имеющих 2-5 галлоильных групп, с получением второго экстракта дубильной кислоты.

36. Способ по любому из пп. 33-35, где растение выбрано из группы, состоящей из Rhus chinensis, Rhus javanica, Rhus semialata, Rhus coriaria, Rhus potaninii, Rhus punjabensis var. sinica (Diels) Rehder & E.H. Wilson, Camellia sinensis, Berry, Bixa orellana, Vitis vinifera, Punica granatum, Quercus infectoria, Quercus cerris, Acacia mearnsii, Pseudotsuga menziesii, Caesalpinia spinosa, Fagus hayata Palib. ex Hayata и Machilus thunbergii Sieb. & Zucc.

37. Способ по п. 36, где растение выбрано из группы, состоящей из Rhus chinensis, Rhus javanica, Rhus semialata, Rhus coriaria, Rhus potaninii и Rhus punjabensis var. sinica (Diels) Rehder & E.H. Wilson.

38. Способ по любому из пп. 33-37, где указанный способ дополнительно включает, перед стадией (iii) и после стадии (ii), пропускание порошка чернильных орешков через сито размером 20-60 меш.

39. Способ по п. 35, где стадию удаления осуществляют путем смешивания первого экстракта дубильной кислоты с растворителем, который представляет собой комбинацию (i) ацетона, ацетонитрила, метилэтилкетона или этилацетата, и (ii) пентана, гексана или гептана, с образованием двух органических слоев, и сбора масляного слоя с получением второго экстракта дубильной кислоты.

40. Способ по п. 39, где растворитель представляет собой комбинацию метилэтилкетона и гексана или комбинацию этилацетата и гексана.