Применение сывороточного альбумина в качестве противомикробного агента Российский патент 2020 года по МПК A61K38/38 A61P31/00 A61P31/04 A61P31/10 A61P31/12 

Область техники

Изобретение относится к области лабораторной диагностики, медицинской иммунологии и микробиологии и предназначено для применения альбумина в качестве антимикробного агента.

Уровень техники

Сывороточный альбумин человека (ЧСА) и животных составляет примерно 50% белков плазмы, кроме того он присутствует в тканях. Функции альбумина в организме весьма многообразны: это поддержание онкотического давления плазмы, связывание и транспорт низкомолекулярных веществ и экзогенных лигандов, участие в окислительно-восстановительных реакциях, пластическая функция, регуляция гемостаза, участие в поддержании кислотно-основного равновесия в крови, регуляция апоптоза. Известно также, что альбумин влияет на целостность сосудов, участвуя в поддержании нормальной капиллярной проницаемости, и оказывает иммуномодулирующее действие за счет связывания различных продуктов жизнедеятельности микроорганизмов.

Антимикробную активность сыворотки крови принято связывать с наличием белков системы комплемента, иммуноглобулинов и антимикробных пептидов. Белки системы комплемента действуют только в полном наборе и по каскадному механизму [Ройт А., Бростофф Д., Мейл Д., Иммунология, 2000, Москва, «Мир», С. 61]. Иммуноглобулины обладают непосредственным антимикробным действием только на те микроорганизмы, с инвазией которых человек непосредственно сталкивается. Например, есть данные о действии специфических иммуноглобулинов класса А против грибов рода Candida, полученные in vitro [Kavishwar A., Shukla Р.K. Candidacidal activity of a monoclonal antibody that binds with glycosyl moieties of proteins of Candida albicans. Medical Mycology. 2006; 44(2): 159-167]. В организме человека насчитывается свыше 20 различных классов антимикробных пептидов [Zasloff М. Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature. 2002; 415(6870): 389-95]. Они действуют совокупно, причем их концентрация в сыворотке крови варьирует от 10^-1 нг/мл для гепцидина [Wolff F. et al, Hepcidin-25: Measurement by LC-MS/MS in serum and urine, reference ranges and urinary fractional excretion // Clinica Chimica Acta Volume 423, P. 99-104]) и 10¹ нг/мл для дефензинов [Arimura Y. et al, Elevated Serum Defensins Concentrations in Patients with Lung Cancer // Anticancer research 24: 4051-4058 (2004)] до 10³ нг/мл для дермцидинов [Ortega Martinez I. et al. Vitronectin and dermcidin serum levels predict the metastatic progression of AJCC I-II early stage melanoma // Int J Cancer. 2016, 139(7): 1598-1607] и лизоцима [Назаренко Г.И., Кишкун А.А. Клиническая оценка результатов лабораторных исследований, Литан, Медицина (Татарстан), М.: Медицина. - 2000. - 544 с.].

До сих пор ничего не было известно об антимикробных свойствах альбумина. Однако, по нашему мнению, альбумин как самый представленный белок плазмы - его концентрация составляет порядка 10⁷ нг/мл - тоже взаимодействует с микроорганизмами. Обнаружение этой новой функции альбумина не только переворачивает общеизвестные представления об этом уникальном компоненте крови, но и позволяет рассчитывать на использование этих свойств в клинической практике, как в диагностических, так и в лечебных целях.

Наиболее близким аналогом заявленного изобретения является применение лизоцима в качестве противомикробного агента [Johansson B.G., Malmquist J. Quantitative immunochemical determination of lysoqyme (muramidase) in serum and urine. Scand J Clin Lab Invest. 1971 May; 27(3): 255-61; Назаренко Г.И., Кишкун А.А. Клиническая оценка результатов лабораторных исследований, Литан, Медицина (Татарстан), М.: Медицина. - 2000. - 544 с.].

Однако, лизоцим имеет ограниченный спектр функций в организме и в плазме крови человека он представлен в невысокой концентрации, в то время как альбумин является основным белком плазмы крови и выполняет целый ряд важных функций.

Задачей изобретения является применение сывороточного альбумина человека в качестве противомикробного агента.

Для решения указанной задачи мы предлагаем применение альбумина в качестве противомикробного агента, поскольку до сих пор терапевтические препараты альбумина использовались лишь как источник белка для поддержания жизнедеятельности, например, при онкологических заболеваниях и др.

К техническому результату изобретения относятся:

- возможность применять альбумин в качестве антимикробного средства.

- расширение арсенала антимикробных средств.

- возможность использовать альбумина в качестве показателя противомикробной активности сыворотки крови у пациентов.

Краткое описание поясняющих материалов.

Фиг. 1 - антимикробная активность альбуминов, где БСА - бычий, ЧСА - человеческий, ОВА - яичный альбумин, по оси ординат - количество живых клеток, выраженное в процентах от контроля.

Фиг. 2 - действие растворов человеческого сывороточного альбумина различной концентрации на микробные клетки, где I - контроль, II - концентрация альбумина 10 мг/мл, III - концентрация альбумина 50 мг/мл.

Табл. 1 - антимикробное действие растворов альбуминов в различной концентрации.

Табл. 2 - активность нативной человеческой сыворотки.

Осуществление изобретения.

Пример 1. Определение антимикробной активности альбуминов методом посевов.

К суспензии клеток дрожжей С albicans №927, разведенных в основе синтетической питательной среды до концентрации 10⁴ КОЕ/мл, добавляли глюкозу до средней концентрации в плазме крови - 5 мМ и альбумин (БСА - бычий, ЧСА - человеческий, ОВА - яичный) в конечной концентрации 50 мг/мл, контрольная проба не содержала альбумина. Проводили инкубацию во флаконах на шейкере при 32°С в течение 2 часов, затем отсевали аликвоты суспензий на чашки с плотной глюкозо-пептон-дрожжевой средой и инкубировали 1 сутки при 32°С. По окончании инкубации проводили учет выросших колоний, что отражает количество живых клеток в аликвоте. Количество живых клеток выражали в процентах от контроля, не содержавшего альбумин. Результаты, представленные на Фиг. 1, показывают, что двухчасовая экспозиция клеток культуры С. albicans приводила к резкому снижению численности популяции дрожжей в присутствии всех альбуминов, особенно БСА.

Пример 2. Определение антимикробной активности альбуминов методами спектрофотометрии и микроскопии.

300 мкл раствора альбуминов (БСА - бычий, ЧСА - человеческий, ОВА - яичный) в конечной концентрации 50 мг/мл соединяли в пробирках типа Эппендорф с 50 мкл суспензии дрожжей - Candida albicans №927 и Cryptococcus neoformans №3465 - в концентрации 10¹⁰ КОЕ/мл либо суспензии бактерий - Escherichia coli М-17 и Staphylococcus aureus Wood 46 - в концентрации 10 КОЕ/мл, причем контрольная пробирка вместо альбумина содержала 300 мкл физраствора; пробирки инкубировали 2 часа при 32°С на шейкере, затем центрифугировали 5 мин при 16000 об/мин, супернатанты удаляли, а к осадкам добавляли по 300 мкл раствора бромкрезолового пурпурного в фосфатном буфере рН 4,6; затем пробирки инкубировали 45 мин при 32°С на шейкере; центрифугировали 5 мин при 16000 об/мин, а осадки микроскопировали при суммарном увеличении микроскопа 1750 и фотографировали цифровой камерой «Sony» (Япония), совмещая ее объектив с окуляром микроскопа, определяя живые клетки, мертвые клетки, дебрис (т.е. везикулы, образованные при разрушении клеток). К удаленным супернатантам добавляли 2,5 мл фосфатного буфера рН 4,6; оптическую плотность полученных растворов измеряли на спектрофотометре «Genesys 10S UV-Vis» (США) при длине волны 440 нм, а из трех измерений для каждой пробы вычисляли среднее значение оптической плотности:

А=(ОП_контр-ОП_опыт.)*100/ОП_контр.,

где ОП_контр - это оптическая плотность смеси из контрольной пробирки; ОП_опыт. - это оптическая плотность смеси из опытной пробирки.

Величина оптической плотности служит характеристикой антимикробной активности образцов, поскольку имеется прямая зависимость ее от содержания в образце живых микробных клеток. Так, чем больше живых микробных клеток - тем больше оптическая плотность измеряемого образца и, соответственно, тем ниже активность действующего на клетки вещества.

На основании полученных величин оптической плотности производили расчет активности, выражая ее в процентах по отношению к контрольному образцу.

Из данных, приведенных на фиг. 2 и в табл.1 можно заключить, что действие всех альбуминов на все изученные микроорганизмы носит дозозависимый характер. При концентрациях сывороточных альбуминов, близких к физиологическим (50 мг/мл), клетки микроорганизмов разрушались с образованием везикул дебриса, тогда как при более низких концентрациях (10 мг/мл) имело место лишь нарушение целостности клеточных мембран. Антимикробная активность альбуминов в отношении клеток дрожжей, изученная методом посевов при концентрации альбуминов 50 мг/мл, коррелирует с таковой, полученной спектрофотометрическим методом - коэффициент Пирсона r=0,999. Из табл. 1 видно, что наибольшей активностью при физиологической концентрации в отношении дрожжей и эшерихий обладал препарат БСА, а наименьшей - ОВА, тогда как в отношении стафилококков наиболее эффективным явился ЧСА.

Пример 3. Сравнение концентрации альбумина в сыворотках с их противомикробной активностью.

Произвольно взятые образцы сывороток людей (n=22) обрабатывали аналогично примеру 2, но вместо раствора альбумина использовали образцы сывороток, концентрацию альбумина в которых определяли с помощью тест-системы «Агат-Альбумин».

Коэффициенты Пирсона были равны: для человеческих сывороток r=0,599, что указывает на наличие прямой корреляционной взаимосвязи высокой силы между концентрацией альбумина и антимикробной активностью сывороток против клеток дрожжей.

Сравнение активности ЧСА в физиологической концентрации с активностью нативной человеческой сыворотки показало следующее: средняя активность сыворотки по отношению к С. albicans №927, оцененная методом спектрофотометрии, находится в пределах 88,2±1,6% (см. табл. 2), тогда как активность ЧСА в концентрации 50 мг/мл равна 72,8±0,9%; к Cr. neoformans - 79,5±7,8 против 60,7±2,8%; к Е. coli - 83,8±0,8% против 71,2±0,8%; к S. aureus - 79,5±0,4% против 80,0±1,0%.

Таким образом, обнаружено, что при обработке тест-культур нативными сыворотками, содержащими сывороточный альбумин в физиологических концентрациях, наблюдается выраженное антимикробное действие этих сывороток.

Проведенные эксперименты показали наличие антимикробной активности человеческого сывороточного альбумина в концентрациях 50 мг/мл и близких к ней. Отметим, что такая концентрация соответствует физиологическому содержанию человеческого альбумина в организме. В такой же концентрации и выше альбумин содержится и в ряде лекарственных препаратов, используемых в практической медицине. Обнаружение антимикробных свойств раствора альбумина в физиологической концентрации, соответствующей уже используемой в лечебных препаратах, позволит расширить область применения указанного раствора и усовершенствовать тактику лечения инфекционно-воспалительных заболеваний путем использования альбумин-содержащих препаратов вместо антибиотиков и антисептиков.

Кроме того, на основании полученных данных выявление у пациентов низких концентраций альбумина в сыворотке крови позволяет сделать вывод о низкой противомикробной защите организма.

Изобретение относится к фармации и микробиологии. Предложено применение сывороточного альбумина человека (ЧСА) в концентрации от 49 до 71 мг/мл в качестве антимикробного средства, разрушающего клетки микроорганизмов. Технический результат состоит в реализации назначения: показано не только подавление роста E. coli, C. albicans, S. aureus, Cr. neoformans, но также разрушение клеток с образованием дебриса в физиологических концентрациях ЧСА. Изобретение обеспечивает возможность применять ЧСА в качестве антимикробного средства и использовать его в качестве показателя противомикробной активности сыворотки крови у пациентов. 2 ил., 2 табл., 3 пр.

Применение сывороточного альбумина человека в концентрации от 49 до 71 мг/мл в качестве антимикробного средства, разрушающего клетки микроорганизмов.