СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПНЕВМОКОККОВЫХ ГИПЕРИММУННЫХ СЫВОРОТОК Российский патент 2017 года по МПК A61K39/40 A61P31/00 

Изобретение относится к медицинской иммунологии и может найти применение для производства высокоактивных, специфичных гипериммунных сывороток [A61K 39/40, C07K 16/12].

Известен патент RU 2203090 на Способ получения диагностической сыворотки с агглютининами к вирулентным иерсиниям (СВИ) путем гипериммунизации кроликов плазмидосодержащим (pYV+) штаммом Yersinia enterocolitica серовара ОЗ и последующей адсорбции бесплазмидными (pYV-) вариантами иерсинии, отличающийся тем, что для иммунизации кроликов антиген вводят внутривенно по схеме: 0,09-0,11 мл трехкратно с интервалом 2-3 дня и через 7-8 дней - еще 2 введения с интервалом 2-3 дня, а в качестве адсорбентов используют микробные массы референтных штаммов ГИСК 189 и ГИСК 207.

Недостатком решения является толерантность к КПС; кроме того, требуется этап адсорбции сывороток. Использование фенола может разрушать внутреннюю оболочку вен кролика и вызывать их тромбоз, что ограничивает время и количество полученной сыворотки.

В отличие от этого решения в заявленном изобретении сыворотку можно получать длительно, повторяя схему иммунизации. В нашем случае цель достигается иммунизацией целыми микробными клетками, отмытыми от излишков полисахарида, чтобы избежать возникновения толерантности к КПС; кроме того, отсутствует этап адсорбции сывороток, что упрощает схему.

Известен патент RU 2135210 на Способ получения диагностической сыворотки, включающий многократную иммунизацию животных-продуцентов авирулентным антигенным материалом в совокупности с иммуномодуляторами, забор крови и отделение сыворотки, отличающийся тем, что в качестве иммуномодуляторов используют тималин и циклофосфан, иммунизацию осуществляют пятикратно, антигенный материал вводят внутривенно, иммуномодулятор тималин - внутримышечно одновременно с инъекцией антигена, при этом циклофосфан вводят однократно с третьей инъекцией.

Недостатком решения является использование иммуномодуляторов и иммуносупрессоров, что усложняет и удорожает получение сывороток. Кроме того, использование иммуномодулятора и иммуносупрессора "истощает" иммунную систему, что ведет к отбраковке кроликов-продуцентов.

В заявленном изобретении предложена иммунизация целыми микробными клетками. Вводимая вакцина позволяет получать специфичные, высокоактивные сыворотки, без использования иммуномодуляторов и иммуносупрессоров.

Наиболее близким по существу и назначению к заявленному способу является способ получения диагностической агглютинирующей сыворотки к патогенным штаммам иерсиний (патент RU 2358764, A61K 39/40 от 20.06.2009 г.). Способ включает гипериммунизацию кроликов антигеном, представляющим собой инактивированный 0,4-0,6% формалином антиген плазмидосодержащего (pYV+) штамма Yersinia enterocolitica My 03R, в ушную краниальную вену. Иммунизацию кроликов указанным антигеном проводят четырехкратно в дозах: 290-310 млн кл./мл, 490-510 млн кл./мл, 0,99-1,1 млрд. кл./мл и 1,9-2,1 млрд. кл./мл, соответственно, с интервалом между каждой инъекцией 6-7 суток. Далее у продуцента определяют иммуногенные свойства, затем забирают кровь с последующим отделением и консервированием полученной сыворотки. Способ обеспечивает получение высококачественной агглютинирующей сыворотки, используемой для диагностики иерсиниоза у животных.

Недостатком прототипа является недостаточно высокая специфическая активность сывороток.

Задачей изобретения является повышение специфической активности диагностических сывороток, упрощение и снижение трудоемкости процесса их получения при высоком выходе целевого продукта.

Техническим результатом заявленного изобретения является повышение качества сывороток.

Указанный технический результат достигается за счет того, что заявлен способ получения пневмококковых гипериммунных сывороток, характеризующийся гипериммунизацией кроликов антигеном, представляющим собой инактивированный формалином антиген плазмидосодержащего штамма пневмококка, иммунизацию вакциной проводят в ушную вену, причем иммунизацию кроликов указанным антигеном проводят с интервалом между каждой инъекцией, затем у продуцента определяют иммуногенные свойства, забирают кровь с последующим отделением и консервированием полученной сыворотки, отличающийся тем, что для получения вакцины одной серии используют 16-часовую культуру, выращенную на полусинтетической питательной среде, клетки которой отделяют центрифугированием, осадок ресуспендируют в физиологическом растворе и инактивируют прогреванием, затем клетки отмывают физиологическим раствором, содержащим 0,25% формалина, и готовят микробную взвесь, соответствующую 4×10⁹ мкр.кл./мл, причем микробные клетки пневмококков перед иммунизацией еще раз отмывают, иммунизацию вакциной проводят 3 раза в неделю в течение 4-х недель: первая неделя в дозах 1×10⁸ мкр.кл./мл, вторая - 5×10⁸ мкр.кл./мл, третья - 1×10⁹ мкр.кл./мл и четвертая - 2×10⁹ мкр.кл./мл, на пятой неделе берут кровь, получают сыворотку и проверяют ее активность в реакции агглютинации (РА), титр которой должен быть в пределах 1:3200-1:6400.

Поскольку иммунизирующая доза, вводимая за неделю, большая и при однократном введении может вызвать гибель животных, необходимо растягивать введение на неделю. В перерыве между иммунизациями происходит частичная элиминация антигена.

Считается, что за неделю после иммунизации происходит формирование антител в необходимом нам количестве.

Технический результат повышения качества сывороток достигается за счет использования изменений в приготовлении вакцин из микробных клеток каждого из серотипов пневмококка и схемы иммунизации кроликов.

Осуществление изобретения

Способ реализуется посредством того, что кроликов-продуцентов иммунизируют инактивированной микробной культурой по приведенной в таблице схеме:

Для получения вакцины одной серии используют 16-часовую культуру, выращенную на полусинтетической питательной среде. Клетки отделяют центрифугированием. Осадок ресуспендируют в физиологическом растворе и инактивируют прогреванием. Клетки отмывают физиологическим раствором, содержащим 0,25% формалина, и готовят микробную взвесь, соответствующую 4×10⁹ мкр.кл./мл. Для стабилизации и интенсивного образования антител ограниченной гетерогенности микробные клетки пневмококков перед иммунизацией еще раз отмывают, во избежание развития толерантности под воздействием свободного полисахарида.

Если сыворотки при пробном кровопускании содержат большое количество антител, то кровопускания продолжают в течение последующих 2-3 недель, а затем делают 4-недельный перерыв. После этого иммунизацию повторяют, вводя по 2×10⁹ мкр.кл. в мл в первую неделю 3 раза и в следующие 4 недели - 2 раза. Активность сывороток определяют в реакции агглютинации. Титр должен быть 1:3200-1:6400.

В патентной и научно-технической литературе не известны технические решения, содержащие режимы получения гипериммунных сывороток к штаммам пневмококка, принадлежащим к различным серотипам, аналогично заявляемому, т.е. предложение соответствует критерию «новизна». Все режимы способа осуществимы в лабораторных и промышленных условиях, направлены на решение реальной технической задачи, т.е. предложение «промышленно применимо».

Способ иллюстрируется на следующих примерах.

Пример 1.

Получают гипериммунную сыворотку к штамму пневмококка серотипа 19А следующим образом. 1500 мл 16-часовой культуры центрифугировали. Осадок микробных клеток ресуспендировали в 30 мл физиологического раствора и инактивировали прогреванием при 56°С. Клетки трижды отмывали физиологическим раствором, содержащим 0,25% формалина, и готовили микробную взвесь, соответствующую 4×10⁹ мкр.кл./мл. Перед иммунизацией микробные клетки еще раз отмывали физраствором.

Иммунизацию кроликов вакциной проводили в ушную вену 3 раза в неделю, в течение 4-х недель в дозах 1×10⁸, 5×10⁸, 1×10⁹ и 2×10⁹ мкр.кл./мл. На пятой неделе у кроликов брали кровь, получали сыворотку и проверяли ее активность в РА. Средний титр антител в полученной сыворотке крови к S. pneumoniae серотип 19А в РА составил 1:6400.

Пример 2.

Получают гипериммунную сыворотку к штамму пневмококка серотипа 3 следующим образом. 1000 мл 16-часовой культуры центрифугировали. Осадок микробных клеток ресуспендировали в 20 мл физиологического раствора и инактивировали прогреванием при 56°С. Клетки трижды отмывали физиологическим раствором, содержащим 0,25% формалина, и готовили микробную взвесь, соответствующую 4×10⁹ мкр.кл./мл. Перед иммунизацией микробные клетки еще раз отмывали физраствором.

Иммунизацию кроликов вакциной проводили в ушную вену 3 раза в неделю, в течение 4-х недель в дозах 1×10⁸, 5×10⁸, 1×10⁹ и 2×10⁹ мкр.кл./мл. На пятой неделе у кроликов брали кровь три раза, получали сыворотку и проверяли ее активность в РА. Средний титр антител в полученной сыворотке крови к S. pneumoniae серотип 3 в РА составил 1:3200.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для получения пневмококковых гипериммунных сывороток. Для этого проводят гипериммунизацию кроликов антигеном, представляющим собой инактивированный формалином антиген плазмидосодержащего штамма пневмококка. Иммунизацию вакциной проводят в ушную вену, причем иммунизацию кроликов указанным антигеном проводят с интервалом между каждой инъекцией, затем у продуцента определяют иммуногенные свойства, забирают кровь с последующим отделением и консервированием полученной сыворотки. Для получения вакцины одной серии используют 16-часовую культуру, выращенную на полусинтетической питательной среде, клетки которой отделяют центрифугированием. Осадок ресуспендируют в физиологическом растворе и инактивируют прогреванием, затем клетки отмывают физиологическим раствором, содержащим 0,25% формалина, и готовят микробную взвесь, соответствующую 4×10⁹ мкр.кл./мл, причем микробные клетки пневмококков перед иммунизацией еще раз отмывают. Иммунизацию вакциной проводят 3 раза в неделю в течение 4-х недель: первая неделя в дозах 1×10⁸ мкр.кл./мл, вторая - 5×10⁸ мкр.кл./мл, третья - 1×10⁹ мкр.кл./мл и четвертая - 2×10⁹ мкр.кл./мл, на пятой неделе берут кровь, получают сыворотку и проверяют ее активность в реакции агглютинации (РА), титр которой должен быть в пределах 1:3200-1:6400. Использование данного способа позволяет повысить специфическую активность сывороток за счет использования в приготовлении вакцин из микробных клеток каждого из серотипов пневмококка и схемы иммунизации кроликов. 2 пр., 1 табл.

Способ получения пневмококковых гипериммунных сывороток, характеризующийся гипериммунизацией кроликов антигеном, представляющим собой инактивированный формалином антиген плазмидосодержащего штамма пневмококка, иммунизацию вакциной проводят в ушную вену, причем иммунизацию кроликов указанным антигеном проводят с интервалом между каждой инъекцией, затем у продуцента определяют иммуногенные свойства, забирают кровь с последующим отделением и консервированием полученной сыворотки, отличающийся тем, что для получения вакцины одной серии используют 16-часовую культуру, выращенную на полусинтетической питательной среде, клетки которой отделяют центрифугированием, осадок ресуспендируют в физиологическом растворе и инактивируют прогреванием, затем клетки отмывают физиологическим раствором, содержащим 0,25% формалина, и готовят микробную взвесь, соответствующую 4×10⁹ мкр.кл./мл, причем микробные клетки пневмококков перед иммунизацией еще раз отмывают, иммунизацию вакциной проводят 3 раза в неделю в течение 4-х недель: первая неделя в дозах 1×10⁸ мкр.кл./мл, вторая - 5×10⁸ мкр.кл./мл, третья - 1×10⁹ мкр.кл./мл и четвертая - 2×10⁹ мкр.кл./мл, на пятой неделе берут кровь, получают сыворотку и проверяют ее активность в реакции агглютинации (РА), титр которой должен быть в пределах 1:3200-1:6400.