Способ определения теофиллина в сыворотке крови Советский патент 1990 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к области иммунохимии, конкретно к способу определения теофиллина в биологических жидкостях, и может быть использовано для лекарственного мониторинга при терапии теофиллином: контроль за концентрацией препарата в организме больных, подбор индивидуальных доз для повышения эффективности терапии и устранения токсических явлений.

Цель изобретения - повышение чувствительности и ускорение способа.

Способ осуществляется следующим образом.

Для иммунизации используют конью- гированный антиген теофиллина с белком, имеющий следующую структуру: (тео-азо-БСА)

О

N

CHj-N-V

(

ел

(бычий сывороточный альбумин).

Этот антиген позволяет получить антитела с константами связывания

10 л/моль. По специфичности эти антитела близки к антителам, описанным в известном способе.

Из антитеофиллиновых сывороток выделяют иммуноглобулиновые фракции и метят их пероксидазой известным мето- Дом, Для сорбции на твердой фазе опробованы несколько коныогированных анСлЭ &

Ю

31573427

игенов теофиллина и для использования методе определения теофиллина выран коньюгат, позволяющий достичь аксимальной чувствительности. ,

При иммунизации коньюгированкым нтигеном всегда образуется три типа нтител: на носитель, на гаптен и на вязь между гаптеном и белком. При орбции на твердой фазе того хе конью-ю ата, который был использован для имунизации, связываются все три типа нтител, полного ингибирования связыания антител с антигеном свободным Препаратом добиться не удается, из-за 15 чего чувствительность метода оказывается невысокой. В предлагаемом способе она авна 0,5-1 мкг/мл. Для устранения влияния антител к носителю был синте- ирован коньюгированный антиген, от- 20 ичающийся от использованного для иммунизации белком-носителем; .

О

CHo-N VV™ 30;kX N NU м

25

N N СН3

(человеческий сывороточный альбумин).

При использовании такого коньюгата для сорбции на твердой фазе чувствиельность метода возросла до О,1 мкг/мл.

Следующим этапом работы был синтез коныогатов, отличающихся от использо ванного для иммунизации не только антигенным носителем, но и типом химической связи между гаптеном и белком.

Эти коньюгаты имели следующие структуры:

О СНз

зо

- 35

40

ЙС VNH(CH2)5NH

О N N

N СН3

(человеческий сывороточный альбумин)

О

СЩ-N,

ч)

О1

OC-N

XX VNHCH CONH

45

50

55

(ч

ко к но вр га да

ва на но ко ни пе и ши сы в те а пе с г с н с м с а ( в

в к п

в

с i

2 к 1

сн(человеческий сывороточный альбумин)

N

.N

О

XXVCHiCH CONH

ч ч „

N

-ю 15а20 .

25

зо

35

40

45

50

55

снз

(человеческий сывороточный альбумин).

Использование второго и третьего коньюгированных антигенов не приводит к существенному повышению чувствительности определения теофиллина, в то время как использование первого кокью- гата повышает чувствительность метода до 0,01 мкг/мл.

Для проведения анализа коньюгированный антиген тео-г/а-ЧСА сорбируют на твердой фазе (полистироловые 96-лу- ночные планшеты, пробирки, шарики) в концентрациях, достаточных для насыщения твердой фазы (они подбирались экспериментально). Аликвоты по 1-10 мкл из сывороток крови больных, получавших теофиллин, контрольных донорских сывороток или донорских сывороток с внесенным в них известным количеством теофиллина смешивают с разведенными антителами к теофиллину, мечеными пероксидаэой, и инкубировали 20 мин с сорбированным на твердой фазе антигеном. Количество антител, связавшихся с антигеном, оценивают по активности ферментной метки по сравнению с контролем. Активность пероксидазы можно измерить с помощью любого доступного субстрата, дающего после реакции с ферментом окрашенный продукт (ортофенилендиамин, 5-аминосалицило- вая кислота, о-дианизидин и др.).

Разведение антител подбирают предварительно таким образом, чтобы в контрольном опыте (донорские сыворотки без теофиллнна) получить значения поглощения, равные 1-1,3.

Пример 1. Получение коньюгиро™ ванного антигена теофиллина с бычьим

сывороточным альбумином (Т-азо-БСА). i

К 20 мг 8-аминотеофиллина в 10 мкл

муравьиной кислоты и 100 мкл 1 н.НС добавляют 6 мг NaNOj. при О С. Через 20 мин образовавшуюся диазониевую соль 8-аминотеофиллина по каплям добавляют к охлажденному раствору 100 мг бычьего сывороточного альбумина (БСА) в 1 мл 0,15 М фосфатного буфера, рН 8,2. Величину рН поддерживают равной 8-9 добавлением 1 н. NaOH. После 2-часового перемешивания при 0-10°С смесь

делят на колонке с сефадексом С-25 или диализуют против воды до тех пор пока поглощение в диализате при 290 нм не становится меньше 0,05. Белковую фракцию лиофильно высушивают. Содержание теофиллина в полученном коньюгированном антигенео определяют по разнице между УФ-спектрами конью- гата и БСА, исходя из Е °/о 87 для 8-аминотеофиллина, тогда при Е k - поглощении коньюгата в концентрации 1 мг/мл и поглощение исходного белка при той же концентрации, равном 0,3, и мол. м. белка и 8-аминотеофиллина, равных соответственно 69000 и 200, получают замещение в молях теофиллина на моль белка:

69000

Замещение г-

Ец-0,3

Полученный коньюгат содержит 13 молекул теофиллина на каждую молекулу белка.

Приме р2. Получение коньюги- рованного антигена теофиллина с человеческим сывороточным альбумином (Т-г/а-ЧСА).

К раствору 40 мг 8-аминотеофиллика и 90 мг человеческого сывороточного альбумина (ЧСА) и 2 мл 0,01 н. NaOH, охлажденного до 10°С, добавляют в течение 30 мин 120 мкл 25%-ного глутаро вого альдегида.Реакционную смесь перемешивают 1 ч и прикапывают NaBH в 100 мкл воды. После инкубации в течение 1 ч при комнатной температуре белок отделяют от низкомолекулярных продуктов реакции в соответствии с примером 1. После инкубации в течение 1 ч при комнатной температуре белок отделяют от низкомолекулярных продуктов реакции в соответствии с приме- ром 1. Полученный коньюгат лиофильно высушивают. По данным УФ-спектров в нем с одной молекулой белка связано 15 молекул теофиллина.

П р и м е р 3. Иммунизация животных и получение сывороток.

Беспородных серых кроликов иммунизируют коньюгированным антигеном Т-азо-БСА, 0,5 мг на .животное, коньюгат растворяют в 0,25 мл физиологического раствора и смешивают с 0,5 мл полного адьюванта Фрейнда до образования устойчивой эмульсии. Смесь вводят подкожно в шесть мест на спине кролика. Иммунизацию повторяют через

6 недель и далее с интерваюм г-4 недели с неполным адьювантом Фрейнда, Кровь берут через 7 дн. после иммунизации из ушной краевой вены кролика, инкубируют 30 мин в термостате при 37°С, центрифугируют при 3000 об./мин 30 мин. Полученную сыворотку хранят замороженной при -20°С. Специфичность антител к теофиллину определяют радиоиммунопогическим методом по связыванию с Н-теофиллином и твердофазным иммуноферментным методом. Специфичность антител к теофиллину, перекрестные реакции в процентах к теофиллину приведена в таблице.

П р и м е р 4„ Получение коньюгата иммуноглобулиновой фракции сыворотки с пероксидазой (1g-PO).

Иммуноглобулиновую фракцию получают из антитеофиллиновой сыворотки высаливанием сульфатом аммония 50%-ного насыщения. Пероксидазу из хрена, 4 мг, растворяют в 1 мп дистиллированной воды, добавляют 0,2 мл свежеприготовленного 100 мМ NaJ04 s перемешивают 20 мин при комнатной температуре, цеа- лизуют ночь при 4°С против 1 мМ буфера а-ацетатного, рН 4,4. Добавляют 20 мкл 200 мМ карбонатного буфера, рН 9, 6,8 мг иммуноглобулинов (растворенных в 1,0 мл 10 мМ карбонатного буфера, рН 9,6) и перемешивают 1 ч при комнатной температуре. Добавляют 0,1 мл свежеприготовленного NaBH4 (4 мг/мл воды) и инкубируют 2 ч при 4°С. Добавляют равный объем насыщенного сульфата аммония, центрифугируют, растворяют осадок в воде, диализуют против 0,15 М NaCl, добавляют БСА до 2%-ной концентрации, разбавляют в два раза глицерином и хранят при -20°С.

П р и м е р 5. Приготовление стандартных растворов теофиллина для построения калибровочных кривых.

Точные навески теофиллина растворяют в воде в концентрации 1 мг/л, затем соответствующие аликвоты этого раствора добавляют к пулу из 10 донор ских сывороток так, чтобы получить Стандарты, содержащие 1,5,10,20 и 30 мкг препарата в 1 мл сыворотки.

Измерение концентрации теофиллина в сыворотках крови твердофазным им- муноферментным методом.

Пример 7. Анализ проводят как в примере 6 с тем отличием, что на твердой фазе сорбируют антиген тео- , азо-БСА, а измеряемый объем сыворотки составляет 10 мкл (разведение 1:10).

Примерв. Анализ проводят как в примере 7, с тем отличием, что на твердой фазе был сорбирован коньюги- Ю рованный антиген тео-азо-ЧСА.

дни 0,98). Таким образом, длительность анализа сокращается на 20 мин по сравнению с известным способом при более высокой чувствительности.

Формула изобретения Способ определения теофиллина в

Коэффициент вариабельности метода не превышает 12%. Результаты измерения совпадают с данными, полученными П р и м е р 6. Коньюгированный ан- 15 методом жидкостной хроматографии высо тиген тео-г/а-ЧСА растворяют в 0,05 М КОго давления (коэффициент корреля- натрийкарбонат-бикарбонатном буфере (рН 9,6) в концентрации 1 мкг/мл и сорбируют на полистироловых 96-луноч- Ных планшетах по 100 мкл/лунку,при 20 А°С в течение ночи, затем твердую фазу отмывают 0,05%-ным раствором тритона Х-100 три раза и три раза водой.

Аликвоты по 1 мкл из сывороток крови больных, получавших теофиллин, или 25 сыворотке крови, включающий получение донорских сывороток, содержащих из- антител путем иммунизации животных вестное количество препарата, разво- коныогированным антигеном теофиллин- дят до 100 мкл буфером А: 0,01 М нат- белок, в котором теофиллин присоеди- рий-фосфатный буфер, содержащий 0,15М Нен к белку через О8 положение мо- NaCl, 0,05% твин-20 и 0,2% БСА, и сме-30 лекулы, сорбн и иммунохимических pea шивают с 100 мкл 1 g-PO в том же бу гентов на твердой фазе, добавления к фере в концентрации 50 мкг/мл. Смесь тщательно встряхивают и переносят на твердую фазу с сорбированным антигеном, инкубируют 20 мин, твердую фазу отмывают и приливают раствор субстрата (4 мкл 30%-ной HaOi и 4 мг ор- тофенилендиамина на 100 мл 0,1 М нат- рий-цитратного буфера, рН 5,0) детекция при 492 нм. Концентрации теофил- 40 белку азо-связью, а в качестве релина в расчете на разведение аликвоты агентов используют пероксидазу и до 100 мкл. Из полученного значения коньюга т, в котором теофиллин присое- поглощения, равного, например, 0,6, динен к белку лентаметилендиаминовой можно определить концентрацию теофил- связью,, причем белок в коньюгате, лина, вводимого в реакцию с антитела- 45 используемом для сорбции, отличается ; ми, она равна 0,16 мкг/мп, а, соот- По антигенности от белка, используе- ветственно, в исходной пробе 16 мкг/мл. мого для иммунизации.

иммобилизованным реагентам полученных антител и исследуемой сыворотки с последующим измерением оптической шют- 35 иости смеси, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа и его ускорения, для иммунизации используют коньюгат, в котором теофиллин присоединен к

Пример 7. Анализ проводят как в примере 6 с тем отличием, что на твердой фазе сорбируют антиген тео- азо-БСА, а измеряемый объем сыворотки составляет 10 мкл (разведение 1:10).

Примерв. Анализ проводят как в примере 7, с тем отличием, что на твердой фазе был сорбирован коньюги- рованный антиген тео-азо-ЧСА.

дни 0,98). Таким образом, длительность анализа сокращается на 20 мин по сравнению с известным способом при более высокой чувствительности.

Формула изобретения Способ определения теофиллина в

Коэффициент вариабельности метода не превышает 12%. Результаты измерения совпадают с данными, полученными методом жидкостной хроматографии высо КОго давления (коэффициент корреля-

сыворотке крови, включающий получение антител путем иммунизации животных коныогированным антигеном теофиллин- белок, в котором теофиллин присоеди- Нен к белку через О8 положение мо- лекулы, сорбн и иммунохимических pea гентов на твердой фазе, добавления к белку азо-связью, а в качестве реагентов используют пероксидазу и коньюга т, в котором теофиллин присое- динен к белку лентаметилендиаминовой связью,, причем белок в коньюгате, используемом для сорбции, отличается ; По антигенности от белка, используе- мого для иммунизации.

сыворотке крови, включающий получение антител путем иммунизации животных коныогированным антигеном теофиллин- белок, в котором теофиллин присоеди- Нен к белку через О8 положение мо- лекулы, сорбн и иммунохимических pea гентов на твердой фазе, добавления к белку азо-связью, а в качестве реагентов используют пероксидазу и коньюга т, в котором теофиллин присое- динен к белку лентаметилендиаминовой связью,, причем белок в коньюгате, используемом для сорбции, отличается ; По антигенности от белка, используе- мого для иммунизации.

иммобилизованным реагентам полученных антител и исследуемой сыворотки с последующим измерением оптической шют- иости смеси, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа и его ускорения, для иммунизации используют коньюгат, в котором теофиллин присоединен к

Изобретение относится к иммунохимии, конкретно к способу определения теофиллина в биологических жидкостях и может быть использовано для лекарственного мониторинга при терапии теофиллином: контроль за концентрацией препарата в организме больных, подбор индивидуальных доз для повышения эффективности терапии и устранения токсических явлений. Целью изобретения является повышение чувствительности и ускорения способа. Измерение теофиллина в сыворотке крови основано на конкуренции между теофиллином из пробы и теофиллином, связанным с твердой фазой азосвязью в антителами к теофиллину, меченными пероксидазой. Для анализа необходимо несколько мкл сыворотки или плазмы крови (достаточно капли крови из пальца), длительность анализа 30 проб составляет около 40 мин, чувствительность метода равна 0,01 мкг/мл теофиллина.