ПРИМЕНЕНИЕ СОДЕРЖАЩЕЙ СЛАДКУЮ МОЛОЧНУЮ СЫВОРОТКУ ДЕТСКОЙ СМЕСИ ДЛЯ ОБЕСПЕЧЕНИЯ ПОСТНАТАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО ТРАКТА МЛАДЕНЦА И ФОРМИРОВАНИЯ ФУНКЦИЙ КИШЕЧНИКА, КОТОРЫМИ ОНА УПРАВЛЯЕТ Российский патент 2020 года по МПК A61K35/20 A61P1/14 A23L33/17 

Область применения изобретения

Настоящее изобретение относится по существу к области здоровья нервной системы, защиты нервной системы и развития нервной системы. Изобретение, в частности, относится к введению белка сладкой молочной сыворотки для обеспечения развития энтеральной нервной системы у младенцев, в особенности у недоношенных младенцев с низким, очень низким и чрезвычайно низким весом при рождении.

Предпосылки создания изобретения

Нервная система является очень сложной сетью, состоящей из нервных и глиальных клеток. Она имеется у всех видов млекопитающих и состоит из центральной нервной системы (головной мозг и спинной мозг) и периферической нервной системы (соматической, автономной и энтеральной нервной системы).

Центральная нервная система управляет когнитивными функциями (память, внимание, восприятие, действие и т.д.). Вместе с периферической нервной системой она играет фундаментальную роль в управлении поведением. Соматическая нервная система отвечает за координацию движений тела (под контролем сознания). Автономная нервная система поддерживает гомеостаз при разных видах деятельности организма без контроля сознания (частота сердечных сокращений и т.д.). Наконец, в составе последней системы энтеральная нервная система непосредственно управляет функциями желудочно-кишечного тракта. Они включают в себя функцию желудочно-кишечного барьера и иммунную функцию, моторику, всасывание, пищеварение и экзокринную/эндокринную секрецию, которые участвуют в защите кишечника от любых типов повреждений и в обеспечении комфорта пищеварения [Neunlist, М. et al. (2008); Neuro-glial crosstalk in inflammatory bowel disease, J Intern. Med, 263: 577-583], [Burns, A.J. et al. (2009); Development of the enteric nervous system and its role in intestinal motility during fetal and early postnatal stages, Semin. Pediatr. Surg., 18:196-205], [Tapper, E.J. (1983); Local modulation of intestinal ion transport by enteric neurons, Am J Physiol., 244:G457-68].

Нервная система развивается во время беременности, а затем окончательно формируется в зрелую функциональную сеть в постнатальный период.

Вследствие важнейшей роли энтеральной нервной системы в функционировании желудочно-кишечного тракта незрелость или задержка созревания этой нервной системы приводит к задержке формирования и надлежащего функционирования основных функций желудочно-кишечного тракта. В частности, это способствует:

- незрелости моторики желудочно-кишечного тракта [Burns, A.J. et al. (2009); Development of the enteric nervous system and its role in intestinal motility during fetal and early postnatal stages, Semin. Pediatr. Surg., 18:196-205], что приводит к замедленному кишечному транзиту с более твердым стулом и вызывает дискомфорт в кишечнике, а в более выраженных случаях приводит к запору, к повышенной предрасположенности младенца к непереносимости энтерального питания, потребности в тотальном парентеральном питании и, в более тяжелых случаях, некротизирующему энтероколиту (НЭК) (Grave GD, Nelson SA, Walker WA, Moss RL, Dvorak B, Hamilton FA, Higgins R, Raju TN. New therapies and preventive approaches for necrotizing enterocolitis: report of a research planning workshop. Pediatr Res. 2007 Oct; 62(4): 510-4; Indrio F, Riezzo G, Cavallo L, Di Mauro A, Francavilla R. Physiological basis of food intolerance in VLBW. J Matern Fetal Neonatal Med. 2011 Oct; 24 Suppl 1:64-6;

- сниженной пищеварительной/всасывающей способности кишечника [Tapper, E.J. (1983); Local modulation of intestinal ion transport by enteric neurons, Am J Physiol., 244:G457-68]; Josef Neu & Liyan Zhang, Feeding intolerance in very low birth weight infants: What is it and what can we do about it? Acta Paediatrica 2005; 94 (suppl 449): 93-99];

- незрелости барьерной функции кишечника [Neunlist, М. et al. (2008); Neuroglial crosstalk in inflammatory bowel disease, J Intern. Med, 263: 577-583, Burns, A.J. et al. (2009)], что повышает риски развития инфекций, непереносимости энтерального питания и некротизирующего энтероколита (НЭК) [Athalye-Jape G, More К, Patole S Progress in the field of necrotising enterocolitis-year 2012.. J Matern Fetal Neonatal Med. 2013 May; 26(7): 625-32; Indrio F, Riezzo G, Cavallo L, Di Mauro A, Francavilla R. Physiological basis of food intolerance in VLBW. J Matern Fetal Neonatal Med. 2011 Oct; 24 Suppl 1:64-6].

Незрелую или поврежденную энтеральную нервную систему можно наблюдать у перечисленных ниже младенцев.

- Недоношенные младенцы, младенцы с низким весом при рождении (<2500 г), очень низким весом при рождении (<1500 г) и чрезвычайно низким весом при рождении (<1000 г). New J. Gastrointestinal development and meeting the nutritional needs of premature infants Am J Clin Nutr 2007; 85(2): 629S-634S.

- Младенцы, родившиеся преждевременно или в срок, с задержкой внутриутробного развития (ЗВУР), которая произошла в результате каких-либо нежелательных явлений во время беременности (курение матери, прием лекарственных препаратов матерью, низкое качество плаценты, неправильное расположение плаценты, неправильное питание матери и плода, избыточный стресс/тревожность матери и т.д.). [Shanklin D.R. and Cooke R.J. (1993); Effects of intrauterine growth on intestinal length in the human foetus, Biol Neonate, 64:76-81], [Neu, J. (2007); Gastrointestinal development and meeting the nutritional needs of premature infants, Am. J. Clin. Nutr., 85(2): 629S-634S], [, M.C.S. et al., (2003); Effects of pre- and postnatal protein energy deprivation on the myenteric plexus of the small intestine: a morphometric study in weanling rats, Nutr. Res., 23: 215-223].

- Любой новорожденный ребенок и младенец с задержкой развития нервной системы в результате, например, гипоксемии-ишемии при рождении или любого другого нежелательного явления [Taylor, С.Т. and Colgan S.P. (2007); Hypoxia and gastrointestinal disease, J. Mol. Med. (Berl.), 85:1295-300], [Barrett R.D. et al. (2007); Destruction and reconstruction: hypoxia and the developing brain, Birth Defects Res С Embryo Today, 81:163-76].

- Любой новорожденный ребенок и младенец с нарушениями функции желудочно-кишечного тракта (расстройствами пищеварения, расстройствами моторики, желудочно-кишечным рефлюксом, медленным желудочно-кишечным транзитом, непереносимостью перорального вскармливания), болезнью Гиршпрунга и воспалением, охватывающим желудочно-кишечный тракт (таким как некротизирующий энтероколит), и обструктивными патологическими состояниями [Burns A.J. et al. (2009); Development of the enteric nervous system and its role in intestinal motility during fetal and early postnatal stages, Semin. Pediatr Surg., 18(4):196-205].

Известно, что у людей клетки нервного гребня, из которых формируется энтеральная нервная система, развиваются у плода внутриутробно вскоре после зачатия (начиная с 7,5 недели развития) [Burns, A. J. and Thapar, N. (2006); Advances in ontogeny of the enteric nervous system, Neurogastroenterol. Motil., 18, 876-887]. Было показано, что энтеральная нервная система подвергается значительным изменениям после рождения до возраста шести лет, при этом до десяти лет продолжаются менее значительные изменения [Wester, Т. et al. (1999); Notable postnatal alterations in the myenteric plexus of normal human bowel, Gut, 44:666-674]. Таким образом, если плод, новорожденный ребенок или младенец имеет задержку развития нервной системы, желательно быстро обратить эту задержку так, чтобы развитие нервной системы «наверстывало» нормальный уровень. Желательно, чтобы любое повреждение энтеральной нервной системы было восстановлено как можно быстрее, так чтобы растущий плод или младенец имел как можно меньше нарушений функции желудочно-кишечного тракта или других патологических состояний, связанных с незрелой или поврежденной энтеральной нервной системой.

Таким образом, здоровое развитие энтеральной нервной системы у плода, новорожденного ребенка и растущего ребенка способствует управлению правильным формированием и сохранением моторики кишечника, барьерной функции кишечника и, таким образом, всасывательной и пищеварительной функциями кишечника. Это позволяет предотвратить воспалительные патологические состояния, связанные с нарушением функции кишечника, а также снижает риск развития инфекции и аллергии (Neunlist et al., 2008).

Таким образом, пери- и/или постнатальные вмешательства соответствуют многообещающему подходу для обеспечения здорового развития энтеральной нервной системы. Вмешательства во время беременности/лактации могут иметь значительные преимущества в отношении удобства и соблюдения назначений по сравнению с вмешательствами, рассчитанными на применение у ребенка.

Существует потребность в обеспечении и поддержании здорового развития и/или восстановления энтеральной нервной системы на самой ранней стадии беременности, а также на ранних этапах жизни новорожденного в ходе быстрого созревания нервной системы. Поскольку нервная система продолжает развиваться в течение первых лет детского возраста (до возраста приблизительно десяти лет), в этот период такая потребность в постоянной поддержке является актуальной.

В частности, существует потребность в поддержке здорового развития энтеральной нервной системы у новорожденных, младенцев и детей младшего возраста для их наилучшей подготовки к нагрузкам на желудочно-кишечный тракт, таким как изменения в рационе питания, химические (например, лекарственные препараты) или физические (трение) повреждения, инфекции, воспалительные/иммунные реакции и т.д., а также для улучшения будущего созревания их энтеральной нервной системы в последующей жизни.

Существует потребность в предоставлении такой поддержки или такой соответствующей композиции в форме, которая является приемлемой для популяции субъектов, в частности, для тех лиц в этих популяциях, которые являются наиболее уязвимыми или больше всего нуждаются в ней. Кроме того, существует потребность в том, чтобы не вызывать неблагоприятных явлений, побочных или негативных воздействий в такой популяции. Существует потребность в обеспечении таких решений для популяций субъектов наиболее простым и наиболее рентабельным способом.

Настоящее изобретение относится ко всем млекопитающим, включая животных и человека.

Изложение сущности изобретения

Изобретение относится к применению белка сладкой молочной сыворотки (SWP) для обеспечения здорового развития и/или восстановления энтеральной нервной системы у новорожденных детей. Белок сладкой молочной сыворотки может представлять собой модифицированный белок сладкой молочной сыворотки (MSWP), из которого удален казеиногликомакропептид (CGMP). SWP может быть частично или в значительной степени гидролизован.

Введение белка сладкой молочной сыворотки обеспечивает нормальное и здоровое развитие нервных и глиальных клеток в кишечнике. Оно также обеспечивает здоровую дифференциацию нейронов в периферической нервной системе. Таким образом, введение SWP в соответствии с изобретением позволяет предотвращать и лечить расстройства, связанные с незрелой или поврежденной энтеральной нервной системой. Введение SWP в соответствии с изобретением обеспечивает здоровое развитие и/или восстановление энтеральной нервной системы у молодых млекопитающих.

Расстройство может представлять собой нарушение барьерной функции кишечника, пищевую непереносимость или некротизирующий энтероколит. Расстройство может представлять собой расстройство, которое непосредственно связано с нарушением барьерной функции кишечника. В более общем случае расстройство может представлять собой нарушение моторной функции желудочно-кишечного тракта, что может проявляться в виде медленного кишечного транзита, дискомфорта в кишечнике, твердого стула, запора и/или желудочно-кишечного рефлюкса.

Введение белка сладкой молочной сыворотки плоду можно осуществлять через мать. Введение также можно осуществлять недоношенному или доношенному младенцу напрямую или через материнское молоко. Введение ребенку также можно осуществлять по существу вплоть до возраста шести лет или животному эквивалентного возраста.

Белок сладкой молочной сыворотки можно вводить младенцу или ребенку, начинающему ходить, непосредственно в чистом виде или разбавленным водой или грудным молоком, в виде биологически активной добавки к пище (БАД к пище) или вместе с обогатителем молока, или с любой молочной добавкой, применяемой во время алиментарного питания, в детской смеси, или в напитке на основе молока. Белок сладкой молочной сыворотки вводят младенцу или ребенку младшего возраста в суточной дозе, составляющей 30-80%, предпочтительно 60 мас. % общего потребления белка.

Период введения для плода составляет по существу по меньшей мере одну неделю, предпочтительно две недели, более предпочтительно по меньшей мере один месяц, а период введения для младенца или ребенка младшего возраста составляет по существу по меньшей мере 4 недели, предпочтительно 2-12 месяцев, более предпочтительно по меньшей мере 18 месяцев, а еще более предпочтительно вплоть до возраста 6 лет.

MSWP можно вводить недоношенному или доношенному младенцу, или ребенку, или молодому человеку совершеннолетнего возраста в дозе 1,6-3,2 г белка/100 ккал, предпочтительно 1,6-2,2 г белка/100 ккал и более предпочтительно 1,8-2,1 г белка/100 ккал. В одном варианте осуществления MSWP вводят младенцу в дозе от 1,0 до менее 1,6 г белка/100 ккал.

Изобретение относится к композиции, содержащей 30-80%, предпочтительно 60% белка сладкой молочной сыворотки для профилактики или лечения расстройств, связанных с незрелой или поврежденной энтеральной нервной системой, у молодого млекопитающего.

Изобретение относится к применению SWT, а более конкретно композиций, содержащих 30-80 мас. % SWP, для обеспечения здорового развития и/или восстановления энтеральной нервной системы у молодых млекопитающих.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Стимуляция сократительной реакции ex-vivo в тощей кишке электрическим полем.

Напряжения (площадь под кривой (AUC)), полученные при изометрических сокращениях тощей кишки в ответ на стимуляцию электрическим полем при 10 Гц у детенышей CTRL-w, PR-w и PR, которым добавляли различные молочные фракции, измеренные после умерщвления (14-й день после рождения). Результаты представляют собой медианы ± ст. ош. медианы, n=6-10 в зависимости от группы, Р<0,05; * по сравнению с CTRL-W и по сравнению с PR-W. Сокращения означают следующее: PR - ограничение белка; W - вода; MSWP28 - модифицированная сладкая молочная сыворотка Р28; концентрат GF - концентрат ростовых факторов.

Фиг. 2. Стимуляция сократительной реакции ex-vivo в тощей кишке ацетилхолином.

Напряжения (площадь под кривой (AUC)), полученные путем изометрических сокращений тощей кишки в ответ на стимуляцию ацетилхолином в концентрации 10^-6 М у детенышей CTRL-w, PR-w и PR, которым добавляли различные молочные фракции, измеренные после умерщвления (14-й день после рождения). Результаты представляют собой медианы ± ст. ош. медианы, n=6-10 в зависимости от группы, Р<0,05; * по сравнению с CTRL-W и по сравнению с PR-W. Сокращения означают следующее: PR - ограничение белка; W - вода; MSWP28 - модифицированная сладкая молочная сыворотка Р28; концентрат GF - концентрат ростовых факторов.

Подробное описание изобретения

Определения

В данном описании следующие термины имеют приведенные ниже значения.

«Младенцы»: в соответствии с Директивой Комиссии ЕС 2006/141/ЕС от 22 декабря 2006 г. о детских смесях и детских смесях для прикармливаемых детей, пункт 1.2 (а), термин «младенцы» означает детей младше 12 месяцев.

«Новорожденный ребенок» по существу означает младенца в возрасте до 6 месяцев.

«Недоношенный младенец» по существу означает младенца, рожденного ранее 37 недель беременности.

«Доношенный младенец» по существу означает младенца, рожденного после 37 недель беременности.

«Ребенок, начинающий ходить» по существу означает ребенка с момента, когда он научился ходить, до трех лет.

«Ребенок младшего возраста» по существу означает ребенка в возрасте от одного до десяти лет (и в эквивалентном возрасте у животных, если применяют термин «молодые млекопитающие»).

«Модифицированный белок сладкой молочной сыворотки» (MSWP) или «модифицированная сладкая молочная сыворотка» (MSW) означает белок сладкой молочной сыворотки, из которого удалена часть или весь казеиногликомакропептид (CGMP). В различных вариантах осуществления изобретения из MSW удаляют более 60%, более 75%, более 90%, более 95% или более 99 мас. % казеиногликомакропептида (CGMP) по сравнению со средним количеством, присутствующим в нативной сладкой молочной сыворотке того же происхождения (например, в коровьей сладкой молочной сыворотке).

Термин «пробиотик» означает препараты из клеток микроорганизмов или компоненты клеток микроорганизмов, которые оказывают благоприятное воздействие на здоровье или состояние организма-хозяина. [Salminen, S. et al. (1999); Probiotics: how should they be defined Trends Food Sci. Technol., 10 107-10]. Определение пробиотика является по существу общепризнанным и соответствует определению ВОЗ. Пробиотик может содержать уникальный штамм микроорганизма, смесь различных штаммов и/или смесь различных видов и родов бактерий. В случае смесей по-прежнему можно применять термин «пробиотик» в единственном числе для обозначения смеси пробиотиков или препарата. Для цели настоящего изобретения микроорганизмы рода Lactobacillus считаются пробиотиками.

«Пребиотик» по существу означает неперевариваемый ингредиент пищи, который благоприятно воздействует на организм-хозяина посредством селективного стимулирования роста и/или активности микроорганизмов, присутствующих в кишечнике организма-хозяина, и, следовательно, пытается улучшить состояние здоровья организма-хозяина.

«Аллергия» означает аллергию, которая была выявлена врачом и которую можно лечить эпизодически или более длительно. «Пищевая аллергия» означает аллергию, связанную с питательной композицией.

«Детские смеси»: в соответствии с Директивами Комиссии ЕС 2006/141/ЕС от 22 декабря 2006 г. и/или 91/321/ЕЕС от 14 мая 1991 г. по детским смесям и смесям для прикармливаемых детей, пункт 1.2 (с), термин «детские смеси» означает продукты питания, предназначенные для специального применения в пищу младенцами в первые четыре - шесть месяцев жизни, которые сами по себе удовлетворяют потребности в питании этой категории лиц. Необходимо понимать, что младенцев можно вскармливать исключительно детскими смесями или же лицо, осуществляющее уход за ребенком, может применять детскую смесь в качестве дополнения к грудному молоку. Это синоним широко распространенного выражения «начальная детская смесь».

«Смеси для прикармливаемых детей»: в соответствии с Директивами Комиссии ЕС 2006/141/ЕС от 22 декабря 2006 г. и/или 91/321/ЕЕС от 14 мая 1991 г. по детским смесям и смесям для прикармливаемых детей, пункт 1.2 (d), термин «смеси для прикармливаемых детей» означает продукты питания, предназначенные для специального применения в пищу младенцами старше четырех месяцев и составляющие основной жидкий компонент в рационе питания с постепенно увеличивающимся разнообразием рациона питания у этой категории лиц.

«Молочная смесь для детей 1-3 лет»: питательная композиция на основе молока, специально адаптированная для ребенка в возрасте от одного года до трех лет.

«Обогатитель грудного молока»: питательная композиция для младенцев или детей младшего возраста, предназначенная для добавления в грудное молоко или разведения грудным молоком.

Термин «гипоаллергенная композиция» означает композицию, которая с низкой вероятностью может вызывать аллергические реакции.

Термин «сиалилированный олигосахарид» означает олигосахарид, имеющий остаток сиаловой кислоты.

Термин «фукозилированный олигосахарид» означает олигосахарид, имеющий остаток фукозы.

Если иное не оговорено особо, все приведенные процентные значения даны в процентах по массе.

При применении в данном описании слова «содержит», «содержащий» и аналогичные слова не следует интерпретировать в исключительном или исчерпывающем смысле. Иными словами, предполагается, что они означают «включая, без ограничений».

Любую ссылку на документы предшествующего уровня техники в данном описании не следует рассматривать как признание того, что такой предшествующий уровень техники является широко известным или составляет часть общеизвестных знаний в области.

Пищевой белок обеспечивает незаменимые аминокислоты, необходимые для синтеза белка и роста, и качество белка имеет такое же значение, как и количество белка. В настоящем изобретении предложен белок сладкой молочной сыворотки для применения путем введения с целью обеспечения здорового развития энтеральной нервной системы у млекопитающих. Сладкую молочную сыворотку можно получить при изготовлении сыра, в частности, сладкую молочную сыворотку получают после коагуляции казеина сычужным ферментом.

Белок сладкой молочной сыворотки в соответствии с изобретением содержит 30-100 мас. % белка, предпочтительно >80 мас. % белка. Примером SWP, который можно применять в соответствии с изобретением, является SWP, продаваемый под товарным знаком Lacprodan Di9224™. Таким образом, SWP может быть в форме изолята белка сладкой молочной сыворотки или концентрата белка сладкой молочной сыворотки.

В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения белок сладкой молочной сыворотки представляет собой фракцию модифицированной сладкой молочной сыворотки, то есть белок сладкой молочной сыворотки со сниженным уровнем казеиногликомакропептида (CGMP) по сравнению с белком классической сладкой молочной сыворотки. Данная фракция сладкой молочной сыворотки называется «модифицированной сладкой молочной сывороткой» (MSW). Классическая сладкая молочная сыворотка может содержать от 4 до 40% CGMP в зависимости от способа обработки молока.

Фракция белка в коровьем молоке представляет собой смесь нескольких белков, причем все они имеют разный аминокислотный профиль. Казеиногликомакропептид (CGMP) получают путем протеолиза каппа-казеина с образованием пара-каппа-казеина, нерастворимой фракции, которая остается во фракции казеина, и CGMP, растворимой фракции, которая находится во фракции молочной сыворотки. Эта фракция молочной сыворотки со сниженным CGMP, или MSW, обеспечивает преимущество, связанное со сниженным содержанием треонина и повышенным содержанием триптофана, по сравнению с обычной сладкой молочной сывороткой и, следовательно, подходит в качестве источника белка для младенцев.

Данную фракцию сладкой молочной сыворотки можно дополнительно обработать для удаления минералов (катионов, анионов), лактозы или любого из этих веществ. При желании сладкую молочную сыворотку можно концентрировать. Подходящие источники сладкой молочной сыворотки доступны в продаже.

Удаление казеиногликомакропептида можно выполнить любым подходящим способом. Один подходящий способ описан в публикации ЕР0880902. В данном способе pH сладкой молочной сыворотки при необходимости доводят до 1-4,3. Затем сладкую молочную сыворотку приводят в контакт со слабоанионной смолой, которая является преимущественно щелочной, до тех пор, пока pH сладкой молочной сыворотки не стабилизируется на уровне приблизительно 4,5-5,5. После этого собирают фракцию сладкой молочной сыворотки, из которой было удалено значительное количество казеиногликомакропептида. В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения такая фракция белка молочной сыворотки со сниженным уровнем CGMP содержит приблизительно 28% белка, из которых CGMP составляет 2-3% общего количества белка, и, следовательно, называется MSWP28.

MSW, предназначенная для применения в соответствии с изобретением, может, разумеется, содержать более высокий процент белка, чем MSWP28, например 30-99% белка. Аналогичным образом, MSW, предназначенная для применения в соответствии с изобретением, может также содержать более высокий процент CGMP, чем MSWP28, например до 15, 20, 25 или 35% общего белка.

В соответствии с другим вариантом осуществления изобретения белок сладкой молочной сыворотки не является модифицированным и составляет минимум 50% белка. Например, SWP, продаваемый под товарным знаком Lacprodan Di9224™ компанией Aria Foods Ingredients, Skanderborgvej 277, 8260 Viby J, Дания, содержит 87% белка.

Другими примерами доступного в продаже немодифицированного белка сладкой молочной сыворотки для применения в соответствии с изобретением являются Lacprodan DI-8790, другой белок сладкой молочной сыворотки от компании Aria, 894 Instantised и МРС 485, запущенный в серийное производство компанией Fonterra (Новая Зеландия), YV0608, Armor Proéines (Франция) и BiPro, Davisco Food International inc (США, 11000 West 78th Street, Suite 210, Eden Prairie, MN 55344).

Белок сладкой молочной сыворотки может быть негидролизованным. Альтернативно в соответствии с некоторыми вариантами осуществления фракция белка сладкой молочной сыворотки может быть частично или в значительной степени гидролизована для профилактики аллергических реакций у младенцев, подверженных риску развития аллергии, а также для облегчения переваривания белка. Процесс гидролиза можно проводить по желанию и так, как известно в данной области. По существу гидролизат сывороточного белка получают путем ферментативного гидролиза фракции сладкой молочной сыворотки в один или более этапов. Например, для получения в значительной степени гидролизованного белка белки сладкой молочной сыворотки могут быть подвергнуты тройному гидролизу с применением, например, алкалазы 2,4 л (ЕС 940459), затем нейтразы 0,5 л (доступна от компании Novo Nordisk Ferment AG), а затем панкреатина при 55°C. Альтернативно для получения менее гидролизованной фракции белка сладкую молочную сыворотку можно подвергнуть двойному гидролизу с применением, например, ферментов NOVOZYMES, а затем панкреатина.

Установлено, что если применяемый белок сладкой молочной сыворотки по существу не содержит лактозы, то в процессе гидролиза белок подвергается блокаде лизина в гораздо меньшей степени. Это позволяет снизить степень блокады лизина с приблизительно 15 мас. % общего лизина до менее приблизительно 10 мас. % лизина; например приблизительно 7 мас. % лизина. Это существенно повышает питательное качество источника белка.

Введение SWP плоду можно осуществлять через мать. Введение также можно осуществлять недоношенному или доношенному младенцу напрямую или через материнское молоко. Введение также можно осуществлять ребенку младшего возраста по существу вплоть до возраста четырех лет или животному эквивалентного возраста.

Введение SWP молодому млекопитающему, которое может быть человеком (плод, младенец, ребенок, начинающий ходить, или ребенок младшего возраста) или животным, имеет положительное воздействие на развитие их энтеральной нервной системы, что позволяет этой системе нормально созревать и развиваться. Таким образом, введение белка сладкой молочной сыворотки в соответствии с изобретением позволяет предотвращать и лечить расстройства, связанные с незрелой или поврежденной энтеральной нервной системой.

Эти расстройства могут представлять собой, например, нарушение барьерной функции кишечника, нарушение барьерной функции кишечника или некротизирующий энтероколит. Последние состояния повышают риск развития инфекции и аллергии, что приводит к пищевой непереносимости (следовательно, к необходимости в парентеральной питательной поддержке). В более общем случае эти расстройства могут представлять собой нарушение моторной функции желудочно-кишечного тракта, что может проявляться в виде медленного кишечного транзита, дискомфорта в кишечнике, твердого стула, запора и/или желудочно-кишечного рефлюкса.

Благоприятное воздействие изобретения в особенности направлено на тех молодых млекопитающих, которые испытывали, например, задержку внутриутробного развития (ЗВУР), которая может происходить после любого нежелательного явления во время беременности (например, активного или пассивного курения матери, приема лекарственных препаратов матерью, низкого качества плаценты, неправильного расположения плаценты, недостаточного питания матери и/или плода и т.д.).

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что SWP и/или содержащие SWP композиции настоящего изобретения можно применять для обеспечения развития, функциональности, выживаемости, пластичности и дифференциации нейронов и для защиты нейронов от дегенерации, что было продемонстрировано стимулированием экспрессии белков, связанных с этими видами биологической активности. Такая дегенерация может развиваться после, например, каких-либо стрессовых ситуаций, таких как ситуации, влияющие на плод (внутриутробно), например упомянутая выше ЗВУР, или на новорожденных (гипоксия-ишемия при рождении, терапия кислородом и гипероксия, воспаление, потребность в парентеральной поддержке и т.д.), или любой причины, приводящей к окислительному стрессу. Было обнаружено, что SWP обеспечивает выживаемость нейронов и/или ограничивает или предотвращает гибель энтеральных нейронов, а также обеспечивает развитие нервной системы, что, например, важно для процессов развития.

У младенцев SWP и/или содержащие SWP композиции в соответствии с настоящими изобретениями можно применять для защиты энтеральной нервной системы от любого стресса, например происходящего в период развития нервной системы, и, следовательно, для ограничения и/или предотвращения вызванной стрессом задержки развития нервной системы и соответствующих нарушений функций кишечника.

Таким образом, в контексте настоящего изобретения SWP можно вводить уже после выявления задержки развития энтеральной нервной системы или для профилактики, когда такая задержка еще не наблюдается.

Положительное воздействие SWP на здоровое развитие кишечной нервной системы у млекопитающего более подробно описано в параграфах ниже.

Дозы SWP

Белок сладкой молочной сыворотки можно вводить младенцу или ребенку младшего возраста в дозе 1,6-3,2 г белка/100 ккал, предпочтительно 1,6-2,2 г белка/100 ккал и еще более предпочтительно 1,8-2,1 г белка/100 ккал.

Имеются опубликованные Комитетом по питанию ESPGHAN специальные рекомендации для недоношенных детей по количеству белка, которое им необходимо получать. В случае недоношенных детей, родившихся с весом менее 1 кг, рекомендованное потребление белка составляет от 3,6 до 4,1 г белка/100 ккал. Для младенцев, родившихся с весом от 1 до 1,8 кг, рекомендованное потребление белка составляет от 3,2 до 3,6 г белка/100 ккал [Agostini et al. (2010) JPGN 2010 (50), 1, Enteral Nutrient Supply for Preterm Infants].

Таким образом, количество SWP, вводимого недоношенному младенцу, надлежащим образом адаптировано в соответствии с действующими рекомендациями. Например, если в соответствии с одним вариантом осуществления изобретения SWP содержит 100% белка и SWP составляет 80% общего белка, вводимого недоношенному младенцу, то подходящее количество SWP, которое необходимо ввести недоношенному младенцу, составляет 2,8-3,2 г на 100 ккал для младенцев с массой тела менее 1 кг и 2,5-2,9 для младенцев с массой тела от 1 кг до 1,8 кг.

Вводимая доза SWP должна быть такой, чтобы потребление белка субъектом находилось в пределах соответствующих руководящих указаний (например, рекомендаций ВОЗ или комитета ESPGHAN).

Например, в предпочтительном варианте осуществления композиция содержит от приблизительно 9,0 до приблизительно 10,0 мас. % белка, более предпочтительно приблизительно 9,5 мас. % Это соответствует приблизительно 1,8 г белка/100 ккал. Преимущество, обеспечиваемое данной концентрацией белка, заключается в том, что она эквивалентна количеству белка, по существу присутствующему в грудном молоке, и соответствует нижнему пределу, описанному в Codex Alimentarius.

По существу MSWP может составлять от приблизительно 70 до приблизительно 100% общего белка в композиции. Таким образом, он может составлять 75%, 80%, 85%, 90% или 95% белка в композиции.

Таким образом, модифицированный белок сладкой молочной сыворотки в соответствии с изобретением можно по существу вводить младенцу или ребенку младшего возраста в дозе 1,6-3,2 г белка/100 ккал, предпочтительно 1,6-2,2 г белка/100 ккал и еще более предпочтительно 1,8-2,1 г белка/100 ккал.

Способ введения

(i) Введение младенцам

SWP можно вводить отдельно младенцам непосредственно перорально (например, в чистом виде или разбавленный водой или материнским молоком) в качестве биологически активной добавки к пище (БАД к пище) (например, в качестве добавки в виде обогатителя грудного молока или вместе с ним), или с любой молочной добавкой, применяемой во время алиментарного питания, или в качестве фармацевтической или нутрицевтической композиции, или в качестве ингредиента в детской молочной смеси. Такая смесь может представлять собой «смесь для недоношенных младенцев», если ребенок родился преждевременно или с низким весом при рождении, «начальную детскую смесь» или «смесь для прикармливаемых детей». Детская смесь может также представлять собой гипоаллергенную (НА) детскую смесь, в которой белки коровьего молока гидролизованы. Пример такой начальной детской смеси приведен в примере 2. SWP можно вводить в виде молочной смеси для детей 1-3 лет или в любом напитке на основе молока.

(ii) Введение детям младшего возраста

SWP можно также вводить перорально детям младшего возраста в форме фармацевтической или нутрицевтической композиции, молочной смеси для детей 1-3 лет, напитков на основе молока, биологически активных добавок к пище (БАД к пище), молочных йогуртов, десертов и пудингов, печенья и зерновых батончиков, каш и фруктовых напитков.

(iii) Введение беременным или кормящим матерям

SWP также можно вводить беременным или кормящим матерям перорально, предпочтительно посредством пищевых продуктов, напитков, диетических добавок или фармацевтических композиций.

(iv) Введение животным

SWP можно также вводить перорально животным отдельно, или в воде, или в форме биологически активной добавки к пище (БАД к пище), фармацевтической или нутрицевтической композиции, или молока, или корма для животных.

Введение с другими соединениями

SWP можно вводить отдельно (например, в чистом виде или разбавленный водой или молоком, включая грудное молоко) или в смеси с другими соединениями (такими как диетические добавки, питательные добавки, лекарственные препараты, носители, ароматизаторы, перевариваемые или неперевариваемые ингредиенты). Витамины и минеральные вещества представляют собой примеры типичных диетических добавок. В предпочтительном варианте осуществления SWP вводят в композиции, например детской смеси, вместе с другими соединениями, которые усиливают описанное благоприятное воздействие на молодых млекопитающих. Например, это может быть пробиотик.

Также можно вводить другие пробиотики. Предпочтительно для этой цели пробиотик можно выбрать из группы, состоящей из Bifidobacterium, Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus, Kluyveromyces, Saccharoymces, Candida, в частности, можно выбрать из группы, состоящей из Bifidobacterium longum, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium adolescentis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillusparacasei, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus lactis, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus salivarius, Lactococcus lactis, Enterococcus faecium, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii или их смесей, предпочтительно можно выбрать из группы, состоящей из Bifidobacterium longum NCC3001 (АТСС ВАА-999), Bifidobacterium longum NCC2705 (CNCM I-2618), Bifidobacterium longum NCC490 (CNCM I-2170), Bifidobacterium lactis NCC2818 (CNCM I-3446), Bifidobacterium breve штамм A, Lactobacillus paracasei NCC2461 (CNCM I-2116), Lactobacillus johnsonii NCC533 (CNCM I-1225), Lactobacillus rhamnosus GG (ATCC53103), Lactobacillus rhamnosus NCC4007 (CGMCC 1.3724), Enterococcus faecium SF 68 (NCC2768; NCIMB10415) и их смесей.

Другими примерами синергетических соединений, которые можно включить в композиции, в особенности в детскую смесь изобретения, являются пребиотические соединения. Пребиотик представляет собой неперевариваемый пищевой ингредиент, который благоприятно воздействует на организм-хозяин посредством селективного стимулирования роста и/или активности одной или ограниченного числа бактерий в толстом кишечнике и, таким образом, улучшает состояние здоровья организма-хозяина. Такие ингредиенты являются неперевариваемыми в том смысле, что они не расщепляются и не всасываются в желудке или тонком кишечнике и, таким образом, в интактном виде проходят в толстый кишечник, в котором они селективно ферментируются полезными бактериями. Примеры пребиотиков включают в себя некоторые олигосахариды, такие как фруктоолигосахариды (FOS), олигосахариды коровьего молока (CMOS) и галактоолигосахариды (GOS). Можно применять комбинацию пребиотиков, такую как 90% GOS и 10% короткоцепочечных фруктоолигосахаридов, например, в виде продукта, продаваемого под товарным знаком Raftilose®, или 10% инулина, например, в виде продукта, продаваемого под торговой маркой Raftiline®. Другие примеры пребиотиков, которые можно применять в контексте настоящего изобретения, включают в себя группу олигосахаридов, получаемых из молока или других источников, необязательно содержащих сиаловую кислоту, фруктозу, фукозу, галактозу или маннозу. Предпочтительными пребиотиками являются сиалоолигосахариды (SOS), фруктоолигосахариды (FOS), галактоолигосахариды (GOS), изомальтоолигосахариды (IMO), ксилоолигосахариды (XOS), арабиноксилоолигосахариды (AXOS), маннанолигосахариды (MOS), соевые олигосахариды, гликозилсахароза (GS), лактосахароза (LS), сиалиллактоза (SL), фукозиллактоза (FL), лакто-N-неотетраоза (LNNT), лактулоза (LA), палатинозаолигосахариды (РАО), мальтоолигосахариды, смолы и/или их гидролизаты, пектины, крахмалы и/или их гидролизаты. Детская смесь в соответствии с изобретением предпочтительно дополнительно содержит по меньшей мере один пребиотик в количестве от 0,3 до 10% общей массы сухой композиции.

В частности, олигосахариды грудного молока, например сиалилированные олигосахариды, описанные в документе WO 2012/069416, опубликованном 31 мая 2012 г., могут быть включены в композицию в соответствии с изобретением. Последние олигосахариды могут действовать синергично с SWP изобретения для обеспечения здорового развития энтеральной нервной системы млекопитающего у младенца или ребенка младшего возраста.

Суточные дозы углеводов и всех остальных соединений, вводимых с SWP, должны в любом случае соответствовать опубликованным руководящим указаниям по безопасности и нормативным требованиям. Это особенно важно при введении новорожденным детям, в частности детям с низким весом при рождении, очень низким или чрезвычайно низким весом при рождении.

Композиция, например детская смесь, содержащая SWP для введения в соответствии с одним вариантом осуществления изобретения, может содержать дополнительный источник белка в таком количестве, чтобы общее содержание белка составляло не более 4,0, 3,0 или 2,0 г/100 ккал, предпочтительно от 1,8 до 2,0 г/100 ккал. Предпочтительно, чтобы более 50 мас. % источника белка представляло собой молочную сыворотку, которая включает в себя модифицированную сладкую молочную сыворотку (MSW) и/или немодифицированную сладкую молочную сыворотку. Тип дополнительного источника белка не считается важным для настоящего изобретения при условии, что соблюдены минимальные требования по содержанию незаменимых аминокислот и обеспечивается удовлетворительной рост. В одном варианте осуществления содержание белка составляет от 30% до 80% белков молочной сыворотки. Таким образом, можно применять дополнительные источники белка, такие как обезжиренное молоко, казеин или соя. В одном варианте осуществления соотношение казеин/молочная сыворотка составляет от 70/30 до 20/80.

Белки могут быть интактными или гидролизованными или могут представлять собой смесь интактных и гидролизованных белков. Может быть желательно вводить частично гидролизованные белки (степень гидролиза от 2 до 20%), например, младенцам, предположительно подверженным риску развития аллергии на коровье молоко. При необходимости применения гидролизованных белков процесс гидролиза может проводиться по желанию и так, как известно в данной области.

Композиция может также содержать источник углеводов и/или источник жира. Детская смесь может содержать источник липидов. Источник липидов может представлять собой любой липид или жир, который подходит для применения в детских смесях. Предпочтительные источники жиров включают в себя пальмовое масло, подсолнечное масло с высоким содержанием олеиновой кислоты и сафлоровое масло с высоким содержанием олеиновой кислоты. Также можно добавлять незаменимые жирные кислоты, линолевую и α-линоленовую кислоту. В композицию можно включить одну или более незаменимых длинноцепочечных жирных кислот (ДЦ-ПНЖК). Примерами ДЦ-ПНЖК, которые можно добавлять, являются докозагексаеновая кислота (DHA) и арахидоновая кислота (АА). ДЦ-ПНЖК можно добавлять в таких концентрациях, которые составляют более 0,01% жирных кислот, присутствующих в композиции. Их можно добавлять как небольшие количества масел, содержащих большие количества предварительно подготовленной арахидоновой кислоты и докозагексаеновой кислоты, например рыбьих жиров или микробных масел. Можно добавлять пальмитиновую кислоту, предпочтительно в положении Sn-2. В целом содержание жиров должно быть предпочтительно таким, чтобы обеспечивать 30-55% общей энергетической ценности детской смеси. Источник жиров предпочтительно имеет соотношение жирных кислот n-6 к n-3 от приблизительно 5:1 до приблизительно 15:1; например от приблизительно 8:1 до приблизительно 10:1.

К питательной композиции можно добавлять дополнительный источник углеводов. Предпочтительно он должен обеспечивать от приблизительно 40% до приблизительно 80% энергетической ценности питательной композиции. Можно применять любой подходящий углевод, например сахарозу, лактозу, глюкозу, фруктозу, сухой кукурузный сироп, мальтодекстрин или их смесь.

При желании также можно добавлять дополнительное пищевое волокно. В случае добавления предпочтительно оно должно составлять до приблизительно 5% энергетической ценности питательной композиции. Дополнительное пищевое волокно может быть получено из любого подходящего источника, включая, например, сою, горох, овес, пектин, гуаровую камедь, аравийскую камедь, олигосахариды, включая FOS, GOS и олигосахариды, описанные выше, или их смесь. В питательную композицию можно включать подходящие витамины и минеральные вещества в количестве, соответствующем руководящим указаниям.

Примеры минеральных веществ, витаминов и других питательных веществ, необязательно присутствующих в детской смеси, включают в себя витамин A, витамин B1, витамин B2, витамин B6, витамин B12, витамин E, витамин K, витамин C, витамин D, фолиевую кислоту, инозит, ниацин, биотин, пантотеновую кислоту, холин, кальций, фосфор, йод, железо, магний, медь, цинк, марганец, хлорид, калий, натрий, селен, хром, молибден, таурин и L-карнитин. Минеральные вещества обычно добавляют в форме соли. Наличие и количества конкретных минеральных веществ и других витаминов зависят от целевой популяции младенцев.

Детская смесь может необязательно содержать другие вещества, которые могут оказывать благоприятное воздействие, такие как волокна, лактоферрин, нуклеотиды, нуклеозиды и т.п.

При желании в питательную композицию можно включить один или более пищевых эмульгаторов, например сложные эфиры диацетилвинной кислоты и моно- и диглицеридов, лецитин и моно- или диглицериды или их смесь. Можно включить аналогично подходящие соли и/или стабилизаторы. В композицию можно добавлять ароматизаторы.

Период введения

Длительность введения может быть различной. Хотя положительные эффекты ожидаются в течение относительно небольшого периода введения (например, ежедневного введения новорожденным в течение от одной до двух недель), при более длительном введении, предположительно, эффект будет более сильным или по меньшей мере сохранится у младенцев более старшего возраста (например, длительность введения три, пять, восемь или 12 месяцев) или у детей (например, длительность введения до 2, или 4, или 6 лет). При введении животным применяют соответствующую продолжительность введения.

Беременная мать может начинать прием модифицированного белка сладкой молочной сыворотки или стандартного (немодифицированного) белка сладкой молочной сыворотки, как только она узнает о своей беременности. Однако введение можно начинать также до начала беременности, например, если женщина стремится забеременеть. Введение можно начинать в любое время после начала беременности. Его можно начинать предпочтительно на 3, 4, 5, 6, 7 или 8-м месяце беременности в случае беременности у человека, или в соответствующие периоды для других млекопитающих, или не позднее чем за две недели до предполагаемой даты родов.

Период введения может быть непрерывным (например, до и включая лактацию и вплоть до отлучения от груди) или прерывистым. Непрерывное введение является предпочтительным в связи с развитием более устойчивого эффекта. Однако предполагается, что прерывистое введение (например, ежедневное введение в течение одной недели в месяц или каждую вторую неделю) может оказывать положительное воздействие на потомство.

Введение может охватывать по меньшей мере часть периода беременности и по меньшей мере часть периода лактации или эквивалентный период, если новорожденный не находится на грудном вскармливании. Предпочтительно период введения для беременной матери охватывает по существу весь период беременности, хотя он может быть меньше. Аналогичным образом, период введения для кормящей матери предпочтительно охватывает по существу весь период лактации, хотя, опять же, данный период может быть меньше.

Предпочтительно введение матери осуществляют посредством ежедневного приема внутрь (один или два раза в день) или еженедельного приема внутрь (один или два раза в неделю).

Модифицированный белок сладкой молочной сыворотки или стандартный белок сладкой молочной сыворотки можно вводить непосредственно младенцу. В частности, это актуально, если мать не осуществляет грудное вскармливание или когда она прекращает грудное вскармливание. Однако младенец на грудном вскармливании может также получать модифицированный белок сладкой молочной сыворотки или стандартный белок сладкой молочной сыворотки путем прямого введения.

Предпочтительно введение младенцу осуществляют путем ежедневного приема внутрь. Например, если модифицированный белок сладкой молочной сыворотки или белок сладкой молочной сыворотки вводят в детской смеси, введение осуществляют во время каждого кормления, т.е. от приблизительно четырех до приблизительно шести раз в сутки для младенцев, причем число кормлений уменьшается с возрастом. У детей младшего возраста (старше одного года) введение можно осуществлять реже, один или два раза в сутки. У детей, начинающих ходить, и детей до возраста шести лет введение осуществляют, если употребление молока рекомендовано для роста и развития.

Введение младенцу путем либо грудного вскармливания, либо непосредственного введения, либо обоими способами можно продолжать вплоть до шести месяцев, или даже одного года, или дольше. Таким образом, модифицированный белок сладкой молочной сыворотки или стандартный белок сладкой молочной сыворотки можно вводить во время лактации, если лактация имеет место, или после частичного или полного отлучения от груди. Введение можно продолжать в период, когда ребенок начинает ходить, и даже вплоть до возраста шести лет. Известно, что энтеральная нервная система продолжает развиваться у детей до этого возраста [Wester, Т. et al. (1999); Notable postnatal alterations in the myenteric plexus of normal human bowel, Gut, 44:666-674]. Таким образом, авторы настоящего изобретения предполагают, что введение модифицированного белка сладкой молочной сыворотки или стандартного белка сладкой молочной сыворотки можно продолжать для получения положительного эффекта, обычно до возраста шести лет.

Воздействие введения MSWP или стандартного SWP

Белок модифицированной сладкой молочной сыворотки или стандартной сладкой молочной сыворотки, который вводят новорожденным, обеспечивает здоровое развитие энтеральной нервной системы. В эксперименте с моделью на крысах, подробно описанном в примере 1, оценивали воздействие введения модифицированной сладкой молочной сыворотки (MSWP28) или доступного в продаже белка сладкой молочной сыворотки (Lacprodan Di9224) на развитие нервной системы.

В этом эксперименте детенышам с задержкой внутриутробного развития, индуцированной рационом питания матери (группа PR), и детенышам, у которых отсутствовала ЗВУР (CTRL), вводили в качестве добавки со 2-го дня после рождения воду (контрольные животные; а именно CTRL-w и PR-w) или одну из следующих фракций молока:

- Lacprodan Di9224: изолят сывороточного белка, сладкая молочная сыворотка, запущенный в серийное производство компанией Arla Foods Ingredients, Нидерланды;

- MSWP28: сладкая молочная сыворотка, модифицированная с помощью запатентованного способа Nestle (удаление cGMP);

- концентрат GF: концентрат ростовых факторов, который представляет собой изолят с высоким содержанием белка (97% белков), экстрагируемый непосредственно из обезжиренного молока и запущенный в серийное производство компанией Tatua (Tatuani, Новая Зеландия). Он содержит высокие концентрации IGF и TGF.

Их вводили детенышам в виде изоазотистых добавок (12% белков), так что биологическое воздействие можно отнести к качественному содержанию фракции молочной сыворотки, а не к количеству белков.

Объем добавок постепенно адаптировали для соответствия росту детенышей крыс (150 мкл/100 г массы тела). Таким образом, добавка обеспечивала от 1 до 5 мг белков в сутки на детеныша.

Группы были следующими:

1) CTRL-w: детеныши CTRL, рожденные от самок CTRL, получавшие в качестве добавки воду;

2) PR-w: детеныши PR, рожденные от самок PR, получавшие в качестве добавки

воду;

3) PR-Lacprodan Di9224: детеныши PR, рожденные от самок PR, получавшие в качестве добавки Lacprodan Di9224;

4) PR-MSWP28: детеныши PR, рожденные от самок PR, получавшие в качестве добавки MSWP28;

6) PR - концентрат GF: детеныши PR, рожденные от самок PR, получавшие в качестве добавки концентрат GF.

Через две недели после рождения, во время умерщвления, оценивали развитие нервной системы у детенышей двумя способами: (i) с использованием подхода с анализом экспрессии гена-мишени в тощей кишке и (и) путем измерения сократительной реакции ex-vivo тощей кишки на стимуляцию электрическим полем (EFS). В последнем способе измеряют сократительную реакцию, индуцированную энтеральной нервной системой, и, таким образом, созревание и степень функционирования энтеральной нервной системы.

Также оценивали сократительную реакцию ex-vivo тощей кишки на ацетилхолин, при этом измеряли сократительную реакцию собственно мышцы кишечника, которая, таким образом, отражает созревание и степень функционирования мышцы кишечника. Последний эксперимент выполняли в качестве контрольного, который позволял авторам изобретения разделить факторы, т.е. нервную систему и мышцу, контролирующие измеряемые сократительные реакции.

Сократительная реакция ex-vivo тощей кишки на EFS

Для оценки созревания нервной системы в модели ограничения белка и последующего добавления изолятов сладкой молочной сыворотки в соответствии с изобретением измеряли сократительную реакцию тощей кишки на EFS, которая является показателем роли/способности нейронной сети стимулировать мышечное сокращение. Возможную роль любого воздействия на мышечное созревание кишечника вследствие ограничения белка или после добавления изолятов сладкой молочной сыворотки оценивали путем измерения сократительной реакции тощей кишки на ацетилхолин.

Сократительная реакция тощей кишки на EFS снижалась у PR-w по сравнению с CTRL-w при частоте 10 Гц (Р=0,040) (Фиг. 1). У PR-w по сравнению с CTRL-w сократительная реакция тощей кишки на ацетилхолин значительно не снижалась, а лишь несущественно (Р=0,181) (Фиг.2). При совместном рассмотрении данные отражают нарушенное нейромышечное взаимодействие и, в частности, нарушенное созревание нервной системы в тощей кишке у детенышей с ограничением белка.

Добавление фракций сладкой молочной сыворотки (Lacprodan Di9224 и MSWP28) существенно увеличивало (Р=0,007 и 0,026 соответственно) сократительную реакцию тощей кишки при 10 Гц до уровня, статистически сходного с контролями (Фиг. 1). Это указывает на стимулирующее воздействие фракций сладкой молочной сыворотки на способность к стимуляции нервной системы в тощей кишке, что отражает обеспечение развития и функционирования нервной системы в неонатальном периоде. Созревание мышечного отделения тощей кишки в действительности существенно не изменялось после добавления фракций сладкой молочной сыворотки (Р=0,199 и 0,828 для Lacprodan Di9224 и MSW Р28 соответственно), поскольку способность к сократительной реакции тощей кишки на ацетилхолин оставалась неизменной по сравнению с PR-w (Фиг. 2).

При совместном рассмотрении эти данные свидетельствуют о том, что стандартный и модифицированный белок сладкой молочной сыворотки (Lacprodan Di9224 и MSWP28 соответственно в эксперименте) улучшают нейронно-опосредованную мышечную сократительную реакцию на EFS в тощей кишке у детенышей PR. Это свидетельствует о том, что белок сладкой молочной сыворотки обеспечивает постнатальное развитие и функциональность энтеральной нервной системы.

Такое стимулирующее воздействие не наблюдали в ответ на стимуляцию ацетилхолином, что предполагает отсутствие улучшения сократительной реакции гладких мышц на ацетилхолин, т.е. отсутствие стимуляции постнатального созревания гладких мышц.

Таким образом, эти данные четко показывают благоприятное воздействие белка сладкой молочной сыворотки на обеспечение развития и функционирование нервной системы в постнатальный период. На основании этих данных сладкая молочная сыворотка представляет собой новое пищевое решение для профилактики или лечения расстройств, связанных с незрелой и/или нарушенной энтеральной нервной системой у молодых млекопитающих до возраста приблизительно шести лет, в частности в течение неонатального периода (для человека обычно определяемого как первые 6 месяцев жизни).

Экспрессия генов, вовлеченных в развитие нервной системы кишечника

В эксперименте на модели с крысами в примере 1 в тощей кишке изучали воздействие ограничения белка, а также ограничения белка с последующим добавлением фракций молока на экспрессию основных генов, вовлеченных в биологические пути развития нервной системы, с применением подхода, включающего анализ экспрессии генов. Исследованные гены перечислены в таблице 2, а данные представлены в таблице 3. Данные для генов, экспрессируемых незначительно или совсем не экспрессируемых, не представлены.

Среди остальных 35 генов, экспрессируемых на уровне обнаружения, для 18 из них наблюдали значимое взаимодействие между видом обработки (ограничение белка) и добавкой (фракции молока) (таблица 3). Гены, которые экспрессировались с существенными отличиями, являются генами, преимущественно вовлеченными в созревание или дифференциацию нейронов и глиальных клеток, или являются маркерами развития и пластичности нервной системы.

Авторы настоящего изобретения ранее показали (Cettour and Faure, рукопись в процессе подготовки), что у детенышей с ограничением белка (PR) присутствуют компенсаторные механизмы, помогающие обеспечить развитие клеток и нервной системы в тонком кишечнике. Настоящие данные подтверждают эти результаты. В частности, экспрессия генов нейротрофических факторов и их рецепторов, таких как NGF (фактор роста нервов), Gfral (рецептор альфа-1 семейства GDNF), Gfra2 (рецептор альфа-2 семейства GDNF), Ntf4 (нейротрофин 4), S100B (кальций-связывающий белок В группы белков S100) и синаптофизина, были существенно повышены в группе PR-w по сравнению с группой CTRL-w. Этот факт, по-видимому, отражает дисбаланс и «стрессовую» ситуацию у животных, для которых тем не менее остается характерной недостаточность стимуляции созревания нервной системы, что продемонстрировано результатами после стимуляции EFS.

Добавка Lacprodan Di9224 существенно повышала экспрессию генов NGF, NGFr (рецептор фактора роста нервов) и Chrm3 (мускариновый рецептор 3) и снижала экспрессию S100b до уровня, аналогичного уровню экспрессии у CTRL-w (таблица 3). Повышенная экспрессия генов NGFr и NGF вместе с повышенной экспрессией NGF у PR свидетельствует об активации роста, развития и выживаемости нейронов, как показано на Фиг.1 [Tessarollo, (1998) Pleiotropic functions of neurotrophins in development. Cytokine Growth Factor Rev. 9(2): 125-37]. Следует отметить, что концентрации NGF и NGFr были повышены у PR-w по сравнению с CTRL-w, но это повышение было значимым только для NGF.

Добавка с MSWP28 существенно повышала экспрессию генов Crhr1, АроЕ, NGFr, Ntf3 (нейротрофин 3), Chrm2 и 3 (мускариновый рецептор 2 и 3) и TGFb2 и существенно снижала экспрессию S100b. Опять же, повышенная экспрессия генов NGFr и Ntf3 может играть роль в обеспечении роста и развития нейронов и может, по меньшей мере частично, объяснять созревание нейронов, наблюдаемое на Фиг. 1.

Мускариновые рецепторы, кодируемые геном Chrm2 и СЬгтЗ, вовлечены в сократительную способность и моторику кишечных мышц в ответ на ацетилхолин [Chen J, Wen J, Cai W. (2012) Smooth muscle adaptation and recovery of contractility after massive small bowel resection in rats. Exp Biol Med (Maywood). May 1; 237(5):578-84]. Аналогичным образом, рецептор кортикотропин-рилизинг гормона (Crhr), также известный как кортикотропин-рилизинг фактор, и аполипопротеин Е участвуют в путях сокращения мышц и моторики [ Y, Kiank С, Stengel А. (2009) A role for corticotropin-releasing factor in functional gastrointestinal disorders Curr Gastroenterol Rep. Aug; 11(4):270-7; Vincelette J, Martin-McNulty B, Vergona R, Sullivan ME, Wang YX, (2006) Reduced cardiac functional reserve in apolipoprotein E knockout mice Transl Res. Jul; 148(1):30-6)].

После добавки MSWP28 экспрессия chrm3 и экспрессия ранее упомянутых генов, вовлеченных в пути сократимости мышц, были существенно повышены по сравнению с PR-w. Этот факт может свидетельствовать о стимуляции созревания мышц кишечника, однако ему нужно уделить дополнительное внимание, поскольку повышенная экспрессия генов все же не транслировалась в измеримое функциональное преимущество, что продемонстрировано неизменной сократительной реакцией на ацетилхолин во время умерщвления детенышей (Фиг. 2).

Добавка концентрата ростовых факторов существенно повышала экспрессию гена Crhr1 и существенно снижала экспрессию GDNF, GFra1, Neurod1, S100b и Syp. В отличие от MSWP 28 и Lacprodan Di 9224, после добавки концентрата ростовых факторов повышенные уровни экспрессии пути NGF (путь фактора роста нервов) не наблюдались. Это согласуется с результатом, что благоприятное воздействие на нейронно-опосредованную сократительную реакцию (EFS) тощей кишки (Фиг. 1) после добавки GF1 не наблюдалось.

Уровень экспрессии гена NGFr был существенно повышен после введения добавки MSWP28 или LacprodanDi9224, причем повышенная экспрессия генов, индуцированная ограничением белка в этих группах, получающих добавку, сохранялась. Это явно свидетельствует о стимуляции пути NGF.

Нейротрофины, подобные NGF, и их рецепторы экспрессируются на высоком уровне в периферической и центральной нервной системе. В подходах с целенаправленным воздействием на ген у мышей была описана роль нейротрофинов в стимулировании эволюционного созревания нейронов периферической и центральной нервной системы, что подтверждает их решающую роль в развитии нервной системы. Обзор приведен в Tessarollo, L. (1998). NGF также имеет большое значение для выживания и сохранности симпатических и чувствительных нейронов. Без него эти нейроны подвергаются апоптозу [Freeman RS et al., (2004) NGF deprivation-induced gene expression: after ten years, where do we stand? "NGF and Related Molecules in Health and Disease". Prog. Brain Res. Progress in Brain Research 146: 111-26]. Фактор роста нервов вызывает рост аксонов. Существует подтверждение того, что NGF циркулирует по всему организму и имеет значение при поддержании гомеостаза. [Levi-Montalcini R (2004). "The nerve growth factor and the neuroscience chess board". Prog. Brain Res. 146: 525-7]. Человеческое и коровье молоко также имеет NGF-активность, которая, предположительно, играет роль в постнатальном неврологическом развитии и имеет нейропротекторный эффект у новорожденного [Gaull, G.E., Wright, СЕ. & Isaacs, СЕ. (1985). Significance of growth modulators in human milk. Pediatrics. 75: 142-145].

Модификации экспрессии генов, представленные в таблице 3, и, в частности, стимуляция пути NGF, вероятно, вносят вклад в наблюдаемую активацию нейронных стимулирующих реакций на EFS в группах, получавших добавку MSW Р28 и Lacprodan, как показано на Фиг. 1.

К популяциям, которые могут получить преимущество из изобретения, относятся:

- недоношенные младенцы, младенцы с низким весом при рождении (<2500 г), младенцы с очень низким весом при рождении (<1500 г) и младенцы с чрезвычайно низким весом при рождении (<1000 г);

- младенцы, родившиеся преждевременно или в срок, с задержкой внутриутробного развития (ЗВУР), которая произошла в результате каких-либо нежелательных явлений во время беременности;

- любой новорожденный ребенок и младенец с задержкой развития нервной системы в результате, например, гипоксемии-ишемии при рождении или любого другого нежелательного явления;

- любой новорожденный ребенок и младенец или ребенок до возраста шести лет с нарушениями функции желудочно-кишечного тракта (расстройствами пищеварения, расстройствами моторики, желудочно-кишечным рефлюксом, медленным желудочно-кишечным транзитом, непереносимостью перорального кормления), болезнью Гиршпрунга и воспалением, охватывающим желудочно-кишечный тракт (таким как некротизирующий энтероколит), и обструктивными патологическими состояниями.

Изобретение далее описано со ссылкой на следующие примеры. Следует понимать, что изобретение в заявленном виде не должно быть каким-либо образом ограничено этими примерами.

Хотя изобретение описано при помощи примера, следует понимать, что возможно внесение изменений и модификаций без отклонения от объема изобретения, определяемого пунктами формулы изобретения. Кроме того, если существуют эквиваленты конкретных свойств, такие эквиваленты включены так, как если бы они конкретно были упомянуты в данном описании.

Пример 1

Исследование на животных (вскармливание и умерщвление)

Эксперименты на животных проводили в соответствии с разрешением №2120, выданным Office Vétérinaire Cantonal, Etat de Vaud. Двухмесячные самки крыс Спрег-Доули после одной недели беременности были получены от компании Harlan, г. Барселона. В день их прибытия самок крыс помещали в индивидуальные клетки и случайным образом распределяли в контрольную группу (CTRL) или в группу с ограничением белка (PR). У животных имелся неограниченный доступ к пище и воде, и для них поддерживали 12-часовой цикл света/темноты.

Рационы питания самок CTRL и PR подробно указаны в таблице 1. Самки CTRL получали контрольный рацион питания, содержащий 20% белков (казеина) в соответствии со стандартным требованием по обеспечению крысы белком во время беременности (Reeves, P.G., Nielsen, F.H., Fahey, G.C., JR. 1993. AIN-93 Purified Diets for Laboratory Rodents: Final Report of the American Institute of Nutrition Ad Hoc Writing Committee on the Reformulation of the AIN-76A Rodent Diet. J. Nutr. 123:1939-1951). Самки PR получали рацион питания PR, содержащий 10% белков (казеина). Оба рациона были изокалорийными, причем дефицит белка компенсировали путем добавления кукурузного крахмала.

Самки CTRL и PR получали соответствующие рационы питания в период беременности и лактации вплоть до дня умерщвления (14-й день после родов (PND 14)).

В PND 2 детенышей случайным образом распределяли между самками одной и той же экспериментальной группы и размер помета доводили до 9 детенышей на одну самку, причем минимальное число самцов составляло от четырех до пяти на один помет.

С PND 2 до PND 14 контрольным или получающим обработку группам ежедневно в пищу добавляли рукой/пипеткой воду или одну из следующих фракций молока соответственно. Объем добавок постепенно адаптировали для соответствия росту детенышей крыс (150 мкл/100 г массы тела).

Группы и рационы питания были следующими:

1) CTRL-w: детеныши CTRL, рожденные от самок CTRL, получавшие в качестве добавки воду;

2) PR-w: детеныши PR, рожденные от самок PR, получавшие в качестве добавки

воду;

3) PR-Lacprodan D19224: детеныши PR, рожденные от самок PR, получавшие в качестве добавки Lacprodan Di9224;

4) PR-MSWP28: детеныши PR, рожденные от самок PR, получавшие в качестве добавки MSWP28;

5) PR - концентрат GF: детеныши PR, рожденные от самок PR, получавшие в качестве добавки концентрат GF.

Фракции молока:

- Lacprodan Di9224: изолят сывороточного белка, сладкая молочная сыворотка, запущенный в серийное производство компанией Arla Foods Ingredients, Дания;

- MSWP28: сладкая молочная сыворотка, модифицированная с помощью запатентованного способа Nestle (удаление cGMP);

- концентрат GF: концентрат ростовых факторов, запущенный в серийное производство компанией Tatua, Новая Зеландия. Он содержит повышенные уровни IGF и TGF.

На PND 14 максимум 10 детенышей из групп CTRL и PR взвешивали и затем умерщвляли посредством декапитации после анестезии галотаном.

Вскрывали брюшную полость посредством продольного разреза брюшной стенки и весь желудочно-кишечный тракт удаляли и освобождали от брыжейки. Изолировали первую 1/3 сегмента тощей кишки после связки Трейтца и разделяли на несколько сегментов. Один сегмент ополаскивали фосфатно-солевым буферным раствором (ФБР) при комнатной температуре и помещали в холодный раствор Кребса для измерений сократительной реакции ex-vivo. Один сегмент промывали ледяным ФБР для удаления полостного материала, переносили в отдельные криопробирки, мгновенно замораживали в жидком азоте и хранили при -80°C до проведения генного анализа.

Развитие нейронов в тощей кишке оценивали двумя способами: (i) с использованием подхода с анализом экспрессии гена-мишени и (И) путем измерения сократительной реакции ex-vivo тощей кишки на стимуляцию электрическим полем (EFS).

Сократительная реакция ex-vivo тощей кишки на стимуляцию электрическим полем (EFS)

Сегменты дистального отдела тощей кишки длиной приблизительно 1 см помещали в холодный раствор Кребса (CaCl₂ (5 мМ), MgCl₂⋅6H2O (1,2 мМ), NaCl (120 мМ), NaH₂PO₄⋅H₂O (1,2 мМ), NaHCO₃ (15,5 мМ), KCl (5,9 мМ), фенолового красного (0,005 мМ) и глюкозы (11,5 мМ)), преоксигенировали 95% O₂/5% СО₂. Сегменты кишечника подвешивали вдоль их продольной оси в инкубатор тканевых культур (объемом 50 мл), заполненный раствором Кребса, оксигенированный 95% O₂/5% CO₂, при 37°C. Один конец мышцы присоединяли к неподвижному зажиму. Другой конец присоединяли посредством неэластичного провода к датчику изометрического измерения силы. Выдерживали в течение стабилизационного периода 30 мин для получения спонтанных сокращений. Затем ткань растягивали до начальной длины так, что любое дополнительное растяжение увеличивало бы натяжение в покое. Изометрическую сократимость дистального отдела тощей кишки индуцировали ацетилхолином (Ach, 10^-5 М) или стимуляцией электрическим полем (EFS, 5-10 Гц). Ach применяли в течение 1 мин. После завершения кривой дозовой зависимости полосы тестировали с применением 80 мМ KCl для того, чтобы убедиться, что они сохранили свою способность к сокращению. Сигналы регистрировали в цифровом виде на компьютере с использованием программы Powerlab Chart 3.4. Результаты нормализовали по площади в поперечном сечении после осторожного промакивания и взвешивания фрагментов ткани. Нелинейные аппроксимации проводили с использованием программы Prism 4.0 (GraphPad Software, Inc., г. Сан-Диего, США). Для получения частот выполняли анализ спектральной плотности мощности измеряемого сигнала. Применяли фильтр верхних частот с граничной частотой 2 Гц (гораздо меньше частоты Найквиста 100 Гц). Применяли метод Уэлча для расчета спектральной плотности мощности с 1,3 секунды перекрытия и с наложением низкочастотной дискретизации: серии частот устанавливали от 0 до 2 Гц с равными промежутками по 0,05 Гц. Расчеты спектральной плотности мощности проводили с применением алгоритма Герцеля. Выбирали три частоты, соответствующие трем наибольшим значениям мощности ниже 2 Гц.

Анализ экспрессии генов

Общую РНК экстрагировали из тощей кишки детенышей PR и CTRL с применением фенол/хлороформного способа с реагентом TriPure® (Roche Diagnostics, г. Базель, Швейцария) в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, образцы замороженной ткани (50-100 мг) гомогенизировали в 1 мл TriPure® с использованием TissueLyser (Qiagen AG, г. Базель, Швейцария). Количество и качество выделенной РНК измеряли с применением набора для количественного определения РНК RiboGreen (Invitrogen-Molecular Probes, г. Карлсбад, штат Калифорния, США) и набора RNA 6000 Nano LabChip (Agilent Technologies) в соответствии с инструкциями, предоставляемыми с этими наборами. Обратную транскрипцию проводили с применением олигопраймера (dT15) (Promega, г. Мэдисон, штат Висконсин, США) и системы для обратной транскрипции ImProm-II(tm) (Promega) в соответствии с инструкциями, предоставляемыми производителем, с применением 1 мкг общей РНК.

Уровни экспрессии основных генов, вовлеченных в развитие энтеральной нервной системы (см. таблицу 2), оценивали посредством 2-этапной количественной ОТ-ПЦР в реальном времени с использованием системы RT Profiler PCR Array System компании Sybergreen (SABiosciences).

Измерения проводили в двух повторностях с применением специфичных наборов праймеров и флуоресцентных зондов TAMRA во время лог-линейной фазы реакции ПЦР на системе для быстрого ПЦР в реальном времени 7600НТ TaqMan Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems) с применением программного обеспечения Sequence Detection Software версии 2.2. Реакции ПЦР проходили в лунках объемом 2 мкл, предварительно загруженных специфичными праймерами и зондами от производителя в каждую из 384 лунок реакционной карты. Реакцию проводили с использованием конечной концентрации образца кДНК 0,8 нг/мкл с универсальной смесью для ПЦР TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems), содержащей ферменты ДНК-полимеразы AmpliTaq Gold DNA Polymerase (Applied Biosystems), нуклеотиды и флуоресцентный краситель ROX как эталон пассивной загрузки. Последовательности используемых праймеров и зондов конструировали и проверяли в компании Applied Biosystems и получали из библиотеки по крысам в компании Assay-on-Demand. Уровень относительной экспрессии каждого гена нормализовали с применением геометрического среднего контрольных генов (тех, экспрессия которых была статистически стабильной для экспериментальных групп в наших условиях).

Статистические данные

Влияние ограничения белка оценивали путем сравнения групп PR и CTRL. Влияние введения добавок на белковой основе оценивали путем сравнения каждой группы PR, получавшей добавку, с группой PR-w. Возможное восстановление до уровней CTRL оценивали путем сравнения каждой группы PR, получавшей добавку, с группой CTRL-w.

Для анализа данных использовали непараметрические способы, для тестирования различий между группами лечения использовали критерий ранговых сумм Уилкоксона. Также применяли способ Ходжеса-Лемана для расчета парного различия между типами лечения с 95%-м доверительным интервалом.

Статистический анализ экспрессии генов выполняли на отсчетах первичных циклических порогов (Ct), предположив, что они являются log 2-значениями. Однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) применяли к различиям: ген - эталонный ген, рассчитанное p-значение представляет собой вероятность того, что по меньшей мере одна из групп отличается от других. Расчеты выполняли с использованием 5 потенциальных конститутивных генов или с использованием среднего из более одного, сохраняли только наиболее стабильные по критериям наименьшей остаточной ошибки.

Пример 2

Ниже приведен пример композиции детской смеси для применения в соответствии с настоящим изобретением. Эта композиция приведена только для иллюстрации. Источник белка представляет собой смесь 60% MSWP28 и 40% казеина.

Изобретение относится к области педиатрии и может быть использовано для профилактики или лечения расстройств, связанных с незрелой или поврежденной энтеральной нервной системой у младенца или ребенка младшего возраста. Для этого применяют белок сладкой молочной (SWP) сыворотки, который вводят младенцу или ребенку младшего возраста в суточной дозе, составляющей 30-80% общего потребления белка. Изобретение обеспечивает развитие энтеральной нервной системы у младенцев, особенно у недоношенных и младенцев с низким весом при рождении. 15 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 табл., 2 пр.

1. Применение белка сладкой молочной сыворотки в профилактике или лечении по меньшей мере одного расстройства, связанного с незрелой или поврежденной энтеральной нервной системой, у младенца или ребёнка младшего возраста, причём белок сладкой молочной сыворотки вводят младенцу или ребёнку младшего возраста в суточной дозе, составляющей 30-80% общего потребления белка.

2. Применение по п. 1, где белок сладкой молочной сыворотки представляет собой модифицированный белок сладкой молочной сыворотки (MSWP), из которого частично или полностью удален СGMP.

3. Применение по п. 1 или 2, где расстройство представляет собой нарушение моторной функции желудочно-кишечного тракта, проявляющееся в виде медленного кишечного транзита, дискомфорта в кишечнике, твердого стула, запора и/или желудочно-кишечного рефлюкса.

4. Применение по п. 1 или 2, где патологическое состояние представляет собой нарушение барьерной функции кишечника, пищевую непереносимость или некротизирующий энтероколит.

5. Применение по п. 1 или 2, где белок сладкой молочной сыворотки содержит по меньшей мере 88 мас.% белка, имеет максимальное содержание жира 0,2 мас.% и содержание CGMP до 40 мас.%.

6. Применение по п. 2, где белок сладкой молочной сыворотки имеет конечное содержание CGMP менее 15 мас.%, предпочтительно менее 10 мас.%, более предпочтительно менее 5 мас.%.

7. Применение по п. 1 или 2, где белок сладкой молочной сыворотки имеет степень гидролиза от 2 до 20%.

8. Применение по п. 1 или 2, где младенец или ребёнок младшего возраста представляет собой недоношенного или доношенного младенца, или ребенка в возрасте до шести лет.

9. Применение по п. 1 или 2, где младенец или ребёнок младшего возраста испытывал гипоксемию-ишемию при рождении, испытывал или испытывает ЗВУР, и/или имел или по прогнозам должен иметь низкий, очень низкий или чрезвычайно низкий вес при рождении, и/или страдает или страдал от задержки развития энтеральной нервной системы либо внутриутробно, либо во время рождения, либо после рождения.

10. Применение по п. 1 или 2, где введение младенцу или ребёнку младшего возраста осуществляется через кормящую мать и/или непосредственно младенцу или ребёнку младшего возраста.

11. Применение по п. 1 или 2, где период введения младенцу или ребенку младшего возраста имеет продолжительность по меньшей мере 4 недели, предпочтительно 2-12 месяцев, а более предпочтительно в течение периода по меньшей мере 18 месяцев и даже более, предпочтительно до достижения ребенком возраста 6 лет.

12. Применение по п. 1 или 2, где белок сладкой молочной сыворотки вводят младенцу или ребенку, начинающему ходить, непосредственно в чистом виде или разбавленным водой или грудным молоком, в виде биологически активной добавки к пище (БАД к пище), или вместе с обогатителем молока, или с любой молочной добавкой, используемой во время алиментарного питания, в детской смеси для преждевременно родившихся младенцев, начальной детской смеси или смеси для прикармливаемых детей, или молочной смеси для детей 1-3 лет, или в напитке на основе молока.

13. Применение по п. 1 или 2, где введение кормящей матери или младенцу, или ребёнку младшего возраста осуществляется перорально, предпочтительно посредством пищевых продуктов, напитков, диетических добавок или фармацевтических композиций.

14. Применение по п. 1 или 2, где белок сладкой молочной сыворотки вводят недоношенному или доношенному младенцу, или ребенку младшего возраста в дозе 1,6-3,2 г белка/100 ккал, предпочтительно 1,6-2,2 г белка/100 ккал и еще более предпочтительно 1,8-2,1 г белка/100 ккал.

15. Применение по п. 1 или 2, где белок сладкой молочной сыворотки вводят в композиции, содержащей по меньшей мере один пребиотик, предпочтительно выбранный из инулина, фруктоолигосахарида (FOS), короткоцепочечного фруктоолигосахарида (короткоцепочечный FOS), галактоолигосахарида (GOS) и олигосахаридов коровьего молока (CMOS) или олигосахаридов грудного молока (HMOS).

16. Применение по п. 1 или 2, где белок сладкой молочной сыворотки вводят в композиции, содержащей по меньшей мере один пробиотик, предпочтительно выбранный из Bifidobacterium longum BB536 (ATCC BAA-999), Lactobacillus rhamnosus (CGMCC 1.3724), Bifidobacterium lactis (NCC2818) или их смесей.