ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО, УСИЛИВАЮЩЕЕ ОКСИГЕНАЦИЮ ТКАНЕЙ ПРИ ДИАБЕТИЧЕСКОЙ СТОПЕ, И СПОСОБ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2020 года по МПК A61K38/05 A61P17/02 A61P3/10 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к медицине и может использоваться для усиления оксигенации тканей при осложнениях сахарного диабета, в частности, при диабетической стопе.

Уровень техники

Проблема лечения осложнений сахарного диабета продолжает оставаться актуальной в современной медицине, в том числе в диабетологии. По данным Всемирной Организации Здравоохранения количество пациентов с диагностированным сахарным диабетом составляет в настоящее время около 160 млн. человек, а к 2025 г. прогнозируется удвоение количества пациентов с этим диагнозом. Одним из осложнений сахарного диабета является синдром «диабетической стопы». При данном осложнении наблюдается комплекс анатомо-функциональных изменений, приводящих к развитию ишемии (гипоксии) тканей, сопровождающихся повышенной травматизацией и инфицированием мягких тканей стопы.

Следует отметить, что такие осложнения приводят к ранней инвалидизации пациентов, вплоть до ампутации стопы и летального исхода. Основным механизмом развития ишемии тканей при сахарном диабете является активация HIF-1(специфического регуляторного белка – гипоксией индуцированного фактора) фактора. Патогенетическая роль фактора HIF-1α открывает возможность не только в коррекции самой гипоксии, но и в лечении осложнений сахарного диабета, таких как «диабетическая стопа». В связи с этим разработка фармакологической терапии, направленной на активацию оксигенации мягких тканей за счет угнетения синтеза фактора HIF-1α, является актуальной задачей медицины и патогенетическим подходом к лечению осложнений сахарного диабета.

Среди наиболее близких аналогов по применению известна группа препаратов с антигипоксическим действием, ингибирующая синтез специфического регуляторного белка – гипоксией индуцированного фактора (HIF 1α): трастузумаб (герцептин), гефитиниб, цалфостин С (ингибитор протеинкиназы С), вортманнин (ингибитор PI3K), PD98095 (ингибитор MAPK), рапамицин (сиролимус, ингибитор FRAP/mTOR), сорафениб и сунитиниб (мультикиназные ингибиторы), носкапин (см. Nilsson M.B., Zage P.E., Zeng L. et al. Multiple receptortyrosine kinases regulate HIF-1α and HIF-2α in normoxiaand hypoxia in neuroblastoma: implications for antiangiogenicmechanisms of multikinase inhibitors // Oncogene. –2010. – Vol. 29. – стр. 2938–2949; Y. S. Chang, L. Adnane, A. Henderson et al. Sorafenib (bay43–9006) inhibits tumor growth and vascularization and induces tumor necrosis in the human rcc xenograft model, 786-o // Clin. Cancer. Res. – 2005. – Vol. 11.– стр 9011; Zhang H., Qian D.Z., Tan Y.S. et al. Digoxin and other cardiac glycosides inhibit HIF-1 synthesis and blocktumor growth // PNAS. 2008. – Vol. 105, N 50. – стр. 19579–19586; Newcomb E.W., Lukyanov Y., Schnee T. etc. Noscapineinhibits hypoxia-mediated HIF‑1alpha expression andangiogenesis in vitro: a novel function for an old drug // Int.J. Oncol. – 2006. — Vol. 28, N 5. – стр. 1121–1130).

Недостатком вышеупомянутых препаратов является их токсичность в разной степени, которая проявляется в развитии побочных эффектов: гипертензии, нарушении в системе свертывания крови, сердечной недостаточности, гастроинтестинальных (тошнота, рвота, диарея), неврологических (слабость, головная боль), дерматологических симптомов (кожная сыпь) как описано J. M. Llovet (см. J. M. Llovet, S. Ricci, V. Mazzaferro et al. Sorafenib in advanced hepatocellular carcinoma // N. Engl. J. Med.– 2008.– Vol. 359.– стр. 378–390).

Из патента US 5811399 (опубл. 22.09.1998) известен дипептид L-Glu-L-Trp, как результат пептидного синтеза.

Известно, что лекарственный препарат Тимоген (дипептид L-Glu-L-Trp), который разрешен к медицинскому применению в Российской Федерации (регистрационный номер Р N 002408/01) и включен в Российскую Фармакопею, обладает иммуномодулирующей активностью, оказывая влияние на реакции клеточного, гуморального иммунитета и неспецифическую резистентность всего организма (US 5538951, опубл. 23.07.1996). Однако известная активность указанного дипептида характеризует только направленность его иммуномодулирующего действия, что не является очевидным и взаимосвязанным проявлением свойств дипептида угнетать синтез фактора HIF 1α c усилением оксигенации тканей при инсулинозависимом и инсулиннезависимом сахарном диабете, и не определяет конкретные показания для его клинического применения. Приведенные ниже примеры антигипоксического действия дипептида L-Glu-L-Trp на усиление оксигенации в тканях при осложнениях сахарного диабета и, в частности при диабетической стопе, объективно подтверждают отсутствие взаимосвязи между известным свойством и заявляемым.

Таким образом заявляемое изобретение направлено на решение задачи получения средства пептидной природы, обладающего антигипоксическим действием и способностью усиливать оксигенацию в тканях при осложнениях сахарного диабета и, в частности при диабетической стопе, за счет угнетения синтеза фактора HIF 1α.

Раскрытие изобретения

Поставленная задача решается путем применения дипептида L-Glu-L-Trp в качестве средства для усиления оксигенации тканей за счет угнетения (снижения синтеза) HIF‑1α фактора при диабетической стопе.

Дипептид может быть получен классическим методом пептидного синтеза в растворе, описанном, например, в патенте US 5538951 (опубл. 23.07.1996).

Другим объектом изобретения является лекарственное средство для усиления оксигенации тканей за счет угнетения (снижения синтеза) HIF‑1α фактора при диабетической стопе, содержащее эффективное количество дипептида L-Glu-L-Trp в качестве активного агента и фармацевтически приемлемый носитель.

Понятие "лекарственное средство", используемое в данной заявке, подразумевает использование любой лекарственной формы, содержащей различные фармацевтические производные дипептида, которые обладают терапевтическим эффектом для лечения осложнений сахарного диабета, при которых необходимо усиление оксигенации тканей.

Понятие "эффективное количество", используемое в данной заявке, подразумевает использование того количества активного начала, которое в соответствии с его количественными показателями активности и токсичности, а также на основании знаний специалиста должно быть эффективным в данной лекарственной форме.

В некоторых вариантах осуществления дипептид L-Glu-L-Trp может использоваться в виде химических модификаций, например, в виде солей и других производных, хорошо известных специалистам в данной области техники.

Для получения фармацевтических композиций, отвечающих изобретению, предлагаемый дипептид L-Glu-L-Trp или его фармацевтически приемлемые производные смешиваются как активный ингредиент с фармацевтическим носителем согласно принятым в фармацевтике способам компаундирования.

Носитель может иметь различные формы, которые зависят от лекарственной формы препарата, желаемой для введения в организм, например, парентерального, интраназального, перорального или местного (например, в виде аппликаций, мази).

При изготовлении композиций в предпочтительной дозированной форме для перорального или местного применения могут использоваться любые известные фармацевтические компоненты.

Для парентерального (интраназального) введения носитель обычно включает стерильную воду, хотя могут быть включены другие ингредиенты, способствующие стабильности, или для сохранения стерильности.

В предпочтительных вариантах выполнения изобретения предлагаемое лекарственное средство используют в виде лекарственной формы для местного введения.

При местном введении в качестве носители содержать водные растворы, например, физиологических раствор.

В одном предпочтительном варианте выполнения изобретения в качестве фармацевтически приемлемого носителя используют физиологический раствор.

Согласно изобретению, дипептид активен при введении его в дозах 1,0-10,0 мкг/кг массы тела, хотя могут быть использованы и более низкие (высокие) дозы в зависимости от степени тяжести и характера течения заболевания.

Изобретение также охватывает способ усиления процессов оксигенации у человека или животного, нуждающихся в такой стимуляции, в частности, способ усиления оксигенации тканей за счет угнетения (снижения синтеза) HIF‑1α фактора при диабетической стопе.

Согласно изобретению, способ усиления процессов оксигенации у человека или животного, нуждающихся в такой стимуляции, в частности, способ усиления оксигенации тканей за счет угнетения (снижения синтеза) HIF-1α фактора при диабетической стопе, состоит в местном введении лекарственного средства, содержащего эффективное количество дипептида L-Glu-L-Trp в качестве активного агента и фармацевтически приемлемый носитель в дозе 1,0 – 10,0 мкг/кг массы тела по меньшей мере один раз в день в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта.

Усиление процессов оксигенации осуществляется посредством угнетения синтеза специфического регуляторного белка – гипоксией индуцированного фактора (HIF 1α), что приводит к усилению оксигенации тканей на фоне инсулинозависимого и инсулиннезависимого сахарного диабета.

В одном из вариантов выполнения изобретения период, необходимый для достижения терапевтического эффекта, составляет от 10 до 40 дней.

Настоящее изобретение иллюстрируется несколькими примерами, представленными ниже.

Варианты осуществления изобретения

Изобретение иллюстрируется примером синтеза дипептида формулы L-глутаминовая-L-триптофановая кислота (L-Glu-L-Trp) (пример 1), примерами испытания токсичности и биологической активности дипептида (примеры 2, 3) и примерами результатов клинического применения дипептида, демонстрирующими его фармакологические свойства и подтверждающими возможность достижения лечебного эффекта (примеры 4, 5).

Необходимо отметить, что последующее описание данных примеров является иллюстративным, но не исчерпывающим.

Пример 1. Синтез R’-Glu-Trp-R”

Удобно, что дипептид типа R’-Glu-Trp-R” синтезируется любым из целого ряда автоматизированных методов, широкодоступных в настоящее время. Эти методы включают в себя ступенчатый синтез путем последовательного добавления аминокислот для постепенного получения более крупных молекул. Аминокислоты связаны между собой конденсацией между карбоксильной группой одной аминокислоты и группой другой аминокислоты с образованием пептидной связи. Чтобы контролировать эти реакции, необходимо блокировать аминогруппу одной аминокислоты и карбоксильную группу другой.

Блокированные группы следует выбирать для легкого удаления без неблагоприятного воздействия на пептиды, то есть путем рацемизации или гидролиза образованных пептидных связей. Аминокислоты с карбоксильными группами (например, Asp, Glu) или гидроксильными группами (например, Ser, гомосерин и Tyr) также требуют блокирования до конденсации. Для синтеза пептидов существует широкий спектр процедур, и предпочтительным обычно является твердофазный синтез. В этой процедуре аминокислота связывается с частицей смолы, и пептид образуется ступенчато путем последовательного добавления защищенных аминокислот к растущей цепи. Обычно используются модификации метода, описанного Моррифилдом (см. Merrifield, R. В.‚ J. Am. Chem.Soc. 96:2989-2993 (1964)).

В примерном автоматизированном твердофазном способе пептиды синтезируют путем загрузки карбоксиконцевой аминокислоты на органический линкер (например, РАМ, 4-оксиметилфенилацетамидометил), ковалентно присоединенный к нерастворимой полистирольной смоле, поперечно связанной с дивинилбензолом. Блокирование с помощью t-Boc используется для защиты терминального амина, а гидроксильные и карбоксильные группы обычно блокируются O-бензильными группами. Синтез осуществляется в автоматизированном пептидном синтезаторе (Applied Biosystems, Фостер Сити, Калифорния, например, модель 430-A). После синтеза продукт можно отделить от смолы и блокирующих групп, удаленных с использованием фтористоводородной кислоты или трифторметилсульфоновой кислоты в соответствии с установленными методами (см. Bergot, B. J., McCurdy S.N., Applied Biosystems Bulletin (1987)).

Обычный синтез может давать 0,5 ммоль пептидной смолы. Выход после расщепления и очистки составляет приблизительно 60-70%. Например, защищенное аминогруппой и защищенной боковой цепью производное активированного сложного эфира Glx подвергают взаимодействию с защищенной боковой группой Trp, присоединенной к твердой фазе на ее С-конце. После элиминации альфа-аминозащитной группы пептид может быть расщеплен из твердой фазы или другой аминокислоты, добавленной аналогичным образом. Аналогичным образом добавляются дополнительные аминокислоты. Затем пептиды могут быть выделены, лиофилизированы и сохранены для последующего использования. Подходящие методы синтеза пептидов подробно описаны Stewart J. M., Young J. D. Solid phase peptide synthesis, 2d edition // Rockford, Ill.: Pierce Chemical Co. – 1984. – 176 стр. и Tam, et al., J. Am. Chem. Soc. 105:6442 (1983)) которые включены сюда в виде ссылки.

Очистку пептидных продуктов осуществляют, например, путем кристаллизации пептида из органического растворителя, такого как метилбутиловый эфир, с последующим растворением в дистиллированной воде и диализом (если молекулярная масса пептида превышает примерно 500 дальтон), тонкослойную хроматографию, гель-хроматографию, лиофилизацию или обратную ВЭЖХ (например, используя колонку С18 с 0,1% трифторуксусной кислотой и ацетонитрилом в качестве растворителей), если молекулярная масса пептида меньше 500 дальтон. Очищенный пептид лиофилизируют и хранят в сухом состоянии до использования. К фармацевтическим препаратам типа R’-Glu-Trp-R” относится очищенный дипептид L-Glu-L-Trp, представляющий собой белый порошок (если лиофилизирован, в противном случае он кристаллический), растворимый в воде и ДМФА, нерастворимый в хлороформе и эфире. [alpha22_D=+12.6; C=0.5 Н₂О. R_f=0.65 (бутанол-уксусная кислота: вода = 3: 1: 1). УФ (275 ± 5 нм, макс.). ЯМР (500 МГц): 0,001 моль / л раствора пептида, Trp (3,17, 3,37, 4,57, 7,16, 7,24, 7,71, 7,49); Glu (1,90, 1,96, 2,21, 3,72)]. Как правило, защищенное аминогруппой и боковой цепью производное активированного сложного эфира глутаминовой кислоты подвергают взаимодействию с защищенным L-триптофаном. После элиминации защитных групп и обычной очистки, такой как тонкослойная или ГЛ-хроматография, пептид может быть очищен, например, путем лиофилизации, гелиевой очистки и т.д.

Пример 2. Изучение токсичности дипептида L-глутаминовая-L-триптофановая кислота (L-Glu-L-Trp).

Изучение общетоксического действия дипептида L-глутаминовая-L-триптофановая кислота (L-Glu-L-Trp) проводилось в соответствии с "Правилами доклинической оценки безопасности фармакологических средств (GLP)" и все животные содержались в соответствии с Европейской директивой 86/609/EC (5 Council of the European Communities. Council Directive 86/609/EEC of 24 November 1986 on the approximation of laws, regulations and administrative provisions of the Member States regarding the protection of animals used for experimental and other scientific purposes. Off J Eur Communities L358:1–28). Протоколы опытов были утверждены Комиссией по гуманному обращению с животными Cанкт-Петербургского Института биорегуляции и геронтологии (Россия).

Цель изучения состояла в определении переносимых токсических доз препарата, оценке степени и характера патологических изменений в различных органах и системах организма и выявлении зависимости токсических эффектов от дозы и длительности применения препарата.

Определение острой токсичности дипептида L-Glu-L-Trp проводили по методу Кербера. Исследование проведено на 60 белых беспородных мышах-самцах массой 20-25 г, содержавшихся на стандартном режиме и получавших стандартное питание в условиях вивария. Животные были разделены случайным распределением на 6 равных групп по 10 мышей в каждой. Препарат вводили животным однократно внутримышечно в объеме 0,25 мл в дозах 1 мг/кг, 2 мг/кг, 3 мг/кг, 4 мг/кг, 5 мг/кг (в несколько тысяч раз превышающих терапевтическую дозу, рекомендуемую для клинического изучения). Животным контрольной группы в том же объеме вводился физиологический раствор.

В течение 72 часов и далее через 14 суток ни в одной группе животных гибели мышей не обнаружено. Не отмечено каких-либо изменений общего состояния, поведения, двигательной активности, волосяного и кожного покрова, физиологических отправлений животных.

Таким образом, дипептид L-Glu-L-Trp в дозах, превышающих терапевтическую, рекомендуемую для клинических испытаний, в несколько тысяч раз, не вызывает острых токсических реакций, что указывает на большую терапевтическую широту препарата.

Исследование подострой токсичности дипептида L-Glu-L-Trp проведено на 60 белых беспородных крысах массой 150-250 мг. Ежедневно однократно животным опытных групп вводили препарат внутримышечно в течение 90 дней в дозах 1 мкг/кг, 0,3 мг/кг, 3 мг/кг в 0,5 мл физиологического раствора. Животным контрольной группы вводили в том же объеме физиологический раствор.

На протяжении всего периода исследования животные находились под ежедневным наблюдением. Отмечали поведение животных, потребление корма и воды, состояние волосяного покрова и слизистых оболочек. Проводили еженедельное взвешивание животных. До введения препарата, на 30, 60 и 90 сутки после начала введения препарата у животных исследовали морфологический состав и свойства периферической крови. При завершении эксперимента исследовали биохимические и коагулологические показатели крови.

Хроническую токсичность дипептида L-Glu-L-Trp, полученного заявляемым способом, изучали при длительном введении его крысам массой 150-250 мг. Животным ежедневно вводили внутримышечно препарат в дозах 1 мкг/кг, 0,1 мг/кг, 1 мг/кг в 0,5 мл физиологического раствора в течение 6 месяцев. Отмечали поведение животных, потребление корма и воды, состояние волосяного покрова и слизистых оболочек. Взвешивание животных проводилось ежедневно в первые 3 месяца эксперимента, затем 1 раз в месяц. Через 3 месяца после начала введения и при завершении эксперимента проводили гематологические и биохимические исследования. Оценивали функции сердечно-сосудистой системы, печени, поджелудочной железы, почек и надпочечников. После окончания введения препарата часть животных подвергали патоморфологическому исследованию с целью оценки состояния различных отделов головного и спинного мозга, сердца, аорты, легких, печени, почек, органов эндокринной и иммунной систем.

При оценке общего состояния животных, морфологических и биохимических показателей периферической крови, морфологического состояния внутренних органов, состояния сердечно-сосудистой и дыхательной систем, функции печени и почек патологические изменения в организме не обнаружены.

Изучение подострой и хронической токсичности дипептида L-Glu-L-Trp свидетельствует об отсутствии побочных эффектов при длительном применении препарата в дозах, превышающих терапевтическую в 100-1000 раз.

Пример 3. Влияние дипептида L-Glu-L-Trp на активацию оксигенации и, как следствие, на заживление ран мягких тканей на фоне стрептозотоцин-индуцированного сахарного диабета (вариант лечения)

Эксперимент проведен на 30 крысах-самцах популяции линии Wistar. Модель стрептозотоцина является одной из наиболее подходящих для использования в исследованиях заживления ран, поскольку позволяет точную количественную оценку основных аспектов заживающей раны, таких как закрытие раны, реэпителизация и формирование ГТ (грануляционная ткань) (см. Hirsch T., Spielmann M., Zuhaili B. et al. Enhanced susceptibility to infections in a diabetic wound healing model // BMC Surgery. – 2008. – Vol. 8(5). – стр.1-8 и Mendes J., Leandro C., Bonaparte D. et al. A Rat Model of Diabetic Wound Infection for the Evaluation of Topical Antimicrobial Therapies // Comparative Medicine. – 2012. – Vol. 62 (1). – стр.37-48). Модель эксцизионной раны вмещает широчайший спектр оценки механизмов, связанных с заживлением ран, включая эпителизацию, грануляцию и ангиогенез (Wong V.W., Sorkin M., Glotzbach J.P., Longaker M.T., Gurtner G.C. Surgical approaches to create murine models of human wound healing // J Biomed Biotechnol. – 2011:969618.; Toker S., Gulcan E., Cayc M.K., Olgun E.G., Erbilen E., Ozay Y. Topical atorvastatin in the treatment of diabetic wounds // Am J Med Sci. – 2009. – Vol. 338. – стр. 201–204; Tsuboi R., Rifkin D.B. Recombinant basic fibroblast growth factor stimulates wound healing in healing-impaired db/db mice // J Exp Med. – 1990. – Vol. 172. – стр. 245- 251).

Крыс содержали в микроизоляции в помещении с контролируемой влажностью (от 50% до 70%) и температурой (20-22°С) и 14:10-часовым циклом день:ночь, со свободным доступом к таблетированному корму (RM3, Специальные диетические системы, Essex, Великобритания) и стерилизованной фильтрованной воде).Содержание животных осуществлялось в соответствии с Правилами надлежащей лабораторной практики (GLP) и в соответствии с Европейской директивой 86/609/EC [14].

Протоколы опытов были утверждены Комиссией по гуманному обращению с животными Cанкт-Петербургского Института биорегуляции и геронтологии (Россия).

Животные рандомизированно были разделены на две группы - контрольную (n=15) и подопытную группы (n=15). Формирование экспериментальной патологии у животных подопытной и контрольной групп проводили введением стрептозотоцина (Sigma, США) в дозе 60 мг/кг однократно внутрибрюшинно (Wu K., Huan Y. Streptozotocin-induced diabetic models in mice and rats // Curr Protoc Pharmacol. –2008, Mar. – Chapter 5:Unit 5.47. – стр. 1-14).

С целью выявления биохимических и гистологических признаков диабета и его поздних осложнений у всех животных были проведены исследования в динамике (оценивали уровень глюкозы в периферической крови, ретикулоцитов), также были выполнены гистологические исследования. Оценку влияния дипептида L-Glu-L-Trp на активацию оксигенации тканей проводили, используя иммуногистохимическое исследование. Данный метод позволяет провести анализ содержания белка HIF-1α в тканях животных контрольной и подопытной групп.

Концентрацию глюкозы в периферической крови (в хвостовой вене) измеряли глюкометром OneTouch Horizоn («Lifescan», США). Линейный диапазон измерения 1,1 – 33,3 ммоль/л. Подсчет ретикулоцитов проводили по унифицированной методике после их окраски готовым красителем – бриллиантовым крезиловым синим (Диахим-ГемиСтейн-РТЦ) в пробирке (суправитальный пробирочный метод).

Для гистологического и иммуногистохимического исследований брали ткани кожных покровов животных контрольной и подопытной групп. Материал фиксировали в 10 % растворе нейтрального формалина в течение 24 часов и по стандартной методике заливали в парафин. Затем изготавливали срезы толщиной 5–7 мкм, которые для гистологических исследований окрашивали гематоксилином и эозином. Морфологическое исследование гистологических препаратов проводилось при помощи светооптического микроскопа CarlZeiss (Германия).

Иммуногистохимическое исследование включало в себя определение экспрессии HIF-1α фактора. Полученные парафиновые блоки резали на микротоме. Срезы депарафинизировали (удаляли парафин). На срезы наносили первичные поликлональные антитела кролика к HIF1α в разведении 1:100 и инкубировали в течение ночи при + 4 °С во влажной камере. Затем обрабатывали срезы вторичными биотинилированными антителами козы анти-кролик (разведение 1:200) в течение 30 мин при комнатной температуре во влажной камере. Далее отмывали и наносили универсальную систему авидин-биотинового комплекса (ABC, Vector Laboratories, Inc, США) и оставляли инкубироваться 30 мин при комнатной температуре. Для визуализации реакции связывания антитела с антигеном использовали диаминобензидиновый кит (DAB Substratekit, VectorLabs, США). Микрофотографирование проводили при помощи цифровой фотокамеры ProgressCT1 («Jenoptic», Германия). Анализ препаратов проводили с использованием морфометрической установки, позволяющей количественно оценить экспрессию продуктов генов по интенсивности иммунореактивности в условных единицах оптической плотности. Морфометрическая установка включала в себя световой микроскоп OlympusCX1 (Япония), цифровую камеру ProgressCT1 («Jenoptic», Германия) и компьютер IBM PC с программным обеспечением Videotest Master Morfology. Используя программу ВидеоТест Мастер Морфология, производили подсчет числа иммунопозитивных клеток.

В ходе исследования было установлено, что через 5 недель у всех животных были выявлены клинические проявления сахарного диабета, которые выражались в статистически значимом увеличении концентрации глюкозы по отношению к исходным показателям (более, чем в 4 раза) (см. Таблицу 1).

Таблица 1

Динамика изменения концентрации глюкозы в периферической крови крыс-самцов

Срок исследования
(недели) Концентрация глюкозы (ммоль/л) Контрольная группа
(n=15) Подопытная группа
(n=15) 0 5,2±2,0 5,7±1,2 5 23,5±1,8* 24,4±1,9* 9 19,4±1,9* 15,9±2,2* 11 18,6±1,7* 13,4±1,5*

* р<0,05– различия статистически значимы по сравнению с исходным показателем в контрольной и опытной группах.

На 5 неделе исследования на фоне клинического проявления сахарного диабета всем животным моделировали рану мягких тканей. Всех диабетических крыс анестезировали внутрибрюшинной инъекцией гидрохлорида ксилазина (10 мг / кг) и кетамина гидрохлорида (25 мг / кг). С этой целью у животных контрольной и подопытной группы выбривали шерсть в области мягких тканей бедра и проводили разрез длиной 1,0 см и глубиной 0,3 см. Мягкие ткани (мышцы, подкожную клетчатку) раздавливали зажимом Кохера, затем на кожу накладывали швы. Через 72 часа непрорезавшиеся швы снимали, проводили обработку ран 3%-ным раствором перекиси водорода.

Через 72 часа после моделирования раны мягких тканей животным подопытной группы ежедневно однократно внутримышечно водили дипептида L-Glu-L-Trp в дозе 100 мкг (1.0 мг) на инъекцию в течение 10 сут. Животным контрольной группы с этого же времени по аналогичной схеме вводили физиологический раствор.

Известно, что достоверным маркером гипоксии является специфический регуляторный белок — гипоксией индуцированный фактор (HIF-1α). Активность данного фактора увеличивается при снижении напряжения кислорода в крови и в тканях организма. Показано, что этот фактор играет главную роль в системном ответе организма на гипоксию (см. Semenza G. L. Regulation of oxygen homeostasis byhypoxia-inducible factor 1 // Physiology (Bethesda). – 2009. – Vol. 24. – стр. 97-106). Как видно из таблицы 2, на 5 неделе исследования на фоне клинического проявления сахарного диабета у всех животных произошло достоверное повышение экспрессии HIF-1α фактора. Фактор HIF-1α ответственен за формирование основы долговременной адаптации к гипоксии. Потому значительное накопление в тканях HIF-1α свидетельствует об ишемии тканей экспериментальных животных.

Однако к 11 неделе в подопытной группе под действием дипептида L-Glu-L-Trp уровень экспрессии HIF-1α фактора оказался достоверно ниже, чем в контрольной. Полученные данные доказывают способность дипептида L-Glu-L-Trp усиливать оксигенацию тканей.

Таблица 2

Динамика экспрессии HIF-1α в тканях кожных покровов крыс

Срок исследования
(недели) Оптическая плотность экспрессии HIF-1α, у.е. Контрольная группа
(n=15) Подопытная группа
(n=15) 0 0,357±0,032 0,360±0,030 5 0,528±0,04* 0,547±0,042* 11 0,519±0,038* 0,436±0,035#*

*р<0,05 – различия статистически значимы по сравнению с исходным показателем в контрольной и подопытной группах.

# р<0,05- различия статистически значимы по сравнению с соответствующим показателем в контрольной группе.

Известно, что на фоне хронического диабета в тканях возникает дефицит кислорода. Гипоксия усиливает экспрессию HIF-1α в тканях, что запускает ответные физиологические реакции, такие как ангиогенез, эритропоэз с выходом в системный кровоток молодых эритроцитов и ретикулоцитов (Semenza G. L. Hypoxia-inducible factor 1: master regulator of O₂ homeostasis // Bioch. Pharmacol. – 1998. – Vol.8., N.5. – стр. 588-594; Semenza G. L. Involvement of oxygen-sensing pathways in physiologic and pathologic erythropoiesis.// Blood. – 2009. – Vol.114, N.10. – стр. 2015-2019). Доказано, что уровень ретикулоцитов в периферической крови при окислительном стрессе отражает степень гипоксии тканей (Wu K., Huan Y. Streptozotocin-induced diabetic models in mice and rats // Curr Protoc Pharmacol. –2008, Mar. – Chapter 5:Unit 5.47. – стр. 1-14 Chen D., Wang M.W. Development and application of rodent models for type 2 diabetes // Diabetes Obes. Metab. – 2005. - Vol. 7, № 4. – стр. 307- 317; Srinivasan K., Ramarao P. Animal models in type 2 diabetes research: an overview // Indian J. Med. Res. – 2007. - Vol. 125, № 3. – стр. 451-472).

Через 11 недель после моделирования экспериментального стрептозотоцин-индуцированного диабета у всех животных контрольной группы было выявлено статистически значимое увеличение уровня ретикулоцитов, что свидетельствовало о гипоксии тканей. Однако в подопытной группе под действием дипептида L-Glu-L-Trp уровень ретикулоцитов оказался достоверно ниже, чем в контроле (Табл. 3). Полученные данные указывают на активизацию дипептидом L-Glu-L-Trp процессов клеточного метаболизма в тканях и на его регулирующее влияние на уровень окислительного стресса и усиление оксигенации тканей.

Таблица 3

Динамика изменения уровня ретикулоцитов в периферической крови крыс-самцов

Срок исследования
(недели) Уровень ретикулоцитов (‰) Контрольная группа
(n=15) Подопытная группа
(n=15) 0 15,5±1,9 14,9±1,7 5 19,5±2,8 20,4±2,5 9 59,2±8,9* 26,6±6,2# 11 57,6±7,4* 30,1±5,4#*

*р<0,05 – различия статистически значимы по сравнению с исходным показателем в контрольной и подопытной группах.

#р<0,05- различия статистически значимы по сравнению с соответствующим показателем в контрольной группе.

Данные гистологического исследования подтвердили к 11 неделе наличие изменений, характерных для диабетической патологии. У животных подопытной и контрольной групп гистологически были выявлены типичные проявления микроангиопатии, характерные для отсроченных осложнений диабета. У всех животных наблюдали продуктивный капиллярит со слабо выраженным периваскулярным склерозом, а также склероз стенок артериол. Однако у животных подопытной группы данные проявления были менее выраженными, чем в контроле, что косвенно свидетельствует об усилении оксигенеции тканей. Кроме того, в тканях была выявлена периваскулярная лимфо-гистиоцитарная инфильтрация от выраженной до умеренной выраженности в контрольной группе и слабой выраженности в подопытной группе. Лимфо-гистиоцитарная инфильтрация как в контрольной, так и в подопытной группе частично затрагивала периневральные зоны. Кроме того, в контрольной группе была выявлена выраженная аксональная дегенерация, демиелинизация и очаговый некробиоз аксонов. Трофические нарушения приводили к дистрофическим нарушениям в дерме в обеих группах. Однако в дерме животных контрольной группы отмечался значительно более выраженный гиперкератоз и акантоз, местами с вовлечением в процесс придатков кожи (волосяных фолликулов, сальных и потовых желез), чем у животных подопытной группы.

Положительное влияние дипептида L-Glu-L-Trp на процессы оксигенации в тканях способствовало более быстрому заживлению ран мягких тканей, что привело к сокращению срока регенерации, появлению грануляционной ткани в ране, началу краевой эпителизации или полной эпителизации (Таблица 4).

Таблица 4

Влияние дипептида L-Glu-L-Trp на заживление ран мягких тканей на фоне стрептозотоцин-индуцированного сахарного диабета

Так, результаты исследований на 11 неделе покали, что в подопытной группе полная эпителизация ран при введении дипетида в 3,2 раза превысила аналогичный показатель в контрольной группе. Кроме того, на 11 неделе наблюдения у 5 животных контрольной группы не было выявлено никаких признаков регенерации раневой поверхности.

Приведенные ниже примеры результатов клинического изучения заявляемого дипептида демонстрируют его фармакологические свойства и подтверждают возможность осуществления изобретения.

Пример 4. Эффективность применения дипептида Тимоген L-Glu-L-Trp при лечении «диабетической стопы» у больных с инсулинозависимым сахарным диабетом.

Под наблюдением находилось 35 пациентов с инсулинозависимым сахарным диабетом. Все пациенты страдали сахарным диабетом на протяжении 10-23 лет и были в возрасте от 25 до 49 лет. На момент осмотра сахарный диабет был компенсирован, все пациенты получали инсулин в необходимой им дозировке. У всех пациентов была выявлена нейроишемическая форма «диабетической стопы». Пациенты жаловались на отеки, боли, быструю утомляемость в области ног. При осмотре кожных покровов отмечалась пигментация, сухость кожных покровов, гиперкератоз, снижение тактильной чувствительности. У 35 пациентов данное заболевание находилось на начальной стадии патологического процесса – раневые дефекты кожных покровов отсутствовали.

Пациенты рандомизированно были разделены на две группы. Первая группа – контрольная (17 человек), получала базовую терапию инсулинозависимого сахарного диабета, вторая группа – основная (18 человек) – дополнительно к основной своей терапии получали дипептид Тимоген L-Glu-L-Trp внутримышечно ежедневно по 200,0 мкг 2 раза в день в течение 20 суток (8,0 мг на курс лечения).

Оценку влияния дипептида Тимоген L-Glu-L-Trp на клиническое течение осложнения сахарного диабета «диабетической стопы», а также его влияние на уровень оксигенации тканей (по уровню концентрации белка HIF-1α в плазме крови людей) оценивали дважды – в начале исследования и на следующий день после окончания наблюдения- на 21 сутки. Оценку уровня HIF-1α проводили с использованием иммуноферментного анализа (ИФА) по методике А. А. Левиной и др. (см. Левина А. А., Макешова А.Б., Мамукова Ю. И., Романова Е. А., Сергеева А. И., Казюкова Т. В. Регуляция гомеостаза кислорода. Фактор, индуцированный гипоксией (hif) и его значение в гомеостазе кислорода//Педиатрия. – 2009. – Vol. 87, № 4. – стр. 92-97) . В качестве дополнительного контроля были взяты 10 здоровых добровольцев, не страдающих сахарным диабетом, у которых также дважды – в первый день исследования и на 21 сутки была взята венозная кровь для определения уровня концентрации белка HIF-1α в плазме крови.

Как видно из таблицы 5, пациенты, страдающие сахарным диабетом, имели достоверно более высокое значение концентрации белка HIF-1α в плазме крови, что свидетельствует о наличии ишемии ткани. Исходно достоверной разницы данного показателя в контрольная и основная группа отмечено не было. Однако под действием дипептида Тимоген L-Glu-L-Trp было выявлено достоверное снижение концентрации белка HIF-1a в плазме крови у пациентов основной группы по сравнению с контролем. Полученные данные свидетельствуют, что заявляемое вещество обладает свойством усиления оксигенации тканей при осложнениях сахарного диабета, в частности, при диабетической стопе.

Таблица 5

Влияние дипептида Тимоген L-Glu-L-Trp на уровень HIF-1α в плазме крови

Группа HIF-1α (пг/мл) Исходный показатель Показатель на 21-е сутки Здоровые (n= 10) 3,8±0,3 3,9±0,4 Контрольная группа
(n= 17) 5,4±0,6# 5,7±0,7# Основная группа
(n= 18) 5,6±0,5# 4,5±0,7*#

#р<0,05 – различия статистически значимы по сравнению с показателем у здоровых.

*р<0,05 – различия статистически значимы по сравнению с исходным показателем.

Таблица 6

Клинические проявления синдрома «диабетическая стопа»

*р<0,05 – различия статистически значимы по сравнению с исходным показателем в контрольной и опытной группах.

Признаки клинических проявлений:

1 балл – отсутствие

2 балла – слабо выражен

3 балла – выражен

4 балла – сильно (ярко выражен)

Как видно из таблицы 6, под действием дипептида Тимоген L-Glu-L-Trp достоверно уменьшились клинические проявления синдрома «диабетической стопы». Улучшение оксигенации тканей способствовало улучшению трофических процессов в них, что способствовало снижению утомляемости ног у пациентов основной группы. Необходимо отметить, что тактильная чувствительность в большей или меньшей степени восстановилась у всех пациентов, которые получали дипептид Тимоген L-Glu-L-Trp. Кроме того, улучшилась структура кожных покровов, что выражалось в уменьшении сухости и восстановления цвета кожи.

Таким образом, заявленное средство дипептид Тимоген L-Glu-L-Trp за счет способности восстанавливать процессы оксигенации в тканях, обладает выраженным трофическим действием.

Пример 5. Эффективность применения дипептида Тимоген L-Glu-L-Trp при лечении «диабетической стопы» у больных с инсулиннезависимым сахарным диабетом.

Известно, что сахарный диабет негативно влияет на течение раневого процесса, замедляя заживление ран. Поэтому очень часто такие процессы приобретают длительный, рецидивирующий характер.

Под наблюдением находилось 29 пациентов с инсулиннезависимым сахарным диабетом. Все пациенты страдали сахарным диабетом на протяжении 5-23 лет и были в возрасте от 51 до 82 лет. На момент осмотра сахарный диабет был компенсирован, все пациенты получали сахароснижающие препараты в необходимой им дозировке.

У всех пациентов при осмотре были выявлены трофические раны с вовлечением кожи, подкожно-жировой клетчатки, мышечной ткани, без поражения костной ткани. Раны были чистые, не инфицированы. Пациенты жаловались на отеки, умеренные боли в области раны, быструю утомляемость в области ног. При осмотре кожных покровов отмечалась пигментация, сухость кожных покровов, гиперкератоз, значительное снижение тактильной чувствительности. Всем пациентам проводили визуальную оценку раневой поверхности, определяли характер и фазу раневого процесса, проводили стандартную обработку раневой поверхности антисептическими препаратами.

Пациенты рандомизированно были разделены на две группы. Первая группа – контрольная (14 человек), получала базовую терапию сахароснижающих препаратов и стандартную обработку раневой поверхности, вторая группа – основная (15 человек) – дополнительно к основной своей терапии получали дипептид Тимоген L-Glu-L-Trp внутримышечно ежедневно по 200,0 мкг 2 раза в день в течение 20 суток (8,0 мг на курс лечения).

Оценку влияния дипептида Тимоген L-Glu-L-Trp на клиническое течение осложнения сахарного диабета «диабетической стопы», а также его влияние на уровень оксигенации тканей (по уровню концентрации белка HIF-1α в плазме крови людей) оценивали дважды – в начале исследования и на следующий день после окончания наблюдения- на 21 сутки. Оценку уровня HIF-1α проводили с использованием иммуноферментного анализа (ИФА) по методике методике А. А. Левиной и др. (см. Левина А. А., Макешова А.Б., Мамукова Ю. И., Романова Е. А., Сергеева А. И., Казюкова Т. В. Регуляция гомеостаза кислорода. Фактор, индуцированный гипоксией (hif) и его значение в гомеостазе кислорода//Педиатрия. – 2009. – Vol. 87, № 4. – стр. 92-97). В качестве дополнительного контроля были взяты 10 здоровых добровольцев, не страдающих сахарным диабетом, у которых также дважды – в первый день исследования и на 21 сутки была взята венозная кровь для определения уровня концентрации белка HIF-1α в плазме крови.

Таблица 7

Влияние дипептида Тимоген L-Glu-L-Trp на уровень HIF-1α в плазме крови

Группа HIF-1α (пг/мл) Исходный показатель Показатель на 21-е сутки Здоровые (n= 10) 3,8±0,3 3,9±0,4 Контрольная группа
(n= 14) 6,7±0,7# 7,1±0,5# Основная группа
(n= 15) 6,9±0,5# 4,8±0,4*#

#р<0,05 – различия статистически значимы по сравнению с показателем у здоровых.

*р<0,05 – различия статистически значимы по сравнению с исходным показателем.

Как видно из таблицы 7, пациенты, страдающие сахарным диабетом, имели достоверно более высокое значение концентрации белка HIF-1α в плазме крови, что свидетельствует о наличии ишемии ткани. Исходно достоверной разницы данного показателя в контрольная и основная группа отмечено не было. Однако под действием дипептида Тимоген L-Glu-L-Trp было выявлено достоверное снижение концентрации белка HIF-1α в плазме крови у пациентов основной группы на 30% по сравнению с контролем. Полученные данные свидетельствуют, что заявляемое вещество обладает свойством усиления оксигенации тканей при осложнениях сахарного диабета, в частности, при диабетической стопе.

Таблица 8

Клинические проявления синдрома «диабетическая стопа»

*р<0,05 – различия статистически значимы по сравнению с исходным показателем в контрольной и опытной группах.

Признаки клинических проявлений:

1 балл – отсутствие

2 балла – слабо выражен

3 балла – выражен

4 балла – сильно (ярко выражен)

Как видно из таблицы 8, под действием дипептида Тимоген L-Glu-L-Trp достоверно уменьшились клинические проявления синдрома «диабетической стопы». Улучшение оксигенации тканей способствовало улучшению трофических процессов в них, что выражалось в улучшении структуры кожных покровов – уменьшении их сухости, восстановлении тактильной чувствительности, снижении утомляемости. Данные процессы коррелировали со скоростью заживления раневой поверхности у пациентов основной группы. Так, к концу исследования у 73,3% пациентов улучшение процессов оксигенации тканей способствовало полной эпителизации раневой поверхности, что в 5 раз больше, чем в контроле (Таблица 9).

Таблица 9

Этап заживления раневой поверхности на 21 сутки исследования

Группы Количество пациентов С признаками грануляции С начальными признаками эпителизации С полной эпителизацией Контрольная (n = 14)
5 (35,7%) 7 (50,0%) 2 (14,3) Основная (n = 15) 1 (6,7%) 3 (20,0%) 11 (73,3)

Таким образом, заявленное средство за счет способности восстанавливать процессы оксигенации в тканях, обладает выраженным ранозаживляющим свойством в сравнении со стандартной терапией. Дипептид Тимоген L-Glu-L-Trp уменьшает период заживления раны.

Клиническое применение дипептида Тимоген L-Glu-L-Trp подтвердило данные экспериментального исследования о том, что препарат эффективен при заболеваниях и состояниях, сопровождающихся ишемией и нарушением оксигенации тканей.

Группа изобретений относится к медицине и к фармации. Предложено применение дипептида L-глутаминовой-L-триптофановой кислоты (L-Glu-L-Trp) в качестве средства для усиления оксигенации тканей за счет угнетения (снижения синтеза) HIF-1α фактора при диабетической стопе. Предложен способ усиления оксигенации тканей за счет угнетения (снижения синтеза) HIF-1α фактора при диабетической стопе, состоящий в местном введении дипептида L-глутаминовой-L-триптофановой кислоты (L-Glu-L-Trp) в дозе 1,0 – 10,0 мкг/кг массы тела по меньшей мере один раз в день в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта. Технический результат состоит в реализации заявленных назначений при лечении диабетической стопы у больных диабетом. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 9 табл., 5 пр.

1. Применение дипептида L-глутаминовой-L-триптофановой кислоты (L-Glu-L-Trp) в качестве средства для усиления оксигенации тканей за счет угнетения (снижения синтеза) HIF-1α фактора при диабетической стопе.

2. Способ усиления оксигенации тканей за счет угнетения (снижения синтеза) HIF-1α фактора при диабетической стопе, состоящий в местном введении дипептида L-глутаминовой-L-триптофановой кислоты (L-Glu-L-Trp) в дозе 1,0 - 10,0 мкг/кг массы тела по меньшей мере один раз в день в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта.

3. Способ по п. 2, в котором период, необходимый для достижения терапевтического эффекта, составляет от 10 до 40 дней.