Способ и устройство для получения трехмерного многоклеточного объекта Российский патент 2020 года по МПК C12M3/00 

Настоящее изобретение относится к способу получения трехмерного многоклеточного объекта в соответствии с ограничительной частью п. 1 формулы изобретения, устройству для получения трехмерного многоклеточного объекта в соответствии с ограничительной частью п. 13 формулы изобретения и применению этого устройства в соответствии с ограничительной частью п. 15 формулы изобретения.

Трехмерные многоклеточные объекты могут также именоваться клеточными объектами биологического материала. Известно получение таких объектов способами так называемой биопечати. В данном случае термин «печать» относится к трехмерному структурированию биологического материала. Обычно биологические клетки формируют в предварительно выбранной структуре посредством геля. Процессами, используемыми для этих способов биопечати, являются так называемая струйная печать, так называемая шприцевал печать или биоплоттинг и так называемая лазерная печать. Каждый из этих трех процессов имеет конкретные преимущества, но и недостатки.

В способе струйной печати клетки в жидкости проталкивают на носитель посредством пьезоэлектрической форсунки (пьезофорсунки). Этот процесс происходит подобно промышленному процессу струйной печати на бумаге с единственным исключением, заключающимся в том, что вместо чернил для печати используются биологические чернила в виде жидкости-носителя с взвешенными в ней клетками. Посредством этого процесса могут быть напечатаны крайне малые объемы, но точность способа оставляет желать лучшего, поскольку капли, создаваемые пьезофорсунками, переносят с биологическими клетками в жидкости-носителе из пьезофорсунок, и они должны пролетать по воздуху расстояние между концами пьезофорсунок и поверхностями, предназначенными для приема объекта печати. В полете капли претерпевают деформации, приводящие к их колебанию в процессе полета. Это приводит к неточностям при использовании этого струйного принтера, поскольку клетки не всегда достигают намеченного места. Кроме того, трехмерная слоистая структура объекта, который должен быть получен, является ограниченной, поскольку укладка слоями может осуществляться только сверху, что затрудняет получение опорных структур и свешивающихся структур.

Эти способы струйной печати описаны, например, в документах WO 99/48541 А1, US 2009/0208466 А1, US 2011/0076734 А1 и US 2011/0250688 А1.

В настоящее время наиболее распространенным способом печати в области биопечати является шприцевал печать. В этом способе подлежащий печати материал загружают в шприц и принудительно подают из шприца посредством сжатого воздуха или выдавливающего давления. Форсунка шприца в этом случае перемещается в намеченное положение блоком трехкоординатного (x-y-z) перемещения в соответствии с подлежащим печати объектом. Затем в месте, намеченном для печати, из шприца выдавливают заданное количество печатного материала. Таким образом получают трехмерный объект, состоящий из слоев. Преимуществом этого способа является простая конструкция, но точное дозирование возможно лишь посредством сложного процесса. Кроме того, если для создания структуры трехмерного объекта должны использоваться разные клетки, в резерве должны держаться и использоваться для печати в дополнение к первому шприцу или взамен его дополнительные шприцы. Это повышает сложность конструкции соответствующего принтера и увеличивает время, требуемое для фактической печати. В конечном счете, это находит отражение в высокой стоимости.

Способы шприцевой печати этого вида описаны, например, в документах WO 2013/113883 А1, US 2011/0313542 А1, US 8580546 В2 и US 2012/0288938 А1. В документе US 2014/0093932 А1 также описан способ шприцевой печати, в котором дополнительное отверждение биологического материала, уже аккумулированного в намеченном месте, осуществляют посредством ультрафиолетового излучения.

В способе лазерной печати печать осуществляют посредством лазерного пучка. В этом случае пленку-носитель вначале покрывают жидкостью, содержащей клетки. После этого на покрытую пленку-носитель направляют импульс лазерного пучка, вызывающий выталкивание капли суспензии клеток с пленки-носителя. Отдельные капли могут затем укладывать одна поверх другой посредством требующей мастерства укладки - подобно способу струйной печати. Действительно, количество капель наносимой клеточной суспензии можно дозировать с довольно высокой точностью. Однако в фазе полета на своем пути до поверхности, на которой должен быть получен напечатанный объект, капли деформируются. Из-за связанного с этим колебания капель, в свою очередь, возникают неточности в размещении капель. Поскольку размер капель в целом довольно мал, способ лазерной печати является очень медленным. Более крупные и более сложные объекты напечатать этим способом невозможно. Кроме того, без опорных структур нельзя получить свешивающиеся структуры.

Целью настоящего изобретения является создание способа печати трехмерного объекта, состоящего из биологического материала, устраняющего недостатки известного уровня техники и, в частности, позволяющего при печати объекта осуществлять высокоточное структурирование объекта и простым путем использовать разные материалы. Кроме того, целью настоящего изобретения является создание устройства, с помощью которого можно реализовать предлагаемый способ.

Первая цель достигается посредством способа получения трехмерного многоклеточного объекта, обладающего признаками по п.1 формулы изобретения. В этом способе вначале в реакционный сосуд вводят первую жидкость с возможностью фотополимеризации. После этого первый световой луч фокусируют на первой фокальной плоскости, лежащей в зоне реакционного сосуда, наполненного первой жидкостью. Посредством этого светового луча в реакционном сосуде затем получают первую полимеризованную структуру. В этом случае первая полимеризованная структура находится в первом слое.

На дальнейших этапах процесса в реакционный сосуд вводят дополнительную жидкость с возможностью фотополимеризации, причем этой дополнительной жидкостью с возможностью фотополимеризации по меньшей мере частично покрывают ранее полученную полимеризованную структуру. Предпочтительно, этой дополнительной жидкостью с возможностью фотополимеризации ранее полученную полимеризованную структуру покрывают полностью. Затем дополнительный световой луч фокусируют на дополнительной фокальной плоскости, лежащей в зоне реакционного сосуда, наполненного дополнительной жидкостью. Таким образом, дополнительная фокальная плоскость отличается от первой фокальной плоскости по меньшей мере в отношении полученной полимеризованной структуры или в отношении слоя этой полимеризованной структуры.

Посредством дополнительного светового луча теперь в дополнительном слое в реакционном сосуде получают дополнительную полимеризованную структуру. В этом случае дополнительная полимеризованная структура расположена непосредственно на ранее полученной полимеризованной структуре и соединена с ней. Связь предпочтительно представляет собой ковалентную связь. Однако в принципе вполне возможны и нековалентные связи, например, основанные на физических взаимодействиях.

Теперь каждый из вышеупомянутых этапов введения дополнительной жидкости с возможностью фотополимеризации, фокусирования дополнительного светового луча и получения дополнительной полимеризованной структуры в дополнительном слое повторяют с еще одной жидкостью с возможностью фотополимеризации, и так до тех пор, пока не получают требуемый трехмерный многоклеточный объект. Посредством разных фокальных плоскостей, в которых происходит полимеризация жидкостей с возможностью фотополимеризации, достигают, таким образом, слоистой структуры трехмерного многоклеточного объекта. В данном случае возможны также подрезки и свешивающиеся структуры, поскольку полимеризация жидкости с возможностью фотополимеризации в заданной фокальной плоскости или слое может происходить, даже если под ней или под ним расположен не уже полимеризованный материал, а лишь еще не полимеризованный материал. Полимеризация этой жидкости с возможностью фотополимеризации, присутствующей вне фокальной плоскости, не происходит; полимеризуется лишь та жидкость с возможностью фотополимеризации, которая лежит в фокальной плоскости. Тем не менее, жидкость, присутствующая вне фокальной плоскости, служит в качестве временной опоры для жидкости, присутствующей в фокальной плоскости, без необходимости в твердых опорных структурах для этой цели.

Первая жидкость с возможностью фотополимеризации и/или по меньшей мере одна из дополнительных жидкостей с возможностью фотополимеризации содержит (содержат) биологические клетки. Когда в результат облучения светом происходит полимеризация, клетки, содержащиеся в жидкости, также внедряются в соответствующий полимер. Поскольку не все жидкости с возможностью фотополимеризации также должны содержать клетки, в полученном трехмерном многоклеточном объекте могут формировать не содержащие клеток структуры, например, в виде промежуточных структур.

С помощью этого способа можно получать сложные биологические объекты как модели, например, для представления и исследования межклеточных взаимодействий, биогенеза органов, болезней или функций органов. Этот трехмерный объект обладает очевидными преимуществами по сравнению с классической двухмерной клеточной культурой, в частности, в случае моделирования взаимодействия среди нескольких типов клеток. Это объясняется тем, что с помощью классических двухмерных клеточных культур нельзя в достаточной мере проиллюстрировать сложность межклеточных взаимодействий, функцию естественного барьера и моделирование болезней или органов.

Кроме того, способ, описанный в настоящем документе, позволяет особенно простым путем получать миниатюризованные модели. В прошлом такие миниатюризованные модели частично создавали вручную. Сложность, требуемая для этого производства, является очень высокой; кроме того, требуются долгие годы опыта.

Наконец, посредством способа, описанного в настоящем документе, может обеспечиваться высокая воспроизводимость разных копий одного и того трехмерного многоклеточного объекта. Как следствие, способ, описанный в настоящем документе, не только позволяет ускорить производство по сравнению с другими способами известного уровня техники, но и обеспечивает всегда одинаковое качество полученных объектов. Эта высокая воспроизводимость является особенно преимущественной в биотехнологии. Это объясняется тем, что при анализе и разработке новых фармацевтических препаратов тестирование, проводимое на трехмерных клеточных культурах, которые всегда остаются неизменными, значительно снижает затраты на разработку. Напротив, если эти сложные трехмерные структуры конструируют вручную, отдельные флуктуации неизбежны. Это, в свою очередь, делает практически невозможным достижение воспроизводимых результатов испытаний. Напротив, способом, описанным в настоящем документе, получают объекты, чрезвычайно хорошо подходящие для достижения воспроизводимых результатов.

В качестве реакционных сосудов можно использовать полости (так называемые лунки) обычных серийных планшетов для микротитрования (например, планшеты для микротитрования с 6, 12, 24, 48, 96, 384 или 1536 лунками), колбы для клеточных культур или чашки Петри.

Трехмерный многоклеточный объект, полученный посредством предлагаемого способа, может состоять из однородного материала и, следовательно, содержать клетки лишь одного типа. Кроме того, полимерный материал, окружающий клетки, может быть выполнен однородным. Однако в одном варианте первая жидкость с возможностью фотополимеризации и по меньшей мере одна из дополнительных жидкостей с возможностью фотополимеризации представляют собой разные жидкости. Это позволяет получать гетерогенно конструированные многоклеточные объекты, содержащие клетки разных типов. Таким образом можно также обеспечить присутствие идентичных или разных клеток в разных окружающих полимерах. Это означает, что разные жидкости могут отличаться, как в части материала с возможностью полимеризации в жидкости, так и в части клеток, содержащихся в жидкости. Следовательно, этот вариант позволяет получить способ, посредством которого разные типы клеток могут быть скомбинированы для создания искусственного органа. Этот орган может представлять собой орган, моделирующий или имитирующий орган человека или животного. Это позволяет одной операцией печати получать разные объекты в одном и том же реакционном сосуде или соседних реакционных сосудах.

Если посредством предлагаемого способа получают искусственный орган, эта модель органа может представлять собой модель, представляющую здоровый орган. Альтернативно, могут получать и модель болезни в виде органа, имеющего заданный изъян. Например, в объект, полученный предлагаемым способом, могут вводить механическую констрикцию для получения «встроенного» повреждения, такого, какое произошло бы в случае удара тупым предметом или тупой травмы. Таким путем можно получить стандартизированную структуру этой модели болезни. Кроме того, в объекте можно получить дегенеративный градиент. Например, в первой зоне объекта можно получить относительно здоровую клеточную культуру, которая затем в полученном объекте непрерывно переходит в структуру, пораженную болезнью, с локальным градиентом. В этом случае в полученном объекте между двумя крайними структурами располагались бы промежуточные, частично пораженные болезнью структуры. Кроме того, возможно также путем введения вирусов или бактерий получить модели инфекции для искусственных органов. Это введение бактерий или вирусов может происходить, как описано выше, во время процесса печати путем выбора подходящей дополнительной жидкости с возможностью фотополимеризации, содержащей в качестве клеток соответствующие вирусы или бактерии.

Путем выбора подходящих типов клеток можно также создавать модели болезней для типичных болезней, таких как диабет, опухоли или нездоровая ткань, такая как наблюдаемая после инфаркта миокарда или инсульта в живом организме. Поскольку в дополнение к содержащим клетки жидкостям с возможностью фотополимеризации могут использовать и не содержащие клетки жидкости с возможностью фотополимеризации, «упаковку» полученного объекта в полимер, не содержащий клеток, могут выполнять во время той же операции печати, в какой получают и сам объект. Это означает, что объект получают одновременно с его носителем и в нем, так что упаковку и многоклеточный объект получают параллельно.

В одном варианте жидкость с возможностью фотополимеризации содержит или представляет собой акриловое соединение, посредством которого достигается полимеризация. Акриловое соединение предпочтительно выбирают из группы, состоящей из метакрилатов, метилакрилатов, этилакрилатов, гидроксиэтилакрилатов, бутилакрилатов, триметилолпропанакрилатов, триакрилатакрилатов и полиакрилатов (РА) вообще.

В одном варианте акриловое соединение связывают с исходным веществом, которое будет желатинизировано или полимеризовано. В частности, это связывание способствует возникновению ковалентной связи между акриловым соединением и исходным веществом, которое будет полимеризовано. Примеры этого исходного вещества могут включать полимер на основе углерода, такой как полиэтиленгликоль (PEG), полиэтилен (РЕ), полипропилен (РР), поликетон (РК), поливилхлорид (PVC), полистирол (PS), политетрафторэтилен (PTFE), полиметилметакрилат (РММА), поликарбонат (PC), полиэтилентерефталат (PET) и полиуретан (PU). В качестве исходных веществ подходят также синтетические полимеры, такие как силиконы, полидиметилсилоксан (PDMS) или смолы, такие как меланиновые смолы или меламиноформальдегидные смолы. Кроме того, в качестве исходных веществ подходят также биополимеры, такие как белки, ДНК, РНК, углеводы и производные углеводов, коллагены, фибрины, альгинаты или желатины. Вместо вышеупомянутых полимеров в качестве исходных веществ могут также использоваться соответствующие мономеры-предшественники или олигомеры-предшественники этих полимеров, если их можно стабильно обеспечить в твердом или жидком агрегатном состоянии. Введение в исходное вещество акрилатной функциональной группы посредством связи между акриловым соединением и исходным веществом создает матрицу с возможностью полимеризации, даже если исходные вещества уже являются полимерами.

Если в качестве матрицы или вещества покрытия используют PDMS с возможностью фотополимеризации, между клетками, включенными в эту матрицу, возможен газообмен. Как уже отмечалось, могут использоваться разные вещества покрытия или матрицы. Например, в дополнение к PDMS или иной матрице, обладающей высокой биосовместимостью, для остальной матрицы могут использовать устойчивый пластик для получения объекта, который устойчив к окружающей среде и содержит внутри менее устойчивую матрицу, допускающую рост клеток. Как уже отмечалось, можно, следовательно, говорить о том, что параллельно трехмерному многоклеточному объекту может быть создана его собственная защита или его собственная упаковка.

Исходное вещество с добавленной акрилатной функциональной группой используют в жидком состоянии, причем возможны разные вязкости. Это означает, что способ, описанный в настоящем документе, не ограничивается жидкостями, имеющими конкретную вязкость, и может также использовать в качестве исходных веществ жидкости низкой вязкости. В этом случае реологическое поведение этих жидкостей может варьировать от тиксотропии до реопексии.

Жидкости могут представлять собой растворы или коллоидные дисперсные смеси, такие как суспензии. В этом случае жидкости могут обладать свойствами от водных до масляных. Среди других факторов это определяется выбором исходных веществ и размером их частиц.

Для того чтобы можно было добиться фотополимеризации исходного вещества, несущего акрилатную функциональную группу, дополнительно используют радикалообразователь (так называемый фотоинициатор), образующий радикалы при выбранной длине волны света, которую используют в контексте предлагаемого способа.

Примеры подходящих радикалообразователей включают производные антрона, такие как виолантрон или изовиолантрон, флуоресцеин, рубрен, производные антрацена, производные тетрацена, бензантрон, бензантронил, эозин, производные левулиновой кислоты, производные фосфина, моноацил- и бис-ацилфосфины, металлоцены, ацетофеноны, бензофеноны, ксантоны, хиноны, производные кетона, гидроксикетоны, аминокетоны, бензоилпероксиды, соли пиридина, фенилглиоксилаты и/или соли иодония.

В дополнение к радикалообразователю предпочтительно используют также виниловый макромер и коинициатор на основе амина, чтобы сделать протекание фотополимеризации особенно подходящим. Примеры подходящих коинициаторов включают аскорбиновую кислоту и производные третичного амина, такие как метилдиэтаноламин или тетраэтиламин.

В одном варианте жидкость с возможностью фотополимеризации содержит или представляет собой производную тиола. Подходящими производными тиола являются дитиотреитол, монофункциональные цистеины, двухфункциональные пептиды и подобные соединения.

Кроме того, в жидкость с возможностью фотополимеризации могут добавлять вещество, подавляющее фотополимеризацию более глубоких, более жидких слоев. Это приводит к тому, что жидкий раствор вне фокальной плоскости остается жидким, даже если находится в зоне облучения фокальной плоскости выше нее. Это вызвано поглощением полимеризующей длины волны этим веществом. В фокальной плоскости происходит перехват, и поэтому проникание полимеризующей длины волны в более глубокие слои невозможно. Подходящими являются все вещества, поглощающие при требуемой длине волны, такие как краски.

В одном дополнительном варианте жидкость с возможностью фотополимеризации содержит или представляет собой монофункциональный мономер, такой как N-винилпирролидон.

Кроме того, в одном варианте первая жидкость с возможностью фотополимеризации и/или одна из дополнительных жидкостей с возможностью фотополимеризации и/или другая жидкость, которая не должна иметь возможность фотополимеризации, может содержать или представлять собой термочувствительный желатинирующий агент.В частности, предлагается использование инверсного термочувствительного (именуемого также обратным термочувствительным) желатинирующего агента. При повышении температуры этот желатинирующий агент становится все тверже. При нагревании реакционного сосуда реакционная жидкость отвердевает и формирует гель, вначале являющийся лишь метастабильным. Если жидкость не должна одновременно с этим иметь возможность фотополимеризации, последующее охлаждение объекта может привести к тому, что метастабильный гель снова станет разжиженным и будет откачан. У обычно используемых термочувствительных желатинирующих агентов температурные условия, которые должны использоваться, являются прямо противоположными. Поэтому, если необходимо, например, опорная структура может быть выполнена с возможностью получения свешивающихся структур. И напротив, если метастабильный гель по меньшей мере частично облучен светом подходящей длины волны, это вызывает фотополимеризацию, и при этом метастабильный гель превращается в этих зонах в стабильный гель или полимер.

Иными словами, посредством термочувствительного, в частности, инверсного термочувствительного желатинирующего агента и регулирования температуры в реакционном пространстве становится возможным проще работать со свешивающимися частями и подрезками. Однако в этом варианте можно продолжать работать даже с жидкими структурами в качестве опоры.

Кроме того, можно предусмотреть температурный градиент, чтобы во всех зонах жидкости, смешанной с термочувствительным, в частности, инверсным термочувствительным желатинирующим агентом, метастабильный гель не сформирован. Благодаря использованию этого градиента можно получать даже более сложные структуры.

Вышеупомянутые отдельные компоненты могут содержаться в жидкости с возможностью фотополимеризации как отдельные вещества. Альтернативно, вещества или группы, предпочтительно используемые для формирования геля, можно реализовать в одном полимере посредством соответствующего синтеза. Вместо смеси отдельных компонентов этот полимер будет затем содержать разные функциональные группы, сочетающие все функции, требуемые и предпочтительно используемые для фотополимеризации. Кроме того, в одном полимере можно предусмотреть лишь некоторые из функциональных групп или групп, предпочтительно используемых для фотополимеризации, а другие функциональные группы или группы, предпочтительно используемые для фотополимеризации, можно подмешать к отдельным индивидуальным компонентам жидкости с возможностью фотополимеризации.

Поскольку для структуры трехмерного многоклеточного объекта используются биологические клетки, подходящими являются все естественно встречающиеся эукариотические и прокариотические клетки. Предпочтительно используют эукариотические клетки. Особенно подходящими являются все клетки и типы клеток, находящиеся в теле млекопитающего, в частности, грызуна и особенно предпочтительно человека, или образующие это тело. В одном варианте биологические клетки представляют собой омнипотентные или полипотентные клетки. В этом отношении изобретение относится - в одном варианте - к использованию только тех клеток, которые можно получить без разрушения человеческих эмбрионов. В дополнение к естественно встречающимся клеткам в качестве биологических клеток могут использоваться и не естественно встречающиеся клеточные линии. Эти искусственно генерируемые клеточные линии позволяют получать индивидуализированную структуру трехмерного многоклеточного объекта.

Поскольку предлагаемый способ позволяет объединять в трехмерный многоклеточный объект различные типы клеток, он особенно хорошо подходит для получения искусственных органов. Например, эти искусственные органы могут представлять собой миниатюризованные объекты-модели естественного органа, в частности, естественного органа человека или животного, такого как млекопитающее или грызун. Поскольку могут использоваться разные жидкости с возможностью фотополимеризации, возможны и разные типы геля, в которые биологические клетки вводят. Можно также объединять синтетические полимеры и биополимеры, благодаря чему можно получать высокостабильные конструкты, в которые введены биологические клетки. В течение одной операции печати можно одновременно получить несколько трехмерных объектов, даже имеющих разные формы.

Кроме того, функция мембраны и барьера в сочетании с функцией органа позволяют также создавать модель беременности с использованием этой технологии.

В одном варианте полученные искусственные органы - это, в частности, те органы, которые моделируют функции мышц, скелета, кожи, жировой ткани, желудка, печени, костного мозга, головного мозга, легких, сердца, почек, щитовидной железы или селезенки и, следовательно, могут называться искусственными мышцами, искусственным скелетом и т.д.

На носителе внутри реакционного сосуда или также в других реакционных сосудах могут быть предусмотрены комбинации разных искусственных органов, полученных, например, в течение одной и той же операции печати.

В одном варианте дополнительную жидкость с возможностью фотополимеризации не вводят в реакционный сосуд, пока из реакционного сосуда не будет удалена жидкость с возможностью фотополимеризации, ранее присутствовавшая в реакционном сосуде (например, это может быть первая жидкость с возможностью фотополимеризации или дополнительная жидкость с возможностью фотополимеризации). С этой целью, например, можно предусмотреть насос, выкачивающий уже использованную жидкость с возможностью фотополимеризации из реакционного сосуда и закачивающий новую дополнительную жидкость с возможностью фотополимеризации в реакционный сосуд. Для этих процессов вместо одного отдельного насоса можно использовать и два или более разных насосов.

В одном варианте для обеспечения стерильного производства трехмерного многоклеточного объекта предусмотрено введение в реакционный сосуд дезинфицирующей жидкости. Эту дезинфицирующую жидкость могут, например, вводить в реакционный сосуд после того, как ранее использованную жидкость с возможностью фотополимеризации уже удалили из реакционного сосуда, а дополнительную жидкость с возможностью фотополимеризации еще не ввели в реакционный сосуд. Кроме того, дезинфицирующую жидкость можно вводить в реакционный сосуд в дополнение к жидкости с возможностью фотополимеризации, чтобы в течение процесса фотополимеризации она содержалась в реакционном сосуде.

В качестве дезинфицирующей жидкости могут использовать, например, спирт, такой как этанол или пропанол. В этом случае особенно подходящими для дезинфекции являются водные растворы этих спиртов, в которых концентрация спирта находится, например, в пределах 40-90%, в частности, 50-80%, в частности, 60-70% (по объему, соответственно).

В одном варианте многоклеточный трехмерный объект во время или в конце процесса его получения могут облучать светом короткой дины волны (например, в ультрафиолетовой области спектра, т.е. менее 380 нм) для обеспечения тем самым стерилизации. Такие стерилизации ультрафиолетовым излучением общеизвестны. Однако в настоящем случае они могут преимущественно использоваться, если биологические клетки, содержащиеся в трехмерном объекте, не повредятся этим ультрафиолетовым излучением.

В одном варианте в реакционном сосуде находится пластина-носитель или структура-носитель, с которой связывается первая полимеризованная структура. Использование такой пластины-носителя желательно в случае, если полученный трехмерный многоклеточный объект не должен исследоваться позже в самом реакционном сосуде, а должен быть удален из реакционного сосуда. Например, в пластине-носителе могут присутствовать винтовые выводы (такие как винтовые выводы DIN) для обеспечения последующей подачи жидкостей и газов в полученный многоклеточный трехмерный объект. Можно также вводить эти винтовые выводы в матрицу трехмерного многоклеточного объекта во время процесса получения, т.е. создавать винтовые выводы в матрице во время указанного процесса. Создание этих винтовых выводов в матрице можно осуществлять независимо от того, используется или не используется пластина-носитель.

В одном варианте пластину-носитель создают до этапа получения первой полимеризованной структуры облучением световым лучом в фокальной плоскости, лежащей в зоне реакционного сосуда, наполненного жидкостью с возможностью фотополимеризации (особенно первой или одной из дополнительных жидкостей с возможностью фотополимеризации) путем формирования полимеризованной структуры-носителя, содержащей или представляющей собой пластину-носитель. Это означает, что в этом варианте реакцией полимеризации получают не только собственно полимеризованные структуры, но и структуру-носитель.

Структура-носитель может иметь такой вид, что между пластиной-носителем и дном реакционного сосуда образовано некоторое расстояние. Это затем приводит к тому, что фокальные плоскости фактических реакций полимеризации находятся на большем расстоянии от дна реакционного сосуда. В частности, первая сформированная полимеризованная структура находится затем на большем расстоянии от дна реакционного сосуда. Это позволяет особенно легко отсасывать из реакционного сосуда жидкости с возможностью полимеризации, которые больше не нужны.

Для того чтобы жидкости могли свободно проникать через пластину-носитель или структуру-носитель, структура-носитель может иметь проницаемые для жидкости отверстия, особенно в зоне пластины-носителя.

В одном варианте между источником света для получения первого и/или дополнительного светового луча и реакционным сосудом расположена оптическая система, причем указанная оптическая система служит для фокусирования светового луча на соответствующей фокальной плоскости в реакционном сосуде. В этой части в одном варианте предлагается, что для изменения фокальной плоскости внутри реакционного сосуда может быть выполнена перефокусировка этой оптической системы. Например, эта перефокусировка может быть достигнута путем изменения расстояния оптической системы от источника света. В этом случае для обеспечения соответствующего перемещения оптической системы может быть предусмотрен шаговый электродвигатель с компьютерным управлением. Оптическая система может, например, содержать или представлять собой систему оптических линз или в случае особенно простой конструкции отдельную фокусирующую линзу.

Если возможна перефокусировка оптической системой для изменения или смещения фокальной плоскости внутри реакционного сосуда, обычно какие-либо конкретные требования к конструктивному исполнению реакционного сосуда отсутствуют.

В одном варианте можно также осуществлять относительное перемещение реакционного сосуда или пластины-носителя, расположенной в реакционном сосуде, с одной стороны, и источника света для получения первого и/или дополнительного светового луча, с другой стороны. Это необходимо для того, что посредством этого относительного перемещения, которое могут осуществлять, например, перемещением реакционного сосуда, перемещением пластины-носителя, расположенной в реакционном сосуде, или перемещением источника света, можно также изменять фокальную плоскость внутри реакционного сосуда. Следовательно, в этом варианте перефокусировка факультативно используемой оптической системы не требуется. Тем самым можно уменьшить риск оптического рассогласования.

В еще одном варианте способа первый и/или дополнительный световой луч направляют на определенную и предварительно определяемую зону в соответствующей фокальной плоскости в первой жидкости с возможностью фотополимеризации и/или дополнительной жидкости с возможностью фотополимеризации. Это означает, что можно предварительно определить конкретную картину света, падающего на жидкость с возможностью фотополимеризации и вызывающего полимеризацию жидкости в этих местах для формирования полимера или геля (матрицы). Например, такую картину света можно получить путем использования масок или экранов, а также путем использования пульсирующего светового луча или посредством цифровой модуляции светового сигнала. Полимеризация происходит на участках жидкости с возможностью фотополимеризации, на которые падает световой луч. В то же время на других участках, на которые световой луч не падает, жидкость с возможностью фотополимеризации остается в своем неполимеризованном состоянии. Таким образом, световой луч определяет участки, на которых происходит печать полимеризованной структуры. Эта поддерживаемая светом печать позволяет достигать намного более высоких разрешений, чем возможные при использовании способов известного уровня техники. В этом случае разрешение зависит от используемой длины волны света. Даже в случае регулярно используемых длинных длин волн разрешение лучше, чем может быть достигнуто обычными способами известного уровня техники. Чем точнее может быть сфокусирован источник света, тем выше результирующее разрешение. Например, крайне высокие разрешения могут быть достигнуты при использовании лазера.

При необходимости световой луч может быть направлен на соответствующую фокальную плоскость с помощью зеркал.

Соответственно выбранная картина экспозиции может обеспечиваться, например, компьютерной программой. В этом случае пользователь может создавать трехмерный объект с помощью программного обеспечения CAD. Цифровой объект, созданный таким образом, затем делят на отдельные плоскости экспозиции соответствующей компьютерной программой. Затем каждой плоскости или разным участкам этой плоскости назначают конкретную жидкость с возможностью фотополимеризации или конкретный тип клеток. На основании этих данных готовят данные для управления принтером, посредством которых осуществляют описанный способ. Эти данные для управления указывают, когда и какая жидкость с возможностью фотополимеризации должна быть введена в реакционный сосуд. Кроме того, эти данные для управления указывают, когда и какое изображение плоскости экспозиции должно быть спроецировано на соответствующую фокальную плоскость в реакционном сосуде. Тем самым цифровой объект, ранее полученный на компьютере, может быть преобразован в реальный трехмерный многоклеточный объект.

В одном варианте в одном и том же слое (т.е. в одной и той же фокальной плоскости) получают более одной полимеризованной структуры. С этой целью вначале происходит полимеризация первой жидкости с возможностью фотополимеризации и, например, закладка первого типа клеток в полимер, сформированный из первой жидкости. После этого первую жидкость с возможностью фотополимеризации удаляют из реакционного сосуда, и в реакционный сосуд подают вторую жидкость с возможностью фотополимеризации. Теперь воздействию света подвергают только участки внутри фокальной плоскости в реакционном сосуде, которые ранее не подвергались воздействию света и поэтому еще не имеют какой-либо полимеризованной структуры. Это позволяет получать в одном и том же слое разные типы клеток или разные матрицы. Следовательно, в одном и том же слое получают несколько полимеризованных структур, что дает в результате гетерогенный слой. После этого вторую жидкость с возможностью фотополимеризации удаляют из реакционного сосуда, и в реакционный сосуд подают дополнительную жидкость с возможностью фотополимеризации. Уровень заполнения для этой дополнительной жидкости с возможностью фотополимеризации может быть доведен лишь до такого уровня, чтобы был полностью покрыт ранее полученный слой. Затем фокальная плоскость может быть смещена, и посредством соответствующей полимеризованной структуры может быть построен дополнительный слой трехмерного многоклеточного объекта, который необходимо получить. В этом случае отдельные слои полученного трехмерного объекта обычно могут быть однородными (содержащими полимеризованную структуру одного типа), а другие слои - неоднородными (содержащими полимеризованные структуры разного типа), причем число отдельных структур на слой не ограничивается. На практике установлено, что в дополнение к одной полимеризованной структуре на слой преимущественными являются неоднородные слои с 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 полимеризованными структурами.

В одном варианте по меньшей мере первую структуру в первом слое, хотя, в частности, каждую структуру первого слоя, облучают с двух разных направлений первым световым лучом. В этом случае указанные два разных направления предпочтительно являются противоположными. Указанным облучением с двух разных направлений обеспечивают особенно прочное закрепление первого слоя на внутренней поверхности реакционного сосуда или на пластине-носителе, расположенной в реакционном сосуде. Это обеспечивает последующее достижение прочного прилипания всего полученного трехмерного многоклеточного объекта к реакционному сосуду или к пластине-носителю в реакционном сосуде, что способствует последующим исследованиям объекта. Обычно облучение осуществляют сверху относительно реакционного сосуда, открытого сверху. В этом варианте первый слой затем предпочтительно облучают и снизу через дно реакционного сосуда. С этой целью реакционный сосуд должен быть изготовлен из материала, проницаемого для светового луча выбранной длины волны. Последующие слои, расположенные выше первого слоя, затем предпочтительно по очереди облучают лишь с одного направления (т.е. предпочтительно сверху), так что уже сформированные полимеризованные структуры не лежат между фокальной плоскостью светового луча и источником света, используемого для испускания светового луча, и, следовательно, снова не облучаются световым лучом перед его фокальной плоскостью.

В одном варианте первый световой луч и/или дополнительный световой луч имеет и/или имеют длину волны в пределах 200-1000 нм (т.е. длину волны между ультрафиолетовой и инфракрасной областями спектра). Вещества, предпочтительно используемые в качестве радикалообразователей, этими длинами волн могут возбуждаться особенно эффективно, вызывая при этом формирование радикалов для обеспечения полимеризации исходных веществ, несущих акрилатные функциональные группы.

Дополнительные подходящие длины волн используемого светового луча находятся в пределах 250-950 нм, в частности 300-850 нм, в частности 350-800 нм, в частности 400-750 нм, в частности 450-700 нм, в частности 500-650 нм и, особенно предпочтительно, 500-600 нм.

Поскольку ультрафиолетовое излучение может повредить биологические клетки, в одном варианте используют лишь свет, имеющий длину волны в видимой области спектра, т.е. от приблизительно 380 нм до приблизительно 780 нм. В этом случае могут также быть предусмотрены УФ-фильтры, отфильтровывающие УФ-составляющие из светового луча, чтобы надежно отфильтровать возможно вредное УФ-облучение из используемого светового луча.

Световые лучи, используемые для полимеризации, могут иметь одинаковую длину волны, но альтернативно могут содержать длины волн, отличные от вышеупомянутого диапазона длин волн, чтобы обеспечить подходящую полимеризацию различных жидкостей с возможностью фотополимеризации. В этом случае отдельные световые лучи могут быть созданы разными источниками света или одним и тем же источником света. Кроме того, если необходимо сформировать гетерогенный слой из разных полимеризованных структур, в одном слое (и, таким образом, в одной фокальной плоскости) можно успешно использовать разные длины волн для полимеризации разных жидкостей с возможностью фотополимеризации в одном и том же слое.

В одном варианте способ осуществляют таким образом, что при получении трехмерного многоклеточного объекта в трехмерный многоклеточный объект вводят по меньшей мере один функциональный элемент. Функциональный элемент в этом случае выбирают из группы, состоящей из мембран, каналов, пор, датчиков, электропроводных носителей и хемотактических препаратов. Например, каналы и поры могут быть введены в объект путем оставления открытыми определенных участков полимеризованной структуры, сформированной в нескольких слоях один поверх другого.

Мембраны могут быть сформированы путем введения в жидкость с возможностью фотополимеризации молекул липидов.

Кроме того, посредством фотополимеризации внутри объекта могут быть также введены солевые мостики. Особенно простым путем это может быть осуществлено, если жидкость с возможностью фотополимеризации содержит соли, т.е. является физиологическим раствором. Таким путем могут быть осуществлены последующие электрический разряд и расслабление напечатанного объекта.

При установке в объект датчиков во время процесса получения объекта последующих дополнительных манипуляций с полученным трехмерным объектом не требуется, поскольку его можно непосредственно считывать посредством уже установленных датчиков. Это существенно облегчает последующие анализы трехмерного объекта.

При введении электропроводных носителей, таких как электроды, анализировать в последующих исследованиях полученного трехмерного многоклеточного объекта электрический потенциал или электрические свойства объекта особенно просто.

При введении хемотактических препаратов, которые в одном варианте могут быть введены в разных слоях в разных концентрациях, чтобы таким путем создать градиент, становится возможным осуществлять целевой рост клеток внутри многоклеточного трехмерного объекта после его получения. Если хемотактический препарат является аттрактантом, он вызывает положительный хемотаксис, так что клетки в трехмерном объекте ориентированы в сторону участков более высокой концентрации аттрактанта. Если хемотактический препарат является репеллентом, он вызывает отрицательный хемотаксис, так что клетки в трехмерном объекте ориентированы в сторону участков более низкой концентрации репеллента или участков, в которых репеллент вообще отсутствует. Это позволяет добиться целевого роста клеток внутри многоклеточного объекта.

Для постоянного точного определения уровня жидкости в реакционном сосуде предпочтительно используют по меньшей мере один датчик уровня наполнения. На основании этих данных об уровне наполнения можно затем определить фокальную плоскость, в которой необходимо проводить следующий этап полимеризации. Данные этого датчика уровня наполнения могут также быть использованы для автоматической регулировки фокальной плоскости. Данные этого датчика уровня наполнения могут также быть использованы для управления насосом, обеспечивающим приток жидкостей с возможностью фотополимеризации в реакционный сосуд. Это позволяет всегда вводить в реакционный сосуд точное количество жидкостей с возможностью фотополимеризации, требуемое для формирования желательного соединения в конкретное время. Это сводит к минимуму количество отходов. Кроме того, это позволяет осуществлять способ в целом экономичным образом.

Как можно видеть из вышеприведенного представления способа, описанного в настоящем документе, этот способ можно осуществлять полностью автоматически, так что никакие действия со стороны пользователя не требуются. Это позволяет даже легче использовать предлагаемый способ.

Время, в течение которого световой луч направляют на соответствующую фокальную плоскость, можно регулировать с учетом соответствующих требований используемой жидкости с возможностью фотополимеризации. Это означает, что каждому материалу дается время отверждения, требуемое и преимущественное для желательной полимеризации.

Если носитель расположен внутри реакционного сосуда, между окружающим псевдоожиженным слоем и уже полимеризованными структурами на носителе, когда этот носитель поднят относительно реакционного сосуда, может возникать отрицательное давление. Однако потенциально отрицательное давление может быть сброшено путем отсасывания остатка жидкости с возможностью фотополимеризации, еще присутствующей в реакционном сосуде, от предыдущего этапа полимеризации, и введения новой жидкости с возможностью фотополимеризации. С этой целью носитель может быть перемещен относительно реакционного сосуда без риска отрыва уже полимеризованных структур трехмерного объекта от носителя.

Если трехмерный объект получают на пластине-носителе, после окончания процесса получения объекта эта пластина-носитель может быть полностью поднята из остающейся жидкости в реакционном сосуде. После этого пользователь может снять полученный объект с пластины-носителя. Для предотвращения разрушения объекта при его снятии с пластины-носителя пластина-носитель может быть конструктивно выполнена такой, чтобы между поверхностью пластины-носителя и нижней стороной полученного трехмерного объекта можно было направлять поток стерильного воздуха. Это затем позволяет равномерно отжать объект от пластины-носителя, тем самым обеспечивая осторожное снятие трехмерного объекта с пластины-носителя.

Цель изобретения достигается также посредством устройства для получения трехмерного многоклеточного объекта из жидкостей с возможностью фотополимеризации, имеющего следующие признаки.

Это устройство содержит реакционный сосуд и источник света, расположенный таким образом, чтобы при работе устройства он мог излучать свет в реакционный сосуд, причем этот свет фокусируется на фокальной плоскости внутри реакционного сосуда. Кроме того, устройство содержит резервуар для разных жидкостей с возможностью фотополимеризации. Кроме того, предусмотрен насос, который может быть приведен в сообщение по текучей среде, как с резервуаром, так и с реакционным сосудом. Для этой цели между насосом и резервуаром или между насосом и реакционным сосудом могут быть предусмотрены подходящие клапаны. Это позволяет посредством насоса вводить в реакционный сосуд разные жидкости с возможностью фотополимеризации и выпускать их из реакционного сосуда. Наконец, предусмотрен также блок управления, предназначенный для управления источником света и насосом.

Основные функции отдельных элементов этого устройства уже представлены в связи с объяснениями вышеописанного способа.

Если реакционный сосуд представляет собой лунку планшета для микротитрования, в одном варианте могут быть предусмотрены несколько разных линий, выполненных с возможностью оправления с помощью различных клапанов, благодаря чему возможно одновременно наполнять или опорожнять разные реакционные сосуды. Кроме того, может также быть предусмотрено одно устройство наполнения или отсасывания, выполненное с возможностью перемещения к различным лункам планшета для микротитрования.

Подача жидкостей с возможностью фотополимеризации в реакционный сосуд и/или их удаление из реакционного сосуда предпочтительно происходит и/или происходят в зоне реакционного сосуда рядом с дном. Это объясняется тем, что таким образом можно обеспечить, с одной стороны, возможность удаления из реакционного сосуда даже остаточных количеств жидкостей с возможностью фотополимеризации, подлежащих удалению. Кроме того, таким образом может обеспечиваться плавная подача в реакционный сосуд новой жидкости с возможностью фотополимеризации, чтобы вновь подаваемой жидкостью не повредить уже полимеризованные структуры.

В одном варианте источник света предусмотрен и конструктивно выполнен таким образом, чтобы излучать свет разных длин волн. В этом случае длина волны излучаемого света может предварительно определяться пользователем или управляющей программой. Это позволяет реализовать полимеризацию при разных длинах волн без необходимости использовать для этой цели разные источники света.

В одном варианте для направления первого и/или дополнительного светового луча на жидкости с возможностью фотополимеризации предусмотрено по меньшей мере одно зеркало. Таким образом, могут быть реализованы даже больше разных расположений источника света и реакционного сосуда.

Вышеописанное устройство особенно подходит для получения искусственного органа или модели беременности, как уже описывалось выше в обзоре способов, описанных в настоящем документе. В этом случае искусственный орган может представлять собой модель здорового органа или модель болезни.

Предпочтительные или альтернативные варианты осуществления способа, описанные в настоящем документе, применимы аналогично описанному устройству или описанному использованию и наоборот. Причем возможны и предусмотрены любые желательные сочетания отдельных вариантов.

Дополнительные детали настоящего изобретения будут далее объяснены более подробно на основании иллюстративных вариантов осуществления и со ссылками на соответствующие фигуры. На фигурах показано следующее:

фиг. 1: первый иллюстративный вариант осуществления устройства для получения трехмерного многоклеточного объекта из жидкостей с возможностью фотополимеризации,

фиг. 2: второй иллюстративный вариант осуществления устройства для получения трехмерного многоклеточного объекта из жидкостей с возможностью фотополимеризации, и

фиг. 3: иллюстративный вариант осуществления варианта способа печати структуры-носителя.

На фиг. 1 показана схематическая структура 3D-принтера как устройства для получения трехмерного многоклеточного объекта из жидкостей с возможностью фотополимеризации. 3D-принтер содержит первый источник 1 света и второй источник 2 света. Свет, излучаемый первым источником 1 света, направлен через первую линзу 3 на несколько реакционных сосудов 4, из которых на иллюстрации на фиг. 1 показаны лишь три. Таким же образом свет, излучаемый вторым источником 2 света, направлен через вторую линзу 5 на реакционные сосуды 4. Вместо двух разных источников 1, 2 света можно было бы использовать и один источник света, при этом путь луча был бы предусмотрен таким образом, чтобы свет, излучаемый этим одним источником света, факультативно был направлен на реакционные сосуды 4 с верхней стороны реакционных сосудов 4 и/или с нижней стороны реакционных сосудов 4.

Первый источник 1 света и второй источник 2 света могут излучать свет разных длин волн, причем длина волны может быть автоматически отрегулирована.

Несколько разных камер 6, соответственно, содержащих разные исходные жидкости в качестве жидкостей с возможностью фотополимеризации, вместе формируют резервуар 7, подсоединенный к насосу 9 несколькими линиями 8, число которых соответствует числу камер 6. Посредством насоса 9 жидкости с возможностью фотополимеризации, содержащиеся в камерах 6 резервуара 7, могут транспортироваться по линиями 8 в реакционные сосуды 4. Для этой цели реакционные сосуды 4 соединены с насосом 9 посредством соответствующей системы 10 линий. Насос 9 дополнительно подсоединен к приемнику 11 отходов, в который могут подаваться больше не нужные остатки жидкости. В частности, насос 9 служит также для отсасывания больше не нужной жидкости с возможностью фотополимеризации из реакционных сосудов 4 по системе 10 линий и последующей подачи ее в приемник 11 отходов.

При работе 3D-принтера, показанного на фиг. 1, данные о цифровом объекте 12, полученные с помощью программы CAD, вначале передаются в центральный блок 13 управления. В этом центральном блоке 13 управления может затем происходить разложение цифрового объекта 12 на отдельные плоскости при условии, что это уже не выполнено посредством переданных данных. В этом случае центральный блок 13 управления служит для включения первого источника 1 света, второго источника 2 света и насоса 9. Кроме того, центральный блок 13 управления может также перемещать вторую линзу 5 по желанию пользователя. Жидкость с возможностью фотополимеризации, требуемую для первого слоя трехмерного объекта, который необходимо получить, которая уже содержит клетки для введения в первый слой, теперь отсасывают из соответствующей камеры 6 резервуара 7 посредством насоса 9 и передают в отдельные реакционные сосуды 4 по соответствующей линии 8 и системе 10 линий. После этого, как свет из первого источника 1 света, так и свет из второго источника 2 света фокусируют на реакционных сосудах 4, при этом происходит полимеризация жидкости с возможностью фотополимеризации, находящейся в реакционных сосудах 4, и полимеризованная структура, сформированная таким образом, прочно приклеивается к внутренней стороне реакционного сосуда 4. После этого оставшуюся неполимеризованную жидкость отсасывают насосом 9 по системе линий из реакционных сосудов 4 и подают в приемник 11 отходов.

В соответствии с данными, предварительно определенными центральным блоком 13 управления, теперь дополнительную жидкость с возможностью фотополимеризации отсасывают насосом 9 из соответствующей камеры 6 резервуара 7 и снова подают в реакционные сосуды 4 по соответствующей линии 8 и системе 10 линий. Теперь центральный блок 13 управления вызывает изменение фокальной плоскости света, падающего на реакционные сосуды. Для этой цели центральный блок 13 управления включает электродвигатель 14, опускающий реакционный сосуд 4 на расстояние, соответствующее толщине полимеризованной структуры первого слоя, полученного на первом этапе. Свет из первого источника 1 света теперь излучают сверху на реакционные сосуды 4 для получения второго слоя полимеризованной структуры, сформированный непосредственно над первым слоем и ковалентно связанный с первым слоем посредством химической реакции.

Для этого этапа второй источник 2 света больше не требуется, поскольку двустороннее облучение должно выполняться только для нижнего слоя, поскольку этот слой должен приклеиваться особенно прочно к внутренней стороне реакционного сосуда 4. После этого неполимеризованную жидкость снова откачивают из реакционных сосудов 4, и дополнительную жидкость с возможностью полимеризации подают в реакционные сосуды 4 в зависимости от состояния клапанов, предопределенного центральным блоком 13 управления. Затем реакционные сосуды 4 снова опускают, при этом фокальная плоскость изменяется, и может быть сформирован дополнительный слой. Эти этапы повторяют до получения требуемого трехмерного объекта.

Как уже отмечалось, в одном и том же слое могут быть выполнены несколько этапов полимеризации для получения гетерогенного слоя из разных полимеризованных структур. Кроме того, из одной и той же жидкости с возможностью фотополимеризации могут быть получены несколько последовательных слоев. В этом случае из реакционных сосудов 4 не нужно отсасывать жидкость, которая не была полимеризована в первом процессе полимеризации. Вместо этого реакционные сосуды 4 могут быть просто опущены для изменения фокальной плоскости, при этом дополнительный слой полимеризованной структуры затем получают на сформированном слое с использованием остатка жидкости с возможностью фотополимеризации, еще присутствующей в реакционных сосудах.

Кроме того, центральный блок 13 управления служит также для включения блока 18 регулирования температуры, выполненного с возможностью охлаждения и/или нагревания реакционных сосудов 4 или пространства, окружающего реакционные сосуды 4, и/или резервуара 7 и/или камеры 6 резервуара 7 для обеспечения определенных условий реакции. Блок 18 регулирования температуры позволяет особенно просто использовать зависящие от температуры желатинирующие агенты и образовывать зависящие от температуры метастабильные гели.

На фиг. 2 показан еще один 3D-принтер как еще один иллюстративный вариант осуществления устройства для получения трехмерного многоклеточного объекта из жидкостей с возможностью фотополимеризации. На этой фигуре одинаковые элементы обозначены такими же позициями, как и на фиг. 1, и в этой связи можно обращаться к вышеприведенным объяснениям в отношении фиг. 1.

3D-принтер, показанный на фиг. 2, отличается от 3D-принтера, показанного на фиг. 1, особенно в части конструктивного исполнения реакционного сосуда 4. В частности, в 3D-принтере, показанном на фиг. 2, внутри реакционного сосуда 4 расположена пластина-носитель 15, служащая как подложка для трехмерного объекта, который необходимо получить. В этом случае облучение светом из первого источника 1 света происходит с нижней стороны реакционного сосуда 4. Это означает, что трехмерный объект, который должен быть получен, получают с верхней стороной, обращенной вниз внутри реакционного сосуда 4. Вначале на пластине-носителе 15 полимеризуют нижний слой объекта, который должен быть получен. После этого пластину-носитель 15 поднимают посредством электродвигателя 14, и при этом на слое, уже приклеенном к пластине-носителю 15, затем получают следующий слой. Это означает, что в этом случае фокальную плоскость света, излучаемого из источника 1 света в реакционный сосуд 4, сдвигают подъемом пластины-носителя 15. В этом случае пластину-носитель 15 поднимают лишь настолько, чтобы слой полимеризованной структуры, уже образованный на ней, едва касается поверхности жидкости 16 с возможностью полимеризации, содержащейся в реакционном сосуде 4. Когда затем в реакционный сосуд 4 излучают свет из источника 1 света, дополнительный слой полимеризованной структуры, образованный им, откладывают непосредственно на уже полученный ранее слой, при этом может иметь место ковалентная связь двух слоев, придающая окончательному полученному объекту высокую стабильность.

Поскольку для 3D-принтера на фиг. 2 предусмотрен лишь один реакционный сосуд 4, система 10 линий, соединяющая насос 9 с реакционным сосудом 4, также представляет собой лишь одну линию.

Для того чтобы объект, полученный на пластине-носителе 15, легко мог быть снят с пластины-носителя 15, предусмотрен также источник 16 давления для стерильного воздуха, который может быть приведен в сообщение по текучей среде с пластиной-носителем 15 по напорному воздуховоду 17. По завершении изготовления трехмерного объекта воздух с помощью источника 16 давления для стерильного воздуха может нагнетаться между нижней стороной пластины-носителя 15 и первый слоем полученного объекта, благодаря чему объект может быть легко снят с пластины-носителя 15.

Как в иллюстративном варианте осуществления на фиг. 1, так и в иллюстративном варианте осуществления на фиг. 2, в дополнение к функциям, упомянутым выше, центральный блок 13 управления используется также для управления изображением или картиной, создаваемым или создаваемой источником света, продолжительностью экспозиции, высотой реакционного сосуда 4 или носителя 15 внутри реакционного сосуда 4, фокальной плоскостью, уровнем наполнения для жидкости 16 с возможностью фотополимеризации внутри реакционного сосуда 4, выбором жидкости с возможностью фотополимеризации и/или клапанами, предусмотренными в линиях 8 и системе 10 линий. Таким образом, 3D-принтеры могут работать полностью автоматически и создавать трехмерный объект без взаимодействия с пользователем на основании соответственно поставляемых данных.

Как и в иллюстративном варианте осуществления на фиг. 1, предусмотрен блок 18 регулирования температуры. В этой связи можно обратиться к вышеприведенным объяснениям.

В еще одном иллюстративном варианте осуществления, объясненном ниже, представлена возможная термочувствительность используемой жидкости с возможностью фотополимеризации.

Добавлением термочувствительного вещества, в частности, инверсного термочувствительного вещества можно дополнительно улучшить получение свешивающихся объектов и полых камер. Например, может быть подмешано вещество, такое как полоксамер, в такой концентрации, чтобы жидкость с возможностью фотополимеризации или жидкость без возможности фотополимеризации превращались в гель в желательном диапазоне температур даже без облучения светом.

Например, протекание способа может быть следующим: Если желатинизации необходимо достичь при температуре прибл. 20°С, полоксамер подмешивают в жидкость с возможностью фотополимеризации в такой концентрации, чтобы жидкость в этой зоне превращалась в гель. Возможны и смеси нескольких полоксамеров. Если возможно, жидкость вначале может быть охлаждена до температуры ниже точки желатинизации. Если желательна свешивающаяся структура внутри объекта, жидкость, содержащая термочувствительный желатинирующий агент, моет быть нагрета до температуры выше точки желатинизации. Затем жидкость превращается в гель. Параллельно с этим жидкость может быть также фотополимеризована. Если участок термочувствительной жидкости не фотополимеризован, при повышенной температуре эта жидкость будет твердой, но может быть снова разжиженной в любое время путем снижения температуры ниже точки желатинизации. Следовательно, термочувствительный желатинизированный компонент может функционировать как опорная структура до конца процесса печати. После завершения печати температуру можно снова понизить ниже вышеупомянутой точки желатинизации 20°C. Как результат, неполимеризованная термочувствительная часть жидкости снова разжижается и может быть откачана. Если гель разжижен, опорная структура удалена, и ранее поддерживаемая часть напечатанного объекта, которая теперь фотополимеризована, свободно свешивается.

На фиг. 3 показан объект 19, напечатанный в реакционном сосуде 4. Напечатанный объект 19 состоит из нескольких наложенных друг на друга полимеризованных структур 20, 21, 22, на иллюстрации на фиг. 3 показанных лишь схематически. Нижняя полимеризованная структура сформирована на платформе 23, служащей в качестве пластины-носителя. Платформа 23 соединена с расположенной по центру подставкой 24 на дне реакционного сосуда 4. Подставка 24 обеспечивает расстояние А между платформой 23 и дном реакционного сосуда 4.

Вместе платформа 23 и подставка 24 образуют носитель 25, который может еще именоваться структурой-носителем. В платформе 23 выполнены отверстия 26, через которые жидкости могут стекать на дно реакционного сосуда 4. Затем жидкости можно отсасывать особенно простым способом через систему 10 линий (в этом отношении см. также фиг. 1 и 2). Кроме того, таким образом свежие жидкости можно просто подавать по системе 10 линий в реакционный сосуд и хорошо распределять, поскольку дно полимеризованной структуры 20 затем не препятствует распределению жидкости.

Группа изобретений относится к области биотехнологии для получения трехмерного многоклеточного объекта посредством биопечати, в частности к способу получения трехмерного многоклеточного объекта, в котором полимеризованные структуры получают слоями путем облучения световыми лучами, и к устройству для осуществления такого способа, и к применению этого устройства для получения искусственного органа. Устройство для получения трехмерного многоклеточного объекта из жидкостей с возможностью фотополимеризации содержит реакционный сосуд (4), источник (1, 2) света. Последний выполнен и расположен с возможностью при работе устройства излучения предварительно определенной картины света на определенные зоны в фокальной плоскости в реакционный сосуд (4). Резервуар (7) с несколькими камерами для хранения разных жидкостей с возможностью фотополимеризации, насос (9), выполненный с возможностью приведения в сообщение по текучей среде с одной из камер (6) резервуара (7) с несколькими камерами и реакционным сосудом (4) для введения одной из разных жидкостей с возможностью фотополимеризации в реакционный сосуд (4) и выпуска их из реакционного сосуда, электродвигатель (14), выполненный с возможностью опускания реакционного сосуда (4), и блок (13) управления для управления картиной, создаваемой источником (1, 2) света, насосом (9) и электродвигателем (14). Блок (13) управления выполнен с возможностью управления источником (1, 2) света на первом этапе полимеризации для излучения света на указанные определенные зоны в фокальной плоскости для полимеризации первой жидкости с возможностью фотополимеризации, с возможностью управления насосом для выпуска неполимеризованной жидкости с возможностью фотополимеризации из реакционного сосуда (4) и введения в реакционный сосуд (4) второй жидкости с возможностью фотополимеризации, и с возможностью управления источником (1, 2) света на втором этапе полимеризации для излучения света в той же фокальной плоскости на зоны, которые ранее не подвергались воздействию света на первом этапе полимеризации, для полимеризации второй жидкости с возможностью фотополимеризации. Способ получения трехмерного многоклеточного объекта с использованием устройства для получения трехмерного многоклеточного объекта включает: введение первой жидкости с возможностью фотополимеризации из резервуара (7) в реакционный сосуд (4); фокусирование первого светового луча из источника (1, 2) света на определенные зоны в фокальной плоскости, лежащей в зоне реакционного сосуда (4), наполненного первой жидкостью; получение первой полимеризованной структуры в первом слое в реакционном сосуде (4) посредством первого светового луча в указанных определенных зонах; выпуск неполимеризованной первой жидкости с возможностью фотополимеризации из реакционного сосуда (4). После чего вводят дополнительную жидкость с возможностью фотополимеризации из резервуара (7) в реакционный сосуд (4), так что участки внутри фокальной плоскости, которые ранее не подвергались воздействию света, покрыты дополнительной жидкостью с возможностью фотополимеризации. Осуществляют фокусирование дополнительного светового луча из источника (1, 2) света на указанную фокальную плоскость, лежащую в зоне реакционного сосуда (4), наполненного дополнительной жидкостью с получением дополнительной полимеризованной структуры в том же слое в реакционном сосуде (4) посредством дополнительного светового луча. Указанная дополнительная полимеризованная структура и первая полимеризованная структура образуют гетерогенный слой. Осуществляют опускание реакционного сосуда (4) на расстояние, соответствующее толщине полимеризованной структуры одного слоя для изменения фокальной плоскости внутри реакционного сосуда (4). Затем повторяют вышеперечисленные приемы каждый раз с той же самой или другой жидкостью с возможностью фотополимеризации до получения трехмерного многоклеточного объекта. При этом первая жидкость с возможностью фотополимеризации и/или по меньшей мере одна из дополнительных жидкостей с возможностью фотополимеризации содержат (содержит) биологические клетки. В одном и том же слое получают более одной полимеризованной структуры. Группа изобретений обеспечивает повышение точности и эффективности процесса структуирования трехмерного биологического объекта по возможности простыми материалами и удобства при получении многоклеточных структур (трехмерных объектов), а также обеспеченние возможности воспроизводимости разных копий одного и того же трехмерного много клеточного объекта при одновременном обеспечении одинакового качества получаемых объектов. 4 н. и 10 з.п. ф-лы, 3 ил.

1. Устройство для получения трехмерного многоклеточного объекта из жидкостей с возможностью фотополимеризации, содержащее реакционный сосуд (4), источник (1, 2) света, выполненный и расположенный с возможностью при работе устройства излучения предварительно определенной картины света на определенные зоны в фокальной плоскости в реакционный сосуд (4), резервуар (7) с несколькими камерами для хранения разных жидкостей с возможностью фотополимеризации, насос (9), выполненный с возможностью приведения в сообщение по текучей среде с одной из камер (6) резервуара (7) с несколькими камерами и реакционным сосудом (4) для введения одной из разных жидкостей с возможностью фотополимеризации в реакционный сосуд (4) и выпуска их из реакционного сосуда, электродвигатель (14), выполненный с возможностью опускания реакционного сосуда (4), и блок (13) управления для управления картиной, создаваемой источником (1, 2) света, насосом (9) и электродвигателем (14), отличающееся тем, что блок (13) управления выполнен с возможностью управления источником (1, 2) света на первом этапе полимеризации для излучения света на указанные определенные зоны в фокальной плоскости для полимеризации первой жидкости с возможностью фотополимеризации, с возможностью управления насосом для выпуска неполимеризованной жидкости с возможностью фотополимеризации из реакционного сосуда (4) и введения в реакционный сосуд (4) второй жидкости с возможностью фотополимеризации, и с возможностью управления источником (1, 2) света на втором этапе полимеризации для излучения света в той же фокальной плоскости на зоны, которые ранее не подвергались воздействию света на первом этапе полимеризации, для полимеризации второй жидкости с возможностью фотополимеризации.

2. Устройство по п.1, отличающееся тем, что источник (1, 2) света предусмотрен и конструктивно выполнен с возможностью излучения света разных длин волн, причем длина волны света, который должен излучаться, может быть задана предварительно.

3. Устройство по п.1, отличающееся тем, что в реакционном сосуде (4) расположена пластина-носитель (15), с возможностью контакта с первой полимеризованной структурой.

4. Способ получения трехмерного многоклеточного объекта с использованием устройства по любому из п. п.1-3, включающий следующие этапы:

a) введение первой жидкости с возможностью фотополимеризации из резервуара (7) с помощью насоса (9) в реакционный сосуд (4),

b) фокусирование первого светового луча из источника (1, 2) света на определенные зоны в фокальной плоскости, лежащей в зоне реакционного сосуда (4), наполненного первой жидкостью,

c) получение первой полимеризованной структуры в первом слое в реакционном сосуде (4) посредством первого светового луча в указанных определенных зонах,

d) выпуск неполимеризованной первой жидкости с возможностью фотополимеризации из реакционного сосуда (4),

e) введение дополнительной жидкости с возможностью фотополимеризации из резервуара (7) с помощью насоса (9) в реакционный сосуд (4), так что участки внутри фокальной плоскости, которые ранее не подвергались воздействию света, покрыты дополнительной жидкостью с возможностью фотополимеризации,

f) фокусирование дополнительного светового луча из источника (1, 2) света на указанную фокальную плоскость, лежащую в зоне реакционного сосуда (4), наполненного дополнительной жидкостью,

g) получение дополнительной полимеризованной структуры в том же слое в реакционном сосуде (4) посредством дополнительного светового луча, причем указанная дополнительная полимеризованная структура и первая полимеризованная структура образуют гетерогенный слой,

h) опускание реакционного сосуда (4) на расстояние, соответствующее толщине полимеризованной структуры одного слоя для изменения фокальной плоскости внутри реакционного сосуда (4), и

i) повторение этапов d)-h) каждый раз с той же самой или другой жидкостью с возможностью фотополимеризации до получения трехмерного многоклеточного объекта, при этом первая жидкость с возможностью фотополимеризации и/или по меньшей мере одна из дополнительных жидкостей с возможностью фотополимеризации содержат (содержит) биологические клетки,

отличающийся тем, что в одном и том же слое получают более одной полимеризованной структуры.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что первая жидкость с возможностью фотополимеризации и по меньшей мере одна из дополнительных жидкостей с возможностью фотополимеризации представляют собой разные жидкости.

6. Способ по п.4 или 5, отличающийся тем, что дополнительную жидкость с возможностью фотополимеризации не вводят в реакционный сосуд (4), пока из реакционного сосуда (4) не удалят жидкость с возможностью фотополимеризации, ранее присутствовавшую в реакционном сосуде (4).

7. Способ по одному из пп.4-6, отличающийся тем, что опускание реакционного сосуда (4) обеспечивает относительное перемещение между реакционным сосудом (4) или пластиной-носителем (15), расположенной в реакционном сосуде (4), с одной стороны, и источником (1, 2) света для получения первого и/или дополнительного светового луча, с другой стороны.

8. Способ по одному из пп.4-7, отличающийся тем, что первый и/или дополнительный световой луч направляют на определенную и предварительно задаваемую зону в соответствующей фокальной плоскости в первой жидкости с возможностью фотополимеризации и/или дополнительной жидкости с возможностью фотополимеризации.

9. Способ по одному из пп.4-8, отличающийся тем, что по меньшей мере первую полимеризованную структуру в первом слое облучают с двух направлений первым световым лучом.

10. Способ по одному из пп.4-9, отличающийся тем, что первый световой луч и/или дополнительный световой луч имеет длину волны в диапазоне 200-1000 нм.

11. Способ по одному из пп.4-10, отличающийся тем, что первый световой луч и/или дополнительный световой луч имеет длину волны в диапазоне 380-780 нм.

12. Способ по одному из пп.4-11, отличающийся тем, что при получении трехмерного многоклеточного объекта в трехмерный многоклеточный объект вводят по меньшей мере один элемент, который выбирают из группы, состоящей из мембран, каналов, пор, датчиков, электропроводных носителей и хемотактических препаратов.

13. Устройство для получения трехмерного многоклеточного объекта из жидкостей с возможностью фотополимеризации, содержащее реакционный сосуд (4), источник (1, 2) света, выполненный и расположенный с возможностью при работе устройства излучения предварительно определенной картины света на определенные зоны в фокальной плоскости в реакционный сосуд (4), резервуар (7) с несколькими камерами для хранения разных жидкостей с возможностью фотополимеризации, насос (9), выполненный с возможностью приведения в сообщение по текучей среде с одной из камер (6) резервуара (7) с несколькими камерами и реакционным сосудом (4) для введения одной из разных жидкостей с возможностью фотополимеризации в реакционный сосуд (4) и выпуска их из реакционного сосуда, оптическую систему (5), расположенную между источником (2) света и реакционным сосудом (4) для фокусирования светового луча на соответствующей фокальной плоскости в реакционном сосуде (4) и для изменения фокальной плоскости внутри реакционного сосуда (4), и блок (13) управления для управления картиной, создаваемой источником (1, 2) света, насосом (9) и оптической системой (5), отличающееся тем, что блок (13) управления выполнен с возможностью управления источником (1, 2) света на первом этапе полимеризации для излучения света на указанные определенные зоны в фокальной плоскости для полимеризации первой жидкости с возможностью фотополимеризации, с возможностью управления насосом для выпуска неполимеризованной жидкости с возможностью фотополимеризации из реакционного сосуда (4) и введения в реакционный сосуд (4) второй жидкости с возможностью фотополимеризации, и с возможностью управления источником (1, 2) света на втором этапе полимеризации для излучения света в той же фокальной плоскости на зоны, которые ранее не подвергались воздействию света на первом этапе полимеризации, для полимеризации второй жидкости с возможностью фотополимеризации.

14. Способ получения трехмерного многоклеточного объекта с использованием устройства по п.13, включающий следующие этапы:

a) введение первой жидкости с возможностью фотополимеризации из резервуара (7) с помощью насоса (9) в реакционный сосуд (4),

b) фокусирование первого светового луча из источника (1, 2) света на определенные зоны в фокальной плоскости, лежащей в зоне реакционного сосуда (4), наполненного первой жидкостью,

c) получение первой полимеризованной структуры в первом слое в реакционном сосуде (4) посредством первого светового луча в указанных определенных зонах,

d) выпуска неполимеризованной первой жидкости с возможностью фотополимеризации из реакционного сосуда (4),

e) введение дополнительной жидкости с возможностью фотополимеризации из резервуара (7) с помощью насоса (9) в реакционный сосуд (4), так что участки внутри фокальной плоскости, которые ранее не подвергались воздействию света, покрыты дополнительной жидкостью с возможностью фотополимеризации,

f) фокусирование дополнительного светового луча из источника (1, 2) света на указанную фокальную плоскость, лежащую в зоне реакционного сосуда (4), наполненного дополнительной жидкостью,

g) получение дополнительной полимеризованной структуры в том же слое в реакционном сосуде (4) посредством дополнительного светового луча, причем указанная дополнительная полимеризованная структура и первая полимеризованная структура образуют гетерогенный слой,

h) выполнение перефокусировки в оптической системе (5) для изменения фокальной плоскости внутри реакционного сосуда (4), и

i) повторение этапов d)-h) каждый раз с той же самой или другой жидкостью с возможностью фотополимеризации до получения трехмерного многоклеточного объекта, при этом первая жидкость с возможностью фотополимеризации и/или по меньшей мере одна из дополнительных жидкостей с возможностью фотополимеризации содержат (содержит) биологические клетки,

отличающийся тем, что в одном и том же слое получают более одной полимеризованной структуры.