Способ создания предполимеризационной морфогенетической матрицы Российский патент 2023 года по МПК A61F2/28 C12N5/02 

В настоящее время в науке волюметрическими способами фотополимеризуют объемы из светопроницаемых фотоотверждаемых полимерных смол, используемых в таких аддитивных печатных технологиях, как проекционная стереолитография (лазерная стереолитография, stereolithography, SLA), цифровая оптическая обработка (или цифровая обработка света, или цифровая светодиодная проекция, Direct или Digital Light Processing, DLP), или прямая УФ засветка (или LCD Masking, или Direct UV Printing, DUP).

Преимущество использования волюметрических способов по сравнению с аддитивными заключается в кардинальном увеличении скорости получения конечных продуктов.

Известен аддитивный метод изготовления трехмерной структуры из нескольких материалов (Xia, Y., Whitesides, G. M., Soft Lithography. Angewandte Chemie International Edition 1998, 37, 550; Tumbleston, J. R., Shirvanyants, D., Ermoshkin, N., Janusziewicz, R., Johnson, A. R., Kelly, D., Chen, K., Pinschmidt, R., Rolland, J. P., Ermoshkin, A., Additive manufacturing. Continuous liquid interface production of 3D objects. Science 2015, 2397; Rus, D., Tolley, M. T., Design, fabrication and control of soft robots. Nature 2015, 521, 467; Esch, E. W, Bahinski, A., Huh, D., Organs-on-chips at the frontiers of drug discovery. Nature reviews Drug discovery 2015, 14, 248). Структуры по аналогии с многоэтапной планарной оптической литографией изготавливаются послойно - путем нанесения первого мономатериального компонента мультиматериального мозаичного слоя фотополимера, последующей его фотополимеризации в избранных локализациях, затем отмывки неполимеризовавшегося материала, затем нанесения следующего мультиматериального компонента слоя, следующая фотополимеризация, отмывание, и так пока не будет окончательно фотополимеризован весь слой. Затем начинается создание следующего слоя тем же способом и т.д.

Недостатком является то, что в результате создается готовый фотополимеризованный продукт в виде трехмерной структуры, которая не прозрачна и не подлежит дальнейшей фотополимеризации.

Известна технология гибридной лазерной печати (hybrid laser printing, HLP) сложных, многомасштабных, мультиматериальных трехмерных структур с микромасштабным разрешением, с использованием одновременно аддитивной и субстрактивной лазерной печати (Kunwar, P., Xiong, Z., Zhu, Y., Li, H., Filip, A., Soman, P., Hybrid Laser Printing of 3D, Multiscale, Multimaterial Hydrogel Structures. Advanced optical materials, 2019. 7(21): p. 1900656), позволяющая как изготавливать структуры на любой глубине размером от сантиметра до микрометра внутри материала, так и удалять опорный (абляционный) материал из рельефа или микроканалов.

Недостатком данной технологии является непригодность для волюметрической фотополимеризации. Помимо того, во время самой фотополимеризации трехмерная структура сохраняет потенциальную возможность схождения лучей в областях, которые для полимеризации не предназначены.

Использование волюметрических методов в биоинженерии пока ограничено только томографической объемно-аддитивной технологией с высоким уровнем разрешения (Loterie, D., P. Delrot, and C. Moser, High-resolution tomographic volumetric additive manufacturing. Nature Communications, 2020. 11(1): p. 852), а любые мультиматериальные трехмерные конструкты создаются исключительно технологиями послойного синтеза. Причем конечные результаты уже полимеризованы. Результат не пригоден для дальнейшей фотополимеризации в силу того, что если объем непрозрачен, полупрозрачен или имеет отделы с различными коэффициентами преломления, то луч слишком ослабляется или отклоняется в сторону.

Технический результат заключается в создании предполимеризационной морфогенетической матрицы аддитивными методами для использования в качестве мультиматериальной заготовки для последующей волюметрической инициации фотополимеризации.

В процессе изготовления трехмерная структура для фотополимеризации из термочувствительных фотополимеров из-за согревания становится изначально непрозрачной, однако при охлаждении перед инициацией фотополимеризации переходит из гелевой в золевую фазу, снова становясь прозрачной, и тем самым пригодной для волюметрической инициации фотополимеризации.

В данном случае под мультиматериальностью понимается нахождение разных материалов в разных локализациях полимеризационно-способного объекта.

Технический результат достигается за счет того, что трехмерная печать непрозрачного или полупрозрачного полимеризационно-способного объекта производится при температуре выше нижней критической температуры раствора. Сформированный непрозрачный объем ограждается боковыми стенками для предотвращения вытекания при охлаждении. После охлаждения ниже нижней критической температуры раствора объект переходит из гелевой фазы обратно в золь, не меняя взаиморасположения и локализации бывших застывших капель, если его не подвергать латеральным ускорениям и вибрациям. В силу вязкости золевого раствора участки разного состава друг с другом не будут успевать смешиваться за необходимое для подготовки инициации фотополимеризации время, а только постепенно взаимно диффундировать сквозь общие границы.

Технический результат достигается за счет того, что берутся биосовместимые фотоотверждаемые термочувствительные гидрогели с регулируемой температурой фазового перехода, при помощи ковалентного включения в свой химический состав солюбилизированных функционально важных гликопротеинов и гликозаминогликанов избранных биологических тканей имитирующих функции нативных органных внеклеточных матриксов. Посредством аддитивной 3D-печати из микрокапель указанных гидрогелей, используемых в качестве биочернил, размещаемых в проекциях будущего месторасположения специфических элементов цитоархитектоники, на нагреваемой подложке области печати создается мозаичный непрозрачный или полупрозрачный мультиматериальный объем. Для предотвращения вытекания при последующем охлаждении сформированный объем ограждают боковыми стенками. Огражденный объем, не допуская латеральных ускорений и вибраций, могущих вызвать смешение на границах различных материалов, охлаждают до температуры ниже нижней критической температуры раствора, в результате чего тот переходит из гелевой фазы обратно в золь, становясь прозрачным в оптическом и частично в ультрафиолетовом диапазоне и пригодным для немедленной фотополимеризации любым волюметрическим способом. Морфогенетическая матрица создается или при помощи разновидности струйного способа трехмерной печати, или при помощи акустофоретического способа трехмерной печати, или при помощи аддитивного способа лазерно-опосредованной биопечати. Материалом для ее создания служат фотополимеризуемые жидкие биоинженерные ткани с регулируемой температурой фазового перехода на основе термочувствительных гидрогелей на основе поли-N-винилкапролактама, или термочувствительных гидрогелей на основе поли-N-изопропилакриламида, или термочувствительных сополимерных гидрогелей на основе поли-N-винилкапролактама и поли-N-изопропилакриламида, или термочувствительных сополимерных гидрогелей на основе полиизоцианопептидов в смеси с короткоцепочечным полиэтиленгликолем.

Все существующие мультиматериальные методы предназначены для создания исключительно готовых мультиматериальных продуктов, предназначенных для непосредственного использования. Данные продукты не являются заготовками для дальнейшей фотополимеризации.

Под морфогенетической матрицей понимается мультиматериальный, прозрачный в оптическом и ультрафиолетовом диапазоне мозаичный гидрогелевый полимеризационно-способный объем.

Способ создания предполимеризационной морфогенетической матрицы подходит для любых волюметрических фотополимеризационных методов. Описание ориентировано как на существующие волюметрические методы, так и на совершенные и универсальные варианты, пока еще даже не существующие, пригодные для медицинского применения.

Особенностью волюметрических методов является объемная фотополимеризация в оптически прозрачном объеме. В случае мультиматериального состава фотополимеризуемый объем должен обладать противоречивыми свойствами, а именно - быть мультиматериальным, и при этом по возможности оптически прозрачным. В фотополизируемом объеме фотополимеризующие лучи не должны отклоняться (от этого зависят минимальные размеры вокселей получающегося конечного продукта), и в то же время фотополимеризуемый объем должен иметь разный состав в разных локализациях (основной объем бывших порций не должен смешиваться).

При трехмерной печати свойства конечных продуктов отличаются от таковых исходных материалов (прозрачность либо теряется, либо даже при её сохранении изменяется коэффициент преломления света на их границах, отклоняя полимеризующие лучи от предназначенного им места). Сходным образом и при печати морфогенетической матрицы конечные капли (порции) при застудневании в тепле - выше нижней критической температуры раствора - становятся опаковыми вплоть до полной непрозрачности.

Термочувствительность в данном случае подразумевает обратимую растворимость при охлаждении, когда субстрат снова становится текучим и прозрачным. В силу достаточно высокой вязкости границы соседних застудневших капель (порций), если не затягивать чрезмерно процедуру, не будут успевать диффундировать настолько, чтобы это негативно сказалось на конечных результатах.

Капли (порции) термочувствительных фотополимеризуемых жидких биоинженерных тканей печатаются в проекциях будущего месторасположения будущих специфических элементов цитоархитектоники, с последующим охлаждением до температуры ниже температуры застудневания и отмывкой массы неполимеризовавшегося материала.

Жидкие и прозрачные в оптическом диапазоне капли (порции) при низких температурах, при температуре выше нижней критической температуры раствора застудневают, становясь непрозрачными.

Мультиматериальный состав морфогенетической матрицы определяется на основе той же математической виртуальной модели, по которой будут фотополимеризовываться объекты волюметрическими методами, в идеале - голографического фантома виртуальной модели гистионарных скаффолдов, представляющей собою совокупность трубчатых многомасштабных аркадных сетей различных ретикулярных стромальных элементов (микротрубок), соединяющих их каркасных балок-тяжей, а также плоскостных стромальных элементов - только с меньшим разрешением, доступным для применяемого аддитивного способа трехмерной печати. При этом каждому типу гистионарного скаффолда назначается свой собственный уникальный материал, который и запечатывается в проекции его расположения на конкретной волюметрической модели имитируемой ткани.

На текущем этапе минимальный размер вокселя, достаточный для отражения любых специфических функционально важных морфологических особенностей существующих в природе гистионов млекопитающих, предполагается в 0,1 мкм. При этом сами гистионы имеют размеры не менее нескольких микрометров по любой из осей, достигая в некоторых случаях тысяч и даже больше микрометров в одном из измерений.

С учетом взаиморасположения гистионов относительно друг друга на расстояниях, начиная от десятков до сотен микрометров, мы полагаем, что для печати гистионарных скаффолдов, из которых и должен состоять шаблон любой биоинженерной ткани, предусматривающий заселение клеточными элементами в дальнейшем - разрешение печати в 20-30 мкм является вполне достаточным для создания предполимеризационной морфогенетической матрицы.

В организме имеется множество разнообразных трубчатых и микротрубчатых структур с соответственно различным составом базальных мембран. Например, кровеносные капилляры отличаются по составу от лимфатических, желчных протоков и тем более нефронов, которые сами имеют разный состав в различных отделах, по сути дела состоя из четырех переходящих друг в друга отличающихся гистионов. Так что фотополимеризуемый объем должен иметь различный полимерный состав в проекциях будущего месторасположения будущих трубчатых/сетчатых и мешотчатых/плоскостных стромальных элементов. Это будет достигаться посредством предварительного создания трёхмерной морфогенетической предполимеризационной матрицы, печатаемой с желательным разрешением 30 или 20 мкм (на современном этапе, например, технология многоструйной печати PolyJet позволяет напылять слои в 16-30 мкм), не обращая внимания на возможный выход границы некоторых печатаемых вокселей за пределы топографических границ элементов гистионарных скаффолдов, так как всё неполимеризовавшееся будет впоследствии вымыто. Все пустоты (в основном места локализации будущей биоинженерной паренхимы) для удешевления можно печатать водными растворами поли-N-винилкапролактама, поли-N-изопропилакриламида, полиизоцианопептидов смеси с короткоцепочечным полиэтиленгликолем, или любым иным термочувствительным гидрогелем, капли (порции) которого оптическими и вязкостными свойствами сходны с соседними каплями (порциями) термочувствительной фотополимеризуемой жидкой биоинженерной ткани.

Под термочувствительным гидрогелем понимается гидрогель с регулируемой температурой фазового перехода.

При создании виртуальной модели гистионарных скаффолдов каждому отдельному гистионарному скаффолду в ней, исходя из соображений, какие конкретно функции он должен выполнять, персонально назначается свой тип термочувствительной фотополимеризуемой жидкой биоинженерной ткани с ковалентно включенными в её химический состав солюбилизированными функционально важными внеклеточными матриксами избранной биологической ткани, отчего та приобретает способность имитировать часть его свойств по воздействию на клеточные элементы. В первую очередь - это либо базальные мембраны конкретных разновидностей эпителия, либо ретикулярная ткань для стромальных соединительнотканных элементов.

В качестве альтернативы могут использоваться любые существующие биоинженерные материалы (например, для имитации состава базальной мембраны микроциркуляторной капиллярной сети весьма перспективен обыкновенный матригель), подходящие для конкретных целей. Ибо рынок таковых предположительно вскорости переживет взрывное развитие.

Для непосредственно создания предполимеризационной морфогенетической матрицы планируется разработать собственный - либо многоструйный, либо акустофоретический - биопринтер соответствующего разрешения, с множеством охлаждаемых головок, а также регулируемой температурой подложки области печати.

Потенциально возможно также применение аддитивного способа лазерно-опосредованной биопечати термочувствительными гидрогелями без клеток, так как разрешение этой методики заявлено производителями (биотехнологическая компания Poietis) в 10 мкм, со скоростью 10000 капель в секунду.

Способ подготовки напечатанной морфогенетической матрицы к инициации полимеризации полимеризационно-способного объекта осуществляется посредством ее создания прямо в оптически прозрачной плоскостной кювете с внутренним объемом, соответствующим объему самой морфогенетической матрицы, с последующим охлаждением до 4°С непосредственно перед инициацией фотополимеризации, при котором таковая переходит в золевую фазу, становясь в десятки раз менее вязкой, и относительно прозрачной в оптическом и части ультрафиолетового диапазона. При этом в процессе охлаждения не следует допускать смещения и вибрации полимеризуемого объема, чтобы ограничить латеральную диффузию полимерных молекул соседних капель (порций).

После окончания фотополимеризации вымывается все лишнее неполимеризованное.

Изобретение относится к области биоинженерии. Способ создания предполимеризационной морфогенетической матрицы включает стадии: берутся биосовместимые фотоотверждаемые термочувствительные гидрогели с регулируемой температурой фазового перехода, ковалентно включают в их химический состав солюбилизированные функционально важные гликопротеины и гликозаминогликаны избранных биологических тканей, имитирующие функции нативных органных внеклеточных матриксов, посредством аддитивной 3D-печати на нагреваемой подложке размещают микрокапли гидрогелей, используемые в качестве биочернил, в проекциях будущего месторасположения специфических элементов цитоархитектоники, создавая мозаичный мультиматериальный непрозрачный или полупрозрачный объем по заданной цифровой трехмерной модели, сформированный объем ограждают боковыми стенками, охлаждают до температуры ниже нижней критической температуры раствора. Изобретение обеспечивает создание предполимеризационной морфогенетической матрицы аддитивными методами для использования в качестве мультиматериальной заготовки для последующей волюметрической инициации фотополимеризации. 7 з.п. ф-лы, 1 пр.

1. Способ создания предполимеризационной морфогенетической матрицы включает в себя следующие стадии: берутся биосовместимые фотоотверждаемые термочувствительные гидрогели с регулируемой температурой фазового перехода, далее ковалентно включают в их химический состав солюбилизированные функционально важные гликопротеины и гликозаминогликаны избранных биологических тканей, имитирующие функции нативных органных внеклеточных матриксов, далее посредством аддитивной 3D-печати на нагреваемой подложке размещают микрокапли гидрогелей, используемые в качестве биочернил, в проекциях будущего месторасположения специфических элементов цитоархитектоники, тем самым послойно создавая мозаичный мультиматериальный непрозрачный или полупрозрачный объем по заданной цифровой трехмерной модели, для предотвращения вытекания при последующем охлаждении сформированный объем ограждают боковыми стенками, огражденный объем, не допуская латеральных ускорений и вибраций, способных вызвать смешение на границах различных материалов, охлаждают до температуры ниже нижней критической температуры раствора, в результате чего огражденный объем переходит из гелевой фазы обратно в золь, становится прозрачным в оптическом и частично в ультрафиолетовом диапазонах и пригодным для немедленной фотополимеризации любым волюметрическим способом.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что морфогенетическая матрица создается при помощи разновидности струйного способа трехмерной печати.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что морфогенетическая матрица создается при помощи акустофоретического способа трехмерной печати.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что морфогенетическая матрица создается при помощи аддитивного способа лазерно-опосредованной биопечати.

5. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что морфогенетическая матрица создается из фотополимеризуемых жидких биоинженерных тканей с регулируемой температурой фазового перехода на основе термочувствительных гидрогелей на основе поли-N-винилкапролактама.

6. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что морфогенетическая матрица создается из фотополимеризуемых жидких биоинженерных тканей с регулируемой температурой фазового перехода на основе термочувствительных гидрогелей на основе поли-N-изопропилакриламида.

7. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что морфогенетическая матрица создается из фотополимеризуемых жидких биоинженерных тканей с регулируемой температурой фазового перехода на основе термочувствительных сополимерных гидрогелей на основе поли-N-винилкапролактама и поли-N-изопропилакриламида.

8. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что морфогенетическая матрица создается из фотополимеризуемых жидких биоинженерных тканей с регулируемой температурой фазового перехода на основе термочувствительных сополимерных гидрогелей на основе полиизоцианопептидов в смеси с короткоцепочечным полиэтиленгликолем.