АНТИТЕЛА, ПОДХОДЯЩИЕ ДЛЯ ПАССИВНОЙ ИММУНИЗАЦИИ ПРОТИВ ГРИППА, И ИХ КОМПОЗИЦИИ, КОМБИНАЦИИ И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2020 года по МПК C07K16/10 

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Настоящая заявка подана 4 февраля 2015 года в виде международной заявки РСТ и испрашивает приоритет на основании предварительной заявки США №61/935746, поданной 4 февраля 2014 года, и предварительной заявки США №62/051630, поданной 17 сентября 2014 года, полное содержание каждой из которых включено в настоящее описание посредством ссылки.

ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, ПОДАННЫЙ ЧЕРЕЗ EFS-WEB

[0002] Полное содержание следующего перечня последовательностей, поданного в электронном виде через сервер USPTO-EFS-WEB, разрешенный и указанный в МРЕР 1730 II.В.2(а)(С), включено в настоящее описание посредством ссылки для всех целей. Указанный перечень последовательностей идентифицируется в поданном в электронном виде текстовом файле следующим образом:

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0003] Предложены антитела, композиции и способы для лечения и профилактики вируса гриппа. Предложены антитела и антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются рядом с консенсусной последовательностью сайта расщепления для созревания гемагглютинина НА₀ вируса гриппа А. Также предложены композиции, комбинации антител и способы для эффективной пассивной иммунизации против всех штаммов гриппа А и В.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0004] Грипп является основной причиной смертности и заболеваемости и поражает верхние и нижние дыхательные пути. Существуют три типа вирусов гриппа, грипп А, В и С. Вирусы гриппа А и В человека вызывают сезонные эпидемии заболевания. Инфекции, вызываемые гриппом типа С, служат причиной легкого заболевания дыхательных путей и, как полагают, не вызывают эпидемии. Вирусы гриппа А классифицируют на подтипы на основе двух белков на поверхности вируса: гемагглютинина (Н) и нейраминидазы (N). Существуют 17 различных подтипов гемагглютинина и 10 различных подтипов нейраминидазы. Вирусы гриппа А можно дополнительно подразделить на различные штаммы. Существующие на данный момент подтипы вирусов гриппа А, которые обычно встречаются у людей, представляют собой вирусы гриппа A (H1N1) и гриппа A (H3N2). Вирусы гриппа В не разделяют на подтипы, а классифицируют на две различные линии: подобные В/Виктория/2/87 (B/Victoria/2/87) и подобные В/Ямагата/16/88 (B/Yamagata/16/88). Вирусы гриппа А (например, H1N1), А (например, H3N2) и гриппа В включены в вакцину против гриппа для ежегодной вакцинации.

[0005] В настоящее время пять видов клинически значимых вирусов гриппа циркулируют среди населения с различной частотой: три вида гриппа А, а также два вида гриппа В. Вирус гриппа типа А делится на две отдельные филогенетические группы 1 и 2. Группа 1 включает подтипы гемагглютинина H1, Н2, Н5, Н6, Н8, Н9, Н11, Н13 и Н16. Группа 2 включает Н3, Н4, Н7, Н10, Н15 и Н14. Значимые в настоящее время циркулирующие вирусы гриппа А группы 1 относятся к подтипу H1, который дополнительно подразделяется на происходящий от человека и свиньи, и значимые циркулирующие вирусы группы 2 в настоящее время относятся к подтипу Н3. Вирусы гриппа А ответственны за большую часть сезонных заболеваний с преобладанием вирусов Н3 на протяжении восьми из последних двенадцати сезонов гриппа в Соединенных Штатах (Сезонный грипп по данным центра контроля и профилактики заболеваний (CDC); данные наблюдений США). В 1968 году вирус Н3 стал причиной одной из трех главных пандемий гриппа двадцатого века, и с тех пор вирусы Н3 остаются значимым возбудителем заболевания у людей. В дополнение к людям, вирусы гриппа Н3 обычно инфицируют птиц, свиней и лошадей. Вирусы гриппа В циркулируют у людей на протяжении более 100 лет, при этом существующие в настоящее время штаммы подразделяются на две линии, линию Ямагата (Yamagata) и линию Виктория (Victoria). Трехвалентная вакцина против гриппа недавно была расширена до четырехвалентной антигенсодержащей вакцины, охватывающей обе линии гриппа В, а также вирус H1 и вирус Н3.

[0006] Современные способы предотвращения и лечения гриппа не являются достаточными и могут быть неэффективны. Несмотря на широко распространенную вакцинацию, восприимчивость к гриппу сохраняется. Факторы, которые вносят вклад в восприимчивость, включают (1) неполный охват вакцинацией, как в случае пандемии H1N1 2009 года, когда был широко распространен дефицит вакцины, (2) в такие годы, как 2008, состав вакцины слабо соответствовал циркулирующим штаммам, (3) снижение эффективности вакцинации у пожилых людей, поскольку средняя эффективность находится в диапазоне 40-50% в возрасте 65 лет и лишь 15-30% после 70 лет, и (4) появление пандемических штаммов, не представленных в сезонных вакцинах, при этом особую озабоченность вызывает H5N1. Кроме того, устойчивость к противовирусным лекарственным средствам, доступным в настоящее время для лечения гриппа, стала серьезной проблемой. Устойчивость к адамантанам (амантидин и римантадин), лекарственным средствам, действующим на белок М2 и ингибирующим слияние вируса, возросла с 1,9% в 2004 году до 14,5% в течение первых 6 месяцев сезона гриппа 2004-2005 годов, и в настоящее время превысила 90% (Sheu, Т.G. et al (2011) J Infect Dis 203:13-17). Устойчивость к осельтамивира фосфату (Тамифлю^®), противовирусному лекарственному средству, ингибирующему белок, представляющий собой нейраминидазу гриппа, резко возросла с 1-2% для вирусов H1N1 в течение сезона гриппа 2006-2007 годов до 12% к 2007-2008 годам, и превысила 99% для сезонных вирусов H1N1 в 2009 году. К счастью, пандемический штамм H1N1 2009 года был чувствителен к Тамифлю, что, вероятно, привело к меньшему числу смертей. Таким образом, существует огромная потребность в разработке новых подходов к профилактике/терапии гриппа.

[0007] К сожалению, диагностика для определения штамма гриппа, как правило, требует 12-24-часового интервала времени между постановкой диагноза и началом лечения, что приводит к неблагоприятной задержке начала лечения, в случае, если определение штамма необходимо для выбора подходящей терапии. Таким образом, сохраняется потребность в разработке антител, которые связывают многочисленные клады (clade) и демонстрируют повышенную аффинность к ним. В частности, желательной является пассивная вакцина, которая содержит антитела, эффективные против как гриппа A, так и гриппа B, и демонстрирует иммунореактивность широкого спектра в отношении множества штаммов, для того, чтобы избежать необходимости подробно характеризовать вызвавший инфекцию вирус перед введением антитела или смеси антител. Антитела с широким спектром реактивности и композиции, эффективные против всех штаммов гриппа как A, так и B, являются желательными, в частности потому, что предварительная диагностика для определения штамма не является необходимой перед лечением. Также желательной является высокая активность для облегчения как получения, так и введения указанных агентов.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0008] В некоторых вариантах реализации предложены рекомбинантные антитела человека или их антигенсвязывающие фрагменты, реактивные в отношении обеих основных линий гриппа B - клад Ямагата и Виктория.

[0009] В некоторых вариантах реализации предложены моноклональные антитела, которые связывают тримеры, характерные для гриппа В, с высокой аффинностью.

[0010] В некоторых вариантах реализации предложены антитела, способные обеспечивать пассивный иммунитет в случае инфекции, вызываемой, например, ранее неидентифицированным штаммом гриппа В или штаммом, защиту от которого не обеспечивают сезонные вакцины, не содержащие действующий штамм, циркулирующий примерно один раз в 2-3 года: Monto, A.A., et al., Vaccine (2009) 27:5043-5053.

[0011] В некоторых вариантах реализации предложены антитела, которые связывают множество штаммов, что указывает на прицельное воздействие на важнейший сайт, и поэтому они, вероятно, связывают даже ранее не встречающиеся штаммы. Такие антитела также подходят для ослабления или предотвращения инфекции, или снижения ее вирулентности у субъектов, у которых вакцинация не обеспечила выработку полного защитного ответа или которые подвержены высокому риску из-за базовой нарушенной функции бронхов как в случае пациентов с хронической обструктивной болезнью легких, или слабой иммунной системы (например, очень молодые, пожилые пациенты, пациенты, которым проведена трансплантация, и страдающие раком или ВИЧ пациенты, которых лечат путем химиотерапии).

[0012] В некоторых вариантах реализации предложены композиции, содержащие смеси моноклональных антител (mAb), которые обеспечивают пассивную иммунизацию широкого спектра.

[0013] В некоторых вариантах реализации предложены композиции, содержащие (1) один или более связывающих агентов, моноклональных антител или их иммунореактивных фрагментов, реактивных в отношении обеих главных линий гриппа В, и (2) один или более связывающих агентов, моноклональных антител или их иммунореактивных фрагментов, реактивных в отношении вируса гриппа А группы 1, включая H1, Н2, Н5, Н6, Н8, Н9, Н11, Н13, Н16, и/или группы 2, включая Н3 и Н7 в качестве голотипов, в том числе те, которые демонстрируют перекрестную реактивность среди групп. В некоторых вариантах реализации антитела, предложенные согласно настоящему изобретению, специфично связываются с эпитопом, содержащимся в белке НА₀, и распознают нативную тримерную форму НА, а также протеолитически активированную форму.

[0014] В другом варианте реализации предложены связывающие агенты, выбранные из биспецифических и полиспецифических антител, и их фрагментов, которые могут расширить диапазон типов и клад вирусов, которые могут быть специфично связаны, а также композиции, содержащие два или более связывающих агентов, реагирующих со множеством штаммов, характерных как для гриппа А, так и для гриппа В.

[0015] В некоторых вариантах реализации предложено выделенное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, демонстрирующий аффинность связывания (KD) 10 нМ или сильнее, или 3 нМ или сильнее к одному или более штаммам каждой из клад линии Ямагата гриппа В и линии Виктория гриппа В. В некоторых вариантах реализации указанное антитело или фрагмент представляет собой рекомбинантное антитело или его фрагмент.

[0016] В некоторых вариантах реализации антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляет собой сконструированные моноспецифические антитела или полиспецифические моноклональные антитела человека.

[0017] В некоторых вариантах реализации предложено антитело или антигенсвязывающий фрагмент, который нейтрализует инфекцию в клетке, вызванную одним или более штаммами клад линии Ямагата гриппа В и линии Виктория гриппа В.

[0018] В некоторых вариантах реализации предложено выделенное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий аминокислотные последовательности (а) определяющей комплементарность области 1 тяжелой цепи (HCDR1), (b) определяющей комплементарность области 2 тяжелой цепи (HCDR2); и (с) определяющей комплементарность области 3 тяжелой цепи (HCDR3), HCDR1/HCDR2/HCDR3, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 31/32/33; 41/42/43; 51/52/53; 61/62/63; 71/72/73; 81/82/83; 91/92/93; 101/102/103; 111/112/113; 121/122/123; 131/132/133; 141/142/143; 151/152/153; 161/162/163; 171/172/173; 181/182/183; 191/192/193; 201/202/203; 211/212/213; 221/222/223; 231/232/233; 241/242/243; 251/252/253; 261/262/263; 271/272/273 и 281/282/283, или их высокогомологичные варианты, содержащие от 1 до 3 замен аминокислот в одной или более последовательностях CDR-домена, при этом указанные варианты и указанное антитело или фрагмент обладают свойством связывания и/или ингибирования вируса гриппа.

[0019] В некоторых вариантах реализации предложено выделенное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий (а) определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1), (b) определяющую комплементарность область 2 легкой цепи (LCDR2); и (с) определяющую комплементарность область 3 легкой цепи (LCDR3), LCDR1/LCDR2/LCDR3, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 34/35/36; 44/45/46; 54/55/56; 64/65/66; 74/75/76; 84/85/86; 104/105/106; 114/115/16; 124/125/126; 134/135/136; 144/145/146; 154/155/156; 164/165/166; 174/175/176; 184/185/186; 194/195/196; 204/205/206; 214/215/216; 224/225/226; 234/235/236; 244/245/246; 254/255/256; 264/265/266; 274/275/276; и 284/285/286, или их высокогомологичные варианты, содержащие от 1 до 3 замен аминокислот в одной или более последовательностях CDR-домена, при этом указанные варианты и указанное антитело или фрагмент обладают свойством связывания и/или ингибирования вируса гриппа.

[0020] В некоторых вариантах реализации предложено выделенное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий последовательности CDR тяжелой и легкой цепи, HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 31/32/33/34/35/36; 41/42/43/44/45/46; 51/52/53/54/55/56; 61/62/63/64/65/66; 71/72/73/74/75/76; 81/82/83/84/85/86; 91/92/93/94/95/96; 101/102/103/104/105/106; 111/112/113/114/115/116; 121/122/123/124/125/126; 131/132/133/134/135/136; 141/142/143/144/145/146; 151/152/153/154/155/156; 161/162/163/164/165/166; 171/172/173/174/175/176; 181/182/183/184/185/186; 191/192/193/194/195/196; 201/202/203/204/205/206; 211/212/213/214/215/216; 221/222/223/224/225/226; 231/232/233/234/235/236; 241/242/243/244/245/246; 251/252/253/254/255/256; 261/262/263/264/265/266; 271/272/273/274/275/276; и 281/282/283/284/285/286, или их высокогомологичный вариант, содержащий от 1 до 3 замен аминокислот в одной или более последовательностях CDR-домена; при этом указанный вариант и указанное антитело или фрагмент обладают свойством связывания и/или ингибирования вируса гриппа.

[0021] В некоторых вариантах реализации предложено выделенное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфично связывается с одним или более штаммами каждой из клад как линии Ямагата гриппа В, так и линии Виктория гриппа В, и содержит вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 119, 129, 139, 149, 159, 169, 179, 189, 199, 209, 219, 229, 239, 249, 259, 269, 279 и 289, или их гомологичный вариант, обладающий по меньшей мере 80% идентичностью последовательности указанной HCVR; при этом указанный вариант и указанное антитело или фрагмент обладают свойством связывания и/или ингибирования вируса гриппа.

[0022] В некоторых вариантах реализации предложено выделенное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий вариабельную последовательность легкой цепи (LCVR), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280 и 290, или их гомологичный вариант, обладающий по меньшей мере 80% идентичностью последовательности указанной LCVR; при этом указанный вариант и указанное антитело или фрагмент обладают свойством связывания и/или ингибирования вируса гриппа.

[0023] В некоторых вариантах реализации предложено выделенное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий пару последовательностей HCVR/LCVR, выбранную из группы, состоящей из 39/40, 49/50, 59/60, 69/70, 79/80, 89/90, 99/100, 109/110, 119/120, 129/130, 139/140, 149/150, 159/160, 169/170, 179/180, 189/190, 199/200, 209/210, 219/220, 229/230, 239/240, 249/250, 259/260, 269/270, 279/280 и 289/290, или их гомологичные варианты, обладающие по меньшей мере 80% идентичностью последовательности указанной HCVR и/или LCVR; при этом указанный вариант и указанное антитело обладают свойством связывания и/или ингибирования вируса гриппа.

[0024] В некоторых вариантах реализации предложено выделенное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий пару HCVR/LCVR, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 79/80, 129/130, 219/220, 229/230, 239/240, 249/250 и 269/270, или их гомологичные варианты, обладающие по меньшей мере 80% идентичностью последовательности указанной HCVR и/или LCVR; при этом указанный вариант и указанное антитело обладают свойством связывания и/или ингибирования вируса гриппа.

[0025] В некоторых вариантах реализации предложено выделенное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с одним или более эпитопами, выбранными из группы, состоящей из SEQ ID NO: 307, 308, 309, 310, 311, 312 и 313, или эпитопом прерывистого типа.

[0026] В некоторых вариантах реализации предложено выделенное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, который конкурирует за связывание с одним или более штаммами каждой из клад как линии Ямагата гриппа В, так и Виктория гриппа В, что и антитело или фрагмент согласно настоящему изобретению путем вытеснения по меньшей мере 50% последнего, когда присутствует в менее, чем 100-кратном избытке.

[0027] В некоторых вариантах реализации предложена выделенная кодон-оптимизированная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело или фрагмент согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах реализации предложен вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую антитело или фрагмент согласно настоящему изобретению.

[0028] В некоторых вариантах реализации предложена клетка-хозяин для экспрессии рекомбинантного полипептида, содержащая вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую антитело или фрагмент согласно настоящему изобретению.

[0029] В некоторых вариантах реализации предложен способ получения антитела к гриппу В или его антигенсвязывающего фрагмента, включающий выращивание клетки-хозяина в условиях, обеспечивающих выработку указанного антитела или его фрагмента, и выделение указанного антитела или его фрагмента, полученного таким образом.

[0030] В некоторых вариантах реализации предложена фармацевтическая композиция, содержащая антитело или антигенсвязывающий фрагмент, демонстрирующий аффинность связывания (KD) 10 нМ или сильнее, или 3 нМ или сильнее к одному или более штаммам каждой из клад линии Ямагата гриппа В и линии Виктория гриппа В, и фармацевтически приемлемый носитель.

[0031] В некоторых вариантах реализации предложена фармацевтическая композиция, содержащая антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащий аминокислотные последовательности HCDR1/HCDR2/HCDR3, выбранные из SEQ ID NO: 31/32/33; 41/42/43; 51/52/53; 61/62/63; 71/72/73; 81/82/83; 91/92/93; 101/102/103; 111/112/113; 121/122/123; 131/132/133; 141/142/143; 151/152/153; 161/162/163; 171/172/173; 181/182/183; 191/192/193; 201/202/203; 211/212/213; 221/222/223; 231/232/233; 241/242/243; 251/252/253; 261/262/263; 271/272/273 и 281/282/283, или их высокогомологичные варианты, содержащие от 1 до 3 замен аминокислот в одной или более последовательностях CDR-домена, при этом указанные варианты и указанное антитело или фрагмент обладают свойством связывания и/или ингибирования вируса гриппа, и фармацевтически приемлемый носитель, при этом указанное антитело или фрагмент демонстрирует первую температуру плавления (Tm1), измеренную в ФБР, выше или равную 55°С.

[0032] В некоторых вариантах реализации предложена композиция, содержащая одно или более антител человека или их антигенсвязывающих фрагментов со специфичностью связывания в отношении по меньшей мере одного штамма гриппа А. В соответствии с некоторыми аспектами антитело или антигенсвязывающий фрагмент со специфичностью в отношении гриппа А включает специфичность в отношении одного или более штаммов как группы 1, так и группы 2.

[0033] В некоторых вариантах реализации предложена фармацевтическая композиция, содержащая (а) первое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую HCDR1/HCDR2/HCDR3 с SEQ ID NO: 11, 12, 13, и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую LCDR1/LCDR2/LCDR3 с SEQ ID NO: 14, 15, 16, или их высокогомологичные варианты, содержащие от 1 до 3 замен аминокислот в одной или более последовательностях CDR-домена, при этом указанные варианты способны связывать и/или ингибировать вирус гриппа; (b) второе антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую HCDR1/HCDR2/HCDR3 с SEQ ID NO: 21, 22, 23, и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую последовательности CDR-домена LCDR1/LCDR2/LCDR3 с SEQ ID NO: 24, 25, 26, или их высокогомологичные варианты, содержащие от 1 до 3 замен аминокислот в одной или более последовательностях CDR-домена, при этом указанные варианты способны связывать и/или ингибировать вирус гриппа; и (с) третье антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую HCDR1/HCDR2/HCDR3, и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую последовательности CDR-домена легкой цепи, LCDR1/LCDR2/LCDR3, соответственно, выбранные из

(i) SEQ ID NO: 71, 72, 73 и SEQ ID NO: 74, 75, 76;

(ii) SEQ ID NO: 91, 92, 93 и SEQ ID NO: 94, 95, 96;

(iii) SEQ ID NO: 101, 102, 103 и SEQ ID NO: 104, 105, 106;

(iv) SEQ ID NO: 121, 122, 123 и SEQ ID NO: 124, 125, 126;

(v) SEQ ID NO: 181, 182, 183 и SEQ ID NO: 184, 185, 186;

(vi) SEQ ID NO: 191, 192, 193 и SEQ ID NO: 194, 195, 196;

(vii) SEQ ID NO: 201, 202, 203 и SEQ ID NO: 204, 205, 206;

(viii) SEQ ID NO: 211, 212, 213 и SEQ ID NO: 214, 215, 216;

(ix) SEQ ID NO: 221, 222, 223 и SEQ ID NO: 224, 225, 226;

(x) SEQ ID NO: 231, 232, 233 и SEQ ID NO: 234, 235, 236;

(xi) SEQ ID NO: 241, 242, 243 и SEQ ID NO: 244, 245, 246;

(xii) SEQ ID NO: 261; 262, 263 и SEQ ID NO: 264, 265, 266; или

(xiii) SEQ ID NO: 271, 272, 273 и SEQ ID NO: 274, 275, 276,

или их высокогомологичные варианты, содержащие от 1 до 3 замен аминокислот в одной или более последовательностях CDR-домена, при этом указанные варианты и указанное антитело или фрагмент способны связывать и/или ингибировать вирус гриппа.

[0034] В некоторых вариантах реализации указанное первое антитело или фрагмент содержит пару HCVR/LCVR с SEQ ID NO: 19/20, или их высокогомологичные варианты обладают по меньшей мере 80% идентичностью последовательности в одной или обеих последовательностях HCVR- или LCVR-домена; при этом указанный вариант и указанное антитело или фрагмент обладают свойством связывания и/или ингибирования вируса гриппа.

[0035] В некоторых вариантах реализации указанное второе антитело или фрагмент содержит пару HCVR/LCVR с SEQ ID NO: 29/30, или их высокогомологичные варианты обладают по меньшей мере 80% идентичностью последовательности в одной или обеих последовательностях HCVR- или LCVR-домена; при этом указанные варианты и указанное антитело или фрагмент обладают свойством связывания и/или ингибирования вируса гриппа.

[0036] В некоторых вариантах реализации указанное третье антитело или фрагмент содержит пару HCVR/LCVR, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 79/80, 99/100, 109/110, 129/130, 189/190, 199/200, 209/210, 219/220, 229/230, 239/240, 249/250, 269/270 и 279/280, или их высокогомологичные варианты обладают по меньшей мере 80% идентичностью последовательности в одной или обеих последовательностях HCVR- или LCVR-домена; при этом указанные варианты и указанное антитело или фрагмент обладают свойством связывания и/или ингибирования вируса гриппа.

[0037] В некоторых вариантах реализации указанное третье антитело или фрагмент содержит пару HCVR/LCVR, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 79/80, 129/130, 219/220, 229/230, 239/240, 249/250 и 269/270, или их высокогомологичные варианты обладают по меньшей мере 80% идентичностью последовательности в одной или обеих последовательностях HCVR- или LCVR-домена; при этом указанный вариант и указанное антитело или фрагмент обладают свойством связывания и/или ингибирования вируса гриппа. В некоторых вариантах реализации предложена композиция, содержащая указанное первое, второе и третье антитела или фрагменты, которые демонстрируют значения изоэлектрической точки (pI), все из которых находятся в диапазоне 2 pI.

[0038] В конкретном варианте реализации предложена композиция, содержащая первое антитело, которое представляет собой TRL053/Mab53, содержащее аминокислотные последовательности тяжелой цепи (НС)/легкой цепи (LC) с SEQ ID NO: 17/18, второе антитело, которое представляет собой антитело TRL579/Mab579, содержащее аминокислотные последовательности HC/LC с SEQ ID NO: 27/28, и третье антитело, которое выбрано из группы, состоящей из TRL847, TRL845, TRL849, TRL848, TRL846, TRL854, TRL809 и TRL832, содержащее аминокислотные последовательности HC/LC, выбранные из группы, состоящей из 227/228, 207/208, 247/248, 237/238, 217/218, 267/268, 77/78 и 127/128 соответственно, или их высокогомологичные варианты, обладающие по меньшей мере 80% идентичностью последовательности в одной или обеих последовательностях домена НС или LC; при этом указанные варианты и указанное антитело или фрагмент обладают свойством связывания и/или ингибирования вируса гриппа.

[0039] В конкретном варианте реализации предложена композиция, содержащая указанное первое, второе и третье антитела или фрагменты согласно настоящему изобретению, каждый из которых представлен в однократной дозе в эффективном количестве, для лечения или предотвращения инфекции или заболевания, вызываемого гриппом А и гриппом В, у нуждающегося в этом субъекта.

[0040] В конкретном варианте реализации предложена композиция, содержащая первое, второе и третье антитела или фрагменты согласно настоящему изобретению в количестве 100 мг/кг или меньше каждого из указанного первого, второго и третьего антител или фрагментов на дозу; в количестве 10 мг/кг или меньше каждого из указанного первого, второго и третьего антител или фрагментов на дозу; или в количестве 1 мг/кг или меньше каждого из указанного первого, второго и третьего антител или фрагментов на дозу. В некоторых вариантах реализации каждое из указанного первого, второго и третьего антител или фрагментов присутствует в композиции в количестве всего антитела или фрагмента антитела 10 мг/кг или меньше на дозу.

[0041] В конкретных вариантах реализации предложена композиция, содержащая носитель, разбавитель и/или вспомогательное вещество, для назальной или легочной доставки.

[0042] В конкретных вариантах реализации предложена композиция, содержащая антитело или фрагмент согласно настоящему изобретению и дополнительно содержащая один или более из: противовирусного лекарственного средства, ингибитора репликации вируса, ингибитора протеазы, ингибитора полимеразы, ингибитора гемагглютинина, бронхолитического средства или ингаляционного кортикостероида. В некоторых вариантах реализации иммуномодулятор представляет собой Интерферон бета-1а; противовирусное лекарственное средство представляет собой ингибитор нейраминидазы, выбранный из группы, состоящей из Осельтамивира, Занамивира, Перамивира и Ланинамивира; противовирусное лекарственное средство представляет собой ингибитор РНК-полимеразы, выбранный из группы, состоящей из Фавипиравира (Т-705) и VX 787; противовирусное лекарственное средство представляет собой лекарственное средство, прицельно воздействующее на клетку-хозяина, выбранное из группы, состоящей из Флюдазы (Das181) и АВ-103 (р2ТА); противовирусное лекарственное средство представляет собой ингибитор ионных каналов, выбранный из группы, состоящей из Римантадина и Амантадина; и бронхолитическое средство выбрано из альбутерола, левальбутерола или сальметерола.

[0043] В конкретных вариантах реализации предложена композиция, содержащая каждое из указанного первого, второго и третьего антител или фрагментов согласно настоящему изобретению в эффективном количестве, для лечения или предотвращения инфекции или заболевания, вызываемого гриппом А и гриппом В, у нуждающегося в этом субъекта, при этом одно или более из указанных антител или их антигенсвязывающих фрагментов представляет собой фрагмент антитела, выбранный из Fab, Fab' и F(ab')₂, scFv, dAb, или полиспецифическое антитело, содержащее аминокислотные последовательности HCDR1/HCDR2/HCDR3, выбранные из группы, состоящей из 11/12/13, 21/22/23, 71/72/73, 74/75/76, 91/92/93, 101/102/103, 121/122/123, 181/182/183, 191/192/193, 201/202/203, 211/212/213, 221/222/223, 231/232/233, 241/242/243, 261/262/263 и 271/272/273, или их высокогомологичные варианты, содержащие от 1 до 3 замен аминокислот в одной или более последовательностях CDR-домена, при этом указанные варианты и указанное антитело обладают свойством связывания и/или ингибирования вируса гриппа.

[0044] В некоторых вариантах реализации предложен способ лечения или профилактики инфекции, вызываемой гриппом, у субъекта, при этом указанный способ включает введение субъекту (а) первого антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащего аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую HCDR1/HCDR2/HCDR3 с SEQ ID NO: 11, 12, 13, и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую LCDR1/LCDR2/LCDR3 с SEQ ID NO: 14, 15, 16, или их высокогомологичных вариантов, содержащих от 1 до 3 замен аминокислот в одной или более последовательностях CDR-домена, при этом указанные варианты и указанное антитело или фрагмент способны связывать и/или ингибировать вирус гриппа; (b) второго антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащего аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую HCDR1/HCDR2/HCDR3 с SEQ ID NO: 21, 22, 23, и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую последовательности CDR-домена LCDR1/LCDR2/LCDR3 с SEQ ID NO: 24, 25, 26, или их высокогомологичных вариантов, содержащих от 1 до 3 замен аминокислот в одной или более последовательностях CDR-домена, при этом указанные варианты и указанное антитело или фрагмент способны связывать и/или ингибировать вирус гриппа; и (с) третьего антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащего аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую HCDR1/HCDR2/HCDR3, и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую последовательности CDR-домена легкой цепи, LCDR1/LCDR2/LCDR3, соответственно, выбранные из (i) SEQ ID NO: 71, 72, 73 и SEQ ID NO: 74, 75, 76; (ii) SEQ ID NO: 91, 92, 93 и SEQ ID NO: 94, 95, 96; (iii) SEQ ID NO: 101, 102, 103 и SEQ ID NO: 104, 105, 106; (iv) SEQ ID NO: 121, 122, 123 и SEQ ID NO: 124, 125, 126; (v) SEQ ID NO: 181, 182, 183 и SEQ ID NO: 184, 185, 186; (vi) SEQ ID NO: 191, 192, 193 и SEQ ID NO: 194, 195, 196; (vii) SEQ ID NO: 201, 202, 203 и SEQ ID NO: 204, 205, 206; (viii) SEQ ID NO: 211, 212, 213 и SEQ ID NO: 214, 215, 216; (ix) SEQ ID NO: 221, 222, 223 и SEQ ID NO: 224, 225, 226; (x) SEQ ID NO: 231, 232, 233 и SEQ ID NO: 234, 235, 236; (xi) SEQ ID NO: 241, 242, 243 и SEQ ID NO: 244, 245, 246; (xii) SEQ ID NO: 261; 262, 263 и SEQ ID NO: 264, 265, 266; или (xiii) SEQ ID NO: 271, 272, 273 и SEQ ID NO: 274, 275, 276, или их высокогомологичных вариантов, содержащих от 1 до 3 замен аминокислот в одной или более последовательностях CDR-домена, при этом указанные варианты и указанное антитело или фрагмент способны связывать и ингибировать вирус гриппа. В некоторых вариантах реализации каждое из указанного первого, второго и третьего антител или фрагментов вводят одновременно или последовательно.

[0045] В некоторых вариантах реализации противогриппозную композицию согласно настоящему изобретению вводят субъекту, при указанного субъекта классифицируют, как имеющего инфекцию вируса гриппа, без необходимости подробного определения штамма вируса.

[0046] В некоторых вариантах реализации противогриппозную композицию согласно настоящему изобретению вводят субъекту, при этом указанного субъекта защищают от инфекции или заболевания, вызываемого гриппом.

[0047] Как хорошо понятно в данной области техники, белки не на основе иммуноглобулина могут обладать схожими с антителами свойствами распознавания эпитопа, а также могут обеспечивать подходящие варианты реализации, включая связывающие агенты на основе фибронектина, трансферрина или липокалина. Агенты на основе нуклеиновых кислот, такие как аптамеры, также обладают данными свойствами связывания.

[0048] Другие варианты реализации настоящего изобретения относятся к фармацевтическим композициям и составам, содержащим связывающие агенты согласно настоящему изобретению, в частности, к тем композициям и составам, в которых связывающие агенты связаны с эритроцитами либо ковалентно, либо нековалентно таким образом, который способствует распределению из крови в легкие, к способам применения связывающих агентов согласно настоящему изобретению для пассивного ингибирования вирусной инфекции у субъектов в качестве превентивной меры у здоровых популяций или у субъектов, которые, возможно, уже подверглись воздействию вируса, или в качестве терапевтической меры у субъектов, которые уже инфицированы. Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным веществам и способам получения антител или фрагментов, включая их применение для выработки антител или фрагментов in situ у субъекта.

[0049] В некоторых вариантах реализации предложена комбинация связывающих молекул, в частности моноклональных антител человека или их фрагментов, которые связывают и эффективны против вируса гриппа, при этом указанная комбинация эффективна против вирусов гриппа А группы 1, вирусов гриппа А группы 2 и вирусов гриппа В. Указанная комбинация антител эффективна для лечения или профилактики вирусов гриппа А и В, что таким образом обеспечивает эффективный агент против всех значимых и циркулирующих вирусов гриппа в одной композиции или дозе.

[0050] В некоторых вариантах реализации предложена содержащая комбинацию композиция, содержащая моноклональные антитела, каждое из которых связывается с вирусом гриппа с низкой нМ или суб-нМ аффинностью. Предложена содержащая комбинацию композиция, содержащая антитело или связывающий фрагмент, направленный, в частности, непосредственно против вирусов гриппа А группы 1, антитело или связывающий фрагмент, направленный, в частности, непосредственно против вирусов гриппа А группы 2, и антитело или связывающий фрагмент, направленный, в частности, непосредственно против вирусов гриппа В, включая линии гриппа В как линии Ямагата, так и линии Виктория.

[0051] В некоторых вариантах реализации предложена комбинация антител, содержащая первое антитело, направленное против гриппа А группы 1, и в более конкретных вариантах реализации, в частности, против по меньшей мере вирусов гриппа H1, второе антитело, направленное против гриппа А группы 2, и в более конкретных вариантах реализации, в частности, против по меньшей мере вирусов гриппа Н3, и третье антитело, направленное против вируса гриппа В, и в более конкретных вариантах реализации, в частности, против как линии Ямагата, так и линии Виктория.

[0052] В некоторых вариантах реализации предложена композиция, содержащая или состоящая из комбинации моноклональных антител к вирусу гриппа или их фрагментов, которые эффективны в комбинации для лечения или профилактики гриппа А и гриппа В.

[0053] Один из вариантов реализации настоящего изобретения включает антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, содержащий вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 119, 129, 139, 149, 159, 169, 179, 189, 199, 209, 219, 229, 239, 249, 259, 269, 279 и 289, или ее гомологичную последовательность, обладающую по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности. В другом варианте реализации указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит HCVR, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 79, 99, 109, 129, 189, 199, 209, 219, 229, 239, 249, 269 и 279. В другом варианте реализации указанное антитело или его фрагмент содержит HCVR, содержащую SEQ ID NO: 209, 229, 239, 249 или 269.

[0054] Один из вариантов реализации настоящего изобретения включает антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, содержащий вариабельную область легкой цепи (LCVR), выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280 и 290, или ее по существу гомологичную последовательность, обладающую по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности. В другом варианте реализации указанное антитело или антигенсвязывающая часть антитела содержит LCVR, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 80, 100, 110, 130, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 270 или 280. В другом варианте реализации указанное антитело или его фрагмент содержит LCVR, содержащую SEQ ID NO: 210, 230, 240, 250 или 270.

[0055] Один из вариантов реализации настоящего изобретения включает композицию, содержащую антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащий вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), выбранную из группы, состоящей из одной или более из SEQ ID NO: 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 119, 129, 139, 149, 159, 169, 179, 189, 199, 209, 219, 229, 239, 249, 259, 269, 279 и 289, или ее гомологичную последовательность, обладающую по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности. В другом варианте реализации указанная композиция содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий HCVR, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 79, 99, 109, 129, 189, 199, 209, 219, 229, 239, 249, 269 и 279. В другом варианте реализации указанная композиция содержит антитело или его фрагмент, содержащий HCVR, содержащую SEQ ID NO: 209, 229, 239, 249 или 269.

[0056] Один из вариантов реализации настоящего изобретения включает композицию, содержащую антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, содержащий вариабельную область легкой цепи (LCVR), выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280 и 290, или ее гомологичную последовательность, обладающую по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности. В другом варианте реализации указанная композиция содержит антитело или антигенсвязывающую часть антитела, содержащую LCVR, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 80, 100, 110, 130, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 270 или 280. В другом варианте реализации указанная композиция содержит антитело или его фрагмент, содержащий LCVR, содержащую SEQ ID NO: 210, 230, 240, 250 или 270.

[0057] Один из вариантов реализации настоящего изобретения включает композицию, содержащую антитело к гриппу В (анти-В-тип) или его фрагмент, предложенный согласно настоящему изобретению, и антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащий вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), выбранную из группы, состоящей из одной или более из SEQ ID NO: 19 и 29, или ее гомологичную последовательность, обладающую по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности.

[0058] Один из вариантов реализации настоящего изобретения включает композицию, содержащую антитело к гриппу В или фрагмент, предложенный согласно настоящему изобретению, и антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, содержащий вариабельную область легкой цепи (LCVR), выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 20 и 30, или ее гомологичную последовательность, обладающую по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности.

[0059] В более конкретных вариантах реализации композиции содержат по меньшей мере одно антитело к гриппу В и по меньшей мере одно или по меньшей мере два антитела к гриппу А.

[0060] В некоторых вариантах реализации предложено антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащий аминокислотные последовательности вариабельной области НС и LC, при этом HCVR содержит аминокислотные последовательности HCDR1/HCDR2/HCDR3, выбранные из любой из SEQ ID NO: 31/32/33; 41/42/43; 51/52/53; 61/62/63; 71/72/73; 81/82/83; 91/92/93; 101/102/103; 111/112/113; 121/122/123; 131/132/133; 141/142/143; 151/152/153; 161/162/163; 171/172/173; 181/182/183; 191/192/193; 201/202/203; 211/212/213; 221/222/223; 231/232/233; 241/242/243; 251/252/253; 261/262/263; 271/272/273 и 281/282/283, или их высокогомологичные варианты, содержащие от 1 до 3 замен аминокислот в одной или более последовательностях CDR-домена, и LCVR содержит аминокислотные последовательности LCDR1/LCDR2/LCDR3, выбранные из любой из SEQ ID NO: 34/35/36; 44/45/46; 54/55/56; 64/65/66; 74/75/76; 84/85/86; 104/105/106; 114/115/16; 124/125/126; 134/135/136; 144/145/146; 154/155/156; 164/165/166; 174/175/176; 184/185/186; 194/195/196; 204/205/206; 214/215/216; 224/225/226; 234/235/236; 244/245/246; 254/255/256; 264/265/266; 274/275/276; и 284/285/286, или их высокогомологичные варианты, содержащие от 1 до 3 замен аминокислот в одной или более последовательностях CDR-домена.

[0061] В некоторых вариантах реализации предложено антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащий модификации Fc для увеличения времени полужизни в сыворотке. Такие модификации описаны в технологии конструирования антител Xtend™ Xencor (Xencor, Мельбурн, Австралия). В соответствии с некоторыми аспектами антитело или фрагмент, содержащий модификации Fc, демонстрирует аминокислотную последовательность, обладающую более чем 80%, более чем 90%, более чем 95% или более чем 99% идентичностью последовательности SEQ ID NO: 297, 17, 2737, 47, 57, 67, 77, 87, 97, 107, 117, 127, 137, 147, 157, 167, 177, 187, 197, 207, 217, 227, 237, 247, 257, 267, 277 или 287.

[0062] Не являясь связанными рамками какой-либо конкретной теории, в некоторых вариантах реализации, поскольку эталонный Fab работает в составе для ингаляций, предложен антигенсвязывающий фрагмент, который представляет собой scFv. Такие сконструированные антитела не встречаются в природе. В некоторых вариантах реализации предложено сконструированное антитело или связывающий фрагмент, содержащий аминокислотные последовательности HCDR1/HCDR2/HCDR3, выбранные из любой из SEQ ID NO: 31/32/33; 41/42/43; 51/52/53; 61/62/63; 71/72/73; 81/82/83; 91/92/93; 101/102/103; 111/112/113; 121/122/123; 131/132/133; 141/142/143; 151/152/153; 161/162/163; 171/172/173; 181/182/183; 191/192/193; 201/202/203; 211/212/213; 221/222/223; 231/232/233; 241/242/243; 251/252/253; 261/262/263; 271/272/273 и 281/282/283, или их высокогомологичные варианты, содержащие от 1 до 3 замен аминокислот в одной или более последовательностях CDR-домена.

[0063] В некоторых вариантах реализации предложена кодон-оптимизированная нуклеиновая кислота для экспрессии антител и фрагментов, предложенных согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах реализации такие не встречающиеся в природе нуклеиновые кислоты применяют для получения более высоких уровней экспрессии. В некоторых вариантах реализации кодон-оптимизированные молекулы нуклеиновой кислоты применяют для получения рекомбинантных антител и фрагментов, предложенных согласно настоящему изобретению.

[0064] В некоторых вариантах реализации предложено антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащий аминокислотные последовательности вариабельной области НС и LC, при этом HCVR содержит аминокислотные последовательности HCDR1/HCDR2/HCDR3, выбранные из любой из SEQ ID NO: 31/32/33; 41/42/43; 51/52/53; 61/62/63; 71/72/73; 81/82/83; 91/92/93; 101/102/103; 111/112/113; 121/122/123; 131/132/133; 141/142/143; 151/152/153; 161/162/163; 171/172/173; 181/182/183; 191/192/193; 201/202/203; 211/212/213; 221/222/223; 231/232/233; 241/242/243; 251/252/253; 261/262/263; 271/272/273 и 281/282/283, или их высокогомологичные варианты, содержащие от 1 до 3 замен аминокислот в одной или более последовательностях CDR-домена, и LCVR содержит аминокислотные последовательности LCDR1/LCDR2/LCDR3, выбранные из любой из SEQ ID NO: 34/35/36; 44/45/46; 54/55/56; 64/65/66; 74/75/76; 84/85/86; 104/105/106; 114/115/16; 124/125/126; 134/135/136; 144/145/146; 154/155/156; 164/165/166; 174/175/176; 184/185/186; 194/195/196; 204/205/206; 214/215/216; 224/225/226; 234/235/236; 244/245/246; 254/255/256; 264/265/266; 274/275/276; и 284/285/286, или их высокогомологичные варианты, содержащие от 1 до 3 замен аминокислот в одной или более последовательностях CDR-домена.

[0065] В некоторых вариантах реализации предложено антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащий модификации Fc для увеличения времени полужизни в сыворотке. Такие модификации описаны в технологии конструирования антител Xtend™ Xencor (Xencor, Мельбурн, Австралия). В соответствии с некоторыми аспектами антитело или фрагмент, содержащий модификации Fc, демонстрирует аминокислотную последовательность, обладающую более чем 80%, более чем 90%, более чем 95% или более чем 99% идентичностью последовательности SEQ ID NO: 297, 17, 27,37, 47, 57, 67, 77, 87, 97, 107, 117, 127, 137, 147, 157, 167, 177, 187, 197, 207, 217, 227, 237, 247, 257, 267, 277 или 287.

[0066] В некоторых вариантах реализации предложено сконструированное антитело или связывающий фрагмент, содержащий аминокислотные последовательности HCDR1/HCDR2/HCDR3, выбранные из любой из SEQ ID NO: 31/32/33; 41/42/43; 51/52/53; 61/62/63; 71/72/73; 81/82/83; 91/92/93; 101/102/103; 111/112/113; 121/122/123; 131/132/133; 141/142/143; 151/152/153; 161/162/163; 171/172/173; 181/182/183; 191/192/193; 201/202/203; 211/212/213; 221/222/223; 231/232/233; 241/242/243; 251/252/253; 261/262/263; 271/272/273 и 281/282/283, или их высокогомологичные варианты, содержащие от 1 до 3 замен аминокислот в одной или более последовательностях CDR-домена.

[0067] В некоторых вариантах реализации предложена кодон-оптимизированная нуклеиновая кислота для экспрессии антител и фрагментов, предложенных согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах реализации такие не встречающиеся в природе нуклеиновые кислоты применяют для получения более высоких уровней экспрессии. В некоторых вариантах реализации кодон-оптимизированные молекулы нуклеиновой кислоты применяют для получения рекомбинантных антител и фрагментов, предложенных согласно настоящему изобретению.

Краткое описание чертежей

[0068] На фиг. 1 представлена известная в данной области техники классификация вируса гриппа А и В по группам значимых клад, взятая из Suzuki, Y., et al., Mol. Biol. Evol. (2002) 19:501-509.

[0069] На фиг. 2 представлены типичные штаммы в пределах двух клад гриппа В, линии Ямагата и линии Виктория, взятые из Dreyfus, С., et al., Science (2012) 337:1343-1348. Типичные клады линии Ямагата включают Mississippi/04/2008; Florida/4/2006; Jilin/20/2003; Houston/B60/1997; Harbin/7/1994; и Nashville/45/1991. Типичные клады линии Виктория включают Malaysia/2506/2004; Mississippi/07/2008; Brisbane/60/2008; и Ohio/01/2005.

[0070] На фиг. 3 представлена таблица 7 с данными твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) с использованием рекомбинантного НА, иллюстрирующая реактивность нескольких mAb к гриппу В и двух mAb к гриппу А в отношении штаммов гриппа А и В. ELISA-анализы с использованием рекомбинантного НА проводили в трех повторностях, и показана средняя кратная реактивность (относительные единицы флуоресценции) относительно фона. На фиг. 3 показано, что каждое из mAb анти-В: TRL809, TRL812, TRL813; TRL832, TRL841, TRL842, TRL845, TRL846, TRL847, TRL848, TRL849, TRL854 и TRL856 демонстрирует перекрестную реактивность широкого спектра в отношении обеих линий вирусов гриппа В, включая B/Florida/06, B/Mass/12 и B/Wisconsin/10 клады линии Ямагата, и B/Brisbane/08, B/Malaysia/04 и В/Виктория/87 клады линии Виктория. mAb к гриппу A: CF401 (mAb 53) и CF402 (mAb 579) демонстрируют реактивность в отношении членов подтипов H1 (A/California/09) и Н3 (A/Sydney/97) гриппа А, но не в отношении штаммов гриппа В.

[0071] На фиг. 4 представлена таблица 8 с данными нейтрализации, IC50, для антител к гриппу В: TRL845, TRL848, TRL849, TRL854, TRL832 и TRL809 в отношении типичных штаммов В/Ямагата/16/1988 и В/Виктория/2/1987.

[0072] На фиг. 5А показана активность in vivo антитела 5А7 к гриппу В у мышей в виде массы тела в процентах после интраназального (и/н) по сравнению с интраперитонеальным (и/п) введением 5А7 у мышей, инфицированных 10xLD50 B/Florida (линия Ямагата). Мышей лечили через 24 часа после инфицирования (24 чпи) mAb либо интраназальным, либо интраперитонеальным путем и ежедневно измеряли массу тела в качестве показателя тяжести заболевания; ФБР и отсутствие вируса использовали в качестве контролей. Осуществляли мониторинг массы тела животных ежедневно в течение 14 дней после инфицирования и отмечали на графике массу тела в процентах от исходной массы в 0 день. Мышей, которые теряли >30% массы тела, подвергали эвтаназии. 1 мг/кг интраназально обеспечивал полную защиту от потери массы, в то время как 1 мг/кг интраперитонеальным путем приводил к некоторой потере массы. Показана повышенная эффективность интраназального пути введения по сравнению с интраперитонеальным путем.

[0073] На фиг. 5B показана активность in vivo антитела 5А7 к гриппу В у мышей в виде массы тела в процентах после интраназального по сравнению с интраперитонеальным введением 5А7, инфицированных 10xLD50 B/Malaysia (линия Виктория). Мышей лечили через 24 часа после инфицирования mAb либо интраназальным, либо интраперитонеальным путем и ежедневно измеряли массу тела в качестве показателя тяжести заболевания. Мышей, которые теряли >30% массы тела, подвергали эвтаназии. 1 мг/кг интраназально обеспечивал полную защиту от потери массы, в то время как 1 мг/кг интраперитонеальным путем приводил к некоторой потере массы тела. Показана повышенная эффективность интраназального пути введения по сравнению с интраперитонеальным путем.

[0074] На фиг. 6А-D показана активность in vivo моноклональных антител к гриппу В согласно настоящему изобретению в отношении 10xLD50 (доза, являющаяся летальной для 50% популяции) вируса в 1 день после инфицирования в модели у мышей после введения 1 мг/кг интраназальным путем с оценкой массы тела мышей вплоть до 14 дней после инфицирования; ФБР и отсутствие вируса использовали в качестве контролей. Осуществляли мониторинг массы тела животных ежедневно в течение 14 дней после инфицирования и отмечали на графике массу тела в процентах от исходной массы в 0 день.

[0075] На фиг. 6А показано, что 1 мг/кг mAb: TRL845, TRL847, TRL848, TRL849 и 5А7 интраназальным путем обеспечивал защиту от заболевания у мышей, инфицированных B/Malaysia/2506/04, характерным для клады линии Виктория.

[0076] На фиг. 6B показано, что 1 мг/кг mAb: TRL845, TRL847, TRL848, TRL849 и 5А7 интраназальным путем обеспечивал защиту от заболевания у мышей, инфицированных B/Florida/04/2006, характерным для клады линии Ямагата.

[0077] На фиг. 6С показано, что 1 мг/кг mAb: TRL849, TRL846, TRL854, TRL856, TRL847 и 5А7 интраназальным путем обеспечивал защиту от заболевания у мышей, инфицированных B/Malaysia/2506/04, характерным для клады линии Виктория.

[0078] На фиг. 6D показано, что 1 мг/кг mAb: TRL849, TRL846, TRL854, TRL856, TRL847 и 5А7 интраназальным путем обеспечивал защиту от заболевания у мышей, инфицированных B/Florida/04/2006, характерным для клады линии Ямагата.

[0079] На фиг. 7A-7D показано, что совместное введение трех mAb к гриппу не нарушало эффективность mAb анти-В. Мышей инфицировали 10xLD50 вируса и лечили через 24 часа после инфицирования 3 мг/кг коктейля из трех mAb, состоящего из CF-401 анти-Н1, CF-402 анти-Н3 и либо TRL845 анти-В (коктейль 1), либо TRL847 анти-В (коктейль 2), либо TRL849 анти-В (коктейль 3); ФБР и отсутствие вируса использовали в качестве контролей. Осуществляли мониторинг массы тела животных ежедневно в течение 14 дней после инфицирования и отмечали на графике массу тела в процентах от исходной массы в 0 день.

[0080] Фиг. 7A-7D вместе демонстрируют, что указанный коктейль будет обеспечивать ожидаемый уровень защиты без нарушения со стороны других mAb в коктейле от типичных штаммов всех подтипов сезонного гриппа (H1N1, H3N2 и обе линии В).

[0081] На фиг. 7А показана защита мышей in vivo, инфицированных 10xLD50 H1N1 и получавших лечение через 24 часа после инфицирования 3 мг/кг коктейля из трех mAb, состоящего из CF-401 анти-Н1, CF-402 анти-Н3 и либо TRL845 анти-В (коктейль 1), либо TRL847 анти-В (коктейль 2), либо TRL849 анти-В (коктейль 3).

[0082] На фиг. 7В показана защита мышей in vivo, инфицированных 10xLD50 H3N2 и получавших лечение через 24 часа после инфицирования 3 мг/кг коктейля из трех mAb, состоящего из CF-401 анти-Н1, CF-402 анти-Н3 и либо TRL845 анти-В (коктейль 1), либо TRL847 анти-В (коктейль 2), либо TRL849 анти-В (коктейль 3).

[0083] На фиг. 7С показана защита мышей in vivo, инфицированных 10xLD50 линии В/Ямагата и получавших лечение через 24 часа после инфицирования 3 мг/кг коктейля из трех mAb, состоящего из CF-401 анти-Н1, CF-402 анти-Н3 и либо TRL845 анти-В (коктейль 1), либо TRL847 анти-В (коктейль 2), либо TRL849 анти-В (коктейль 3).

[0084] На фиг. 7D показана защита мышей in vivo, инфицированных 10xLD50 линии В/Виктория и получавших лечение через 24 часа после инфицирования 3 мг/кг коктейля из трех mAb, состоящего из CF-401 анти-Н1, CF-402 анти-Н3 и либо TRL845 анти-В (коктейль 1), либо TRL847 анти-В (коктейль 2), либо TRL849 анти-В (коктейль 3).

[0085] На фиг. 8 показана пептидная матрица CLIPS™, созданная PEPSCAN Inc., для белка B/Lee/1940/ НА (SEQ ID NO: 291) (верхнее изображение). Затененные области белка B/Lee/1940/ НА соответствуют остаткам, используемым для получения пептидных матриц из аа_15-65 (SEQ ID NO: 292), аа_300-359 (SEQ ID NO: 293) и аа_362-481 (SEQ ID NO: 294). В таблице 9 (нижнее изображение) показан эпитоп 1-аа_333-338 (SEQ ID NO: 304), эпитоп 2-аа_342-346 (SEQ ID NO: 305) и эпитоп 3-аа_457-463 (SEQ ID NO: 306) для mAb 5А7; эпитоп -аа_455-463 (SEQ ID NO: 307) для mAb TRL845; эпитоп 1-аа_64-71 (SEQ ID NO: 308), эпитоп 2-аа_336-348 (SEQ ID NO: 309), эпитоп 3-аа_424-428 (SEQ ID NO: 310) для TRL848; эпитоп 1-аа_317-323 (SEQ ID NO: 311), эпитоп 2-аа_344-349312), эпитоп 3-аа_378-383 (SEQ ID NO: 313) для mAb 849; эпитоп 1-аа_457-463 (SEQ ID NO: 314) для mAb 854. На чертеже в нижнем правом углу темно-серым цветом показана область, картированная на стебле НА.

[0086] Фиг. 9 иллюстрирует картирование эпитопов путем анализа PEPSCAN™ по стеблю белка НА. Затемненные области показывают эпитоп, с которым связывается каждое mAb. mAb: TRL848, TRL845, TRL854 и TRL849 распознают эпитопы прерывистого типа, которые частично перекрываются по стеблю НА. Контрольное mAb 5А7, полученное из опубликованной последовательности, давало схожие, но уникальные эпитопы.

[0087] На фиг. 10A-10F представлены анализы кривой плавления для mAb: TRL845, TRL847, TRL848, TRL849 и TRL854. Каждое mAb демонстрировало высокую термическую стабильность.

[0088] На фиг. 10А представлена кривая плавления для TRL845, демонстрирующая две температуры плавления (Tm1, Tm2) 58,3°С и 68,7°С соответственно.

[0089] На фиг. 10В представлена таблица 10 со значениями температуры плавления (Tm) для mAb: TRL845, TRL847, TRL848, TRL849 и TRL854, показанными на фиг. 10А и 10C-10F соответственно.

[0090] На фиг. 10С представлена кривая плавления для TRL847, демонстрирующая температуру плавления (Tm1), равную 70,3°С.

[0091] На фиг. 10D представлена кривая плавления для TRL848, демонстрирующая температуру плавления (Tm1), равную 70,1°С

[0092] На фиг. 10E представлена кривая плавления для TRL849, демонстрирующая две температуры плавления (Tm1, Tm2) 70°С и 81,8°С соответственно.

[0093] На фиг. 10F представлена кривая плавления для TRL854, демонстрирующая две температуры плавления (Tm1, Tm2) 59,7°С и 68,9°С.

[0094] На фиг. 11А показано интраназальное и интраперитонеальное введение в сопоставимых дозах и показано, что Mab интраназально в 10-100 раз более активно, чем это же Mab, вводимое интраперитонеально. Животных заражали 10XLD50 вируса гриппа H1 (A/Puerto Rico/8/1934) и лечили интраназально или интраперитонеально через 24 часа после инфицирования 10 мг/кг, 1 мг/кг и 0,1 мг/кг нейтрализующего Mab СА6261; ФБР и отсутствие вируса использовали в качестве контролей. Осуществляли мониторинг массы тела животных ежедневно в течение 14 дней после инфицирования и отмечали на графике массу тела в процентах от исходной массы в 0 день. Данные показывают, что интраназальная доставка нейтрализующих антител значительно повышала их терапевтическую эффективность по сравнению с системной доставкой.

[0095] На фиг. 11В показана оценка терапевтической эффективности интраназального и интраперитонеального введения антитела MAb53 (TRL053) против вируса H1. Животных заражали 10XLD50 вируса гриппа H1 A/Puerto Rico/8/1934 (PR8) и лечили через 24 часа после инфицирования 10 мг/кг, 1 мг/кг и 0,1 мг/кг нейтрализующего антитела TRL053 (MAb53), вводимого интраназально или интраперитонеально; лечение ФБР и отсутствие вируса использовали в качестве контролей. Осуществляли мониторинг массы тела животных ежедневно в течение 14 дней после инфицирования и отмечали на графике массу тела в процентах от исходной массы в 0 день. TRL053, вводимое интраназально, демонстрировало большую эффективность, чем при интраперитонеальном дозировании. TRL053 было до некоторой степени эффективно только в случае дозы для интраперитонеального введения, составляющей 10 мг/кг. Дозы для интраназального введения были эффективны на уровне 10 мг/кг и 1 мг/кг.

[0096] На фиг. 12А показано сравнение интраназального и интраперитонеального введения в сопоставимых дозах и показано, что Mab СА8020 интраназально в 10-100 раз более активно, чем это же Mab, вводимое интраперитонеально. Животных заражали 10XLD50 вируса гриппа Н3 и лечили интраназально или интраперитонеально через 24 часа после инфицирования 10 мг/кг, 1 мг/кг и 0,1 мг/кг нейтрализующего Mab СА8020; ФБР и отсутствие вируса использовали в качестве контролей. Осуществляли мониторинг массы тела животных ежедневно в течение 14 дней после инфицирования и отмечали на графике массу тела в процентах от исходной массы в 0 день.

[0097] На фиг. 12В показана оценка терапевтической эффективности интраназального и интраперитонеального введения антитела MAb579 (TRL579) против вируса Н3. Животных заражали 10XLD50 вируса Vic/11 Н3 и лечили через 24 часа после инфицирования 10 мг/кг, 1 мг/кг и 0,1 мг/кг антитела TRL579, вводимого интраназально или интраперитонеально. Осуществляли мониторинг массы тела животных ежедневно в течение 14 дней после инфицирования. TRL579 было эффективно интраперитонеально или интраназально, однако вводимое интраназально TRL579 демонстрировало большую эффективность, чем интраперитонеальное дозирование. TRL579 было до некоторой степени эффективно только в случае дозы для интраперитонеального введения, составляющей 10 мг/кг. В данном исследовании дозы для интраназального введения были эффективны на уровне 10 мг/кг и 1 мг/кг.

[0098] На фиг. 13 показано профилактическое интраназальное и интраперитонеальное введение за 3 или 4 дня до инфицирования вирусом. Антитело СА6261 вводили интраназально или интраперитонеально за 3 или 4 дня до заражения 3XLD50 вируса гриппа H1 A/Puerto Rico/8/1934 (обозначаемого PR8). Антитело СА6261 вводили интраназально (0,1 мг/кг) или интраперитонеально (0,1 мг/кг и 1 мг/кг) за 3 дня до инфицирования (-3 дди) или за 4 дня до инфицирования (-4 дди), и осуществляли заражение вирусом гриппа H1. Контроли представляли собой отсутствие вируса и отсутствие лечения. Осуществляли мониторинг массы тела животных ежедневно в течение 14 дней после инфицирования и отмечали на графике массу тела в процентах от исходной массы в 0 день. Фиг. 13 показывает, что интраназальное введение вплоть до 4 дней до инфицирования (-4 дди) (оценивали на уровне 0,1 мг/кг) защищало мышей от заражения вирусом. Интраперитонеальное введение за 3 или 4 дня до инфицирования в этой же дозе (0,1 мг/кг) было совершенно неэффективным. Интраперитонеальное введение за 3 или 4 дня до инфицирования было эффективным в случае 1 мг/кг.При сравнении интраназального (0,1 мг/г) и интраперитонеального (1 мг/кг) введения в -3 дди и -4 дди в обоих случаях в десять раз более низкая доза интраназально была эффективнее дозы интраперитонеально.

[0099] На фиг. 14 показано профилактическое интраназальное и интраперитонеальное введение за 5, 6 или 7 дней до инфицирования вирусом. Антитело СА6261 вводили интраперитонеально (1 мг/кг) или интраназально (1 мг/кг) за 5, 6 или 7 дней до заражения 3XLD50 вируса гриппа H1 PR8. Контроли представляли собой Тамифлю (10 мг/кг, вводимые перорально, два раза в сутки в течение пяти дней), отсутствие лечения и отсутствие вируса. Осуществляли мониторинг массы тела животных ежедневно в течение 14 дней после инфицирования и отмечали на графике массу тела в процентах от исходной массы в 0 день. Во всех случаях антитело было эффективнее Тамифлю.

[00100] На фиг. 15 показано профилактическое интраназальное и интраперитонеальное введение за 5, 6 или 7 дней до инфицирования вирусом, при этом заражение вирусом осуществляли в более высокой дозе, составляющей 10XLD50. Антитело СА6261 вводили интраперитонеально (1 мг/кг) или интраназально (1 мг/кг) за 5, 6 или 7 дней до заражения 10XLD50 вируса гриппа H1 PR8. Контроли представляли собой Тамифлю (10 мг/кг, вводимые перорально, два раза в сутки в течение пяти дней), отсутствие лечения и отсутствие вируса. Осуществляли мониторинг массы тела животных ежедневно в течение 14 дней после инфицирования и отмечали на графике массу тела в процентах от исходной массы в 0 день. В данном исследовании только животные, которым вводили антитело в дыхательные пути (путем интраназального введения), выжили после заражения вирусом. Мыши, которых лечили 1 мг/кг антитела, вводимого за 5, 6 или 7 дней до заражения вирусом, не были полностью защищены и погибли от инфекции. Тамифлю был совершенно неэффективен с точки зрения защиты. Мыши, которых лечили 0,1 мг/кг антитела интраназально либо за 5, либо за 6 дней до инфицирования вирусом, выжили после заражения вирусом практически наравне с контрольными животными, которых не инфицировали.

[00101] На фиг. 16 представлена таблица 11 с оценкой моноклональных антител к гриппу В на предмет ингибирования гемагглютинации, нейтрализации линии В/Виктория и В/Ямагата in vitro, предсказанного центра связывания (голова, стебель) и эффективности in vivo. Результаты in vivo представлены в виде резюме трех различных исследований в каждом случае, оценивающих процент от исходной массы тела у животных, зараженных 10xLD50 вируса и которым вводили указанное антитело TRL интраназально в дозе 1 мг/кг через 24 часа после инфицирования. Массу тела животных наблюдали в течение 14 дней, и указана самая маленькая наблюдаемая масса тела. Результаты представлены для антител TRL809, TRL832, TRL846, TRL845, TRL847, TRL848, TRL849 и TRL854. Каждое из TRL809, TRL832, TRL846, TRL845, TRL847, TRL848, TRL849 и TRL854 эффективно сохраняло по меньшей мере 95% от исходной массы тела животного на протяжении оценки эффективности in vivo. Каждое из TRL845, TRL847, TRL848, TRL849 и TRL854 эффективно сохраняло по меньшей мере 96% от исходной массы тела животного на протяжении оценки эффективности in vivo. Хотя TRL846 не демонстрировало нейтрализацию в традиционном анализе in vitro, оно действительно демонстрировало ингибирование выхода и, таким образом, считается нейтрализующим.

[00102] На фиг. 17 представлена таблица 12 с характеристикой антител к гриппу В на предмет изоэлектрической точки и аффинности (K_D в нМ) к штаммам вируса гриппа B/Florida (линия Ямагата) и B/Malaysia (линия Виктория). Оценивали аффинность антител анти-В к вирусу гриппа, служащую в качестве индикатора относительной эффективности. Аффинность каждого из TRL845, TRL847, TRL848, TRL849 и TRL854 к B/Malaysia была суб-нМ (<1,0 нМ) в каждом случае (данные не представлены).

[00103] На фиг. 18 показаны исследования эффективности у животных с различными антителами к гриппу В, вводимыми через 24 часа после инфицирования вирусом B/Florida (линия Ямагата). Все антитела вводили интраназально в дозе 1 мг/кг через 24 часа после инфицирования 10XLD50 вируса. Тестируемые антитела представляли собой TRL845, TRL847, TRL848, TRL849, 5А7 и СА8033. ФБР и отсутствие вируса представляли собой контроли. Осуществляли мониторинг массы тела животных ежедневно в течение 14 дней после инфицирования и отмечали на графике массу тела в процентах от исходной массы в 0 день. Вводимые интраназально антитела к гриппу В демонстрировали эффективность против инфицирования вирусом линии Ямагата в дозе 10XLD50, при этом некоторые антитела демонстрировали сохранение 100% массы тела инфицированными животными, получавшими лечение антителами.

[00104] На фиг. 19 показаны исследования эффективности у животных с различными антителами к гриппу В, вводимыми через 24 часа после инфицирования вирусом B/Florida (линия Ямагата). Все антитела вводили интраназально в дозе 1 мг/кг через 24 часа после инфицирования 10XLD50 вируса. Тестируемые антитела представляли собой TRL849, TRL846, TRL854, TRL856, TRL847, 5А7, TRL809 и TRL848. ФБР и отсутствие вируса представляли собой контроли. Осуществляли мониторинг массы тела животных ежедневно в течение 14 дней после инфицирования и отмечали на графике массу тела в процентах от исходной массы в 0 день. Вводимые интраназально антитела к гриппу В демонстрировали эффективность против инфицирования вирусом линии Ямагата в дозе 10XLD50, при этом некоторые антитела демонстрировали сохранение 100% массы тела инфицированными животными, получавшими лечение антителами.

[00105] На фиг. 20 показаны исследования эффективности у животных с различными антителами к гриппу В, вводимыми через 24 часа после инфицирования вирусом B/Malaysia (линия Виктория). Все антитела вводили интраназально в дозе 1 мг/кг через 24 часа после инфицирования 10XLD50 вируса. Тестируемые антитела представляли собой TRL845, TRL847, TRL848, TRL849, 5А7 и СА8033. ФБР и отсутствие вируса представляли собой контроли. Осуществляли мониторинг массы тела животных ежедневно в течение 14 дней после инфицирования и отмечали на графике массу тела в процентах от исходной массы в 0 день. Вводимые интраназально антитела к гриппу В демонстрировали эффективность против инфицирования вирусом линии Виктория в дозе 10XLD50, при этом некоторые антитела демонстрировали сохранение 100% массы тела инфицированными животными, получавшими лечение антителами.

[00106] На фиг. 21 показаны исследования эффективности у животных с различными антителами к гриппу В, вводимыми через 24 часа после инфицирования вирусом B/Malaysia (линия Виктория). Все антитела вводили интраназально в дозе 1 мг/кг через 24 часа после инфицирования 10XLD50 вируса. Тестируемые антитела представляли собой TRL849, TRL846, TRL854, TRL856, TRL847, 5А7, TRL809 и TRL848. ФБР и отсутствие вируса представляли собой контроли. Осуществляли мониторинг массы тела животных ежедневно в течение 14 дней после инфицирования и отмечали на графике массу тела в процентах от исходной массы в 0 день. Вводимые интраназально антитела к гриппу В демонстрировали эффективность против инфицирования вирусом линии Виктория в дозе 10XLD50, при этом некоторые антитела демонстрировали сохранение 100% массы тела инфицированными животными, получавшими лечение антителами.

[00107] На фиг. 22А и 22 В представлена оценка эффективности антител к гриппу В в исследованиях у животных с (фиг. 22А) вирусом B/Malaysia линии Виктория и (фиг. 22В) вирусом B/Florida линии Ямагата. Мышей инфицировали 10xLD50 вируса и лечили интраназально антителом в дозе 1 мг/кг через 24 часа после инфицирования. Осуществляли мониторинг массы тела животных ежедневно в течение 14 дней после инфицирования и отмечали на графике массу тела в процентах от исходной массы в 0 день. Тестируемые антитела представляли собой указанные TRL809, TRL832, антитело 5А7 и TRL579. TRL579 представляет собой антитело анти-Н3, и оно служило в качестве отрицательного контроля. TRL809 и TRL832 нейтрализовали грипп путем блокирования связывания вируса. Вводимые интраназально антитела к гриппу В, TRL809, TRL832 и 5А7, демонстрировали эффективность против инфицирования вирусом линии Виктория в дозе 10XLD50, демонстрируя сохранение ~100% массы тела инфицированными животными, получавшими лечение антителами.

[00108] На фиг. 23 показаны исследования у животных, позволяющие оценить противовирусную эффективность, с использованием интраназального введения комбинации антител TRL053, TRL579 и 5А7 к вирусам гриппа А или гриппа В. Животных инфицировали либо вирусом H1 PR8, либо вирусом Н3 Виктория/11, либо вирусом гриппа В B/Malaysia, либо вирусом гриппа В B/Florida, а затем оставляли без лечения или лечили коктейлем из трех антител. Каждое антитело включали в дозе 1 мг/кг, что обеспечивало общую дозу антител, составляющую 3 мг/кг. Для животных, получавших лечение коктейлем, комбинацию антител вводили через 24 часа после инфицирования 10XLD50 указанных вирусов. Отсутствие вируса показано в качестве контроля. Осуществляли мониторинг массы тела животных ежедневно в течение 14 дней после инфицирования и отмечали на графике массу тела в процентах от исходной массы в 0 день. Фиг. 23 подтверждает, что коктейль антител, вводимый в виде однократной смешанной дозы через 24 часа после инфицирования 10xLD50 вируса, демонстрировал эффективность против инфицирования каждым или любым из вируса H1, вируса Н3, вируса линии В/Ямагата и вируса линии В/Виктория.

[00109] На фиг. 24 показаны исследования у животных, в которых 100% мышей выжили после заражения летальной дозой H1N1 при лечении через 4 дня после инфицирования путем однократного введения CF-401 в дозе 1 мг/кг. Введение стандарта лечения Тамифлю не оказывало защиты, но в дополнение к терапии mAb CF-401 обеспечивало дополнительную защиту от потери массы. 10 мг/кг Тамифлю вводили перорально в 4-8 дни два раза в сутки. Данные показывают, что стандарт лечения (Тамифлю) плюс терапия mAb эффективны при введении в поздние моменты времени.

[0001] На фиг. 25 представлены результаты сравнения интраназального и интраперитонеального введения эталонного Fab-фрагмента антитела СА6261 на предмет терапевтической эффективности против вируса H1. Животных заражали 10XLD50 вируса гриппа H1 и через 24 часа после инфицирования лечили 10 мг/кг, 1 мг/кг и 0,1 мг/кг нейтрализующего Fab СА6261, вводимого интраназально или интраперитонеально; лечение ФБР и отсутствие вируса использовали в качестве контролей. Осуществляли мониторинг массы тела животных ежедневно в течение 14 дней после инфицирования и отмечали на графике массу тела в процентах от исходной массы в 0 день. Все дозы Fab антитела СА6261, вводимые интраназально, демонстрировали более высокую эффективность, чем любая доза, вводимая интраперитонеально. Введение нейтрализующего Fab интраперитонеально не демонстрировало детектируемую эффективность даже в самой высокой дозе, 10 мг/кг.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[00110] Опасные для жизни сезонные и пандемические инфекции, вызываемые гриппом, остаются серьезным заболеванием, которое только в США убивает 40000 человек. Доступность сезонных вакцин не обеспечила устранение гриппа как значительной клинической проблемы. Существует только одно одобренное лекарственное средство от гриппа, которое применяют на практике, Тамифлю^®, однако грипп продемонстрировал сильную склонность к развитию устойчивости к Тамифлю^® и другим ингибиторам нейраминидазы. Более того, известно, что Тамифлю^® по существу теряет эффективность, если его вводят через 48 часов после появления симптомов.

[00111] Антитела, прицельно воздействующие на грипп, обеспечивают альтернативу вакцинам и могут быстро и эффективно лечить или предотвращать инфекцию, в то время как вакцинам обычно требуется несколько недель, чтобы индуцировать эффективную противовирусную активность. Наиболее привлекательными являются моноклональные антитела, реактивные в отношении основного белка, гемагглютинина, на поверхности вируса гриппа в области, называемой «стеблем» гемагглютинина, которая генетически стабильна и значительно не варьируется или совсем не варьируется от одного сезона к другому.

[00112] Было охарактеризовано множество антител, и они находятся на стадии разработки в качестве терапевтических антител к гриппу, в том числе на основе консервативных эпитопов указанного вируса. Некоторые антитела с перекрестной реактивностью прицельно воздействуют на гликопротеин гемагглютинин (НА), который вызывает наиболее устойчивые нейтрализующие антитела при вакцинации или естественном инфицировании. НА содержит две субъединицы НА1 и НА2, которые являются критическими компонентами в вирусной инфекции. MAb CR6261 представляет собой хорошо изученное антитело, которое, согласно сообщениям, связывается с вирусами H1 и другими подтипами (Н5) в пределах группы 1, и связывается на субъединице НА2 (Throsby М et al. (2008) PLоS ONE 3:e3942; Eckert DC et al. (2009) Science 324:246-251; Friesen RHE et al. (2010) PLoS ONE 5(2):el906; патент США 8192927). Согласно сообщениям, MAb CR8020 связывается с околомембранной областью НА2 как на вирусах Н3, так и на вирусах другого подтипа (Н7), которые представляют собой вирусы группы 2 (Eckert DC et al. (2011) Science 333:843-850). Согласно сообщениям, антитело FI6v3 от исследователей в Швейцарии обладает способностью связываться с эпитопом, присутствующим на вирусах как группы 1 (H1), так и группы 2 (Н3), однако FI6 продемонстрировал ограниченную эффективность у мышей (Corti D et al. (2011) Science 333:850-856). Palese и коллеги сообщили о защитных в широком спектре моноклональных антителах к вирусам гриппа Н3 при применении последовательной иммунизации у мышей различными гемагглютининами (Wang ТТ et al. (2010) PLoS Pathog 6(2):e1000796; заявка США 20110027270). С использованием данного подхода выделяли, антитело к H1, которое согласно сообщениям, демонстрирует реактивность широкого спектра (Tan GS et al. (2012) J Virol 86(11):6179-6188).

[00113] Терапевтическое лечение гриппа моноклональными антителами к НА зависит от дозы, а также требует более высоких доз при введении в более позднее время после инфицирования. Типичные терапевтические дозы НА-специфичных антител с широким спектром реактивности, вводимые интраперитонеально или внутривенно, предусматривают дозы в диапазоне от 2 мг/кг до 50 мг/кг для защиты от летального заражения. В более позднее время после инфицирования для достижения такого же эффекта необходимо введение доз в диапазонах выше >10 мг/кг. Средняя масса тела взрослого человека в Северной Америке составляет приблизительно 80,7 кг, и потребуется 807 мг антитела при введении в дозе 10 мг/кг. Два исследования 1 фазы моноклональных антител к гриппу, CR6261 и CR8020, проводимые в настоящее время Crucell Holland BV, оценивают безопасность и переносимость в однократных дозах, возрастающих с 1 мг/кг до 50 мг/кг (исследования NCT01406418 и NCT01756950 соответственно; clinical trials.gov). У мышей данные антитела требовали 15 мг/кг для защиты мышей от гибели (Friesen, RHE et al (2010) PLoS ONE 5(2):e1906); Ekiert DC et al (2011) Science 333:843-850). На основе этих дозируемых количеств для интраперитонеального или внутривенного введения, потребуются количества одного антитела около грамма или на уровне грамма на пациента, исходя из массы тела человека (примерно 70 кг). Это усугубляется потребностью любой терапии, направленной на несколько подтипов гриппа, в более, чем одном антителе для лечения трех различных циркулирующих подтипов гриппа (грипп А Н3, грипп А H1 и грипп В), и, таким образом, всего может потребоваться порядка 3 грамм антитела из расчета примерно один грамм каждого антитела. Такое большое количество антитела становится чрезмерно затратным и трудным для введения, и представляет собой главное препятствие при разработке терапевтических антител к гриппу.

[00114] Авторы настоящего изобретения нашли решение для значительного снижения количества антитела, более чем в 10 раз, при значительном сохранении и даже повышении эффективности. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что интраназальная доставка антител или, в более общем смысле, доставка антител путем ингаляции обеспечивает заметное и значительное повышение эффективности по сравнению с внутривенным или интраперитонеальным путем. Эффективное введение моноклональных антител к гриппу в дыхательные пути описано в USSN 61/782661 и PCT/US 2014/27939, содержание которых включено в настоящее описание посредством ссылки.

[00115] Удивительно, интраназальная (и/н) доставка нейтрализующих антител может значительно повышать терапевтическую эффективность более чем в 10 раз по сравнению с интраперитонеальным (и/п) или внутривенным (в/в) путем доставки с использованием принятой и известной модели гриппа у мышей. Сопоставимая эффективность может быть достигнута с применением менее одной десятой этой же дозы при введении интраназально, а не внутривенным или интраперитонеальным путем. В текущих терапевтических схемах лечения гриппа используют внутривенную доставку в качестве стандарта (ClinicalTrials.gov Идентификационный номер: NCT01390025, NCT01756950, NCT01406418). Данный подход к доставке является стандартом в данной области, поскольку не известна возможность извлечения пользы из нейтрализующих характеристик антитела. Подавляющее большинство исследований лекарственных средств на основе антител использует внутривенную или интраперитонеальную доставку, и не может установить, что интраназальная доставка нейтрализующих антител к гриппу будет повышать эффективность по сравнению с внутривенной или интраперитонеальной доставкой.

[00116] В предыдущих сообщениях об интраназальной доставке содержалась оценка поликлонального сывороточного гамма-глобулина IVIG или IgA-класса антител (антитела IgA по природе характерны для легких) (Akerfeldt S et al. (1973) Biochem Pharmacol 22:2911-2917; Ramisse F et al. (1998) Clin Exp Immmunol 111:583-587; Ye J et al. (2010) Clin Vaccine Immunol 17(9): 1363). Одна группа тестировала препарат антитела асцитной жидкости (С179) интраназальным путем и описала, что защитная интраназальная доставка (до заражения) была сопоставима с интраперитонеальной (Sakabe S et al. (2010) Antiviral Res 88(3):249-255). C179 проявляет низкую нейтрализующую активность против пандемического вируса H1N1 2009 года, но, согласно сообщениям, защищает мышей от инфекции.

[00117] В противоположность этому авторы настоящего изобретения обнаружили, что значительно повышенная эффективность не просто сопровождает любые перекрестно реактивные антитела к гриппу независимо от способа введения. Как правило, антитела, которые не нейтрализуют, при введении интраназально не демонстрируют эффективность против гриппа. Насколько известно, более ранние исследования не установили, что данный эффект можно более широко применять к антителам, проявляющим нейтрализующую активность in vitro, независимо от их вирусного эпитопа или белка-мишени. Более того, не требуется, чтобы антитела были перекрестно реактивными в отношении НА, поскольку штаммоспецифические антитела, которые нейтрализуют, будут демонстрировать повышенную эффективность при введении интраназально. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что нейтрализующие антитела (а не просто перекрестно реактивные антитела анти-НА) имеют важное значение для значительного снижения количества антитела, необходимого для достижения сопоставимой эффективности в зависимости от пути введения. В действительности, авторы настоящего изобретения обнаружили, что происходит обратное при применении перекрестно реактивных антител анти-НА, которые не являются нейтрализующими. Терапевтическое применение данных перекрестно реактивных не нейтрализующих антител анти-НА приводит к заметному снижению терапевтической эффективности при лечении мышей интраназально; тем не менее, при введении интраперитонеальным или внутривенным путем, эти антитела демонстрируют значительную эффективность.

[00118] Без конкретного теоретического обоснования, возможный механизм в основе этого явления заключается в том, что интраназальная доставка позволяет достичь уровня антитела IgG в слизистой оболочке дыхательных путей, который позволяет использовать нейтрализующую способность антигенсвязывающего центра антитела, тогда как внутривенная или интраперитонеальная доставка антитела зависит от Fc. В дыхательных путях ингибиторный механизм основан на нейтрализующих характеристиках антитела и Fc-зависимое действие сильно ограничено. При введении антитела IgG интраперитонеально или внутривенно количество антитела, достигающее данное пространство в дыхательных путях, является слишком низким для получения пользы от нейтрализующего действия указанного антитела. Например, когда нейтрализующие антитела вводят интраперитонеально или внутривенно, наблюдаемый терапевтический эффект исходит главным образом из эффекторной функции антитела. Авторы настоящего изобретения обнаружили сопоставимые уровни эффективности нейтрализующих или не нейтрализующих антител при введении интраперитонеально или внутривенно, но не интраназально. Для дополнительной иллюстрации того, что данный эффект зависит от нейтрализации, антитела к белку М2 не демонстрируют нейтрализацию in vitro и способны только демонстрировать Fc-опосредуемые эффекты. Предыдущая работа с использованием антител, направленных на ионный канал М2 (более генетически консервативная молекула, чем НА), была перспективной в доклинических моделях, и завершила исследования I фазы (TCN-032 от Theraclone; NCT01390025, NCT01719874; Grandea AG et al. (2010) Proc Natl Acad Sci USA 107(28): 12658-12663). Антитела к белку M2 не могут нейтрализовать вирус, но могут демонстрировать документально подтвержденную терапевтическую эффективность, опосредуемую эффекторной функцией (Wang, R. et al. (2008) Antiviral research 80:168-177; Grandea, A. G., 3^rd et al. (2010) Proc Natl Acad Sci USA 107(28): 12658-12663). Авторы настоящего изобретения полагают, что как нейтрализующие, так и не нейтрализующие антитела при введении интраперитонеально или внутривенно функционируют главным образом через эффекторную функцию подобно антителам, прицельно воздействующим на М2. Белок М2 значительно менее распространен, чем НА, а также не выступает из поверхности. Антитела к НА могут нейтрализовать вирус, обеспечивая возможность дальнейшего повышения эффективности. Таким образом, антитела к НА, как правило, более терапевтически эффективны, чем антитела анти-М2. Однако антитела, которые не являются нейтрализаторами и все же прицельно воздействуют на НА, могут демонстрировать сопоставимые с нейтрализующими антителами уровни эффективности при введении интраперитонеально, что позволяет предположить, что данный путь доставки не позволяет извлечь пользу из сильного эффекта, который можно использовать при введении интраназально. Более того, доставка нейтрализующих Fab интраназально, а не интраперитонеально обуславливает терапевтическую эффективность. Не нейтрализующие Fab, вводимые интраназально, не демонстрируют терапевтическую эффективность. В целом, только нейтрализующие антитела, вводимые интраназально, демонстрируют повышенную эффективность. Продолжая данное наблюдение, это явление, повышенная эффективность за счет легочной доставки, может возникать для нейтрализующих антител, прицельно воздействующих на другие белки гриппа (например, нейраминидаза), и нейтрализующих антител к другим респираторным патогенам (например, паливизумаб для респираторно-синцитиального вируса (RSV)). Данная повышенная эффективность или уровень повышенной эффективности может зависеть от жизненного цикла, включающего репликацию в апикальной части, данной подгруппы респираторных патогенов, при этом в апикальном пространстве эти вирусы чувствительны к нейтрализующей способности данных антител. Поскольку доставка антител как интраназальным, так и интраперитонеальным/внутривенным путями может быть по-разному эффективна, возможно, что использование обоих путей в комбинации позволит использовать максимальное терапевтическое действие нейтрализующего антитела. Данный подход будет обеспечивать максимальную эффективность за счет использования повышенной нейтрализующей активности через интраназальный путь и повышенной Fc-зависимой активности через интраперитонеальный/внутривенный путь.

[00119] Данные примеры демонстрируют эффективность при интраназальном введении в низких дозах для нейтрализующих антител, включая известные антитела и недавно выделенные антитела. Эффективность при интраназальном введении обеспечивается для многочисленных различных и известных антител в качестве типичных антител, включая антитела CR6261, CR8020, CR9114, 5А7, mAb53(TRL053), mAb579(TRL579), TRL845, TRL846, TRL847, TRL848, TRL849, TRL854, TRL809 и TRL832. Такая активность и эффективность не была продемонстрирована ранее, несмотря на множество исследований, например, CR6261 и CR8020, включая доклинические исследования. Согласно настоящему изобретению проведена оценка множества различных антител, в том числе известных и недавно выделенных антител, и они эффективны при введении в дыхательные пути.

[00120] Настоящее изобретение относится к новой и уникальной комбинации антител, которые эффективны против вирусов гриппа А и В, и могут быть получены и введены совместно без нежелательных взаимодействий и с заметной эффективностью состава. Антитела в комбинации согласно настоящему изобретению направлены на различные, но все клинически значимые подтипы, включая подтипы H1, Н3, Н5 вируса гриппа А, а также линии Ямагата и Виктория гриппа В. Таким образом, согласно настоящему изобретению предложена общеприменимая комбинация и коктейль антител, при этом уникальную комбинацию или коктейль антител, способные нейтрализовать значимые циркулирующие вирусы гриппа, можно применять в способах и композициях для введения в дыхательные пути и для лечения или предотвращения вируса гриппа, инфекции, вызываемой гриппом, и/или передачи гриппа путем введения указанной комбинации или коктейля антител согласно настоящему изобретению через дыхательные пути, например, интраназально или путем доставки в слизистую легких или бронхов. Благодаря уникальной и подходящей эффективности комбинации или коктейлей антител согласно настоящему изобретению, клиническая оценка или специфическая диагностика вируса гриппа или подтипа не является необходимой или не требуется перед введением или применением. Предусмотрены фрагменты, производные или варианты антител. В настоящем документе показано, что фрагменты антител, включая Fab, являются эффективными согласно настоящему изобретению. В соответствии с одним из аспектов вариантов реализации, описанных в настоящем документе, Fab-фрагменты антител активны и эффективны при введении через дыхательные пути (например, интраназально или путем ингаляции), и неэффективны при введении интраперитонеально или внутривенно. Эталонный Fab эффективен in vivo в составе для ингаляций, как показано на фиг. 25. В некоторых вариантах реализации предложен антигенсвязывающий фрагмент, представляющий собой scFv.

[00121] В некоторых вариантах реализации предложены антитела, антигенсвязывающие фрагменты, композиции и способы для применения для пассивной иммунизации против гриппа. В некоторых вариантах реализации предложены комбинации антител, композиции антител и способы для лечения или профилактики вируса гриппа. В соответствии с некоторыми аспектами предложены композиции, содержащие моноклональные антитела, направленные против гриппа А и В, которые подходят для введения системно или непосредственно в дыхательные пути, в том числе путем введения в дыхательные пути, например, путем интраназального или ингаляционного введения. Предложены композиции и способы для лечения или профилактики путем введения в дыхательные пути антитела (антител) или комбинирования интраназального или ингаляционного введения с интраперитонеальным или внутривенным введением антител.

[00122] Недавно были обнаружены консервативные эпитопы в молекуле гемагглютинина (НА). Было несколько сообщений о выделении и получении характеристик моноклональных антител (MAb) человека, способных распознавать и нейтрализовать разное количество подтипов вируса гриппа А. Многие из них прицельно воздействуют на гликопротеин гемагглютинин (НА), который вызывает наиболее устойчивые нейтрализующие антитела при вакцинации или естественном инфицировании. НА содержит две субъединицы НА1 и НА2, которые являются критическими компонентами в вирусной инфекции. НА1 вовлечена в присоединение к сиаловой кислоте рецептора клетки-хозяина, и НА2 опосредует слияние вирусной и эндосомной мембран.

[00123] На основе научно-исследовательского и клинического опыта на сегодняшний день с множеством рекомбинантных антител, включая более двадцати моноклональных антител, которые были клинически одобрены в Соединенных Штатах (Newsome BW and Ernstoff MS (2008) Br J Clin Pharmacol 66(1):6-19), точно установлено, что дозы для современной терапии антителами составляют несколько мг/кг на дозу. Например, панитумумаб, антитело анти-EGFR полностью человеческого происхождения, одобренный для лечения рака толстой и прямой кишки, вводят внутривенно в дозе 6 мг/кг в течение 1- часа каждые 2 недели. В случае средней массы тела человека, равной 70 кг, это составляет 420 мг антитела на дозу.

[00124] До сих пор ни одно моноклональное антитело не было клинически одобрено для гриппа. Отчеты по исследованиям с использованием антител к гриппу у животных показывают, что эффективный диапазон доз данных антител при введении внутривенно или интраперитонеально в терапевтических или профилактических целях, предусматривает диапазоны от 1 мг/кг до 100 мг/кг. В клинических исследованиях I фазы в США с использованием некоторых из данных антител (CR6261, CR8020, TCN-032) используют увеличение дозы в исследованиях безопасности и переносимости с 2 мг/кг и вплоть до 50 мг/кг (clinicaltrials.gov; NCT01390025, NCT01406418, NCT01756950). Последующие исследования IIа фазы с использованием данных антител проводили в самых высоких дозах I фазы (например, 30 мг/кг или 50 мг/кг). Данное большое количество вещества представляет собой главное препятствие для разработки этой новой линии лекарственных средств на основе антител. В частности, дозы для системного введения в этом диапазоне обуславливают значительную стоимость вещества, а также требуют времени, пространства и расходов на персонал, связанных с инфузией. Таким образом, существует настоятельная потребность либо в повышении эффективности, и/либо в снижении количества вещества для того, чтобы терапия или профилактика гриппа антителами была эффективной альтернативой.

[00125] Хотя грипп В несколько менее распространен, чем грипп А, он, тем не менее, представляет собой серьезное заболевание. В целом, вирусы гриппа В классифицируются на две линии: подобные В/Виктория/2/87 и подобные В/Ямагата/16/88. Вирусы гриппа В отличаются от вирусов гриппа А, т.к. они не содержат белок, называемый основным 1-F2 (PB1-F2), но содержат дополнительные белки, которые отсутствуют у вируса гриппа А, такие как гликопротеин В (NB). Также существуют дополнительные отличия. Однако НА-белки штаммов гриппа В гомологичны некоторым НА-белкам гриппа А в той же степени, что и друг другу.

[00126] Белок вируса гриппа гемагглютинин (НА) содержит глобулярный головной домен, который крайне неоднороден среди штаммов гриппа, и область-стебель, содержащую сайт слияния, который необходим для проникновения в клетки. НА присутствует в виде тримера на оболочке вируса. Нерасщепленная форма белка гемагглютинина (НА₀) активируется путем расщепления трипсином на части HA₁ и НА₂ для обеспечения вирулентности сайтом слияния. Две отщепленные части остаются связанными дисульфидными связями, но претерпевают конформационное изменение в среде эндосомного компартмента клетки-хозяина с низким рН, которое приводит к слиянию вирусной мембраны и мембраны клетки-хозяина.

[00127] Сайт расщепления содержит консенсусную последовательность, которая является общей для различных штаммов как гриппа А, так и гриппа В. Нерасщепленный тример белка гемагглютинина (НА₀) называется инактивированной формой, тогда как при расщеплении на части HA₁ и НА₂, белок гемагглютинин называется находящимся в активированной форме.

[00128] Bianchi, Е., et al., J. Virol. (2005) 79:7380-7388 описывают «универсальную» вакцину против гриппа В на основе консенсусной последовательности данного сайта расщепления, при этом пептид, содержащий данный сайт, мог вызывать выработку антител у мышей при конъюгации с комплексом белков наружной мембраны Neisseria meningitidis. Также были описаны моноклональные антитела (mAb), которые, по-видимому, связываются с консенсусной последовательностью. Кроме того, у мышей наблюдали успешный пассивный перенос антисыворотки. Другие вакцины уровня техники, такие как те, которые описаны в WO 2004/080403, содержащие пептиды, полученные из белков гриппа М2 и/или НА, индуцируют антитела, которые либо малоэффективны, либо не эффективны в отношении всех штаммов.

[00129] Антитела, описанные в данной области техники, которые связывают область-стебель НА, включают антитела, разработанные Crucell, такие как CR6261 и CR8020, описанные в WO 2008/028946 ('946); в Throsby, М., et al., PLoS One (2008) 3:e3942; в Ekiert, D.С., et al., Science (2011) 333:843-850; и в Sui, J., et al., Nat. Struct. Mol. Biol. (2009) 16:265-273. Согласно вышеупомянутой публикации PCT '946 данные антитела связываются не только с H5N1, но также с Н2, Н6, Н9 и H1. Также было разработано mAb к консервативному антигену М2Е, описанное Grandea, A.G., et al., PNAS USA (2010) 107:12658-12663. M2E представляет собой кодируемый вирусом белок, который появляется на поверхности инфицированных клеток, а также является мишенью для амантадина и римантадина. Лекарственная устойчивость к данным противовирусным агентам стала широко распространена, что позволяет предположить, что данная мишень не выполняет необходимую функцию.

[00130] Дополнительное антитело уровня техники было описано Lanzavecchia Group: Corti, D., et al., Science (2011) 333:850-856, которое связывает и нейтрализует штаммы гриппа А как группы 1, так и группы 2, но активность не столь высока, как у тех антител, которые описаны в настоящем документе. Кроме того, mAb, иммунореактивное в отношении области-стебля как гриппа А, так и гриппа В, описано в Dreyfus, С., et al., Science (2012) 337:1343-1348, но оно не обладает детектируемой нейтрализующей активностью. Эти же авторы описали два mAb, связывающие головную группу НА, одно из которых демонстрирует высокую вариабельность аффинности и активности в отношении штаммов из двух клад гриппа В, а другое из которых демонстрирует ~1 нМ аффинность. Эти результаты показывают, что трудно получить mAb к гриппу В с широким спектром нейтрализации.

[00131] В публикации заявки PCT WO 2011/160083, содержание которой включено в настоящее описание посредством ссылки, описаны моноклональные антитела, полученные из клеток человека и подходящие для применения в пассивных вакцинах. Указанные антитела демонстрируют высокие значения аффинности связывания с кладой H1 вируса гриппа, которая относится к группе 1, и некоторые антитела также демонстрируют высокие значения аффинности к Н9, также в группе 1 и/или к Н7 в группе 2, и/или Н2 в группе 1. Некоторые из описанных антител связывают только инактивированную форму тримера, предположительно, в консенсусной области расщепления, тогда как другие могут связывать активированный белок гемагглютинин, который уже был расщеплен.

[00132] В публикации PCT № WO 2013/086052, содержание которой включено в настоящее описание посредством ссылки, описана группа антител, включая биспецифические антитела, которые связываются с эпитопом в данной консенсусной области и связываются с большим числом вирусов гриппа А как группы 1, так и группы 2, в том числе H1, Н2, Н5, Н6, Н8, Н9, Н11, Н13 и Н16 в группе 1, и Н3 и Н7 в группе 2. Кроме того, в недавней публикации Yasugi, М., et al., PLoS Pathogens (2013) 9: опубликованной в интернете как el003150, страницы 1-12, описаны mAb человека, нейтрализующие вирус гриппа В, в частности, mAb, обозначенное 5А7, которое, согласно сообщениям, демонстрирует терапевтическую эффективность у мышей даже при введении через 72 часа после инфицирования. Сообщали, что K_D для 5А7 составляла 5 нМ в отношении единственного тестируемого штамма, с идентифицированным эпитопом в высоко консервативной С-концевой области-стебле; сообщаемая активность была сопоставимой в отношении всех штаммов гриппа В. Этот результат показывает, что трудно получить обладающее высокой аффинностью (суб-нМ) mAb к гриппу В.

[00133] В некоторых вариантах реализации предложены антитела или аналоговые связывающие агенты, подходящие как для профилактики, так и для терапии. Таким образом, их можно применять для защиты субъекта от инфекции, вызываемой вирусом, а также для лечения субъектов, которые уже подверглись воздействию или инфицированы вирусом гриппа В. Субъекты, представляющие наибольший конечный интерес, представляют собой людей, и для применения у субъектов-людей предпочтительны человеческие формы или гуманизированные формы связывающих агентов, которые представляют собой традиционные природные антитела или их иммунореактивные фрагменты. Однако антитела, имеющие соответствующие характеристики связывания, обусловленные определяющими комплементарность областями (CDR), при применении в исследованиях у лабораторных животных могут сохранять не относящиеся к человеку характеристики. Антитела, применяемые в исследованиях в примерах ниже, несмотря на то, что указанные исследования проводят у мышей, тем не менее, содержат как вариабельные, так и константные области человеческого происхождения.

Определения

[00134] Согласно настоящему изобретению могут быть использованы традиционные методики молекулярной биологии, микробиологии и технологии рекомбинантных ДНК, которые находятся в рамках компетенции специалиста в данной области техники. Такие методики полностью описаны в литературе. См., например, Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III [Ausubel, R.M., ed. (1994)]; "Cell Biology: A Laboratory Handbook" Volumes I-III [J.E. Celis, ed. (1994))]; "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III [Coligan, J.E., ed. (1994)]; "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait ed. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)]; "Transcription And Translation" [B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)]; "Animal Cell Culture" [R.I. Freshney, ed. (1986)]; "Immobilized Cells And Enzymes" [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984).

[00135] Следовательно, в настоящем документе следующие термины будут иметь определения, приведенные ниже, если контекст явным образом не предусматривает иное.

[00136] В настоящем описании термин «антитело» или «связывающий агент» относится к антителам, их иммунореактивным фрагментам или антигенсвязывающим фрагментам, а также к моноспецифическим моноклональным антителам, полиспецифическим антителам, таким как биспецифические моноклональные антитела или триспецифические моноклональные антитела, выделенным моноклональным антителам, рекомбинантным моноклональным антителам и выделенным моноклональным антителам человека или гуманизированным моноклональным антителам, или их антигенсвязывающим фрагментам, молекуле, содержащей две тяжелые цепи иммуноглобулина и две легкие цепи иммуноглобулина, а также включает иммунореактивные фрагменты или антигенсвязывающие фрагменты традиционных антител, даже в отдельных случаях избыточного упоминания «фрагментов». Таким образом, антитела включают Fab-фрагменты, одноцепочечные F_v-антитела, содержащие по существу только вариабельные области, биспецифические или триспецифические антитела и их различные фрагментированные формы, которые, тем не менее, сохраняют иммуноспецифичность, и белки в целом, которые имитируют активность «природных» антител за счет содержания аминокислотных последовательностей или модифицированных аминокислотных последовательностей (т.е. псевдопептиды), почти соответствующих активности вариабельных областей более традиционных встречающихся в природе антител. Таким образом, данный термин включает фрагменты, производные, функциональные эквиваленты антител и гомологи антител, включая любой полипептид, содержащий связывающий домен иммуноглобулина, будь то природный или полностью, или частично синтетический, например, рекомбинантный или сконструированный иным образом. Следовательно, указанный термин включает химерные молекулы, содержащие связывающий домен иммуноглобулина или эквивалент, слитый с другим полипептидом. Клонирование и экспрессия химерных антител описаны в ЕР-А-0120694 и ЕР-А-0125023, и патентах США №№4816397 и 4816567.

[00137] Термин «антитело» также включает иммуноглобулин, будь то природный или частично, или полностью полученный путем синтеза. Указанный термин также включает любой полипептид или белок, содержащий связывающий домен, который представляет собой связывающий домен антитела или гомологичен ему. Данный термин также предполагает CDR-привитые антитела. «Антитело» представляет собой любой иммуноглобулин, включая антитела и их фрагменты, который связывает конкретный эпитоп. Указанный термин включает поликлональные, моноклональные и химерные антитела; последние из упомянутых более подробно описаны в патентах США №№4816397 и 4816567. Термин «антитело (антитела)» включает молекулу иммуноглобулина (Ig) дикого типа, как правило, содержащую четыре полноразмерные полипептидные цепи, две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи, или эквивалентный гомолог Ig (например, нанотело верблюда, которое содержит только тяжелую цепь); включая их полноразмерные функциональные мутанты, варианты или производные, которые сохраняют необходимые свойства связывания эпитопа, характерные для молекулы Ig, и включая антитела с двойной специфичностью, биспецифические, полиспецифические антитела и антитела с двойным вариабельным доменом; молекулы иммуноглобулина могут быть любого класса (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY) или подкласса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2). Предпочтительные антитела относятся к IgG-классу.

[00138] «Антигенсвязывающий центр антитела» представляет собой ту структурную часть молекулы антитела, состоящую из вариабельных и гипервариабельных областей тяжелой и легкой цепи, которая специфично связывает антиген.

[00139] В настоящем описании термин «молекула антитела» в различных грамматических формах предполагает как интактную молекулу иммуноглобулина, так и иммунологически активную часть молекулы иммуноглобулина.

[00140] В настоящем описании термин «моноклональное антитело» относится к антителу, полученному из популяции по существу однородных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными и/или связывают одинаковый эпитоп (или эпитопы), за исключением возможных вариантных антител, например, содержащих встречающиеся в природе мутации или образующихся при получении препарата моноклональных антител, при этом такие варианты обычно присутствуют в незначительных количествах. Моноклональное антитело представляет собой антитело, демонстрирующее один тип антигенсвязывающего центра антитела, способный к иммунной реакции с конкретным антигеном. Таким образом, моноклональное антитело, как правило, демонстрирует одиночную аффинность связывания в отношении какого-либо антигена, с которым оно вступает в иммунную реакцию. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые, как правило, содержат разные антитела, направленные против разных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело в препарате моноклональных антител направлено против одной детерминанты на антигене. Однако моноклональное антитело может быть полиспецифическим, если оно содержит молекулу антитела, содержащую множество антигенсвязывающих центров антитела, каждый из которых иммуноспецифичен в отношении отличного антигена; например, биспецифическое (химерное) моноклональное антитело. Определение «моноклональное» указывает на характер антитела, как антитела, полученного по существу из однородной популяции антител, и его не следует рассматривать как требующее получения антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела для применения согласно настоящему изобретению могут быть получены различными способами, включая, но не ограничиваясь ими, способ на основе гибридом, способы на основе рекомбинантных ДНК, способы фагового отображения и способы с использованием трансгенных животных, содержащих все или часть локусов иммуноглобулина человека; такие способы и другие типичные способы получения моноклональных антител описаны в настоящем документе.

[00141] Термин «антигенсвязывающий фрагмент» и его синонимы «иммунореактивный фрагмент», «связывающий фрагмент» и «фрагмент антитела» относятся к получаемому под воздействием ферментов, синтетическому или рекомбинантному «сконструированному» полипептиду или гликопротеину, который специфично связывает антиген с образованием комплекса. Термин «фрагмент антитела» относится к молекуле, отличной от интактного антитела, которая содержит часть интактного антитела, связывающую антиген, с которым связывается указанное интактное антитело. Примеры «сконструированных» фрагментов антител включают, но не ограничиваются ими, Fv, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂; диатела; линейные антитела; одноцепочечные молекулы антител (например, scFv); и полиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител. Кроме того, фрагменты антител содержат одноцепочечные полипептиды, обладающие характеристиками вариабельного домена тяжелой цепи (VH-домена), т.е. они способны к сборке с вариабельным доменом легкой цепи (VL-доменом), или характеристиками VL-домена, т.е. они способны к сборке с VH-доменом с образованием функционального антигенсвязывающего центра и, таким образом, обладают свойством связывания антигена, характерным для полноразмерных антител. Термин «фрагмент антитела» включает молекулу, содержащую по меньшей мере одну полипептидную цепь, которая не является полноразмерной, в том числе (i) Fab-фрагмент, который представляет собой моновалентный фрагмент, состоящий из вариабельного домена легкой цепи (VL), вариабельного домена тяжелой цепи (VH), константного домена легкой цепи (CL) и константного домена 1 тяжелой цепи (CH1); (ii) F(ab')2-фрагмент, который представляет собой двухвалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, связанные дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) часть тяжелой цепи Fab (Fd)-фрагмента, состоящую из VH- и СН1-доменов; (iv) вариабельный фрагмент (Fv), состоящий из VL- и VH-доменов одного плеча антитела; (v) представляющий собой доменное антитело (dAb) фрагмент, содержащий один вариабельный домен (Ward, E.S. et al., Nature 341, 544-546 (1989)); (vi) антитело верблюда; (vii) выделенную определяющую комплементарность область (CDR); (viii) одноцепочечный Fv-фрагмент, в котором VH-домен и VL-домен связаны пептидным линкером, обеспечивающим ассоциацию этих двух доменов с образованием антигенсвязывающего центра (Bird et al., Science, 242, 423-426, 1988; Huston et al, PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988); (ix) диатело, которое представляет собой двухвалентное биспецифическое антитело, в котором VH- и VL-домены экспрессированы в одной полипептидной цепи, но с использованием линкера, который является слишком коротким для того, чтобы сделать возможным спаривание между двумя доменами в одной цепи, что тем самым заставляет домены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и образовывать два антигенсвязывающих центра (WO 94/13804; P. Holliger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448, (1993)); и (x) линейное антитело, содержащее пару тандемных Fv-сегментов (VH-CH1-VH-CH1), которые вместе с комплементарными полипептидами легкой цепи образуют пару антигенсвязывающих областей; (xi) поливалентные фрагменты антител (димеры, тримеры и/или тетрамеры scFv (Power and Hudson, J Immunol. Methods 242: 193-204 9 (2000)); (xii) миниантитело, которое представляет собой двухвалентную молекулу, состоящую из scFv, слитого с константными доменами иммуноглобулина, СН3 или СН4, при этом указанные константные СН3- или СН4-домены служат в качестве доменов димеризации (Olafsen Т et al. (2004) Prot Eng Des Sel 17(4):315-323; Hollinger P and Hudson PJ (2005) Nature Biotech 23(9): 1126-1136); и (xiii) другие неполноразмерные части тяжелых и/или легких цепей, или их мутанты, варианты или производные отдельно или в любой комбинации. Известны одноцепочечные Fab (scFAb) и они описаны, в том числе в US 20070274985.

[00142] Антигенсвязывающие фрагменты включают Fab-фрагменты; А(ab')₂-фрагменты; Fd-фрагменты; Fv-фрагменты; одноцепочечные молекулы Fv (scFv); dAb-фрагменты; и минимальные распознающие единицы, состоящие из аминокислотных остатков, которые имитируют гипервариабельную область антитела (CDR). Другие сконструированные молекулы, такие как диатела, триатела, тетратела и миниантитела, также включены в термин «антигенсвязывающий фрагмент» в настоящем описании.

[00143] Антитела, используемые и упомянутые в настоящем описании в комбинациях, отличные от антител, описанных в начале настоящего документа, и представляющие собой новые полипептидные соединения, могут включать те антитела, которые содержат описанные и общеизвестные аминокислотные последовательности, и включают антитела, белки, полипептиды, содержащие модификации указанных известных или доступных аминокислотных последовательностей и сохраняющие или демонстрирующие по существу эквивалентную активность, в том числе нейтрализующую цель активность или распознающую и связывающую активность. Соответственно, также предусмотрены белки, демонстрирующие по существу эквивалентную или измененную активность. Данные модификации могут быть преднамеренными, например, такие как модификации, полученные путем сайт-направленного мутагенеза, или могут быть случайными, такие как модификации, полученные вследствие мутаций в хозяевах, которые являются «производителями» комплекса или его указанных субъединиц. Антитела включают в своем объеме белки, специально указанные в настоящем описании, а также все по существу гомологичные аналоги и аллельные вариации, такие как последовательности, обладающие по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности специально описанному или широко известному антителу.

[00144] Аминокислотные остатки, описанные в настоящем документе, предпочтительно находятся в «L»-изомерной форме. Однако остатки в «D»-изомерной форме могут заменять любой остаток L-аминокислоты при сохранении полипептидом желаемого функционального свойства иммуноглобулинового связывания. NH₂ относится к свободной аминогруппе, присутствующей на аминоконце полипептида. COOH относится к свободной карбоксигруппе, присутствующей на карбоксиконце полипептида. В соответствии со стандартной номенклатурой полипептидов, J. Biol. Chem., 243:355259 (1969), обозначения аминокислотных остатков представлены в следующей таблице 1 соответствия:

[00145]

[00146] Следует отметить, что все последовательности аминокислотных остатков представлены в настоящем документе формулами, левая и правая ориентация которых имеет традиционное направление от аминоконца к карбоксиконцу. Таблица 1 представлена для соотнесения друг с другом трехбуквенных и однобуквенных обозначений, которые могут попеременно встречаться в настоящем документе.

[00147] Ниже приведены примеры различных групп аминокислот: аминокислоты с неполярными R-группами: аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, триптофан, метионин; аминокислоты с незаряженными полярными R-группами: глицин, серии, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин, глутамин; аминокислоты с заряженными полярными R-группами (отрицательно заряженными при рН 6,0): аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота; основные аминокислоты (положительно заряженные при рН 6,0): лизин, аргинин, гистидин (при рН 6,0); еще одна группа может представлять собой аминокислоты с фенильными группами: фенилаланин, триптофан, тирозин.

[00148] Другая группа может быть выделена на основе молекулярной массы (т.е. размера R-групп):

Глицин 75 Глутамин 146 Алании 89 Лизин 146 Серин 105 Глутаминовая кислота 147 Пролин 115 Метионин 149 Валин 117 Гистидин (при рН 6,0) 155 Треонин 119 Фенилаланин 165 Цистеин 121 Аргинин 174 Лейцин 131 Тирозин 181 Изолейцин 131 Триптофан 204 Аспарагин 132 Аспарагиновая кислота 133

[00149] Наиболее предпочтительные консервативные замены аминокислот представляют собой:

- Arg на Lys и наоборот так, что может сохраняться положительный заряд;

- Asp на Glu и наоборот так, что может сохраняться отрицательный заряд;

- Thr на Ser так, что может сохраняться свободный -ОН; и

- Asn на Gln так, что может сохраняться свободная NH₂-группа.

[00150] Замены аминокислот могут быть также введены для замены на аминокислоту с наиболее предпочтительным свойством. Например, Cys может быть введен в качестве потенциального сайта для образования дисульфидных мостиков с другим Cys. His может быть введен в качестве особо «каталитического» центра (т.е. His может выступать в качестве кислоты или основания, и представляет собой самую распространенную аминокислоту в биохимическом катализе). Pro может быть введен ввиду его особенно плоской структуры, которая индуцирует бета-изгибы в структуре белка.

[00151] Две аминокислотные последовательности являются «по существу гомологичными», когда по меньшей мере примерно 70% аминокислотных остатков (предпочтительно, по меньшей мере примерно 80% и в более конкретных вариантах реализации по меньшей мере примерно 90 или 95%, по меньшей мере примерно 98% или меньшей мере примерно 99% идентичность последовательности) являются идентичными или представляют собой консервативные замены. В некоторых вариантах реализации предложена по существу гомологичная последовательность, содержащая одну или более консервативных замен аминокислот.

[00152] Нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела, применяемые согласно настоящему изобретению, можно использовать для получения и/или продуцирования антител или их активных фрагментов, применяемых в вариантах реализации, описанных в настоящем документе. Векторы, содержащие такие нуклеиновые кислоты, можно применять для экспрессии или выделения антител, предложенных или применяемых согласно настоящему изобретению.

[00153] «Репликон» представляет собой любой генетический элемент (например, плазмида, хромосома, вирус), функционирующий как автономная единица репликации ДНК in vivo, т.е. способная к репликации под собственным контролем.

[00154] «Вектор» представляет собой репликон, такой как плазмида, фаг или космида, к которому может быть присоединен другой сегмент ДНК для осуществления репликации данного присоединенного сегмента.

[00155] Термин «молекула ДНК» относится к полимерной форме дезоксирибонуклеотидов (аденин, гуанин, тимин или цитозин) либо в одноцепочечной форме, либо в виде двухцепочечной спирали. Данный термин относится только к первичной и вторичной структуре молекулы, и не ограничивает ее какими-либо конкретными третичными формами. Таким образом, данный термин включает двухцепочечную ДНК, обнаруживаемую, в том числе в линейных молекулах ДНК (например, фрагменты рестрикции), вирусах, плазмидах и хромосомах. При рассмотрении структуры конкретных двухцепочечных молекул ДНК последовательности могут быть описаны в настоящем документе согласно стандартному представлению только последовательности в направлении 5'-3' вдоль нетранскрибируемой цепи ДНК (т.е. цепи, имеющей последовательность, гомологичную мРНК).

[00156] Термин «точка начала репликации» относится к тем последовательностям ДНК, которые участвуют в синтезе ДНК.

[00157] «Кодирующая последовательность» ДНК представляет собой двухцепочечную последовательность ДНК, которая находясь под контролем соответствующих регуляторных последовательностей, транскрибируется и транслируется в полипептид in vivo. Границы кодирующей последовательности определяются стартовым кодоном на 5' (амино)-конце и терминирующим трансляцию кодоном на 3' (карбокси)-конце. Кодирующая последовательность может включать, но не ограничивается ими, последовательности прокариот, кДНК от мРНК эукариот, последовательности геномной ДНК от ДНК эукариот (например, млекопитающего) и даже синтетические последовательности ДНК. Сигнал полиаденилирования и терминирующая транскрипцию последовательность, как правило, будут расположены в направлении 3' относительно кодирующей последовательности.

[00158] Контролирующие транскрипцию и трансляцию последовательности представляют собой регуляторные последовательности ДНК, такие как промоторы, энхансеры, сигналы полиаденилирования, терминаторы и т.п., которые обеспечивают экспрессию кодирующей последовательности в клетке-хозяине.

[00159] «Промоторная последовательность» или «промотор» представляет собой регуляторную область ДНК, способную связывать РНК-полимеразу в клетке и инициировать транскрипцию кодирующей последовательности в прямом направлении (3'-направлении). Для целей определения вариантов реализации, описанных в настоящем документе, промоторная последовательность ограничена на 3'-конце сайтом инициации транскрипции и простирается в обратном направлении (5'-направлении), и включает минимальное число оснований или элементов, необходимых для инициации транскрипции на детектируемых уровнях выше фонового. В пределах промоторной последовательности располагается сайт инициации транскрипции (удобно определяемый путем картирования с помощью нуклеазы S1), а также белок-связывающие домены (консенсусные последовательности), ответственные за связывание РНК-полимеразы. Эукариотические промоторы зачастую, но не всегда, содержат «ТАТА»-боксы и «САТ»-боксы. В дополнение к консенсусным последовательностям -10 и -35 прокариотические промоторы содержат последовательности Шайна-Дальгарно.

[00160] «Контролирующая экспрессию последовательность» является формой регуляторной последовательности и представляет собой последовательность ДНК, которая контролирует и регулирует транскрипцию и трансляцию другой последовательности ДНК. Кодирующая последовательность находится «под контролем» контролирующих транскрипцию и трансляцию последовательности в клетке, когда РНК-полимераза транскрибирует указанную кодирующую последовательность в мРНК, которая затем транслируется в белок, кодируемый кодирующей последовательностью.

[00161] Клетка была «трансформирована» экзогенной или гетерологичной ДНК, когда такая ДНК была введена в указанную клетку. Трансформирующая ДНК может быть или может не быть интегрирована (ковалентно соединена) в хромосомную ДНК, составляющую геном клетки. Например, в прокариотических клетках, клетках дрожжей и млекопитающих трансформирующая ДНК может быть расположена на эписомном элементе, таком как плазмида. Что касается эукариотических клеток, стабильно трансформированная клетка представляет собой клетку, в которой трансформирующая ДНК была интегрирована в хромосому, в результате чего она наследуется дочерними клетками через репликацию хромосомы. Данная стабильность демонстрируется способностью эукариотической клетки создавать линии или клоны клеток, состоящие из популяции дочерних клеток, содержащих трансформирующую ДНК. «Клон» представляет собой популяцию клеток, полученных из одной клетки или общего предшественника путем митоза. «Линия клеток» представляет собой клон первичной клетки, способный к стабильному росту in vitro с образованием множества поколений.

[00162] Две последовательности ДНК являются «по существу гомологичными», когда по меньшей мере примерно 75% (предпочтительно, по меньшей мере примерно 80% и наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно 90% или 95%) нуклеотидов совпадают на протяжении определенной длины указанных последовательностей ДНК. Последовательности, которые являются по существу гомологичными, могут быть идентифицированы путем сравнения указанных последовательностей с использованием стандартного программного обеспечения, доступного в банках данных последовательностей, или в эксперименте с саузерн-блот-гибридизацией, например, в жестких условиях, определенных для данной конкретной системы. Определение подходящих условий гибридизации находится в рамках компетенции специалиста в данной области техники. См., например, Maniatis et al. выше; DNA Cloning, Vols. I & II выше; Nucleic Acid Hybridization выше.

[00163] Следует понимать, что объем настоящего изобретения также включает последовательности ДНК, кодирующие антитела согласно настоящему изобретению или применяемые согласно настоящему изобретению, которые кодируют антитело, полипептид или его активный фрагмент, имеющие одинаковую аминокислотную последовательность, но которые вырождаются в исходную или известную кодирующую последовательность. Термин «вырождаться» означает, что используется другой трехбуквенный кодон для определения конкретной аминокислоты. В данной области техники хорошо известно, что следующие кодоны могут взаимозаменяемо кодировать каждую конкретную аминокислоту:

Фенилаланин (Phe или F) UUU или UUC Лейцин (Leu или L) UUA или UUG, или CUU, или CUC, или CUA, или CUG Изолейцин (Ilе или I) AUU или AUC, или AUA Метионин (Met или М) AUG Валин (Val или V) GUU или GUC, GUA, или GUG Серин (Ser или S) UCU или UCC, или UCA, или UCG, или AGU, или AGC Пролин (Pro или Р) CCU или ССС, или ССА, или CCG

Треонин (Thr или Т) ACU или АСС, или АСА, или ACG Аланин (Ala или А) GCU или GCG, или GCA, или GCG Тирозин (Tyr или Y) UAU или UAC Гистидин (His или Н) CAU или САС Глутамин (Gln или Q) САА или CAG Аспарагин (Asn или N) AAU или ААС Лизин (Lys или K) AAA или AAG Аспарагиновая кислота (Asp или D) GAU или GAC Глутаминовая кислота (Glu или Е) GAA или GAG Цистеин (Cys или С) UGU или UGC Аргинин (Arg или R) CGU или CGC, или CGA, или CGG, или AGA, или AGG Глицин (Gly или G) GGU или GGC, или GGA, или GGG Триптофан (Trp или W) UGG Терминирующий кодон UAA (охра) или UAG (янтарь), или UGA (опал)

[00164] Следует понимать, что кодоны, указанные выше, приведены для последовательностей РНК. Соответствующие кодоны для ДНК содержат замену U на Т.

[00165] В последовательностях, кодирующих антитело или активный фрагмент, могут быть произведены такие мутации, при которых конкретный кодон заменяют кодоном, кодирующим другую аминокислоту. Такую мутацию обычно осуществляют путем проведения наименьшего возможного числа замен нуклеотидов. Такую мутацию путем замены можно осуществлять для замены аминокислоты в получаемом белке «неконсервативным» способом (т.е. путем замены кодона с аминокислоты, относящейся к другой группе аминокислот, имеющих конкретный размер или характеристику, на аминокислоту, относящуюся к другой группе) или «консервативным» способом (т.е. путем замены кодона с аминокислоты, относящейся к группе аминокислот, имеющих конкретный размер или характеристику, на аминокислоту, относящуюся к этой же группе). Такая консервативная замена, как правило, приводит к меньшему изменению структуры и функции полученного белка. Неконсервативная замена с большей вероятностью изменяет структуру, активность или функцию полученного белка. Считается, что некоторые варианты реализации включают последовательности, содержащие консервативные изменения или замены одного, двух, трех, четырех, пяти, шести или семи аминокислотных остатков в аминокислотных последовательностях, которые не изменяют в значительной степени активность или характеристики связывания полученного белка.

[00166] Как упомянуто выше, последовательность ДНК, кодирующая антитело, полипептид или его активный фрагмент, может быть получена путем синтеза, а не клонирована. Последовательность ДНК может быть сконструирована с соответствующими кодонами для аминокислотной последовательности антитела или фрагмента. Как правило, будут выбирать кодоны, предпочтительные для предполагаемого хозяина, если последовательность будут использовать для экспрессии. Полную последовательность собирают из перекрывающихся олигонуклеотидов, полученных стандартными способами и составляемых в полную кодирующую последовательность. См., например, Edge, Nature, 292:756 (1981); Nambair et al., Science, 223:1299 (1984); Jay et al., J. Biol. Chem., 259:6311 (1984). Синтетические последовательности ДНК позволяют удобным образом конструировать гены, которые будут экспрессировать аналоги или «мутеины». В качестве альтернативы, ДНК, кодирующая мутеины, может быть получена путем сайт-направленного мутагенеза нативных генов или кДНК, и мутеины могут быть напрямую получены с использованием традиционного синтеза полипептидов.

[00167] «Гетерологичная» область ДНК-конструкции представляет собой идентифицируемый сегмент ДНК в более крупной молекуле ДНК, который не встречается в природе совместно с указанной более крупной молекулой. Таким образом, когда гетерологичная область кодирует ген млекопитающего, указанный ген, как правило, будет фланкирован ДНК, которая не фланкирует геномную ДНК млекопитающего в геноме организма-источника. Другим примером гетерологичной кодирующей последовательности является конструкция, в которой сама кодирующая последовательность не встречается в природе (например, кДНК, где геномная кодирующая последовательность содержит интроны или синтетические последовательности, содержащие кодоны, отличные от нативного гена). Аллельные вариации или встречающиеся в природе мутационные явления не приводят к образованию гетерологичной области ДНК, определенной в настоящем описании.

[00168] Последовательность ДНК является «функционально связанной» с контролирующей экспрессию последовательностью, когда указанная контролирующая экспрессию последовательность контролирует и регулирует транскрипцию и трансляцию данной последовательности ДНК. Термин «функционально связанный» включает наличие подходящего стартового сигнала (например, ATG) перед экспрессируемой последовательностью ДНК и сохранение соответствующей рамки считывания для обеспечения экспрессии последовательности ДНК под контролем контролирующей экспрессию последовательности и получения желаемого продукта, кодируемого последовательностью ДНК. Если ген, который необходимо встроить в рекомбинантную молекулу ДНК, не содержит подходящий стартовый сигнал, такой стартовый сигнал может быть встроен перед данным геном.

[00169] Термин «стандартные условия гибридизации» относится к солевым и температурным условиям, по существу эквивалентным 5×SSC и 65°С как для гибридизации, так и для промывки. Однако для специалиста в данной области техники очевидно, что такие «стандартные условия гибридизации» зависят от конкретных условий, включая концентрацию натрия и магния в буфере, длину и концентрацию нуклеотидной последовательности, процент несоответствий, процент формамида и т.п. При определении «стандартных условий гибридизации» важное значение также имеет то, являются ли две гибридизующиеся последовательности РНК-РНК, ДНК-ДНК или РНК-ДНК. Специалист в данной области техники может легко определить такие стандартные условия гибридизации в соответствии с хорошо известными формулами, при этом гибридизацию проводят при температуре, которая, как правило, на 10-20°С ниже предсказанной или определенной T_m, с промывками в более жестких условиях при необходимости.

[00170] В настоящем документе «аффинность связывания» для антител и фрагментов описана как KD (равновесная константа диссоциации между антителом и его антигеном), которая может быть определена различными способами, известными в данной области техники. В некоторых вариантах реализации антитела или антигенсвязывающие фрагменты демонстрируют следующую аффинность связывания в отношении вируса гриппа А, вируса гриппа В или белков НА, полученных из указанных вирусов, таких как рекомбинантные белки НА. В одном из вариантов реализации аффинность связывания составляет от примерно 5×10^-8 М до примерно 5×10^-12 М, в некоторых вариантах реализации аффинность связывания составляет от примерно 5×10^-9 М до примерно 5×10^-11 М, в некоторых вариантах реализации аффинность связывания составляет от примерно 3×10^-9 М до примерно 5×10^-11 М, в некоторых вариантах реализации аффинность связывания составляет от примерно 5×10^-10 М до примерно 5×10^-11 М. В некоторых вариантах реализации предложены антитела и антигенсвязывающие фрагменты, демонстрирующие KD менее 10 нМ, менее 3 нМ или менее 1 нМ или сильнее для рекомбинантного белка НА. В некоторых вариантах реализации предложены антитела и фрагменты, демонстрирующие KD от 10 нМ до 0,1 пМ. В некоторых вариантах реализации предложены антитела и фрагменты, демонстрирующие KD от 3 нМ до 1 пМ. В настоящем описании термин «сильнее» означает указанное значение KD или меньшее значение (более низкое значение KD), поскольку чем интенсивнее или сильнее аффинность, тем ниже значение KD. В некоторых вариантах реализации KD измеряют путем определения отражающей способности при косом падении (OI-RD), например, путем использования микроматрицы или жидкостной системы, например, от АВСАМ®, см. Landry et al., 2012, Assay and Drug Dev Technol 10(3), 250-259, или BIACORE® (т.е. поверхностный плазмонный резонанс), или анализов конкурентного связывания.

[00171] Опосредуемая антителами нейтрализация вируса определяется в настоящем документе, как определено или известно в данной области техники и, как указано и используется в настоящем документе, может быть исследована в различных традиционных или известных анализах нейтрализации. Примеры анализов нейтрализации включают традиционные анализы нейтрализации на основе ингибирования цитопатического эффекта (СРЕ) вируса в отношении клеток в культуре. Например, нейтрализацию гриппа можно тестировать по уменьшению или блокированию формирования СРЕ в клетках MDCK, инфицированных гриппом. Вирус и нейтрализующий агент могут быть предварительно смешаны перед добавлением к клеткам с последующим измерением блокирования проникновения вируса. Ингибирование гемагглютинина (HI) можно тестировать in vitro и оно может детектировать блокирование способности вирусов связываться с эритроцитами. Типичный известный и принятый анализ нейтрализации предложен в Руководстве ВОЗ по гриппу у животных (who/cds/csr/ncs/2002.5, страницы 48-54). Антитела, которые блокируют центр связывания рецептора на основе сиаловой кислоты, будут нейтрализовать связывание вируса с клетками, тем самым блокируя инфекцию. И наоборот, анализы нейтрализации могут детектировать блокирование выхода вируса, как в случае ингибиторов нейраминидазы, подобных Тамифлю®. Недавно были идентифицированы нейтрализующие антитела, функционирующие схожим образом путем предотвращения выхода вируса, данный пример нейтрализации включает антитело CR9114 для вирусов гриппа В (Dreyfus et al (2012) Science 337:1343-1348). Кроме того, используют анализы микронейтрализации, в которых нуклеопротеин (NP) вируса детектируют в инфицированных клетках с использованием микротитрационных планшетов в комбинации с ELISA. Были описаны анализы путем количественной ПЦР для измерения вирусных белков (Dreyfus С et al (2012) Emerging Inf Diseases 19(10:1685-1687). В некоторых вариантах реализации предложено антитело или фрагмент, который, по-видимому, не является нейтрализующим антителом в другом традиционном анализе нейтрализации in vitro, но действительно демонстрирует ингибирующую нейтрализацию выхода и, таким образом, является эффективным при интраназальном введении. Таким образом, термин «нейтрализующее» антитело, определенный в настоящем описании, будет относиться к антителу, демонстрирующему нейтрализацию в традиционном анализе нейтрализации in vitro, и/или антителу, демонстрирующему ингибирование выхода. Таким образом, в соответствии с одним из смыслов указанного термина ингибитор выхода является нейтрализующим, поскольку он ингибирует распространение инфекции, вызываемой гриппом.

[00172] «Не нейтрализующее» антитело может связываться с вирусом, но не ингибирует вирус или репликацию вируса в известном анализе нейтрализации или при традиционном оценочном определении. Связывание с вирусом может ингибировать вирус путем предотвращения его эффективного взаимодействия с клетками, клеточными рецепторами или клеточными мишенями. Не нейтрализующие антитела могут связываться с консервативными белками или эпитопами на белках в вирусе. Например, антитело к М2 в клинических исследованиях, TCN-032, может связываться с широким спектром вирусов гриппа А, но не демонстрирует нейтрализацию в традиционных анализах нейтрализации. Подобным образом, могут быть идентифицированы не нейтрализующие антитела, которые связываются с НА.

[00173] В настоящем описании термин «Fab-фрагмент» относится к фрагменту антитела, содержащему фрагмент легкой цепи, содержащий VL-домен и константный домен легкой цепи (CL), и VH-домен, и первый константный домен (СН1) тяжелой цепи. Fab- и F(ab')₂-части молекул антитела могут быть получены путем проведения протеолитической реакции папаина и пепсина соответственно по существу на интактных молекулах антитела хорошо известными способами или могут быть получены путем синтеза или рекомбинантным способом. Fab'-части молекул антитела также хорошо известны и могут быть получены из F(ab')₂-частей с последующим восстановлением дисульфидных связей, связывающих две части тяжелой цепи, с помощью меркаптоэтанола, и с последующим алкилированием полученного белкового меркаптана таким реагентом, как йодацетамид.

[00174] В настоящем описании термин «Fc-домен» определяет С-концевую область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит по меньшей мере часть константной области. Например, в природных антителах Fc-домен состоит из двух идентичных белковых фрагментов, полученных из второго и третьего константных доменов двух тяжелых цепей антитела, для изотипов IgG, IgA и IgD; Fc-домены IgM и IgE содержат три константных домена тяжелой цепи (C_H-домены 2-4) в каждой полипептидной цепи.

[00175] Типичные молекулы антител представляют собой интактные молекулы иммуноглобулина, по существу интактные молекулы иммуноглобулина и те части молекулы иммуноглобулина, которые содержат паратоп, в том числе те части, которые известны в данной области техники как Fab, Fab', F(ab')₂ и F(v), при этом указанные части являются предпочтительными для применения в способах лечения, описанных в настоящем документе.

[00176] В некоторых случаях, указанных в настоящем описании, требуется некоторый уровень или величина нейтрализующей активности и необходимый признак антитела для применения, в частности, для интраназального или ингаляционного введения. Таким образом, необходимо, чтобы любой фрагмент, вариант, производное, синтетический продукт или часть антитела для применения интраназально согласно настоящему изобретению сохраняли нейтрализующую способность и активность против целевого вируса или патогена, в соответствии с одним из аспектов - вируса гриппа. С другой стороны, антитело, которое будут вводить альтернативными системными путями, в том числе интраперитонеально или внутривенно, должно связывать или распознавать целевой вирус или патоген, в соответствии с одним из аспектов - вирус гриппа, однако нейтрализация не требуется. Таким образом, в качестве примера, Fab-фрагменты антитела (антител), которые сохраняют нейтрализацию, можно применять интраназально. Эффекторные функции, опосредуемые Fc, не требуются для эффективности и нейтрализации при интраназальном введении. И наоборот, эффективность системно доставляемых антител будет опосредоваться в значительной степени эффекторной функцией.

[00177] Термин «антигенсвязывающий домен» относится к части антигенсвязывающей молекулы, содержащей область, которая специфично связывается и является комплементарной части антигена или всему антигену. В случае, когда антиген является крупным, антигенсвязывающая молекула может связываться только с конкретной частью указанного антигена, при этом указанная часть называется эпитопом. Антигенсвязывающий домен могут обеспечивать, например, один или более вариабельных доменов антитела (также называемых вариабельными областями антитела). Предпочтительно, антигенсвязывающий домен содержит вариабельную область легкой цепи (VL) антитела и вариабельную область тяжелой цепи (VH) антитела.

[00178] Термин «вариабельная область» или «вариабельный домен» относится к домену тяжелой или легкой цепи антитела, который вовлечен в связывание указанного антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи (VH и VL соответственно) нативного антитела обычно имеют схожие структуры, при этом каждый домен содержит четыре консервативные каркасные области (FR) и три гипервариабельные области (HVR). (См., например, Kindt et al. Kuby Immunology, 6^th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)). Одного VH- или VL-домена может быть достаточно для придания специфичности связывания антигена. Кроме того, антитела, которые связывают конкретный антиген, могут быть выделены с использованием VH- или VL-домена из антитела, связывающего антиген, для скрининга библиотеки комплементарных VH- или VL-доменов соответственно. См., например, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).

[00179] В настоящем описании термин «антигенсвязывающий центр антитела» относится к аминокислотным остаткам антитела, которые ответственны за связывание антигена. Антигенсвязывающая часть антитела содержит аминокислотные остатки из «определяющих комплементарность областей» или «CDR». «Каркасные» или «FR»-области представляют собой области вариабельного домена, отличные от остатков гипервариабельной области, определенных в настоящем описании. Таким образом, вариабельные домены легкой и тяжелой цепи антитела содержат от N- к С-концу домены FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. В особенности, CDR3 тяжелой цепи представляет собой область, которая вносит наибольший вклад в связывание антигена и определяет свойства антитела. Антитела могут быть в достаточной степени определены в аминокислотной последовательности в соответствии с их CDR тяжелой и легкой цепи, и, в частности, могут быть описаны и охарактеризованы в соответствии с последовательностями CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области тяжелой цепи и последовательностями CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области легкой цепи. Антитело может быть определено или охарактеризовано как антитело или фрагмент, содержащий тяжелую и легкую цепь, при этом вариабельная область тяжелой цепи содержит конкретные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, и вариабельная область легкой цепи содержит конкретные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3. CDR- и FR-области антитела могут быть определены в соответствии со стандартными способами и анализами, доступными и известными специалисту в данной области техники. Таким образом, CDR-и FR-области могут быть определены в соответствии со стандартным определением Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), или в соответствии с международной информационной системой ImmunoGeneTics (IMGT) (imgt.org; LeFranc, М-Р (1999) Nucl Acids Res 27:209-212; LeFranc, М-Р (2005) Nucl Acids Res 33:D539-D579).

[00180] Термин «по существу как представлена» означает, что последовательности вариабельной области и/или, в частности, последовательности CDR антител согласно настоящему изобретению будут либо идентичны, либо высокогомологичны указанным последовательностям, приведенным в прилагаемом перечне последовательностей. Когда Xaa встречается в перечне последовательностей, он представляет собой любой встречающийся в природе аминокислотный остаток.

[00181] Термин «высокогомологичный» предполагает, что в последовательности вариабельной области и/или в последовательностях CDR может быть произведено лишь несколько замен, предпочтительно от 1 до 8, предпочтительно от 1 до 5, предпочтительно от 1 до 4 или от 1 до 3, или 1, или 2 замены. Термин «по существу как представлена» включает, в частности, консервативные замены аминокислот, которые не оказывают существенного или значительного влияния на специфичность и/или активность антител согласно настоящему изобретению. Консервативные замены аминокислот предусмотрены для последовательностей CDR-областей. Согласно настоящему изобретению предусмотрены и предложены типичные замены и варианты CDR. В соответствии с некоторыми аспектами могут быть произведены замены в последовательности вариабельной области за пределами CDR для того, чтобы сохранить последовательности CDR. Таким образом, можно вводить или использовать изменения в последовательности вариабельной области или альтернативные негомологичные или «венированные» последовательности вариабельной области, в результате чего сохраняются последовательности CDR, а остальная часть последовательности вариабельной области может содержать замены.

[00182] Термин «эпитоп» включает любую полипептидную детерминанту, способную специфично связываться с антителом. В некоторых вариантах реализации эпитопная детерминанта включает химически активные поверхностные группы молекул, такие как аминокислоты, боковые цепи сахаров, фосфорил или сульфонил, и в некоторых вариантах реализации может демонстрировать конкретные трехмерные структурные характеристики и/или конкретные характеристики заряда. Эпитоп представляет собой область антигена, которую связывает антитело.

[00183] Способы и методики получения моноклональных антител с помощью гибридом или других средств и подходов хорошо известны. Панели полученных моноклональных антител к патогену, вирусным пептидам или пептидам гриппа могут быть подвергнуты скринингу на предмет различных свойств; т.е. нейтрализации, изотипа, эпитопа, аффинности и т.д. Особый интерес представляют моноклональные антитела, которые нейтрализуют активность вируса или его субъединиц. Такие моноклональные антитела могут быть легко идентифицированы в анализах нейтрализующей активности. Антитела с высокой аффинностью также подходят для эффективного связывания и/или нейтрализации, или когда необходима или представляет интерес иммуноаффинная очистка нативного или рекомбинантного вируса.

[00184] Моноклональное антитело, подходящее для практического применения вариантов реализации, описанных в настоящем документе, может быть получено путем инициации культуры моноклональной гибридомы, содержащей питательную среду, содержащую гибридому, которая секретирует молекулы антитела с соответствующей специфичностью к антигену. Культуру выдерживают в условиях и в течение периода времени, достаточного для секреции гибридомой молекул антитела в среду. Затем собирают среду, содержащую антитело. Затем молекулы антитела могут быть дополнительно выделены хорошо известными методами.

[00185] Среды, подходящие для получения данных композиций, как хорошо известны в данной области техники, так и коммерчески доступны, и включают синтетические культуральные среды, инбредные мыши и т.п. Типичной синтетической средой является минимальная питательная среда Дульбекко (DMEM; Dulbecco et al., Virol. 8:396 (1959)) с добавлением 4,5 г/л глюкозы, 20 мМ глутамина и 20% фетальной телячьей сыворотки. Типичной инбредной линией мышей является Balb/c.

[00186] Способы получения моноклональных противовирусных антител также хорошо известны в данной области техники. См. Niman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:4949-4953 (1983). Как правило, вирус, вирусный белок или пептидный аналог используют либо отдельно, либо в конъюгированной с иммуногенным носителем форме, в качестве иммуногена для получения моноклональных антител. Гибридомы подвергают скринингу на предмет способности продуцировать антитело, которое вступает в иммунную реакцию с вирусом, белком или пептидным аналогом.

[00187] Антитела также могут быть биспецифическими или полиспецифическими, например, в которых один связывающий домен антитела представляет собой нейтрализующее вирус антитело, применяемое согласно настоящему изобретению, а другой связывающий домен обладает другой специфичностью, например, к связыванию или ассоциации с апикальной поверхностью клеток, к связыванию эпителиальных клеток дыхательных путей и т.д. Биспецифические антитела согласно настоящему изобретению включают антитела, в которых один связывающий домен антитела представляет собой нейтрализатор, применяемый согласно настоящему изобретению, включая его фрагмент, а другой связывающий домен представляет собой отличное антитело или его фрагмент, в том числе отличного противовирусного специфического антитела, включая альтернативное нейтрализующее антитело или не нейтрализующие антитело. Другой связывающий домен может представлять собой антитело, которое распознает или прицельно воздействует на конкретный тип клеток, как в антителе, специфичном в отношении эпителиальных клеток легкого, альвеолярных макрофагов, нервных или глиальных клеток. В биспецифических антителах согласно настоящему изобретению один связывающий домен антитела согласно настоящему изобретению может быть комбинирован с другими связывающими доменами или молекулами, которые распознают конкретные клеточные рецепторы и/или модулируют клетки определенным образом, как, например, иммуномодулятор (например, интерлейкин (интерлейкины)), модулятор роста или цитокин, или токсин (например, рицин), или антимитотический агент или апоптотический агент или фактор. Таким образом, антитела согласно настоящему изобретению можно применять для направления или нацеливания агентов, меток, других молекул или соединений, или антител при таких показаниях, как инфекция, воспаление и т.д.

[00188] Биспецифические антитела, применяемые согласно настоящему изобретению, могут содержать по меньшей мере два Fab-фрагмента, при этом в одном из примеров либо вариабельные области, либо константные области тяжелой и легкой цепи второго Fab-фрагмента подвергнуты обмену. В результате обмена либо вариабельных областей, либо константных областей, указанный второй Fab-фрагмент также называется «кросс-Fab-фрагментом» или «xFab-фрагментом», или «перекрестным Fab-фрагментом». Такие биспецифические антитела описаны в US 2013006011.

[00189] В соответствии с конкретным дополнительном аспектом комбинированное или последовательное введение нейтрализующего антитела интраназально совместно с введением антитела интраперитонеально или внутривенно обеспечивает эффективный и синергический способ лечения и/или профилактики вирусной инфекции. Антитело, вводимое системно, в том числе интраперитонеально или внутривенно, может быть нейтрализующим или не нейтрализующим и, таким образом, может представлять собой то же антитело, которое вводят интраназально, или может представлять собой модифицированное антитело или отличное антитело. Таким образом, антитело для интраназальной доставки, нейтрализующее антитело, может представлять собой другое антитело или антитело, отличное от антитела, применяемого в комбинации с ним для доставки другим способом, в частности, для системной доставки, в том числе интраперитонеальной или внутривенной доставки.

[00190] Настоящее изобретение показывает, что для повышенной эффективности при интраназальном введении не требуется функции Fc и Fc-частей нейтрализующих антител, соответственно эффекторной функции. Таким образом, антитела и фрагменты, такие как Fab-фрагменты, или антитела, не содержащие Fc или не обладающие эффекторной функцией, являются эффективными при интраназальном введении. В противоположность этому, Fab-фрагменты антител (нейтрализующие или не нейтрализующие) или антитела, не содержащие Fc или не обладающие эффекторной функцией, не являются эффективными при интраперитонеальном или внутривенном введении.

[00191] В некоторых вариантах реализации предложены иммуноконъюгаты или белки слияния антител, при этом антитела, молекулы антител или их фрагменты, применяемые согласно настоящему изобретению, конъюгированы или присоединены к другим молекулам или агентам, и также включают, но не ограничиваются ими, такие антитела, молекулы или фрагменты, конъюгированные с агентом химической абляции, токсином, иммуномодулятором, цитокином, цитотоксическим агентом, химиотерапевтическим агентом, противовирусным агентом, противомикробным агентом или пептидом, разрушителем клеточной стенки и/или клеточной мембраны, или лекарственным средством. В соответствии с одним из аспектов иммуноконъюгаты или слитые антитела могут включать антитела, молекулы или фрагменты, конъюгированные с противовирусным агентом, в частности противогриппозным агентом. Противогриппозный агент может представлять собой ингибитор нейраминидазы. Указанный противогриппозный агент может быть выбран из Тамифлю и Реленза. Противогриппозный агент может представлять собой ингибитор М2, такой как амантадин или римантадин. Противогриппозный агент может представлять собой ингибитор репликации вируса.

[00192] «Субъекты» или «субъект», для лечения и профилактики у которых подходят антитела, их фрагменты и композиции, в том числе антитела согласно настоящему изобретению, включают, в дополнение к людям, любой субъект, восприимчивый инфекции, вызываемой гриппом. Таким образом, профилактическое и терапевтическое применение данных связывающих агентов будет оказывать полезный эффект у различных млекопитающих, таких как быки, свиньи, овцы и другие субъекты, представляющие собой млекопитающих, в том числе лошади и домашние животные, а также тюлени. В некоторых случаях применяют антитела, адаптированные к конкретному виду субъекта. Более того, известно, что грипп инфицирует виды птиц, у которых композиции, содержащие антитела согласно настоящему изобретению, возможно также адаптированные к конкретному виду субъекта, будут также оказывать полезный эффект.

[00193] «Терапевтически эффективное количество» или «эффективное количество» антитела или фрагмента представляет собой заранее определенное количество, которое обеспечивает терапевтический эффект в отношении субъекта, получающего лечение, при разумном соотношении польза/риск, применимом к любому лечению. Терапевтический эффект может быть объективным (т.е. измеримым с помощью какого-либо теста или маркера) или субъективным (т.е. субъект указывает на эффект или чувствует его, или врач наблюдает изменение). Эффективное количество каждого антитела в композиции может находиться в диапазоне от примерно 0,001 мг/кг до примерно 100 мг/кг, от примерно 0,01 мг/кг до примерно 10 мг/кг, от примерно 0,05 мг/кг до примерно 1 мг/кг. Эффект, предусмотренный согласно настоящему изобретению, включает как терапевтическое, так и/или профилактическое лечение при необходимости. Конкретная вводимая доза антитела или фрагмента согласно настоящему изобретению для достижения терапевтического и/или профилактического эффекта, конечно, будет определяться конкретными обстоятельствами случая, включая, например, вводимое соединение, путь введения, совместное введение других активных ингредиентов, вылечиваемое состояние, конкретную применяемую композицию, возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол и рацион пациента; время введения, путь введения и скорость выведения конкретного применяемого соединения, и продолжительность лечения. Вводимое эффективное количество может быть определено врачом с учетом соответствующих вышеупомянутых обстоятельств и результатов проведения тщательной медицинской оценки. Термин «терапевтически эффективное количество» означает количество лекарственного средства, соединения, противомикробного агента, антитела или фармацевтического агента, которое будет вызывать биологический или медицинский ответ у субъекта, которого добивается врач или другой клиницист. В частности, применительно к вирусным инфекциям и пролиферации вируса термин «эффективное количество» включает эффективное количество соединения или агента, которое будет приводить к биологически значимому уменьшению величины или степени репликации вируса или патогенеза, и/или уменьшению продолжительности заболевания (лихорадка, боли в суставах, дискомфорт) у субъекта, или снижению потери массы тела у инфицированного индивидуума. В настоящем описании термин «терапевтически эффективное количество» означает количество, достаточное для снижения и, предпочтительно, предотвращения вирусной нагрузки, репликации вируса, передачи вируса или другого признака патологии, такого как, например, лихорадка или повышение уровня лейкоцитов, которое может сопровождать присутствие и активность вируса.

[00194] В некоторых вариантах реализации термин «эффективное количество» в контексте введения лекарственного средства субъекту относится к количеству лекарственного средства, которое является достаточным для достижения одного, двух, трех, четырех или более из следующих эффектов: (i) снижение или уменьшение тяжести инфекции, вызванной вирусом гриппа, заболевания, вызванного вирусом гриппа, или связанного с ними симптома; (ii) сокращение продолжительности инфекции, вызванной вирусом гриппа, заболевания, вызванного вирусом гриппа, или связанного с ними симптома; (iii) предотвращение прогрессирования инфекции, вызванной вирусом гриппа, заболевания, вызванного вирусом гриппа, или связанного с ними симптома; (iv) регресс инфекции, вызванной вирусом гриппа, заболевания, вызванного вирусом гриппа, или связанного с ними симптома; (v) предотвращение развития или возникновения инфекции, вызываемой вирусом гриппа, заболевания, вызываемой вирусом гриппа, или связанного с ними симптома; (vi) предотвращение рецидива инфекции, вызываемой вирусом гриппа, заболевания, вызываемого вирусом гриппа, или связанного с ними симптома; (vii) уменьшение или предотвращение распространения вируса гриппа от одной клетки к другой клетке, от одной ткани к другой ткани или от одного органа к другому органу; (viii) предотвращение или уменьшение распространения/передачи вируса гриппа от одного субъекта к другому субъекту; (ix) снижение недостаточности органов, связанной с инфекцией, вызванной вирусом гриппа, или заболеванием, вызванным вирусом гриппа; (х) уменьшение госпитализации субъекта; (xi) сокращение продолжительности госпитализации; (xii) увеличение выживаемости субъекта с инфекцией, вызванной вирусом гриппа, или связанным с ней заболеванием; (xiii) устранение инфекции, вызванной вирусом гриппа, или связанного с ней заболевания; (xiv) ингибирование или уменьшение репликации вируса гриппа; (xv) ингибирование или уменьшение связывания или слияния вируса гриппа с клеткой (клетками)-хозяином; (xvi) ингибирование или уменьшение проникновения вируса гриппа в клетку (клетки)-хозяина; (xvii) ингибирование или уменьшение репликации генома вируса гриппа; (xviii) ингибирование или уменьшение синтеза белков вируса гриппа; (xix) ингибирование или уменьшение сборки частиц вируса гриппа; (хх) ингибирование или уменьшение высвобождения частиц вируса гриппа из клетки (клеток)-хозяина; (xxi) снижение титра вируса гриппа; (xxii) уменьшение количества симптомов, связанных с инфекцией, вызванной вирусом гриппа, или заболеванием, вызванным вирусом гриппа; (xxiii) усиление, улучшение, поддержка, дополнение или повышение профилактического или лечебного эффекта (эффектов) другой терапии; (xxiv) предотвращение возникновения или прогрессирования вторичной инфекции, связанной с инфекцией, вызванной вирусом гриппа; (xxv) предотвращение возникновения или ослабление тяжести бактериальной пневмонии, возникающей вторично по отношению к инфекциям, вызываемым вирусом гриппа; и/или (xxvi) изменение иммунного ответа на грипп, включая цитокины, хемокины, комплемент, клеточные ответы и т.д. В некоторых вариантах реализации «эффективное количество» лекарственного средства оказывает полезный эффект, но не лечит инфекцию, вызванную вирусом гриппа, или связанное с ней заболевание. В некоторых вариантах реализации термин «эффективное количество» лекарственного средства может включать введение нескольких доз лекарственного средства с определенной частотой для достижения количества лекарственного средства, оказывающего профилактический и/или терапевтический эффект. В других ситуациях термин «эффективное количество» лекарственного средства может включать введение однократной дозы лекарственного средства с определенной величиной.

[00195] «Симптом» или «симптомы», связанные с вирусной инфекцией, включая, в частности, инфекцию, заболевание, вызванное вирусом гриппа, или воздействие вируса гриппа, могут включать, но не ограничиваются ими, лихорадку с температурой 100°F или выше, чувство озноба, кашель и/или боль в горле, насморк или заложенность носа, головную боль и/или боли в теле, озноб, усталость, общую слабость, тошноту, рвоту и/или диарею, ломоту и боли в суставах и мышцах, и/или вокруг глаз.

[00196] Термин «предотвращение» относится к снижению риска приобретения или развития заболевания или нарушения (т.е. недопущение развития по меньшей мере одного из клинических симптомов указанного заболевания) у субъекта, который может подвергаться воздействию болезнетворного агента или может быть предрасположен к заболеванию, до возникновения заболевания.

[00197] Термин «профилактика» относится и включен в термин «предотвращение», и относится к мере или процедуре, целью которой является предотвращение, а не лечение или излечение заболевания. В одном из вариантов реализации термин «осуществление лечения» или «лечение» любого заболевания или инфекции относится к ослаблению указанного заболевания или инфекции (т.е. прекращению заболевания или развития инфекционного агента или вируса, или уменьшению проявления, степени или тяжести по меньшей мере одного из его клинических симптомов). В другом варианте реализации термин «осуществление лечения» или «лечение» относится к улучшению по меньшей мере одного физического параметра, который может не быть виден субъекту. В другом варианте реализации термин «осуществление лечения» или «лечение» относится к модуляции заболевания или инфекции либо физически (например, стабилизация видимого симптома), либо физиологически (например, стабилизация физического параметра), либо обоими путями. В другом варианте реализации термин «осуществление лечения» или «лечение» относится к замедлению прогрессирования заболевания, передачи заболевания или уменьшению инфекции.

[00198] В настоящем описании термин «пг» означает пикограмм, «нг» означает нанограмм, «мкг» означает микрограмм, «мг» означает миллиграмм, «мкл» означает микролитр, «мл» означает миллилитр, «л» означает литр.

[00199] Способы применения для профилактики и терапии являются традиционными и, в целом, хорошо известными. Антитела или другие связывающие агенты, как правило, вводят путем инъекции, но понятно, что пероральные вакцины также являются эффективными. Уровни доз и время введения можно легко оптимизировать и это находится в рамках компетенции специалиста в данной области техники. В качестве альтернативы, могут быть введены рекомбинантные вещества для выработки антител in situ. В настоящее время доступна технология экспрессии генов антител в клетках субъекта, представляющего собой животное, включая, например, лимфоциты или мышечные клетки (см., например, Johnson, P.R., et al., Nature Medicine (2009) 15:901-907). Такая выработка антител in situ может снизить стоимость производства лекарственного средства, и упрощает введение. Введение антител согласно настоящему изобретению такими способами представляет собой другой аспект настоящего изобретения.

[00200] Клетки человека (или клетки от любого указанного вида), которые секретируют подходящие антитела, могут быть идентифицированы с использованием, в частности, способа CellSpot™, описанного в патенте США 7413868, содержание которого включено в настоящее описание посредством ссылки. Вкратце, с помощью указанного способа можно осуществлять скрининг отдельных клеток, полученных от субъектов, представляющих собой людей (или других субъектов), в анализах с высокой пропускной способностью с преимуществом мечения метками в виде частиц и наблюдения под микроскопом. В одном из иллюстративных вариантов реализации даже одну клетку можно анализировать на предмет секретируемых ею антител, позволяя секретируемым антителам адсорбироваться или связываться с поверхностью, а затем обрабатывая указанную поверхность желаемыми антигенами, каждый из которых связан с отличительной меткой в виде частицы. Следовательно, отпечаток клетки может быть идентифицирован с помощью микроскопа. С использованием данной технологии можно подвергать скринингу миллионы клеток на предмет секреции желаемых антител и даже редких антител, например, могут быть выделены антитела, описанные в настоящем документе, необходимые для пассивной иммунизации против всех штаммов гриппа. Поскольку у субъектов, представляющих собой людей, есть существующие антитела по меньшей мере к некоторым штаммам гриппа, и поскольку антитела, полученные способом согласно настоящему изобретению, связывают консервативную последовательность, данные антитела подходят для борьбы с новыми штаммами, а также штаммами, с которыми население сталкивалось.

[00201] Способы получения подходящих антител не ограничиваются технологией CellSpot™, а также они не ограничиваются субъектами, представляющими собой людей.

Клетки, вырабатывающие подходящие антитела, могут быть идентифицированы различными способами, и указанные клетки могут представлять собой клетки лабораторных животных, таких как мыши или другие грызуны. Могут быть выделены последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие данные антитела, и получены различные формы антител, включая химерные и гуманизированные формы антител, вырабатываемых клетками, не относящимися к человеку. Кроме того, получаемые рекомбинантным способом антитела или фрагменты включают одноцепочечные антитела или их Fab- или Fab₂-области. Антитела человека могут быть также получены с использованием хозяев, таких как XenoMouse®, с гуманизированной иммунной системой. Способы получения антител для скрининга на предмет подходящих характеристик связывания хорошо известны в данной области техники.

[00202] Подобным образом, в данной области техники также известны способы конструирования РНК-аптамеров с желаемым характером связывания.

[00203] Как отмечено выше, антитела или другие связывающие агенты могут связывать активированную форму, инактивированную форму или обе формы белка гемагглютинина. В некоторых случаях предпочтительно, чтобы эпитоп находился в центре расщепления данного белка, поскольку он является относительно консервативным среди штаммов, но предпочтительно, связывающий агент связывает как тример, так и активированную форму.

[00204] Известен центр расщепления для различных штаммов гриппа А и гриппа В. Например, в вышеупомянутой статье Bianchi, et al. в таблице 2 представлена последовательность вокруг сайта расщепления для нескольких таких штаммов:

[00205] Как указано, строгая консенсусная последовательность наблюдается, начиная с остатка аргинина, расположенного выше (upstream) сайта расщепления, и, таким образом, предпочтительные консенсусные последовательности, включенные в тестируемые пептиды согласно настоящему изобретению, имеют последовательность RGI/L/FFGAIAGFLE (SEQ ID NO: 57). Может быть возможным использование только части данной последовательности в тестируемых пептидах.

[00206] Как отмечено выше, после идентификации клеток, секретирующих желаемые антитела, просто восстановить нуклеотидные последовательности, кодирующие указанные антитела, и получать желаемые антитела в больших масштабах рекомбинантным способом. Это также позволяет осуществлять манипуляции с антителами для того, чтобы их можно было получить, например, в виде одноцепочечных антител или в виде только их вариабельных областей, или в виде биспецифических антител.

[00207] Восстановленные нуклеиновые кислоты можно физически хранить и извлекать для последующего рекомбинантного получения и/или информацию о последовательности в отношении кодирующей последовательности для антитела можно восстанавливать и хранить для обеспечения последующего синтеза соответствующих нуклеиновых кислот. Доступность информации, содержащейся в кодирующих последовательностях, и технологии быстрого синтеза и клонирования наряду с известными способами рекомбинантного получения позволяют быстро получать необходимые антитела в случае пандемии или другой чрезвычайной ситуации.

[00208] Для сведения, последовательности константных областей человека как тяжелой, так и легкой цепей были описаны и представлены в настоящем описании как SEQ ID NO: 33-35. В вышеупомянутых WO 2011/160083 и WO 2013/086052 были извлечены различные моноклональные антитела с вариабельными областями определенной аминокислотной последовательности и соответствующие кодирующие нуклеотидные последовательности, которые связываются с различной степенью аффинности с белком НА различных штаммов гриппа. Данные антитела включают mAb53 и mAb579. mAb53 связывается с особой аффинностью с H1; более того, mAb53 сильно связывается с Н5, Н7 и Н9. mAb579 связывает Н3 и Н7. Значения аффинности находятся в низко- - субнаномолярном диапазоне. Реактивность в отношении нативного тримера НА подтверждали с использованием НА, экспрессируемого на поверхности клеток НЕK293. Связывание антитела измеряли путем проточной цитометрии. НА-кодирующая плазмида была предложена S. Galloway и D. Steinhauer из Университета Эмори, и mAb согласно настоящему изобретению распознавали тример, представленный на клеточной поверхности различных клад.

[00209] В настоящее время существует множество технологий для создания одной антителоподобной молекулы, которая заключает в себе антигенспецифические домены из двух отдельных антител (биспецифическое антитело). Таким образом, одно антитело с реактивностью в отношении широкого спектра штаммов может быть сконструировано с использованием Fab-доменов индивидуальных антител с широким спектром реактивности в отношении группы 1 и группы 2 соответственно или одной из этих групп в комбинации со связыванием гриппа В. Подходящие технологии были описаны Macrogenics (Роквилл, Мэриленд), Micromet (Бетесда, Мэриленд) и Merrimac (Кембридж, Массачусетс). (См., например, Orcutt, K.D., et al., "A modular IgG-scFv bispecific antibody topology," Protein Eng Des Sel. (2010) 23:221-228; Fitzgerald, J., et al., "Rational engineering of antibody therapeutics targeting multiple oncogene pathways," MAbs. (2011) 1:3(3); и Baeuerle, P.A., et al., "Bispecific T-cell engaging antibodies for cancer therapy," Cancer Res. (2009) 69:4941-4944.)

[00210] Таким образом, особенно подходящим является получение антител или других связывающих агентов, которые связываются с несколькими типами белка гемагглютинина, путем конструирования биспецифических антител. Наиболее подходящими комбинациями являются те, которые комбинируют специфичность связывания mAb53 (H1, Н5 и Н9) и mAb579 (Н3 и Н7).

[00211] Тогда как mAb53 с высокой аффинностью связывается с НА₀, оно не связывает HA₁, предполагающий связывание с комплементарным НА₂-фрагментом, связывание с которым было подтверждено. Поскольку mAb53 не связывается с НА₀ при тестировании путем вестерн-блоттинга, можно предположить, что доминантный эпитоп является по меньшей мере частично конформационным.

[00212] В таблице 3 и таблице 4 приведены значения KD и IC₅₀ для белка гемагглютинина различных штаммов гриппа А, демонстрируемые mAb 53 и 579.

[00213] Данные значения получали в анализе микронейтрализации в монослое MDCK.

[00214] Согласно настоящему изобретению предложено множество новых моноклональных антител, обладающих специфичностью, которая дополняет антитела, указанные выше, например, mAb53 и mAb579, которые включают mAb, распознающие грипп В. Доступность данных дополнительных mAb дает возможность получить пассивные вакцины, эффективные в отношении широкого диапазона штаммов гриппа, что таким образом уменьшает необходимость точного определения или диагностики штамма инфекционного агента перед лечением.

[00215] Что касается данных связывающих агентов согласно настоящему изобретению, которые в действительности представляют собой mAb, как хорошо известно, специфичность по существу определяется определяющими комплементарность областями (CDR), которые присутствуют в вариабельных областях легких и тяжелых цепей. Понятно, что влияние CDR тяжелой цепи имеет более важное значение, в то время как идентичность легкой цепи является более гибкой. Таким образом, общая специфичность mAb или фрагмента, как правило, определяется природой CDR тяжелой цепи, тогда как CDR, присутствующая в легкой цепи, подвержена большей вариации, при этом специфичность антитела остается по существу такой же.

[00216] В дополнение к биспецифическим антителам как таковым, настоящее изобретение предусматривает применение только тяжелой цепи в конструкциях для нейтрализации вирусной инфекции; такие антитела также могут быть биспецифическими. Поскольку в данной области техники понятно, что специфичность обеспечивают главным образом вариабельные области тяжелой цепи в некоторых положениях, тяжелые цепи сами по себе являлись и являются согласно настоящему изобретению эффективными в качестве активных ингредиентов в вакцинах. В качестве альтернативы, тяжелая цепь соответствующей специфичности может быть ассоциирована с различными формами легкой цепи для повышения аффинности или способности нейтрализовать вирус.

[00217] Как отмечено, специфичность связывания для связывающих агентов согласно настоящему изобретению определяется CDR, главным образом, тяжелой цепи, но ее дополняет также CDR легкой цепи. Таким образом, связывающие агенты согласно настоящему изобретению могут содержать три CDR тяжелой цепи и возможно три CDR соответствующей ей легкой цепи. Настоящее изобретение также включает связывающие агенты, которые связываются с теми же эпитопам, что и те, которые в действительности содержат данные CDR. Таким образом, например, также включены аптамеры, обладающие той же специфичностью связывания - т.е. связывающиеся с теми же эпитопами, с которыми связываются связывающие агенты, которые в действительности содержат CDR. Поскольку аффинность связывания также определяется тем, как CDR расположены в рамке, связывающие агенты согласно настоящему изобретению могут содержать полные вариабельные области тяжелой цепи, содержащие три соответствующие CDR, а также, возможно, полную вариабельную область легкой цепи область, содержащую три CDR, связанные с легкой цепью, дополняющей рассматриваемую тяжелую цепь. Это справедливо в отношении связывающих агентов, которые обладают иммуноспецифичностью к одному эпитопу, а также биспецифических антител или связывающих соединений, которые способны связывать два отдельных эпитопа.

[00218] Таким образом, применительно к связывающим агентам, полученным из вариабельных областей антител с подходящей аффинностью, важное значение имеют аминокислотные последовательности, представляющие собой последовательности CDR, расположенные в рамке, при этом указанная рамка может варьироваться без обязательного влияния на специфичность или снижения аффинности до недопустимого уровня. Определение данных CDR осуществляют способами, известными в данной области техники. В частности, наиболее широко используемым способом идентификации соответствующей CDR является способ Kabat, описанный в Wu, Т.Т., et al., J. Exp.Med. (1970) 132:211-250 и в книге Kabat, Е.A., et al. (1983) Sequence of Proteins of Immunological Interest, Bethesda National Institute of Health, 323 pages. Другим схожим и широко используемым способом является способ Chothia, опубликованный в Chothia, С., et al., J. Mol. Biol. (1987) 196:901-917 и в Chothia, С., et al., Nature (1989) 342:877-883. Дополнительная модификация была предложена Abhinandan, K.R., et al., Mol. Immunol. (2008) 45:3832-3839. Настоящее изобретение включает CDR, определенную посредством любой из данных систем.

[00219] Различные исследователи высказывали критические замечания в отношении обеих систем; поэтому, понятно, что CDR, указанная в настоящем описании и в формуле изобретения, может слегка варьироваться. До тех пор пока полученные вариабельные области сохраняют аффинность связывания, точное расположение CDR не имеет важного значения, и те области, указанные в формуле изобретения, следует рассматривать как включающие CDR, идентифицированную посредством любой принятой системы.

[00220] Антитела или другие связывающие агенты согласно настоящему изобретению могут быть введены в виде пассивных вакцин с применением стандартных методик и составов. Как правило, такие вакцины вводят путем инъекции, обычно внутримышечной или подкожной, но никоим образом не исключены и другие способы введения, включая внутривенный. При надлежащей разработке вакцины можно также вводить перорально. Как отмечено выше, разрабатываемая технология демонстрирует перспективы выработки mAb in situ в мышце или лимфоцитах человека, например, и антитела согласно настоящему изобретению также подходят для данного способа получения.

[00221] Что касается состава, используют типичные вспомогательные вещества для составов в виде пассивной вакцины, содержащей антитела, или связывающие агенты могут быть введены в носителях, таких как липосомы, мицеллы, наночастицы и т.п. Наиболее интересный способ, включенный в объем настоящего изобретения, заключается в присоединении связывающего агента к эритроцитам через адсорбцию наночастиц, полученных из mAb, как описано в Anselmo, А.С., et al., в ACS Nano. и опубликовано в интернете в 2013 году как 10.1021/NN404853Z. Согласно данной технологии, путем адсорбции либо частиц носителя, либо лекарственных средств, либо обоих на эритроцитах, получают предпочтительную доставку в легкие, что таким образом предотвращает уменьшение времени полужизни вследствие процессинга в печени и селезенке, и обеспечивает более высокую концентрацию в легких. Это особенно подходит в отношении пассивных вакцин против гриппа и можно применять различные способы для присоединения связывающих агентов к эритроцитам. Однако согласно указанной статье, простая адсорбция - это все, что требуется. Для повышения активности пассивной вакцины также могут быть использованы другие способы увеличения распределения mAb в легкие, такие как аэрозольный продукт, доставляемый путем ингаляции.

[00222] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложен способ и средства для эффективного лечения и профилактики вируса гриппа и инфекции, вызываемой вирусом гриппа, путем одновременного или комбинированного введения антител, направленных против вируса гриппа А группы 1 и группы 2, и вируса гриппа В. Согласно настоящему изобретению вводят комбинацию антител с широким спектром нейтрализации, содержащую антитело или активный фрагмент с направленностью широкого спектра против вируса гриппа А группы 1, антитело или активный фрагмент с направленностью широкого спектра против вирусов гриппа А группы 2, и антитело или активный фрагмент с направленностью широкого спектра против вирусов гриппа В.

[00223] В некоторых вариантах реализации предложена пассивная вакцина, композиция антител или комбинация антител, содержащая антитела, эффективные как против гриппа А, так и против гриппа В, и обладающая широким спектром реактивности в отношении нескольких штаммов. Она будет обеспечивать противогриппозный агент, эффективный в однократной дозе, и может быть введена при развитии первичных симптомов или после воздействия гриппа. Более того, она позволит обойти необходимость получения подробных характеристик инфекционного вируса перед введением антитела или смеси антител. Диагностика для определения штамма гриппа требует доступного оснащения клинической лаборатории и, как правило, требует минимального 12-24-часового интервала времени между постановкой диагноза и началом лечения, что приводит к неблагоприятному отсрочиванию лечения, если перед выбором соответствующей направленной терапии необходимо определение штамма гриппа. В случае композиции с широким спектром реактивности в отношении штаммов гриппа А и В, предварительная диагностика для определения штамма не является необходимой перед лечением.

[00224] В некоторых вариантах реализации предложен новой способ и средства для эффективного лечения и профилактики вируса гриппа путем введения комбинации антител или композиции комбинированных антител непосредственно в дыхательный тракт или дыхательные пути, в том числе путем интраназального или ингаляционного введения. Настоящее изобретение демонстрирует, что доставка нейтрализующего антитела или комбинации антител непосредственно в дыхательный тракт, включая доставку в дыхательные пути, например, путем ингаляционной (и/г) и/или интраназальной (и/н) доставки и введения, лучше, более действенна и эффективна в более низких дозах, чем системное введение (в/в или и/п) этого же антитела или комбинации антител в тех же количествах. Эффективным является лечение или профилактика доставляемым интраназально или интраперитонеально антителом до или даже после воздействия вируса или инфекции.

[00225] В некоторых вариантах реализации предложены композиции для введения в дыхательные пути, в частности композиции для ингаляционного или интраназального введения, в частности композиции комбинированных антител, эффективные для лечения или профилактики вирусной инфекции у млекопитающего, содержащие антитело или активный фрагмент с направленностью широкого спектра против вируса гриппа А группы 1, антитело или активный фрагмент с направленностью широкого спектра против вируса гриппа А группы 2 и антитело или активный фрагмент с направленностью широкого спектра против вирусов гриппа В. В соответствии с первым аспектом настоящего изобретения предложены композиции для ингаляционного или интраназального введения, эффективные для лечения или профилактики инфекции, вызываемой вирусом гриппа, у млекопитающего, содержащие комбинацию нейтрализующих вирус моноклональных антител, в стандартной единичной дозе, при этом каждое антитело включено в указанную дозу в количестве для введения, составляющем 1 мг/кг или меньше. Согласно настоящему изобретению предложены композиции для ингаляционного или интраназального введения, эффективные для лечения или профилактики инфекции, вызываемой вирусом гриппа, у млекопитающего, содержащие комбинацию нейтрализующих моноклональных антител, в стандартной единичной дозе, при этом каждое антитело вводят в эффективном количестве, составляющем 10 мг/кг или меньше. Согласно настоящему изобретению предложены композиции для ингаляционного или интраназального введения, эффективные для лечения или профилактики вируса гриппа у млекопитающего, содержащие комбинацию нейтрализующих грипп моноклональных антител, каждое в стандартной единичной дозе, составляющей менее 1 мг/кг. Согласно настоящему изобретению предложены композиции для ингаляционного или интраназального введения, эффективные для лечения или профилактики вируса гриппа у млекопитающего, содержащие комбинацию нейтрализующих грипп моноклональных антител, каждое в стандартной единичной дозе, составляющей менее 0,5 мг/кг. Согласно настоящему изобретению предложены композиции для ингаляционного или интраназального введения, эффективные для лечения или профилактики вируса гриппа у млекопитающего, содержащие комбинацию антител, при этом каждое вводят в дозе, составляющей менее 0,1 мг/кг.

[00226] В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложены композиции для ингаляционного или интраназального введения, эффективные для лечения, профилактики или уменьшения передачи вируса гриппа у млекопитающего, содержащие комбинацию нейтрализующих грипп антител, направленных против циркулирующих штаммов вируса гриппа. В соответствии с одним из аспектов настоящего изобретения предложены композиции для интраназального введения, состоящие из комбинации нейтрализующих грипп антител, направленных против циркулирующих штаммов вируса гриппа, в частности, состоящие из антитела к гриппу А анти-Н1, антитела к гриппу А анти-Н3 и антитела к гриппу В. В соответствии с одним из аспектов композиция содержит антитело к гриппу А, эффективное против или также эффективное против других штаммов гриппа, включая, но не ограничиваясь ими, штаммы Н2, Н5 и Н7.

[00227] Композиции подходят для применения и для лечения или профилактики вируса гриппа. В соответствии с конкретным аспектом композиции подходят для уменьшения передачи вируса гриппа.

[0002] В конкретном варианте реализации предложена композиция, содержащая комбинацию антител, содержащую антитело Mab53(TRL053), антитело Mab579(TRL579), фрагменты указанных антител или биспецифические антитела на их основе, и одно или более антител к вирусу гриппа В, выбранных из TRL847, TRL845, TRL849, TRL848, TRL846, TRL854, TRL809 и TRL832.

[00228] В некоторых вариантах реализации предложена фармацевтическая композиция, содержащая (а) первое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую HCDR1/HCDR2/HCDR3 с SEQ ID NO: 11, 12, 13, и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую LCDR1/LCDR2/LCDR3 с SEQ ID NO: 14, 15, 16; (b) второе антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую HCDR1/HCDR2/HCDR3 с SEQ ID NO: 21, 22, 23, и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую последовательности CDR-домена LCDR1/LCDR2/LCDR3 с SEQ ID NO: 24, 25, 26; и (с) одно или более нейтрализующих вирус гриппа антител, направленных против гриппа В, в частности, против линии Ямагата и/или линии Виктория, при этом указанное антитело или его фрагмент выбран из антитела или его фрагмента, содержащего аминокислотную последовательность тяжелой цепи и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащие определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1), определяющую комплементарность область 2 тяжелой цепи (HCDR2); и определяющую комплементарность область 3 тяжелой цепи (HCDR3), HCDR1/HCDR2/HCDR3, выбранные из группы, состоящей из 31/32/33; 41/42/43; 51/52/53; 61/62/63; 71/72/73; 81/82/83; 91/92/93; 101/102/103; 111/112/113; 121/122/123; 131/132/133; 141/142/143; 151/152/153; 161/162/163; 171/172/173; 181/182/183; 191/192/193; 201/202/203; 211/212/213; 221/222/223; 231/232/233; 241/242/243; 251/252/253; 261/262/263; 271/272/273 и 281/282/283, или их высокогомологичные варианты, содержащие от 1 до 3 замен аминокислот в одной или более последовательностях CDR-домена, при этом указанные варианты и указанное антитело обладают свойством связывания и ингибирования вируса гриппа.

[00229] В некоторых вариантах реализации предложена фармацевтическая композиция, содержащая (а) первое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую HCDR1/HCDR2/HCDR3 с SEQ ID NO: 11, 12, 13, и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую LCDR1/LCDR2/LCDR3 с SEQ ID NO: 14, 15, 16; (b) второе антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую HCDR1/HCDR2/HCDR3 с SEQ ID NO: 21, 22, 23, и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую последовательности CDR-домена LCDR1/LCDR2/LCDR3 с SEQ ID NO: 24, 25, 26; и (с) одно или более нейтрализующих вирус гриппа антител, направленных против гриппа В, в частности, против линии Ямагата и/или линии Виктория, при этом указанное антитело или его фрагмент выбран из антитела или его фрагмента, содержащего аминокислотную последовательность тяжелой цепи и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую определяющую комплементарность область 3 легкой цепи (LCDR3), LCDR1/LCDR2/LCDR3, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 34/35/36; 44/45/46; 54/55/56; 64/65/66; 74/75/76; 84/85/86; 104/105/106; 114/115/16; 124/125/126; 134/135/136; 144/145/146; 154/155/156; 164/165/166; 174/175/176; 184/185/186; 194/195/196; 204/205/206; 214/215/216; 224/225/226; 234/235/236; 244/245/246; 254/255/256; 264/265/266; 274/275/276; и 284/285/286, или их высокогомологичные варианты, содержащие от 1 до 3 замен аминокислот в одной или более последовательностях CDR-домена, при этом указанные варианты способны связывать и ингибировать вирус гриппа.

[00230] В некоторых вариантах реализации предложены композиции, содержащие (а) первое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую HCDR1/HCDR2/HCDR3 с SEQ ID NO: 11, 12, 13, и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую LCDR1/LCDR2/LCDR3 с SEQ ID NO: 14, 15, 16; (b) второе антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую HCDR1/HCDR2/HCDR3 с SEQ ID NO: 21, 22, 23, и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую последовательности CDR-домена LCDR1/LCDR2/LCDR3 с SEQ ID NO: 24, 25, 26; и (с) одно или более нейтрализующих вирус гриппа антител или фрагментов, направленных против гриппа В, в частности, против линии Ямагата и/или линии Виктория, при этом указанное антитело или его фрагмент выбран из антитела или его фрагмента, содержащего аминокислотную последовательность тяжелой цепи и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащие последовательности CDR тяжелой и легкой цепи, HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 31/32/33/34/35/36; 41/42/43/44/45/46; 51/52/53/54/55/56; 61/62/63/64/65/66; 71/72/73/74/75/76; 81/82/83/84/85/86; 91/92/93/94/95/96; 101/102/103/104/105/106; 111/112/113/114/115/116; 121/122/123/124/125/126; 131/132/133/134/135/136; 141/142/143/144/145/146; 151/152/153/154/155/156; 161/162/163/164/165/166; 171/172/173/174/175/176; 181/182/183/184/185/186; 191/192/193/194/195/196; 201/202/203/204/205/206; 211/212/213/214/215/216; 221/222/223/224/225/226; 231/232/233/234/235/236; 241/242/243/244/245/246; 251/252/253/254/255/256; 261/262/263/264/265/266; 271/272/273/274/275/276; и 281/282/283/284/285/286, или их высокогомологичные варианты, содержащие от 1 до 3 замен аминокислот в одной или более последовательностях CDR-домена, при этом указанные варианты способны связывать и ингибировать вирус гриппа.

[00231] В некоторых вариантах реализации предложена фармацевтическая композиция, содержащая (а) первое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую HCDR1/HCDR2/HCDR3 с SEQ ID NO: 11, 12, 13, и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую LCDR1/LCDR2/LCDR3 с SEQ ID NO: 14, 15, 16; (b) второе антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую HCDR1/HCDR2/HCDR3 с SEQ ID NO: 21, 22, 23, и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую последовательности CDR-домена LCDR1/LCDR2/LCDR3 с SEQ ID NO: 24, 25, 26; и (с) одно или более нейтрализующих вирус гриппа антител или фрагментов, направленных против гриппа В, в частности, против линии Ямагата и/или линии Виктория, при этом указанное антитело или его фрагмент выбран из антитела или его фрагмента, содержащего аминокислотную последовательность тяжелой цепи и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащие пару последовательностей HCVR/LCVR, выбранную из группы, состоящей из 39/40, 49/50, 59/60, 69/70, 79/80, 89/90, 99/100, 109/110, 119/120, 129/130, 139/140, 149/150, 159/160, 169/170, 179/180, 189/190, 199/200, 209/210, 219/220, 229/230, 239/240, 249/250, 259/260, 269/270, 279/280 и 289/290.

[00232] В некоторых вариантах реализации нейтрализующие антитела, подходящие для доставки в дыхательные пути, например, интраназальной доставки и введения, могут быть комбинированы с не нейтрализующими антителами. Настоящая заявка показывает, что интраназальное введение можно комбинировать с альтернативными путями введения, включая интраперитонеальное или внутривенное введение, для обеспечения полной и усиленной комбинацией эффективности. Предложенное согласно настоящему изобретению комбинированное интраназальное и интраперитонеальное введение антитела обеспечивает повышенную синергетическую активность и эффективность по сравнению с либо одним интраназальным введением, либо одним интраперитонеальным введением. В дополнение к предложенному заменяющему или альтернативному способу введения или лечения, согласно настоящему изобретению предложен усиленный подход на основе комбинации к опосредуемой антителами терапии и профилактике, при котором легочное введение комбинируют с системным введением для наивысшей эффективности.

[00233] В некоторых вариантах реализации альтернативные способы дозирования антител путем легочного введения позволяют применять более низкие дозы, составы в более низких дозах и эффективные противогриппозные композиции комбинированных антител широкого спектра.

[00234] В некоторых вариантах реализации предложена комбинация связывающих молекул, в частности моноклональных антител человека или их фрагментов, которые нейтрализуют и эффективны против вируса гриппа, при этом указанная комбинация эффективна против вирусов гриппа А группы 1, вирусов гриппа А группы 2 и вирусов гриппа В. Указанная комбинация антител эффективна для лечения или профилактики вирусов гриппа А и В, что таким образом обеспечивает эффективный агент против всех значимых и циркулирующих вирусов гриппа в одной композиции или дозе.

[00235] Согласно настоящему изобретению предложена композиция, содержащая или состоящая из комбинации моноклональных антител к вирусу гриппа или их фрагментов, которые эффективны в комбинации для лечения или профилактики гриппа А и гриппа В.

[00236] Композиция, содержащая комбинацию, может быть введена для эффективного воздействия на неохарактеризованную и неопределенную инфекцию, вызванную гриппом. В соответствии с конкретным аспектом настоящего изобретения композицию, содержащую комбинацию, вводят непосредственно в дыхательные пути, в том числе путем интраназального или ингаляционного введения. В частности, комбинацию или коктейль антител вводят в однократной дозе или их можно вводить несколькими циклами дозирования, или последовательным введением каждого антитела. Таким образом, коктейль антител так же эффективен против любого неизвестного или неопределенного циркулирующего вируса гриппа, как и одно специально выбранное антитело против определенного целевого гриппа. Например, введение коктейля так же эффективно против любого конкретного вируса H1 группы 1, как и одно антитело, специфичное к вирусу H1.

[00237] В некоторых вариантах реализации антитела в комбинации демонстрируют определенные признаки и аспекты, которые делают их эффективными и наиболее применимыми, и полезными в комбинации. В соответствии с конкретными аспектами все антитела в комбинациях согласно настоящему изобретению демонстрируют значительное связывание и аффинность к вирусу гриппа.

[00238] В некоторых вариантах реализации антитела в комбинации можно совместно включать в состав, смешивать или последовательно вводить с другими антителами для лечения широкого спектра гриппоподобных заболеваний, включая такие патогены, как РСВ, PAIV или MPV.

[00239] В некоторых вариантах реализации каждое из антител в эффективной комбинации демонстрирует нМ- или суб-нМ-аффинность к нескольким штаммам гриппа. Это представляет собой аспект, который отличается и особенно подходит, и применим по сравнению с другими известными или существующими антителами. Например, Mab53 и Mab579 демонстрируют нМ- или суб-нМ-аффинность к различным штаммам H1 (а также Н5) или Н3 (а также Н7) соответственно, демонстрируя значительно более высокую аффинность связывания по сравнению с CR6261 и CR8020 (WO 2013/086052). Антитела к гриппу В в комбинации согласно настоящему изобретению аналогичным образом демонстрируют нМ- или суб-нМ-аффинность связывания в отношении штаммов гриппа В клад как линии Ямагата, так и линии Виктория.

[00240] В некоторых вариантах реализации антитела в соответствии с аспектами комбинирования согласно настоящему изобретению разработаны и отобраны таким образом, что обладают схожими биофизическими свойствами, включая изоэлектрическую точку (pI). В некоторых вариантах реализации каждое из антител, выбранных для объединения в композицию, демонстрирует pI в пределах ±2 pI-точки относительно другого, в пределах ±1,5 pI-точки, в пределах ±1,0 pI-точка или ±0,5 pI-точки относительно другого.

[00241] В некоторых вариантах реализации антитела в соответствии с аспектами комбинирования согласно настоящему изобретению разработаны и отобраны таким образом, что обладают схожими биофизическими свойствами, такими как сильная термическая устойчивость. В соответствии с некоторыми аспектами предложены антитела, которые демонстрируют первую температуру плавления (Tm1) в анализе кривой плавления, проводимом в ФБР, равную ≥50°С, ≥55°С, ≥60°С, ≥65°С или ≥70°С.

[00242] В некоторых вариантах реализации разработаны и экспрессированы антитела предпочтительно со схожими или сопоставимыми последовательностями константной области, и они предпочтительно относятся к одному и тому же IgG, выбранному из IgG1, IgG2, IgG2, IgG3 или IgG4 человека. В данной области техники также известны модифицированные последовательности Fc для обеспечения большего времени полужизни в кровообращении.

[00243] В некоторых вариантах реализации предложены антитела к гриппу В, содержащие аминокислотную последовательность константной области IgG1 человека. В некоторых вариантах реализации предложены антитела к гриппу В, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 297 константной области IgG1 человека. В некоторых вариантах реализации предложены антитела к гриппу В, содержащие константную область SEQ ID NO: 295 легкой каппа-цепи человека или константную область SEQ ID NO: 296 легкой лямбда-цепи человека.

[00244] В некоторых вариантах реализации предложены композиции антител, содержащие антитела к гриппу В, содержащие константную область SEQ ID NO: 297 IgG1 человека. В некоторых вариантах реализации предложены композиции антител, содержащие антитела к гриппу В, содержащие константную область SEQ ID NO: 295 легкой каппа-цепи человека или константную область SEQ ID NO: 296 легкой лямбда-цепи человека.

[00245] В некоторых вариантах реализации предложена композиция, содержащая комбинацию одного или более антител к гриппу А и одного или более антител к гриппу В. В соответствии с некоторыми аспектами антитела в указанной комбинации демонстрируют одно или более свойств, выбранных из агрегации антитела от низкой до ее отсутствия, отсутствия межмолекулярной ассоциации и/или отсутствия конкурентного связывания. Данные аспекты продемонстрированы и проиллюстрированы на примере антител в комбинациях согласно настоящему изобретению.

[00246] Настоящее изобретение относится к идентификации нового способа, протокола и средства для эффективного лечения и профилактики инфекций, вызываемых вирусом гриппа, путем введения коктейля антител согласно настоящему изобретению в дыхательные пути или дыхательный тракт, например, путем интраназального или ингаляционного введения нейтрализующего антитела (антител). Интраназальное или ингаляционное введение нейтрализующих вирус гриппа антител более эффективно лечит или блокирует вирус в терапевтических или профилактических целях, чем альтернативные способы введения, такие как интраперитонеальное введение. Ингаляционная и/или интраназальная доставка и введение лучше, более действенны и эффективны в более низких дозах, чем системное введение (в/в или и/п) этого же антитела или комбинации антител в тех же количествах. Эффективным является лечение или профилактика антителом (антителами), доставляемым интраназально, до или даже после воздействия вируса или инфекции.

[00247] Способы или протоколы, комбинирующие дозу антитела для легочного введения с дозой антитела для системного введения, являются особенно эффективными в терапевтических или профилактических целях против вируса гриппа. Такие способы или протоколы включают комбинацию одной или более доз антитела для интраназального или ингаляционного введения с одной или более дозами антитела для интраперитонеального или внутривенного введения. Дозу для интраназального или ингаляционного введения можно вводить до, после, одновременно или последовательно с дозой для интраперитонеального или внутривенного введения. Можно вводить одну или более доз для интраназального, ингаляционного, интраперитонеального или внутривенного введения. Антитело, вводимое интраназально, может представлять собой фрагмент антитела, не содержащий Fc или не обладающий эффекторной функцией, такой как Fab, тогда как антитело, вводимое интраперитонеально, может обладать эффекторной функцией или усиленной эффекторной функцией.

[00248] Согласно настоящему изобретению нейтрализующее антитело вводят в дыхательные пути или дыхательный тракт для достижения повышенной эффективности против вируса, в частности вируса гриппа. Введение в дыхательные пути или дыхательный тракт можно осуществлять любым признанным или известным способом, и оно может включать ингаляционное введение или интраназальное введение. Для повышения эффективности антитело доставляют в один или более из: верхних дыхательных путей и нижних дыхательных путей, и может включать носовую полость, нос, пазуху, горло, глотку, гортань, трахею, бронхи и легкие.

[00249] Термин «ингаляция» относится к принятию внутрь, в частности в контексте принятия внутрь или введения агента или соединения, включая антитело или его активный фрагмент, или содержащую их композицию, при котором указанный агент, соединение, антитело, фрагмент, в том числе содержащиеся в композиции, доставляют в весь или часть дыхательных путей. Дыхательные пути могут включать в себя верхние и/или нижние дыхательные пути. Верхние дыхательные пути включают нос, носовую полость, пазухи, гортань, трахею. Нижние дыхательные пути включают легкие, дыхательные пути (бронхи и бронхиолы) и альвеолярные мешочки (альвеолы). Ингаляция может происходить через нос или через рот, или путем непосредственного введения в нижние дыхательные пути, как в случае внутритрахеального введения. Таким образом, ингаляция может включать только или главным образом введение в нос, интраназальное введение, ингаляцию через рот, пероральную ингаляцию, внутритрахеальную ингаляцию, внутритрахеальную инсталляцию. Таким образом, ингаляция предусматривает и предполагает любой способ введения, посредством которого лекарственное средство, агент, композиция, антитело, фрагмент достигает или осаждается исключительно, в частности или предпочтительно на или в дыхательных путях, включая верхние и/или нижние дыхательные пути.

[00250] В настоящем описании термин «интраназальный» включает, но не ограничивается ими, введение или введение, происходящее в пределах или через нос или структуры носа, или доставку в дыхательные пути, например, путем ингаляции. В настоящем описании термин «интраназальный», проиллюстрированный в качестве варианта реализации в примерах, не ограничивается или не подразумевает ограничение введением непосредственно или специально, или исключительно через нос или носовую полость, в частности, не исключает другие способы введения, посредством которых лекарственное средство, агент, антитело, фрагмент, композицию доставляют или иным образом направляют, осаждают в или на, или иным образом распределяют в дыхательные пути.

[00251] Устройства для введения или доставки в дыхательный тракт или дыхательный путь (пути) известны и признаны в данной области техники и в клинической или медицинской практике, и применимы в способах, протоколах и композициях согласно настоящему изобретению. Устройства включают дозирующий ингалятор, помпы для распыления отмеренных доз, аэрозольный ингалятор с ручным распылителем, распылители малого или большого объема, ультразвуковой распылитель и ингалятор сухого порошка.

[00252] Варианты реализации, описанные в настоящем документе, применимы для лечения или профилактики, в частности, от агентов или патогенов, которые прицельно воздействуют, инфицируют или поражают дыхательные пути. Данные вирусы могут демонстрировать репликацию в апикальной части, что позволяет нейтрализовать восприимчивость доставляемыми в легкие моноклональными антителами или их фрагментами, которые в таком случае могут обуславливать повышенную эффективность по сравнению с системной доставкой. Таким образом, настоящие варианты реализации применимы для лечения или профилактики респираторных инфекций, в частности, респираторных вирусов, а также от агентов, ассоциированных или причинно связанных с респираторным заболеванием. Распространенные респираторные вирусные заболевания представляют собой заболевания, вызываемые различными вирусами, которые имеют схожие признаки и поражают верхние дыхательные пути. Вовлеченные вирусы могут представлять собой вирусы гриппа, респираторно-синцитиальный вирус (RSV), вирусы парагриппа и респираторные аденовирусы. Вирусы парагриппа являются основной причиной крупа у детей младшего возраста, и могут вызывать бронхит, пневмонию и бронхиолит. Аденовирусы проникают главным образом в дыхательные пути и желудочно-кишечный тракт, и конъюнктиву глаз. Аденовирусы могут вызывать различные заболевания от фарингита до пневмонии, конъюнктивит и диарею. Симптомы могут появляться через 1-10 дней после воздействия вирусов.

[00253] В клиническом введении антител для лечения или облегчения состояний (рак, воспалительные состояния, противовирусные агенты, противоинфекционные агенты) применяли исключительно системное введение и, как правило, внутривенное введение, которое требует больших и дорогостоящих количеств антитела, участия медицинского персонала и значительного времени для введения (типичная доза для внутривенного введения рассчитана на 2 часа). В то время как другие способы введения, такие как интраназальный, могут быть упомянуты, в частности в патентах или заявках, включающих данные антитела, интраназальное введение считается эквивалентной альтернативой в лучшем случае, полностью игнорируется или не рассматривается, возможно, потому, что оно менее понятно, считается менее привлекательным или менее эффективным и, как полагают, активирует иммунологическую систему непрямо или в меньшей степени прямо, чем интраперитонеальный или внутривенный пути введения. Однако настоящее изобретение и удивительные исследования, представленные в настоящем документе, демонстрируют, что интраназальное введение действительно является предпочтительной и более эффективной альтернативой, особенно для нейтрализующих антител. В частности, нейтрализующие антитела, которые могут действовать на участке или в месте первичного поражения или воздействия патогена, более эффективны по сравнению с альтернативными способами введения. Таким образом, нейтрализующие антитела, прицельно воздействующие на грипп, демонстрируют резкие отличия в эффективности, обусловленные отчасти другими механизмами действия при введении легочным путем по сравнению с системным путем.

[00254] Введение в дыхательные пути дает уникальную возможность доставлять эффективную низкую дозу и осуществлять малозатратную терапию, для которой таким образом не будет требоваться подтверждения путем проведения диагностического анализа. Проявления симптомов во время сезона гриппа будет достаточно врачам для введения данного низкодозового коктейля, например, в виде ингалятора сухого порошка или в виде распылителя, или другим способом доставки в дыхательные пути. Данный не требующий диагностики стандарт лечения является современной практикой для Тамифлю и Реленза, но он бы не был возможен в случае дорогостоящей внутривенной терапии антителом, которая была бы непрактичной и чрезмерно затратной. После завершения диагностики введение антитела в высокой дозе можно было бы осуществлять либо системным, например внутривенным, путем, либо через дыхательные пути, и оно могло быть представлено в виде коктейля или в виде отдельного конкретного антитела, специфичного к типу гриппа.

[00255] Таким образом, согласно настоящему изобретению легочная доставка антител обеспечивает заметное и значительное повышение эффективности по сравнению с системными путями, такими как внутривенный или интраперитонеальный путь. Более того, повышенную эффективность при интраназальном введении демонстрируют антитела, которые являются нейтрализующими. Не нейтрализующие антитела, в частности антитела, которые не демонстрируют прямое ингибирование или блокирование вируса гриппа при использовании принятых или известных анализов нейтрализации или блокирования вирусов, демонстрируют снижение эффективности при интраназальной доставке по сравнению с системным или интраперитонеальным введением. Настоящие исследования показывают, что интраназальная (и/н) доставка нейтрализующих антител может значительно повышать терапевтическую и профилактическую эффективность более чем в 10 раз по сравнению с интраперитонеальным (и/п) или внутривенным (в/в) путем доставки, при использовании принятой и известной модели гриппа у мышей. Сопоставимая эффективность может быть достигнута с применением менее одной десятой этой же дозы при введении интраназально, а не внутривенным или интраперитонеальным путем. Нейтрализующие антитела, вводимые в дыхательные пути, например, интраназально, могут значительно повышать терапевтическую эффективность на порядок величины, в частности, в 10-100 раз или по меньшей мере в 10-100 раз. Нейтрализующие антитела, вводимые интраназально, могут значительно повышать терапевтическую эффективность по меньше мере в 10 раз, по меньшей мере в 50 раз, более чем в 10 раз, более чем в 50 раз, более чем в 100 раз, до 100 раз, по сравнению с интраперитонеальным (и/п) введением этого же антитела в аналогичных условиях. Интраназальное введение нейтрализующих антител обеспечивает новый и неожиданный подход к профилактике и лечению инфекции, в частности, включая инфекцию, вызываемую гриппом. В настоящее время интраназальное введение можно эффективно осуществлять и комбинировать с другими формами введения для получения более эффективных и менее дорогостоящих подходов к лечению и профилактике. Введение в дыхательные пути, включая интраназальное введение, обеспечивает эффективность комбинации или коктейля антител в однократной дозе против любого ожидаемого вируса гриппа.

КОМПОЗИЦИИ

[00256] Согласно настоящему изобретению предложены композиции комбинированных антител для применения и эффективности против гриппа. Композиции комбинированных антител эффективны в низких дозах при введении непосредственно в дыхательные пути, например, интраназально. Композиции, в частности, содержат комбинацию антител, в частности нейтрализующих антител, в частности моноклонального антитела или его активного фрагмента, в частности противовирусного антитела, в частности антитела к гриппу. Нейтрализующее антитело (антитела) может нейтрализовать более одного типа или подтипа вируса гриппа и его комбинируют с антителами, нейтрализующими различные типы или группы гриппа. Композиция согласно настоящему изобретению, в частности, содержит комбинацию нейтрализующих грипп антител, направленных против циркулирующих штаммов вируса гриппа. Композиция (композиции), в частности, содержит комбинацию нейтрализующих грипп антител, направленных против циркулирующих штаммов вируса гриппа, в частности, антитела к гриппу А и антитела к гриппу В. Композиция (композиции), в частности, содержит комбинацию нейтрализующих грипп антител, при этом указанная комбинация в совокупности направлена против соответствующих и значимых циркулирующих штаммов вируса гриппа, в частности, в совокупности направлена против подтипов H1 и Н3 гриппа А, и против гриппа В линий Ямагата и Виктория. Композиция (композиции) может содержать три или более нейтрализующих антител, при условии, что указанная комбинация антител нейтрализует вирусы гриппа А и В.

[00257] Композиция (композиции), в частности, может содержать комбинацию нейтрализующих грипп антител, направленных против циркулирующих штаммов вируса гриппа, в частности, антитела к гриппу А анти-Н1, антитела к гриппу А анти-Н3 и антитела к гриппу В. Композиция (композиции) может содержать антитело к гриппу А, эффективное против или также эффективное против штаммов гриппа Н5 и Н7. Антитело к гриппу может быть штаммоспецифическим или -неспецифическим, или полиспецифическим и может нейтрализовать грипп А, включая подтип H1 и/или подтип Н3, и/или Н5, и/или Н7, или другие штаммы или подтипы гриппа А, и/или может нейтрализовать грипп В, включая линии Ямагата и/или Виктория. Композиции могут содержать идентичные компоненты или различные, или дополнительные компоненты в качестве композиций антител для альтернативного введения, такого как внутривенное или интраперитонеальное.

[00258] В некоторых вариантах реализации предложена композиция, содержащая нейтрализующее антитело или его фрагмент, включая Fab-фрагмент. Композиция согласно настоящему изобретению может содержать комбинацию антител, нейтрализующих вирус гриппа, в частности, антитела TRL053/Mab53 к группе 1, антитела TRL579/Mab579 к группе 2 и антитела к гриппу В, выбранного из TRL847, TRL845, TRL849, TRL848, TRL846, TRL854, TRL809 и TRL832, их фрагментов, их синтетических или рекомбинантных производных, их гуманизированных или химеризованных вариантов, и антител, содержащих CDR тяжелой и легкой цепи.

[00259] Антитело, нейтрализующее вирус, может представлять собой, в частности, фрагмент антитела, способный к нейтрализации. В соответствии с одним из аспектов указанный фрагмент антитела не содержит Fc и/или не обладает, или обладает сниженной эффекторной функцией. Фрагмент антитела может быть выбран из Fab, Fab' и F(ab')₂. Антитело или фрагмент, нейтрализующий вирус, может быть получен из рекомбинантного белка, может быть экспрессирован рекомбинантным способом, в том числе в виде активного фрагмента, или может быть получен или образован другими методами или способами, включая методы или способы получения нейтрализующего антитела или фрагмента (фрагментов) в пределах дыхательных путей или дыхательного тракта, в том числе посредством генетического материала или экспрессии ДНК или ДНК-вектора, например, путем доставки ДНК или РНК, кодирующей нейтрализующее антитело или его фрагмент (фрагменты).

[00260] Композиция согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, носитель или разбавитель. Композиция может содержать вспомогательное вещество, носитель, разбавители или добавку, подходящую или применимую для назальной или легочной доставки и для интраназального или ингаляционного введения. Композиция может содержать вспомогательное вещество, носитель, разбавители или добавку, подходящую или применимую для стимуляции или усиления иммунного ответа и/или опосредуемых антителом клеточных или системных эффектов. Композиция может содержать иммунологический медиатор или стимулятор иммунного ответа.

[00261] Согласно настоящему изобретению предложены способы лечения, профилактики или уменьшения, или ингибирования передачи вируса, в частности вируса гриппа. Согласно настоящему изобретению предложен способ лечения или профилактики вирусной инфекции у млекопитающего, подверженного воздействию, заразившегося или страдающего вирусом гриппа, включающий введение в дыхательные пути указанного млекопитающего, например, интраназально (и/н) или путем ингаляции, комбинации антител, предложенной согласно настоящему изобретению. В соответствии с конкретным аспектом указанная комбинация содержит антитело TRL053/Mab53 к группе 1, антитело TRL579/Mab579 к группе 2 и антитело к гриппу В, выбранное из TRL847, TRL845, TRL849, TRL848, TRL846, TRL854, TRL809 и TRL832, их фрагментов, их синтетических или рекомбинантных производных, их гуманизированных или химеризованных вариантов, и антител, содержащих CDR тяжелой и легкой цепи.

[00262] В соответствии с одним из аспектов указанного способа все моноклональные антитела в композиции, содержащей комбинацию, относятся к одному подтипу IgG и содержат идентичные или почти идентичные последовательности константной области. В соответствии с конкретным аспектом все антитела в комбинации представляют собой антитела IgG1.

[00263] В соответствии с указанным способом комбинацию антител можно вводить после инфицирования или после предполагаемого инфицирования, воздействия или проявления клинических симптомов. В соответствии с одним из аспектов комбинацию антител можно вводить в период времени до 8 часов после инфицирования. В качестве альтернативы, комбинацию антител вводят в период времени до 24 часов после инфицирования. В качестве дополнительной альтернативы, комбинацию антител вводят в период времени до 48 часов после инфицирования. В качестве дополнительной альтернативы, комбинацию антител вводят в период времени до 72 часов после инфицирования. Комбинацию антител можно вводить, в том числе в виде однократной дозы или в нескольких последовательных дозах в период до 8 часов после инфицирования (8 чпи), 12 часов после инфицирования, 18 часов после инфицирования, 24 часов после инфицирования, 36 часов после инфицирования, 48 часов после инфицирования, 72 часов после инфицирования, 1 дня после инфицирования, 2 дней после инфицирования, 3 дней после инфицирования, 4 дней после инфицирования, 5 дней после инфицирования, 6 дней после инфицирования, 7 дней после инфицирования, недели после инфицирования, 10 дней после инфицирования, 2 недель после инфицирования, 3 недель после инфицирования, 4 недель после инфицирования, месяца после инфицирования, нескольких месяцев после инфицирования.

[00264] Комбинацию антител вводят в однократной дозе или трех отдельных дозах одновременно или почти одновременно для того чтобы каждое антитело, необходимое в комбинации, было эффективно при введении.

[00265] В некоторых вариантах реализации предложена композиция, содержащая комбинацию двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти или более антител в любом соотношении. В некоторых вариантах реализации предложена композиция, содержащая 2-10 или 3-5 антител или фрагментов по массе приблизительно 10-80 масс. %; 20-50 масс. %; 25-40 масс. % каждого антитела или фрагмента от общей массы антител или фрагментов в композиции. В конкретном варианте реализации предложена композиция, содержащая по существу равную дозу или соотношение первого, второго и третьего антитела или фрагмента на уровне приблизительно 33 масс. % ±3 масс. % каждого из первого, второго и третьего антител или фрагментов от общей массы антител или фрагментов в композиции. В соответствии с конкретным предпочтительным аспектом антитела в комбинации вводят по существу в равном соотношении доз, в одинаковой величине дозы или в массовом соотношении 1:1:1 или равном соотношении.

[00266] В некоторых вариантах реализации предложена композиция, содержащая 2-10 антител, при этом эффективное количество каждого антитела в однократной дозе комбинации может составлять менее 10 мг/кг массы тела, менее 5 мг/кг массы тела, менее 2 мг/кг массы тела, 1 мг/кг массы тела или меньше. Количество каждого антитела в однократной дозе комбинации может составлять менее 1 мг/кг массы тела, менее 0,5 мг/кг, менее 0,1 мг/кг, менее 0,05 мг/кг. Может быть введено несколько доз комбинации антител. Каждая доза комбинации может быть одинаковой или дозы могут отличаться, например, начальная доза более высокая с последующими более низкими дозами, или начальная доза более низкая с последующими более высокими дозами. Однократная доза или дозы, или любая доза может составлять менее 1 мг/кг массы тела, менее 0,5 мг/кг, менее 0,1 мг/кг, менее 0,05 мг/кг. Начальная доза может быть больше 1 мг/кг, а дальнейшие или последующие дозы могут быть ниже или могут быть меньше 1 мг/кг.

[00267] Антитело может быть введено в дыхательные пути, например, интраназально или путем ингаляции, в нескольких дозах, при этом каждое антитело в каждой отдельной дозе комбинации составляет менее 1 мг/кг на дозу. В соответствии с таким аспектом, указанные несколько доз могут быть введены по меньшей мере с 2-часовым интервалом и до 72 часов или позже после предполагаемого инфицирования, воздействия или проявления клинических симптомов. Таким образом, дозы антител могут быть введены с интервалом в несколько минут или часов, или дней. Дозы антител могут быть введены после инфицирования или после предполагаемого инфицирования, или воздействия с интервалом в несколько часов или дней. Дозы антител могут быть введены после инфицирования или после предполагаемого инфицирования, или воздействия и спустя до 2, 4, 6, 8, 12, 24, 36, 48 или 72 часов.

[00268] Протокол или способ введения согласно настоящему изобретению может, в частности, включать первое введение антитела в дыхательные пути или дыхательный тракт, в частности путем ингаляционного или интраназального введения антитела, в комбинации или с последующим вторым или одним или более дополнительными введениями, осуществляемыми не ингаляционным или не интраназальным путем, например, путем системной доставки, такой как интраперитонеальное или внутривенное введение. Таким образом, способ может включать дополнительное введение вирусоспецифического моноклонального антитела интраперитонеально или внутривенно, при этом указанное дополнительно вводимое антитело представляет собой нейтрализующее или не нейтрализующее антитело. В этом случае начальная доза может быть для комбинации антител согласно настоящему изобретению с последующим одним антителом, направленным на вирусный подтип инфекции, в том числе определенный путем проведения клинических или диагностических анализов. Таким образом, первая доза комбинации антител является изначально эффективной, независимо от типа вируса гриппа. После определения типа вируса может быть введена вторая или дополнительная доза (дозы) комбинации, измененное соотношение комбинации, однонаправленное антитело. Вторая или дополнительная доза (дозы) может быть введена в дыхательные пути, например, путем ингаляции или интраназально, или может быть введена системно. Антитело, дополнительно вводимое системно, например, интраперитонеально или внутривенно, может представлять собой то же антитело, что и вводимое интраназально или путем ингаляции, или может представлять собой другое или измененное антитело относительно вводимого интраназально или путем ингаляции. Дополнительно вводимое антитело, например, интраперитонеально или внутривенно, может быть введено одновременно, последовательно или после антитела, введенного интраназально или путем ингаляции. Любое такое последующее введение можно осуществлять через несколько часов, и можно осуществлять через 2, 4, 6, 8, 12 или до 24 часов. Последующее введение можно осуществлять через несколько дней, и можно осуществлять через 1 день, 2 дня или 3 дня. Последующее введение можно осуществлять через несколько дней, и можно осуществлять спустя до 7 дней, спустя неделю или спустя несколько недель. Последующее введение можно осуществлять в однократной дозе или нескольких дозах через несколько часов и/или дней, и/или недель.

[00269] В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен протокол введения комбинации антител, направленных против вируса гриппа А и гриппа В, включающий введение первой вводимой в дыхательные пути дозы, например, дозы для интраназального или ингаляционного введения, комбинации антител, предложенных согласно настоящему изобретению, и последовательное или одновременное введение второй дозы или одной или более дополнительных доз антитела, которые не вводят в дыхательные пути или дыхательный тракт, и которые могут быть введены интраперитонеально или внутривенно, при этом антитело второй дозы или дополнительной дозы (доз) представляет собой то же антитело или антитело, отличное от антитела в комбинации первой дозы. Антитело второй дозы или дополнительной дозы (доз) может представлять собой измененное или модифицированное антитело, которое изменено или модифицировано для большей эффективности или действенности при внутривенном или интраперитонеальном введении. В соответствии с одним из аспектов антитело первой дозы может не обладать эффекторной функцией, например, Fab-антитело, а антитело второй дозы может обладать эффекторной функцией, содержать Fc или может быть модифицировано для демонстрации усиленной эффекторной функции.

[00270] Протокол может включать несколько доз комбинации антител согласно настоящему изобретению для введения путем ингаляции или интраназальным путем, и может включать несколько доз этой же комбинации, одного или более антител комбинации, или альтернативного антитела для введения интраперитонеальным или внутривенным путем. В соответствии с одним из аспектов указанного протокола можно осуществлять мониторинг субъекта или пациента, которому вводят антитело, например, на предмет клинического проявления заболевания или вирусной инфекции, и дозу или дозы можно изменять, понижать или повышать, или вводить с меньшим или большим интервалом в зависимости от состояния указанного пациента или субъекта и инфекции или заболевания.

[00271] В соответствии с одним из аспектов протокола вирус гриппа может представлять собой грипп А или грипп В, или неизвестный, или неопределенный вирус гриппа. Антитело второй дозы, которую не вводят в дыхательные пути, может представлять собой нейтрализующее или не нейтрализующее антитело, и может обладать эффекторной функцией или усиленной эффекторной функцией.

[00272] В соответствии с одним из аспектов протокола первая вводимая интраназально или путем ингаляции доза может содержать комбинацию антител согласно настоящему изобретению, каждое из которых составляет менее 1 мг/кг, менее 0,5 мг/кг, менее 0,1 мг/кг. Вторую или дополнительную и/п или в/в дозу, в частности, вводят в более высокой дозе, чем первую дозу для интраназального или ингаляционного введения. Вторую или дополнительную и/п или в/в дозу, в частности, вводят в дозе, по меньшей мере в 10 раз выше количества каждого или любого антитела, чем первая доза для интраназального или ингаляционного введения. Вторая или дополнительная и/п или в/в доза может составлять по меньшей мере 1 мг/кг, по меньшей мере 5 мг/кг, по меньшей мере 10 мг/кг, по меньшей мере 15 мг/кг или больше 10 мг/кг, или больше 20 мг/кг, или больше 50 мг/кг.

[00273] В соответствии с другим аспектом протокола первая доза для интраназального или ингаляционного введения может составлять меньше 1 мг/кг каждого антитела в комбинации, а вторая и/п или в/в доза может быть по меньшей мере в 10 раз выше в мг/кг, чем первая доза для интраназального введения. В соответствии с другим аспектом протокола первая доза для интраназального или ингаляционного введения может составлять меньше 1 мг/кг каждого антитела в комбинации, а вторая и/п или в/в доза может быть по меньшей мере в 50 раз выше в мг/кг, чем первая доза для интраназального введения. В соответствии с дополнительным аспектом первая доза для интраназального или ингаляционного введения может составлять меньше 0,5 мг/кг каждого антитела в комбинации, а вторая и/п или в/в доза может составлять по меньшей мере 5 мг/кг.

[00274] Доза каждого антитела в комбинации в первой дозе для интраназального или ингаляционного введения может составлять 10 мг/кг или менее 10 мг/кг, и может быть введена в течение 24 часов после предполагаемого инфицирования, воздействия или проявления клинических симптомов. Доза каждого антитела в комбинации в первой дозе для интраназального или ингаляционного введения может составлять 10 мг/кг или менее 10 мг/кг, и может быть введена в течение 48 часов после предполагаемого инфицирования, воздействия или проявления клинических симптомов. Доза каждого антитела в комбинации в первой дозе для интраназального или ингаляционного введения может составлять 10 мг/кг или менее 10 мг/кг, и может быть введена в течение 72 часов после предполагаемого инфицирования, воздействия или проявления клинических симптомов.

[00275] Другой аспект настоящего изобретения представляет собой способ ингибирования передачи респираторного вируса, включающий введение комбинации антител согласно настоящему изобретению в дыхательные пути, например, интраназально или путем ингаляции, субъекту, подверженному воздействию, риску воздействия или демонстрирующему клинические признаки инфекции, вызванной вирусом гриппа, при этом каждое антитело вводят в стандартной дозе, составляющей 1 мг/кг или меньше. Стандартная доза каждого антитела в комбинации может составлять менее 10 мг/кг или менее 1 мг/кг. Стандартная доза в указанном способе может составлять менее 0,5 мг/кг или менее 0,1 мг/кг, или менее 0,05 мг/кг.

[00276] Согласно настоящему изобретению предложены композиции комбинированных антител или композиции комбинации антител, в частности антител к гриппу и, в частности, моноклональных антител к гриппу, подходящие или выбранные для легочного введения, при этом указанная комбинация антител содержит, включает или состоит из антител, направленных против циркулирующих штаммов вируса, состоящих из сезонных и пандемических подтипов. Например, поскольку циркулирующие штаммы сезонного вируса гриппа в настоящее время представляют собой грипп В (линия Ямагата), грипп В (линия Виктория), подтип H1 гриппа А и подтип Н3 гриппа А, предложена содержащая комбинацию композиция согласно настоящему изобретению, включающая или содержащая антитело (антитела), направленное против каждого из: гриппа В (линия Ямагата), гриппа В (линия Виктория), подтипа H1 гриппа А и подтипа Н3 гриппа А. Настоящее изобретение включает включение других антител в коктейль для обеспечения дополнительного специфического охвата других подтипов, например, подтипа Н7.

[00277] В некоторых вариантах реализации предложена композиция, содержащая комбинацию антитела TRL053/Mab53 к группе 1, антитела TRL579/Mab579 к группе 2 и одного или более антител к гриппу В, выбранных из TRL784, TRL794, TRL798, TRL799, TRL809, TRL811, TRL812, TRL813, TRL823, TRL832, TRL833, TRL834, TRL835, TRL837, TRL839, TRL841, TRL842, TRL845, TRL846, TRL847, TRL848, TRL849, TRL851, TRL854, TRL856 и TRL858, их иммунореактивных фрагментов, их синтетических или рекомбинантных производных, их гуманизированных или химеризованных вариантов, и антител, содержащих CDR тяжелой и легкой цепи.

[00278] В некоторых вариантах реализации предложена фармацевтическая композиция, содержащая комбинацию антитела TRL053/Mab53 к группе 1, антитела TRL579/Mab579 к группе 2 и антитела к гриппу В, выбранного из TRL845, TRL846, TRL847, TRL848, TRL849 и TRL854, или их фрагментов, их синтетических или рекомбинантных производных, их гуманизированных или химеризованных вариантов, и антител, содержащих CDR тяжелой и легкой цепи.

[00279] В некоторых вариантах реализации предложена фармацевтическая композиция, содержащая комбинацию антитела TRL053/Mab53 к группе 1, антитела TRL579/Mab579 к группе 2 и антитела к гриппу В, выбранного из TRL845, TRL847 и TRL849, или их фрагментов, их синтетических или рекомбинантных производных, их гуманизированных или химеризованных вариантов, и антител, содержащих CDR тяжелой и легкой цепи. В некоторых вариантах реализации предложена противогриппозная композиция, содержащая комбинацию моноклональных антител к гриппу или их связывающих фрагментов, содержащую: (а) антитело или его фрагмент, содержащий аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую последовательности CDR-домена HCDR1/HCDR2/HCDR3 с SEQ ID NO: 11, 12, 13, и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую последовательности CDR-домена LCDR1/LCDR2/LCDR3 с SEQ ID NO: 14, 15, 16; (b) антитело или его фрагмент, содержащий аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую последовательности CDR-домена HCDR1/HCDR2/HCDR3 с SEQ ID NO: 21, 22, 23, и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую последовательности CDR-домена LCDR1/LCDR2/LCDR3 с SEQ ID NO: 24, 25, 26; и (с) антитело или его фрагмент, содержащий аминокислотную последовательность тяжелой цепи и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащие последовательности CDR-домена тяжелой и легкой цепи, HCDR1/HCDR2/HCDR3 и LCDR1/LCDR2/LCDR3 соответственно, выбранные из

(i) SEQ ID NO: 71, 72, 73 и SEQ ID NO: 74, 75, 76;

(ii) SEQ ID NO: 91, 92, 93 и SEQ ID NO: 94, 95, 96;

(iii) SEQ ID NO: 101, 102, 103 и SEQ ID NO: 104, 105, 106;

(iv) SEQ ID NO: 121, 122, 123 и SEQ ID NO: 124, 125, 126;

(v) SEQ ID NO: 181, 182, 183 и SEQ ID NO: 184, 185, 186;

(vi) SEQ ID NO: 191, 192, 193 и SEQ ID NO: 194, 195, 196;

(vii) SEQ ID NO: 201, 202, 203 и SEQ ID NO: 204, 205, 206;

(viii) SEQ ID NO: 211, 212, 213 и SEQ ID NO: 214, 215, 216;

(ix) SEQ ID NO: 221, 222, 223 и SEQ ID NO: 224, 225, 226;

(x) SEQ ID NO: 231, 232, 233 и SEQ ID NO: 234, 235, 236;

(xi) SEQ ID NO: 241, 242, 243 и SEQ ID NO: 244, 245, 246;

(xii) SEQ ID NO: 261; 262, 263 и SEQ ID NO: 264, 265, 266; и

(xiii) SEQ ID NO: 271, 272, 273 и SEQ ID NO: 274, 275, 276 соответственно.

[00280] Согласно настоящему изобретению предусмотрены и представлены в качестве примера их высокогомологичные варианты, содержащие от 1 до 3 замен аминокислот в одной или более последовательностях CDR-домена, при этом указанные варианты способны связывать и ингибировать вирус гриппа, при этом указанная композиция эффективна против вирусов гриппа А группы 1 и 2, и вирусов гриппа В.

[00281] В конкретных вариантах реализации предложены композиции, содержащие комбинацию антител, выбранных из: (а) антитела или его фрагмента, содержащего последовательности CDR тяжелой цепи и легкой цепи, HCDR1/HCDR2/HCDR3 и LCDR1/LCDR2/LCDR3 соответственно, с SEQ ID NO: 11, 12, 13 и SEQ ID NO: 14, 15, 16; антитела или его фрагмента, содержащего HCDR1/HCDR2/HCDR3 и LCDR1/LCDR2/LCDR3 соответственно с SEQ ID NO: 21, 22, 23 и SEQ ID NO: 24, 25, 26; и антитела или его фрагмента, содержащего HCDR1/HCDR2/HCDR3 и LCDR1/LCDR2/LCDR3 соответственно с SEQ ID NO: 201, 202, 203 и SEQ ID NO: 204, 205, 206; (b) антитела или его фрагмента, содержащего последовательности CDR тяжелой цепи и легкой цепи, HCDR1/HCDR2/HCDR3 и LCDR1/LCDR2/LCDR3 соответственно, с SEQ ID NO: 11, 12, 13 и SEQ ID NO: 14, 15, 16; антитела или его фрагмента, содержащего HCDR1/HCDR2/HCDR3 и LCDR1/LCDR2/LCDR3 соответственно с SEQ ID NO: 21, 22, 23 и SEQ ID NO: 24, 25, 26; и антитела или его фрагмента, содержащего HCDR1/HCDR2/HCDR3 и LCDR1/LCDR2/LCDR3 соответственно с SEQ ID NO: 221, 222, 223 и SEQ ID NO: 224, 225, 226; (с) антитела или его фрагмента, содержащего последовательности CDR тяжелой цепи и легкой цепи, HCDR1/HCDR2/HCDR3 и LCDR1/LCDR2/LCDR3 соответственно, с SEQ ID NO: 11, 12, 13 и SEQ ID NO: 14, 15, 16; антитела или его фрагмента, содержащего HCDR1/HCDR2/HCDR3 и LCDR1/LCDR2/LCDR3 соответственно с SEQ ID NO: 21, 22, 23 и SEQ ID NO: 24, 25, 26; и антитела или его фрагмента, содержащего HCDR1/HCDR2/HCDR3 и LCDR1/LCDR2/LCDR3 соответственно с SEQ ID NO: 231, 232, 233 и SEQ ID NO: 234, 235, 236; (d) антитела или его фрагмента, содержащего последовательности CDR тяжелой цепи и легкой цепи, HCDR1/HCDR2/HCDR3 и LCDR1/LCDR2/LCDR3 соответственно, с SEQ ID NO: 11, 12, 13 и SEQ ID NO: 14, 15, 16; антитела или его фрагмента, содержащего HCDR1/HCDR2/HCDR3 и LCDR1/LCDR2/LCDR3 соответственно с SEQ ID NO: 21, 22, 23 и SEQ ID NO: 24, 25, 26; и антитела или его фрагмента, содержащего HCDR1/HCDR2/HCDR3 и LCDR1/LCDR2/LCDR3 соответственно с SEQ ID NO: 241, 242, 243 и SEQ ID NO: 244, 245, 246; или (e) антитела или его фрагмента, содержащего последовательности CDR тяжелой цепи и легкой цепи, HCDR1/HCDR2/HCDR3 и LCDR1/LCDR2/LCDR3 соответственно, с SEQ ID NO: 11, 12, 13 и SEQ ID NO: 14, 15, 16; антитела или его фрагмента, содержащего HCDR1/HCDR2/HCDR3 и LCDR1/LCDR2/LCDR3 соответственно с SEQ ID NO: 21, 22, 23 и SEQ ID NO: 24, 25, 26; и антитела или его фрагмента, содержащего HCDR1/HCDR2/HCDR3 и LCDR1/LCDR2/LCDR3 соответственно с SEQ ID NO: 261, 262, 263 и SEQ ID NO: 264, 265, 266.

[00282] В некоторых вариантах реализации антитела в комбинации могут быть направлены против более одного штамма или подтипа гриппа, например, указанного на фиг. 3 и продемонстрированного в настоящем документе. Антитело mAb53 эффективно против подтипов H1, Н9, Н7 и Н5 гриппа А группы 1 и 2. Антитело Mab579 эффективно против подтипов Н3 и Н7. Таким образом, в то время как циркулирующие в настоящее время штаммы гриппа представляют собой типы H1, Н3 и В, могут быть получены комбинации, демонстрирующие эффективность против дополнительных штаммов и подтипов, включая подтипы, которые могут возникнуть и появиться в новом или единственном сезоне гриппа, и они предложены согласно настоящему изобретению.

[00283] Композиции могут быть, в частности, получены или содержать более низкие дозы или количества антитела, чем любая альтернативная лекарственная форма, например, для интраперитонеального или внутривенного введения. Таким образом, применяемые композиции согласно настоящему изобретению могут содержать сниженное в 5 раз, в 10 раз, в 20 раз, в 50 раз, в 100 раз, более чем в 10 раз, более чем в 100 раз количество нейтрализующего антитела относительно или по сравнению с композициями указанного антитела для альтернативного введения, в частности интраперитонеального или внутривенного введения.

[00284] В некоторых вариантах реализации предложены композиции, содержащие дозу каждого антитела, предназначенную для легочного введения, в частности интраназального введения, величина которой составляет менее 1 мг/кг исходя из массы тела млекопитающего. В некоторых вариантах реализации предложены композиции, содержащие антитело в количестве для введения, составляющем менее 10 мг/кг, менее 5 мг/кг или менее 1 мг/кг исходя из массы человека. Композиции согласно настоящему изобретению могут, в частности, содержать дозу антитела, предназначенную для введения, в частности интраназального введения, величина которой составляет менее 1 мг/кг, менее 0,5 мг/кг, менее 0,1 мг/кг, менее 0,05 мг/кг, менее 0,01 мг/кг, менее 0,005 мг/кг, менее 0,0025 мг/кг, менее 0,001 мг/кг исходя из массы тела млекопитающего, включая клинически значимое млекопитающее, такое как мышь, собака, лошадь, кошка или человек. В некоторых вариантах реализации терапевтически эффективная доза выбрана из примерно 100 мг/кг, 50 мг/кг, 10 мг/кг, 3 мг/кг, 1 мг/кг или 1 мг/кг. В соответствии с некоторыми аспектами эффективная профилактическая доза или доза для постконтактной профилактики выбрана из примерно 1 мг/кг, 0,1 мг/кг или примерно 0,01 мг/кг.

[00285] Специалист в данной области техники может определить, в том числе на основе эффективности в моделях у животных и с учетом клинического и физиологического ответа, вирусной нагрузки и скорости передачи вируса, соответствующую и эффективную дозу у млекопитающего, включая человека. Таким образом, настоящее изобретение и параметры дозирования не ограничиваются примерами, приведенными в настоящем документе, или конкретными дозами, приведенными в качестве примера. Настоящее изобретение демонстрирует, что ингаляционное или интраназальное дозирование является предпочтительной альтернативой с точки зрения эффективности и уменьшения, ограничения или блокирования клинически проявляющегося действия вирусной инфекции, включая инфекцию, вызванную вирусом гриппа. Ингаляционное или интраназальное введение нейтрализующих антител обеспечивает повышенную и усиленную эффективность по сравнению с другими путями введения, включая интраперитонеальный или внутривенный, которую нельзя было ожидать или предсказать. Повышенная эффективность благодаря легочной доставке дает возможность включать несколько mAb в коктейль, что позволяет разработать коктейль для всех типов/подтипов гриппа. Специалист в данной области техники может также оценить количество и время дозирования интраназальным путем или путем ингаляции. Исследования, представленные в настоящем документе, показывают, что интраназальное или ингаляционное введение более эффективно в более низких дозах по сравнению с интраперитонеальным или внутривенным введением, и что введение можно осуществлять через несколько дней после инфицирования с сохранением, тем не менее, эффективности.

[00286] Дозы и диапазоны доз, применяемые и продемонстрированные согласно настоящему изобретению в моделях у мышей, могут быть преобразованы или применены специалистом или клиническим специалистом, или специалистом-медиком при необходимости и с использованием параметров, известных в данной области техники. Таким образом, дозирование мг/кг у мыши может быть экстраполировано на сопоставимое или достаточно эквивалентное дозирование человеку или другому животному. Например, средняя масса лабораторной мыши составляет 20 г, тогда как средняя масса человека составляет 70 кг.

[0003] В клиническом исследовании обычной практикой является преобразование доз для животного в дозы для человека, и специалист в данной области техники будет ожидать, что такая преобразованная доза (дозы) будет эффективна у людей. Было описано межвидовое приведение и предсказание фармакокинетических параметров у людей (например, Mahmood et al. (2003) J Clin Pharmacol 43: 692-697; Mordenti (1986) Journal of Pharmaceutical Sciences, 75:1028-1040). Например, терапевтические уровни зачастую предполагают параллельную токсичность, поэтому обычно используют коэффициенты преобразования, применяемые для преобразования токсичности у животных в токсичность у людей, для преобразования минимальных эффективных доз у животных в минимальные эффективные дозы у людей. Кроме того, FDA предлагает «Руководство для промышленности» ("Guidance for Industry"), которое приводит коэффициенты преобразования для определения максимальной безопасной начальной дозы в клинических исследованиях для лекарственных средств, включая коэффициенты, используемые для преобразования доз для животного (мыши) в дозы для человека (например, в одном из случаев дозу для мыши умножают на 0,08).

[00287] Термин «фармацевтически приемлемый» относится к молекулярным соединениям и композициям, которые являются физиологически переносимыми и, как правило, не вызывают аллергической или подобной нежелательной реакции, такой как расстройство желудка, головокружение и т.п., при введении человеку.

[00288] Настоящее изобретение также предусматривает терапевтические композиции, подходящие для практического применения способов лечения согласно настоящему изобретению. Рассматриваемая терапевтическая композиция содержит смесь фармацевтически приемлемого вспомогательного вещества (носителя) с одним или более из: антитела или его активного фрагмента, в частности нейтрализующего антитела, его полипептидного аналога или его фрагмента, описанного в настоящем документе, в качестве активного ингредиента. В предпочтительном варианте реализации композиция содержит антитело или фрагмент, способный нейтрализовать вирус, в частности вирус гриппа, в целевой клетке или у субъекта, или пациента.

[00289] Получение терапевтических композиций, содержащих антитела, полипептиды, аналоги или активные фрагменты в качестве активных ингредиентов, хорошо известно в данной области техники. Как правило, такие композиции получают для введения либо в виде жидких растворов, либо суспензий, однако также могут быть получены твердые формы, подходящие для растворения или суспендирования в жидкости перед введением. Препарат может также быть эмульгирован. Активный терапевтический ингредиент часто смешивают со вспомогательными веществами, которые являются фармацевтически приемлемыми и совместимыми с активным ингредиентом. Подходящие вспомогательные вещества представляют собой, например, воду, физиологический раствор, декстрозу, глицерин, этанол и т.п., и их комбинации. Кроме того, при необходимости композиция может содержать незначительные количества вспомогательных веществ, таких как смачивающие агенты или эмульгаторы, рН-буферные агенты, которые повышают эффективность активного ингредиента.

[00290] Антитело, полипептид, аналог или активный фрагмент может быть включен в состав терапевтической композиции в нейтрализованной форме фармацевтически приемлемой соли. Фармацевтически приемлемые соли включают соли присоединения кислоты (образованные свободными аминогруппами молекулы полипептида или антитела), образованные неорганическими кислотами, такими как, например, хлористоводородная или фосфорная кислоты, или такими органическими кислотами, как уксусная, щавелевая, винная, миндальная и т.п. Соли, образуемые свободными карбоксильными группами, могут также быть получены из неорганических оснований, таких как, например, гидроксиды натрия, калия, аммония, кальция или железа, и таких органических оснований, как изопропиламин, триметиламин, 2-этиламиноэтанол, гистидин, прокаин и т.п.

[00291] Терапевтические композиции, содержащие антитело, полипептид, аналог или активный фрагмент, обычно вводят путем введения стандартной дозы, например. Термин «стандартная доза» применительно к терапевтической композиции согласно настоящему изобретению относится к физически раздельным объектам, подходящим для использования в качестве однократной дозы для введения людям; причем каждая доза содержит заранее определенное количество активного вещества, рассчитанное таким образом, чтобы обеспечить желаемый терапевтический эффект, совместно с необходимым разбавителем, т.е. носителем или средой.

[00292] В некоторых вариантах реализации носитель выбран из любого носителя, известного в данной области техники и подходящего для легочного введения. В некоторых вариантах реализации носитель выбран из соответствующих носителей для интраназального введения, например, описанных в Csaba et al., Adv Drug Deliv Rev. 2009, 61(2):140-157, содержание которого включено в настоящее описание посредством ссылки. В некоторых вариантах реализации носитель представляет собой систему на основе нано- или микрочастиц. В некоторых вариантах реализации носитель выбран из или содержит один или более из: разлагаемого крахмала, растворимого крахмала, полистирола, декстрана, хитозана, микрокристаллической целлюлозы (МКЦ), гидроксипропилцеллюлозы (ГПЦ), гидроксипропилметилцеллюлозы (ГПМЦ), карбомера, Карбопола® 974Р, мальтодекстрана, восковидного кукурузного крахмала, альгината, Сефадекса®, поли(винилового спирта), желатиновых полимеров, наночастиц полимолочной кислоты, покрытых гидрофильным полиэтиленгликолем (ПЭГ-наночастицы ПМК) (Vila et al., J Aerosol Med 2004; 17(2):174-185); наночастиц низкомолекулярного хитозана (Vila et al., Eur J Pharm Biopharm 2004 Jan; 67(1):123-131); частиц на основе полиакрилатного полимера (Zaman et al., Curr Drug Deliv 2010 Apr; 7(2): 118-124). В некоторых вариантах реализации носитель представляет собой фосфатный буферный раствор (ФБР). Системы для интраназальной доставки описаны в Ozsoy et al., Molecules 2009, 14, 3754-3779, содержание которого включено в настоящее описание посредством ссылки.

[00293] В некоторых вариантах реализации указанные наночастицы доставляют в легкие, избегая при этом печень и селезенку, путем адсорбции на эритроцитах согласно методике Anselmo et al., ACSNano 2013, опубликованной в интернете 10.1021/nn404853z. В данном способе наночастицы (например, сферические наночастицы, например, диаметром 200 нм или 500 нм), например, присоединяют к эритроцитам путем инкубации в соотношениях частицы/эритроциты, варьирующихся до 100/1.

[00294] В некоторых вариантах реализации эффективное и активное антитело или фрагмент заключают в раствор, порошок или суспензию, которые можно стабилизировать без использования вспомогательных веществ или с использованием вспомогательных веществ, которые не влияют на активность активного ингредиента (ингредиентов) и которые не токсичны для легких. Антитела могут денатурировать в окислительных или гидролитических условиях. В некоторых вариантах реализации водные составы для доставки антител посредством назальных спреев или путем инъекции получают с содержанием хелатирующих агентов или комплексообразующих агентов, таких как кофеин, декстран или циклодекстраны, или как иначе предложено согласно настоящему изобретению, для стабилизации антитела или фрагмента в растворе. Дополнительные сведения о таких вспомогательных веществах и аэрозольных или распыляемых композициях можно найти, например, в WO 2005/025506; Maillet, A. et al. 2008 Phar, Res. 25(6):1318-1326; Hatcha, J et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 2012 47(5):709-717, содержание всех из которых включено в настоящее описание посредством ссылки.

[00295] Некоторые стабилизирующие агенты несовместимы с легочной доставкой, поскольку такие стабилизирующие агенты вызывают местное воспаление или сильно токсичны. В некоторых вариантах реализации для дополнительного ингибирования распада растворов активных ингредиентов, составы антител или фрагментов заключают во флаконы из темного стекла, которые должным быть открыты специальным открывателем, подвергнуты фильтрации для удаления осколков стекла и перенесены в инъектор или спреевый распылитель непосредственно перед применением.

[00296] В других вариантах реализации раствор активного ингредиента может быть приготовлен непосредственно перед применением путем смешивания порошка активного ингредиента с жидкостью для инъекций, например, как в случае автоинъектора двухфазного формата (порошкообразную часть смешивают с жидкостью в стеклянном флаконе, шприце или блистерной упаковке (например, Pozen МТ300)). Такие подходы с использованием составов для немедленного введения могут быть использованы в попытке получения раствора для легочной доставки путем струйного или ультразвукового распыления. Однако любой из известных способов распыления, используемых для получения ингаляционных аэрозолей из водных растворов, подвергает активный ингредиент нагреванию и концентрациям кислорода, достаточным для того, чтобы вызвать различные немедленные изменения эффективности и активности. Вследствие данных трудностей, свойственных получению стабильного состава или его представлению в виде аэрозоля, активный ингредиент не подходил для введения путем легочной ингаляции. В другом способе доставке с помощью аэрозоля используют дозирующий ингалятор под давлением (pMDI), в котором галогенуглеродный пропеллент проталкивает раствор или суспензию антитела или фрагмента через маленькое отверстие с образованием мелкодисперсного вдыхаемого «тумана», состоящего из антитела или фрагмента внутри капелек пропеллента. Для получения стабильных составов для pMDI антитело или фрагмент должен быть способен образовывать растворы или суспензии мелких частиц, которые стабильны и физико-химически совместимы с пропеллентом и клапанным устройством pMDI. Вопросы стабильности раствора и его токсичности для легких, описанные выше, для назальных растворов или растворов для инъекций в равной степени применимы к составам для pMDI, и дополнительное требование совместимости с пропеллентом не позволяет использовать принятые совместимые с легкими реагенты, такие как вода или спирт. Для суспензий требуются мелкие частицы, которые меньше приблизительно 5,8 микрон (масс-медианный аэродинамический диаметр, необходимый для глубокого проникновения в легкие), и частица должна быть стабильной в суспензии. Такие частицы получают из основной массы антитела или фрагмента способами измельчения, такими как перемалывание, микронизация, измельчение, или способами многофазового осаждения, такими как сушка распылением, осаждение раствора или лиофилизация, с получением порошков, которые могут быть диспергированы в пропелленте. Данные способы зачастую непосредственно изменяют физико-химические свойства антитела или фрагмента вследствие термических или химических взаимодействий. Поскольку некоторые активные ингредиенты могут быть нестабильными, данные способы не признаны подходящими для получения порошков, которые могут быть повторно диспергированы в пропелленте, или если порошок является изначально диспергируемым, частицы со временем увеличиваются в размере или меняют свою химическую композицию при воздействии на состав с течением времени. Данная нестабильность вызывает изменения эффективности, активности или увеличивает размер частиц больше 3,0 микрон, что делает подходы с использованием состава в виде суспензии для pMDI неподходящими для аэрозольной доставки активных ингредиентов. Дополнительный способ получения аэрозолей для вдыхания заключается в применении ингаляторов сухого порошка, в которых порошкообразный состав антитела или фрагмента диспергируется во вдыхаемом воздухе пользователя и вдыхается в легкие. Трудности, описанные выше для составов в виде суспензии для pMDI, в равной степени относятся к получению стабильного состава в виде сухого порошка. Очевидно, что в данной области техники отсутствует подходящий состав для ингаляционной доставки активного ингредиента. Настоящее изобретение описывает новые стабильные составы активного ингредиента или его фармацевтически приемлемых солей для введения сухих порошков и суспензий в пропелленте путем аэрозольной ингаляции в легкие или ингаляции назального спрея. Такие составы можно применять для лечения различных заболеваний и состояний, включая, но не ограничиваясь ими, мигреневые головные боли. Более того, также описаны способы получения новых составов активного ингредиента или его фармацевтически приемлемых солей.

[00297] Активные компоненты, которые вводят путем ингаляции, должны проникать глубоко в легкие для оказания местного или, в качестве альтернативы, системного действия. Для достижения этого, частицы активного антитела или фрагмента должны иметь диаметр, который не превышает масс-медианный аэродинамический диаметр (MMAD) приблизительно 0,5-5,8 мкм. Частицы в данном оптимальном диапазоне размеров редко получают в ходе этапа кристаллизации, и для получения частиц в диапазоне 0,5-5,8 мкм необходимы вспомогательные способы. Такие вспомогательные способы включают, но не ограничиваются ими, измельчение путем размола на струйной мельнице, микронизацию и механическое измельчение, многофазовое осаждение, такое как осаждение раствора, сушка распылением, сушка методом сублимации или лиофилизация. Такие вспомогательные способы включают большие температурные и механические градиенты, которые могут непосредственно снижать эффективность и активность активного антитела или фрагмента, или вызывать топологические дефекты или химическую нестабильность, которые изменяют размер, форму или химическую композицию частиц при дальнейшей обработке или хранении. Данные вспомогательные способы также сообщают значительное количество свободной энергии частицам, которое обычно накапливается на поверхности частиц. Эта свободная энергия, накапливаемая частицами, производит когезионную силу, которая заставляет частицы агломерировать для уменьшения данной накопленной свободной энергии.

[00298] Процессы агломерации могут быть настолько обширными, что частицы активного антитела или фрагмента для вдыхания больше не присутствуют в составе в форме частиц или больше не могут быть получены из состава в форме частиц из-за высокой силы когезионного взаимодействия. Этот процесс усиливается в случае доставки путем ингаляции, поскольку частицы должны храниться в форме, подходящей для доставки с помощью устройства для ингаляции. Поскольку частицы хранятся в течение относительно длительного периода времени, процесс агломерации может усиливаться при хранении. Агломерация частиц препятствует повторному диспергированию частиц устройством для ингаляции, вследствие чего частицы для вдыхания, необходимые для легочной доставки и назальной доставки, не могут быть получены. Кроме того, большинство обычных фармацевтически способов, используемых для подавления эффекта агломерации, такие как применение носителей и/или вспомогательных веществ, не может быть использовано в лекарственных формах для ингаляции, поскольку нежелателен токсикологический профиль данных веществ в легких.

[00299] В настоящем документе описаны новые стабильные составы активного ингредиента или его фармацевтически приемлемых солей (называемые в настоящем описании DHE) для введения сухих порошков и суспензий в пропелленте путем аэрозольной ингаляции в легкие или ингаляции назального спрея. В одном из вариантов реализации DHE применяют в виде мезилатной соли. Порошок DHE получают с использованием способов на основе сверхкритической жидкости. Способы на основе сверхкритической жидкости дают значительные преимущества при получении частиц DHE для доставки путем ингаляции. Важно то, что способы на основе сверхкритической жидкости позволяют получать частицы для вдыхания желаемого размера за один этап, что устраняет необходимость во вспомогательных способах для уменьшения размера частиц. Таким образом, частицы для вдыхания, получаемые с использованием способов на основе сверхкритической жидкости, демонстрируют снижение свободной поверхностной энергии, что приводит к ослаблению когезионных сил и уменьшению агломерации. Получаемые частицы также демонстрируют равномерное распределение по размерам. Более того, получаемые частицы имеют гладкую поверхность и воспроизводимую кристаллическую структуру, что также способствует уменьшению агломерации. Такие способы на основе сверхкритической жидкости могут включать быстрое расширение (RES), усиленную диффузию в растворе (SEDS), газ-антирастворитель (GAS), сверхкритический антирастворитель (SAS), осаждение из газонасыщенного раствора (PGSS), осаждение из сжатого антирастворителя (РСА), аэрозольную жидкостную экстракцию (ASES) или любые комбинации вышеперечисленного. Технология, лежащая в основе каждого из данных способов на основе сверхкритической жидкости, хорошо известна в данной области техники и не будет повторно описана в настоящем документе. В одном из конкретных вариантов реализации используемый способ на основе сверхкритической жидкости представляет собой способ SEDS, описанный Palakodaty et al. в заявке США 20030109421. Способы на основе сверхкритической жидкости позволяют получать сухие частицы, которые могут быть непосредственно использованы путем предварительного дозирования в формат ингалятора сухого порошка (DPI), или частицы могут быть суспендированы/диспергированы непосредственно в суспендирующих средах, таких как фармацевтически приемлемый пропеллент, в формате дозирующего ингалятора (MDI). Получаемые частицы могут быть кристаллическими или могут быть аморфными в зависимости от используемого способа на основе сверхкритической жидкости и используемых условий (например, способ SEDS способен производить аморфные частицы). Как рассмотрено выше, получаемые частицы обладают лучшими свойствами по сравнению с частицами, получаемыми традиционными способами, включая, но не ограничиваясь ими, гладкую однородную поверхность, низкую энергию, равномерное распределение частиц по размерам и высокую степень чистоты. Данные характеристики повышают физико-химическую стабильность частиц и облегчают диспергирование частиц при использовании либо в формате DPI, либо в формате MDI. Размер частиц должен быть таким, чтобы обеспечивать ингаляцию частиц DHE в легкие при введении частиц аэрозоля. В одном из вариантов реализации распределение частиц по размерам составляет менее 20 микрон. В альтернативном варианте реализации распределение частиц по размерам находится в диапазоне MMAD от примерно 0,050 микрон до 10,000 микрон по данным измерения каскадными импакторами; в другом альтернативном варианте реализации распределение частиц по размерам находится в диапазоне MMAD от примерно и предпочтительно 0,400 до 3,000 микрон по данным измерения каскадными импакторами. Способы на основе сверхкритической жидкости, описанные выше, позволяют получать размеры частиц в нижней части данных диапазонов. В формате DPI частицы DHE могут быть электростатически, криометрически или традиционно дозированы в лекарственные формы, как известно в данной области техники. Частицу DHE можно использовать отдельно (в чистом виде) или совместно с одним или более фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами, такими как носители или дисперсионные порошки, включая, но не ограничиваясь ими, лактозу, маннозу, мальтозу и т.д., или покрытия на основе поверхностно-активных веществ. В одном из предпочтительных составов частицы DHE используют без дополнительных вспомогательных веществ. Одной из удобных лекарственных форм, широко применяемых в данной области техники, являются блистеры из фольги. В данном варианте реализации частицы DHE дозируют в блистеры из фольги без дополнительных вспомогательных веществ для применения с DPI. Типичные отмеряемые дозы могут находиться в диапазоне от примерно 0,050 миллиграмма до 2,000 миллиграмм или от примерно 0,250 миллиграмма до 0,500 миллиграмма. Блистеры вскрывают и их можно диспергировать во вдыхаемом воздухе с помощью электростатических, аэродинамических или механических сил, или любой их комбинации, как известно в данной области техники. В одном из вариантов реализации более 25% предварительно отмеренной дозы будет доставлено в легкие при ингаляции; в альтернативном варианте реализации более 50% предварительно отмеренной дозы будет доставлено в легкие при ингаляции; в другом альтернативном варианте реализации более 80% предварительно отмеренной дозы будет доставлено в легкие при ингаляции. Вдыхаемые фракции частиц DHE (определенные в соответствии с Фармакопеей США, глава 601) в результате доставки в формате DPI находятся в диапазоне от 25% до 90%, при этом остаточные частицы в блистере находятся в диапазоне от 5% от предварительно отмеренной дозы до 55% от предварительно дозированной дозы. В формате MDI частицы могут быть суспендированы/диспергированы непосредственно в суспендирующих средах, таких как фармацевтически приемлемый пропеллент. В одном из конкретных вариантов реализации суспендирующие среды представляют собой пропеллент.Желательно, чтобы пропеллент не служил растворителем для частиц DHE. Подходящие пропелленты включают Cι_4 гидрофторалкан, такой как, но не ограничиваясь ими, 1,1,1,2-тетрафторэтан (HFA 134а) и 1,1,1,2,3,3,3-гептафтор-н-пропан (HFA 227) либо отдельно, либо в любой комбинации. Диоксид углерода и алканы, такие как пентан, изопентан, бутан, изобутан, пропан и этан, могут быть также использованы в качестве пропеллентов или смешаны с пропеллентами, представляющими собой C\гидрофторалкан, рассмотренными выше. В случае смесей пропеллент может содержать 0-25% указанного диоксида углерода и 0-50% алканов. В одном из вариантов реализации получают дисперсию частиц DHE без поверхностно-активных веществ. В альтернативном варианте реализации дисперсия частиц DHE может содержать поверхностно-активные вещества при необходимости, при этом указанные поверхностно-активные вещества присутствуют в массовых соотношениях с DHE в диапазоне от 0,001 до 10. Типичные поверхностно-активные вещества включают олеаты, стеараты, миристаты, алкиловые эфиры, алкиларилэфиры, сорбаты и другие поверхностно-активные вещества, используемые специалистом в области получения составов антитела или фрагмента для доставки путем ингаляции, или любую комбинацию вышеперечисленных агентов. Конкретные поверхностно-активные вещества включают, но не ограничиваются ими, сорбитанмоноолеат (СПАН-80) и изопропилмиристат. Дисперсия частиц DHE может также содержать полярные растворители в малых количествах для облегчения солюбилизации поверхностно-активных веществ в случае использования. Подходящие полярные растворители включают С2-6 спирты и полиолы, такие как этанол, изопропанол, полипропиленгликоль, и любую комбинации вышеперечисленных соединений. Полярное антитело или фрагмент может быть добавлен в массовых соотношениях с пропеллентом в диапазоне от 0,0001% до 4%. Полярные растворители в количестве, превышающем 4%, могут реагировать с DHE или солюбилизировать DHE. В одном из конкретных вариантов реализации полярное антитело или фрагмент представляет собой этанол, используемый в массовом соотношении с пропеллентом от 0,0001 до 1%. К составам частиц DHE не добавляют дополнительную воду или гидроксилсодержащее антитело или фрагмент, отличный от находящегося в равновесии с фармацевтически приемлемыми пропеллентами и поверхностно-активными веществами. Пропелленты и поверхностно-активные вещества (при использовании) могут быть подвергнуты воздействию воды или гидроксилсодержащего антитела, или фрагмента перед их применением для того чтобы вода или гидроксилсодержащее антитело, или фрагмент находились в точке равновесия. Могут быть использованы стандартные дозирующие клапаны (например, от Neotechnics, Valois или Bespak) и баллоны (например, от PressPart или Gemi), которые подходят для композиции пропеллент/поверхностно-активное вещество. Объем содержимого баллона от 2,0 миллилитров до 17 миллилитров можно использовать для достижения количества доз от одного (1) до нескольких сотен срабатываний. Может быть предусмотрен счетчик доз с механизмом блокировки для ограничения конкретного количества доз независимо от объема содержимого. Общая масса DHE в суспензии пропеллента, как правило, будет находиться в диапазоне от 0,100 миллиграмма до 2,000 миллиграмм DHE на 100 микролитров пропеллента. Использование стандартных дозирующих клапанов MDI в диапазоне дозирования от 50 до 100 микролитров будет приводить к отмеренным дозам в диапазоне от 0,050 микрограмма до 1,000 микрограмма за одно срабатывание. Предпочтительно, можно использовать пускатель с активацией вдохом для максимального повышения координации ингаляции, но он не является обязательным для достижения терапевтической эффективности. Вдыхаемая фракция в случае таких MDI будет находиться в диапазоне от 25% до 75% от отмеренной дозы (как определено в соответствии с Фармакопеей США, глава 601).

[00300] Предусмотренная настоящим изобретением стандартная доза нейтрализующего антитела для интраназального введения, которая является эффективной и подходит для лечения или профилактики вируса, в частности вируса гриппа, сравнительно снижена по сравнению с указанной или требуемой для альтернативного введения, например, требуемой для интраперитонеального или внутривенного введения. Таким образом, в соответствии с одним из аспектов предложена композиция антител для введения, в частности интраназального введения, при этом стандартная доза снижена на порядок величины, в частности несколько или множество порядков по сравнению с указанной или требуемой для альтернативного введения, например, требуемой для интраперитонеального или внутривенного введения. Таким образом, в соответствии с одним из аспектов предложена композиция антител для введения, в частности интраназального введения, при этом стандартная доза снижена по меньшей мере в 10 раз, в 10 раз, в 20 раз, в 25 раз, в 50 раз, по меньшей мере в 100 раз, в 100 раз, в 500 раз, до 1000 раз. В частности, композиция, таким образом, снижена по сравнению с эквивалентной стандартной дозой для интраперитонеального или внутривенного введения, в частности, для достижения такого же или сопоставимого показателя или эффекта, и/или активности. Стандартная доза для интраназального введения может быть комбинирована с дозой для интраперитонеального или внутривенного введения для повышения эффективности.

[00301] Композиции вводят способом, совместимым с дозированной лекарственной формой, и в терапевтически эффективном количестве. Вводимое количество зависит от субъекта, которого лечат, способности иммунной системы субъекта использовать активный ингредиент и желаемой степени ингибирования или нейтрализации вируса. Точные количества активного ингредиента, необходимые для введения, зависят от оценки практикующего врача и являются индивидуальными для каждого индивидуума. Однако подходящие дозы могут находиться в диапазоне от примерно 0,001 до 10, предпочтительно от примерно 0,005 до примерно 1, менее 1, менее 0,5, менее 0,1, менее 0,05, менее 0,01 и более предпочтительно менее одного, менее 0,5, менее 0,1 миллиграмма активного ингредиента на килограмм массы тела индивидуума на дозу для интраназального введения. Подходящие схемы первоначального введения и последующего введения также различны. В одной из схем за первоначальным введением следует последующая повторная доза (дозы), одна или несколько последующих доз, с интервалом в один или более часов последующая инъекция или другое введение.

[00302] За первоначальным введением интраназально может следовать введение более высоких доз антитела интраперитонеально или внутривенно, или другим подходящим путем. В соответствии с одним из аспектов настоящего изобретения предложен новый подход или параметр дозирования, согласно которому пациенту или субъекту вводят нейтрализующее антитело интраназально и либо одновременно, либо последовательно, либо позже вводят нейтрализующее или не нейтрализующее антитело путем интраперитонеального или внутривенного введения

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ КОМБИНАЦИИ

[00303] В соответствии с одним из аспектов вариантов реализации настоящего изобретения связывающее вирус антитело или его связывающий фрагмент, в частности, когда указанное антитело или фрагмент является нейтрализующим, можно комбинировать с агентами или лекарственными средствами с образованием конъюгата антитело-лекарственное средство или антитело-агент для введения в дыхательный тракт или дыхательные пути, включая ингаляционное или интраназальное введение, для применения в вариантах реализации, описанных в настоящем документе. Лекарственное средство или агент, комбинированный или конъюгированный с антителом или фрагментом, может представлять собой лекарственное средство или агент, нейтрализующий вирус.

[00304] В качестве альтернативы, антитело или комбинацию можно вводить наряду с противовирусным агентом, противовирусным лекарственным средством, противогриппозным лекарственным средством или агентом, в частности, включая противогриппозное лекарственное средство для перорального введения. Противогриппозный агент может представлять собой ингибитор нейраминидазы. Указанный противогриппозный агент может быть выбран из Тамифлю и Реленза. Противогриппозный агент может представлять собой ингибитор М2, такой как амантадин или римантадин. Дополнительные агенты для комбинирования могут быть выбраны из противовирусного лекарственного средства, ингибитора репликации вируса, ингибитора протеазы, ингибитора полимеразы, ингибитора гемагглютинина, бронхолитического средства (например, альбутерол, левальбутерол, сальметерол) или ингаляционного кортикостероида. Противовирусный агент может представлять собой связывающий вирус агент или связывающий ингибитор вируса. В соответствии с одним из аспектов связывающий ингибитор вируса может представлять собой антитело, способное связывать вирус гриппа и ингибировать грипп путем связывания, а не более традиционными способами нейтрализации. TRL809 и TRL832 представляют собой типичные связывающие антитела, которые могут подходить или быть эффективными в комбинации с коктейлем для обеспечения повышенной эффективности или синергии, в частности, путем введения в дыхательные пути. Другие агенты, эффективные при введении в дыхательные пути, в частности, в комбинации с коктейлем антител, описанным в настоящем документе, могут включать поверхностно-активные вещества или модуляторы выстилки дыхательных путей, такие как поверхностно-активные наноэмульсии и катионные модуляторы выстилки дыхательных путей. Агенты, которые модулируют или ослабляют воспаление дыхательных путей, также могут быть эффективными или подходящими в комбинации с коктейлями антител согласно настоящему изобретению.

[00305] В некоторых вариантах реализации терапевтические композиции, в частности композиции для легочного введения, могут дополнительно содержать эффективное количество нейтрализующего антитела или его фрагмента и один или более из следующих активных ингредиентов: антибиотика, противовирусного агента, стероида, противовоспалительного агента. В соответствии с конкретным аспектом композиции содержат противовирусное лекарственное средство. Композиции могут содержать противогриппозный агент. В некоторых вариантах реализации предложены способы и композиции для повышения эффективности путем комбинирования терапии mAb согласно настоящему изобретению с другим противовирусным лечением, таким как противовирусное лекарственное средство, такое как ингибиторы нейраминидазы (например, осельтамивир [Тамифлю™], занамивир [Реленза™]), ингибиторы РНК-полимеразы (например, фавипиравир, VX-787), иммуномодуляторы (например, ингаляционный Интерферон бета-1а), агенты, прицельно воздействующие на клетки-хозяева (например, Флюдаза™, Радавирсен™ (Radavirsen™)), ингибиторы ионных каналов (например, амантидин) или другие противовирусные агенты.

[00306] Любые такие противогриппозные агенты можно также смешивать или комбинировать в рамках композиций, предложенных согласно настоящему изобретению, или вводить совместно с антителами или их активными фрагментами, или отдельно от них. Противогриппозные агенты можно вводить теми же или альтернативными способами (например, путем ингаляции или пероральным способом (например, пилюли)), что и антитела или их фрагменты, или композиции согласно настоящему изобретению для ингаляционного или интраназального введения. Таким образом, комбинация (комбинации) антител согласно настоящему изобретению и композиции согласно настоящему изобретению для ингаляционного или интраназального введения могут дополнительно содержать или могут быть введены в комбинации или последовательно до или после противогриппозного агента или противовирусного агента, такого как, например, ингибитор нейраминидазы, включая агент, выбранный из Тамифлю и Реленза.

[00307] В настоящем описании термин «пг» означает пикограмм, «нг» означает нанограмм, «мкг» означает микрограмм, «мг» означает миллиграмм, «мкл» означает микролитр, «мл» означает миллилитр, «л» означает литр.

[00308] Композиции могут быть представлены в форме назальных спреев или растворов или суспензий для ингаляции с использованием подходов, известных и принятых в данной области техники и в области медицины и клинической практики. FDA предлагает руководство и рекомендации в отношении таких спреев, растворов и суспензий, и лекарственных средств в форме спрея, включая документы Руководства для промышленности, доступные на fda.gov. Типичный документ Руководства для промышленности июля 2002 года под названием Nasal Spray and Inhalation Solution, Suspension and Spray Drug Products - Chemistry, Manufacturing and Controls Documentation содержит подробные сведения в отношении компонентов и композиций состава, их технических характеристик, изготовления и систем контейнер/укупорочный элемент.

[00309] Назальные спреи представляют собой лекарственные средства, которые содержат активные ингредиенты, растворенные или суспендированные в составе, как правило, на водной основе, который может содержать другие вспомогательные вещества, и предназначены для применения путем назальной ингаляции. Системы контейнер/укупорочный элемент для назальных спреев включают контейнер и все компоненты, которые отвечают за дозирование, атомизацию и доставку состава пациенту. Лекарственные средства в форме назальных спреев содержат терапевтически активные ингредиенты (лекарственные вещества), растворенные или суспендированные в растворах или смесях вспомогательных веществ (например, консерванты, модификаторы вязкости, эмульгаторы, буферные агенты), в не находящихся под давлением дозаторах, которые доставляют спрей, содержащий отмеренную дозу активного ингредиента. Доза может быть отмерена с помощью распылительного насоса или она могла быть предварительно отмерена во время изготовления. Устройство, представляющее собой назальный спрей, может быть предназначено для единичного дозирования или может производить многочисленные отмеренные распыления состава, содержащего лекарственное вещество. Назальные спреи применяют для носовой полости для оказания местных и/или системных эффектов.

[00310] Лекарственные средства в форме раствора и суспензии для ингаляций, как правило, представляют собой составы на водной основе, которые содержат терапевтически активные ингредиенты и могут также содержать дополнительные вспомогательные вещества. Растворы и суспензии на водной основе для пероральной ингаляции должны быть стерильными (21 CFR 200.51). Растворы и суспензии для ингаляции предназначены для доставки в легкие путем пероральной ингаляции для оказания местных и/или системных эффектов и должны быть использованы вместе с соответствующим распылителем. Лекарственное средство в форме спрея для ингаляции состоит из состава и системы контейнер/укупорочный элемент. Составы, как правило, имеют водную основу и не содержат какого-либо пропеллента.

[00311] Современные конструкции систем контейнер/укупорочный элемент для лекарственных средств в форме спрея для ингаляции включают как предварительно дозированное представление, так и представление с дозирующим устройством с использованием механической или силовой поддержки и/или энергии вдоха пациента для получения струи спрея. Предварительно дозированное представление содержит предварительно измеренные дозы или фракцию дозы в некоторых типах устройств (например, один или несколько блистеров или другие полости), которые затем вставляются в устройство во время изготовления или самим пациентом перед применением. Типичные дозирующие устройства содержат резервуар, содержащий достаточное количество состава для нескольких доз, которые доставляет в виде отмеренных распылений само устройство при активации пациентом.

[00312] Длительное время удержания в носовой полости также может быть достигнуто путем применения биоадгезивных полимеров, микросфер, хитозана или путем повышения вязкости состава. Назальный мукоцилиарный клиренс можно также стимулировать или ингибировать лекарственными средствами, вспомогательными веществами, консервантами и/или усилителями абсорбции, и, таким образом, влиять на доставку лекарственного средства в участок абсорбции.

[00313] Технология с использованием микросфер является одной из специализированных систем, используемых для разработки назальных продуктов. Микросферы могут обеспечивать более длительный контакт со слизистой оболочкой носа и таким образом повышать абсорбцию или эффективность. Микросферы для назального применения были получены с использованием биосовместимых веществ, таких как крахмал, альбумин, декстран и желатин (Bjork Е, Edman Р (1990) Int J Pharm 62:187-192).

[00314] Растворимость лекарственного средства в воде может являться значимым ограничивающим параметром для назальной доставки лекарственного средства в растворе. Традиционные растворители или сорастворители, такие как гликоли, малые количества спирта, Транскутол (моноэтиловый эфир диэтиленгликоля), среднецепочечные глицериды и Лабразол (насыщенный полигликолизированный C₈-C₁₀ глицерид) можно использовать для повышения растворимости лекарственных средств. Другие варианты включают использование поверхностно-активных веществ или циклодекстринов, таких как НР-бета-циклодекстрин, которые служат в качестве биосовместимого солюбилизатора и стабилизатора в комбинации с липофильными усилителями абсорбции. В таких случаях следует учитывать их влияние на появление раздражения в носу.

[00315] Большинство назальных составов имеют водную основу и требуют присутствия консервантов для предотвращения роста микроорганизмов. Парабены, бензалкония хлорид, фенилэтиловый спирт, EDTA и бензоиловый спирт являются одними из широко применяемых консервантов в назальных составах. Ртутьсодержащих консерванты оказывают быстрое и необратимое действие на движение ресничек и не рекомендуются для применения в назальных системах.

[00316] Может потребоваться малое количество антиоксидантов для предотвращения окисления лекарственного средства. Широко применяемыми антиоксидантами являются метабисульфит натрия, бисульфит натрия, бутилированный гидрокситолуол и токоферол. Как правило, антиоксиданты не влияют на абсорбцию лекарственного средства или не вызывают раздражения в носу. Химическое/физическое взаимодействие антиоксидантов и консервантов с лекарственными средствами, вспомогательными веществами, элементами производственного оборудования и компонентами упаковки следует рассматривать в рамках программы разработки состава.

[00317] Многие аллергические и хронические заболевания часто связаны со струпьями и высыханием слизистой оболочки. Некоторые консерванты/антиоксиданты среди других вспомогательных веществ также могут вызывать раздражение в носу, особенно при использовании в больших количествах. Для предотвращения обезвоживания необходимо достаточное интраназальное увлажнение. Следовательно, могут быть добавлены увлажнители, особенно в назальные продукты на основе геля. Увлажнители позволяют избежать раздражения в носу и, вероятно, не влияют на абсорбцию лекарственного средства. Распространенные примеры включают глицерин, сорбитол и маннитол.

[00318] Выбор системы доставки зависит от применяемого лекарственного средства, предполагаемого показания, популяции пациентов и, наконец, что не менее важно, маркетинговых предпочтений. Некоторые из данных систем доставки включают назальные капли, назальные спреи, назальные гели и назальные порошки.

[00319] В некоторых вариантах реализации предложены композиции для введения посредством распылителя для интраназальной и ингаляционной доставки. Распылитель представляет собой устройство для доставки лекарственного средства, применяемое для введения лекарственного средства в форме «тумана», ингалируемого в дыхательный тракт. Распылители можно применять для интраназальной и ингаляционной доставки моноклональных антител через рот и носовой ход, и они являются эффективными устройствами для доставки моноклональных антител в верхние и/или нижние дыхательные пути. Распылители используют кислород, сжатый воздух или ультразвуковую мощность для разделения медицинских растворов и суспензий на мелкие капельки аэрозоля, которые можно непосредственно вдыхать из наконечника указанного устройства. Аэрозоль представляет собой смесь газа и жидких частиц, и лучшим примером встречающегося в природе аэрозоля является туман, образуемый, когда мелкие частицы испаряющейся воды, смешанные с горячим окружающим воздухом, охлаждаются и конденсируют с образованием мелкодисперсного облака видимых капелек воды, содержащихся в воздухе. Дозирующий ингалятор (MDI) представляет собой устройство, которое доставляет конкретное количество лекарственного средства в легкие в форме короткого выброса аэрозольного лекарственного средства, которое, как правило, самостоятельно вводится пациентом путем ингаляции. Ингаляторы сухого порошка включают микронизированный порошок, часто упакованный в количествах для однократной дозы в блистеры или гелевые капсулы, содержащие порошкообразное лекарственное средство для втягивания в легкие с помощью собственного дыхания пользователя. На рынке распылителей была произведена значительная инновация с созданием ультразвуковой технологии вибрирующей сетки-мембраны (Vibrating Mesh Technology, VMT). С помощью данной технологии сетка/мембрана с 1000-7000 отверстий, просверленных лазером, вибрирует в верхней части резервуара для жидкости и тем самым выдавливает «туман» из очень мелких капелек через указанные отверстия. Данная технология более эффективна, чем наличие вибрирующего пьезоэлектрического элемента в нижней части резервуара для жидкости, и, таким образом, также достигают меньшего времени лечения. Доступные распылители на основе VMT включают Pari eFlow Respironics i-Neb, Omron MicroAir, Beurer Nebulizer IH50 и Aerogen Aeroneb.

[00320] В другом варианте реализации композицию получают в виде лиофилизированного порошка для восстановления или стерильной жидкой композиции с добавлением или без добавления консервантов для интраназального введения с помощью устройства распыления на слизистую оболочку (MAD). Устройство распыления на слизистую оболочку (MAD) крепят через наконечник Люэра к шприцу, содержащему противовирусную композицию. Поршень шприца энергично сжимают с быстрым интраназальным распылением «тумана», составляющим примерно 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1 мл на дозу. В некоторых случаях всю дозу вводят в одну ноздрю, или доза может быть поделена между ноздрями в одном или более распылениях на дозу.

[00321] рН назального состава имеет важное значение для стабильности антител и для избегания раздражения слизистой оболочки носа, для обеспечения доступности антител в оптимальной форме для абсорбции, для предотвращения роста патогенных бактерий в носовом ходу, для сохранения функциональности вспомогательных веществ, таких как консерванты, и для поддержания нормального физиологического движения ресничек. В некоторых вариантах реализации композицию получают с рН в пределах 4,5-8,2, 5,2-7,9 или от 4,5 до 6,5 с учетом физико-химических свойств коктейля антител, лекарственного средства или активного ингредиента. Назальные составы, как правило, вводят в малых объемах в диапазоне от 25 до 200 мкл, при этом 100 мкл являются наиболее распространенным объемом дозы.

ВВЕДЕНИЕ

[00322] Снова отмечено, что обычные и вполне ожидаемые дозы для терапии антителом представляют собой, как установлено, в/в или и/п дозы в мг-диапазоне. Это основано на научно-исследовательском и клиническом опыте на сегодняшний день с множеством рекомбинантных антител. На сегодняшний день в Соединенных Штатах было клинически одобрено более двадцати (20) моноклональных антител (см., например, Newsome BW and Ernstoff MS (2008) Br J Clin Pharmacol 66(1):6-19). Все клинически одобренные антитела, применяемые в настоящее время, использовали и вводили интраперитонеально или внутривенно в диапазоне мг/кг.

[00323] До сих пор ни одно моноклональное антитело к гриппу не было клинически одобрено. Во всех проводимых исследованиях или исследованиях, о которых сообщают в настоящее время, используют внутривенную доставку в качестве стандарта. В частности, антитело TCN-032 от TheraClone Sciences оценивали с увеличением однократных доз в диапазоне 1-40 мг/кг (NCT01390025, clinical trails.gov). Антитело TCN-032 представляет собой антитело человека, которое связывается с консервативным эпитопом аминоконцевого внеклеточного домена (М2е) матричного белка гриппа (М2) (Grandea AG et al (2010) PNAS USA 107(28):12658-12663; Epub 2010 Jul 1). Антитела CR6261 и CR8020 подобным образом оценивают в исследованиях безопасности и переносимости с использованием доз, возрастающих с 2 мг/кг до 50 мг/кг, вводимых внутривенно в течение 2 часов (клинические исследования NCT01406418 и NCT01756950 соответственно, проводимые Crucell Holland BV).

[00324] Вакцины против гриппа вводят путем инъекции. Одним исключением среди вакцин против гриппа является живая вакцина против гриппа ФлуМист (MedImmune), которую вводят интраназально. ФлуМист представляет собой комбинацию трех живых штаммов гриппа - штамма A/H1N1, штамма A/H3N2 и штамма В, и ее вводят в дозе 0,2 мл с использованием суспензии, подаваемой в предварительно заполненный распылитель с однократной дозой для интраназального введения. В дополнение к штаммам вируса каждая доза также содержит глутамат натрия, гидролизованный свиной желатин, аргинин, сахарозу, двухосновный фосфат калия и одноосновный фосфат калия, и не содержит консервантов (FluMist Highlights of Prescribing Information, 2012-2013 Formula, MedImmune, RAL-FLUV12, Component No.: 11294).

[00325] Согласно настоящему изобретению предложен новый и эффективный способ введения комбинации антител, и протокол введения антител для лечения и профилактики вирусной инфекции, в частности вирусов, которые инфицируют или передаются через дыхательный путь, включая, в частности вирус гриппа. Таким образом, согласно настоящему изобретению предложено лечение, профилактика или облегчение вирусной инфекции, в частности вируса гриппа, путем легочного введения комбинации антител, способных нейтрализовать любой значимый или циркулирующий вирус гриппа. Указанная комбинация антител может быть введена с помощью однократной дозы для интраназального введения или может быть введена в нескольких индивидуальных дозах одновременно или по существу одновременно. Дополнительную комбинацию или индивидуальные дозы можно вводить последовательно, при этом каждое введение отделено минутами, часами или днями.

[00326] В соответствии с одним из конкретных аспектов настоящего изобретения предложено лечение, профилактика или облегчение вирусной инфекции, в частности вируса гриппа, путем легочного введения комбинации антител, направленных против циркулирующих штаммов гриппа. Таким образом, предложено лечение, профилактика или облегчение вирусной инфекции, в частности вируса гриппа, и их осуществляют согласно настоящему изобретению путем легочного введения комбинации антител, направленных против гриппа В и циркулирующих вирусов гриппа А, в частности, в соответствии с одним из аспектов, комбинации антитела к гриппу В, антитела к гриппу А группы 1, такого как антитело анти-Н1, и антитела к гриппу А группы 2, такого как антитело анти-Н3. Согласно настоящему изобретению интраназальное введение комбинации антитела к гриппу В, антитела к гриппу А группы 1, такого как антитело анти-Н1, и антитела к гриппу А группы 2, такого как антитело анти-Н3, эффективно предотвращает инфекцию или лечит инфекцию, вызванную вирусом гриппа В или гриппа А. Поскольку антитела доступны и, как протестировано и показано согласно настоящему изобретению, эффективны и направлены против более одного подтипа или штамма вируса, комбинации, предложенные и предусмотренные согласно настоящему изобретению, служат в качестве универсального коктейля или комбинации, эффективной против многочисленных штаммов и/или подтипов вируса, в частности вируса гриппа, включая известные и циркулирующие штаммы или подтипы, появляющиеся штаммы или подтипы и неизвестные, неожиданные и вариантные штаммы или подтипы.

[00327] Антитело, применяемое в вариантах реализации, описанных в настоящем документе, может быть введено интраназально или путем ингаляции с последующим или совместным, в том числе одновременно, в комбинации или последовательно, или отдельно, системным введением другого или того же антитела, в частности интраперитонеальным или внутривенным введением. Таким образом, согласно настоящему изобретению предусмотрен и предложен протокол или способ комбинированного введения, согласно которому комбинируют интраназальное и интраперитонеальное (или внутривенное) введение для повышения эффективности против агента, в частности вируса, в частности вируса гриппа. Действительно, исследования, представленные в настоящем документе, показывают что при применении комбинированного дозирования с интраназальным и альтернативным введением (и/п или в/в), комбинированная эффективность является синергической и могут быть использованы низкие дозы как и/н, так и и/п в качестве примера.

[00328] Введение в дыхательные пути дает уникальную возможность доставлять эффективную низкую дозу и осуществлять малозатратную терапию, для которой таким образом не будет требоваться подтверждения путем проведения диагностического анализа. Проявления симптомов во время сезона гриппа будет достаточно врачам для введения данного низкодозового коктейля, например, в виде ингалятора сухого порошка или в виде распылителя, или другим способом доставки в дыхательные пути. Данный не требующий диагностики стандарт лечения является современной практикой для Тамифлю и Реленза, но он бы не был возможен в случае дорогостоящей внутривенной терапии антителом, которая была бы непрактичной и чрезмерно затратной. После завершения диагностики введение антитела в высокой дозе можно было бы осуществлять либо внутривенным путем, либо через дыхательные пути, и оно могло быть представлено в виде коктейля или в виде отдельного антитела, специфичного к типу гриппа.

[00329] Согласно настоящему изобретению предложен способ лечения или профилактики вирусной инфекции у млекопитающего, подверженного воздействию, риску воздействия, заразившегося, клинически проявляющего симптомы или страдающего респираторным вирусом, включающий введение указанному млекопитающему интраназально (и/н) или путем ингаляции комбинации или коктейля антител, предложенного согласно настоящему изобретению. В указанном коктейле или комбинации антител все антитела могут, в частности, представлять собой антитела IgG.

[00330] Комбинацию антител можно вводить после инфицирования или после предполагаемого инфицирования. В соответствии с одним из аспектов комбинацию антител можно вводить в период времени до 8 часов после инфицирования (чпи), включая 2 часа после инфицирования, 4 часа после инфицирования, 6 часов после инфицирования, 8 часов после инфицирования. В качестве альтернативы, комбинацию антител вводят в период времени до 24 часов после инфицирования, включая 4 часа после инфицирования, 8 часов после инфицирования, 12 часов после инфицирования, 18 часов после инфицирования, 24 часа после инфицирования. В качестве дополнительной альтернативы, антитело вводят в период времени до 48 часов после инфицирования, включая 12 часов после инфицирования, 24 часа после инфицирования, 36 часов после инфицирования, 48 часов после инфицирования. В качестве дополнительной альтернативы, комбинацию антител вводят в период времени до 72 часов после инфицирования, включая 24 часа после инфицирования, 36 часов после инфицирования, 48 часов после инфицирования, 60 часов после инфицирования, 72 часа после инфицирования. Антитело можно вводить через несколько дней после инфицирования или после предполагаемого инфицирования, или после проявления клинических симптомов, таких как лихорадка, ломота, боль в суставах, вялость. Антитело можно вводить через 1 день после инфицирования, 2 дня после инфицирования, 3 дня после инфицирования, 4 дня после инфицирования, 5 дней после инфицирования, 6 дней после инфицирования, 7 дней после инфицирования, 10 дней после инфицирования, 12 дней после инфицирования, 14 дней после инфицирования. Антитело можно вводить через несколько недель после инфицирования или предполагаемого инфицирования, в том числе через 1 неделю, через 2 недели, через 3 недели, через 4 недели, через месяц.

[00331] Комбинацию антител можно вводить до инфицирования или для уменьшения или предотвращения передачи, или до появления любого клинического признака болезни, заболевания или инфекции. В соответствии с одним из аспектов антитело можно вводить в качестве профилактического средства в период времени, составляющий несколько дней до инфицирования или до возможного или предполагаемого воздействия или риска воздействия. Комбинацию антител можно вводить за день, за 2 дня, за 3 дня, за 4 дня, за 5 дней, за 6 дней, за 7 дней, за неделю, более чем за 7 дней, более чем за неделю, за период до 9 дней, за период до 10 дней. Антитело можно вводить один или более раз предварительно в одной или более дозах с интервалом в несколько часов, дней или недель.

[00332] Комбинацию антител можно вводить в одной однократной дозе или в нескольких повторных комбинированных дозах. В соответствии с любым предпочтительным аспектом каждое антитело в комбинации или коктейле вводят в одинаковом относительном количестве. Каждая доза может быть идентичной по стандартной или мг/кг величине, или может быть разной по величине. Например, начальная доза может представлять собой более высокую относительную дозу, такую как, например, но не ограничиваясь ими, примерно 1 мг/кг, более 1 мг/кг, менее 1 мг/кг, или примерно максимальную или близкую к максимальной переносимой дозе, или половину максимально переносимой дозы для млекопитающего, которому ее вводят. Последующие дозы могут быть такими же, как начальная доза или могут быть меньше или больше начальной дозы, и могут зависеть от реакции или ответа у субъекта или пациента, или облегчения или степени клинических симптомов.

[00333] Несколько доз, каждая или любая доза из которых имеет одинаковую или разную величину, можно вводить с интервалами в несколько часов, минут, дней или недель. Распределение во времени может варьироваться и может быть сокращено или увеличено в зависимости от ответа и симптомов. Интервал между дозами, например и не ограничиваясь ими, может составлять по меньшей мере 2 часа, по меньшей мере 4 часа, по меньшей мере 6 часов, по меньшей мере 8 часов, по меньшей мере 24 часа, по меньшей мере 48 часов, по меньшей мере 72 часа. Дозу или дозы антител можно вводить после инфицирования или после предполагаемого инфицирования и спустя до 2, 4, 6, 8, 12, 24, 36, 48, 72 часов, до 1 дня, 2 дней, 3 дней, 4 дней, 5 дней, 6 дней, 7 дней, одной недели, 2 недель, 3 недель, 4 недель, одного месяца или больше.

[00334] Способ может включать дополнительное введение вирусоспецифического моноклонального антитела интраперитонеально или внутривенно, при этом указанное дополнительно вводимое антитело представляет собой нейтрализующее или не нейтрализующее антитело. Антитело, дополнительно вводимое интраперитонеально или внутривенно, может представлять собой то же антитело, что и вводимое интраназально или путем ингаляции. Антитело, дополнительно вводимое интраперитонеально или внутривенно, может быть введено одновременно, последовательно или после антитела, введенного интраназально или путем ингаляции. Любое такое последующее введение можно осуществлять через несколько часов, и можно осуществлять через 2, 4, 6, 8, 12, 24, 36, 48, 72 или более часов. Последующее введение можно осуществлять через несколько дней и можно осуществлять через 1 день, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней. Последующее введение можно осуществлять через несколько недель и можно осуществлять через 1, 2, 3, 4 или 5 недель.

[00335] Дозу для ингаляционного или интраназального введения можно использовать для усиления ответа или эффективности у пациента или субъекта, который очень болен или продолжает демонстрировать симптомы инфекции или заболевания после начальной и/н или и/п, или в/в, или комбинированной дозы.

[00336] В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен протокол введения коктейля или комбинации моноклональных антител против вируса гриппа, включающий введение первой дозы комбинации антител для интраназального или ингаляционного введения и последовательное или одновременное введение второй дозы антитела интраперитонеально или внутривенно, или снова интраназально, или путем ингаляции, при этом комбинация антител для второй дозы представляет собой такую же комбинацию антител, что и комбинация антител для первой дозы, или отличную от нее. Антитело второй дозы или любой дополнительной дозы может представлять собой нейтрализующее или не нейтрализующее антитело.

[00337] Варианты реализации, описанные в настоящем документе, могут стать понятнее со ссылкой на следующие не ограничивающие примеры, которые представлены в качестве иллюстрации настоящего изобретения. Следующие примеры представлены для более полной иллюстрации предпочтительных или конкретных вариантов реализации, но, тем не менее, никоим образом не ограничивают широкий объем настоящего изобретения.

[00338] Структуры антител

[00339] Некоторые аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепи для моноклональных антител согласно настоящему изобретению приведены ниже и в прилагаемом перечне последовательностей.

[00340] TRL 784

ПРИМЕРЫ

[00341] Для примеров, приведенных в настоящем описании, использовали следующие материалы и способы.

[00342] Антитела: в некоторых случаях Mab выделяли с использованием фагового отображения, как описано ниже. Моноклональные антитела CR8020 и CR6261 представляют собой хорошо изученные антитела к вирусам группы 2 и группы 1 соответственно с широким спектром реактивности (Throsby М et al. (2008) PL0S ONE 3:e3942; Eckert DC et al. (2009) Science 324:246-251; Friesen RHE et al. (2010) PLoS ONE 5(2):e1906; патент США 8192927; Eckert DC et al (2011) Science 333:843-850). Антитело CR9114 связывает консервативный эпитоп на стебле НА и защищает от летального заражения вирусами гриппа А и В при введении внутривенно (Dreyfus С et al. (2012) Science Express 9 August 2012 10.1126/science. 1222908). Авторы настоящего изобретения клонировали данные нейтрализующие антитела путем синтеза вариабельной области и субклонировали в векторы экспрессии IgG2a мыши. Вариабельную область CR8020 клонировали с использованием опубликованной тяжелой цепи GI: 339779688 и легкой цепи GI: 339832448. Вариабельную область CR6261 клонировали с использованием опубликованной тяжелой цепи GI: 313742594 и легкой цепи GI: 313742595. Вариабельную область CR9114 клонировали с использованием последовательности Genbank для тяжелой цепи, номер доступа JX213639 и легкой цепи, номер доступа JX213640. Антитела CR6261, CR8020 и CR9114, применяемые в данных исследованиях, клонировали в векторы экспрессии IgG, содержащие вариабельные области человека, слитые с IgG2a мыши. Химерные антитела для антител мыши CR6261, CR8020 и CR9114 обозначены в настоящем описании СА6261, СА8020 и СА9114 соответственно. Mab 5А7 связывается с общим эпитопом на НА вируса В и нейтрализует вирус, и защищает мышей от летального заражения при введении интраперитонеально (Yasugi М et al. (2013) PLoS Pathog 9(2): e1003150, doi: 10.1371/journal.ppat.1003150).

[00343] Антитело Mab53 человека (также обозначаемое TRL053) описано в US 2012/0020971 и WO 2011/160083, содержание каждого из которых включено в настоящее описание посредством ссылки, и эффективно нейтрализует подтипы H1, Н9, Н7 и Н5 группы 1 и 2.

[00344] Антитело Mab579 (также обозначаемое TRL579) описано в WO 2013/086052, содержание которого включено в настоящее описание посредством ссылки, и эффективно нейтрализует Н3 и Н7.

[00345] Опубликованные последовательности, включая последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепи антитела, и в частности последовательности CDR-домена (CDR1, CDR2 и CDR3) тяжелой и легкой цепи для антител, указанных выше и приведенных в качестве примера в настоящем документе, в частности включая CR6261, CR8020, CR9114, 5А7, Mab53 и Mab579, известны и общедоступны, в том числе в источниках, указанных выше, и включены в настоящее описание посредством ссылки.

[00346] Валидация Fab: Fab-кодирующие фаголизаты подвергали скринингу путем ELISA против рекомбинантного НА. Отдельные колонии, отобранные в 384-луночные планшеты, содержащие среды 2XYT/Cam/Glc, выращивали в течение ночи при 30°С. Клетки TG1 в 384-луночных планшетах воспроизводили в 384-луночных планшетах для экспрессии, содержащих 2XYT/Cam с низким содержанием глюкозы, с использованием Qpix. Планшеты культивировали в течение 2-4 часов при 30°С и 400 об/мин. Экспрессию Fab индуцировали 0,5 мМ IPTG и культивировали в течение ночи при 22°С и 400 об/мин. Fab-содержащие клетки лизировали буфером BEL, содержащим Бензоназу, при 22°С и 400 об/мин в течение 1 часа. Fab-содержащие лизаты блокировали 12,5% MPBST в течение 30 минут при 400 об/мин и 22°С. Лизаты добавляли в покрытые НА планшеты для ELISA в течение 1 часа при комнатной температуре. Планшеты промывали пять раз фосфатным буферным раствором с Твином (ФБР-Т), а затем инкубировали совместно с IgG анти-Fab, конъюгированным со щелочной фосфатазой, в течение 1 часа при комнатной температуре. Планшеты промывали пять раз TBST и проявляли с помощью AutoPhos (Roche, Нью-Джерси). Планшеты прочитывали с использованием Infinite Pro F200. Положительные фаголизаты секвенировали, и уникальные Fab субклонировали в конструкции для экспрессии Fab, содержащие с-тус и his-метку для дальнейшего получения характеристик.

[00347] Экспрессия Fab: плазмиды экспрессии Fab электропорировали в TG1 F-клетки и высевали в планшеты с агаром LB/Cam. Планшеты инкубировали при 37°С в течение ночи. 5 мл 2XYT/Cam/Glc инокулировали одной колонией и инкубировали в течение ночи при 30°С и 350 об/мин. 500 мл 2XYT/Cam/низкое содержание глюкозы инокулировали 2 мл ночной культуры и встряхивали при 30°С и 180 об/мин до достижения оптической плотности (OD) при 600 нм, составляющей 0,5. Экспрессию Fab индуцировали путем добавления IPTG в конечной концентрации 0,75 мМ. Культуры встряхивали при 30°С и 160 об/мин в течение ночи. Культуры центрифугировали в течение 30 минут при 5000 g и 4°С. Бактериальные осадки замораживали при -80°С в течение не менее 2 часов. Клетки лизировали и фильтровали на 0,22 мкм фильтре, и подвергали очистке путем аффинной хроматографии на иммобилизованных ионах металла (IMAC) и эксклюзионному этапу.

[00348] Клонирование и экспрессия антител: Fab-кодирующий фаг секвенировали и субклонировали в плазмиды экспрессии IgG для соответствующих тяжелых и легких цепей. IgG получали в клетках 293F Invitrogen или 293Expi Invitrogen в колбах для встряхивания. Клетки трансфицировали плазмидами экспрессии для тяжелой и легкой цепей. Надосадочные жидкости культур собирали через шесть дней после трансфекции и очищали с использованием аффинной хроматографии с белком А и этапа замены буфера.

[00349] Исследования терапевтической эффективности у мышей: в экспериментах использовали 6-7-недельных самок мышей BALB/c. Всех мышей содержали и давали им акклиматизироваться в течение периода, составляющего по меньшей мере три дня, до начала эксперимента. Массу мышей определяли в день заражения вирусом, а затем ежедневно в течение 2 недель. Систему клинической оценки использовали в качестве критериев клинического исхода и исключения из исследования. Клинические признаки оценивали следующим образом: сгорбленная поза = 3, пилоэрекция = 3, отказ от еды или питья = 2, потеря массы ≥30%=10, неврологические симптомы = 10. Мышей исключали из исследования и подвергали эвтаназии при достижении оценки 16 или больше. Исследования у животных проводили в соответствии с одобренными протоколами Институционального комитета по содержанию и использованию животных. Терапевтическое лечение мышей осуществляли в указанные дни после инфицирования. Мышей сначала анестезировали смесью кетамин/ксилазин перед интраназальным введением вируса, Mab или Fab в объеме 50 мкл на мышь. Перитонеальное введение Mab или Fab осуществляли в объеме 100 мкл. Среднюю массу тела определяли каждый день в течение 14-дневного периода исследования и представляли относительно средней массы тела в 0 день.

[00350] Вирусы: штаммы вируса гриппа (включая A/California/7/09, А/Виктория/11, B/Malaysia/2506/2004, B/Florida/04/2006) адаптировали для мышей в соответствии с Cottey, Rowe и Bender (Current Protocols in Immunology, 2001). Осуществляли три цикла адаптации для мышей с последующим одним циклом размножения вируса в яйцах с развивающимся эмбрионом. Вкратце, трех 6-8 недельных мышей анестезировали и интраназально инфицировали 20 мкл вируса. Через три дня после инфицирования мышей подвергали эвтаназии и извлекали легкие. Легкие механически гомогенизировали, осветляли и центрифугировали с удалением крупных элементов осадка. Дополнительный перенос 20 мкл гомогената легких ранее не подверженным экспериментам мышам осуществляли тремя циклами.

[00351] ССЫЛКИ

Huber VC, Lynch JM, Bucher DJ, Le J, Metzger DW: Fc receptor-mediated phagocytosis makes a significant contribution to clearance of influenza virus infections. J Immunol 2001, 166:7381-7388.

Jegerlehner A, Schmitz N, Storni T, Bachmann MF: Influenza A vaccine based on the extracellular domain of M2: weak protection mediated via antibody-dependent NK cell activity. J Immunol 2004, 172:5598-5605.

Feng J, Mozdzanowska K, Gerhard W: Complement component C1q enhances the biological sctivity of influenza virus hemagglutinin-specific antibodies depending on their fine antigen specificity and heavy chain isotype. J Virol 2002, 76:1369-1378.

Mozdzanowska K, Feng J, Eid M, Zharikova D, Gerhard W: Enhancement of neutralizing activity of influenza virus-specific antibodies by serum components. Virology 2006, 352:418-426.

[00352] Следующие примеры представлены для иллюстрации, а не для ограничения настоящего изобретения.

[00353] Пример 1. Аффинность моноклональных антител

[00354] Первичный скрининг с использованием технологии CellSpot™ по своей сути настроен на обнаружение mAb с высокой аффинностью, поскольку антигены связаны с гранулами, которые не сохраняются во время промывки, если взаимодействие антиген-антитело является слишком слабым. Датчик, используемый для измерения аффинности клонированных mAb, представлял собой Octet . Измерение аффинности в виде соотношения скоростей ассоциации и диссоциации становится менее точным по мере снижения скорости диссоциации. Для получения более точной оценки варьирующиеся концентрации антитела пропускали через антиген, фиксированный к поверхности датчика. В таблице 5 показан набор mAb к гриппу В вместе с их KD, определенными таким образом.

[00355] Определенная биодатчиком (Biacore™) аффинность к НА (KD) для 5А7, описанного Yasugi, et al. (абзац 0008), составляла ~5 нМ. mAb TRL835 согласно настоящему изобретению конкурирует с 5А7 за связывание, но имеет по существу более сильную KD, составляющую 0,6 нМ, как показано.

[00356] Пример 2. Связывание моноклональных антител с рекомбинантными НА гриппа В

[00357] Связывание антител определяли путем ELISA. На 384-луночные планшеты для ELISA наносили 20 нг на лунку белка rHA в фосфатном буферном растворе Дульбекко (Д-ФБР), рН 7,4. После нанесения покрытия на планшеты в течение ночи при 4°С планшеты дважды промывали ФБР с 0,01% Твин 20 (ФБР-Т). Затем планшеты блокировали 5% обезжиренным молоком в ФБР-Т (М-ФБР-Т) в течение одного часа, и два раза промывали в ФБР-Т. Очищенные антитела разводили в ФБР и исследовали в отношении каждого антигена с использованием 20 нг на лунку. Планшеты пять раз промывали ФБР-Т, и исследовали с использованием вторичного антитела, конъюгированного со щелочной фосфатазой. Затем планшеты пять раз промывали ФБР-Т и проявляли с помощью флуоресцентного субстрата AttoPhos АР (Promega S1000). Планшеты непрерывно прочитывали пока фоновый сигнал от лунок с отрицательным контролем не начал давать флуоресцентный сигнал.

[00358] Результаты некоторых ELISA-анализов представлены на фиг. 3: данные ELISA с использованием рекомбинантного НА, иллюстрирующие реактивность нескольких mAb к гриппу В и двух mAb к гриппу А в отношении штаммов гриппа А и В. ELISA-анализы с использованием рекомбинантного НА проводили в трех повторностях, и показана средняя кратная реактивность относительно фона. На фиг. 3 показано, что каждое из mAb анти-В: TRL809, TRL812, TRL813; TRL832, TRL841, TRL842, TRL845, TRL846, TRL847, TRL848, TRL849, TRL854 и TRL856 демонстрирует перекрестную реактивность широкого спектра в отношении обеих линий вирусов гриппа В, включая B/Florida/06, B/Mass/12 и B/Wisconsin/10 клады линии Ямагата, и B/Brisbane/08, B/Malaysia/04 и В/Виктория/87 клады линии Виктория. mAb к гриппу A: CF401 (=mAb 53, TRL053) и CF402 (=mAb 579, TRL579) демонстрируют реактивность в отношении членов подтипов H1 (A/California/09) и Н3 (A/Sydney/97) гриппа А, но не в отношении штаммов гриппа В.

[00359] Пример 3. Нейтрализация вирусов гриппа В моноклональными антителами

[00360] Антитела инкубировали совместно с 200 БОЕ вирусов при 37°С в течение 1 часа. Затем клетки MDCK адсорбировали смесями при 37°С в течение 1 часа. Клетки MDCK покрывали Авицел-содержащими средами для анализа бляшкообразования. Бляшки определяли после двух дней инкубации. Идентифицированные mAb к гриппу В с широким спектром реактивности были способны нейтрализовать линии как Ямагата, так и Виктория с высокой активностью. После инкубации в течение 12 часов клетки фиксировали и подвергали иммунофлуоресценции для детектирования инфицированных клеток. Контрольное mAb 5А7 анти-В демонстрировало нейтрализацию штаммов линии как Ямагата, так и Malaysia, данные не представлены. Однако mAb согласно настоящему изобретению демонстрировали более высокую активность, как показано в таблице 8 на фиг. 4.

[00361] Результаты анализов нейтрализации для выбранных антител к гриппу В представлены на фиг. 4 для антител к гриппу В TRL845, TRL848, TRL849, TRL854, TRL832 и TRL809. IC50 представляют собой концентрации, которые ингибируют вирус в данном конкретном анализе нейтрализации. Каждое из указанных mAb нейтрализовало типичный член каждой из: линии Ямагата и линии Виктория. В данном эксперименте использовали определенные штаммы этих линий, но mAb также нейтрализовали все тестируемые вирусы В.

[00362] Пример 4. Эффективность in vivo в модели инфекции, вызванной гриппом, у мышей

[00363] В целом, за исключение случаев, когда указано иное, моноклональные антитела оценивали на предмет повышенной эффективности в модели легочной доставки. Мышей инфицировали 10xLD50 и лечили через 24 часа после инфицирования в дозе 1 мг/кг, вводимой посредством легочной доставки интраназальным путем. Осуществляли мониторинг массы тела и выживаемости для оценки относительной эффективности.

[00364] На фиг. 6А-D показана активность in vivo моноклональных антител к гриппу В согласно настоящему изобретению в отношении 10xLD50 вируса в 1 день после инфицирования в модели у мышей после введения 1 мг/кг интраназальным путем с оценкой массы тела мышей вплоть до 14 дней после инфицирования; ФБР и отсутствие вируса использовали в качестве контролей. Осуществляли мониторинг массы тела животных ежедневно в течение 14 дней после инфицирования и отмечали на графике массу тела в процентах от исходной массы в 0 день.

[00365] На фиг. 6А показано, что 1 мг/кг mAb: TRL845, TRL847, TRL848, TRL849 и 5А7 интраназальным путем обеспечивал защиту от заболевания у мышей, инфицированных B/Malaysia/2506/04, характерным для клады Виктория.

[00366] На фиг. 6B показано, что 1 мг/кг mAb: TRL845, TRL847, TRL848, TRL849 и 5А7 интраназальным путем обеспечивал защиту от заболевания у мышей, инфицированных B/Florida/04/2006, характерным для клады линии Ямагата.

[00367] На фиг. 6С показано, что 1 мг/кг mAb: TRL849, TRL846, TRL854, TRL856, TRL847 и 5А7 интраназальным путем обеспечивал защиту от заболевания у мышей, инфицированных B/Malaysia/2506/04, характерным для клады линии Виктория.

[00368] На фиг. 6D показано, что 1 мг/кг mAb: TRL849, TRL846, TRL854, TRL856, TRL847 и 5А7 интраназальным путем обеспечивал защиту от заболевания у мышей, инфицированных B/Florida/04/2006, характерным для клады линии Ямагата.

[00369] Пример 5. Повышение эффективности in vivo путем легочной доставки

[00370] Для оценки возможности повышения эффективности посредством альтернативного способа доставки моноклональные антитела тестировали на предмет эффективности in vivo. Мышей инфицировали 10xLD50 и лечили через 24 часа после инфицирования в дозе 10,1 и 0,1 мг/кг с использованием традиционной системной доставки путем интраперитонеального введения по сравнению с моноклональными антителами в дозе 1,0 и 0,1 мг/кг, вводимой посредством легочной доставки интраназальным путем. Затем сравнивали как выживаемость, так и массу тела. Выживаемость и потерю массы (мера тяжести инфекции) использовали для оценки относительной активности. На фиг. 5А и 5В показано mAb 5А7 в качестве примера для иллюстрации повышенной эффективности благодаря легочной доставке.

[00371] На фиг. 5А показана активность in vivo антитела 5А7 к гриппу В у мышей в виде массы тела в процентах после интраназального (и/н) по сравнению с интраперитонеальным (и/п) введением 5А7 у мышей, инфицированных 10xLD50 B/Florida (линия Ямагата). Мышей лечили через 24 часа после инфицирования mAb либо интраназальным, либо интраперитонеальным путем и ежедневно измеряли массу тела в качестве показателя тяжести заболевания; ФБР и отсутствие вируса использовали в качестве контролей. Осуществляли мониторинг массы тела животных ежедневно в течение 14 дней после инфицирования и отмечали на графике массу тела в процентах от исходной массы в 0 день. Мышей, которые теряли >30% массы тела, подвергали эвтаназии. 1 мг/кг интраназально обеспечивал полную защиту от потери массы, в то время как 1 мг/кг интраперитонеальным путем приводил к некоторой потере массы. Показана повышенная эффективность интраназального пути введения по сравнению с интраперитонеальным путем.

[00372] На фиг. 5B показана активность in vivo антитела 5А7 к гриппу В у мышей в виде массы тела в процентах после интраназального по сравнению с интраперитонеальным введением 5А7, инфицированных 10xLD50 B/Malaysia (линия Виктория). Мышей лечили через 24 часа после инфицирования mAb либо интраназальным, либо интраперитонеальным путем и ежедневно измеряли массу тела в качестве показателя тяжести заболевания. Мышей, которые теряли >30% массы тела, подвергали эвтаназии. 1 мг/кг интраназально обеспечивал полную защиту от потери массы, в то время как 1 мг/кг интраперитонеальным путем приводил к некоторой потере массы тела. Показана повышенная эффективность интраназального пути введения по сравнению с интраперитонеальным путем.

[00373] Пример 6. Присутствие моноклональных антител к гриппу группы А не влияет на эффективность in vivo

[00374] Эффективность введения в дыхательные пути с применением интраназального введения оценивали с использованием дополнительных альтернативных антител к гриппу. Были предварительно выделены моноклональные антитела человека, которые нейтрализуют и демонстрируют эффективность против вирусов гриппа А как группы 1, так и группы 2. Антитело человека Mab53 (также обозначаемое TRL053) описано в US 2012/0020971 и WO 2011/160083, и эффективно нейтрализует подтипы H1, Н9, Н7 и Н5 группы 1 и 2. Антитело Mab579 (также обозначаемое TRL579) описано в WO 2013/086052 и эффективно нейтрализует Н3 и Н7. Как указано в настоящем документе, данные mAb получали и оптимизировали с получением CF-401 анти-Н1 (=mAb 53, TRL053), CF-402 анти-Н3 (=mAb 579, TRL579), применяемых в настоящих исследованиях.

[00375] Антитела Mab579 и Mab53 тестировали в модели у мышей на предмет терапевтической эффективности против инфекции, вызываемой вирусом гриппа А. Mab579 тестировали в отношении гриппа Н3, и Mab53 тестировали в отношении гриппа H1. Сравнивали интраназальное и интраперитонеальное дозирование, при этом интраназальное дозирование осуществляли в дозе 1 мг/кг, а интраперитонеальное дозирование осуществляли в дозе в десять раз выше, 10 мг/кг. Антитело Mab579 вводили через 24 часа после инфицирования (24 чпи) для оценки эффективности лечения против 10XLD50 вируса гриппа Н3 Vic11 (данные не представлены и фиг. 12B). Антитело Mab53 вводили через 24 часа после инфицирования (24 чпи) для оценки эффективности лечения против 10XLD50 вируса гриппа H1 Са109 и PR8 (данные не представлены и фиг. 11В). Интраназальное введение было эффективнее, чем интраперитонеальное введение, даже в случае интраперитонеального введения в 10 раз более высокой дозе в этом же эксперименте.

[00376] Получали сопоставимые данные выживаемости и потери массы как для отдельных mAb анти-В, так и для смесей этих же mAb с mAb анти-Н1 и анти-Н3 в формате коктейля, позволяющие установить, что указанные mAb не нарушают активность друг друга.

[00377] На фиг. 7А-7D показано, что совместное введение трех mAb к гриппу не нарушало эффективность mAb анти-В. Мышей инфицировали 10xLD50 вируса и лечили через 24 часа после инфицирования 3 мг/кг коктейля из трех mAb, состоящего из CF-401 анти-Н1 (=mAb 53, TRL053), CF-402 анти-Н3 (=mAb 579, TRL579) и либо TRL845 анти-В (коктейль 1), либо TRL847 анти-В (коктейль 2), либо TRL849 анти-В (коктейль 3); ФБР и отсутствие вируса использовали в качестве контролей. Осуществляли мониторинг массы тела животных ежедневно в течение 14 дней после инфицирования и отмечали на графике массу тела в процентах от исходной массы в 0 день.

[00378] Фиг. 7А-7D вместе демонстрируют, что указанный коктейль будет обеспечивать ожидаемый уровень защиты без нарушения со стороны других mAb в коктейле от типичных штаммов всех подтипов сезонного гриппа (H1N1, H3N2 и обе линии В).

[00379] На фиг. 7А показана защита мышей in vivo, инфицированных 10xLD50 H1N1 и получавших лечение через 24 часа после инфицирования 3 мг/кг коктейля из трех mAb, состоящего из CF-401 анти-Н1, CF-402 анти-Н3 и либо TRL845 анти-В (коктейль 1), либо TRL847 анти-В (коктейль 2), либо TRL849 анти-В (коктейль 3).

[00380] На фиг. 7B показана защита мышей in vivo, инфицированных 10xLD50 H3N2 и получавших лечение через 24 часа после инфицирования 3 мг/кг коктейля из трех mAb, состоящего из CF-401 анти-Н1, CF-402 анти-Н3 и либо TRL845 анти-В (коктейль 1), либо TRL847 анти-В (коктейль 2), либо TRL849 анти-В (коктейль 3).

[00381] На фиг. 7С показана защита мышей in vivo, инфицированных 10xLD50 линии В/Ямагата и получавших лечение через 24 часа после инфицирования 3 мг/кг коктейля из трех mAb, состоящего из CF-401 анти-Н1, CF-402 анти-Н3 и либо TRL845 анти-В (коктейль 1), либо TRL847 анти-В (коктейль 2), либо TRL849 анти-В (коктейль 3).

[00382] На фиг. 7D показана защита мышей in vivo, инфицированных 10xLD50 линии В/Виктория и получавших лечение через 24 часа после инфицирования 3 мг/кг коктейля из трех mAb, состоящего из CF-401 анти-Н1, CF-402 анти-Н3 и либо TRL845 анти-В (коктейль 1), либо TRL847 анти-В (коктейль 2), либо TRL849 анти-В (коктейль 3).

[00383] Пример 7. Картирование эпитопов для моноклональных антител анти-В с использованием PepScan™

[00384] Эпитопы для mAb анти-В картировали с использованием технологии CLIPS™ Pepscan, согласно которой оценивали связывание различных иммобилизованных линейных пептидов и пептидов с ограниченной конформационной свободой, соответствующих сегментам области-стебля гемагглютинина гриппа В, с разными mAb анти-В. Выбирали последовательность стебля для штамма В Lee гриппа В, поскольку она является предшественником линий как Виктория, так и Ямагата. Пептиды, которые связываются с mAb, считаются эпитопами. Для каждого тестируемого mAb описывали уникальный паттерн эпитопов прерывистого типа. Результаты суммированы на фиг. 8 и 9. На фиг. 8 показана пептидная матрица, созданная PEPSCAN™, для белка B/Lee/1940/ НА (SEQ ID NO: 291) (верхнее изображение). Затененные области белка B/Lee/1940/ НА соответствуют остаткам, используемым для получения пептидных матриц из аа_15-65 (SEQ ID NO: 292), аа_300-359 (SEQ ID NO: 293) и аа_362-481 (SEQ ID NO: 294). В таблице (нижнее изображение) показан эпитоп 1-аа_333-338 (SEQ ID NO: 304), эпитоп 2-аа_342-346 (SEQ ID NO: 305) и эпитоп 3-аа_457-463 (SEQ ID NO: 306) для mAb 5А7; эпитоп - аа_455-463 (SEQ ID NO: 307) для mAb TRL845; эпитоп 1-аа_64-71 (SEQ ID NO: 308), эпитоп 2-аа_336-348 (SEQ ID NO: 309), эпитоп 3-аа_424-428 (SEQ ID NO: 310) для TRL848; эпитоп 1-аа_317-323 (SEQ ID NO: 311), эпитоп 2-аа_344-349312), эпитоп 3-аа_378-383 (SEQ ID NO: 313) для mAb 849; эпитоп 1-аа_457-463 (SEQ ID NO: 314) для mAb 854. На чертеже в нижнем правом углу темно-серым цветом показана область, картированная на стебле НА.

[00385] Фиг. 9 иллюстрирует картирование эпитопов путем анализа PEPSCAN™ по стеблю белка НА. Затемненные области показывают эпитоп, с которым связывается каждое mAb. mAb: TRL848, TRL845, TRL854 и TRL849 распознают эпитопы прерывистого типа, которые частично перекрываются по стеблю НА. Контрольное mAb 5А7, полученное из опубликованной последовательности, давало схожие, но уникальные эпитопы.

[00386] Пример 8. Экспрессия моноклональных антител in vivo

[00387] В некоторых вариантах реализации mAb согласно настоящему изобретению предназначены для экспрессии in vivo. Было описано несколько систем доставки для переноса генетической информации для mAb в клетки-хозяева для выработки mAb in situ. В одном из вариантов реализации кодирующую ДНК инкапсулируют в лентивирусную частицу, которая содержит фузогенный белок на своей поверхности, комбинированный с антителом, прицельно воздействующим на ткань, как описано лабораторией Дэвида Балтимора (David Baltimore): Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 103(31): 11479-11484 (2006). Указанное прицельно воздействующее антитело может связывать CD20, например, тем самым обеспечивая предпочтительную доставку вектора в В-клетки для оптимальной выработки антител. В качестве альтернативы, применяют вектор AAV (аденоассоциированный вирус), как описано Johnson, P. R., et al., Nature Medicine (2009) 15:901-906. Другие способы включают инкапсулирование кодирующей мРНК в липосому или липидную частицу для облегчения поглощения клеткой.

[00388] Пример 9. Анализы кривой плавления

[00389] Анализы кривой плавления проводили в концентрации 2 мкг/мл в ФБР с помощью устройства ПЦР StepOne Plus™ с нагреванием от 15°С до 99°С со скоростью 1,58°С/мин. с непрерывным измерением флуоресценции. На фиг. 10A-10F представлены анализы кривой плавления для mAb: TRL845, TRL847, TRL848, TRL849 и TRL854. Каждое mAb демонстрировало высокую термическую стабильность. На фиг. 10А представлена кривая плавления для TRL845, демонстрирующая две температуры плавления (Tm1, Tm2) 58,3°С и 68,7°С соответственно. На фиг. 10В представлена таблица со значениями температуры плавления (Tm) для mAb: TRL845, TRL847, TRL848, TRL849 и TRL854, показанными на фиг. 10А и 10C-10F соответственно. Демонстрация двух температур плавления (Tm1, Tm2), вероятно, была обусловлена тем, что Fc- и Fab-домены этих mAb денатурировали по отдельности. На фиг. 10С представлена кривая плавления для TRL847, демонстрирующая температуру плавления (Tm1), равную 70,3°С. На фиг. 10D представлена кривая плавления для TRL848, демонстрирующая температуру плавления (Tm1), равную 70,1°С. На фиг. 10E представлена кривая плавления для TRL849, демонстрирующая две температуры плавления (Tm1, Tm2) 70°С и 81,8°С соответственно. На фиг. 10F представлена кривая плавления для TRL854, демонстрирующая две температуры плавления (Tm1, Tm2) 59,7°С и 68,9°С. Каждое из антител: TRL053, содержащего аминокислотные последовательности HC/LC с SEQ ID NO: 17/18, и TRL597, содержащего аминокислотные последовательности HC/LC с SEQ ID NO: 27/28, демонстрировало температуры плавления, представленные в таблице 6.

[00390]

[00391] Демонстрация двух температур плавления (Tm1, Tm2) некоторыми антителами, вероятно, была обусловлена тем, что Fc- и Fab-домены этих mAb денатурировали по отдельности. Таким образом, антитела, применяемые в конкретных комбинациях и композициях, предложенных согласно настоящему изобретению, стабильны и демонстрируют температуры плавления выше 55°С или в некоторых случаях выше 65°С.

[00392] Пример 10. Моноклональные антитела к гриппу обеспечивают защиту при доставке легочным путем

[00393] Для исследования эффекта комбинации CF-401 (mAb 053) с ингибитором нейраминидазы осельтамивиром для лечения инфекции H1N1, мышей заражали 3xLD50 вируса H1N1 и лечили на четвертый день либо однократной дозой 1 мг/кг mAb CF-401 для интраназального введения, либо путем лечения 10 мг/кг осельтамивира для перорального введения два раза в сутки в течение четырех дней, либо комбинацией обоих видов лечения. Как показано на фиг. 24, 100% мышей выжили после заражения при лечении путем однократного введения CF-401 в дозе 1 мг/кг. Стандарт лечения осельтамивир не оказывал защитного эффекта (0% выживаемость) при введении в данные поздние моменты времени после инфицирования, но в комбинации с терапией mAb CF-401 он обеспечивал дополнительную защиту от потери массы по сравнению с одной терапией mAb. Результаты представлены на фиг. 24, согласно которым 100% мышей выжили после заражения летальной дозой H1N1 при лечении через 4 дня после инфицирования путем однократного введения CF-401 в дозе 1 мг/кг. Введение стандарта лечения Тамифлю не обеспечивало защиту, но в дополнение к терапии mAb CF-401 обеспечивало дополнительную защиту от потери массы. 10 мг/кг Тамифлю вводили перорально в 4-8 дни два раза в сутки. Данные показывают, что стандарт лечения (Тамифлю) плюс терапия mAb эффективны при введении в поздние моменты времени.

[00394] mAb к гриппу обеспечивают защиту при доставке легочным путем. В некоторых вариантах реализации эффективность можно повышать путем комбинирования терапии mAb согласно настоящему изобретению с другими противовирусными лекарственными средствами, такими как ингибиторы нейраминидазы (например, осельтамивир [Тамифлю™], занамивир [Реленза™]), ингибиторы РНК-полимеразы (например, фавипиравир, VX-787), иммуномодуляторы (например, ингаляционный Интерферон бета-1a), агенты, прицельно воздействующие на клетки-хозяева (например, Флюдаза™, Радавирсен™), ингибиторы ионных каналов (например, амантидин) или другие противовирусные агенты.

[00395] Пример 11. Нейтрализующие антитела эффективны при интраназальном введении

[00396] Терапевтическая эффективность системно доставляемых антител зависит не только от нейтрализующей способности, поскольку как нейтрализующие, так и не нейтрализующие антитела, вводимые интраперитонеальным путем, демонстрируют схожие эффекты в лечении и профилактике летальной инфекции. Нейтрализующие и не нейтрализующие антитела были схожи по эффективности при введении интраперитонеально. Это ставит под сомнение значительный вклад нейтрализации в терапевтическую эффективность при системной доставке. Доставка не нейтрализующих антител внутривенным или интраперитонеальным путем не приводила к значительным различиям в эффективности (данные не представлены).

[00397] Интраназальная доставка нейтрализующих антител, напротив, значительно повышала их терапевтическую эффективность по сравнению с системной доставкой (фиг. 11А). Данное повышение терапевтической эффективности характерно для нейтрализующих антител, поскольку установленные не нейтрализующие антитела не демонстрируют подобную повышенную терапевтическую эффективность. В отличие от интраперитонеальной доставки, интраназальная доставка нейтрализующих антител обеспечивает значительный полезный терапевтический эффект по сравнению с не нейтрализующими антителами. Данная повышенная эффективность интраназальной терапии коррелирует со способностью антитела нейтрализовать, поскольку не нейтрализующие антитела не демонстрируют повышенную терапевтическую эффективность при интраназальном введении. Повышенную эффективность при интраназальном введении демонстрируют широко распознающие антитела СА6261 к вирусу H1 (антитело IgG2a, связывающее короткую α-спираль субъединицы НА2) (фиг. 11А). При дальнейшем подтверждении интраназальной эффективности авторы настоящего изобретения оценивали другое перекрестно-защитное антитело CR9114 и показали, что оно высокоэффективно при интраназальном введении (данные не представлены и фиг. 24). CR9114 связывает консервативный эпитоп в стебле НА и защищает от летального заражения вирусами гриппа А и В при введении внутривенно (Dreyfus С et al (2012) Science Express 9 August 2012 10.1126/science. 1222908).

[00398] Авторы настоящего изобретения не наблюдали значительного различия в интраназальной эффективности применительно к антителам, демонстрирующим различные изотипы антител. Отличия изотипов наблюдали при интраперитонеальном дозировании, что позволяет предположить, что эффекторная функция может быть значимой. Кроме того, одиночные нейтрализующие антитела эффективно блокировали инфекцию, вызываемую несколькими штаммами их целевого вируса H1 или Н3, что указывает на то, что эффективность не является штаммоспецифической или ограниченной. Таким образом, интраназальное введение обеспечивает жизнеспособную и действительно более эффективную альтернативу для нейтрализующих антител, направленных против вируса гриппа.

[00399] Пример 12. Нейтрализующие Fab эффективны интраназально

[00400] Проводили исследование для оценки того, будет ли удаление Fc «отменять» терапевтическую эффективность интраперитонеально или интраназально вводимых нейтрализующих и не нейтрализующих Fab. Как видно на фиг. 25, интраперитонеальное введение эталонного Fab (Fab антитела СА6261) не обеспечивает терапевтическую эффективность против вируса H1 в дозе 10 мг/кг или ниже. Все мыши, которых лечили Fab интраперитонеально, погибали от инфекции подобно мышам, которых лечили ФБР. В противоположность этому, мыши, которых лечили интраназально нейтрализующим Fab в дозе 10 мг/кг и 1 мг/кг, были способны выжить после летальной инфекции (фиг. 25). Все дозы, вводимые интраназально (даже 0,1 мг/кг), демонстрировали более высокую эффективность, чем любая доза, вводимая интраперитонеально. Наблюдали сопоставимые результаты при сравнении Fab СА6261 интраназально с интраперитонеальным или внутривенным введением в одном и том же эксперименте, в котором Fab СА6261 не оказывал защитного эффекта или не был эффективным при введении либо интраперитонеально, либо внутривенно, но демонстрировал значительную эффективность (животные сохраняли 95% или более массы тела), когда такую же дозу (5 мг/кг) вводили интраназально (данные не представлены). Эти данные показывают, что Fab эффективно блокируют или лечат вирусную инфекцию интраназально в случае нейтрализующих антител. Эти данные также показывают, что системная доставка Mab требует эффекторной функции Fc для терапевтической эффективности, поскольку Fab были неэффективны.

[00401] Эталонные Fab из не нейтрализующих антител не сохраняли терапевтическую эффективность при введении любо интраназальным, либо интраперитонеальным путем. Мышей, инфицированных вирусом Н3, лечили путем интраназальной доставки очищенного Fab типичных антител уровня техники СА8020 (нейтрализующее) и не нейтрализующего антитела (данные не представлены). В то время как нейтрализующие Fab могли демонстрировать терапевтическую эффективность, не нейтрализующие Fab не были способны защищать мышей от летального заражения. Фрагменты антител, в частности Fab, из не нейтрализующих антител не демонстрируют терапевтическую эффективность при введении интраназально.

[00402] Пример 13. Интраназальная доставка в 10-100 раз эффективнее интраперитонеальной доставки

[00403] Интраназальная (и/н) доставка нейтрализующих антител в 10-100 раз эффективнее интраперитонеальной (и/п) доставки. Мышей инфицировали 10xLD50 вируса PR8 (вирус H1) и через 24 часа после инфицирования лечили антителом (фиг. 11А). Нейтрализующее антитело СА6261 подвергали десятикратному серийному разведению и вводили либо интраназальным, либо интраперитонеальным путем (фиг. 11А). Мыши, которых лечили интраназальным путем, демонстрировали меньшую тяжесть заболевания, на которую указывает потеря массы, и были на 100% защищены от летальной инфекции в случае всех разведений. Для сравнения, только мыши, которых лечили интраперитонеально в самой высокой дозе (10 мг/кг), демонстрировали временную потерю массы и защиту от летальной инфекции. Все более низкие разведения не защищали мышей при введении интраперитонеально. Интраназальное лечение дозой 0,1 мг/кг, напротив, приводило к временной потере массы и выживаемости всех мышей. Мышей, которых лечили дозой 10 мг/кг и 1 мг/кг путем интраназальной доставки, защищали от детектируемой потери массы в любое время после инфицирования. Антитела, вводимые интраперитонеальным путем во всех дозах, демонстрировали некоторую степень потери массы, и только мыши, которых лечили в самой высокой дозе 10 мг/кг, выжили после инфицирования.

[00404] Авторы настоящего изобретения подтвердили, что интраназальная доставка нейтрализующих антител подобным образом приводит к повышению терапевтической эффективности против вирусов Н3. Мышей инфицировали вирусом Н3 и лечили через 24 часа после инфицирования (фиг. 12А). Нейтрализующее антитело СА8020 подвергали десятикратному серийному разведению и вводили интраназально или интраперитонеально. Как наблюдали в исследованиях с вирусом H1, антитело, вводимое интраназальным путем, обеспечивало 100% выживаемость во всех разведениях против вируса Н3 и демонстрировало меньшую потерю массы по сравнению с антителами, вводимыми интраперитонеальным путем.

[00405] В совокупности эти данные показывают, что нейтрализация необходима для повышения терапевтической эффективности при интраназальной доставке. Более того, терапевтическая эффективность системно доставляемых антител не зависит от нейтрализации, поскольку схожие уровни эффективности можно наблюдать как для нейтрализующих, так и для не нейтрализующих антител. В подтверждение данного наблюдения, терапевтическая эффективность нейтрализующего Fab «отменяется» при введении интраперитонеально, но нейтрализующий Fab демонстрирует эффективность при доставке интраназально. Нейтрализующие Fab, вводимые интраназально, демонстрируют повышенную эффективность по сравнению с интраперитонеальным введением, схожую с интраназальной доставкой их полного Mab-эквивалента.

[00406] Примеры 14. Исследования профилактики с применением антител, вводимых интраназально

[00407] С учетом значительной эффективности интраназального введения нейтрализующих антител после инфицирования проводили исследования для оценки эффективности профилактического интраназального введения и до инфицирования вирусом. Данные исследования служат для оценки и демонстрации применимости интраназального введения в случаях, когда индивидуум подвергается воздействию вируса гриппа, и в качестве эффективного подхода к предотвращению или уменьшению передачи среди популяции, подверженной воздействию или риску, или клинически у пациентов, когда инфекция или заболевание будет представлять собой более высокий совокупный для здоровья. Антитело СА6261 группы 1 (H1) оценивали на предмет введения за несколько дней до инфицирования вирусом гриппа в модели у мышей. Введение СА6261 оценивали за 3, 4, 5, 6 и 7 дней до заражения инфекцией и непосредственно сравнивали интраназальное и интраперитонеальное дозирование в различных дозах.

[00408] В первых исследованиях антитело СА6261 вводили интраназально или интраперитонеально, а затем мышей заражали дозой 3XLD50 вируса H1 PR8. На фиг. 13 представлены исследования профилактического интраназального и интраперитонеального введения за 3 или 4 дня до инфицирования вирусом. Антитело СА6261 вводили интраназально или интраперитонеально за 3 или 4 дня до заражения 3XLD50 PR8. Антитело СА6261 вводили интраназально (0,1 мг/кг) или интраперитонеально (0,1 мг/кг и 1 мг/кг). Интраназальное введение вплоть до 4 дней до инфицирования (-4 дди) (оценивали на уровне 0,1 мг/кг) защищало мышей от заражения вирусом. Интраперитонеальное введение за 3 или 4 дня до инфицирования в этой же дозе (0,1 мг/кг) было совершенно неэффективным. Интраперитонеальное введение за 3 или 4 дня до инфицирования было эффективным в случае 1 мг/кг. При сравнении интраназального (0,1 мг/г) и интраперитонеального (1 мг/кг) введения в -3 дди и -4 дди в обоих случаях в десять раз более низкая доза интраназально была эффективнее дозы интраперитонеально.

[00409] Затем оценивали профилактическую эффективность за 5, 6 и 7 дней до инфицирования вирусом. Оценивали в десять раз более высокую дозу интраперитонеально по сравнению с интраназальным введением. Антитело СА6261 вводили интраперитонеально (1 мг/кг) или интраназально (0,1 мг/кг) либо за 5, либо за 6, либо за 7 дней до заражения 3XLD50 вируса гриппа H1 PR8 (данные не представлены). Введение Тамифлю (10 мг/кг перорально, два раза в сутки в течение пяти дней) также оценивали для сравнения. Эффективность демонстрировали при интраназальном введении 0,1 мг/кг в -5 дди. Не все мыши выжили при интраназальном введении 0,1 мг/кг за 6 или 7 дней до заражения вирусом. В десять раз более высокая и/п доза (10 мг/кг) была эффективна при введении за 5, 6 или 7 дней до заражения. Введение антитела интраназально в дозе 0,1 мг/кг за 5 дней до заражения было по меньшей мере столь же эффективным, что и интраперитонеальное введение в десять раз более высокой дозы 1 мг/кг за 7 дней до заражения.

[00410] Затем оценивали более высокие и/н дозы, составляющие 1 мг/кг, за 5, 6 и 7 дней до заражения вирусом. На фиг. 14 представлены исследования интраназального по сравнению с интраперитонеальным введением с применением антитела СА6261, вводимого интраперитонеально или интраназально в дозе 1 мг/кг за 5, 6 или 7 дней до заражения 3XLD50 вируса PR8. Интраназальное введение 1 мг/кг антитела было профилактически эффективным вплоть до 7 дней до заражения вирусом, и в каждом случае интраназальное введение было более эффективным, чем такое же количество антитела, вводимое интраперитонеально. В действительности интраназальное введение в любое время (5, 6 или 7 дней до заражения) было эффективнее любого интраперитонеального введения, даже если интраперитонеальное введение осуществляли ближе к заражению вирусом. Во всех случаях антитело было эффективнее Тамифлю.

[00411] Вышеуказанные исследования демонстрируют, что интраназальное введение на самом деле лучше интраперитонеального введения для профилактической защиты. Интраназальное введение 0,1 мг/кг антитела защищает от заражения (3xLD50) вплоть до 5 дней до инфицирования (-5 дди). Такая же доза 0,1 мг/кг, вводимая интраперитонеально в любой из 3-7 дней до инфицирования вирусом, не защищает животное (от той же дозы 3xLD50 вируса). В более высоких дозах вводимое интраназально антитело (оценивали 1 мг/кг) может защитить от заражения при введении за по меньшей мере до 7 дней. Интраназальное введение более чем за 7 дней не оценивали, но оно может быть эффективным.

[00412] Повторное дозирование после инфицирования является эффективным и более низкие дозы интраназально эффективны при нескольких введениях доз с интервалом в несколько часов (8 часов, 32 часа, 52 часа) (данные не представлены). Подобным образом, повторное дозирование до инфицирования или воздействия вируса, по прогнозам, является эффективным и может обеспечить профилактическое интраназальное введение в более низких дозах.

[00413] Профилактическую эффективность оценивали в более высоких дозах заражения вирусом, в частности, введение антитела СА2621 осуществляли за несколько дней до заражения 10xLD50 вируса PR8 H1. За три и четыре дня до заражения 10xLD50 вируса PR8 подтипа H1 животным вводили 0,1 мг/кг антитела СА6261 либо интраназально, либо интраперитонеально (данные не представлены). Интраперитонеальное введение 0,1 мг/кг антитела за 3 или 4 дня до заражения вирусом было совершенно неэффективным, и животные, которых лечили интраперитонеально, погибали от вирусных инфекций, как и животные, которые не получали лечения. Животные, которым вводили 0,1 мг/кг антитела интраназально либо за 3, либо за 4 дня до заражения высоким титром вируса, напротив, были защищены от инфекции.

[00414] Оценивали введение антител за 5, 6 и 7 дней до заражения высоким титром вируса, при этом антитело вводили в дозе 1 мг/кг либо интраназально, либо интраперитонеально (фиг. 15). В данном исследовании только животные, которым вводили антитело в дыхательные пути (путем интраназального введения), выжили после заражения вирусом. Мыши, которых лечили 1 мг/кг антитела, вводимого за 5, 6 или 7 дней до заражения вирусом, не были полностью защищены и погибли от инфекции. Тамифлю был совершенно неэффективен с точки зрения защиты. Мыши, которых лечили 0,1 мг/кг антитела интраназально либо за 5, либо за 6 дней до инфицирования вирусом, выжили после заражения вирусом практически наравне с контрольными животными, которых не инфицировали.

[00415] Таким образом, интраназальное введение антител к гриппу представляет собой эффективный протокол и способ профилактики инфекции. Нейтрализующее грипп антитело, вводимое интраназально за по меньшей мере до 7 дней до инфицирования вирусом, защищало от заражения вирусом. Защиту путем интраназального введения за по меньшей мере до 7 дней демонстрировали для высокого титра вируса, который даже выше ожидаемого титра вируса, воздействующего на человека. Уровень защиты, наблюдаемый в данных исследованиях, указывает на то, что интраназальное введение антител будет эффективно защищать субъекта, представляющего собой человека, от заражения вирусом и блокировать или уменьшать передачу вируса. Антитело, вводимое легочным путем, является защитным при состояниях и в случаях, когда системное введение неэффективно.

[00416] Пример 16. Комбинации для лечения или профилактики гриппа

[00417] Желательной является комбинация антител, перекрестно реагирующих с тремя основными штаммами гриппа (H1, Н3 и В), для того, чтобы можно было лечить или предотвращать любой ожидаемый циркулирующий грипп в однократной дозе или комбинации доз. Это может позволить обойти необходимость получения подробных характеристик инфекционного вируса перед введением антитела или смеси антител. Диагностика для определения штамма гриппа требует доступного оснащения клинической лаборатории и, как правило, требует минимального 12-24-часового интервала времени между постановкой диагноза и началом лечения, что приводит к неблагоприятному отсрочиванию лечения, если перед выбором соответствующей направленной терапии необходимо определение штамма гриппа. В случае композиции с широким спектром реактивности в отношении штаммов гриппа А и В, предварительная диагностика для определения штамма не является необходимой перед лечением. Более того, антитела, в частности нейтрализующие антитела, демонстрируют немедленный лечебный эффект, который не может быть получен путем вакцинации, которая действует только профилактически и для эффективности которой, как правило, требуются недели.

[00418] Авторы настоящего изобретения стремились оценить и идентифицировать терапевтическую комбинацию моноклональных антител (mAb), охватывающих грипп типа А и типа В. В частности, подходящая и ценная комбинация содержит антитела, эффективные против вирусов типа А группы 1, типа А группы 2 и гриппа В. Это обеспечивает комбинацию, эффективную против значимых и циркулирующих вирусов гриппа, и она может быть введена до или без диагностической оценки или определения типа вируса. Критерии для терапевтической комбинации включали: эффективные нейтрализующие антитела; антитела, демонстрирующие эффективность в комбинации, против значимых циркулирующих вирусов гриппа, в частности, H1 и Н3 гриппа А, и гриппа В; эффективность в комбинации против заражения либо гриппом А, либо гриппом В; отсутствие заметного взаимодействия или конкуренции между антителами; антитела, эффективные интраперитонеально, внутривенно и интраназально или путем введения в дыхательные пути, а также системно. Предпочтительно, mAb для включения в коктейль обладают совместимыми биофизическими свойствами, так что они могут быть легко включены в один состав. Может быть желательным совпадение значений pI. Указанная терапевтическая комбинация будет эффективной против любого значимого циркулирующего вируса гриппа, не требуя при этом диагностической оценки или характеристики гриппа у пациента или субъекта. Моноклональные антитела человека или по меньшей мере антитела, содержащие вариабельную область человека, в частности по меньшей мере определяющие комплементарность области (CDR) человека в тяжелых и легких цепях, являются предпочтительными и применяемыми.

[00419] Оценивали походящие антитела к гриппу А. Антитело TRL053 (mAb53) анти-Н1 эффективно нейтрализует вирусы гриппа группы 1, включая H1, in vitro и in vivo. TRL-053 выделяли из фаговой библиотеки антител человека и оно описано в US 2012/0020971 и WO 2011/160083, и эффективно нейтрализует подтипы H1, Н9, Н7 и Н5 группы 1 и 2. TRL053 демонстрирует аффинность связывания Kd в отношении штаммов вируса гриппа H1 и H5 в нМ или суб-нМ диапазоне, и демонстрирует изоэлектрическую точку (pI) 8,54. Последовательности CDR вариабельной области тяжелой и легкой цепи для TRL053 представлены в прилагаемом перечне последовательностей, при этом полные аминокислотные последовательности вариабельной области указаны выше. TRL053 оценивали in vivo на предмет эффективности против вируса PR8 H1 (фиг. 11В). Животных заражали 10XLD50 вируса гриппа PR8 H1 и лечили через 24 часа после инфицирования 10 мг/кг, 1 мг/кг и 0,1 мг/кг антитела TRL053 (MAb53), вводимого интраназально или интраперитонеально. Осуществляли мониторинг массы тела животных ежедневно в течение 14 дней после инфицирования. TRL053 было эффективно интраперитонеально или интраназально, однако вводимое интраназально TRL053 демонстрировало большую эффективность, чем при интраперитонеальном дозировании. TRL053 было до некоторой степени эффективно только в случае дозы для интраперитонеального введения, составляющей 10 мг/кг. Дозы для интраназального введения в данном исследовании были эффективны на уровне 10 мг/кг и 1 мг/кг.

[00420] Антитело TRL579 (MAb579) анти-Н1 эффективно нейтрализует вирусы гриппа группы 2 in vitro и in vivo. TRL-579 выделяли из фаговой библиотеки антител человека и оно описано в WO 2013/086-52, и эффективно нейтрализует Н3 и Н7. TRL579 демонстрирует аффинность связывания Kd в отношении штаммов вируса гриппа Н3 и Н7 в нМ или суб-нМ диапазоне, и демонстрирует изоэлектрическую точку (pI) 8,60. Последовательности CDR вариабельной области тяжелой и легкой цепи для TRL-579 представлены в прилагаемом перечне последовательностей, при этом полные аминокислотные последовательности вариабельной области указаны выше. TRL579 оценивали in vivo на предмет эффективности против вируса Vic/11 Н3 (фиг. 12В). Животных заражали 10XLD50 вируса и лечили через 24 часа после инфицирования 10 мг/кг, 1 мг/кг и 0,1 мг/кг антитела TRL579, вводимого интраназально или интраперитонеально. Осуществляли мониторинг массы тела животных ежедневно в течение 14 дней после инфицирования. TRL579 было эффективно интраперитонеально или интраназально, однако вводимое интраназально TRL579 демонстрировало большую эффективность, чем при интраперитонеальном дозировании. TRL579 было до некоторой степени эффективно только в случае дозы для интраперитонеального введения, составляющей 10 мг/кг. В данном исследовании дозы для интраназального введения были эффективны на уровне 10 мг/кг и 1 мг/кг.

[00421] Для получения подходящего антитела анти-В в эффективной комбинации выделяли антитела, направленные против гриппа В. Антитела человека, связывающие белок гемагглютинин (НА) гриппа и эффективно нейтрализующие вирусы гриппа В клад В/Ямагата и В/Виктория, идентифицировали с использованием CellSpot (патент США 7413868) для идентификации антител с высокой аффинностью связывания и они были первоначально описаны в USSN 61/935746, поданном 4 февраля 2014 года. Перечень специфичных к гриппу В антител и их последовательностей, в частности последовательностей CDR тяжелой и легкой цепи моноклональных антител, для различных антител к гриппу В, приведен в перечне последовательностей. Показаны CDR1, CDR2 и CDR3 для тяжелой и легкой цепи, определенные в соответствии с критериями IMGT (международная база данных ImMunoGeneTics imgt; Ehrenmann F., Kaas Q. and Lefranc M.-P. (2010) Nucleic Acids Res., 38, D301-307).

[00422] Конструировали и выделяли антитела к гриппу В, и они содержали идентичные последовательности константных областей тяжелой цепи. Константные области оптимизировали кодоном для экспрессии в клетках человека. Последовательность константной области тяжелой цепи IgG1 представлена выше (SEQ ID NO: 297). Константная область легкой цепи для антител с легкой каппа-цепью (TRL845, 846, 847, 809, 849 и 854) представлена выше (SEQ ID NO: 295). Антитела TRL848 и 832 содержат константную область легкой лямбда-цепи, указанную ниже (SEQ ID NO: 296).

[00423] Последовательности вариабельной области тяжелой и легкой цепи для антител к гриппу В приведены выше и в прилагаемом перечне последовательностей.

[00424] Пример 17. Получение характеристик антител к гриппу В

[00425] Для идентификации и получения характеристик моноклонального антитела, подходящего для применения в комбинации антител с широким спектром эффективности, оценивали эффективность антител человека, направленных против гриппа В, в отношении вирусов гриппа В. На фиг. 16 сведены в таблицу данные оценочных исследований, оценивающих ингибирование гемагглютинации, классическую нейтрализацию in vitro и введение in vivo, для различных антител анти-B. Антитела оценивали в отношении обеих линий гриппа В, Ямагата и Виктория. Результаты in vivo представлены в виде резюме трех различных исследований в каждом случае, оценивающих процент от исходной массы тела у животных, зараженных 10xLD50 вируса и которым вводили указанное антитело TRL интраназально в дозе 1 мг/кг через 24 часа после инфицирования. Массу тела животных наблюдали в течение 14 дней, и указана самая маленькая наблюдаемая масса тела. Каждое из TRL845, TRL847, TRL848, TRL849 и TRL854 эффективно сохраняло по меньшей мере 96% от исходной массы тела животного на протяжении оценок эффективности in vivo.

[00426] Оценивали аффинность антител анти-В к вирусу гриппа, служащую в качестве индикатора относительной эффективности. Некоторые данные приведены на фиг. 17. Отмечены изоэлектрические точки антител. Изоэлектрическая тока (pI) для TRL053 составляет 8,54, и pI для TRL579 составляет 8,60. Оценивали аффинность к штаммам вируса гриппа B/Florida (линия Ямагата) и B/Malaysia (линия Виктория), и K_D в нМ приведена в таблице. Антитела к гриппу В демонстрировали нМ или суб-нМ аффинность к штаммам B/Florida. Аффинность каждого из TRL845, TRL847, TRL848, TRL849 и TRL854 к B/Malaysia была суб-нМ (<1,0 нМ) в каждом случае (данные не представлены).

[00427] Тестировали моноклональные антитела к гриппу В на предмет эффективности у животных, инфицированных вирусом B/Florida или B/Malaysia, представляющим линии Ямагата и Виктория соответственно. Антитела оценивали путем введения интраназально в дозе 1 мг/кг через 24 часа после инфицирования 10XLD50 вируса. Результаты эффективности в отношении вируса B/Florida представлены на фиг. 18, фиг. 19 и фиг. 22В. Результаты эффективности в отношении вируса B/Malaysia представлены на фиг. 20, фиг. 21 и фиг. 22А. Вводимые интраназально антитела к гриппу В демонстрировали эффективность против инфекции, вызванной любым вирусом линии В в дозе 10XLD50, при этом некоторые антитела демонстрировали сохранение 100% массы тела инфицированными животными, получавшими лечение антителами. Антитела TRL847, TRL845, TRL849, TRL848, TRL84, TRL854, а также TRL809 и TRL832 выбирали в качестве предпочтительных антител на основе исследований эффективности in vivo и аффинности.

[00428] Данные исследования представляют несколько антител к гриппу В, наиболее эффективных для применения в комбинации с антителом анти-Н1 и анти-Н3, для получения комбинации антител, перекрестно реактивных и эффективных против основных штаммов гриппа у населения. Комбинацию антитела TRL53 анти-Н1, антитела TRL579 анти-Н3 и антитела анти-В тестировали в виде коктейля. Антитело 5А7 к гриппу В описано выше в предыдущих примерах и эффективно лечит B/Florida или B/Malaysia через 24 часа после инфицирования в случае интраперитонеального или интраназального введения (фиг. 5). Легочное введение демонстрирует большую эффективность по меньшей мере в дозе 1 мг/кг или 0,1 мг/кг, в то время как для получения сопоставимой эффективности при системной доставке требуются более высокие дозы.

[00429] Пример 18. Коктейли, комбинации и композиции

[00430] Введение нескольких антител, каждого в количестве 10 мг/кг, в комбинации представляет собой значительную нагрузку дозой белкового антитела и может не быть хорошо переносимым или оправданным, особенно у больных или подверженных риску пациентов. Подходящей является комбинации или коктейль, содержащий антитела в более низких дозах, в частности в диапазоне 1 мг/кг. В настоящем документе показано, что интраназальное введение антител эффективно в дозе 1 мг/кг или меньше, даже в случае профилактического введения. Коктейль, содержащий антитела к гриппу А, эффективные против вирусов группы 1 и группы 2, в частности, антитело анти-Н1 и анти-Н3, а также антитело к гриппу В, обеспечивает комбинацию антител против всех значимых штаммов и типов гриппа у населения в однократной дозе или в комбинации. Коктейль из TRL053, TRL579 и 5А7, каждое в дозе 1 мг/кг, всего 3 мг/кг антитела, оценивали in vivo на предмет защиты от потери массы в случае вирусной инфекции. Коктейль антител вводили в виде однократной смешанной дозы через 24 часа после инфицирования 10xLD50 вируса. Указанный коктейль демонстрировал эффективность против инфицирования каждым или любым из: вируса H1, вируса Н3, вируса линии В/Ямагата и вируса линии В/Виктория (фиг. 23).

[00431] Комбинации антитела TRL053 анти-Н1, антитела TRL579 анти-Н3 и антител TRL анти-В оценивали в виде коктейлей антител. Данные комбинации содержат антитела, которые эффективны против значимых типов или штаммов гриппа и которые совместимы и эффективны в комбинации. Они сконструированы с остовом одного подтипа, демонстрируют схожие pI, не взаимодействуют или не конкурируют и нейтрализуют целевой вирус гриппа без нарушающих эффектов или концентрационных эффектов в присутствии другого антитела (антител). Коктейль из TRL053, TRL579 и каждого потенциального антитела TRL к гриппу В, каждое в дозе 1 мг/кг, всего 3 мг/кг антитела, вводимый после инфицирования, оценивали in vivo на предмет защиты от потери массы в случае вирусной инфекции. Была продемонстрирована эффективность против инфекции, вызванной каждым или любым из: вируса H1, вируса Н3, вируса линии В/Ямагата и вируса линии В/Виктория. На фиг. 7А-D представлены результаты исследований интраназального введения различных коктейлей. Полной защиты от инфекции, вызываемой вирусом H1, вирусом Н3 и вирусами линии В/Ямагата и В/Виктория, достигали с применением комбинации антител. Результаты для трех типичных коктейлей - TRL053, TRL579 и TRL845(c) (коктейль 1), TRL053, TRL579 и TRL847 (коктейль 2), и TRL053, TRL579 и TRL849 (коктейль 3) - представлены на фиг. 7А-7D.

[00432] На фиг. 7А-7D показано, что совместное введение трех mAb к гриппу не нарушало эффективность mAb анти-В. Мышей инфицировали 10xLD50 вируса и лечили через 24 часа после инфицирования 3 мг/кг коктейля из трех mAb, состоящего из CF-401 анти-Н1, CF-402 анти-Н3 и либо TRL845 анти-В (коктейль 1), либо TRL847 анти-В (коктейль 2), либо TRL849 анти-В (коктейль 3); ФБР и отсутствие вируса использовали в качестве контролей. Осуществляли мониторинг массы тела животных ежедневно в течение 14 дней после инфицирования и отмечали на графике массу тела в процентах от исходной массы в 0 день.

[00433] Фиг. 7A-7D вместе демонстрируют, что указанный коктейль будет обеспечивать ожидаемый уровень защиты без нарушения со стороны других mAb в коктейле от типичных штаммов всех подтипов сезонного гриппа (H1N1, H3N2 и обе линии В).

[00434] На фиг. 7А показана защита мышей in vivo, инфицированных 10xLD50 H1N1 и получавших лечение через 24 часа после инфицирования 3 мг/кг коктейля из трех mAb, состоящего из CF-401 анти-Н1, CF-402 анти-Н3 и либо TRL845 анти-В (коктейль 1), либо TRL847 анти-В (коктейль 2), либо TRL849 анти-В (коктейль 3).

[00435] На фиг. 7В показана защита мышей in vivo, инфицированных 10xLD50 H3N2 и получавших лечение через 24 часа после инфицирования 3 мг/кг коктейля из трех mAb, состоящего из CF-401 анти-Н1, CF-402 анти-Н3 и либо TRL845 анти-В (коктейль 1), либо TRL847 анти-В (коктейль 2), либо TRL849 анти-В (коктейль 3).

[00436] На фиг. 7С показана защита мышей in vivo, инфицированных 10xLD50 линии В/Ямагата и получавших лечение через 24 часа после инфицирования 3 мг/кг коктейля из трех mAb, состоящего из CF-401 анти-Н1, CF-402 анти-Н3 и либо TRL845 анти-В (коктейль 1), либо TRL847 анти-В (коктейль 2), либо TRL849 анти-В (коктейль 3).

[00437] На фиг. 7D показана защита мышей in vivo, инфицированных 10xLD50 линии В/Виктория и получавших лечение через 24 часа после инфицирования 3 мг/кг коктейля из трех mAb, состоящего из CF-401 анти-Н1, CF-402 анти-Н3 и либо TRL845 анти-В (коктейль 1), либо TRL847 анти-В (коктейль 2), либо TRL849 анти-В (коктейль 3).

[00438] Данные показывают, что композиция коктейля, объединяющая в себе три новых и уникальных антитела, эффективна против инфекции, вызываемой любым значимым или циркулирующим штаммом или типом вируса гриппа. Комбинированные антитела эффективны против вирусов гриппа А группы 1 и группы 2, а также вирусов гриппа В. Защиты от любого заражения достигают с помощью комбинации антител, вводимой в однократной дозе. Для того чтобы комбинация в однократной дозе была эффективной и переносимой, и без необходимости в дозах антител, которые являются чрезмерно затратными или избыточными, низких доз достигают в комбинации, которую вводят в виде коктейля непосредственно в дыхательные пути, например, путем интраназального введения. Эффективность комбинации антител, диапазон доз каждого из которых составляет примерно 1 мг/кг или менее, не была ранее достигнута с помощью комбинации антител ко всем значимым вирусам гриппа А и В. Описанная и предложенная согласно настоящему изобретению комбинация антител в совокупности нейтрализует все значимые вирусы гриппа и предназначена для наибольшей эффективности в комбинации. Антитела обладают совместимыми биофизическими свойствами. Антитела в комбинации не конкурируют или не препятствуют друг другу в значительной степени, и каждое из них так же активно в комбинации, как и отдельно. Антитела демонстрируют схожие изоэлектрические точки и схожим образом экспрессируются в клеточной культуре. В соответствии с одним из аспектов настоящего изобретения антитела сконструированы на основе одинаковых остовов IgG и содержат общие последовательности константной области, каждое рекомбинантно экспрессировано с одинаковыми последовательностями константной области тяжелой и легкой цепи или родственными последовательностями.

[00439] Настоящее изобретение может быть реализовано в других формах или осуществлено другими способами в пределах его сущности или существенных характеристик. Соответственно, настоящее описание является во всех отношениях иллюстративным и не ограничивающим, при этом объем настоящего изобретения определяется прилагаемой формулой изобретения, и все изменения, которые подпадают под значение и диапазон эквивалентности, включены в него.

[00440] На всем протяжении настоящего описания приведены различные источники, полное содержание каждого из которых включено в настоящее описание посредством ссылки.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Contrafect Corporation

Trellis Bioscience, LLC

Estelles, Angeles

Kauvar, Lawrence M.

Vigil, Adam

Wittekind, Michael

<120> АНТИТЕЛА, ПОДХОДЯЩИЕ ДЛЯ ПАССИВНОЙ ИММУНИЗАЦИИ ПРОТИВ ГРИППА, И ИХ КОМПОЗИЦИИ, КОМБИНАЦИИ И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ

<130> 4808.1WOU1

<140> Новая подача

<141> 2015-02-04

<150> US 61/935,746

<151> 2014-02-04

<150> US 62/051,630

<151> 2014-09-17

<160> 314

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 5A7 HC CDR1

<400> 1

Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr Gly

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 5A7 HC CDR2

<400> 2

Val Trp Tyr Asp Gly Leu Ile Lys

1 5

<210> 3

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 5A7 HC CDR3

<400> 3

Ala Arg Asp Leu Gln Pro Pro His Ser Pro Tyr Gly Met Asp Val

1 5 10 15

<210> 4

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 5A7 LC CDR1

<400> 4

Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Asp

1 5

<210> 5

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 5A7 LC CDR2

<400> 5

Asn Asn Asn

1

<210> 6

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 5A7 LC CDR3

<400> 6

Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Thr Val Ser

1 5 10

<210> 7

<211> 452

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 5A7 HC

<400> 7

Gln Cys Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Val Trp Tyr Asp Gly Leu Ile Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Met Gly Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Leu Gln Pro Pro His Ser Pro Tyr Gly Met Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Pro Gly Lys

450

<210> 8

<211> 215

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 5A7 LC

<400> 8

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn

20 25 30

Asp Val Tyr Trp Tyr Gln Asn Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asn Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu

85 90 95

Thr Val Ser Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln Pro

100 105 110

Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu

115 120 125

Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro

130 135 140

Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala

145 150 155 160

Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala

165 170 175

Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg

180 185 190

Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr

195 200 205

Val Val Pro Ala Glu Cys Ser

210 215

<210> 9

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 5A7 HCVR

<400> 9

Gln Cys Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Val Trp Tyr Asp Gly Leu Ile Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Met Gly Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Leu Gln Pro Pro His Ser Pro Tyr Gly Met Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 10

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 5A7 LCVR

<400> 10

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn

20 25 30

Asp Val Tyr Trp Tyr Gln Asn Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asn Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu

85 90 95

Thr Val Ser Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

<210> 11

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL053 HC CDR1

<400> 11

Gly Gly Ile Ile Arg Lys Tyr Ala

1 5

<210> 12

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL053 HC CDR2

<400> 12

Ile Ile Ala Ile Phe Asn Thr Ala

1 5

<210> 13

<211> 13

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL053 HC CDR3

<400> 13

Ala Arg Gly Met Asn Tyr Tyr Ser Asp Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 14

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL053 LC CDR1

<400> 14

Gln Ser Val Arg Ser Asn Asn

1 5

<210> 15

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL053 LC CDR2

<400> 15

Gly Ala Ser

1

<210> 16

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL053 LC CDR3

<400> 16

Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Ala Leu Thr

1 5 10

<210> 17

<211> 450

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL053 HC

<400> 17

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Arg Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Gly Ile Ile Arg Lys Tyr

20 25 30

Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Ala Ile Phe Asn Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Met Asn Tyr Tyr Ser Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Pro Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 18

<211> 216

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL053 LC

<400> 18

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Asn

20 25 30

Asn Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Phe Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro

85 90 95

Ala Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val

100 105 110

Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys

115 120 125

Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg

130 135 140

Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn

145 150 155 160

Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser

165 170 175

Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys

180 185 190

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr

195 200 205

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 19

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL053 HCVR

<400> 19

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Arg Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Gly Ile Ile Arg Lys Tyr

20 25 30

Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Ala Ile Phe Asn Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Met Asn Tyr Tyr Ser Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Pro

115 120

<210> 20

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL053 LCVR

<400> 20

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Asn

20 25 30

Asn Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Phe Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro

85 90 95

Ala Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr

100 105 110

<210> 21

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL579 HC CDR1

<400> 21

Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr Thr

1 5

<210> 22

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL579 HC CDR2

<400> 22

Ile Asn Ala Gly Asn Gly His Thr

1 5

<210> 23

<211> 25

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL579 HC CDR3

<400> 23

Ala Arg Gly Pro Glu Thr Tyr Tyr Tyr Asp Lys Thr Asn Trp Leu Asn

1 5 10 15

Ser His Pro Asp Glu Tyr Phe Gln His

20 25

<210> 24

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL579 LC CDR1

<400> 24

Gln Thr Ile Asn Asn Tyr

1 5

<210> 25

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL579 LC CDR2

<400> 25

Lys Ala Ser

1

<210> 26

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL579 LC CDR3

<400> 26

Gln Glu Tyr Asn Asn Asp Ser Pro Leu Thr

1 5 10

<210> 27

<211> 462

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL579 HC

<400> 27

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr

20 25 30

Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly His Thr Lys Tyr Ser Gln Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Arg Thr Thr Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Pro Glu Thr Tyr Tyr Tyr Asp Lys Thr Asn Trp Leu Asn

100 105 110

Ser His Pro Asp Glu Tyr Phe Gln His Trp Gly His Gly Thr Gln Val

115 120 125

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

130 135 140

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

145 150 155 160

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

165 170 175

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

180 185 190

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

195 200 205

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

210 215 220

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

225 230 235 240

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

245 250 255

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

260 265 270

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

275 280 285

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

290 295 300

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

305 310 315 320

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

325 330 335

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

340 345 350

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

355 360 365

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

370 375 380

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

385 390 395 400

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

405 410 415

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

420 425 430

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

435 440 445

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

450 455 460

<210> 28

<211> 215

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL579 LC

<400> 28

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Asn Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Glu Tyr Asn Asn Asp Ser Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 29

<211> 132

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL579 HCVR

<400> 29

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr

20 25 30

Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly His Thr Lys Tyr Ser Gln Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Arg Thr Thr Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Pro Glu Thr Tyr Tyr Tyr Asp Lys Thr Asn Trp Leu Asn

100 105 110

Ser His Pro Asp Glu Tyr Phe Gln His Trp Gly His Gly Thr Gln Val

115 120 125

Thr Val Ser Ser

130

<210> 30

<211> 110

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL579 LCVR

<400> 30

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Asn Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Glu Tyr Asn Asn Asp Ser Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr

100 105 110

<210> 31

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL784 HC CDR1

<400> 31

Gly Gly Thr Phe Ile Asn Tyr Ala

1 5

<210> 32

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL784 HC CDR2

<400> 32

Ile Ile Pro Val Tyr Gly Thr Ser

1 5

<210> 33

<211> 18

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL784 HC CDR3

<400> 33

Ala Ala Ser Thr Ala Thr Ser Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Arg Pro Phe

1 5 10 15

Asp Phe

<210> 34

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL784 LC CDR1

<400> 34

Asn Met Gly Pro Thr Ser

1 5

<210> 35

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL784 LC CDR2

<400> 35

Asp Asp Ser

1

<210> 36

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL784 LC CDR3

<400> 36

Gln Val Trp Asp Met Ser Ser Asp Arg Arg Val

1 5 10

<210> 37

<211> 455

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL784 HC

<400> 37

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Met Ala Thr Gly Gly Thr Phe Ile Asn Tyr

20 25 30

Ala Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Val Tyr Gly Thr Ser Asn His Val Glu Lys Leu

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Ala Ser Thr Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Gly Leu Arg Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Ala Ser Thr Ala Thr Ser Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Arg Pro Phe

100 105 110

Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Ser Val Ser Ser Ala Ser Thr

115 120 125

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser

130 135 140

Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

145 150 155 160

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

165 170 175

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

180 185 190

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys

195 200 205

Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu

210 215 220

Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

225 230 235 240

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

245 250 255

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

260 265 270

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

275 280 285

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

290 295 300

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

305 310 315 320

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

325 330 335

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

340 345 350

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys

355 360 365

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

370 375 380

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

385 390 395 400

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

405 410 415

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

420 425 430

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

435 440 445

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

450 455

<210> 38

<211> 214

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL784 LC

<400> 38

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Pro Cys Val Arg Phe Asn Met Gly Pro Thr Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr

35 40 45

Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asp Ser Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Met Ser Ser Asp Arg

85 90 95

Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys

100 105 110

Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln

115 120 125

Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly

130 135 140

Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly

145 150 155 160

Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala

165 170 175

Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser

180 185 190

Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val

195 200 205

Val Pro Ala Glu Cys Ser

210

<210> 39

<211> 125

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL784 HCVR

<400> 39

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Met Ala Thr Gly Gly Thr Phe Ile Asn Tyr

20 25 30

Ala Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Val Tyr Gly Thr Ser Asn His Val Glu Lys Leu

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Ala Ser Thr Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Gly Leu Arg Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Ala Ser Thr Ala Thr Ser Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Arg Pro Phe

100 105 110

Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Ser Val Ser Ser

115 120 125

<210> 40

<211> 110

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL784 LCVR

<400> 40

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Pro Cys Val Arg Phe Asn Met Gly Pro Thr Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr

35 40 45

Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asp Ser Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Met Ser Ser Asp Arg

85 90 95

Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

<210> 41

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL794 HC CDR1

<400> 41

Gly Phe Thr Phe Arg Ser His Ala

1 5

<210> 42

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL794 HC CDR2

<400> 42

Ile Ser Tyr Asp Glu Val Asn Lys

1 5

<210> 43

<211> 13

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL794 HC CDR3

<400> 43

Ala Arg Gly His Ser Gly Ser Tyr Arg Leu Phe Asp Phe

1 5 10

<210> 44

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL794 LC CDR1

<400> 44

Gln Val Val Gly Thr Asn

1 5

<210> 45

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL794 LC CDR2

<400> 45

Ala Ala Ser

1

<210> 46

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL794 LC CDR3

<400> 46

Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Leu Ser

1 5

<210> 47

<211> 450

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL794 HC

<400> 47

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser His

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ala Leu Ile Ser Tyr Asp Glu Val Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Val Ser Lys Asn Thr Val Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Ser Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly His Ser Gly Ser Tyr Arg Leu Phe Asp Phe Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 48

<211> 214

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL794 LC

<400> 48

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Val Val Gly Thr Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Leu

85 90 95

Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Arg Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 49

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL794 HCVR

<400> 49

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser His

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ala Leu Ile Ser Tyr Asp Glu Val Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Val Ser Lys Asn Thr Val Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Ser Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly His Ser Gly Ser Tyr Arg Leu Phe Asp Phe Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 50

<211> 109

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL794 LCVR

<400> 50

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Val Val Gly Thr Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Leu

85 90 95

Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Arg Arg Thr

100 105

<210> 51

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL798 HC CDR1

<400> 51

Gly Tyr Asn Phe Ala Ala Tyr Tyr

1 5

<210> 52

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL798 HC CDR2

<400> 52

Ser Asn Pro Asn Thr Gly Gly Ala

1 5

<210> 53

<211> 22

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL798 HC CDR3

<400> 53

Ala Arg Val Pro Arg Asp Arg Leu Leu Thr Leu Tyr Tyr Glu Ser Ser

1 5 10 15

Thr Tyr Gly Phe Asp Tyr

20

<210> 54

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL798 LC CDR1

<400> 54

Gln Gly Ile Asn Thr His

1 5

<210> 55

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL798 LC CDR2

<400> 55

Ser Ala Ser

1

<210> 56

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL798 LC CDR3

<400> 56

Gln Gln Ser Tyr Asn Tyr Pro Arg Thr

1 5

<210> 57

<211> 459

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL798 HC

<400> 57

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Ala Ala Tyr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ser Asn Pro Asn Thr Gly Gly Ala Asn Tyr Ala Gln Asp Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Val Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Leu Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Val Pro Arg Asp Arg Leu Leu Thr Leu Tyr Tyr Glu Ser Ser

100 105 110

Thr Tyr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser

130 135 140

Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp

145 150 155 160

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr

165 170 175

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr

180 185 190

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln

195 200 205

Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp

210 215 220

Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro

225 230 235 240

Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

245 250 255

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

260 265 270

Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn

275 280 285

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

290 295 300

Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

305 310 315 320

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

325 330 335

Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

340 345 350

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

355 360 365

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

370 375 380

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

385 390 395 400

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

405 410 415

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

420 425 430

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

435 440 445

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

450 455

<210> 58

<211> 214

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL798 LC

<400> 58

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Val Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asn Thr His

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Thr Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Leu Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Asn Tyr Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Asn Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 59

<211> 129

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL798 HCVR

<400> 59

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Ala Ala Tyr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ser Asn Pro Asn Thr Gly Gly Ala Asn Tyr Ala Gln Asp Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Val Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Leu Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Val Pro Arg Asp Arg Leu Leu Thr Leu Tyr Tyr Glu Ser Ser

100 105 110

Thr Tyr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser

<210> 60

<211> 109

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL798 LCVR

<400> 60

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Val Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asn Thr His

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Thr Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Leu Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Asn Tyr Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Asn Val Asp Ile Lys Arg Thr

100 105

<210> 61

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL799 HC CDR1

<400> 61

Gly Tyr Thr Leu Ile Asp Tyr Tyr

1 5

<210> 62

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL799 HC CDR2

<400> 62

Ile Asn Pro Ile Asn Gly Gly Thr

1 5

<210> 63

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL799 HC CDR3

<400> 63

Thr Arg Gly Arg Pro Ile Gly Arg Asn Trp Glu Pro Arg Asp Lys Asp

1 5 10 15

Tyr

<210> 64

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL799 LC CDR1

<400> 64

Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr

1 5 10

<210> 65

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL799 LC CDR2

<400> 65

Leu Gly Ser

1

<210> 66

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL799 LC CDR3

<400> 66

Met Gln Gly Leu Gln Thr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 67

<211> 454

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL799 HC

<400> 67

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Phe Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Ile Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Val Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Pro Ile Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Asp Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Gly Arg Pro Ile Gly Arg Asn Trp Glu Pro Arg Asp Lys Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

115 120 125

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

130 135 140

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

145 150 155 160

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

165 170 175

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

180 185 190

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

195 200 205

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro

210 215 220

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

225 230 235 240

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

245 250 255

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

260 265 270

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

275 280 285

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

290 295 300

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

305 310 315 320

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

325 330 335

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

340 345 350

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn

355 360 365

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

370 375 380

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

385 390 395 400

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

405 410 415

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

420 425 430

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

435 440 445

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

450

<210> 68

<211> 219

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL799 LC

<400> 68

Asp Ile Glu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Ser Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly

85 90 95

Leu Gln Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 69

<211> 124

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL799 HCVR

<400> 69

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Phe Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Ile Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Val Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Pro Ile Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Asp Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Gly Arg Pro Ile Gly Arg Asn Trp Glu Pro Arg Asp Lys Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 70

<211> 114

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL799 LCVR

<400> 70

Asp Ile Glu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Ser Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly

85 90 95

Leu Gln Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr

<210> 71

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL809 HC CDR1

<400> 71

Gly Phe Thr Phe Ser Ala Tyr Ala

1 5

<210> 72

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL809 HC CDR2

<400> 72

Thr Ser Tyr Asp Gly Arg Asp Ser

1 5

<210> 73

<211> 19

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL809 HC CDR3

<400> 73

Ala Lys Val Gly Pro Tyr Thr Gly Tyr Asp Asp Tyr Asn Tyr Tyr Gly

1 5 10 15

Met Asp Val

<210> 74

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL809 LC CDR1

<400> 74

Gln Ser Val Leu Ser Asn Ser Lys Asn Leu Asn Tyr

1 5 10

<210> 75

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL809 LC CDR2

<400> 75

Trp Ala Ser

1

<210> 76

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL809 LC CDR3

<400> 76

Gln Gln His Tyr Ser Ile Pro Leu Thr

1 5

<210> 77

<211> 456

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL809 HC

<400> 77

Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ala Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala His Thr Ser Tyr Asp Gly Arg Asp Ser Tyr Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Val Gly Pro Tyr Thr Gly Tyr Asp Asp Tyr Asn Tyr Tyr Gly

100 105 110

Met Asp Val Trp Gly His Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

115 120 125

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr

130 135 140

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro

145 150 155 160

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

165 170 175

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

180 185 190

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile

195 200 205

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val

210 215 220

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

225 230 235 240

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

245 250 255

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

260 265 270

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

275 280 285

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

290 295 300

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

305 310 315 320

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

325 330 335

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

340 345 350

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

355 360 365

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

370 375 380

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

385 390 395 400

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

405 410 415

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

420 425 430

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

435 440 445

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

450 455

<210> 78

<211> 220

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL809 LC

<400> 78

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Val Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Ser Ala Thr Val Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Ser Asn

20 25 30

Ser Lys Asn Leu Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

His Tyr Ser Ile Pro Leu Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile

100 105 110

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

115 120 125

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

130 135 140

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

145 150 155 160

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

165 170 175

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

180 185 190

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

195 200 205

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<210> 79

<211> 126

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL809 HCVR

<400> 79

Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ala Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala His Thr Ser Tyr Asp Gly Arg Asp Ser Tyr Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Val Gly Pro Tyr Thr Gly Tyr Asp Asp Tyr Asn Tyr Tyr Gly

100 105 110

Met Asp Val Trp Gly His Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 80

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL809 LCVR

<400> 80

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Val Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Ser Ala Thr Val Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Ser Asn

20 25 30

Ser Lys Asn Leu Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

His Tyr Ser Ile Pro Leu Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile

100 105 110

Lys Arg Thr

115

<210> 81

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL811 HC CDR1

<400> 81

Gly Phe Thr Phe Thr Asn Tyr Ala

1 5

<210> 82

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL811 HC CDR2

<400> 82

Ile Ser Phe Asp Glu Asp Asn Lys

1 5

<210> 83

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL811 HC CDR3

<400> 83

Ala Arg Gly Pro Glu Gly Val Trp Gly Arg Ser Ile Asp Ser

1 5 10

<210> 84

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL811 LC CDR1

<400> 84

Gln Asp Ile Arg Asn Arg

1 5

<210> 85

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL811 LC CDR2

<400> 85

Ala Ala Ser

1

<210> 86

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL811 LC CDR3

<400> 86

Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Trp Thr

1 5

<210> 87

<211> 451

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL811 HC

<400> 87

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Phe Asp Glu Asp Asn Lys Ser Tyr Ala Asp Tyr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Asn Asn Arg Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Pro Glu Gly Val Trp Gly Arg Ser Ile Asp Ser Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Lys

450

<210> 88

<211> 214

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL811 LC

<400> 88

Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Arg

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 89

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL811 HCVR

<400> 89

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Phe Asp Glu Asp Asn Lys Ser Tyr Ala Asp Tyr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Asn Asn Arg Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Pro Glu Gly Val Trp Gly Arg Ser Ile Asp Ser Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 90

<211> 109

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL811 LCVR

<400> 90

Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Arg

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr

100 105

<210> 91

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL812 HC CDR1

<400> 91

Gly Phe Asn Phe Ser Ser Tyr Gly

1 5

<210> 92

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL812 HC CDR2

<400> 92

Ile Trp Ser Gly Gly Ser Asn Lys

1 5

<210> 93

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL812 HC CDR3

<400> 93

Ala Arg Ala His Thr Ala Leu Thr Arg Phe Arg Trp Leu Asp Pro

1 5 10 15

<210> 94

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL812 LC CDR1

<400> 94

Gln Gly Ile Gly Ser Asn

1 5

<210> 95

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL812 LC CDR2

<400> 95

Ala Ala Ser

1

<210> 96

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL812 LC CDR3

<400> 96

Gln Gln Tyr Asn Thr Trp Pro Leu Thr

1 5

<210> 97

<211> 452

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL812 HC

<400> 97

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Ser Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ala His Thr Ala Leu Thr Arg Phe Arg Trp Leu Asp Pro Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Ile Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Pro Gly Lys

450

<210> 98

<211> 214

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL812 LC

<400> 98

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Gly Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Gly Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Thr Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Ile Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 99

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL812 HCVR

<400> 99

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Ser Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ala His Thr Ala Leu Thr Arg Phe Arg Trp Leu Asp Pro Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Ile Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 100

<211> 109

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL812 LCVR

<400> 100

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Gly Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Gly Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Thr Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Ile Arg Thr

100 105

<210> 101

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL813 HC CDR1

<400> 101

Gly Phe Ile Phe Gly Asp Phe Ala

1 5

<210> 102

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL813 HC CDR2

<400> 102

Ile Arg Ser Gly Leu Asn Arg Phe Glu Thr

1 5 10

<210> 103

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL813 HC CDR3

<400> 103

Thr Tyr Leu Val Gly Ala Val Gly Phe Gln His

1 5 10

<210> 104

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL813 LC CDR1

<400> 104

Gln Thr Ile Tyr Arg Trp

1 5

<210> 105

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL813 LC CDR2

<400> 105

Lys Ala Ser

1

<210> 106

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL813 LC CDR3

<400> 106

Gln Gln Tyr Asn Ser Phe Pro Tyr Arg

1 5

<210> 107

<211> 450

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL813 HC

<400> 107

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Gly Asp Phe

20 25 30

Ala Ile His Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Arg Ser Gly Leu Asn Arg Phe Glu Thr Ala Tyr Ala Ala

50 55 60

Ser Val Glu Gly Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Met

65 70 75 80

Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Val Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Leu Cys Thr Tyr Leu Val Gly Ala Val Gly Phe Gln His Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 108

<211> 214

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL813 LC

<400> 108

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Tyr Arg Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Ala Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Phe Pro Tyr

85 90 95

Arg Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 109

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL813 HCVR

<400> 109

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Gly Asp Phe

20 25 30

Ala Ile His Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Arg Ser Gly Leu Asn Arg Phe Glu Thr Ala Tyr Ala Ala

50 55 60

Ser Val Glu Gly Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Met

65 70 75 80

Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Val Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Leu Cys Thr Tyr Leu Val Gly Ala Val Gly Phe Gln His Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 110

<211> 109

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL813 LCVR

<400> 110

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Tyr Arg Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Ala Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Phe Pro Tyr

85 90 95

Arg Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr

100 105

<210> 111

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL823 HC CDR1

<400> 111

Gly Phe Asn Phe Asp Glu Tyr Val

1 5

<210> 112

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL823 HC CDR2

<400> 112

Ile Gly Ala Asp Gly Arg Gly Thr

1 5

<210> 113

<211> 19

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL823 HC CDR3

<400> 113

Ala Lys Val Glu Arg Ser Phe Tyr Asp Gly Ser Gly Tyr Gly Asp Ala

1 5 10 15

Leu Glu Ile

<210> 114

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL823 LC CDR1

<400> 114

Gln Thr Ile Thr Arg Phe

1 5

<210> 115

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL823 LC CDR2

<400> 115

Ala Ala Ser

1

<210> 116

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL823 LC CDR3

<400> 116

Gln Gln Ser Tyr Ser Ala Pro Phe Thr

1 5

<210> 117

<211> 456

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL823 HC

<400> 117

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Asp Glu Tyr

20 25 30

Val Met Tyr Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Leu Ile Gly Ala Asp Gly Arg Gly Thr Tyr Asn Ser Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Arg Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Val Glu Arg Ser Phe Tyr Asp Gly Ser Gly Tyr Gly Asp Ala

100 105 110

Leu Glu Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

115 120 125

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr

130 135 140

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro

145 150 155 160

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

165 170 175

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

180 185 190

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile

195 200 205

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val

210 215 220

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

225 230 235 240

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

245 250 255

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

260 265 270

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

275 280 285

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

290 295 300

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

305 310 315 320

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

325 330 335

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

340 345 350

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

355 360 365

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

370 375 380

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

385 390 395 400

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

405 410 415

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

420 425 430

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

435 440 445

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

450 455

<210> 118

<211> 214

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL823 LC

<400> 118

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Thr Arg Phe

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Gly Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Thr Val His Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ala Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Pro Gly Thr Thr Val Asp Ile Arg Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 119

<211> 126

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL823 HCVR

<400> 119

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Asp Glu Tyr

20 25 30

Val Met Tyr Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Leu Ile Gly Ala Asp Gly Arg Gly Thr Tyr Asn Ser Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Arg Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Val Glu Arg Ser Phe Tyr Asp Gly Ser Gly Tyr Gly Asp Ala

100 105 110

Leu Glu Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 120

<211> 109

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL823 LCVR

<400> 120

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Thr Arg Phe

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Gly Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Thr Val His Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ala Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Pro Gly Thr Thr Val Asp Ile Arg Arg Thr

100 105

<210> 121

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL832 HC CDR1

<400> 121

Gly Gly Ser Val Ser Asn Tyr Tyr

1 5

<210> 122

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL832 HC CDR2

<400> 122

Val Phe Tyr Ser Gly Ser Ser Asn Tyr Asn

1 5 10

<210> 123

<211> 19

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL832 HC CDR3

<400> 123

Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Val Asn Ser Gly Tyr Asp Trp Gly Pro Asn

1 5 10 15

Phe Asp Ser

<210> 124

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL832 LC CDR1

<400> 124

Arg Leu Gly Glu Lys Phe

1 5

<210> 125

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL832 LC CDR2

<400> 125

Glu Asp Ser

1

<210> 126

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL832 LC CDR3

<400> 126

Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Val Val

1 5

<210> 127

<211> 458

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL832 HC

<400> 127

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Met Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Asn Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Val Phe Tyr Ser Gly Ser Ser Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Asn

50 55 60

Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Asn

65 70 75 80

Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala

85 90 95

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Val Asn Ser Gly Tyr Asp Trp Gly

100 105 110

Pro Asn Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Ala Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

130 135 140

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

145 150 155 160

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

165 170 175

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

180 185 190

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

195 200 205

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

210 215 220

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

225 230 235 240

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

245 250 255

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

260 265 270

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

275 280 285

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

290 295 300

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

305 310 315 320

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

325 330 335

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

340 345 350

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

355 360 365

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

370 375 380

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

385 390 395 400

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

405 410 415

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

420 425 430

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

435 440 445

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

450 455

<210> 128

<211> 212

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL832 LC

<400> 128

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ala Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Arg Leu Gly Glu Lys Phe Ala

20 25 30

Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Glu Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ile Met

65 70 75 80

Asp Glu Gly Asp Phe Phe Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Val Val

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn

115 120 125

Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val

130 135 140

Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu

145 150 155 160

Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser

165 170 175

Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser

180 185 190

Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Val Pro

195 200 205

Ala Glu Cys Ser

210

<210> 129

<211> 128

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL832 HCVR

<400> 129

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Met Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Asn Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Val Phe Tyr Ser Gly Ser Ser Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Asn

50 55 60

Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Asn

65 70 75 80

Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala

85 90 95

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Val Asn Ser Gly Tyr Asp Trp Gly

100 105 110

Pro Asn Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Ala Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 130

<211> 108

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL832 LCVR

<400> 130

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ala Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Arg Leu Gly Glu Lys Phe Ala

20 25 30

Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Glu Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ile Met

65 70 75 80

Asp Glu Gly Asp Phe Phe Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Val Val

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105

<210> 131

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL833 HC CDR1

<400> 131

Gly Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Asn Tyr

1 5 10

<210> 132

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL833 HC CDR2

<400> 132

Ile Phe Tyr Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn

1 5 10

<210> 133

<211> 19

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL833 HC CDR3

<400> 133

Phe Cys Ala Arg Gly Ser Pro Asn Ser Gly Tyr Asp Trp Gly Pro His

1 5 10 15

Phe Asp Tyr

<210> 134

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL833 LC CDR1

<400> 134

Lys Leu Gly Asp Lys Phe

1 5

<210> 135

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL833 LC CDR2

<400> 135

Gln Asp Asp

1

<210> 136

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL833 LC CDR3

<400> 136

Gln Ala Trp Asp Ser Thr Thr Val Val

1 5

<210> 137

<211> 460

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL833 HC

<400> 137

Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Leu Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ala Ser Ile Ser Thr Gly

20 25 30

Gly Asn Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Asp Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Val Asp Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Met Ser Val Asp Thr

65 70 75 80

Ser Glu Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp

85 90 95

Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Ser Pro Asn Ser Gly Tyr Asp

100 105 110

Trp Gly Pro His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

115 120 125

Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser

130 135 140

Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys

145 150 155 160

Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu

165 170 175

Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu

180 185 190

Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr

195 200 205

Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val

210 215 220

Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

225 230 235 240

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

245 250 255

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

260 265 270

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

275 280 285

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

290 295 300

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

305 310 315 320

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

325 330 335

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

340 345 350

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

355 360 365

Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

370 375 380

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

385 390 395 400

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

405 410 415

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

420 425 430

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

435 440 445

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

450 455 460

<210> 138

<211> 212

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL833 LC

<400> 138

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Phe Val

20 25 30

Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Gln Ser Pro Ile Val Val Ile Tyr

35 40 45

Gln Asp Asp Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Ala Trp Asp Ser Thr Thr Val Val

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn

115 120 125

Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val

130 135 140

Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu

145 150 155 160

Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser

165 170 175

Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser

180 185 190

Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Val Pro

195 200 205

Ala Glu Cys Ser

210

<210> 139

<211> 130

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL833 HCVR

<400> 139

Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Leu Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ala Ser Ile Ser Thr Gly

20 25 30

Gly Asn Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Asp Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Val Asp Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Met Ser Val Asp Thr

65 70 75 80

Ser Glu Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp

85 90 95

Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Ser Pro Asn Ser Gly Tyr Asp

100 105 110

Trp Gly Pro His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

115 120 125

Ser Ser

130

<210> 140

<211> 108

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL833 LCVR

<400> 140

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Phe Val

20 25 30

Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Gln Ser Pro Ile Val Val Ile Tyr

35 40 45

Gln Asp Asp Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Ala Trp Asp Ser Thr Thr Val Val

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105

<210> 141

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL834 HC CDR1

<400> 141

Gly Gly Thr Phe Ser Tyr Tyr Ala

1 5

<210> 142

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL834 HC CDR2

<400> 142

Ile Ile Pro Ile Val Gly Thr Ala

1 5

<210> 143

<211> 21

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL834 HC CDR3

<400> 143

Ala Arg Ala Ala Asp Glu Ser Val Glu Ser Leu Thr Ile Lys Ala Phe

1 5 10 15

Arg Thr Asn Tyr His

20

<210> 144

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL834 LC CDR1

<400> 144

Thr Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr

1 5

<210> 145

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL834 LC CDR2

<400> 145

Thr Asp Asn

1

<210> 146

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL834 LC CDR3

<400> 146

Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Trp Val

1 5 10

<210> 147

<211> 458

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL834 HC

<400> 147

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Tyr Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Val Gly Thr Ala His Tyr Thr Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Ala Asp Glu Ser Val Glu Ser Leu Thr Ile Lys Ala Phe

100 105 110

Arg Thr Asn Tyr His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

130 135 140

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

145 150 155 160

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

165 170 175

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

180 185 190

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

195 200 205

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

210 215 220

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

225 230 235 240

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

245 250 255

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

260 265 270

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

275 280 285

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

290 295 300

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

305 310 315 320

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

325 330 335

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

340 345 350

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

355 360 365

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

370 375 380

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

385 390 395 400

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

405 410 415

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

420 425 430

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

435 440 445

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

450 455

<210> 148

<211> 216

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL834 LC

<400> 148

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Glu Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Asp Thr Ser Asn Ile Gly Ser Asn

20 25 30

Thr Val Ser Trp Phe Gln Leu Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Phe Thr Asp Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Thr Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu

85 90 95

Asn Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

180 185 190

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

195 200 205

Thr Val Val Pro Ala Glu Cys Ser

210 215

<210> 149

<211> 128

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL834 HCVR

<400> 149

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Tyr Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Val Gly Thr Ala His Tyr Thr Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Ala Asp Glu Ser Val Glu Ser Leu Thr Ile Lys Ala Phe

100 105 110

Arg Thr Asn Tyr His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 150

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL834 LCVR

<400> 150

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Glu Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Asp Thr Ser Asn Ile Gly Ser Asn

20 25 30

Thr Val Ser Trp Phe Gln Leu Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Phe Thr Asp Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Thr Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu

85 90 95

Asn Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

<210> 151

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL835 HC CDR1

<400> 151

Gly Tyr Asn Phe Pro Lys Tyr Trp

1 5

<210> 152

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL835 HC CDR2

<400> 152

Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Val

1 5

<210> 153

<211> 20

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL835 HC CDR3

<400> 153

Ala Arg His Leu Gly Gln Gln Leu Val Ser Asn Thr Tyr Tyr Tyr Tyr

1 5 10 15

Gly Met Asp Val

20

<210> 154

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL835 LC CDR1

<400> 154

Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr

1 5 10

<210> 155

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL835 LC CDR2

<400> 155

Leu Ala Ser

1

<210> 156

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL835 LC CDR3

<400> 156

Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Pro Met Tyr Thr

1 5 10

<210> 157

<211> 457

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL835 HC

<400> 157

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Arg Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Arg Ile Ser Cys Arg Gly Ser Gly Tyr Asn Phe Pro Lys Tyr

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Met Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Val Arg Tyr Asn Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Glu Ser Ile Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Arg Thr Ser Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg His Leu Gly Gln Gln Leu Val Ser Asn Thr Tyr Tyr Tyr Tyr

100 105 110

Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120 125

Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser

130 135 140

Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe

145 150 155 160

Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly

165 170 175

Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu

180 185 190

Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr

195 200 205

Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys

210 215 220

Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

225 230 235 240

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

245 250 255

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

260 265 270

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

275 280 285

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

290 295 300

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

305 310 315 320

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

325 330 335

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

340 345 350

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

355 360 365

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

370 375 380

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

385 390 395 400

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

405 410 415

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

420 425 430

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

435 440 445

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

450 455

<210> 158

<211> 221

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL835 LC

<400> 158

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Arg Ala Pro Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Leu Tyr Tyr Cys Met Gln Ala

85 90 95

Leu Gln Thr Pro Pro Met Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu

100 105 110

Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser

115 120 125

Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn

130 135 140

Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala

145 150 155 160

Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys

165 170 175

Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp

180 185 190

Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu

195 200 205

Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<210> 159

<211> 127

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL835 HCVR

<400> 159

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Arg Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Arg Ile Ser Cys Arg Gly Ser Gly Tyr Asn Phe Pro Lys Tyr

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Met Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Val Arg Tyr Asn Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Glu Ser Ile Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Arg Thr Ser Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg His Leu Gly Gln Gln Leu Val Ser Asn Thr Tyr Tyr Tyr Tyr

100 105 110

Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 160

<211> 116

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL835 LCVR

<400> 160

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Arg Ala Pro Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Leu Tyr Tyr Cys Met Gln Ala

85 90 95

Leu Gln Thr Pro Pro Met Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu

100 105 110

Ile Lys Arg Thr

115

<210> 161

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL837 HC CDR1

<400> 161

Gly His Thr Phe Ile Ser Tyr Ala

1 5

<210> 162

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL837 HC CDR2

<400> 162

Ile Val Pro Ile Phe Gly Thr Val

1 5

<210> 163

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL837 HC CDR3

<400> 163

Ala Arg Glu Ala Gly Tyr His Ser Ser Phe Ser Gly Val Tyr Phe Asp

1 5 10 15

Tyr

<210> 164

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL837 LC CDR1

<400> 164

Gln Ser Val Arg Ser Gly Tyr

1 5

<210> 165

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL837 LC CDR2

<400> 165

Asp Ala Ser

1

<210> 166

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL837 LC CDR3

<400> 166

Leu Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Arg Thr

1 5

<210> 167

<211> 454

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL837 HC

<400> 167

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Thr Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly His Thr Phe Ile Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Val Pro Ile Phe Gly Thr Val Asn Tyr Thr Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Leu Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Asp Leu Ser Arg Leu Thr Phe Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Ala Gly Tyr His Ser Ser Phe Ser Gly Val Tyr Phe Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

115 120 125

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

130 135 140

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

145 150 155 160

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

165 170 175

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

180 185 190

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

195 200 205

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro

210 215 220

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

225 230 235 240

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

245 250 255

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

260 265 270

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

275 280 285

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

290 295 300

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

305 310 315 320

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

325 330 335

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

340 345 350

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn

355 360 365

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

370 375 380

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

385 390 395 400

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

405 410 415

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

420 425 430

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

435 440 445

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

450

<210> 168

<211> 215

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL837 LC

<400> 168

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Tyr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Gly

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Gln Ala Pro Leu Leu Leu

35 40 45

Phe Tyr Asp Ala Ser Gly Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Gly Ser Ser Pro

85 90 95

Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 169

<211> 124

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL837 HCVR

<400> 169

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Thr Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly His Thr Phe Ile Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Val Pro Ile Phe Gly Thr Val Asn Tyr Thr Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Leu Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Asp Leu Ser Arg Leu Thr Phe Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Ala Gly Tyr His Ser Ser Phe Ser Gly Val Tyr Phe Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Leu Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 170

<211> 110

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL837 LCVR

<400> 170

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Tyr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Gly

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Gln Ala Pro Leu Leu Leu

35 40 45

Phe Tyr Asp Ala Ser Gly Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Gly Ser Ser Pro

85 90 95

Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr

100 105 110

<210> 171

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL839 HC CDR1

<400> 171

Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr Gly

1 5

<210> 172

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL839 HC CDR2

<400> 172

Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Lys

1 5

<210> 173

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL839 HC CDR3

<400> 173

Ala Ser Leu Asp Tyr Asp Phe Ser Tyr Tyr Tyr His Arg Asp Val

1 5 10 15

<210> 174

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL839 LC CDR1

<400> 174

Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asp Tyr

1 5

<210> 175

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL839 LC CDR2

<400> 175

Glu Val Arg

1

<210> 176

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL839 LC CDR3

<400> 176

Ala Ser Tyr Ala Gly Thr Tyr Ile His Leu

1 5 10

<210> 177

<211> 452

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL839 HC

<400> 177

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Arg Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Cys Val

35 40 45

Ala Leu Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asp Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Leu Asp Tyr Asp Phe Ser Tyr Tyr Tyr His Arg Asp Val Trp

100 105 110

Gly Pro Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Pro Gly Lys

450

<210> 178

<211> 216

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL839 LC

<400> 178

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asp Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Glu Val Arg Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Tyr Tyr Tyr Cys Ala Ser Tyr Ala Gly Thr

85 90 95

Tyr Ile His Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

180 185 190

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

195 200 205

Thr Val Val Pro Ala Glu Cys Ser

210 215

<210> 179

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL839 HCVR

<400> 179

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Arg Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Cys Val

35 40 45

Ala Leu Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asp Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Leu Asp Tyr Asp Phe Ser Tyr Tyr Tyr His Arg Asp Val Trp

100 105 110

Gly Pro Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 180

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL839 LCVR

<400> 180

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asp Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Glu Val Arg Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Tyr Tyr Tyr Cys Ala Ser Tyr Ala Gly Thr

85 90 95

Tyr Ile His Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

<210> 181

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL841 HC CDR1

<400> 181

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly

1 5

<210> 182

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL841 HC CDR2

<400> 182

Ile Ser Tyr Asp Glu Ile Asn Lys

1 5

<210> 183

<211> 13

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL841 HC CDR3

<400> 183

Ala Lys Pro Leu Arg Gly Ser Tyr Arg Tyr Phe Asp Leu

1 5 10

<210> 184

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL841 LC CDR1

<400> 184

Gln Gly Leu Gly Ser Asn

1 5

<210> 185

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL841 LC CDR2

<400> 185

Ala Ala Ser

1

<210> 186

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL841 LC CDR3

<400> 186

Gln Gln Tyr Thr Tyr Trp Pro Leu Thr

1 5

<210> 187

<211> 450

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL841 HC

<400> 187

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Phe Ile Ser Tyr Asp Glu Ile Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Pro Leu Arg Gly Ser Tyr Arg Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg

100 105 110

Gly Thr Val Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 188

<211> 214

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL841 LC

<400> 188

Asp Ile Val Met Thr Gln Pro Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Gly Ala Ser Gln Gly Leu Gly Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Thr Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Thr Tyr Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 189

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL841 HCVR

<400> 189

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Phe Ile Ser Tyr Asp Glu Ile Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Pro Leu Arg Gly Ser Tyr Arg Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg

100 105 110

Gly Thr Val Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 190

<211> 109

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL841 LCVR

<400> 190

Asp Ile Val Met Thr Gln Pro Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Gly Ala Ser Gln Gly Leu Gly Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Thr Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Thr Tyr Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr

100 105

<210> 191

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL842 HC CDR1

<400> 191

Gly Phe Ser Leu Trp Thr Ser Gly

1 5

<210> 192

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL842 HC CDR2

<400> 192

Met Ser Tyr Asp Glu Thr Lys Lys

1 5

<210> 193

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL842 HC CDR3

<400> 193

Ala Lys Pro Arg Leu Asp Tyr Leu Asp Tyr Phe His Ala Ala Asp Ser

1 5 10 15

<210> 194

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL842 LC CDR1

<400> 194

Tyr Ile Gly Ser Lys Ser

1 5

<210> 195

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL842 LC CDR2

<400> 195

Asp Asp Ser

1

<210> 196

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL842 LC CDR3

<400> 196

Cys Gln Val Trp Glu Thr Ser Glu Asp Leu Trp Val

1 5 10

<210> 197

<211> 453

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL842 HC

<400> 197

Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Asp Val Val Gln Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Trp Thr Ser

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Met Ser Tyr Asp Glu Thr Lys Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Lys Pro Arg Leu Asp Tyr Leu Asp Tyr Phe His Ala Ala Asp Ser

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Ser Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

145 150 155 160

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

165 170 175

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

195 200 205

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys

210 215 220

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

225 230 235 240

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

245 250 255

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

260 265 270

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

275 280 285

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

290 295 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

305 310 315 320

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

325 330 335

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

340 345 350

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln

355 360 365

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

370 375 380

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

385 390 395 400

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

405 410 415

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

420 425 430

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

435 440 445

Leu Ser Pro Gly Lys

450

<210> 198

<211> 217

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL842 LC

<400> 198

Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Thr Ile Thr Cys Gly Gly Asn Tyr Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly His Ala Pro Val Leu Val Val Tyr

35 40 45

Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Arg Ser Thr Ala Thr Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val

65 70 75 80

Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Glu Thr Ser

85 90 95

Glu Asp Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu

115 120 125

Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe

130 135 140

Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val

145 150 155 160

Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys

165 170 175

Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser

180 185 190

His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu

195 200 205

Lys Thr Val Val Pro Ala Glu Cys Ser

210 215

<210> 199

<211> 123

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL842 HCVR

<400> 199

Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Asp Val Val Gln Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Trp Thr Ser

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Met Ser Tyr Asp Glu Thr Lys Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Lys Pro Arg Leu Asp Tyr Leu Asp Tyr Phe His Ala Ala Asp Ser

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Ser Val Ser Ser

115 120

<210> 200

<211> 113

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL842 LCVR

<400> 200

Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Thr Ile Thr Cys Gly Gly Asn Tyr Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly His Ala Pro Val Leu Val Val Tyr

35 40 45

Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Arg Ser Thr Ala Thr Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val

65 70 75 80

Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Glu Thr Ser

85 90 95

Glu Asp Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

Gln

<210> 201

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL845 HC CDR1

<400> 201

Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr Ser

1 5

<210> 202

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL845 HC CDR2

<400> 202

Ile Ser Asp Thr Ser Arg Thr Ile

1 5

<210> 203

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL845 HC CDR3

<400> 203

Ala Arg Asp Pro Asp Thr Pro Phe Val Arg Ala Phe Asp Ser

1 5 10

<210> 204

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL845 LC CDR1

<400> 204

Gln Leu Ile Ser Ser Tyr

1 5

<210> 205

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL845 LC CDR2

<400> 205

Ala Ala Ser

1

<210> 206

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL845 LC CDR3

<400> 206

Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Pro Ile Thr

1 5 10

<210> 207

<211> 451

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL845 HC

<400> 207

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Met Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Ser Asp Thr Ser Arg Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Lys Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Pro Asp Thr Pro Phe Val Arg Ala Phe Asp Ser Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Lys

450

<210> 208

<211> 215

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL845 LC

<400> 208

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Leu Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Phe Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Pro

85 90 95

Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 209

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL845 HCVR

<400> 209

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Met Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Ser Asp Thr Ser Arg Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Lys Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Pro Asp Thr Pro Phe Val Arg Ala Phe Asp Ser Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 210

<211> 110

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL845 LCVR

<400> 210

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Leu Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Phe Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Pro

85 90 95

Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr

100 105 110

<210> 211

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL846 HC CDR1

<400> 211

Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr Ala

1 5

<210> 212

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL846 HC CDR2

<400> 212

Ile Arg Gly Ser Gly Glu Asn Thr

1 5

<210> 213

<211> 22

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL846 HC CDR3

<400> 213

Ala Arg Lys Trp Gly Arg Met Thr Val Phe Gly Val Ala Thr Asp Gln

1 5 10 15

Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr

20

<210> 214

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL846 LC CDR1

<400> 214

Gln Ser Val Ser Ser Asn

1 5

<210> 215

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL846 LC CDR2

<400> 215

Gly Ala Ser

1

<210> 216

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL846 LC CDR3

<400> 216

Gln Gln Phe Asn Asp Trp Pro Phe Leu Thr

1 5 10

<210> 217

<211> 459

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL846 HC

<400> 217

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Val Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Arg Gly Ser Gly Glu Asn Thr Tyr Tyr Ala Glu Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Lys Trp Gly Arg Met Thr Val Phe Gly Val Ala Thr Asp Gln

100 105 110

Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser

130 135 140

Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp

145 150 155 160

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr

165 170 175

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr

180 185 190

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln

195 200 205

Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp

210 215 220

Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro

225 230 235 240

Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

245 250 255

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

260 265 270

Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn

275 280 285

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

290 295 300

Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

305 310 315 320

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

325 330 335

Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

340 345 350

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

355 360 365

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

370 375 380

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

385 390 395 400

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

405 410 415

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

420 425 430

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

435 440 445

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

450 455

<210> 218

<211> 215

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL846 LC

<400> 218

Asp Ile Thr Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Ala Thr Asp Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Asp Trp Pro Phe

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 219

<211> 129

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL846 HCVR

<400> 219

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Val Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Arg Gly Ser Gly Glu Asn Thr Tyr Tyr Ala Glu Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Lys Trp Gly Arg Met Thr Val Phe Gly Val Ala Thr Asp Gln

100 105 110

Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser

<210> 220

<211> 110

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL846 LCVR

<400> 220

Asp Ile Thr Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Ala Thr Asp Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Asp Trp Pro Phe

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr

100 105 110

<210> 221

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL847 HC CDR1

<400> 221

Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe Ser

1 5

<210> 222

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL847 HC CDR2

<400> 222

Ile Ser Asp Thr Gly Arg Thr Ile

1 5

<210> 223

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL847 HC CDR3

<400> 223

Ala Arg Asp Pro Asp Thr Pro Phe Val Arg Ala Phe Asp Ser

1 5 10

<210> 224

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL847 LC CDR1

<400> 224

Gln Val Ile Ser Ser Tyr

1 5

<210> 225

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL847 LC CDR2

<400> 225

Ala Ala Ser

1

<210> 226

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL847 LC CDR3

<400> 226

Gln Gln Leu Thr Thr Tyr Pro Pro Ile Thr

1 5 10

<210> 227

<211> 451

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL847 HC

<400> 227

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Met Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Asp Thr Gly Arg Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Lys Ser Leu Arg Asp Glu Asp Ser Ala Phe Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Pro Asp Thr Pro Phe Val Arg Ala Phe Asp Ser Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Val Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Lys

450

<210> 228

<211> 215

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL847 LC

<400> 228

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Val Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Arg Phe Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Leu Thr Thr Tyr Pro Pro

85 90 95

Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 229

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL847 HCVR

<400> 229

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Met Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Asp Thr Gly Arg Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Lys Ser Leu Arg Asp Glu Asp Ser Ala Phe Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Pro Asp Thr Pro Phe Val Arg Ala Phe Asp Ser Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Val Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 230

<211> 110

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL847 LCVR

<400> 230

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Val Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Arg Phe Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Leu Thr Thr Tyr Pro Pro

85 90 95

Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr

100 105 110

<210> 231

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL848 HC CDR1

<400> 231

Gly Phe Ser Leu Trp Thr Ser Gly

1 5

<210> 232

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL848 HC CDR2

<400> 232

Met Ser Tyr Asp Glu Thr Lys Lys

1 5

<210> 233

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL848 HC CDR3

<400> 233

Ala Lys Pro Arg Leu Asp Tyr Leu Asp Tyr Phe His Ala Ala Asp Ser

1 5 10 15

<210> 234

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL848 LC CDR1

<400> 234

Tyr Ile Gly Ser Lys Ser

1 5

<210> 235

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL848 LC CDR2

<400> 235

Asp Asp Ser

1

<210> 236

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL848 LC CDR3

<400> 236

Cys Gln Val Trp Glu Thr Ser Glu Asp Leu Trp Val

1 5 10

<210> 237

<211> 453

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL848 HC

<400> 237

Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Asp Val Val Gln Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Trp Thr Ser

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Met Ser Tyr Asp Glu Thr Lys Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Lys Pro Arg Leu Asp Tyr Leu Asp Tyr Phe His Ala Ala Asp Ser

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Ser Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

145 150 155 160

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

165 170 175

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

195 200 205

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys

210 215 220

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

225 230 235 240

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

245 250 255

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

260 265 270

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

275 280 285

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

290 295 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

305 310 315 320

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

325 330 335

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

340 345 350

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln

355 360 365

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

370 375 380

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

385 390 395 400

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

405 410 415

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

420 425 430

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

435 440 445

Leu Ser Pro Gly Lys

450

<210> 238

<211> 217

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL848 LC

<400> 238

Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Thr Ile Thr Cys Gly Gly Asn Tyr Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly His Ala Pro Val Leu Val Val Tyr

35 40 45

Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Arg Ser Thr Ala Thr Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val

65 70 75 80

Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Glu Thr Ser

85 90 95

Glu Asp Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu

115 120 125

Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe

130 135 140

Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val

145 150 155 160

Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys

165 170 175

Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser

180 185 190

His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu

195 200 205

Lys Thr Val Val Pro Ala Glu Cys Ser

210 215

<210> 239

<211> 123

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL848 HCVR

<400> 239

Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Asp Val Val Gln Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Trp Thr Ser

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Met Ser Tyr Asp Glu Thr Lys Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Lys Pro Arg Leu Asp Tyr Leu Asp Tyr Phe His Ala Ala Asp Ser

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Ser Val Ser Ser

115 120

<210> 240

<211> 113

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL848 LCVR

<400> 240

Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Thr Ile Thr Cys Gly Gly Asn Tyr Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly His Ala Pro Val Leu Val Val Tyr

35 40 45

Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Arg Ser Thr Ala Thr Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val

65 70 75 80

Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Glu Thr Ser

85 90 95

Glu Asp Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

Gln

<210> 241

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL849 HC CDR1

<400> 241

Gly Gly Ser Ile Ser Asn Gly Gly Tyr His

1 5 10

<210> 242

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL849 HC CDR2

<400> 242

Ile Tyr Tyr Arg Gly Ser Thr

1 5

<210> 243

<211> 21

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL849 HC CDR3

<400> 243

Ala Arg Met Pro Leu Ala Asn Tyr Asp Leu Leu Thr Gly Leu Tyr Ile

1 5 10 15

Gly Ala Phe Asp Leu

20

<210> 244

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL849 LC CDR1

<400> 244

Gln Ser Val Asn Arg Asn

1 5

<210> 245

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL849 LC CDR2

<400> 245

Asp Ala Ser

1

<210> 246

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL849 LC CDR3

<400> 246

Gln Gln Tyr Asp Lys Trp Pro Pro Gly

1 5

<210> 247

<211> 459

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL849 HC

<400> 247

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asn Gly

20 25 30

Gly Tyr His Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Tyr Arg Gly Ser Thr Phe Tyr Asp Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Ser Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Met Pro Leu Ala Asn Tyr Asp Leu Leu Thr Gly Leu Tyr

100 105 110

Ile Gly Ala Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser

130 135 140

Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp

145 150 155 160

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr

165 170 175

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr

180 185 190

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln

195 200 205

Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp

210 215 220

Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro

225 230 235 240

Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

245 250 255

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

260 265 270

Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn

275 280 285

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

290 295 300

Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

305 310 315 320

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

325 330 335

Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

340 345 350

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

355 360 365

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

370 375 380

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

385 390 395 400

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

405 410 415

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

420 425 430

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

435 440 445

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

450 455

<210> 248

<211> 214

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL849 LC

<400> 248

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asn Arg Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Phe Gln Gln Ile Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Phe Asp Ala Ser Thr Arg Ala Ala Asp Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Gly Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr Val Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Lys Trp Pro Pro

85 90 95

Gly Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 249

<211> 129

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL849 HCVR

<400> 249

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asn Gly

20 25 30

Gly Tyr His Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Tyr Arg Gly Ser Thr Phe Tyr Asp Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Ser Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Met Pro Leu Ala Asn Tyr Asp Leu Leu Thr Gly Leu Tyr

100 105 110

Ile Gly Ala Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser

<210> 250

<211> 109

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL849 LCVR

<400> 250

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asn Arg Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Phe Gln Gln Ile Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Phe Asp Ala Ser Thr Arg Ala Ala Asp Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Gly Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr Val Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Lys Trp Pro Pro

85 90 95

Gly Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr

100 105

<210> 251

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL851 HC CDR1

<400> 251

Gly Asp Ser Phe Thr Ser Tyr Trp

1 5

<210> 252

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL851 HC CDR2

<400> 252

Ile Tyr Pro Arg Asp Ser Glu Thr

1 5

<210> 253

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL851 HC CDR3

<400> 253

Ala Arg Ser Pro Gly Tyr Ser Gly Tyr Leu Tyr Gly Trp Phe Asp Pro

1 5 10 15

<210> 254

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL851 LC CDR1

<400> 254

Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr

1 5 10

<210> 255

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL851 LC CDR2

<400> 255

Leu Gly Ser

1

<210> 256

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL851 LC CDR3

<400> 256

Met Gln Gly Leu Gln Thr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 257

<211> 453

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL851 HC

<400> 257

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Arg Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Ala His Gly Asp Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Leu Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Ala Val Ile Tyr Pro Arg Asp Ser Glu Thr Lys Phe Ser Pro Ala Phe

50 55 60

His Gly Gln Val Ser Ile Ser Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val His

65 70 75 80

Leu Gln Trp Asn Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Pro Gly Tyr Ser Gly Tyr Leu Tyr Gly Trp Phe Asp Pro

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

145 150 155 160

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

165 170 175

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

195 200 205

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys

210 215 220

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

225 230 235 240

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

245 250 255

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

260 265 270

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

275 280 285

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

290 295 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

305 310 315 320

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

325 330 335

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

340 345 350

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln

355 360 365

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

370 375 380

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

385 390 395 400

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

405 410 415

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

420 425 430

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

435 440 445

Leu Ser Pro Gly Lys

450

<210> 258

<211> 219

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL851 LC

<400> 258

Asp Ile Glu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Ser Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly

85 90 95

Leu Gln Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 259

<211> 123

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL851 HCVR

<400> 259

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Arg Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Ala His Gly Asp Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Leu Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Ala Val Ile Tyr Pro Arg Asp Ser Glu Thr Lys Phe Ser Pro Ala Phe

50 55 60

His Gly Gln Val Ser Ile Ser Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val His

65 70 75 80

Leu Gln Trp Asn Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Pro Gly Tyr Ser Gly Tyr Leu Tyr Gly Trp Phe Asp Pro

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 260

<211> 114

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL851 LCVR

<400> 260

Asp Ile Glu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Ser Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly

85 90 95

Leu Gln Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr

<210> 261

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL854 HC CDR1

<400> 261

Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr His

1 5

<210> 262

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL854 HC CDR2

<400> 262

Ile Asn Pro Asn Ser Gly Ala Thr

1 5

<210> 263

<211> 22

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL854 HC CDR3

<400> 263

Ala Thr Asp Ile Val Val Glu Arg Asp Ala Ser Leu Gly Gly Phe Asn

1 5 10 15

Ser Tyr Gly Met Asp Val

20

<210> 264

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL854 LC CDR1

<400> 264

Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn His

1 5 10

<210> 265

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL854 LC CDR2

<400> 265

Leu Ala Ser

1

<210> 266

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL854 LC CDR3

<400> 266

Met Gln Ser Leu Gln Thr Ser Ile Thr

1 5

<210> 267

<211> 459

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL854 HC

<400> 267

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr

20 25 30

His Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Phe Glu Trp Val

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr Thr Ser Thr Phe

50 55 60

Glu Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Asp Ile Val Val Glu Arg Asp Ala Ser Leu Gly Gly Phe Asn

100 105 110

Ser Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser

130 135 140

Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp

145 150 155 160

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr

165 170 175

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr

180 185 190

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln

195 200 205

Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp

210 215 220

Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro

225 230 235 240

Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

245 250 255

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

260 265 270

Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn

275 280 285

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

290 295 300

Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

305 310 315 320

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

325 330 335

Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

340 345 350

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

355 360 365

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

370 375 380

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

385 390 395 400

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

405 410 415

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

420 425 430

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

435 440 445

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

450 455

<210> 268

<211> 219

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL854 LC

<400> 268

Asp Ile Glu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Tyr Asn His Leu Ala Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Arg Ser

35 40 45

Pro His Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln Ser

85 90 95

Leu Gln Thr Ser Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 269

<211> 129

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL854 HCVR

<400> 269

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr

20 25 30

His Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Phe Glu Trp Val

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr Thr Ser Thr Phe

50 55 60

Glu Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Asp Ile Val Val Glu Arg Asp Ala Ser Leu Gly Gly Phe Asn

100 105 110

Ser Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser

<210> 270

<211> 114

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL854 LCVR

<400> 270

Asp Ile Glu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Tyr Asn His Leu Ala Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Arg Ser

35 40 45

Pro His Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln Ser

85 90 95

Leu Gln Thr Ser Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr

<210> 271

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL856 HC CDR1

<400> 271

Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Trp

1 5

<210> 272

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL856 HC CDR2

<400> 272

Ile Ser Ser Asp Gly Ser Thr Thr

1 5

<210> 273

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL856 HC CDR3

<400> 273

Ala Arg Val Ala Thr Pro Tyr Tyr Tyr Glu Ser Gly Phe Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 274

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL856 LC CDR1

<400> 274

Asp Ile Gly Ser Lys Ser

1 5

<210> 275

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL856 LC CDR2

<400> 275

Asp Asp Arg

1

<210> 276

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL856 LC CDR3

<400> 276

Gln Val Trp Asp Ile Thr Ser Asp Leu Val Val

1 5 10

<210> 277

<211> 452

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL856 HC

<400> 277

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Trp Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val

35 40 45

Ser Arg Ile Ser Ser Asp Gly Ser Thr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Pro Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Ala Thr Pro Tyr Tyr Tyr Glu Ser Gly Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Ala Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Pro Gly Lys

450

<210> 278

<211> 214

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL856 LC

<400> 278

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asp Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Phe

35 40 45

Asp Asp Arg Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ile Thr Ser Asp Leu

85 90 95

Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Val Gly Gln Pro Lys

100 105 110

Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln

115 120 125

Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly

130 135 140

Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly

145 150 155 160

Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala

165 170 175

Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser

180 185 190

Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val

195 200 205

Val Pro Ala Glu Cys Ser

210

<210> 279

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL856 HCVR

<400> 279

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Trp Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val

35 40 45

Ser Arg Ile Ser Ser Asp Gly Ser Thr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Pro Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Ala Thr Pro Tyr Tyr Tyr Glu Ser Gly Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Ala Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 280

<211> 110

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL856 LCVR

<400> 280

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asp Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Phe

35 40 45

Asp Asp Arg Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ile Thr Ser Asp Leu

85 90 95

Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Val Gly Gln

100 105 110

<210> 281

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL858 HC CDR1

<400> 281

Gly Asp Ser Val Ile Asn Ser Ala Tyr Tyr

1 5 10

<210> 282

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL858 HC CDR2

<400> 282

Val Tyr Tyr Ser Gly Ile Thr

1 5

<210> 283

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL858 HC CDR3

<400> 283

Ala Arg Arg Gly Gly Gly Trp Gln Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val

1 5 10 15

<210> 284

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL858 LC CDR1

<400> 284

Gln Ser Val Ser Thr Asn

1 5

<210> 285

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL858 LC CDR2

<400> 285

Gly Ala Ser

1

<210> 286

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL858 LC CDR3

<400> 286

Gln Gln Tyr Asp Asn Trp Leu Pro Ile Thr

1 5 10

<210> 287

<211> 453

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL858 HC

<400> 287

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Val Ile Asn Ser

20 25 30

Ala Tyr Tyr Trp Asp Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Val Gly Ser Val Tyr Tyr Ser Gly Ile Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Arg Leu Ser Tyr Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Arg Gly Gly Gly Trp Gln Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

145 150 155 160

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

165 170 175

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

195 200 205

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys

210 215 220

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

225 230 235 240

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

245 250 255

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

260 265 270

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

275 280 285

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

290 295 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

305 310 315 320

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

325 330 335

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

340 345 350

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln

355 360 365

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

370 375 380

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

385 390 395 400

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

405 410 415

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

420 425 430

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

435 440 445

Leu Ser Pro Gly Lys

450

<210> 288

<211> 215

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL858 LC

<400> 288

Asp Ile Val Met Thr Gln Pro Pro Gly Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

His Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Trp Leu Pro

85 90 95

Ile Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Gln Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 289

<211> 123

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL858 HCVR

<400> 289

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Val Ile Asn Ser

20 25 30

Ala Tyr Tyr Trp Asp Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Val Gly Ser Val Tyr Tyr Ser Gly Ile Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Arg Leu Ser Tyr Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Arg Gly Gly Gly Trp Gln Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 290

<211> 110

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL858 LCVR

<400> 290

Asp Ile Val Met Thr Gln Pro Pro Gly Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

His Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Trp Leu Pro

85 90 95

Ile Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Gln Arg Thr

100 105 110

<210> 291

<211> 584

<212> БЕЛОК

<213> Вирус гриппа В

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(584)

<223> B/Lee/1940 HA полноразмерный белок

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (486)..(486)

<223> Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту

<400> 291

Met Lys Ala Ile Ile Val Leu Leu Met Val Val Thr Ser Asn Ala Asp

1 5 10 15

Arg Ile Cys Thr Gly Ile Thr Ser Ser Asn Ser Pro His Val Val Lys

20 25 30

Thr Ala Thr Gln Gly Glu Val Asn Val Thr Gly Val Ile Pro Leu Thr

35 40 45

Thr Thr Pro Thr Lys Ser His Phe Ala Asn Leu Lys Gly Thr Gln Thr

50 55 60

Arg Gly Lys Leu Cys Pro Asn Cys Phe Asn Cys Thr Asp Leu Asp Val

65 70 75 80

Ala Leu Gly Arg Pro Lys Cys Met Gly Asn Thr Pro Ser Ala Lys Val

85 90 95

Ser Ile Leu His Glu Val Lys Pro Ala Thr Ser Gly Cys Phe Pro Ile

100 105 110

Met His Asp Arg Thr Lys Ile Arg Gln Leu Pro Asn Leu Leu Arg Gly

115 120 125

Tyr Glu Asn Ile Arg Leu Ser Thr Ser Asn Val Ile Asn Thr Glu Thr

130 135 140

Ala Pro Gly Gly Pro Tyr Lys Val Gly Thr Ser Gly Ser Cys Pro Asn

145 150 155 160

Val Ala Asn Gly Asn Gly Phe Phe Asn Thr Met Ala Trp Val Ile Pro

165 170 175

Lys Asp Asn Asn Lys Thr Ala Ile Asn Pro Val Thr Val Glu Val Pro

180 185 190

Tyr Ile Cys Ser Glu Gly Glu Asp Gln Ile Thr Val Trp Gly Phe His

195 200 205

Ser Asp Asp Lys Thr Gln Met Glu Arg Leu Tyr Gly Asp Ser Asn Pro

210 215 220

Gln Lys Phe Thr Ser Ser Ala Asn Gly Val Thr Thr His Tyr Val Ser

225 230 235 240

Gln Ile Gly Gly Phe Pro Asn Gln Thr Glu Asp Glu Gly Leu Lys Gln

245 250 255

Ser Gly Arg Ile Val Val Asp Tyr Met Val Gln Lys Pro Gly Lys Thr

260 265 270

Gly Thr Ile Val Tyr Gln Arg Gly Ile Leu Leu Pro Gln Lys Val Trp

275 280 285

Cys Ala Ser Gly Arg Ser Lys Val Ile Lys Gly Ser Leu Pro Leu Ile

290 295 300

Gly Glu Ala Asp Cys Leu His Glu Lys Tyr Gly Gly Leu Asn Lys Ser

305 310 315 320

Lys Pro Tyr Tyr Thr Gly Glu His Ala Lys Ala Ile Gly Asn Cys Pro

325 330 335

Ile Trp Val Lys Thr Pro Leu Lys Leu Ala Asn Gly Thr Lys Tyr Arg

340 345 350

Pro Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile Ala

355 360 365

Gly Phe Leu Glu Gly Gly Trp Glu Gly Met Ile Ala Gly Trp His Gly

370 375 380

Tyr Thr Ser His Gly Ala His Gly Val Ala Val Ala Ala Asp Leu Lys

385 390 395 400

Ser Thr Gln Glu Ala Ile Asn Lys Ile Thr Lys Asn Leu Asn Tyr Leu

405 410 415

Ser Glu Leu Glu Val Lys Asn Leu Gln Arg Leu Ser Gly Ala Met Asn

420 425 430

Glu Leu His Asp Glu Ile Leu Glu Leu Asp Glu Lys Val Asp Asp Leu

435 440 445

Arg Ala Asp Thr Ile Ser Ser Gln Ile Glu Leu Ala Val Leu Leu Ser

450 455 460

Asn Glu Gly Ile Ile Asn Ser Glu Asp Glu His Leu Leu Ala Leu Glu

465 470 475 480

Arg Lys Leu Lys Lys Xaa Leu Gly Pro Ser Ala Val Glu Ile Gly Asn

485 490 495

Gly Cys Phe Glu Thr Lys His Lys Cys Asn Gln Thr Cys Leu Asp Arg

500 505 510

Ile Ala Ala Gly Thr Phe Asn Ala Gly Asp Phe Ser Leu Pro Thr Phe

515 520 525

Asp Ser Leu Asn Ile Thr Ala Ala Ser Leu Asn Asp Asp Gly Leu Asp

530 535 540

Asn His Thr Ile Leu Leu Tyr Tyr Ser Thr Ala Ala Ser Ser Leu Ala

545 550 555 560

Val Thr Leu Met Ile Ala Ile Phe Ile Val Tyr Met Val Ser Arg Asp

565 570 575

Asn Val Ser Cys Ser Ile Cys Leu

580

<210> 292

<211> 50

<212> БЕЛОК

<213> Вирус гриппа В

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(50)

<223> B/Lee/1940 HA белок aa_15-65

<400> 292

Asp Arg Ile Cys Thr Gly Ile Thr Ser Ser Asn Ser Pro His Val Val

1 5 10 15

Lys Thr Ala Thr Gln Gly Glu Val Asn Val Thr Gly Val Ile Pro Leu

20 25 30

Thr Thr Thr Pro Thr Lys Ser His Phe Ala Asn Leu Lys Gly Thr Gln

35 40 45

Thr Arg

50

<210> 293

<211> 59

<212> БЕЛОК

<213> Вирус гриппа В

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(59)

<223> B/Lee/1940 HA белок aa_300-359

<400> 293

Leu Pro Leu Ile Gly Glu Ala Asp Cys Leu His Glu Lys Tyr Gly Gly

1 5 10 15

Leu Asn Lys Ser Lys Pro Tyr Tyr Thr Gly Glu His Ala Lys Ala Ile

20 25 30

Gly Asn Cys Pro Ile Trp Val Lys Thr Pro Leu Lys Leu Ala Asn Gly

35 40 45

Thr Lys Tyr Arg Pro Pro Ala Lys Leu Leu Lys

50 55

<210> 294

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> Вирус гриппа В

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(120)

<223> B/Lee/1940 HA белок aa_362-481

<400> 294

Gly Phe Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Leu Glu Gly Gly Trp Glu Gly

1 5 10 15

Met Ile Ala Gly Trp His Gly Tyr Thr Ser His Gly Ala His Gly Val

20 25 30

Ala Val Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Glu Ala Ile Asn Lys Ile

35 40 45

Thr Lys Asn Leu Asn Tyr Leu Ser Glu Leu Glu Val Lys Asn Leu Gln

50 55 60

Arg Leu Ser Gly Ala Met Asn Glu Leu His Asp Glu Ile Leu Glu Leu

65 70 75 80

Asp Glu Lys Val Asp Asp Leu Arg Ala Asp Thr Ile Ser Ser Gln Ile

85 90 95

Glu Leu Ala Val Leu Leu Ser Asn Glu Gly Ile Ile Asn Ser Glu Asp

100 105 110

Glu His Leu Leu Ala Leu Glu Arg

115 120

<210> 295

<211> 105

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(105)

<223> константная область LC каппа человека (каппа конст.)

<400> 295

Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu

1 5 10 15

Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro

20 25 30

Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly

35 40 45

Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr

50 55 60

Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His

65 70 75 80

Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val

85 90 95

Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 296

<211> 104

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(104)

<223> константная область LC лямбда человека (лямбда конст.)

<400> 296

Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

1 5 10 15

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

20 25 30

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys

35 40 45

Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

50 55 60

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

65 70 75 80

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

85 90 95

Thr Val Val Pro Ala Glu Cys Ser

100

<210> 297

<211> 330

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(330)

<223> константная область HC IgG1 человека (константная область НС человека)

<400> 297

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 298

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> A/H3/HA0 консенсус N-концевой

<400> 298

Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg

1 5

<210> 299

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> A/H3/HA0 консенсус C-концевой

<400> 299

Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu

1 5 10

<210> 300

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> A/H1/HA0 консенсус N-концевой

<400> 300

Asn Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg

1 5

<210> 301

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> A/H1/HA0 консенсус С-концевой

<400> 301

Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu

1 5 10

<210> 302

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> B/HA0 консенсус N-концевой

<400> 302

Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg

1 5

<210> 303

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> B/HA0 консенсус С-концевой

<400> 303

Gly Phe Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Leu Glu

1 5 10

<210> 304

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 5A7 Эпитоп 1

<400> 304

Gly Asn Cys Pro Ile Trp Val Lys

1 5

<210> 305

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 5A7 Эпитоп 2

<400> 305

Leu Lys Leu Ala Asn

1 5

<210> 306

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 5A7 Эпитоп 3

<400> 306

Ile Glu Leu Ala Val Leu Leu

1 5

<210> 307

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL845 Эпитоп 1

<400> 307

Ser Gln Ile Glu Leu Ala Val Leu Leu

1 5

<210> 308

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL848 Эпитоп 1

<400> 308

Ser His Phe Ala Asn Leu Lys

1 5

<210> 309

<211> 13

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL848 Эпитоп 2

<400> 309

Pro Ile Trp Val Lys Thr Pro Leu Lys Leu Ala Asn Gly

1 5 10

<210> 310

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL848 Эпитоп 3

<400> 310

Arg Leu Ser Gly

1

<210> 311

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL849 Эпитоп 1

<400> 311

Leu Asn Lys Ser Lys Pro Tyr

1 5

<210> 312

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL849 Эпитоп 2

<400> 312

Lys Leu Ala Asn Thr Gly Thr

1 5

<210> 313

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL849 Эпитоп 3

<400> 313

Met Ile Ala Gly Trp His

1 5

<210> 314

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TRL854 Эпитоп 1

<400> 314

Ile Glu Leu Ala Val Leu Leu

1 5

<---

Изобретение относится к биотехнологии. Описано выделенное антитело человека или антигенсвязывающий фрагмент указанного антитела, демонстрирующие аффинность связывания (KD) 10 нМ или сильнее к одному или более штаммам каждой из клад вируса гриппа B линии Ямагата и вируса гриппа B линии Виктория, при этом указанное антитело или указанный фрагмент содержат: (a) определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1), (b) определяющую комплементарность область 2 тяжелой цепи (HCDR2); и (с) определяющую комплементарность область 3 тяжелой цепи (HCDR3), при этом HCDR1/HCDR2/HCDR3 выбраны из группы, состоящей из SEQ ID NO: 31/32/33; 41/42/43; 51/52/53; 61/62/63; 71/72/73; 81/82/83; 91/92/93; 101/102/103; 111/112/113; 121/122/123; 131/132/133; 141/142/143; 151/152/153; 161/162/163; 171/172/173; 181/182/183; 191/192/193; 201/202/203; 211/212/213; 221/222/223; 231/232/233; 241/242/243; 251/252/253; 261/262/263; 271/272/273 и 281/282/283, и (d) определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1), (e) определяющую комплементарность область 2 легкой цепи (LCDR2); и (f) определяющую комплементарность область 3 легкой цепи (LCDR3), при этом LCDR1/LCDR2/LCDR3 выбраны из группы, состоящей из SEQ ID NO: 34/35/36; 44/45/46; 54/55/56; 64/65/66; 74/75/76; 84/85/86; 94/95/96; 104/105/106; 114/115/16; 124/125/126; 134/135/136; 144/145/146; 154/155/156; 164/165/166; 174/175/176; 184/185/186; 194/195/196; 204/205/206; 214/215/216; 224/225/226; 234/235/236; 244/245/246; 254/255/256; 264/265/266; 274/275/276; и 284/285/286, при этом указанные антитело или фрагмент обладают свойством связывания и/или ингибирования вируса гриппа. Изобретение может быть использовано для эффективной пассивной иммунизации против всех штаммов гриппа A и B. 10 н. и 33 з.п. ф-лы, 25 ил., 6 табл., 18 пр.

1. Выделенное антитело человека или антигенсвязывающий фрагмент указанного антитела, демонстрирующие аффинность связывания (KD) 10 нМ или сильнее к одному или более штаммам каждой из клад вируса гриппа B линии Ямагата и вируса гриппа B линии Виктория, при этом указанное антитело или указанный фрагмент содержат:

(а) определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1), (b) определяющую комплементарность область 2 тяжелой цепи (HCDR2); и (с) определяющую комплементарность область 3 тяжелой цепи (HCDR3), при этом HCDR1/HCDR2/HCDR3 выбраны из группы, состоящей из SEQ ID NO: 31/32/33; 41/42/43; 51/52/53; 61/62/63; 71/72/73; 81/82/83; 91/92/93; 101/102/103; 111/112/113; 121/122/123; 131/132/133; 141/142/143; 151/152/153; 161/162/163; 171/172/173; 181/182/183; 191/192/193; 201/202/203; 211/212/213; 221/222/223; 231/232/233; 241/242/243; 251/252/253; 261/262/263; 271/272/273 и 281/282/283, и

(d) определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1), (e) определяющую комплементарность область 2 легкой цепи (LCDR2); и (f) определяющую комплементарность область 3 легкой цепи (LCDR3), при этом LCDR1/LCDR2/LCDR3 выбраны из группы, состоящей из SEQ ID NO: 34/35/36; 44/45/46; 54/55/56; 64/65/66; 74/75/76; 84/85/86; 94/95/96; 104/105/106; 114/115/116; 124/125/126; 134/135/136; 144/145/146; 154/155/156; 164/165/166; 174/175/176; 184/185/186; 194/195/196; 204/205/206; 214/215/216; 224/225/226; 234/235/236; 244/245/246; 254/255/256; 264/265/266; 274/275/276; и 284/285/286, при этом указанные антитело или фрагмент обладают свойством связывания и/или ингибирования вируса гриппа.

2. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, демонстрирующие аффинность связывания (KD) 3 нМ или сильнее к одному или более штаммов каждой из клад вируса гриппа B линии Ямагата и вируса гриппа B линии Виктория.

3. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела по п. 1, которое выбрано из группы, состоящей из сконструированных моноспецифических антител и полиспецифических моноклональных антител человека.

4. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела по п. 1, которые нейтрализуют в клетке инфекцию, вызванную одним или более штаммами клад вируса гриппа B линии Ямагата и вируса гриппа B линии Виктория.

5. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела по п. 1, отличающееся тем, что указанные последовательности CDR тяжелой и легкой цепи, HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3, выбраны из группы, состоящей из SEQ ID NO: 31/32/33/34/35/36; 41/42/43/44/45/46; 51/52/53/54/55/56; 61/62/63/64/65/66; 71/72/73/74/75/76; 81/82/83/84/85/86; 91/92/93/94/95/96; 101/102/103/104/105/106; 111/112/113/114/115/116; 121/122/123/124/125/126; 131/132/133/134/135/136; 141/142/143/144/145/146; 151/152/153/154/155/156; 161/162/163/164/165/166; 171/172/173/174/175/176; 181/182/183/184/185/186; 191/192/193/194/195/196; 201/202/203/204/205/206; 211/212/213/214/215/216; 221/222/223/224/225/226; 231/232/233/234/235/236; 241/242/243/244/245/246; 251/252/253/254/255/256; 261/262/263/264/265/266; 271/272/273/274/275/276; и 281/282/283/284/285/286; при этом указанные антитело или фрагмент обладают свойством связывания и/или ингибирования вируса гриппа.

6. Выделенное антитело человека или антигенсвязывающий фрагмент указанного антитела, которые специфично связываются с одним или более штаммами каждой из клад как вируса гриппа B линии Ямагата, так и вируса гриппа B линии Виктория, и содержат вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 119, 129, 139, 149, 159, 169, 179, 189, 199, 209, 219, 229, 239, 249, 259, 269, 279 и 289; и содержат вариабельную последовательность легкой цепи (LCVR), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280 и 290; при этом указанные антитело или фрагмент обладают свойством связывания и/или ингибирования вируса гриппа.

7. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела по п. 6, которые содержат пару последовательностей HCVR/LCVR, выбранную из группы, состоящей из 39/40, 49/50, 59/60, 69/70, 79/80, 89/90, 99/100, 109/110, 119/120, 129/130, 139/140, 149/150, 159/160, 169/170, 179/180, 189/190, 199/200, 209/210, 219/220, 229/230, 239/240, 249/250, 259/260, 269/270, 279/280 и 289/290; при этом указанное антитело обладает свойством связывания и/или ингибирования вируса гриппа.

8. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела по п. 7, которые содержат пару HCVR/LCVR, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 79/80, 129/130, 219/220, 229/230, 239/240, 249/250 и 269/270; при этом указанное антитело обладает свойством связывания и/или ингибирования вируса гриппа.

9. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела по п. 1, которое связывается с одним или более эпитопами, выбранными из группы, состоящей из SEQ ID NO: 307, 308, 309, 310, 311, 312 и 313, или эпитопом прерывистого типа.

10. Выделенное антитело или фрагмент по любому из пп. 1-9, представляющие собой рекомбинантное антитело или его фрагмент.

11. Выделенная кодон-оптимизированная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело по любому из пп. 1-10.

12. Вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п. 11.

13. Клетка-хозяин для экспрессии рекомбинантного полипептида, содержащая вектор экспрессии по п. 12.

14. Способ получения антитела к гриппу В или антигенсвязывающего фрагмента указанного антитела, включающий выращивание клетки-хозяина по п. 13 в условиях, обеспечивающих выработку указанного антитела или его фрагмента, и выделение указанного антитела или его фрагмента, полученного таким образом.

15. Композиция для лечения или профилактики вируса гриппа В, содержащая антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела по п. 1 и фармацевтически приемлемый носитель.

16. Композиция для лечения или профилактики вируса гриппа В, содержащая антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела по п. 1 и фармацевтически приемлемый носитель, при этом указанные антитело или фрагмент демонстрируют первую температуру плавления (Tm1), измеренную в ФБР, выше или равную 55°C.

17. Композиция по п. 16, дополнительно содержащая одно или более антител человека или их антигенсвязывающих фрагментов, которые обладают специфичностью связывания в отношении по меньшей мере одного штамма гриппа А.

18. Композиция по п. 17, отличающаяся тем, что антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, которое обладает специфичностью в отношении гриппа А, имеет специфичность в отношении одного или более штаммов как группы 1, так и группы 2.

19. Композиция для лечения или профилактики вируса гриппа В, содержащая:

(a) первое антитело или антигенсвязывающий фрагмент указанного антитела, которые содержат аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую HCDR1/HCDR2/HCDR3 с SEQ ID NO: 11, 12, 13, и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую LCDR1/LCDR2/LCDR3 с SEQ ID NO: 14, 15, 16, (b) второе антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, которые содержат аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую HCDR1/HCDR2/HCDR3 с SEQ ID NO: 21, 22, 23, и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую последовательности CDR-домена LCDR1/LCDR2/LCDR3 с SEQ ID NO: 24, 25, 26; и

(с) третье антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, которое содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую HCDR1/HCDR2/HCDR3, и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую последовательности CDR-домена легкой цепи, LCDR1/LCDR2/LCDR3, соответственно, выбранные из:

(i) SEQ ID NO: 71, 72, 73 и SEQ ID NO: 74, 75, 76;

(ii) SEQ ID NO: 91, 92, 93 и SEQ ID NO: 94, 95, 96;

(iii) SEQ ID NO: 101, 102, 103 и SEQ ID NO: 104, 105, 106;

(iv) SEQ ID NO: 121, 122, 123 и SEQ ID NO: 124, 125, 126;

(v) SEQ ID NO: 181, 182, 183 и SEQ ID NO: 184, 185, 186;

(vi) SEQ ID NO: 191, 192, 193 и SEQ ID NO: 194, 195, 196;

(vii) SEQ ID NO: 201, 202, 203 и SEQ ID NO: 204, 205, 206;

(viii) SEQ ID NO: 211, 212, 213 и SEQ ID NO: 214, 215, 216;

(ix) SEQ ID NO: 221, 222, 223 и SEQ ID NO: 224, 225, 226;

(x) SEQ ID NO: 231, 232, 233 и SEQ ID NO: 234, 235, 236;

(xi) SEQ ID NO: 241, 242, 243 и SEQ ID NO: 244, 245, 246;

(xii) SEQ ID NO: 261; 262, 263 и SEQ ID NO: 264, 265, 266; или

(xiii) SEQ ID NO: 271, 272, 273 и SEQ ID NO: 274, 275, 276, при этом указанные антитело или фрагмент способны связывать и/или ингибировать вирус гриппа.

20. Композиция по п. 19, отличающаяся тем, что указанное первое антитело или фрагмент антитела содержит пару HCVR/LCVR с SEQ ID NO: 19/20, при этом указанные антитело или фрагмент обладают свойством связывания и/или ингибирования вируса гриппа.

21. Композиция по п. 19, отличающаяся тем, что указанное второе антитело или фрагмент антитела содержит пару HCVR/LCVR с SEQ ID NO: 29/30; при этом указанные антитело или фрагмент обладают свойством связывания и/или ингибирования вируса гриппа.

22. Композиция по п. 19, отличающаяся тем, что указанное третье антитело или фрагмент антитела содержит пару HCVR/LCVR, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 79/80, 99/100, 109/110, 129/130, 189/190, 199/200, 209/210, 219/220, 229/230, 239/240, 249/250, 269/270 и 279/280, при этом указанные антитело или фрагмент обладают свойством связывания и/или ингибирования вируса гриппа.

23. Композиция по п. 19, отличающаяся тем, что указанное третье антитело или фрагмент антитела содержит пару HCVR/LCVR, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 79/80, 129/130, 219/220, 229/230, 239/240, 249/250 и 269/270, при этом указанные антитело или фрагмент обладают свойством связывания и/или ингибирования вируса гриппа.

24. Композиция по п. 19, отличающаяся тем, что каждое из указанных первого, второго и третьего антител или фрагментов антител демонстрирует значения изоэлектрической точки (pI), все из которых находятся в диапазоне 2 pI.

25. Композиция по п. 19, отличающаяся тем, что указанное первое антитело представляет собой TRL053/Mab53, содержащее аминокислотные последовательности тяжелой цепи (HC)/легкой цепи (LC) с SEQ ID NO: 17/18, указанное второе антитело представляет собой антитело TRL579/Mab579, содержащее аминокислотные последовательности HC/LC с SEQ ID NO: 27/28, и указанное третье антитело выбрано из группы, состоящей из TRL847, TRL845, TRL849, TRL848, TRL846, TRL854, TRL809 и TRL832, содержащих аминокислотные последовательности HC/LC, выбранные из группы, состоящей из 227/228, 207/208, 247/248, 237/238, 217/218, 267/268, 77/78 и 127/128 соответственно; при этом указанные антитело или фрагмент обладают свойством связывания и/или ингибирования вируса гриппа.

26. Композиция по п. 25, отличающаяся тем, что каждое из указанного первого, второго и третьего антител или фрагментов представлено в однократной дозе в эффективном количестве для лечения или предотвращения инфекции или заболевания, вызываемых гриппом А и гриппом В, у нуждающегося в этом субъекта.

27. Композиция по п. 26, отличающаяся тем, что каждое из указанного первого, второго и третьего антител или фрагментов присутствует в композиции в количестве 100 мг/кг или меньше каждого из указанного первого, второго и третьего антител или фрагментов на дозу.

28. Композиция по п. 26, отличающаяся тем, что каждое из указанных первого, второго и третьего антител или фрагментов присутствует в композиции в количестве 10 мг/кг или меньше каждого из указанных первого, второго и третьего антител или фрагментов на дозу.

29. Композиция по п. 26, отличающаяся тем, что каждое из указанных первого, второго и третьего антител или фрагментов присутствует в композиции в количестве 1 мг/кг или меньше каждого из указанных первого, второго и третьего антител или фрагментов на дозу.

30. Композиция по п. 26, отличающаяся тем, что каждое из указанных первого, второго и третьего антител или фрагментов присутствует в композиции в количестве всего антитела или фрагмента антитела 10 мг/кг или меньше на дозу.

31. Композиция по п. 26, отличающаяся тем, что указанный носитель содержит разбавитель и/или вспомогательное вещество для назальной или легочной доставки.

32. Композиция по п. 26, дополнительно содержащая одно или более из: противовирусного лекарственного средства, ингибитора репликации вируса, ингибитора протеазы, ингибитора полимеразы, ингибитора гемагглютинина, бронхолитического средства или ингаляционного кортикостероида.

33. Композиция по п. 19, отличающаяся тем, что одно или более из указанных антител или их антигенсвязывающих фрагментов представляет собой фрагмент антитела, выбранный из Fab, Fab' и F(ab')2, scFv, dAb, или полиспецифическое антитело, содержащее аминокислотные последовательности HCDR1/HCDR2/HCDR3, выбранные из группы, состоящей из 11/12/13, 21/22/23, 71/72/73, 74/75/76, 91/92/93, 101/102/103, 121/122/123, 181/182/183, 191/192/193, 201/202/203, 211/212/213, 221/222/223, 231/232/233, 241/242/243, 261/262/263 и 271/272/273, при этом указанное антитело обладает свойством связывания и/или ингибирования вируса гриппа.

34. Композиция по п. 32, отличающаяся тем, что указанный иммуномодулятор представляет собой Интерферон бета-1a.

35. Композиция по п. 32, отличающаяся тем, что указанное противовирусное лекарственное средство представляет собой ингибитор нейраминидазы, выбранный из группы, состоящей из Осельтамивира, Занамивира, Перамивира и Ланинамивира.

36. Композиция по п. 32, отличающаяся тем, что указанное противовирусное лекарственное средство представляет собой ингибитор РНК-полимеразы, выбранный из группы, состоящей из Фавипиравира (T-705) и VX 787.

37. Композиция по п. 32, отличающаяся тем, что указанное противовирусное лекарственное средство представляет собой лекарственное средство, прицельно воздействующее на клетку-хозяина, выбранное из группы, состоящей из Флюдазы (Das181) и AB-103 (p2TA).

38. Композиция по п. 32, отличающаяся тем, что указанное противовирусное лекарственное средство представляет собой ингибитор ионных каналов, выбранный из группы, состоящей из Рамантадина и Амантадина.

39. Композиция по п. 32, отличающаяся тем, что указанное бронхолитическое средство выбрано из альбутерола, левальбутерола или сальметерола.

40. Способ лечения или профилактики гриппа, вызванного вирусом гриппа В, у субъекта, при этом указанный способ включает введение субъекту:

(a) первого антитела или антигенсвязывающего фрагмента указанного антитела, содержащего аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую HCDR1/HCDR2/HCDR3 с SEQ ID NO: 11, 12, 13, и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую LCDR1/LCDR2/LCDR3 с SEQ ID NO: 14, 15, 16, при этом указанные антитело или фрагмент способны связывать и/или ингибировать вирус гриппа;

(b) второго антитела или антигенсвязывающего фрагмента указанного антитела, содержащего аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую HCDR1/HCDR2/HCDR3 с SEQ ID NO: 21, 22, 23, и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую последовательности CDR-домена LCDR1/LCDR2/LCDR3 с SEQ ID NO: 24, 25, 26, при этом указанные антитело или фрагмент способны связывать и/или ингибировать вирус гриппа; и

(с) третьего антитела или антигенсвязывающего фрагмента указанного антитела, содержащего аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую HCDR1/HCDR2/HCDR3, и аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую последовательности CDR-домена легкой цепи, LCDR1/LCDR2/LCDR3, соответственно, выбранные из

(i) SEQ ID NO: 71, 72, 73 и SEQ ID NO: 74, 75, 76;

(ii) SEQ ID NO: 91, 92, 93 и SEQ ID NO: 94, 95, 96;

(iii) SEQ ID NO: 101, 102, 103 и SEQ ID NO: 104, 105, 106;

(iv) SEQ ID NO: 121, 122, 123 и SEQ ID NO: 124, 125, 126;

(v) SEQ ID NO: 181, 182, 183 и SEQ ID NO: 184, 185, 186;

(vi) SEQ ID NO: 191, 192, 193 и SEQ ID NO: 194, 195, 196;

(vii) SEQ ID NO: 201, 202, 203 и SEQ ID NO: 204, 205, 206;

(viii) SEQ ID NO: 211, 212, 213 и SEQ ID NO: 214, 215, 216;

(ix) SEQ ID NO: 221, 222, 223 и SEQ ID NO: 224, 225, 226;

(x) SEQ ID NO: 231, 232, 233 и SEQ ID NO: 234, 235, 236;

(xi) SEQ ID NO: 241, 242, 243 и SEQ ID NO: 244, 245, 246;

(xii) SEQ ID NO: 261; 262, 263 и SEQ ID NO: 264, 265, 266; или

(xiii) SEQ ID NO: 271, 272, 273 и SEQ ID NO: 274, 275, 276, при этом указанные антитело или фрагмент способны связывать и/или ингибировать вирус гриппа.

41. Способ по п. 40, отличающийся тем, что указанного субъекта классифицируют как имеющего грипп, без необходимости подробного определения штамма вируса.

42. Способ по п. 40, отличающийся тем, что указанного субъекта защищают от гриппа.

43. Способ по п. 40, отличающийся тем, что каждое из указанного первого, второго и третьего антител или фрагментов вводят одновременно или последовательно.