Область техники, к которой относится настоящее изобретение
[0001] Настоящее изобретение относится к производству мутантных вирусных белков в растениях. Более конкретно, настоящее изобретение относится к производству и увеличению продукции подобных вирусу гриппа частиц в растениях.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретения
[0002] Вирусы гриппа представляют собой оболочечные вирусы с одноцепочечной РНК семейства Orthomyxoviridae. Вирусы гриппа очень заразны и могут вызывать легкие или серьезные заболевания во всех возрастных группах.
[0003] Вакцинация остается наиболее эффективным способом предотвращения инфекции гриппа. Как правило, вакцинацию проводят с использованием живых аттенуированных или целых инактивированных форм вируса, которые вызывают иммунный ответ при введении пациенту. Чтобы исключить потенциальный риск того, что живые аттенуированные и целые инактивированные вирусы вновь приобретут способность к репликации и станут заразными, также использовались вакцины, содержащие рекомбинантные вирусные белки, чтобы вызвать защитный иммунитет к инфекции гриппа.
[0004] Однако применение рекомбинантных вирусных белков в качестве иммуногенного компонента вакцин характеризуется рядом ограничений. Во-первых, в отсутствие полного набора вирусных белков и генетических компонентов, необходимых для оптимальной экспрессии и правильного сворачивания белков, выход рекомбинантных вирусных белков в стандартных системах экспрессии in vitro может быть недостаточным для цели производства вакцины. Во-вторых, вакцины с рекомбинантными вирусными белками могут проявлять низкую иммуногенность из-за неправильного сворачивания, плохой презентации антигена и/или генерации преимущественно гуморального иммунного ответа, который неэффективен для обеспечения длительного защитного иммунитета.
[0005] Существует четыре типа вируса гриппа: А, В, С и D, из которых грипп А и В являются возбудителями сезонных эпидемий заболеваний у людей.
[0006] Вирусы гриппа А дополнительно подразделяются на основе экспрессии подтипов гликопротеинов гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA) на поверхности вируса. Существует 18 различных подтипов НА (H1-H18).
[0007] НА представляет собой тримерный лектин, который облегчает связывание частицы вируса гриппа с содержащими сиаловую кислоту белками на поверхности клеток-мишеней и опосредует высвобождение вирусного генома в клетку-мишень. Белки НА содержат два структурных элемента: головку, которая представляет собой основную мишень серопротективных антител, и ножку. НА транслируется как отдельный полипептид НА0 (собранный в виде тримеров), который должен расщепляться сериновой эндопротеазой между субдоменами НА1 (~40 кДа) и НА2 (~20 кДа). После расщепления два домена белка с дисульфидной связью принимают необходимую конформацию, необходимую для вирусной инфекционности. НА1 образует глобулярный головной домен, содержащий рецептор-связывающий сайт (RBS), и RBS представляет собой наименее консервативный сегмент вируса гриппа. НА2 представляет собой однопроходный интегральный мембранный белок со слитым пептидом (FP), растворимым эктодоменом (SE), трансмембранным (ТМ) и цитоплазматическим хвостом (СТ) с соответствующей длиной приблизительно 25, 160, 25 и 10 остатков. НА2 вместе с N- и С-концевыми остатками НА1 образует домен «ножки», который включает в себя трансмембранную область и является относительно консервативным.
[0008] Были исследованы различные мутации в белках вируса гриппа, особенно в НА гриппа.
[0009] Например, Castelán-Vega et al. (Adv Appl Bioinform Chem. 2014; 7:37-44) использовали алгоритм прогнозирования стабильности для сравнения 7479 полноразмерных аминокислотных последовательностей НА из вируса гриппа А (H1N1)pdm09 и идентифицировали, что мутации D104N, А259Т, S124N и Е172К приводили к прогнозируемому повышению стабильности НА гриппа. Напротив, мутации S206T, K285Е и Е47K характеризовались предсказанным дестабилизирующим эффектом на НА.
[0010] При сравнении последовательностей исходного гриппа A (H1N1)pdm [A/California/7/2009] и более позднего штамма гриппа [A/Brisbane/10/2010], Cotter et al. (PLoS Pathog. 2014; 10(1):e1003831) идентифицировали, что мутация E47K в области ножки A/California/07/09 НА стабилизировала структуру тримера, понижала рН для слияния мембран и увеличивала термическую и кислотную стабильность вируса. Cotter et al. дополнительно наблюдали, что НА мутанта Е47K A/California/7/2009 был более заразным для хорьков, чем его аналог дикого типа.
[0011] Antanasijevic et al. (J Biol Chem. 2014;289(32):22237-45) исследовали структурно-функциональные свойства области «петли-на-стебле» НА Н5 посредством сайт-направленного мутагенеза в 14 различных положениях. Мутанты A/Vietnam/1203/04 (H5N1) экспрессировались в клетках НЕК 293Т, и Antanasijevic сообщил, что большинство мутаций в области «петли-на-стебле» не нарушают экспрессию, протеолитический процессинг, сборку вируса или связывание рецептора. Однако Antanasijevic наблюдал, что мутанты HA1-D26K, HA1-M102L, HA2-V52A и HA2-I55A (на основе нумерации Н3) демонстрируют значительно сниженные уровни общего НА, что предполагает снижение экспрессии и/или сборки НА в вирусные частицы. Мутанты НА1-D26K, НА2-Т49А и HA2-M102L также проявляли более низкие титры гемагглютинации по сравнению с вирусом дикого типа. Antanasijevic дополнительно наблюдал, что все одиночные мутанты демонстрируют пониженное проникновение в клетки легких А549, причем наиболее выраженное нарушение проявляется у мутантов HA1-D26K и HA2-I55A. Antanasijevic также продемонстрировал, что мутант HA2-L99A был более чувствителен к ингибированию клеток легких А549 нейтрализующим антителом С179 по сравнению с вирусом дикого типа, предполагая, что мутация усиливает связывание антитела и/или способ нейтрализующего действия. Напротив, мутанты HA1-I28A, НА1-М31А, НА1-M31L, HA2-I45A и HA2-I55V оказались менее чувствительными к ингибированию проникновения нейтрализующим антителом С179.
[0012] В публикации международной заявки WO 2013/177444 и сопутствующей публикации Lu et al. (Proc Natl Acad Sci USA. 2014; 111(1): 125-30) сообщается о способе получения правильно свернутого домена стебля НА из A/California/05/2009 (H1N1) с использованием системы экспрессии бесклеточного белка на основе Escherichia coli и простого протокола рефолдинга. Для индукции тримеризации домена стебля НА либо хлорамфеникол-ацетилтрансферазу (CAT), либо домен сборки сливали с С-концом НА. Для уменьшения вновь выявленной гидрофобности и/или образования пар межмолекулярных ионов, вызывающих агрегацию экспрессированного белка стебля НА, оценивали пять групп мутаций: M1 (I69T + I72E + I74T + С77Т); М2 (I69T + I72E + I74T + С77Т + F164D); М3 (I69T + I72E + I74T + С77Т + F164D + L174D); М4 (F164D) и М5 (F164D + L174D). Lu наблюдал, что мутации М5 (F164D + L174D) оказались наиболее влиятельными мутациями для улучшения растворимости белков стебля НА. Дополнительные делеции (от Н38 до С43 и от С49 до N61) и мутации С77Т были внесены в мутанты М5, чтобы избежать образования нежелательных дисульфидных связей, уменьшить гидрофобность поверхности и pI и избежать областей с неупорядоченной структурой.
[0013] В заявке США №13/838796 и сопутствующей публикации Holtz et al. (ВМС Biotechnology. 2014; 14:111) сообщается о повышенной стабильности и сохранении активности рекомбинантного НА за счет мутации остатков цистеина в карбоксиконцевой области белка НА, включая в себя трансмембранный (ТМ) и цитозольный домен (СТ). В частности, Holtz et al. демонстрируют мутации С539А, С546А, С549А, C524S и С528А в рекомбинантном НА Perth/16/2009 (H3N2). Мутация всех пяти остатков цистеина или различных их подмножеств приводила к выходам, чистоте, размеру частиц, активности гемагглютинации и термостабильности НА, сравнимым с рекомбинантным белком НА дикого типа. Напротив, мутации C64S и C76S приводили к значительному снижению экспрессии НА, что указывает на критическую роль этих остатков в собственном сворачивании НА. Используя анализ простой радиальной иммунодиффузии (SRID), Holtz et al. также показывают, что пять мутаций остатков цистеина улучшают активность рекомбинантного НА по сравнению с белком дикого типа, предотвращая перекрестное связывание дисульфидов в доменах ТМ и СТ. Мутантные белки НА сохраняют активность в течение по меньшей мере 12 месяцев при температуре 25°С, тогда как белок НА дикого типа проявлял активность менее 40% только через 50 дней после очистки.
[0014] В публикации международной заявки WO 2015/020913 сообщается о мутации конкретных остатков в одном или более положениях, выбранных из группы из 403, 406, 411, 422, 429, 432, 433 и 435 вируса гриппа A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1), в тирозин. Эти мутации способствуют образованию дитирозиновых поперечных сшивок, которые стабилизируют или «блокируют» домен ножки НА гриппа в его нативной тримерной конформации.
[0015] В публикации международной заявки WO 2013/079473 раскрыт модифицированный НА гриппа, лишенный глобулярного головного домена. Полипептид, описанный в публикации международной заявки WO 2013/079473, содержит домен НА1, в котором аминокислоты с 53 по 620 (со ссылкой на нумерацию A/Brisbane/59/2007 [H1N1]) удалены и заменены ковалентно связанной последовательностью из 0-10 аминокислот, и домен НА2, где С-концевая аминокислота домена НА1 представляет собой аминокислоту, отличную от аргинина или лизина, и где одна или более аминокислот в положениях 406, 409, 413 и 416 мутированы в аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из серина, треонина, аспарагина, глутамина, аргинина, гистидина, лизина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты и глицина.
[0016] В публикации международной заявки WO 2014/191435 аналогичным образом описан модифицированный НА гриппа, содержащий домен НА1, в котором удаленный сегмент заменен ковалентно связанной последовательностью от 0 до 50 аминокислот, и домен НА2, причем НА устойчив к расщеплению на стыке между НА1 и НА2 и причем одна или более аминокислот в положениях 337, 340, 352, 353, 402, 406, 409, 413 и/или 416 были мутированы.
[0017] Вирусоподобные частицы (VLP) представляют собой потенциальных кандидатов для включения в иммуногенные композиции. VLP очень похожи на зрелые вирионы, но они не содержат вирусного геномного материала. Следовательно, VLP нерепликативны по своей природе, что делает их безопасными для введения в качестве вакцины. Кроме того, VLP могут быть сконструированы для экспрессии вирусных гликопротеинов на поверхности VLP, которая является их наиболее естественной физиологической конфигурацией. Более того, поскольку VLP похожи на интактные вирионы и представляют собой поливалентные структуры в виде частиц, VLP могут быть более эффективными в индукции нейтрализующих антител к гликопротеину, чем антигены растворимых белков оболочки.
[0018] VLP были произведены в растениях (смотрите, например, публикации международных заявок WO 2009/076778; WO 2009/009876; WO 2009/076778; WO 2010/003225; WO 2010/003235; WO 2010/006452; WO 2011/03522; WO 2010/148511 и WO 2014153674, которые включены в настоящий документ посредством ссылки).
[0019] В публикации международной заявки WO 2009/076778 описан способ получения VLP гриппа в растениях, предусматривающий введение нуклеиновой кислоты, содержащей регуляторную область, активную в растении, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей НА гриппа из гриппа типа А или типа В.
[0020] В публикации международной заявки WO 2009/009876 описан способ получения VLP НА гриппа в растениях, при котором НА гриппа самоорганизуется в VLP в клетках растений и почках из мембран растительных клеток.
[0021] В публикации международной заявки WO 2010/003225 раскрыт способ получения VLP НА гриппа в растениях, предусматривающий введение нуклеиновой кислоты, содержащей регуляторную область, активную в растении, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей НА гриппа из A/California/04/09 (H1N1).
[0022] В публикации международной заявки WO 2010/006452 сообщается о получении VLP, содержащих модифицированные белки НА гриппа, причем сайты гликозилирования в положениях 154, 165, 286 или их комбинации (со ссылкой на нумерацию A/Vietnam/1194/04 [H5N1]) были отменены путем мутации остатков в указанных положениях в аминокислоты, отличные от аспарагина. В публикации международной заявки WO 2010/006452 также сообщается, что аминокислоты в положениях 156, 167, 288 или их комбинации могут быть мутированы в остатки, отличные от серина или треонина, чтобы аналогичным образом отменить N-связанную триаду сигнала гликозилирования «N-X-S/Т». Путем избирательного удаления сайтов гликозилирования, расположенных в глобулярной головке белка НА, в публикации международной заявки WO 2010/006452 продемонстрировано, что полученный белок НА характеризуется повышенной антигенностью и более широкой перекрестной реактивностью.
[0023] В публикации международной заявки WO 2011/035422 сообщается о способе получения VLP растительного происхождения, предусматривающем: получение растения или растительного вещества, содержащего VLP, локализованные в апопласте; получение фракции протопласта/сферопласта и фракции апопласта; и выделение фракции апопласта, содержащей VLP растительного происхождения.
[0024] В публикации международной заявки WO 2010/148511 раскрыт способ получения VLP гриппа в растениях, причем VLP содержат химерные белки НА. Химерные белки НА содержат кластер домена стебля, содержащий субдомены F'1, F'2 и F; кластер головного домена, содержащий субдомены RB, Е1 и Е2; и кластер транс мембранного домена, содержащий транс мембранный домен и С-концевой хвостовой домен, причем по меньшей мере один субдомен происходит от первого штамма гриппа, а другие субдомены происходят от одного или более вторых штаммов гриппа.
[0025] В публикации международной заявки WO 2014/153674 сообщается о способе получения VLP вируса гриппа в растении, причем VLP содержат модифицированный НА гриппа, содержащий модифицированную протеолитическую петлю. Модифицированная протеолитическая петля содержит удаление сайта протеолитического расщепления между доменами НА1 и НА2 предшественника НА0. Таким образом, белок НА стабилизируется, и достигаются повышенные выходы белка по сравнению с нативным белком НА.
Сущность настоящего изобретения
[0026] Настоящее изобретение относится к производству модифицированных белков вируса гриппа в растениях. Более конкретно, настоящее изобретение относится к производству и увеличению продукции подобных вирусу гриппа частиц (VLP) в растениях, причем VLP содержат модифицированные вирусные белки гриппа, например, модифицированный белок гемагглютинин (НА).
[0027] Цель настоящего изобретения заключается в создании улучшенного способа увеличения производства VLP вируса гриппа в растениях.
[0028] В соответствии с настоящим изобретением предусмотрено следующее:
[0029] А. Нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую модифицированный белок гемагглютинина (НА) Н3 вируса гриппа, причем белок НА содержит аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей мере одну замену по сравнению с соответствующей аминокислотной последовательностью дикого типа, причем указанная по меньшей мере одна замена представляет собой замену одной или более чем одной аминокислоты, соответствующей аминокислотам в положении 382, 384, 392 или 431 A/Hong Kong/4801/14 НА.
[0030] Белок НА может содержать аминокислотную последовательность с заменой на не аспарагин по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 382 A/Hong Kong/4801/14 НА. Белок НА может содержать аминокислотную последовательность с заменой на аланин или консервативную замену аланина в аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 382 A/Hong Kong/4801/14 НА.
[0031] Белок НА может содержать аминокислотную последовательность с заменой на не лейцин по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 384 A/Hong Kong/4801/14 НА. Белок НА может содержать аминокислотную последовательность с заменой на валин или консервативную замену валина по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 384 A/Hong Kong/4801/14 НА.
[0032] Белок НА может содержать аминокислотную последовательность с заменой на не фенилаланин по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 392 A/Hong Kong/4801/14 НА. Белок НА может содержать аминокислотную последовательность с заменой на аспарагиновую кислоту или консервативную замену аспарагиновой кислоты по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 392 A/Hong Kong/4801/14 НА.
[0033] Белок НА может содержать аминокислотную последовательность с заменой на не лейцин по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 431 A/Hong Kong/4801/14 НА. Белок НА может содержать аминокислотную последовательность с заменой на метионин или консервативную замену метионина по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 431 A/Hong Kong/4801/14 НА.
[0034] Также предусмотрено:
[0035] В. Нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую модифицированный белок гемагглютинин (НА) вируса гриппа Н3, причем белок НА содержит аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей мере одну замену, по сравнению с соответствующей аминокислотной последовательностью дикого типа, причем указанная по меньшей мере одна замена представляет собой замену одной или более чем одной аминокислоты, соответствующей аминокислотам в положениях 382, 384, 392, 431, 524, 525, 526 или 528 A/Hong Kong/4801/14 НА.
[0036] Белок НА может дополнительно содержать аминокислотную последовательность с первой заменой на не аспарагин по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 382 A/Hong Kong/4801/14 НА, второй заменой на не цистеин по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 524 A/Hong Kong/4801/14 НА, и третьей заменой на не цистеин по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 528 A/Hong Kong/4801/14 НА. Белок НА может дополнительно содержать аминокислотную последовательность с первой заменой на аланин или консервативную замену аланина по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 382 A/Hong Kong/4801/14 НА, второй заменой на серин или консервативную замену серина по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 524 A/Hong Kong/4801/14 НА, и третьей заменой на лейцин или консервативную замену лейцина по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 528 из A/Hong Kong/4801/14 НА.
[0037] Белок НА может дополнительно содержать аминокислотную последовательность с первой заменой на не лейцин по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 384 A/Hong Kong/4801/14 НА, второй заменой на не цистеин по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 524 A/Hong Kong/4801/14 НА, и третьей заменой на не цистеин по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 528 A/Hong Kong/4801/14 НА. Белок НА может дополнительно содержать аминокислотную последовательность с первой заменой на валин или консервативную замену валина по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 384 A/Hong Kong/4801/14 НА, второй заменой на серин или консервативную замену серина по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 524 A/Hong Kong/4801/14 НА, и третьей заменой на лейцин или консервативную замену лейцина по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 528 из A/Hong Kong/4801/14 НА.
[0038] Белок НА может дополнительно содержать аминокислотную последовательность с первой заменой на не фенилаланин по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 392 A/Hong Kong/4801/14 НА, второй заменой на не цистеин по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 524 A/Hong Kong/4801/14 НА, и третьей заменой на не цистеин по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 528 A/Hong Kong/4801/14 НА. Белок НА может дополнительно содержать аминокислотную последовательность с первой заменой на аспарагиновую кислоту или консервативную замену аспарагиновой кислоты по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 392 A/Hong Kong/4801/14 НА, второй заменой на серин или консервативную замену серина по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 524 A/Hong Kong/4801/14 НА, и третьей заменой на лейцин или консервативную замену лейцина по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 528 из A/Hong Kong/4801/14 НА.
[0039] Белок НА может дополнительно содержать аминокислотную последовательность с первой заменой на не лейцин по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 431 A/Hong Kong/4801/14 НА, второй заменой на не цистеин по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 524 A/Hong Kong/4801/14 НА, и третьей заменой на не цистеин по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 528 A/Hong Kong/4801/14 НА. Белок НА может дополнительно содержать аминокислотную последовательность с первой заменой на метионин или консервативную замену метионина по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 431 A/Hong Kong/4801/14 НА, второй заменой на серин или консервативную замену серина по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 524 A/Hong Kong/4801/14 НА, и третьей заменой на лейцин или консервативную замену лейцина по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 528 A/Hong Kong/4801/14 НА.
[0040] Белок НА может дополнительно содержать аминокислотную последовательность с первой заменой на не аспарагин по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 382 A/Hong Kong/4801/14 НА, второй заменой на не лейцин по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 384 A/Hong Kong/4801/14 НА, третьей заменой на не цистеин по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 524 A/Hong Kong/4801/14 НА, и четвертой заменой на не цистеин по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 528 A/Hong Kong/4801/14 НА. Белок НА может дополнительно содержать аминокислотную последовательность с первой заменой на аланин или консервативную замену аланина на аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 382 A/Hong Kong/4801/14 НА, второй заменой на валин или консервативную замену валина по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 384 A/Hong Kong/4801/14 НА, третьей заменой на серин или консервативную замену серина по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положение 524 A/Hong Kong/4801/14 НА, и четвертой заменой на лейцин или консервативную замену лейцина по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 528 A/Hong Kong/4801/14 НА.
[0041] Белок НА может дополнительно содержать аминокислотную последовательность с заменой по аминокислотам, соответствующим аминокислотам в положениях 525, 526 или 525 и 526 A/Hong Kong/4801/14 НА, причем замена аминокислоты в положении 525 представляет собой замену на не фенилаланин, а замена аминокислоты в положении 526 представляет собой замену на не лейцин. Белок НА может дополнительно содержать аминокислотную последовательность с заменой по аминокислотам, соответствующим аминокислотам в положениях 525, 526 или 525 и 526 A/Hong Kong/4801/14 НА, причем замена аминокислоты в положении 525 представляет собой замену на лейцин или консервативную замену лейцина, а замена аминокислоты в положении 526 представляет собой замену на валин или консервативную замену валина.
[0042] Дополнительно предоставлен белок НА, кодируемый рекомбинантными нуклеиновыми кислотами, как описано в разделах А или В, и вирусоподобная частица (VLP), содержащая белок НА, кодируемый рекомбинантными нуклеиновыми кислотами, как описано в разделах А или В.
[0043] Таким образом, дополнительно предусмотрен модифицированный белок НА, содержащий аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей мере одну замену по сравнению с соответствующей аминокислотной последовательностью дикого типа, причем указанная по меньшей мере одна замена представляет собой замену по одной или более чем одной аминокислоте, соответствующей аминокислотам в положении 382, 384, 392 или 431 в A/Hong Kong/4801/14 НА.
[0044] Согласно другому аспекту предусмотрен модифицированный белок гемагглютинин (НА) вируса гриппа Н3, причем белок НА содержит аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей мере одну замену, по сравнению с соответствующей аминокислотной последовательностью дикого типа, причем указанная по меньшей мере одна замена представляет собой замену по одной или более чем одной аминокислоте, соответствующей аминокислотам в положениях 382, 384, 392, 431, 524, 525, 526 или 528 A/Hong Kong/4801/14 НА.
[0045] Кроме того, представлен способ получения вирусоподобной частицы (VLP) в растении, части растения или растительной клетке, предусматривающий:
a) введение рекомбинантной нуклеиновой кислоты, как описано в разделе А или В, в растение, часть растения или растительную клетку; а также
b) инкубацию растения, части растения или растительной клетки в условиях, которые допускают экспрессию белка НА, кодируемого рекомбинантной нуклеиновой кислотой, с получением VLP. Способ может дополнительно предусматривать стадию с) сбора растения, части растения или растительной клетки и очистки VLP.
[0046] Кроме того, представлен способ получения подобной вирусу гриппа частицы (VLP) в растении, части растения или растительной клетке, предусматривающий:
a) предоставление растения, части растения или растительной клетки, содержащих рекомбинантную нуклеиновую кислоту, как описано в разделе А или В; а также
b) инкубацию растения, части растения или растительной клетки в условиях, которые допускают экспрессию белка НА, кодируемого рекомбинантной нуклеиновой кислотой, с получением VLP. Способ может дополнительно предусматривать стадию с) сбора растения, части растения или растительной клетки и очистки VLP.
[0047] Кроме того, представлен способ увеличения выхода продукции вирусоподобных частиц (VLP) в растении, части растения или растительной клетке, предусматривающий: а) введение рекомбинантной нуклеиновой кислоты А или В в растение, часть растения или растительную клетку или предоставление растения, части растения или растительной клетки, содержащих рекомбинантную нуклеиновую кислоту А или В; и b) инкубацию растения, части растения или растительной клетки в условиях, которые допускают экспрессию белка НА, кодируемого рекомбинантной нуклеиновой кислотой, тем самым производя VLP с более высоким выходом по сравнению с растением, частью растения или растительной клеткой, экспрессирующей немодифицированный белок НА гриппа. Способ может дополнительно предусматривать стадию с) сбора растения, части растения или растительной клетки и очистки VLP.
[0048] Способы могут дополнительно предусматривать введение второй нуклеиновой кислоты, кодирующей белок протонного канала; причем растение, часть растения или растительную клетку инкубируют в условиях, которые допускают экспрессию белка протонного канала, кодируемого второй нуклеиновой кислотой. Белок протонного канала может представлять собой белок М2 подтипа А.
[0049] Кроме того, предусмотрена VLP, полученная описанным ниже способом.
[0050] VLP может содержать один или более липидов, полученных из растения, части растения или растительной клетки, специфические для растений N-гликаны, модифицированные N-гликаны или их комбинации.
[0051] Кроме того, представлен способ получения антитела или фрагмента антитела, предусматривающий введение описанной VLP субъекту или животному-хозяину, тем самым производя антитело или фрагмент антитела. Также предусмотрены антитела или фрагменты антител, полученные данным способом.
[0052] Кроме того, предусмотрено растение, часть растения или растительная клетка, содержащие рекомбинантную нуклеиновую кислоту А или В или белок НА, кодируемый рекомбинантной нуклеиновой кислотой А или В. Белок НА может образовывать VLP. Соответственно, также предусмотрено растение, часть растения или растительная клетка, содержащая VLP, содержащую белок НА, кодируемый рекомбинантной нуклеиновой кислотой А или В.
[0053] Кроме того, предусмотрена композиция для индукции иммунного ответа, содержащая эффективную дозу VLP, как описано в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель, адъювант, наполнитель или вспомогательное вещество. Также представлен способ индукции иммунитета к инфекции гриппа у субъекта, предусматривающий введение описанной VLP. VLP можно вводить субъекту перорально, интраназально, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно или подкожно.
[0054] Кроме того, предусмотрен модифицированный белок гемагглютинина (НА) гриппа, содержащий аминокислотную последовательность, характеризующуюся идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим от приблизительно 30% до приблизительно 100% по отношению к последовательности, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 98, при условии, что белок НА гриппа содержит по меньшей мере одну замену, как описано в настоящем документе, и способен образовывать VLP, индуцирует иммунный ответ при введении субъекту, индуцирует гемагглютинацию или их комбинацию.
[0055] Это краткое раскрытие настоящего изобретения не обязательно описывает все особенности настоящего изобретения.
Краткое описание графических материалов
[0056] Эти и другие особенности настоящего изобретения станут более очевидными из следующего описания, в котором сделана ссылка на прилагаемые графические материалы, где:
[0057] На фиг. 1 показано выравнивание аминокислотных последовательностей гемагглютинина (НА) A/Bangkok/3007/15 (H3N2) (SEQ ID NO: 91); A/Hongkong/4801/14 (H3N2) (SEQ ID NO: 92); A/Minnesota/40/15 (H3N2) (SEQ ID NO: 93); A/South Australia/1/16 (H3N2) (SEQ ID NO: 94); A/Pennsylvania/09/15 (H3N2) (SEQ ID NO: 95); A/Switzerland/9715293/13 (H3N2) (SEQ ID NO: 96); A/Mississippi/16/16 (H3N2) (SEQ ID NO: 97); выделенные остатки совпадают с аминокислотами N382, L384, F392, L431 НА из штаммов гриппа Н3 (H3N2), например, A/Hongkong/4801/14 (H3N2) (SEQ ID NO: 92).
[0058] На фиг. 2 показаны титры гемагглютинации A/Switzerland/9715293/13 Н3 дикого типа, мутанта N382A A/Switzerland/9715293/13 НЗ, мутанта L384V A/Switzerland/9715293/13 НЗ, мутанта F392D A/Switzerland/9715293/13 Н3 и мутанта L431M A/Switzerland/9715293/13 Н3.
[0059] На фиг. 3 показаны титры гемагглютинации A/Indonesia/5/2005 Н5 дикого типа, A/Egypt/N04915/2014 Н5 дикого типа, мутанта F393D A/Indonesia/5/2005 Н5, мутанта F393D A/Egypt/N04915/2014 Н5, мутанта N383 A A/Indonesia/5/2005 Н5 и мутанта N383 A A/Egypt/N04915/2014 Н5. Нумерация в соответствии с A/Indonesia/5/2005.
[0060] На фиг. 4А показано схематическое представление вектора 3045 (Н3 A-Swi-9715293-13 (F392D)). На фиг. 4В показано схематическое представление вектора 3022 (Н3 A-Swi-9715293-13 (L431M)). На фиг. 4С показано схематическое представление вектора 3023 (Н3 A-Swi-9715293-13 (N382A)). На фиг. 4D показано схематическое представление вектора 3034 (Н3 A-Swi-9715293-13 (L384V)).
[0061] На фиг. 5А показано схематическое представление вектора 3556 (вектор для клонирования In-Fusion в кассету экспрессии на основе CPMV 160 в дополнение к вспомогательному белку М2 под контролем промотора и терминатора пластоцианина люцерны). На фиг. 5В показано схематическое представление вектора 1190 (вектор для клонирования In-Fusion в кассету экспрессии на основе CPMV 160).
[0062] На фиг. 6А показаны титры гемагглютинации A/Switzerland/9715293/13 Н3 дикого типа и мутанта CysTM A/Switzerland/9715293/13 Н3.
[0063] На фиг. 6В показаны титры гемагглютинации A/Pennsylvania/09/2015 Н3 дикого типа и мутанта CysTM A/Pennsylvania/09/2015 Н3.
[0064] На фиг. 7А показаны титры гемагглютинации A/Switzerland/9715293/13 Н3 дикого типа, мутанта N382A A/Switzerland/9715293/13 Н3, мутанта L384V A/Switzerland/9715293/13 НЗ, мутанта F392D A/Switzerland/9715293/13 Н3, мутанта L431M A/Switzerland/9715293/13 НЗ, A/Switzerland/9715293/13 Н3 с модификацией CysTM, мутанта N382A + CysTM A/Switzerland/9715293/13 Н3, мутанта L384V + CysTM A/Switzerland/9715293/13 Н3, мутанта F392D + CysTM A/Switzerland/9715293/13 Н3 и мутанта L431M + CysTM A/Switzerland/9715293/13 Н3. На фиг. 7В показаны выходы VLP после градиента плотности мутанта CysTM A/Switzerland/9715293/13 Н3, мутанта N382A + CysTM A/Switzerland/9715293/13 Н3, мутанта L384V + CysTM A/Switzerland/9715293/13 Н3, мутанта F392D + CysTM A/Switzerland/9715293/13 Н3 и мутанта L431M + CysTM A/Switzerland/9715293/13 Н3, выраженные в процентах по отношению к мутанту CysTM A/Switzerland/9715293/13 Н3. На фиг. 7С показаны титры гемагглютинации A/Pennsylvania/09/2015 Н3 дикого типа, мутанта CysTM A/Pennsylvania/09/2015 Н3, мутанта N382A + CysTM A/Pennsylvania/09/2015 Н3 и мутанта L384V + CysTM A/Pennsylvania/09/2015 Н3. На фиг. 7D показаны титры гемагглютинации мутанта CysTM A/S. Australia/1/16 Н3 и мутанта N382A + L384V + CysTM A/S. Australia/1/16 Н3. На фиг. 7Е показаны титры гемагглютинации мутанта CysTM A/Hong Kong/4801/14 Н3 и мутанта N382A + L384V + CysTM A/Hong Kong/4801/14 Н3; мутанта CysTM A/Minnesota/40/15 Н3 и мутанта N382A + L384V + CysTM A/Minnesota/40/15 Н3; мутанта CysTM A/S. Australia/1/16 Н3 и мутанта N382A + L384V + CysTM A/S. Australia/1/16 Н3; мутанта CysTM A/Bangkok/3007/15 Н3 и мутанта N382A + L384V + CysTM A/Bangkok/3007/15 Н3; мутанта CysTM A/Switzerland/9715293/13 Н3 и мутанта L384V + CysTM A/Switzerland/9715293/13 Н3; мутанта CysTM A/Mississippi/16/16 Н3 и мутанта N382A + L384V + CysTM A/Mississippi/16/16 Н3.
[0065] На фиг. 8А показано схематическое представление вектора 3340 (Н3 А-НК-4801-14). На фиг. 8В показано схематическое представление вектора 3341 (Н3 А-НК-4801-14). На фиг. 8С показано схематическое представление вектора 3375 (Н3 А-НК-4801-14 (N382A+L384V)). На фиг.8D показано схематическое представление вектора 3914 (Н3 A-Minn-40-15). На фиг. 8Е показано схематическое представление вектора 3915 (Н3 A-Minn-40-15 (N382A + L384V)). На фиг. 8F показано схематическое представление вектора 3924 (Н3 A-SAus-1-16). На фиг. 8G показано схематическое представление вектора 3925 (Н3 A-SAus-1-16 (N382A + L384V)). На фиг. 8Н показано схематическое представление вектора 3904 (Н3 A-Bang-3007-15). На фиг. 8I показано схематическое представление вектора 3905 (Н3 A-Bang-3007-15 (N382A + L384V)). На фиг. 8J показано схематическое представление вектора 2801 (Н3 A-Swi-9715293-13). На фиг. 8K показано схематическое представление вектора 2811 (Н3 A-Swi-9715293-13). На фиг. 8L показано схематическое представление вектора 3063 (Н3 A-Swi-9715293-13 (N382A)). На фиг. 8М показано схематическое представление вектора 3074 (Н3 A-Swi-9715293-13 (L384V)). На фиг. 8N показано схематическое представление вектора 3085 (Н3 A-Swi-9715293-13 (F392D)). На фиг. 80 показано схематическое представление вектора 3062 (Н3 A-Swi-9715293-13 (L431M)). На фиг. 8Р показано схематическое представление вектора 3312 (Н3 А-Penn-09-15). На фиг. 8Q показано схематическое представление вектора 3313 (Н3 А-Penn-09-15). На фиг. 8R показано схематическое представление вектора 3314 (Н3 А-Penn-09-15 (N382A)). На фиг. 8S показано схематическое представление вектора 3315 (Н3 A-Penn-09-15 (L384V)).
[0066] На фиг. 9А показано схематическое представление вектора 2295 (Н5 A-Indo-5-05). На фиг. 9В показано схематическое представление вектора 3680 (Н5 A-Indo-5-05 (F393D)). На фиг. 9С показано схематическое представление вектора 3645 (Н5 A-Egypt-N04915-14). На фиг. 9D показано схематическое представление вектора 3690 (Н5 A-Egypt-N04915-14 (F392D)).
Подробное описание настоящего изобретения
[0067] Следующее описание относится к предпочтительному варианту осуществления.
[0068] Используемые в настоящем документе термины «содержащий», «имеющий», «включающий в себя», «состоящий» и их грамматические вариации являются включающими или открытыми и не исключают дополнительные, непроцитированные элементы и/или стадии способа. Термин «состоящий по существу из», когда он используется в настоящем документе в связи с продуктом, применением или способом, означает, что могут присутствовать дополнительные элементы и/или стадии способа, но эти добавления не оказывают существенного влияния на способ, посредством которого функционирует изложенный способ или применения. Термин «состоящий из», когда он используется в настоящем документе в связи с продуктом, применением или способом, исключает присутствие дополнительных элементов и/или стадий способа. Продукт, применение или способ, описанные в настоящем документе как содержащие определенные элементы и/или стадии, могут также, согласно определенным вариантам осуществления, состоять по существу из этих элементов и/или стадий, а согласно другим вариантам осуществления состоять из этих элементов и/или стадий, независимо от того, упомянуты ли конкретные варианты осуществления. Кроме того, использование единственного числа включает в себя множественное число, а «или» означает «и/или», если не указано иное. Если в настоящем документе не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, характеризуются тем же значением, которое обычно понимается специалистом в настоящей области техники. Используемый в настоящем документе термин «приблизительно» относится к отклонению приблизительно на +/- 10% от заданного значения. Следует понимать, что такое изменение всегда включается в любое данное значение, предоставленное в настоящем документе, независимо от того, упоминается ли оно конкретно или нет. Использование единственного числа при использовании в настоящем документе вместе с термином «содержащий» может означать «один», но это также согласуется со значением «один или более», «по меньшей мере один» и «один или более чем один».
[0069] Термин «растение», «часть растения», «растительная часть», «растительное вещество», «растительная биомасса», «растительный материал», растительный экстракт» или «листья растения», как они используются в настоящем документе, может включать в себя все растение, ткань, клетки или любую их фракцию, внутриклеточные компоненты растений, внеклеточные компоненты растений, жидкие или твердые экстракты растений или их комбинацию, которые способны обеспечивать транскрипционный, трансляционный и посттрансляционный аппарат для экспрессии одной или более нуклеиновых кислот, описанных в настоящем документе, и/или из которых можно экстрагировать и очищать экспрессируемый белок или VLP. Растения могут включать в себя, без ограничения, травянистые растения. Кроме того, растения могут включать в себя, без ограничения, сельскохозяйственные культуры, включая в себя, например, канолу, виды Brassica, кукурузу, виды Nicotiana, (табак), например, Nicotiana benthamiana, Nicotiana rustica, Nicotiana, tabacum, Nicotiana alata, Arabidopsis thaliana, люцерну, картофель, сладкий картофель (Ipomoea batatus), женьшень, горох, овес, рис, сою, пшеницу, ячмень, подсолнечник, хлопок, кукурузу, рожь (Secale cereale), сорго (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), сафлор (Carthamus tinctorius).
[0070] Используемый в настоящем документе термин «часть растения» относится к любой части растения, включая в себя, без ограничения, листья, стебель, корень, цветы, плоды, растительную клетку, полученную из листьев, стебля, корня, цветов, плодов, растительный экстракт, полученный из листьев, стебля, корня, цветов, плодов, или их комбинации. Используемый в настоящем документе термин «растительный экстракт» относится к продукту растительного происхождения, который получают после обработки растения, части растения, растительной клетки или их комбинации физически (например, замораживанием с последующей экстракцией в подходящем буфере), механически (например, путем измельчения или гомогенизации растения или части растения с последующей экстракцией в подходящем буфере), ферментативно (например, с использованием ферментов, разрушающих клеточную стенку), химически (например, с использованием одного или более хелаторов или буферов) или их комбинации. Растительный экстракт можно дополнительно обработать для удаления нежелательных растительных компонентов, например, остатков клеточной стенки. Растительный экстракт может быть получен для помощи в извлечении одного или более компонентов из растения, части растения или растительной клетки, например, белка (включая в себя белковые комплексы, белковые поверхностные структуры и/или VLP), нуклеиновой кислоты, липида, углевода или их комбинации из растения, части растения или растительной клетки. Если растительный экстракт содержит белки, он может называться белковым экстрактом. Белковый экстракт может представлять собой неочищенный растительный экстракт, частично очищенный растительный или белковый экстракт или очищенный продукт, который содержит один или более белков, белковых комплексов, белковых супраструктур и/или VLP из растительной ткани. При желании белковый экстракт или растительный экстракт можно частично очистить с использованием технологий, известных специалистам в настоящей области техники, например, экстракт можно подвергнуть осаждению солью или рН, центрифугированию, центрифугированию в градиенте плотности, фильтрации, хроматографии, например, эксклюзионной хроматографии, ионообменной хроматографии, аффинной хроматографии или их комбинации. Белковый экстракт также можно очистить с использованием технологий, известных специалисту в настоящей области техники.
[0071] Используемый в настоящем документе термин «конструкция», «вектор» или «вектор экспрессии» относится к рекомбинантной нуклеиновой кислоте для переноса последовательностей экзогенных нуклеиновых кислот в клетки-хозяева (например, клетки растений) и направления экспрессии последовательности экзогенной нуклеиновой кислоты в клетках-хозяевах. «Кассета экспрессии» относится к нуклеотидной последовательности, содержащей представляющую интерес нуклеиновую кислоту, находящуюся под контролем и функционально (или оперативно) связанную с подходящим промотором или другими регуляторными элементами для транскрипции представляющей интерес нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине. Как будет понятно специалисту в настоящей области техники, кассета экспрессии может содержать последовательность терминации (терминатор), которая представляет собой любую последовательность, которая активна для растения-хозяина. Например, последовательность терминации может происходить из сегмента генома РНК-2 двудольного РНК вируса, например, комовируса, последовательность терминации может представлять собой терминатор NOS, или последовательность терминатора может быть получена из 3'UTR гена пластоцианина люцерны.
[0072] Конструкции по настоящему раскрытию могут дополнительно содержать 3'-нетранслируемую область (UTR). 3'-нетранслируемая область содержит сигнал полиаденилирования и любые другие регуляторные сигналы, способные влиять на процессинг мРНК или экспрессию гена. Сигнал полиаденилирования, как правило, характеризуется добавлением треков полиадениловой кислоты к 3'-концу предшественника мРНК. Сигналы полиаденилирования, как правило, распознаются по наличию гомологии с канонической формой 5' ААТААА-3', хотя вариации не являются редкостью. Неограничивающими примерами подходящих 3'-областей являются 3' транскрибируемые нетранслируемые области, содержащие сигнал полиаденилирования индуцирующих опухоль плазмидных генов (Ti) Agrobacterium, таких как нопалинсинтаза (ген Nos), и генов растений, таких как гены запасного белка сои, ген рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы малой субъединицы (ssRUBISCO; US 4962028; который включен в настоящий документ посредством ссылки), промотора, используемого для регуляции экспрессии пластоцианина.
[0073] Под «регуляторной областью», «регуляторным элементом» или «промотором» подразумевается часть нуклеиновой кислоты, как правило, но не всегда, перед кодирующей белок областью гена, которая может состоять из ДНК или РНК, или как ДНК, так и РНК. Когда регуляторная область активна и функционально связана или оперативно связана с представляющей интерес нуклеотидной последовательностью, это может привести к экспрессии представляющей интерес нуклеотидной последовательности. Регуляторный элемент может быть способен опосредовать специфичность органа или контролировать активацию генов в процессе развития или во времени. «Регуляторная область» включает в себя элементы промотора, основные элементы промотора, проявляющие базальную промоторную активность, элементы, которые индуцируются в ответ на внешний стимул, элементы, которые опосредуют активность промотора, такие как негативные регуляторные элементы или усилители транскрипции. Используемая в настоящем документе «регуляторная область» также включает в себя элементы, которые активны после транскрипции, например, регуляторные элементы, которые модулируют экспрессию генов, такие как энхансеры трансляции и транскрипции, репрессоры трансляции и транскрипции, активирующие последовательности выше против хода транскрипции и детерминанты нестабильности мРНК. Некоторые из этих последних элементов могут быть расположены вблизи кодирующей области.
[0074] В контексте настоящего раскрытия термин «регуляторный элемент» или «регуляторная область», как правило, относится к последовательности ДНК, как правило, но не всегда, выше против хода транскрипции (5') от кодирующей последовательности структурного гена, который контролирует экспрессию кодирующей области, обеспечивая распознавание для РНК-полимеразы и/или других факторов, необходимых для начала транскрипции в конкретном сайте. Однако следует понимать, что другие нуклеотидные последовательности, расположенные внутри интронов, или 3' последовательности также могут вносить вклад в регуляцию экспрессии представляющей интерес кодирующей области. Примером регуляторного элемента, который обеспечивает распознавание для РНК-полимеразы или других факторов транскрипции для обеспечения инициации в конкретном сайте, является элемент промотора. Большинство, но не все эукариотические промоторные элементы содержат ТАТА-бокс, консервативную последовательность нуклеиновой кислоты, состоящую из аденозиновых и тимидиновых пар нуклеотидных оснований, как правило, расположенных приблизительно на 25 пар оснований выше против хода транскрипции от сайта начала транскрипции. Промоторный элемент может содержать базальный промоторный элемент, ответственный за инициацию транскрипции, а также другие регуляторные элементы, которые изменяют экспрессию гена.
[0075] Существует несколько типов регуляторных областей, включая в себя те, которые регулируются в процессе развития, индуцибельные или конститутивные. Регуляторная область, которая регулируется в процессе развития или контролирует дифференциальную экспрессию гена, находящегося под его контролем, активируется в определенных органах или тканях органа в определенные моменты времени во время развития этого органа или ткани. Однако некоторые регуляторные области, которые регулируются в процессе развития, могут предпочтительно быть активными в определенных органах или тканях на определенных стадиях развития, они также могут быть активными в рамках регулируемого в процессе развития способа или на базальном уровне в других органах или тканях растения. Примеры тканеспецифических регуляторных областей, например, специфических регуляторных областей, включают в себя промотор напина и промотор круциферина (Rask et al., 1998, J. Plant Physiol. 152: 595-599; Bilodeau et al., 1994, Plant Cell 14: 125-130). Пример специфического для листа промотора включает в себя промотор пластоцианина (смотрите патент США 7125978, который включен в настоящий документ посредством ссылки).
[0076] Индуцибельная регуляторная область представляет собой область, которая способна прямо или косвенно активировать транскрипцию одной или более последовательностей ДНК или генов в ответ на индуктор. В отсутствие индуктора последовательности ДНК или гены не будут транскрибироваться. Как правило, белковый фактор, который специфически связывается с индуцибельной регуляторной областью для активации транскрипции, может присутствовать в неактивной форме, которая затем прямо или косвенно превращается в активную форму посредством индуктора. Однако белковый фактор также может отсутствовать. Индуктор может представлять собой химическое средство, такое как белок, метаболит, регулятор роста, гербицид или фенольное соединение, или физиологический стресс, вызываемый непосредственно теплом, холодом, солью или токсическими элементами, или опосредованно через действие патогена или агента заболевания, такого как вирус. Растительная клетка, содержащая индуцибельную регуляторную область, может подвергаться действию индуктора путем внешнего воздействия индуктора на клетку или растение, например, путем опрыскивания, полива, нагревания или аналогичных способов. Индуцибельные регуляторные элементы могут происходить как из растительных, так и не растительных генов (например, Gatz, С. and Lenk, I.R.P., 1998, Trends Plant Sci. 3, 352-358). Примеры потенциальных индуцибельных промоторов включают в себя, без ограничения, индуцируемый тетрациклином промотор (Gatz, С., 1997, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 89-108), индуцируемый стероидом промотор (Aoyama, Т. and Chua, N.H., 1997, Plant J. 2, 397-404) и индуцируемый этанолом промотор (Salter, M.G., et al, 1998, Plant Journal 16, 127-132; Caddick, M.X., et al., 1998, Nature Biotech. 16, 177-180), индуцируемые цитокинином гены IB6 и CKI1 (Brandstatter, I. and Kieber, J.J., 1998, Plant Cell 10, 1009-1019; Kakimoto, Т., 1996, Science 274, 982-985) и индуцируемый ауксином элемент DR5 (Ulmasov, Т., et al., 1997, Plant Cell 9, 1963-1971).
[0077] Конститутивная регуляторная область направляет экспрессию гена в различных частях растения и непрерывно на протяжении всего развития растения. Примеры известных конститутивных регуляторных элементов включают в себя промоторы, связанные с транскриптом 35S CaMV (p35S; Odell et al., 1985, Nature, 313: 810-812; который включен в настоящий документ посредством ссылки), актин 1 риса (Zhang et al., 1991, Plant Cell, 3: 1155-1165), актин 2 (An et al., 1996, Plant J., 10: 107-121) или tms 2 (US 5428147), и гены триозофосфат-изомеразы 1 (Xu et. Al., 1994, Plant Physiol. 106: 459-467), ген убиквитина 1 кукурузы (Cornejo et al, 1993, Plant Mol. Biol. 29: 637-646), гены убиквитина 1 и 6 Arabidopsis (Holtorf et al., 1995, Plant Mol. Biol. 29: 637-646), ген фактора инициации трансляции табака 4А (Mandel et al., 1995 Plant Mol. Biol. 29: 995-1004), промотор вируса мозаики прожилок виноградного листа, pCAS (Verdaguer et al., 1996); промотор малой субъединицы рибулозобифосфаткарбоксилазы, pRbcS: (Outchkourov et al., 2003), pUbi (для однодольных и двудольных).
[0078] Используемый в настоящем документе термин «конститутивный» не обязательно означает, что нуклеотидная последовательность, находящаяся под контролем конститутивной регуляторной области, экспрессируется на одном уровне во всех типах клеток, но что последовательность экспрессируется в широком диапазоне типов клеток, хотя часто наблюдается колебание численности.
[0079] Конструкции экспрессии, как описано выше, могут присутствовать в векторе. Вектор может содержать граничные последовательности, которые позволяют переносить и интегрировать кассету экспрессии в геном организма или хозяина. Конструкция может представлять собой растительный бинарный вектор, например, бинарный вектор трансформации на основе pPZP (Hajdukiewicz, et al., 1994). Другие иллюстративные конструкции включают в себя pBin19 (смотрите Frisch, D.A., L.W. Harris-Haller, et al., 1995, Plant Molecular Biology 27: 405-409).
[0080] Используемый в настоящем документе термин «нативный», «нативный белок» или «нативный домен» относится к белку или домену, имеющему первичную аминокислотную последовательность, идентичную дикому типу. Нативные белки или домены могут кодироваться нуклеотидными последовательностями, характеризующимися 100% сходством последовательности с последовательностью дикого типа. Нативная аминокислотная последовательность также может кодироваться нуклеотидной последовательностью, оптимизированной для кодонов человека (hCod), или нуклеотидной последовательностью, содержащей повышенное содержание GC по сравнению с нуклеотидной последовательностью дикого типа при условии, что аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью hCod, проявляет 100% идентичность последовательности по отношению к природной аминокислотной последовательности.
[0081] Под нуклеотидной последовательностью, которая является «оптимизированной кодонами человека» или нуклеотидной последовательностью «hCod», подразумевается выбор подходящих нуклеотидов ДНК для синтеза олигонуклеотидной последовательности или ее фрагмента, который приближается к частоте использования кодонов, как правило, встречающемуся в олигонуклеотидной последовательности нуклеотидной последовательности человека. Под «повышенным содержанием GC» подразумевается выбор соответствующих нуклеотидов ДНК для синтеза олигонуклеотидной последовательности или ее фрагмента, чтобы приблизиться к частоте использования кодона, которое по сравнению с соответствующей природной олигонуклеотидной последовательностью характеризуется увеличением содержания GC в отношении, например, от приблизительно 1 до приблизительно 30% или любого числа между ними, длины кодирующей части олигонуклеотидной последовательности. Например, приблизительно от 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30% или любого числа между ними по длине участка кодирования олигонуклеотидной последовательности. Как описано ниже, нуклеотидная последовательность с оптимизированным кодоном человека или нуклеотидная последовательность, содержащая увеличенный контакт GC (по сравнению с нуклеотидной последовательностью дикого типа), демонстрирует повышенную экспрессию в растении, части растения или растительной клетке по сравнению с экспрессией отличной от человеческой оптимизированной (или с более низким содержанием GC) нуклеотидной последовательности.
[0082] Модифицированные белки гемагглютинина (НА) гриппа (также называемые модифицированным белком НА, модифицированным белком НА гриппа, модифицированным НА, модифицированным НА гриппа, мутантным НА, мутантным НА гриппа, вариантами НА гриппа или вариантами НА) и способы получения модифицированных белков НА гриппа в растениях описаны в настоящем документе. Описанные в настоящем документе модифицированные белки НА гриппа содержат модификации или мутации, которые, как было обнаружено, приводят к улучшенным характеристикам НА по сравнению с НА дикого типа или немодифицированными белками НА. Например, модифицированный белок НА гриппа может содержать аминокислотную последовательность по меньшей мере с одной заменой аминокислоты по сравнению с соответствующей аминокислотной последовательностью дикого типа.
[0083] Примеры улучшенных характеристик модифицированного белка НА включают в себя повышенный выход белка НА при экспрессии в растительных клетках по сравнению с НА дикого типа или немодифицированным НА того же штамма или подтипа гриппа, который не содержит модификацию(и) или мутацию(и); улучшенный титр гемагглютинации модифицированного белка НА по сравнению с белком НА дикого типа или немодифицированным белком НА; улучшенную целостность, стабильность или как целостность, так и стабильность вирусоподобных частиц (VLP), которые состоят из модифицированных белков НА, по сравнению с целостностью, стабильностью или и тем и другим VLP, содержащими НА дикого типа, которые не содержат модификацию(и) или мутацию(и); повышенный выход VLP при экспрессии в растительных клетках по сравнению с уровнем продукции VLP дикого типа, который не содержит модификацию(и) или мутацию(и); и их комбинация.
Подтипы и штаммы гриппа
[0084] Используемый в настоящем документе термин «подтип вируса гриппа» относится к вариантам вируса гриппа А, которые характеризуются различными комбинациями вирусных поверхностных белков гемагглютинина (Н или НА) и нейрамидазы (N). В соответствии с настоящим описанием подтипы вируса гриппа и гемагглютинин (НА) из таких подтипов вируса могут упоминаться по их номеру Н, например, «НА подтипа Н3», «НА Н3» или «грипп Н3». Термин «подтип», в частности, включает в себя все индивидуальные «штаммы» внутри каждого подтипа, которые обычно возникают в результате мутаций и могут проявлять различные патогенные профили. Такие штаммы можно также называть различными «изолятами» вирусного подтипа. Соответственно, в контексте настоящего описания термины «штаммы» и «изоляты» могут использоваться взаимозаменяемо.
[0085] Традиционно различные штаммы гриппа классифицируются на основании, например, способности гриппа агглютинировать красные клетки крови (RBC или эритроциты). Антитела, специфические для определенных штаммов гриппа, могут связываться с вирусом и, таким образом, предотвращать такую агглютинацию. Анализы, определяющие типы штаммов на основе такого ингибирования, как правило, известны как анализы ингибирования гемагглютинина (анализы HI или анализы HAI), и они представляют собой стандартные и хорошо известные способы для характеристики штаммов гриппа.
[0086] Однако белки НА из разных штаммов вирусов также демонстрируют значительное сходство последовательностей как на уровне нуклеиновой кислоты, так и на уровне аминокислот. Этот уровень сходства варьируется при сравнении штаммов разных подтипов, причем некоторые штаммы явно демонстрируют более высокие уровни сходства, чем другие (Air, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, 78:7643). Уровни аминокислотного сходства варьируются между вирусными штаммами одного подтипа и вирусными штаммами других подтипов (Air, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, 78:7643). Этой вариации достаточно для установления дискретных подтипов и эволюционного происхождения различных штаммов, но ДНК и аминокислотные последовательности разных штаммов все еще легко выравниваются с использованием обычных способов биоинформатики (Air, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, 78:7643; Suzuki and Nei, Mol. Biol. Evol. 2002, 19:501).
[0087] Множественные нуклеотидные последовательности или соответствующие полипептидные последовательности гемагглютинина (НА) могут быть выровнены для определения «консенсуса» или «консенсусной последовательности» подтипа (смотрите фиг. 1).
[0088] Основываясь на сходстве последовательностей, подтипы вируса гриппа могут быть дополнительно классифицированы по их филогенетической группе. Филогенетический анализ (Fouchier et al., J Virol. 2005 Mar; 79(5):2814-22) продемонстрировал подразделение НА, которое представляет собой деление на две основные группы (Air, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, 78:7643): среди прочего, подтипы H1, H2, H5 и Н9 в филогенетической группе 1 и, среди прочего, подтипы Н3, Н4 и Н7 в филогенетической группе 2.
[0089] Новые белки НА гриппа, модификации НА, варианты и мутанты белка НА создаются путем внесения изменений в аминокислотную последовательность белка НА, что приводит к улучшенным характеристикам НА, как описано выше. Выделение нуклеиновых кислот, кодирующих такие молекулы НА, является обычным делом, как и модификация нуклеиновой кислоты для внесения изменений в аминокислотную последовательность, например, посредством сайт-направленного мутагенеза.
[0090] В настоящем документе описаны модифицированные белки НА гриппа и способы получения модифицированных белков НА гриппа в растениях. Было замечено, что модификация, например, путем замены определенных аминокислот в белках НА, например, НА из подтипа Н3, приводит к улучшенным характеристикам модифицированного белка НА по сравнению с белком НА дикого типа или немодифицированным белком НА.
[0091] Одна или более модификаций, мутаций или замен белка НА, как описано в настоящем документе, не расположены в глобулярном головном домене белка НА, не расположены в известных эпитопных областях белка НА, и эти модификации, мутации или замены не добавляют или не удаляют сайты гликозилирования в белке НА.
[0092] Белок НА, мутантный белок НА или модифицированный белок НА, как описано в настоящем документе, модифицирован и содержит одну или более мутаций, модификаций или замен в своей аминокислотной последовательности в любой одной или более аминокислотах, которые соответствуют одной или более чем одной мутации или модификации по любой одной или более аминокислотам, которые соответствуют положениям 382, 384, 392, 431, 524, 525, 526, 527 или 528 аминокислотной последовательности A/Hong Kong/4801/14 (SEQ ID NO: 92; смотрите фиг. 1).
[0093] Под «соответствовать аминокислоте» или «соответствующей аминокислоте» подразумевается, что аминокислота соответствует аминокислоте в выравнивании последовательности с эталонным штаммом гриппа, как описано ниже.
[0094] Номер аминокислотного остатка или положение остатка НА соответствует нумерации НА эталонного штамма гриппа. Например, в случае гриппа Н3 эталонным штаммом может быть A/Hong Kong/4801/14 [SEQ ID NO: 92 смотрите фиг. 1]. Соответствующие аминокислотные положения могут быть определены путем выравнивания последовательностей НА (например, Н3 НА) с последовательностью НА их соответствующего эталонного штамма. Способы выравнивания последовательностей для сравнения хорошо известны в настоящей области техники. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно проводить, например, с помощью алгоритма локальной гомологии Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), с помощью алгоритма выравнивания гомологии Needleman & Wunsch a, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), способом поиска сходства Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), с помощью компьютеризированных реализаций этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в пакете программного обеспечения Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) или путем ручного выравнивания и визуальной проверки (смотрите, например, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995, приложение)). Выравнивание аминокислотных последовательностей нескольких доменов НА вируса гриппа А, которые не следует рассматривать как ограничивающие, показано на фиг.1.
[0095] При упоминании модификаций, мутантов или вариантов за аминокислотным остатком дикого типа (также называемым просто «аминокислотой») следует номер остатка и новая или замещенная аминокислота. Например, замена аспарагина (N, Asn) на аланин (A, Ala) в остатке или аминокислоте в положении 382 обозначается как N382A (смотрите таблицу 1). 382 (N382A).
[0096] Модифицированные НА, мутанты или варианты НА, например, модифицированные Н3 НА, обозначаются таким же образом с использованием однобуквенного аминокислотного кода для остатка дикого типа, за которым следует его положение и однобуквенный аминокислотный код остатка замены. Множественные мутанты обозначены компонентными одиночными мутантами, разделенными косой чертой (/) или плюсом (+). Мутации или модификации транс мембранного (ТМ) домена или области обозначены как (CysTM). Так, например, мутант Н3 НА N382A + L384V (CysTM) представляет собой мутант, в котором аланин (A, Ala) замещает аспарагин (N, Asp) в положении остатка 382, а валин (V, Val) замещает лейцин (L, Leu) в положении остатка 384, а мутант Н3 НА содержит дополнительные мутации в трансмембранном домене.
[0098] Модифицированный белок гемагглютинин (НА) гриппа может содержать аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей мере одну аминокислотную замену по сравнению с соответствующей аминокислотной последовательностью дикого типа.
[0099] Под «аминокислотной заменой» или «заменой» подразумевается замена аминокислоты в аминокислотной последовательности белка другой аминокислотой. Термины «аминокислота», «аминокислотный остаток» или «остаток» используются в настоящем раскрытии как взаимозаменяемые. Одна или более аминокислот могут быть замещены одной или более аминокислотами, которые отличаются от исходной аминокислоты или аминокислоты дикого типа в этом положении, без изменения общей длины аминокислотной последовательности белка. Замена или замещение могут быть экспериментально индуцированы изменением последовательности кодона в нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, на последовательность кодона другой аминокислоты по сравнению с исходной аминокислотой или аминокислотой дикого типа. Полученный белок представляет собой модифицированный белок, например, модифицированный белок НА гриппа. Модифицированный белок НА гриппа не встречается в природе.
[00100] Модифицированный НА включает в себя не встречающийся в природе белок НА, содержащий по меньшей мере одну модификацию природного НА и обладающий улучшенными характеристиками по сравнению с природным белком НА, от которого происходит аминокислотная последовательность модифицированного НА. Модифицированные белки НА содержат аминокислотную последовательность, не встречающуюся в природе, которая образована замещением одного или более аминокислотных остатков белка НА одной или более различными аминокислотами.
[00101] Соответственно, модифицированный НА, мутантный НА или рекомбинантный НА относится к НА, в котором последовательность ДНК, кодирующая природный НА, модифицирована для получения модифицированной или мутантной последовательности ДНК, которая кодирует модификацию, мутацию или замену одной или более аминокислот в аминокислотной последовательности НА.
[00102] Некоторые из остатков, идентифицированных для модификации, мутации или замены, соответствуют консервативным остаткам, тогда как другие нет. В случае остатков, которые являются неконсервативными, замещение одной или более аминокислот ограничивается заменами, которые производят модифицированный НА, аминокислотная последовательность которого не соответствует обнаруженной в природе. В случае консервативных остатков такая модификация, замена или замещения также не должны приводить к природным последовательностям НА.
Консервативные замены
[00103] Как описано в настоящем документе, остатки в белках НА могут быть идентифицированы и модифицированы, заменены или мутированы для получения модифицированного белка НА или вариантов белка НА. Замены или мутации в конкретных положениях не ограничиваются аминокислотными заменами, описанными в настоящем документе или приведенными в примерах. Например, варианты НА могут содержать консервативные замены описанных аминокислотных замен.
[00104] Используемый в настоящем документе термин «консервативная замена» и его грамматические вариации относятся к присутствию аминокислотного остатка в последовательности белка НА, который отличается, но принадлежит к тому же классу аминокислоты в качестве описанной замены или описанного остатка (т.е. неполярный остаток, заменяющий неполярный остаток, ароматический остаток, заменяющий ароматический остаток, полярно-незаряженный остаток, заменяющий полярно-незаряженный остаток, заряженный остаток, заменяющий заряженный остаток). Кроме того, консервативные замены могут охватывать остаток, имеющий значение межфазной гидропатии того же знака и, как правило, такой же величины, что и остаток, заменяющий остаток дикого типа.
[00105] Используемый в настоящем документе термин «неполярный остаток» относится к глицину (G, Gly), аланину (A, Ala), валину (V, Val), лейцину (L, Leu), изолейцину (I, Ile) и пролину (Р, Pro); термин «ароматический остаток» относится к фенилаланину (F, Phe), тирозину (Y, Tyr) и триптофану (W, Trp); термин «полярный незаряженный остаток» относится к серину (S, Ser), треонину (Т, Thr), цистеину (С, Cys), метионину (М, Met), аспарагину (N, Asn) и глутамину (Q, Gln); термин «заряженный остаток» относится к отрицательно заряженным аминокислотам аспарагиновой кислоте (D, Asp) и глутаминовой кислоте (Е, Glu), а также к положительно заряженным аминокислотам лизину (K, Lys), аргинину (R, Arg) и гистидину (Н, His). Другая классификация аминокислот может быть следующей:
• аминокислоты с гидрофобной боковой цепью (алифатические): аланин (А, Ala), изолейцин (I, Не), лейцин (L, Leu), метионин (М, Met) и валин (V, Val);
• аминокислоты с гидрофобной боковой цепью (ароматические): фенилаланин (F, Phe), триптофан (W, Тгр), тирозин (Y, Туг);
• аминокислоты с полярно-нейтральной боковой цепью: аспарагин (N, Asn), цистеин (С, Cys), глутамин (Q, Gin), серин (S, Ser) и треонин (Т, Thr);
• аминокислоты с электрически заряженными боковыми цепями (кислотные): аспарагиновая кислота (D, Asp), глутаминовая кислота (Е, Glu);
• аминокислоты с электрически заряженными боковыми цепями (основные): аргинин (R, Arg); гистидин (Н, His); лизин (K, Lys), глицин (G, Gly) и пролин (Р, Pro).
[00106] Консервативные аминокислотные замены, вероятно, будут иметь такой же эффект на активность полученного варианта белка НА или модифицированного белка НА, как и исходная замена или модификация. Дополнительную информацию о консервативных заменах можно найти, например, в Ben Bassat et al. (J. Bacteriol, 169:751-757, 1987), O'Regan et al. (Gene, 77:237-251, 1989), Sahin-Toth et al. (Protein ScL, 3:240-247, 1994), Hochuli et al. (Bio/Technology, 6:1321-1325, 1988) и в широко используемых учебниках генетики и молекулярной биологии.
[00107] Матрицы Blosum, как правило, используются для определения родства полипептидных последовательностей. Матрицы Blosum были созданы с использованием большой базы данных надежных выравниваний (база данных BLOCKS), в которой подсчитывались попарные выравнивания последовательностей, связанные с идентичностью менее некоторого порогового процента (Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10915-10919, 1992). Для высококонсервативных целевых частот матрицы BLOSUM90 использовали порог идентичности 90%. Для матрицы BLOSUM65 использовали порог идентичности 65%. Баллы от нуля и выше в матрицах Blosum считаются «консервативными заменами» при выбранной процентной идентичности. В следующей таблице показаны примеры консервативных аминокислотных замен: таблица 2.
[00108] Нуклеотидная последовательность, кодирующая модифицированный белок НА, может быть оптимизирована для частоты использования кодонов человека, для увеличения содержания GC или их комбинации. Модифицированный белок НА может быть экспрессирован в растении, части растения или растительной клетке.
А. МОДИФИКАЦИИ Н3 НА I
[00109] Модифицированные белки НА гриппа Н3 и способы получения модифицированных белков НА гриппа Н3 в растениях описаны в настоящем документе. Было замечено, что модификация специфических аминокислот в белках НА из подтипа Н3 приводит к улучшенным характеристикам модифицированного белка Н3 НА по сравнению с белком Н3 НА дикого типа или немодифицированным белком Н3 НА.
[00110] Всего было исследовано 33 одинарных, двойных и/или тройных модификаций остатков, которые не представляют собой часть транс мембранного (ТМ) и цитозольного домена НА (ТМ), и/или модификаций остатков, которые представляют собой часть транс мембранного (ТМ) и цитозольного домена (СТ) НА, в отношении улучшения характеристик белка Н3 НА. Как описано ниже и как показано в примерах, только модификации или комбинации модификаций в определенных положениях улучшают характеристики белка Н3 НА. Модификации в 13 положениях или комбинациях положений отрицательно влияли на характеристики белка Н3 НА (данные не показаны).
[00111] Примеры улучшенных характеристик мутантного белка Н3 НА или модифицированного белка Н3 НА включают в себя повышенный выход или накопление белка НА при экспрессии в растительных клетках по сравнению с НА дикого типа или немодифицированным НА того же штамма или подтипа гриппа, который не содержит модификацию(и) или мутацию(и); улучшенный титр гемагглютинации модифицированного или мутированного белка НА по сравнению с белком НА дикого типа или немодифицированным НА; улучшенную целостность, стабильность или как целостность, так и стабильность VLP, которые состоят из модифицированных белков НА, по сравнению с целостностью, стабильностью или и тем и другим VLP, содержащими НА дикого типа, которые не содержат мутацию(и); повышенный выход VLP при экспрессии в растительных клетках по сравнению с уровнем продукции VLP дикого типа, которая не содержит модификацию(и) или мутацию(и); и их комбинацию.
[00112] Модифицированный белок Н3 НА или мутантный белок Н3 НА, как описано в настоящем документе, модифицирован и содержит одну или более мутаций или модификаций в любом одном или более остатках при выравнивании последовательностей с положениям 382, 384, 392 и/или 431 эталонного штамма A/Hong Kong/4801/14 (SEQ ID NO: 92; смотрите фиг. 1). Поэтому предусмотрены полипептиды, белки и/или белковые комплексы НА гриппа НЗ, такие как, например, вирусоподобные частицы (VLP), которые содержат модификации или мутации в одном или более положениях аминокислот 382, 384, 392 и 431, причем такая нумерация аминокислот основана на последовательности A/Hong Kong/4801/14, как показано на фиг. 1 (SEQ ID NO: 92), или на положениях аминокислот, которые соответствуют таким положениям аминокислот, например, как определено выравниванием аминокислотной последовательности НА с SEQ ID NO: 92. Неограничивающие примеры аминокислотных последовательностей НА гриппа Н3, которые содержат одну или более таких мутаций, включают в себя SEQ ID NO: 91, 92, 93, 94, 95, 96 и 97.
[00113] Модифицированный белок Н3 НА, описанный в настоящем документе, включает в себя белок Н3 НА с аминокислотными последовательностями, которые характеризуются идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к аминокислотной последовательности, кодирующей НА из Н3 (SEQ ID NO: 91-97), причем аминокислотная последовательность содержит одну или более мутаций или модификаций в любом одном или более остатках при выравнивании последовательностей с положениями 382, 384, 392 и 431 A/Hong Kong/4801/14 НА (SEQ ID NO: 92).
[00114] Кроме того, белок Н3 НА может кодироваться нуклеотидными последовательностями, которые характеризуются идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к нуклеотидной последовательности, кодирующей НА из Н3 (SEQ ID NO: 91-97), причем белок Н3 НА содержит одну или более чем одну мутацию или модификацию в любом одном или более остатках при выравнивании последовательностей с положениями 382, 384, 392 и 431 A/Hong Kong/4801/14 НА (SEQ ID NO: 92), причем нуклеотидная последовательность кодирует белок гемагглютинин, который при экспрессии образует VLP.
[00115] Неограничивающими примерами штаммов, из которых может происходить Н3 НА, являются A/Bangkok/3007/15 (H3N2) (SEQ ID NO: 91); A/Hongkong/4801/14 (H3N2) (SEQ ID NO: 92); A/Minnesota/40/15 (H3N2) (SEQ ID NO: 93); A/South Australia/1/16 (H3N2) (SEQ ID NO: 94); A/Pennsylvania/09/15 (H3N2) (SEQ ID NO: 95); A/Switzerland/9715293/13 (H3N2) (SEQ ID NO: 96) и A/Mississippi/16/16 (H3N2) (SEQ ID NO: 97).
Модификация в позиции 382
[00116] Согласно одному аспекту предусмотрен Н3 НА, который может содержать модифицированный остаток в положении 382 (нумерация в соответствии с нумерацией A/Hong Kong/4801/14 НА, SEQ ID NO: 92).
[00117] Antanasijevic et al. (J Biol Chem. 2014; 289(32):22237-45) исследовали структурно-функциональные свойства области петли-на-стебле Н5 НА посредством сайт-направленного мутагенеза в 14 различных положениях. Мутировавшие положения Thr41, Gln42, Ile45, Asn53 и Leu99 НА2 являются высококонсервативными и были разработаны для анализа важности этих остатков для функции НА. Antanasijevic наблюдал, что консервативные мутации в положениях HA1-I28V, НА2-Т41А, НА2-Т49А, HA2-N53A и HA2-D57E нарушают проникновение вируса. В случае мутационного эффекта на ингибирование входа малой молекулой МВХ2329 наибольшее влияние оказали замены на HA2-Ile45, HA2-Val52, HA2-Asn53 и HA2-Ser54 на внешней поверхности и HA2-Leu99 на внутренней поверхности. Эти остатки высококонсервативны в НА группы 1 (например, H1 и Н5). Положение 53 в НА Н5 Antanasijevic соответствует положению 380 в H1 НА и положению 382 в Н3 НА текущего раскрытия.
[00118] Неожиданно было обнаружено, что модификация консервативного остатка в положении 380 в H1 НА из аспарагина в аланин приводит к приблизительно 80%-ному снижению титра гемагглютинации модифицированного H1 НА по сравнению с H1 НА дикого типа (данные не показаны). Эквивалентная модификация НА из Н5 также приводит к снижению титра гемагглютинации (смотрите фиг. 3, таблица 7). Однако изменение эквивалентного положения в НА из Н3 (N382A) из аспарагина в аланин приводит к приблизительно 130%-ному увеличению титра гемагглютинации по сравнению с НА дикого типа (смотрите фиг. 2, таблицу 5).
[00119] Соответственно, остаток в положении 382 Н3 НА может быть модифицирован так, чтобы он не представлял собой аспарагин. Например, остаток в положении 382 может быть модифицирован, чтобы представлять собой гидрофобную аминокислоту, например, аланин или консервативную замену аланина, например, серин (S, Ser), глицин (G, Gly), треонин (Т, Thr), цистеин (С, Cys) или валин (V, Val).
[00120] Например, модифицированный белок Н3 НА может содержать аминокислотную последовательность, которая характеризуется идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к аминокислотной последовательности НА из Н3 A/Hong Kong/4801/14 (SEQ ID NO: 92), причем аминокислотная последовательность содержит аланин (A, Ala) или консервативную замену аланина (A, Ala) в положении 382 и причем последовательность не встречается в природе. Консервативная замена аланина может, например, представлять собой серин (S, Ser), глицин (G, Gly), треонин (Т, Thr), цистеин (С, Cys) или валин (V, Val).
[00121] В настоящем описании также представлена нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую модифицированный Н3 НА с заменой в положениях 382, как описано выше, функционально связанную с регуляторной областью, активной в растении.
[00122] Например, нуклеотидные последовательности могут характеризоваться идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к нуклеотидной последовательности, кодирующей НА из Н3 A/Hong Kong/4801/14 (SEQ ID NO: 102), причем нуклеотидная последовательность кодирует модифицированный белок Н3 НА, который содержит аланин (A, Ala) или консервативную замену аланина (A, Ala) в положении 382, и причем последовательность не встречается в природе. Консервативная замена может, например, представлять собой серин (S, Ser), глицин (G, Gly), треонин (Т, Thr), цистеин (С, Cys) или валин (V, Val).
[00123] Нуклеотидные последовательности могут характеризоваться идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 102, причем нуклеотидная последовательность кодирует модифицированный белок Н3 НА, который содержит аланин (A, Ala) или консервативную замену аланина (A, Ala) в положении 382, и причем последовательность не встречается в природе. Консервативная замена может, например, представлять собой серин (S, Ser), глицин (G, Gly), треонин (Т, Thr), цистеин (С, Cys) или валин (V, Val).
[00124] Помимо остатка в положении 382, в Н3 НА могут быть модифицированы остатки в положениях 384, 524, 525, 526, 527, 528 или любая их комбинация.
[00125] Кроме того, представлен способ получения VLP, которые содержат модифицированный Н3 НА с заменой по меньшей мере в положении 382 и, необязательно, в положении 384, 524, 525, 526, 527, 528 или любой их комбинации, в растении. Способ предусматривает введение нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный Н3 НА, функционально связанной с регуляторной областью, активной в растении, в растение или часть растения, и инкубацию растения или части растения в условиях, которые обеспечивают экспрессию нуклеиновой кислоты, тем самым производя VLP.
[00126] Кроме того, представлен способ увеличения выхода VLP, которые содержат модифицированный Н3 НА с заменой по меньшей мере в положении 382 и, необязательно, заменами в положениях 384, 524, 525, 526, 527, 528 или любой их комбинации, в растении. Способ предусматривает введение нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный Н3 НА, функционально связанной с регуляторной областью, активной в растении, в растение или часть растения, и инкубацию растения или части растения в условиях, которые обеспечивают экспрессию нуклеиновой кислоты, тем самым производя VLP.
[00127] Настоящее описание дополнительно предусматривает VLP, содержащую Н3 НА с заменой по меньшей мере в положении 382 и, необязательно, заменами в положениях 384, 524, 525, 526, 527, 528 или любую их комбинацию. VLP может быть получена способом, предусмотренным настоящим описанием. VLP, содержащие модифицированный Н3 НА, демонстрируют улучшенные характеристики по сравнению с VLP, которые содержат немодифицированный белок Н3 НА.
Модификация в положении 384
[00128] Согласно другому аспекту предусмотрен Н3 НА, который может содержать модифицированный остаток в положении 384 (нумерация A/Hong Kong/4801/14 НА, SEQ ID NO: 92).
[00129] Как показано, например, на фиг. 2 и в таблице 5, наличие остатка в положении 384, модифицированного из лейцина в валин, приводит к приблизительно 200%-ному увеличению титра гемагглютинации по сравнению с Н3 НА дикого типа.
[00130] Соответственно, остаток в положении 384 Н3 НА может быть модифицирован так, чтобы он представлял собой не лейцин. Например, остаток в положении 384 может быть модифицирован, чтобы представлять собой, например, валин или консервативную замену валина, которая не представляет собой лейцин, например, изолейцин, метионин, аланин или треонин.
[00131] Например, модифицированный белок Н3 НА может содержать аминокислотную последовательность, которая характеризуется идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к аминокислотной последовательности НА из Н3 A/Hong Kong/4801/14 (SEQ ID NO: 92), причем аминокислотная последовательность содержит валин (V, Val) или консервативную замену валина, которая не представляет собой лейцин, в положении 384, причем последовательность не встречается в природе и причем белок НА при экспрессии образует VLP. Консервативная замена валина может представлять собой, например, изолейцин, метионин, аланин или треонин.
[00132] В настоящем описании также предусмотрена нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую модифицированный Н3 НА с заменой в положениях 384, как описано выше, функционально связанную с регуляторной областью, активной в растении.
[00133] Например, нуклеотидные последовательности могут характеризоваться идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к нуклеотидной последовательности, кодирующей НА из Н3 A/Hong Kong/4801/14 (SEQ ID NO: 102), причем нуклеотидная последовательность кодирует модифицированный белок НА Н3, который содержит валин (V, Val) или консервативную замену валина (V, Val), которая не представляет собой лейцин, в положении 384, причем последовательность не встречается в природе и причем нуклеотидная последовательность кодирует белок НА, который при экспрессии образует VLP. Консервативная замена валина может представлять собой, например, изолейцин, метионин, аланин или треонин.
[00134] Нуклеотидные последовательности могут характеризоваться идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 102, причем нуклеотидная последовательность кодирует модифицированный белок Н3 НА, который содержит валин (V, Val) или консервативную замену валина (V, Val), которая не представляет собой лейцин, в положении 384, причем последовательность не встречается в природе и причем нуклеотидная последовательность кодирует белок НА, который при экспрессии образует VLP. Консервативная замена валина может представлять собой, например, изолейцин, метионин, аланин или треонин.
[00135] Помимо остатка в положении 384, в Н3 НА могут быть модифицированы остатки в положениях 382, 524, 525, 526, 527, 528 или любая их комбинация.
[00136] Кроме того, представлен способ получения VLP, которые содержат модифицированный Н3 НА с заменой по меньшей мере в положениях 384 и, необязательно, заменами в положениях 382, 524, 525, 526, 527, 528 или любой их комбинации, в растении. Способ предусматривает введение нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный Н3 НА, функционально связанной с регуляторной областью, активной в растении, в растение или часть растения, и инкубацию растения или части растения в условиях, которые позволяют экспрессию нуклеиновой кислоты, тем самым производя VLP.
[00137] Кроме того, представлен способ увеличения выхода VLP, которые содержат модифицированный Н3 НА с заменой по меньшей мере по 384 и необязательно с заменами в положениях 382, 524, 525, 526, 527, 528 или любой их комбинации, как описано выше, в растении. Способ предусматривает введение нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный Н3 НА, функционально связанной с регуляторной областью, активной в растении, в растение или часть растения, и инкубацию растения или части растения в условиях, которые позволяют экспрессию нуклеиновой кислоты, тем самым производя VLP.
[00138] В настоящем описании дополнительно предусмотрена VLP, содержащая Н3 НА с заменой по меньшей мере в положении 384 и, необязательно, заменами в положениях 382, 524, 525, 526, 527, 528 или любой их комбинации. VLP может быть получена способом, предусмотренным в настоящем описании. VLP, содержащие модифицированный Н3 НА, демонстрируют улучшенные характеристики по сравнению с VLP, которые содержат немодифицированный белок Н3 НА.
Модификация в положении 392
[00139] Согласно другому аспекту предусмотрен Н3 НА, который может содержать модифицированный остаток в положении 392 (нумерация Н3 A/Hong Kong/4801/14 НА, SEQ ID NO: 92).
[00140] Как показано, например, на фиг. 2 и в таблице 5, наличие остатка в положении 392, модифицированного из фенилаланина в аспарагиновую кислоту, приводит к приблизительно 140%-ному увеличению титра гемагглютинации по сравнению с Н3 НА дикого типа.
[00141] Соответственно, остаток в положении 392 в Н3 НА может быть модифицирован так, чтобы он не представлял собой фенилаланин. Например, остаток в положении 392 может быть модифицирован, например, чтобы представлять собой аспарагиновую кислоту или консервативную замену аспарагиновой кислоты, например, глутаминовую кислоту, аспарагин, глутамин или серин.
[00142] Например, модифицированный белок Н3 НА может содержать аминокислотную последовательность, которая характеризуется идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к аминокислотной последовательности НА из Н3 A/Hong Kong/4801/14 (SEQ ID NO: 92), причем аминокислотная последовательность содержит аспарагиновую кислоту или консервативную замену аспарагиновой кислоты, например, глутаминовую кислоту, аспарагин, глутамин или серин в положении 392, причем последовательность не встречается в природе и причем белок НА при экспрессии образует VLP. Консервативная замена аспарагиновой кислоты может, например, представлять собой глутаминовую кислоту, аспарагин, глутамин или серин.
[00143] В настоящем документе также предусмотрена нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую модифицированный Н3 НА с заменой в положениях 392, как описано выше, функционально связанную с регуляторной областью, активной в растении.
[00144] Например, нуклеотидные последовательности могут характеризоваться идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к нуклеотидной последовательности, кодирующей НА из Н3 A/Hong Kong/4801/14 (SEQ ID NO: 102), причем нуклеотидная последовательность кодирует модифицированный белок Н3 НА, который содержит аспарагиновую кислоту или консервативную замену аспарагиновой кислоты в положении 392, причем последовательность не встречается в природе и причем нуклеотидная последовательность кодирует белок НА, который при экспрессии образует VLP. Консервативная замена аспарагиновой кислоты может, например, представлять собой глутаминовую кислоту, аспарагин, глутамин или серин.
[00145] Например, нуклеотидные последовательности могут характеризоваться идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 102, причем нуклеотидная последовательность кодирует модифицированный белок Н3 НА, который содержит аспарагиновую кислоту или консервативную замену аспарагиновой кислоты в положении 392, причем последовательность не встречается в природе и причем нуклеотидная последовательность кодирует белок НА, который при экспрессии образует VLP. Консервативная замена аспарагиновой кислоты может, например, представлять собой глутаминовую кислоту, аспарагин, глутамин или серин.
[00146] Кроме того, представлен способ получения VLP, которые содержат модифицированный Н3 НА с заменой по меньшей мере в положениях 392, как описано выше, в растении. Способ предусматривает введение нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный Н3 НА, функционально связанной с регуляторной областью, активной в растении, в растение или часть растения, и инкубацию растения или части растения в условиях, которые позволяют экспрессию нуклеиновой кислоты, тем самым производя VLP.
[00147] Кроме того, представлен способ увеличения выхода VLP, которые содержат модифицированный Н3 НА с заменой по меньшей мере по 392, как описано выше, в растении. Способ предусматривает введение нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный Н3 НА, функционально связанной с регуляторной областью, активной в растении, в растение или часть растения, и инкубацию растения или части растения в условиях, которые позволяют экспрессию нуклеиновой кислоты, тем самым производя VLP.
[00148] В настоящем описании дополнительно предусмотрена VLP, содержащая Н3 НА с заменой по меньшей мере в положении 392. VLP может быть получена способом, предусмотренным настоящим описанием. VLP, содержащие модифицированный Н3 НА, демонстрируют улучшенные характеристики по сравнению с VLP, которые содержат немодифицированный белок Н3 НА.
Модификация в положении 431
[00149] Согласно другому аспекту предусмотрен Н3 НА, который может содержать модифицированный остаток в положении 431 (нумерация Н3 A/Hong Kong/4801/14 НА, SEQ ID NO: 92).
[00150] Как показано, например, на фиг. 2 и в таблице 5, наличие остатка в положении 431, модифицированного из лейцина в метионин, приводит к приблизительно 170%-ному увеличению титра гемагглютинации по сравнению с Н3 НА дикого типа.
[00151] Соответственно, остаток в положении 431 в Н3 НА может быть модифицирован так, чтобы он представлял собой не лейцин. Например, остаток в положении 431 может быть модифицирован, например, чтобы представлять собой метионин или консервативную замену метионина, например, лейцин, изолейцин, глутамин, валин или фенилаланин.
[00152] Например, модифицированный белок Н3 НА может содержать аминокислотную последовательность, которая характеризуется идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к аминокислотной последовательности НА из Н3 A/Hong Kong/4801/14 (SEQ ID NO: 92), причем аминокислотная последовательность содержит метионин или консервативную замену метионина в положении 431, причем последовательность не встречается в природе и причем белок НА при экспрессии образует VLP. Консервативная замена метионина может представлять собой, например, лейцин, изолейцин, глутамин, валин или фенилаланин.
[00153] В настоящем описании также предусмотрена нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую модифицированный Н3 НА с заменой в положении 431, как описано выше, функционально связанную с регуляторной областью, активной в растении.
[00154] Например, нуклеотидные последовательности могут характеризоваться идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к нуклеотидной последовательности, кодирующей НА из Н3 A/Hong Kong/4801/14 (SEQ ID NO: 102), причем нуклеотидная последовательность кодирует модифицированный белок Н3 НА, который содержит метионин или консервативную замену метионина в положении 431, причем последовательность не встречается в природе и причем нуклеотидная последовательность кодирует белок НА, который при экспрессии образует VLP. Консервативная замена метионина может представлять собой, например, лейцин, изолейцин, глутамин, валин или фенилаланин.
[00155] Например, нуклеотидные последовательности могут характеризоваться идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 102, причем нуклеотидная последовательность кодирует модифицированный белок Н3 НА, который содержит метионин или консервативную замену метионина в положении 431, причем последовательность не встречается в природе и причем нуклеотидная последовательность кодирует НА белок, который при экспрессии образует VLP. Консервативная замена аспарагиновой кислоты может, например, представлять собой лейцин, изолейцин, глутамин, валин или фенилаланин.
[00156] Кроме того, представлен способ получения VLP, которые содержат модифицированный Н3 НА с заменой по меньшей мере в положении 431, как описано выше, в растении. Способ предусматривает введение нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный Н3 НА, функционально связанной с регуляторной областью, активной в растении, в растение или часть растения, и инкубацию растения или части растения в условиях, которые позволяют экспрессию нуклеиновой кислоты, тем самым производя VLP.
[00157] Кроме того, представлен способ увеличения выхода VLP, которые содержат модифицированный Н3 НА с заменой по меньшей мере по 431, как описано выше, в растении. Способ предусматривает введение нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный Н3 НА, функционально связанной с регуляторной областью, активной в растении, в растение или часть растения, и инкубацию растения или части растения в условиях, которые позволяют экспрессию нуклеиновой кислоты, тем самым производя VLP.
[00158] В настоящем описании дополнительно предусмотрена VLP, содержащая Н3 НА с заменой по меньшей мере в положении 431. VLP может быть получена способом, предусмотренным настоящим описанием. VLP, содержащие модифицированный Н3 НА, демонстрируют улучшенные характеристики по сравнению с VLP, которые содержат немодифицированный белок Н3 НА.
В. МОДИФИКАЦИИ Н3 НА II
Модификация в положении 382, 384, 392, 431 и/или 524-528 («CysTM»)
[00159] Модифицированные белки НА гриппа Н3 и способы получения модифицированных белков НА гриппа Н3 в растениях описаны в настоящем документе. Было замечено, что модификация конкретных аминокислот в белках НА из подтипа Н3 приводит к улучшенным характеристикам модифицированного белка Н3 НА по сравнению с белком Н3 НА дикого типа или немодифицированным белком Н3 НА.
[00160] Согласно одному аспекту остатки цистеина в положении 524 и/или 528 (нумерация Н3 A/Hong Kong/4801/14, SEQ ID NO: 92) или остатки, эквивалентные этим положениям, как определено посредством выравнивания, могут быть заменены на остатки не цистеина в этих положениях. Кроме того, остатки в положении 525, 526 и/или 527 (нумерация Н3 A/Hong Kong/4801/14 НА) также могут быть модифицированы. Эти модификации или замены могут называться «модификация CysTM», «CysTM», «мутация CysTM», «замена CysTM» или «замещение CysTM» или грамматически эквивалентные выражения.
[00161] В заявке США №13/838796 и сопутствующей публикации Holtz et al. (ВМС Biotechnology. 2014; 14: 111) сообщают о повышенной стабильности и сохранении активности рекомбинантного НА за счет мутации остатков цистеина в карбоксиконцевой области белка НА, включая в себя трансмембранный (ТМ) и цитозольный домен (СТ). В частности, Holtz et al. демонстрируют мутации С539А, С546А, С549А, C524S и С528А в рекомбинантном НА Perth/16/2009 (H3N2). Мутация всех пяти остатков цистеина или различных их подмножеств привела к выходам, чистоте, размеру частиц, активности гемагглютинации и термостабильности НА, сравнимым с рекомбинантным белком НА дикого типа. Напротив, мутации пары консервативных остатков цистеина в эктодомене, о которых известно, что они образуют дисульфидную связь (C64S и C76S), приводили к значительному снижению экспрессии НА, что указывает на критическую роль этих остатков в собственном укладывании НА. Используя анализ простой одномерной радиальной иммунодиффузии (SRID), Holtz et al. также показывают, что пять мутаций остатков цистеина улучшают эффективность рекомбинантного НА по сравнению с белком дикого типа, предотвращая перекрестное сшивание дисульфидов в доменах ТМ и СТ. Мутантные белки НА сохраняют активность в течение по меньшей мере 12 месяцев при температуре 25°С, тогда как белок НА дикого типа проявляет активность менее чем 40% только через 50 дней после очистки.
[00162] Xu et al. (Virus Genes (2013) 47: 20-26) показали, что мутантные Н3 НА с мутациями одного или двух цистеинов ТМ (С540/544) могут правильно экспрессироваться в клетках, однако мутант проявляет более низкую термостойкость и повышенную активность слияния по сравнению с белками Н3 НА дикого типа.
[00163] Всего 33 одиночных, двойных или тройных модификаций в сочетании с модификациями трансмембраны (ТМ), как описано в настоящем документе («модификация Cys ТМ»), исследовали для улучшения характеристик белка Н3 НА. Как описано ниже и как показано в примерах, только модификации или комбинации модификаций в определенных положениях улучшают характеристики белка Н3 НА. Модификации в 13 положениях или комбинациях положений отрицательно влияли на характеристики белка Н3 НА (данные не показаны).
[00164] Примеры улучшенных характеристик мутантного белка Н3 НА включают в себя повышенный выход белка НА при экспрессии в растительных клетках по сравнению с НА дикого типа или немодифицированным НА того же штамма или подтипа гриппа, который не содержит модификацию(и) или мутацию(и); улучшенный титр гемагглютинации модифицированного или мутированного белка НА по сравнению с белком НА дикого типа или немодифицированным белком НА; улучшенную целостность, стабильность или как целостность, так и стабильность VLP, которые состоят из модифицированных белков НА, по сравнению с целостностью, стабильностью или и тем и другим VLP, содержащими НА дикого типа, которые не содержат мутацию(й); повышенный выход VLP при экспрессии в растительных клетках по сравнению с уровнем продукции VLP дикого типа, которая не содержит модификацию(и) или мутацию(и); и их комбинацию.
[00165] Согласно одному аспекту предусмотрен модифицированный Н3 НА, содержащий остатки цистеина в положении 524 и/или 528 (нумерация A/Hong Kong/4801/14) или остатки, эквивалентные этим положениям, как определено выравниванием, замененные на остатки не цистеина в этих положениях. Например, остатки цистеина в положении 524 могут быть заменены на серин (S, Ser) или консервативную замену серина или цистеин в положении 528 может быть заменен на лейцин (L, Leu) или консервативную замену лейцина.
[00166] Кроме того, последовательность между двумя цистеинами в положениях 524 и 528 (нумерация A/Hong Kong/4801/14, SEQ ID NO: 92) также может быть модифицирована. Например, в последовательности «С524Х525Х526Х527С528» С524 (положение 524) может быть заменен серином (S, Ser) или консервативной заменой серина; если Х525 (положение 525) не представляет собой лейцин, остаток Х525 может быть замещен лейцином (L, Leu) или консервативной заменой лейцина; если Х526 (положение 526) не представляет собой валин, Х526 может быть замещен валином (V, Val) или консервативной заменой валина; если Х527 (положение 527) не представляет собой лейцин, остаток в положении Х527 может быть замещен лейцином (L, Leu) или консервативной заменой лейцина и С528 (положение 528) может быть заменен лейцином (L, Leu) или консервативной заменой лейцина. Например, согласно одному варианту осуществления последовательность «CFLLC» в положениях с 524 по 528 может быть заменена последовательностью «SLVLL» (SEQ ID NO: 98).
[00167] Белки НА из других штаммов, отличных от Н3 вируса гриппа, которые содержат остатки цистеина в положении 524 и/или 528 или остатки, эквивалентные этим положениям, как определено выравниванием, также могут быть модифицированы, как описано ниже. Например, белки НА из штаммов вируса гриппа В, которые содержат остатки цистеина в положениях, которые эквивалентны положению 524 и/или 528 Н3 НА, могут быть модифицированы до остатков не цистеина, как описано ниже.
[00168] В дополнение к мутации трансмембранного домена, как описано в настоящем документе, модифицированные белки Н3 НА могут дополнительно содержать одну или более замен аминокислот в положениях 382, 384, 392 и/или 431, что приводило к улучшенной характеристике модифицированного белка НА3 или VLP, полученных с использованием модифицированного белка НА. Следует понимать, что улучшенная характеристика не ограничивается заменой конкретной аминокислоты в определенных сайтах, поскольку специалист в настоящей области техники поймет, что аминокислоты с аналогичными свойствами могут быть заменены на аминокислоты в идентифицированных положениях.
[00169] Соответственно, модифицированный белок Н3 НА или мутантный белок Н3 НА, как описано в настоящем документе, может содержать одну или более мутаций или модификаций в любом одном или более остатках при выравнивании последовательностей с положениями 382, 384, 392, 431, 524, 525, 526, 527 или 528 эталонного штамма Н3 A/Hong Kong/4801/14 (SEQ ID NO: 92; смотрите фиг. 1). Поэтому предусмотрены полипептиды НА гриппа Н3, белки и/или белковые комплексы, такие как, например, вирусоподобные частицы (VLP), которые содержат модификации или мутации в одном или более положениях аминокислот 382, 384, 392, 431, 524, 525, 526, 527 или 528, причем такая нумерация аминокислот основана на последовательности Н3 A/Hong Kong/4801/14, как показано на фиг. 1 (SEQ ID NO: 92), или в положениях аминокислот, которые соответствуют таким положениям аминокислот, например, как определено выравниванием аминокислотной последовательности НА с SEQ ID NO: 92. Неограничивающие примеры аминокислотных последовательностей НА вируса гриппа НЗ, которые содержат одну или более таких мутаций, включают в себя SEQ ID NO: 91, 92, 93, 94, 95, 96 и 97.
[00170] Описанный в настоящем документе модифицированный белок Н3 НА включает в себя белок Н3 НА с аминокислотными последовательностями, которые характеризуются идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к аминокислотной последовательности, кодирующей НА из Н3 (SEQ ID NO: 91-97), причем аминокислотная последовательность содержит одну или более чем одну мутацию или модификацию в любом одном или более остатках в выравнивании последовательностей с положениями 382, 384, 392, 431, 524, 525, 526, 527 или 528 A/Hong Kong/4801/14 НА (SEQ ID NO: 92).
[00171] Кроме того, белок Н3 НА может кодироваться нуклеотидными последовательностями, которые характеризуются идентичностью последовательностей или сходством последовательностей, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к нуклеотидной последовательности, кодирующей НА из Н3 (SEQ ID NO: 91-97 последовательностей штаммов Н3), причем белок Н3 НА содержит одну или более мутаций или модификаций в любом одном или более остатках в выравнивании последовательностей с положениями 382, 384, 392, 431, 524, 525, 526, 527 или 528 Н3 A/Hong Kong/4801/14 HA (SEQ ID NO: 92) и причем нуклеотидная последовательность кодирует белок гемагглютинин, который при экспрессии образует VLP.
[00172] Неограничивающими примерами штаммов, из которых может происходить Н3 НА, являются A/Bangkok/3007/15 (H3N2) (SEQ ID NO: 91); A/Hongkong/4801/14 (H3N2) (SEQ ID NO: 92); A/Minnesota/40/15 (H3N2) (SEQ ID NO: 93); A/South Australia/1/16 (H3N2) (SEQ ID NO: 94); A/Pennsylvania/09/15 (H3N2) (SEQ ID NO: 95); A/Switzerland/9715293/13 (H3N2) (SEQ ID NO: 96) и A/Mississippi/16/16 (H3N2) (SEQ ID NO: 97).
Модификация в положении 524-528 (CysTM) и 382
[00173] Согласно другому аспекту предусмотрен Н3 НА, который может содержать модифицированный остаток в положении 382 и может быть модифицирована так, чтобы содержать остаток цистеина в положениях 524 и/или 528 (нумерация Н3 A/Hongkong/4801/14, SEQ ID NO: 92). Кроме того, остатки в положении 525, 526 и/или 527 (нумерация Н3 A/Hongkong/4801/14) также могут быть модифицированы.
[00174] Как показано, например, на фиг. 7А, 7В и 7С, Н3 НА, содержащий модифицированные в не цистеин остатки цистеина в положениях 524 и 528 и содержащий остаток в положении 382, модифицированный из аспарагина в аланин, приводит к приблизительно 260%-ному увеличению в титре гемагглютинации по сравнению с Н3 НА дикого типа.
[00175] Соответственно, предусмотрен модифицированный белок Н3 НА, который содержит одну или более чем одну модификацию в положении 524, 525, 526, 527 или 528 и модификацию в положении 382. В неограничивающем примере модифицированный Н3 НА содержит модификации по меньшей мере в положениях 382, 524 и 528.
[00176] Остаток в положении 382 Н3 НА может быть модифицирован так, чтобы он не представлял собой аспарагин. Например, остаток в положении 382 может быть модифицирован, чтобы представлять собой гидрофобную аминокислоту, например, аланин или консервативную замену аланина, например, серин (S, Ser), глицин (G, Gly), треонин (Т, Thr), цистеин (С, Cys) или валин (V, Val). Остаток в положении 524 может быть модифицирован в не цистеин, серин или консервативную замену серина (S, Ser), а остаток в положении 528 может быть модифицирован в не цистеин, лейцин (L, Leu) или консервативную замену лейцина.
[00177] Например, модифицированный белок Н3 НА может содержать аминокислотную последовательность, которая характеризуется идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к аминокислотной последовательности НА из Н3 A/Hongkong/4801/14 (SEQ ID NO: 92), причем аминокислотная последовательность содержит аланин (A, Ala) или консервативную замену аланина (A, Ala) в положении 382, не содержит остаток цистеина в положениях 524 и 528, причем последовательность не встречается в природе и причем НА при экспрессии образует VLP. Консервативная замена аланина может, например, представлять собой серин (S, Ser), глицин (G, Gly), треонин (Т, Thr), цистеин (С, Cys) или валин (V, Val). Не цистеин в положении 524 может представлять собой серин (S, Ser) или консервативную замену серина, а не цистеин в положении 528 может представлять собой лейцин (L, Leu) или консервативную замену лейцина. Консервативная замена серина (Se, Ser) может представлять собой, например, треонин (Т, Thr), аланин (А, Ala), аспарагин (N, Asn), аспарагиновую кислоту (D, Asp), глутамин (Q, Gln), глицин (G, Gly), глутаминовую кислоту (Е, Glu) или лизин (L, Lys). Консервативная замена лейцина может представлять собой, например, изолейцин (I, Не), валин (V, Val), метионин (М, Met), фенилаланин (F, Phe) или валин (V, Val).
[00178] В настоящем документе также предусмотрена нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую модифицированный Н3 НА с заменой в положениях 382, 524 и 528, как описано выше, функционально связанную с регуляторной областью, активной в растении.
[00179] Например, нуклеотидные последовательности могут характеризоваться идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к нуклеотидной последовательности, кодирующей НА из Н3 A/Hongkong/4801/14 (SEQ ID NO: 102), причем нуклеотидная последовательность кодирует модифицированный белок Н3 НА, который содержит аланин (A, Ala) или консервативную замену аланина (A, Ala) в положении 382, не содержит остаток цистеина в положениях 524 и 528, причем последовательность не встречается в природе и причем НА при экспрессии образует VLP. Консервативная замена для аланина может, например, представлять собой серин (S, Ser), глицин (G, Gly), треонин (Т, Thr), цистеин (С, Cys) или валин (V, Val). Не цистеин в положении 524 может представлять собой серин (S, Ser) или консервативную замену серина, а не цистеин в положении 528 может представлять собой лейцин (L, Leu) или консервативную замену лейцина. Консервативная замена серина (Se, Ser) может представлять собой, например, треонин (Т, Thr), аланин (A, Ala), аспарагин (N, Asn), аспарагиновую кислоту (D, Asp), глутамин (Q, Gln), глицин (G, Gly), глутаминовую кислоту (Е, Glu) или лизин (L, Lys). Консервативная замена лейцина может представлять собой, например, изолейцин (I, Не), валин (V, Val), метионин (М, Met), фенилаланин (F, Phe) или валин (V, Val).
[00180] Нуклеотидные последовательности могут характеризоваться идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 102, причем нуклеотидная последовательность кодирует модифицированный белок Н3 НА, который содержит аланин (A, Ala) или консервативную замену аланина (A, Ala) в положении 382, не содержит остаток цистеина в положениях 524 и 528, причем последовательность не встречается в природе и причем НА при экспрессии образует VLP. Консервативная замена аланина может, например, представлять собой серин (S, Ser), глицин (G, Gly), треонин (Т, Thr), цистеин (С, Cys) или валин (V, Val).
[00181] Помимо остатков в положениях 382, 524 и 528, модифицированный Н3 НА может содержать дополнительные модифицированные остатки. Например, могут быть модифицированы один или более остатков в положении 384, 525, 526 и 527. В неограничивающем примере модифицированный Н3 НА может содержать замещенные остатки в положениях 382, 524, 528 и одну или более замен в положениях 384, 525, 526, 527 или их комбинацию.
[00182] Кроме того, представлен способ получения VLP, которые содержат модифицированный Н3 НА с заменой по меньшей мере в положениях 382, 524 и 528 и, необязательно, заменами в положениях 384, 525, 526, 527 выше, в растении. Способ предусматривает введение нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный Н3 НА, функционально связанной с регуляторной областью, активной в растении, в растение или часть растения, и инкубацию растения или части растения в условиях, которые позволяют экспрессию нуклеиновой кислоты, тем самым производя VLP.
[00183] Кроме того, представлен способ увеличения выхода VLP, которые содержат модифицированный Н3 НА с заменой по меньшей мере в положениях 382, 524 и 528 и, необязательно, с заменами в положениях 384, 525, 526, 527, как описано выше, в растении. Способ предусматривает введение нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный Н3 НА, функционально связанной с регуляторной областью, активной в растении, в растение или часть растения, и инкубацию растения или части растения в условиях, которые обеспечивают экспрессию нуклеиновой кислоты, тем самым производя VLP.
[00184] В настоящем описании дополнительно предусмотрена VLP, содержащая Н3 НА с заменой по меньшей мере в положениях 382, 524 и 528 и, необязательно, заменами в положениях 384, 525, 526, 527. VLP может быть получена способом, предусмотренным в настоящем описании. VLP, содержащие модифицированный Н3 НА, демонстрируют улучшенные характеристики по сравнению с VLP, которые содержат немодифицированный белок Н3 НА.
Модификация в положении 524-528 (CysTM) и 384
[00185] Согласно другому аспекту предусмотрен Н3 НА, который может содержать модифицированный остаток в положении 384 и может быть модифицирован так, чтобы не содержать остатка цистеина в положениях 524 и 528 (нумерация Н3 A/Hongkong/4801/14, SEQ ID NO: 92). Кроме того, остатки в положении 525, 526 и/или 527 (нумерация Н3 A/Hongkong/4801/14) также могут быть модифицированы.
[00186] Как показано, например, на фиг. 7А, 7В и 7С, Н3 НА, содержащий остатки цистеина в положениях 524 и 528, модифицированные в остатки не цистеина, и содержащий остаток в положении 384, модифицированный из лейцина в валин, приводит к приблизительно 270%-ному увеличению титра гемагглютинации по сравнению с Н3 НА дикого типа.
[00187] Соответственно, предусмотрен модифицированный белок Н3 НА, который содержит одну или более модификаций в положении 524, 525, 526, 527 или 528 и модификацию в положении 384. В неограничивающем примере модифицированный Н3 НА содержит модификации по меньшей мере в положениях 384, 524 и 528.
[00188] Остаток в положении 384 Н3 НА может быть модифицирован так, чтобы он не представлял собой лейцин. Например, остаток в положении 384 может быть модифицирован в другую гидрофобную аминокислоту, например, валин или консервативную замену валина, например, изолейцин, лейцин, метионин, аланин или треонин.
[00189] Например, модифицированный белок Н3 НА может содержать аминокислотную последовательность, которая характеризуется идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к аминокислотной последовательности НА из Н3 A/Hongkong/4801/14 (SEQ ID NO: 92), причем аминокислотная последовательность содержит валин или консервативную замену валина в положении 384, не содержит остатка цистеина в положениях 524 и 528, причем последовательность не встречается в природе и причем НА при экспрессии образует VLP. Консервативная замена валина может представлять собой, например, изолейцин, лейцин, метионин, аланин или треонин.
[00190] В настоящем описании также представлена нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую модифицированный Н3 НА с заменой в положениях 384, 524 и 528, как описано выше, функционально связанную с регуляторной областью, активной в растении.
[00191] Например, нуклеотидные последовательности могут характеризоваться идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к нуклеотидной последовательности, кодирующей НА из Н3 A/Hongkong/4801/14 (SEQ ID NO: 102), причем нуклеотидная последовательность кодирует модифицированный белок Н3 НА, который содержит валин или консервативную замену валина в положении 384, не содержит остаток цистеина в положениях 524 и 528 и причем последовательность не встречается в природе. Консервативная замена может представлять собой, например, изолейцин, лейцин, метионин, аланин или треонин.
[00192] Нуклеотидные последовательности могут характеризоваться идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 102, причем нуклеотидная последовательность кодирует модифицированный белок Н3 НА, который содержит валин или консервативную замену валина в положении 384, не содержит остаток цистеина в положениях 524 и 528, причем последовательность не встречаются в природе и причем НА при экспрессии образует VLP. Консервативная замена валина может представлять собой, например, изолейцин, лейцин, метионин, аланин или треонин.
[00193] Помимо остатков в положениях 384, 524 и 528, модифицированный Н3 НА может содержать дополнительные модифицированные остатки. Например, могут быть модифицированы один или более остатков в положении 382, 525, 526 и 527. В неограничивающем примере модифицированный Н3 НА может содержать замещенные остатки в положениях 384, 524, 528 и одну или более замен в положениях 382, 525, 526, 527 или их комбинацию.
[00194] Кроме того, представлен способ получения VLP, которые содержат модифицированный Н3 НА с заменой по меньшей мере в положениях 384, 524 и 528 и, необязательно, заменами в положениях 382, 525, 526, 527 выше, в растении. Способ предусматривает введение нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный Н3 НА, функционально связанной с регуляторной областью, активной в растении, в растение или часть растения, и инкубацию растения или части растения в условиях, которые допускают экспрессию нуклеиновой кислоты, тем самым производя VLP.
[00195] Кроме того, представлен способ увеличения выхода VLP, которые содержат модифицированный Н3 НА с заменой по меньшей мере в положениях 384, 524 и 528 и, необязательно, с заменами в положениях 382, 525, 526, 527, как описано выше, в растении. Способ предусматривает введение нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный Н3 НА, функционально связанной с регуляторной областью, активной в растении, в растение или часть растения, и инкубацию растения или части растения в условиях, которые допускают экспрессию нуклеиновой кислоты, тем самым производя VLP.
[00196] В настоящем описании дополнительно предусмотрена VLP, содержащая Н3 НА с заменой по меньшей мере в положениях 384, 524 и 528 и, необязательно, заменами в положениях 382, 525, 526, 527. VLP может быть получена способом, предусмотренным настоящим описанием. VLP, содержащие модифицированный Н3 НА, демонстрируют улучшенные характеристики по сравнению с VLP, которые содержат немодифицированный белок Н3 НА.
Модификация в положении 524-528 (CysTM) и 392
[00197] Согласно другому аспекту предусмотрен Н3 НА, который может содержать модифицированный остаток в положении 392 и может не содержать остатка цистеина в положениях 524 и 528 (нумерация Н3 A/Hongkong/4801/14, SEQ ID NO: 92). Кроме того, остатки в положении 525, 526 и/или 527 (нумерация Н3 A/Hongkong/4801/14) также могут быть модифицированы.
[00198] Как показано, например, на фиг. 7А и 7В, Н3 НА, содержащий остатки цистеина в положениях 524 и 528, модифицированные в не цистеин, и содержащий остаток в положении 392, модифицированный из фенилаланина в аспарагиновую кислоту, дает от 200% до 270% увеличение титра гемагглютинации по сравнению с Н3 НА дикого типа.
[00199] Соответственно, предусмотрен модифицированный белок Н3 НА, который содержит одну или более модификаций в положении 524, 525, 526, 527 или 528 и модификацию в положении 392. В неограничивающем примере модифицированный Н3 НА содержит модификации по меньшей мере в положениях 392, 524 и 528.
[00200] Остаток в положении 392 Н3 НА может быть модифицирован, чтобы не представлять собой фенилаланин. Например, остаток в положении 392 может быть модифицирован в заряженную аминокислоту, например, аспарагиновую кислоту или консервативную замену аспарагиновой кислоты, например, глутамин, аспарагин, глутаминовую кислоту или серин.
[00201] Например, модифицированный белок НА Н3 может содержать аминокислотную последовательность, которая характеризуется идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к аминокислотной последовательности НА из Н3 A/Hongkong/4801/14 (SEQ ID NO: 92), причем аминокислотная последовательность содержит аспарагиновую кислоту или консервативную замену аспарагиновой кислоты в положении 392, не содержит остаток цистеина в положениях 524 и 528, причем последовательность не встречается в природе и причем НА при экспрессии образует VLP. Консервативная замена аспарагиновой кислоты может, например, представлять собой глутамин, аспарагин, глутаминовую кислоту или серин. Не цистеин в положении 524 может представлять собой серин (S, Ser) или консервативную замену серина, а не цистеин в положении 528 может представлять собой лейцин (L, Leu) или консервативную замену лейцина. Консервативная замена серина (Se, Ser) может представлять собой, например, треонин (Т, Thr), аланин (А, Ala), аспарагин (N, Asn), аспарагиновую кислоту (D, Asp), глутамин (Q, Gln), глицин (G, Gly), глутаминовую кислоту (Е, Glu) или лизин (L, Lys). Консервативная замена лейцина может представлять собой, например, изолейцин (I, Не), валин (V, Val), метионин (М, Met), фенилаланин (F, Phe) или валин (V, Val).
[00202] В настоящем описании также представлена нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую модифицированный Н3 НА с заменой в положениях 392, 524 и 528, как описано выше, функционально связанную с регуляторной областью, активной в растении.
[00203] Например, нуклеотидные последовательности могут характеризоваться идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к нуклеотидной последовательности, кодирующей НА из Н3 A/Hongkong/4801/14 (SEQ ID NO: 102), причем нуклеотидная последовательность кодирует модифицированный белок Н3 НА, который содержит аспарагиновую кислоту или консервативную замену аспарагиновой кислоты в положении 392, не содержит остаток цистеина в положениях 524 и 528, причем последовательность не встречается в природе и причем НА при экспрессии образует VLP. Консервативная замена может представлять собой, например, глутамин, аспарагин, глутаминовую кислоту или серин.
[00204] Нуклеотидные последовательности могут характеризоваться идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 102, причем нуклеотидная последовательность кодирует модифицированный белок Н3 НА, который содержит аспарагиновую кислоту или консервативную замену аспарагиновой кислоты в положении 392, не содержит остаток цистеина в положениях 524 и 528, причем последовательность не встречается в природе и причем НА при экспрессии образует VLP. Консервативная замена может представлять собой, например, глутамин, аспарагин, глутаминовая кислота или серин.
[00205] Помимо остатков в положениях 392, 524 и 528, модифицированный Н3 НА может содержать дополнительные модифицированные остатки. Например, могут быть модифицированы один или более остатков в положении 525, 526 и 527. В неограничивающем примере модифицированный Н3 НА может содержать замещенные остатки в положениях 392, 524, 528 и одну или более замен в положениях 525, 526, 527 или их комбинацию.
[00206] Кроме того, представлен способ получения VLP, которые содержат модифицированный Н3 НА с заменой по меньшей мере в положениях 392, 524 и 528 и, необязательно, заменами в положениях 525, 526, 527 выше, в растении. Способ предусматривает введение нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный Н3 НА, функционально связанной с регуляторной областью, активной в растении, в растение или часть растения, и инкубацию растения или части растения в условиях, которые допускают экспрессию нуклеиновой кислоты, тем самым производя VLP.
[00207] Кроме того, представлен способ увеличения выхода VLP, которые содержат модифицированный Н3 НА с заменой по меньшей мере в положениях 392, 524 и 528 и, необязательно, заменами в положениях 525, 526, 527, как описано выше, в растении. Способ предусматривает введение нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный НА Н3, функционально связанной с регуляторной областью, активной в растении, в растение или часть растения, и инкубацию растения или части растения в условиях, которые позволяют экспрессию нуклеиновой кислоты, тем самым производя VLP.
[00208] В настоящем описании дополнительно предусмотрены VLP, содержащие Н3 НА с заменой по меньшей мере в положениях 392, 524 и 528 и, необязательно, заменами в положениях 525, 526, 527. VLP может быть получена способом, предусмотренным настоящим описанием. VLP, содержащие модифицированный Н3 НА, демонстрируют улучшенные характеристики по сравнению с VLP, которые содержат немодифицированный белок Н3 НА.
Модификация в положении 524-528 (CysTM) и 431
[00209] Согласно другому аспекту предусмотрен Н3 НА, который может содержать модифицированный остаток в положении 431 и может не содержать остаток цистеина в положениях 524 и 528 (нумерация Н3 A/Hongkong/4801/14, SEQ ID NO: 92). Кроме того, остатки в положении 525, 526 и/или 527 (нумерация Н3 A/Hongkong/4801/14) также могут быть модифицированы.
[00210] Как показано, например, на фиг. 7А и 7В, Н3 НА, содержащий остатки цистеина в положениях 524 и 528, модифицированные в не цистеин, и содержащий остаток в положении 431, модифицированный из лейцина в метионин, приводит к приблизительно 250%-ному увеличению титра гемагглютинации по сравнению с Н3 НА дикого типа.
[00211] Соответственно, предусмотрен модифицированный белок НА Н3, который содержит одну или более модификаций в положении 524, 525, 526, 527 или 528 и модификацию в положении 431. В неограничивающем примере модифицированный Н3 НА содержит модификации по меньшей мере в положениях 431, 524 и 528.
[00212] Остаток в положении 431 Н3 НА может быть модифицирован так, чтобы он не представлял собой лейцин. Например, остаток в положении 431 может быть модифицирован в метионин или консервативную замену метионина, например, лейцин, изолейцин, глутамин, валин или фенилаланин.
[00213] Например, модифицированный белок H1 НА может содержать аминокислотную последовательность, которая характеризуется идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к аминокислотной последовательности НА из Н3 A/Hongkong/4801/14 (SEQ ID NO: 92), причем аминокислотная последовательность содержит метионин или консервативную замену метионина в положении 431, не содержит остаток цистеина в положениях 524 и 528, причем последовательность не встречается в природе и причем НА при экспрессии образует VLP. Консервативной заменой метионина может быть, например, лейцин, изолейцин, глутамин, валин или фенилаланин. Не цистеин в положении 524 может представлять собой серин (S, Ser) или консервативную замену серина, а не цистеин в положении 528 может представлять собой лейцин (L, Leu) или консервативную замену лейцина. Консервативная замена серина (Se, Ser) может представлять собой, например, треонин (Т, Thr), аланин (A, Ala), аспарагин (N, Asn), аспарагиновую кислоту (D, Asp), глутамин (Q, Gin), глицин (G, Gly), глутаминовую кислоту (Е, Glu) или лизин (L, Lys). Консервативная замена лейцина может представлять собой, например, изолейцин (I, Не), валин (V, Val), метионин (М, Met), фенилаланин (F, Phe) или валин (V, Val).
[00214] В настоящем описании также предусмотрена нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую модифицированный Н3 НА с заменой в положениях 431, 524 и 528, как описано выше, функционально связанную с регуляторной областью, активной в растении.
[00215] Например, нуклеотидные последовательности могут характеризоваться идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к нуклеотидной последовательности, кодирующей НА из Н3 A/Hongkong/4801/14 (SEQ ID NO: 102), причем нуклеотидная последовательность кодирует модифицированный белок Н3 НА, который содержит метионин или консервативную замену метионина в положении 431, не содержит остаток цистеина в положениях 524 и 528, причем последовательность не встречается в природе и причем НА при экспрессии образует VLP. Консервативная замена может представлять собой, например, лейцин, изолейцин, глутамин, валин или фенилаланин.
[00216] Нуклеотидные последовательности могут характеризоваться идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 102, причем нуклеотидная последовательность кодирует модифицированный белок Н3 НА, который содержит метионин или консервативную замену метионина в положении 431, не содержит остаток цистеина в положениях 524 и 528, причем последовательность не встречается в природе и причем НА при экспрессии образует VLP. Консервативная замена может представлять собой, например, лейцин, изолейцин, глутамин, валин или фенилаланин.
[00217] Помимо остатков в положениях 431, 524 и 528, модифицированный Н3 НА может содержать дополнительные модифицированные остатки. Например, могут быть модифицированы один или более остатков в положении 525, 526 и 527. В неограничивающем примере модифицированный Н3 НА может содержать замещенные остатки в положениях 431, 524, 528 и одну или более замен в положениях 525, 526, 527 или их комбинацию.
[00218] Кроме того, представлен способ получения VLP, которые содержат модифицированный Н3 НА с заменой по меньшей мере в положениях 431, 524 и 528 и, необязательно, заменами в положениях 525, 526, 527 выше, в растении. Способ предусматривает введение нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный Н3 НА, функционально связанной с регуляторной областью, активной в растении, в растение или часть растения, и инкубацию растения или части растения в условиях, которые позволяют экспрессию нуклеиновой кислоты, тем самым производя VLP.
[00219] Кроме того, представлен способ увеличения выхода VLP, которые содержат модифицированный Н3 НА с заменой по меньшей мере в положениях 431, 524 и 528 и, необязательно, заменами в положениях 525, 526, 527, как описано выше, в растении. Способ предусматривает введение нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный Н3 НА, функционально связанной с регуляторной областью, активной в растении, в растение или часть растения, и инкубацию растения или части растения в условиях, которые позволяют экспрессию нуклеиновой кислоты, тем самым производя VLP.
[00220] В настоящем описании дополнительно предусмотрена VLP, содержащая Н3 НА с заменой по меньшей мере в положениях 431, 524 и 528 и, необязательно, заменами в положениях 525, 526, 527. VLP может быть получена способом, предусмотренным настоящим описанием. VLP, содержащие модифицированный Н3 НА, демонстрируют улучшенные характеристики по сравнению с VLP, которые содержат немодифицированный белок Н3 НА. Модификация в положении 524-528 (CysTM), 382 и 384
[00221] Согласно другому аспекту предусмотрен Н3 НА, который может содержать модифицированные остатки в положениях 382 и 384 и может не содержать остаток цистеина в положениях 524 и 528 (нумерация Н3 A/Hongkong/4801/14, SEQ ID NO: 92). Кроме того, остатки в положении 525, 526 и/или 527 (нумерация Н3 A/Hongkong/4801/14) также могут быть модифицированы.
[00222] Как показано, например, на фиг. 7Е, Н3 НА, содержащий остатки цистеина в положениях 524 и 528, модифицированные в не цистеин, и содержащий остаток в положении 382, модифицированный из аспарагина в аланин, и остаток в положении 384, модифицированный из лейцина в валин, дает увеличение титра гемагглютинации приблизительно на 400-500% по сравнению с Н3 НА дикого типа.
[00223] Соответственно, предусмотрен модифицированный белок Н3 НА, который содержит одну или более модификаций в положении 524, 525, 526, 527 или 528 и модификацию в положениях 382 и 384. В неограничивающем примере модифицированный Н3 НА содержит модификации по меньшей мере в положениях 382, 384, 524 и 528.
[00224] Остаток в положении 382 Н3 НА может быть модифицирован так, чтобы он не представлял собой аспарагин. Например, остаток в положении 382 может быть модифицирован, чтобы представлять собой гидрофобную аминокислоту, например, аланин или консервативную замену аланина, например, серин (S, Ser), глицин (G, Gly), треонин (Т, Thr), цистеин (С, Cys) или валин (V, Val). Остаток в положении 384 Н3 НА может быть модифицирован так, чтобы он не представлял собой лейцин. Например, остаток в положении 384 может быть модифицирован в другую гидрофобную аминокислоту, например, валин или консервативную замену валина, например, изолейцин, лейцин, метионин, аланин или треонин.
[00225] Например, модифицированный белок H1 НА может содержать аминокислотную последовательность, которая характеризуется идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к аминокислотной последовательности НА из Н3 A/Hongkong/4801/14 (SEQ ID NO: 92), причем аминокислотная последовательность содержит аланин (A, Ala) или консервативную замену аланина (A, Ala) в положении 382, валин или консервативную замену валина в положении 384, не содержит остаток цистеина в положениях 524 и 528 и причем последовательность не встречается в природе, и причем НА при экспрессии образует VLP. Консервативная замена аланина может, например, представлять собой серин (S, Ser), глицин (G, Gly), треонин (Т, Thr), цистеин (С, Cys) или валин (V, Val). Консервативная замена валина может представлять собой, например, изолейцин (I, Не), лейцин (L, Leu), метионин (М, Met), аланин A, Ala) или треонин (Т, Thr). Не цистеин в положении 524 может представлять собой серин (S, Ser) или консервативную замену серина, а не цистеин в положении 528 может представлять собой лейцин (L, Leu) или консервативную замену лейцина. Консервативная замена серина (Se, Ser) может представлять собой, например, треонин (Т, Thr), аланин (A, Ala), аспарагин (N, Asn), аспарагиновую кислоту (D, Asp), глутамин (Q, Gln), глицин (G, Gly), глутаминовую кислоту (Е, Glu) или лизин (L, Lys). Консервативная замена лейцина может представлять собой, например, изолейцин (I, Не), валин (V, Val), метионин (М, Met), фенилаланин (F, Phe) или валин (V, Val).
[00226] В настоящем описании также предусмотрена нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую модифицированный Н3 НА с заменой в положениях 382, 384, 524 и 528, как описано выше, функционально связанную с регуляторной областью, активной в растении.
[00227] Например, нуклеотидные последовательности могут характеризоваться идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к нуклеотидной последовательности, кодирующей НА из Н3 A/Hongkong/4801/14 (SEQ ID NO: 102), причем нуклеотидная последовательность кодирует модифицированный белок НА Н3, который содержит аланин (A, Ala) или консервативную замену аланина (A, Ala) в положении 382, валин или консервативную замену валина в положении 384, не содержит остаток цистеина в положениях 524 и 528, и причем последовательность не встречается в природе, и причем НА при экспрессии образует VLP. Консервативная замена аланина может, например, представлять собой серин (S, Ser), глицин (G, Gly), треонин (Т, Thr), цистеин (С, Cys) или валин (V, Val). Консервативная замена валина может представлять собой, например, изолейцин (I, Не), лейцин (L, Leu), метионин (М, Met), аланин A, Ala) или треонин (Т, Thr). Не цистеин в положении 524 может представлять собой серин (S, Ser) или консервативную замену серина, а не цистеин в положении 528 может представлять собой лейцин (L, Leu) или консервативную замену лейцина. Консервативная замена серина (Se, Ser) может представлять собой, например, треонин (Т, Thr), аланин (A, Ala), аспарагин (N, Asn), аспарагиновую кислоту (D, Asp), глутамин (Q, Gln), глицин (G, Gly), глутаминовую кислоту (Е, Glu) или лизин (L, Lys). Консервативная замена лейцина может представлять собой, например, изолейцин (I, Не), валин (V, Val), метионин (М, Met), фенилаланин (F, Phe) или валин (V, Val).
[00228] Нуклеотидные последовательности могут характеризоваться идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 102, причем нуклеотидная последовательность кодирует модифицированный белок Н3 НА, который содержит аланин (A, Ala) или консервативную замену аланина (A, Ala) в положении 382, валин или консервативную замену валина в положении 384, не содержит остаток цистеина в положениях 524 и 528 и причем последовательность не встречается в природе, и причем НА при экспрессии образует VLP. Консервативная замена аланина может, например, представлять собой серин (S, Ser), глицин (G, Gly), треонин (Т, Thr), цистеин (С, Cys) или валин (V, Val). Консервативная замена валина может представлять собой, например, изолейцин (I, Ile), лейцин (L, Leu), метионин (М, Met), аланин A, Ala) или треонин (Т, Thr). Не цистеин в положении 524 может представлять собой серин (S, Ser) или консервативную замену серина, а не цистеин в положении 528 может представлять собой лейцин (L, Leu) или консервативную замену лейцина. Консервативная замена серина (Se, Ser) может представлять собой, например, треонин (Т, Thr), аланин (A, Ala), аспарагин (N, Asn), аспарагиновую кислоту (D, Asp), глутамин (Q, Gln), глицин (G, Gly), глутаминовую кислоту (Е, Glu) или лизин (L, Lys). Консервативная замена лейцина может представлять собой, например, изолейцин (I, Не), валин (V, Val), метионин (М, Met), фенилаланин (F, Phe) или валин (V, Val).
[00229] В дополнение к остаткам в положении 382, 384, 524 и 528, модифицированный Н3 НА может содержать дополнительные модифицированные остатки. Например, могут быть модифицированы один или более остатков в положениях 525, 526 и 527. В неограничивающем примере модифицированный Н3 НА может содержать замещенные остатки в положениях 382, 384, 524, 528 и одну или более замен в положениях 525, 526, 527 или их комбинацию.
[00230] Кроме того, представлен способ получения VLP, которые содержат модифицированный Н3 НА с заменой по меньшей мере в положениях 382, 384, 524 и 528 и, необязательно, заменами в положениях 525, 526, 527 выше, в растении. Способ предусматривает введение нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный Н3 НА, функционально связанной с регуляторной областью, активной в растении, в растение или часть растения, и инкубацию растения или части растения в условиях, которые позволяют экспрессию нуклеиновой кислоты, тем самым производя VLP.
[00231] Кроме того, представлен способ увеличения выхода VLP, которые содержат модифицированный Н3 НА с заменой по меньшей мере в положениях 382, 384, 524 и 528 и, необязательно, с заменами в положениях 525, 526, 527, как описано выше, в растении. Способ предусматривает введение нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный Н3 НА, функционально связанной с регуляторной областью, активной в растении, в растение или часть растения, и инкубацию растения или части растения в условиях, которые позволяют экспрессию нуклеиновой кислоты, тем самым производя VLP.
[00232] В настоящем описании дополнительно предусмотрена VLP, содержащая Н3 НА с заменой по меньшей мере в положениях 382, 384, 524 и 528 и, необязательно, заменами в положениях 525, 526, 527. VLP может быть получена способом, как предусмотрено согласно данному описанию. VLP, содержащие модифицированный Н3 НА, демонстрируют улучшенные характеристики по сравнению с VLP, которые содержат немодифицированный белок Н3 НА.
[00233] В настоящем документе также представлены способы увеличения производства или выхода VLP, содержащих мутантные НА гриппа, в растениях. Например, способ может предусматривать введение нуклеиновой кислоты, кодирующей мутантный НА гриппа, как описано в настоящем документе, в растение, часть растения или растительную клетку. Нуклеиновая кислота, кодирующая мутантный НА гриппа, может быть оптимизирована в отношении частоты использования кодонов человека, повышенного содержания GC или их комбинации. Один или более чем один мутантный белок НА гриппа может быть экспрессирован в растении, части растения или растительной клетке, чтобы производить VLP, содержащую один или более чем один мутантный белок НА гриппа. Альтернативно, способ может предусматривать получение растения, части растения или растительной клетки, которые содержат нуклеиновую кислоту, кодирующую мутантный белок НА гриппа, для получения VLP, содержащей один или более чем один мутантный белок НА гриппа.
[00234] Способы получения VLP, содержащей мутантный НА гриппа, могут дополнительно предусматривать стадию введения второй последовательности нуклеиновой кислоты в растение, часть растения или растительную клетку, причем вторая нуклеиновая кислота кодирует белок протонного канала, который коэкспрессируется с мутантным НА гриппа. Например, белок протонного канала может представлять собой белок М2 подтипа гриппа А, такой как A/New Caledonia/20/99 М2. Коэкспрессия белка протонного канала может приводить к повышенному накоплению мутантного белка НА гриппа и/или VLP, содержащих мутантный белок НА гриппа, как, например, описано в публикации международной заявки WO 2013/044390, которая включена в настоящий документ посредством ссылки.
[00235] Кроме того, мутантный НА гриппа может дополнительно содержать модифицированную протеолитическую петлю или сайт расщепления, как описано в публикациях международных заявок WO 2013/044390 и WO 2014/153674 и которые включены в настоящий документ посредством ссылки.
[00236] Под «коэкспрессией» подразумевается введение и экспрессия двух или более нуклеотидных последовательностей, причем каждая из двух или более нуклеотидных последовательностей кодирует представляющий интерес белок или фрагмент представляющего интерес белка, в растении, части растения или растительной клетке. Две или более нуклеотидных последовательностей могут быть введены в растение, часть растения или растительную клетку в одном векторе, так что каждая из двух или более нуклеотидных последовательностей находится под контролем отдельной регуляторной области (например, содержащей двойную конструкцию). Альтернативно, две или более нуклеотидных последовательностей могут быть введены в растение, часть растения или растительную клетку в отдельных векторах (например, содержащих одиночные конструкции), и каждый вектор содержит соответствующие регуляторные области для экспрессии соответствующей нуклеиновой кислоты. Например, две нуклеотидные последовательности, каждая в отдельном векторе и введенная отдельным хозяевам Agrobacterium tumefaciens, могут быть совместно экспрессированы путем смешивания суспензий каждого хозяина A. tumefaciens в желаемом объеме (например, равный объем или соотношении каждого хозяина A. tumefaciens может быть изменено) перед вакуумной инфильтрацией. Таким образом, совместная инфильтрация множества суспензий А. tumifaciens позволяет коэкспрессию множества трансгенов.
[00237] Нуклеиновая кислота, кодирующая мутантный НА гриппа, как описано в настоящем документе, может дополнительно содержать последовательности, которые усиливают экспрессию мутантного НА гриппа в растении, части растения или растительной клетке. Последовательности, которые усиливают экспрессию, могут включать в себя энхансерный элемент вируса мозаики коровьего гороха (CPMV), функционально связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей мутантный белок НА гриппа.
[00238] Нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую модифицированный белок гемагглютинин (НА) гриппа, как описано в настоящем документе, может дополнительно содержать последовательности, которые усиливают экспрессию белка НА в растении, части растения или растительной клетке. Последовательности, которые усиливают экспрессию, могут включать в себя элемент энхансера CPMV или энхансер экспрессии растительного происхождения в функциональной связи с нуклеиновой кислотой, кодирующей модифицированный белок гемагглютинин гриппа (НА). Последовательность, кодирующая модифицированный гемагглютинин (НА) гриппа, также может быть оптимизирована в отношении частоты использования кодонов человека, повышенного содержания GC или их комбинации.
[00239] Используемый в настоящем документе термин «энхансерный элемент CPMV» относится к нуклеотидной последовательности, кодирующей 5'UTR, регулирующую полипептид RNA2 вируса мозаики коровьего гороха (CPMV) или модифицированную последовательность CPMV, как известно в настоящей области техники. Например, энхансерный элемент CPMV или энхансер экспрессии CPMV включает в себя нуклеотидную последовательность, как описано в публикации международной заявки WO 2015/14367; WO 2015/103704; WO 2007/135480; WO 2009/087391; Sainsbury F., and Lomonossoff G.P., (2008, Plant Physiol. 148: pp. 1212-1218), каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки. Последовательность энхансера CPMV может усиливать экспрессию гетерологичной открытой рамки считывания (ORF) ниже по ходу транскрипции, к которой они присоединены. Энхансер экспрессии CPMV может включать в себя CPMV НТ, CPMVX (где X=160, 155, 150, 114), например, CPMV 160, CPMVX+ (где X=160, 155, 150, 114), например, CPMV 160+, CPMV-HT+, CPMV HT+ [WT115] или CPMV HT+ [511] (публикации международной заявки WO 2015/143567; WO 2015/103704, которые включены в настоящий документ посредством ссылки). Энхансер экспрессии CPMV можно использовать в системе экспрессии растений, содержащей регуляторную область, которая функционально связана с последовательностью энхансера экспрессии CPMV и представляющей интерес нуклеотидной последовательностью.
[00240] Используемый в настоящем документе термин «энхансерный элемент CPMV» относится к нуклеотидной последовательности, кодирующей 5'UTR, регулирующую полипептид RNA2 вируса мозаики коровьего гороха (CPMV) или модифицированную последовательность CPMV, как известно в настоящей области техники. Например, энхансерный элемент CPMV или энхансер экспрессии CPMV включает в себя нуклеотидную последовательность, как описано в публикации международной заявки WO 2015/14367; WO 2015/103704; WO 2007/135480; WO 2009/087391; Sainsbury F., and Lomonossoff G.P., (2008, Plant Physiol. 148: pp. 1212-1218), каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки. Последовательность энхансера CPMV может усиливать экспрессию гетерологичной открытой рамки считывания (ORF) ниже по ходу транскрипции, к которой они присоединены. Энхансер экспрессии CPMV может включать в себя CPMV НТ, CPMVX, CPMVX+, CPMV-HT+, CPMV HT+ [WT115] или CPMV НТ+ [511] (публикации международной заявки WO 2015/14367; WO 2015/103704, которые включены в настоящий документ посредством ссылки). Энхансер экспрессии CPMV можно использовать в системе экспрессии растений, содержащей регуляторную область, которая функционально связана с последовательностью энхансера экспрессии CPMV и представляющей интерес нуклеотидной последовательностью.
[00241] Термин «5'UTR» или «5'-нетранслируемая область», или «5'-лидерная последовательность» относится к участкам мРНК, которые не транслируются. 5'UTR, как правило, начинается в сайте старта транскрипции и заканчивается непосредственно перед сайтом инициации трансляции или стартовым кодоном кодирующей области. 5'-UTR может модулировать стабильность и/или трансляцию транскрипта мРНК.
[00242] Используемый в настоящем документе термин «энхансер экспрессии растительного происхождения» относится к нуклеотидной последовательности, полученной из растения, нуклеотидной последовательности, кодирующей 5'UTR. Примеры энхансера экспрессии растительного происхождения описаны в предварительной заявке на патент США №62/643053 (поданной 14 марта 2018 г.; которая включена в настоящий документ посредством ссылки) или в публикации Diamos A.G. et al. (2016, Front Plt Sci. 7: 1-15; которая включена в настоящий документ посредством ссылки). Энхансер экспрессии растительного происхождения может быть выбран из nbMT78, nbATL75, nbDJ46, nbCHP79, nbEN42, atHSP69, atGRP62, atPK65, atRP46, nb30S72, nbGT61, nbPV55, nbPPI43, nbPM64 и nbH2A, как описано в US 62/533A). Энхансер экспрессии растительного происхождения может использоваться в системе экспрессии растений, содержащей регуляторную область, которая функционально связана с последовательностью энхансера экспрессии растительного происхождения и представляющей интерес нуклеотидной последовательностью.
[00243] Под «функционально связанными» подразумевается, что конкретные последовательности взаимодействуют либо прямо, либо опосредованно для выполнения намеченной функции, такой как опосредование или модуляция экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты. Взаимодействие функционально связанных последовательностей может, например, опосредоваться белками, которые взаимодействуют с функционально связанными последовательностями.
[00244] Когда один или более чем один мутантный белок НА гриппа экспрессируется в растении, части растения или растительной клетке, один или более чем один мутантный белок НА гриппа самособирается в VLP. Растение, часть растения или растительную клетку можно собирать в подходящих условиях экстракции и очистки для поддержания целостности VLP, и VLP, содержащие один или более чем один мутантный НА гриппа, можно очищать.
[00245] В настоящем изобретение также предусмотрено применение мутантного НА гриппа или VLP, содержащей мутантный НА гриппа, как описано в настоящем документе, для индукции иммунитета к инфекции гриппа у субъекта. В настоящем документе также раскрыто антитело или фрагмент антитела, полученные путем введения мутантного НА гриппа или VLP, содержащего мутантный НА гриппа, субъекту или животному-хозяину. Кроме того, предусмотрена композиция, содержащая эффективную дозу мутантного НА гриппа или VLP, содержащей мутантный НА гриппа, как описано в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель, адъювант, наполнитель или вспомогательное вещество для индукции иммунного ответа у субъекта. Также предусмотрена вакцина для индукции иммунного ответа у субъекта, которая содержит эффективную дозу мутантного НА гриппа.
[00246] В настоящем документе также представлены способы индукции иммунитета к инфекции гриппа у субъекта, предусматривающие введение субъекту мутантного НА гриппа или VLP, содержащей мутантный НА гриппа, перорально, интраназально, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно или подкожно.
[00247] Используемый в настоящем документе термин «вирус гриппа» относится к штамму оболочечных вирусов семейства Orthomyxoviridae, который характеризуется геномом отрицательно направленной одноцепочечной РНК. Геном вируса гриппа содержит восемь генных сегментов, кодирующих 12-14 белков в зависимости от штамма.
[00248] Существует четыре типа вируса гриппа: А, В, С и D, из которых грипп А или В являются возбудителями сезонных эпидемий заболеваний у людей. Грипп А дополнительно классифицируется на основе экспрессии подтипов гликопротеинов НА и нейраминидазы (NA).
[00249] Используемый в настоящем документе термин «гемагглютинин» или «НА» относится к тримерному лектину, который облегчает связывание частицы вируса гриппа с белками, содержащими сиаловую кислоту, на поверхности клеток-мишеней и опосредует высвобождение вирусного генома в клетку-мишень. Существует 18 различных подтипов НА (Н1-Н18). Белки НА состоят из двух структурных элементов: головки, которая является основной мишенью серопротекторных антител; и ножки. НА транслируется как единый полипептид, НАО (собранный в виде тримеров), который должен расщепляться сериновой эндопротеазой между субдоменами НА1 (~40 кДа) и НА2 (~20 кДа). После расщепления два домена белка с дисульфидной связью принимают необходимую конформацию, необходимую для вирусной инфекционности.
[00250] Белки НА гриппа А или модифицированные белки НА гриппа А, как раскрыто в настоящем документе, включают в себя любые известные белки НА, полученные из любого известного штамма гриппа А, а также модификации известных штаммов гриппа А, которые развиваются с течением времени. Например, НА гриппа может происходить из A/Hong Kong/4801/14 (H3N2), A/Minnesota/40/15 (H3N2), A/South Australia/1/16 (H3N2), A/Bangkok/3007/15 (H3N2), A/Switzerland/9715293/13 (H3N2), A/Mississippi/16/16 (H3N2) или A/Pennsylvania/09/2015 (H3N2). НА гриппа А может включать в себя НА, полученный из штаммов, где НА характеризуется идентичностью аминокислотной последовательности, составляющей приблизительно 30-100% или любое число между ними, по отношению к любому НА, полученному из штаммов гриппа А, перечисленных выше, при условии, что белок НА гриппа содержит по меньшей мере одну замену, как описано в настоящем документе, и способен образовывать VLP, индуцирует иммунный ответ при введении субъекту, индуцирует гемагглютинацию или их комбинацию.
[00251] Например, белки НА гриппа могут характеризоваться идентичностью аминокислотной последовательности (сходством последовательности, процентом идентичности, процентом сходства), составляющим 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100% или любое число между ними, по отношению к любым НА, полученным из перечисленных выше штаммов гриппа А, и содержать по меньшей мере одну замену, как описано в настоящем документе, и способны образовывать VLP, индуцировать иммунный ответ при введении субъекту, индуцировать гемагглютинацию или их комбинацию. Выравнивание аминокислотных последовательностей нескольких доменов НА гриппа А, которые не следует рассматривать как ограничивающие, показано на фиг. 1.
[00252] Термины «процент сходства», «сходство последовательностей», «процент идентичности» или «идентичность последовательностей», когда они относятся к конкретной последовательности, используются, например, как изложено в программном обеспечении GCG Университета Висконсина, или путем выравнивания вручную и визуального осмотра (смотрите, например, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. 1995, приложение). Способы выравнивания последовательностей для сравнения хорошо известны в настоящей области техники. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может быть проведено, например, с использованием алгоритма локальной гомологии Smith & Waterman, (1981, Adv. Appl. Math. 2:482), с помощью алгоритма выравнивания гомологии Needleman & Wunsch, (1970, J. Mol. Biol. 48:443), способом поиска сходства Pearson & Lipman, (1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444), с помощью компьютеризированных реализаций этих алгоритмов (например, GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в пакете программного обеспечения Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wis.).
[00253] Примером алгоритма, подходящего для определения процента идентичности последовательностей и сходства последовательностей, являются алгоритмы BLAST и BLAST 2.0, которые описаны в Altschul et al., (1977, Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402) и Altschul et al. (1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410), соответственно. BLAST и BLAST 2.0 используются с параметрами, описанными в настоящем документе, для определения процента идентичности последовательностей нуклеиновых кислот и белков по настоящему изобретению. Например, программа BLASTN (для нуклеотидных последовательностей) может использовать по умолчанию длину слова (W), равную 11, математическое ожидание (Е), равное 10, М=5, N=-4 и сравнение обеих цепей. Для аминокислотных последовательностей программа BLASTP может использовать по умолчанию длину слова 3 и математическое ожидание (Е) 10, а также оценочную матрицу BLOSUM62 (смотрите Henikoff & Henikoff, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915) выравнивания (В) 50, математическое ожидание (Е) 10, М=5, N=-4, и сравнение обеих цепей. Программное обеспечение для проведения анализов BLAST общедоступно через Национальный центр биотехнологической информации (смотрите URL: ncbi.nlm.nih.gov/).
[00254] Используемый в настоящем документе термин «вирусоподобная частица», VLP, «вирусоподобные частицы» или «VLP» относится к частицам вируса гриппа, которые содержат один или более чем один белок НА гриппа и которые самособираются в нереплицирующиеся, неинфекционные структуры вирусного капсида, лишенные всех частей генома гриппа.
Производство белка НА гриппа в растениях
Белок НА гриппа А включает в себя любой белок НА, содержащий аминокислотную последовательность, характеризующуюся идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим от приблизительно 30 до приблизительно 100%, от приблизительно 40 до приблизительно 100%, от приблизительно 50 до приблизительно 100%, от приблизительно 60 до приблизительно 100%, от приблизительно 70 до приблизительно 100%, от приблизительно 80 до приблизительно 100%, от приблизительно 85 до приблизительно 100%, от приблизительно 90 до приблизительно 100%, от 95 до приблизительно 100% или от приблизительно 97 до приблизительно 100%, от приблизительно 98 до приблизительно 100% или любое число между ними, по отношению к последовательности НА гриппа А из A/Hong Kong/4801/14 (H3N2, SEQ ID NO: 92), A/Minnesota/40/15 (H3N2, SEQ ID NO: 93), A/South Australia/1/16 (H3N2, SEQ ID NO: 94), A/Bangkok/3007/15 (H3N2, SEQ ID NO: 91), A/Switzerland/9715293/13 (H3N2, SEQ ID NO: 96), A/Mississippi/16/16 (H3N2, SEQ ID NO: 97) и A/Pennsylvania/09/2015 (H3N2, SEQ ID NO: 95), при условии, что белок НА гриппа содержит по меньшей мере одну замену, как описано в настоящем документе, и способен образовывать VLP, вызывает иммунный ответ при введении субъекту, вызывает гемагглютинацию или их комбинацию.
[00255] Кроме того, модифицированный белок НА гриппа включает в себя любой белок НА, содержащий аминокислотную последовательность, характеризующуюся идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим от приблизительно 30% до приблизительно 100%, от приблизительно 40% до приблизительно 100%, от приблизительно 50% до приблизительно 100%, от приблизительно 60%. до приблизительно 100%, от приблизительно 70% до приблизительно 100%, от приблизительно 80% до приблизительно 100%, от приблизительно 85% до приблизительно 100%, от приблизительно 90% до приблизительно 100%, от 95% до приблизительно 100% или от приблизительно 97% до приблизительно 100%, от приблизительно 98% до приблизительно 100% или любое число между ними, по отношению к последовательности из последовательностей SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, при условии, что белок НА гриппа содержит по меньшей мере одну замену, как описано в настоящем документе, и способен образовывать VLP, вызывает иммунный ответ при введении субъекту, индуцирует гемагглютинацию или их комбинацию.
[00256] Как описано в настоящем документе, одна или более специфических мутаций или модификаций НА гриппа приводит к повышенному накоплению белка НА и увеличению продукции VLP в растениях по сравнению с НА гриппа дикого типа.
[00257] Примеры мутантных белков НА гриппа А, характеризующихся повышенной продукцией НА и/или VLP вируса гриппа в растениях, включают в себя, без ограничения, следующие:
мутант CysTM A/Hong Kong/4801/14 Н3 (конструкция №3341, SEQ ID NO: 21), мутант N382A + L384V + CysTM A/Hong Kong/4801/14 Н3 (конструкция №3375, SEQ ID NO: 25); мутант CysTM A/Minnesota/40/15 Н3 (конструкция №3914, SEQ ID NO: 27); мутант N382A + L384V + CysTM A/Minnesota/40/15 Н3 (конструкция №3915, SEQ ID NO: 30); мутант CysTM A/S. Australia/1/16 Н3 (конструкция №3924, SEQ ID NO: 33); мутант N382A + L384V + CysTM A/S. Australia/1/16 Н3 (конструкция №3925, SEQ ID NO: 35); мутант N382A + L384V + CysTM A/Bangkok/3007/15 Н3 (конструкция №3905, SEQ ID NO: 39); мутант N382A A/Switzerland/9715293/13 Н3 (конструкция №3023, SEQ ID NO: 82); мутант L384V A/Switzerland/9715293/13 Н3 (конструкция №3034, SEQ ID NO: 84); мутант F392D A/Switzerland/9715293/13 Н3 (конструкция №3045, SEQ ID NO: 43; мутант L431M A/Switzerland/9715293/13 Н3 (конструкция №3022, SEQ ID NO: 47); мутант CysTM A/Switzerland/9715293/13 Н3 (конструкция №2811, SEQ ID NO: 49); мутант N382A + CysTM A/Switzerland/9715293/13 Н3 (конструкция №3063, SEQ ID NO: 53); мутант L384V + CysTM A/Switzerland/9715293/13 Н3 (конструкция №3074, SEQ ID NO: 57); мутант F392D + CysTM A/Switzerland/9715293/13 Н3 (конструкция №3085, SEQ ID NO: 59) и мутант L431M + CysTM A/Switzerland/9715293/13 Н3 (конструкция №3062, SEQ ID NO: 61), мутант CysTM A/Pennsylvania/09/2015 Н3 (конструкция №3313, SEQ ID NO: 86), мутант N382A + CysTM A/Pennsylvania/09/2015 Н3 (конструкция №3314, SEQ ID NO: 88) и мутант L384V + CysTM A/Pennsylvania/09/2015 Н3 (конструкция №3315, SEQ ID NO: 90).
Индукция иммунитета против инфекции гриппа
[00258] «Иммунный ответ», как правило, относится к ответу адаптивной иммунной системы субъекта. Адаптивная иммунная система, как правило, включает в себя гуморальный ответ и клеточно-опосредованный ответ. Гуморальный ответ представляет собой аспект иммунитета, который опосредуется секретируемыми антителами, производимыми клетками линии В-лимфоцитов (В-клетками). Секретируемые антитела связываются с антигенами на поверхности вторгающихся микробов (таких как вирусы или бактерии), что указывает на их уничтожение. Гуморальный иммунитет, как правило, используется для обозначения производства антител и процессов, которые его сопровождают, а также эффекторных функций антител, включая в себя активацию Th2-клеток и продукцию цитокинов, образование клеток памяти, опсониновую стимуляцию фагоцитоза, элиминацию патогенов и т.п. Термины «модулировать» или «модуляция» или подобные относятся к увеличению или уменьшению конкретного ответа или параметра, как определено любым из нескольких общеизвестных или используемых анализов, некоторые из которых приведены в настоящем документе в качестве примеров.
[00259] Клеточно-опосредованный ответ представляет собой иммунный ответ, который не включает в себя антитела, а скорее включает в себя активацию макрофагов, естественных клеток-киллеров (NK), антигенспецифических цитотоксических Т-лимфоцитов и высвобождение различных цитокинов в ответ на антиген. Клеточно-опосредованный иммунитет, как правило, используется для обозначения некоторой активации Th-клеток, активации Тс-клеток и опосредованных Т-клетками ответов. Клеточный иммунитет может иметь особое значение в ответ на вирусные инфекции.
[00260] Например, индукцию антигенспецифических CD8-положительных Т-лимфоцитов можно измерить с помощью анализа ELISPOT; стимуляцию CD4-положительных Т-лимфоцитов можно измерить с помощью анализа пролиферации. Титры антител к НА гриппа можно количественно определить с помощью анализа ELISA; изотипы антигенспецифических или перекрестно-реактивных антител также можно измерить с использованием антиизотипических антител (например, к IgG, IgA, IgE или IgM). Способы и технологии проведения таких анализов хорошо известны в настоящей области техники.
[00261] Присутствие или уровни цитокинов также могут быть определены количественно. Например, ответ Т-хелперных клеток (Th1/Th2) будет охарактеризован путем измерения клеток, секретирующих IFN-β и IL-4, с использованием ELISA (например, наборов BD Biosciences OptEIA). Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) или спленоциты, полученные от субъекта, можно культивировать, а супернатант анализировать. Т-лимфоциты также могут быть количественно определены с помощью сортировки активируемых флуоресценцией клеток (FACS) с использованием маркерных флуоресцентных меток и способов, известных в настоящей области техники.
[00262] Анализ микронейтрализации также может быть проведен для характеристики иммунного ответа у субъекта, смотрите, например, способы Rowe et al., 1973. Титры нейтрализации вируса могут быть определены количественно несколькими способами, включая в себя: подсчет гемолитических бляшек лизиса (анализ бляшкообразования) после фиксации/окрашивания клеток кристаллическим фиолетовым; исследование под микроскопом лизиса клеток в культуре in vitro и 2) ELISA и спектрофотометрическое определение вируса гриппа.
[00263] Используемый в настоящем документе термин «эпитоп» или «эпитопы» относится к структурной части антигена, с которой специфически связывается антитело.
[00264] Иммунные ответы, вызванные в ответ на введение белков НА гриппа дикого типа или VLP или мутантных белков НА гриппа или VLP растительного происхождения, могут, например, наблюдаться у мышей Balb/C. Образцы сыворотки крови, взятой у животных, могут быть проанализированы с помощью ELISA на Н3-специфические общие антитела IgG и IgA. Мыши, иммунизированные белками НА гриппа дикого типа или мутантными белками НА гриппа растительного происхождения, могут проявлять титры НА-специфических антител IgG в сыворотках для каждой группы лечения.
Экспрессия в растениях
[00265] Конструкции по настоящему изобретению могут быть введены в клетки растений с использованием плазмид Ti, плазмид Ri, векторов растительных вирусов, прямой трансформации ДНК, микроинъекции, электропорации и т.д. Для обзоров таких способов смотрите, например, Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academy Press, New York VIII, pp. 421-463 (1988); Geierson and Corey, Plant Molecular Biology, 2d Ed. (1988) и Miki and Iyer, Fundamentals of Gene Transfer in Plants. In Plant Metabolism, 2d Ed. DT. Dennis, DH Turpin, DD Lefebrvre, DB Layzell (eds), Addison Wesly, Langmans Ltd. London, pp. 561-579 (1997). Другие способы предусматривают прямое поглощение ДНК, использование липосом, электропорацию, например, с использованием протопластов, микроинъекцию, микрочастицы или нитевидные кристаллы и вакуумную инфильтрацию. Смотрите, например, Bilang, et al. (1991, Gene 100: 247-250), Scheid et al. (1991, Mol. Gen. Genet. 228: 104-112), Guerche et al. (1987, Plant Science 52: 111-116), Neuhause et al. (1987, Theor. Appl Genet. 75: 30-36), Klein et al. (2987, Nature 327: 70-73); Freeman et al. (1984, Plant Cell Physiol. 29: 1353), Howell et al. (1985, Science 227: 1229-1231), DeBlock et al. (1989, Plant Physiology 91: 694-701), Способы молекулярной биологии растений (Weissbach and Weissbach, eds., Academic Press Inc., 1988), Способы в молекулярной биологии растений (Schuler and Zielinski, eds., Academic Press Inc., 1989), публикации международной заявки WO 92/09696, WO 94/00583, Европейские патенты ЕР 331083, ЕР 175966, Liu and Lomonossoff (2002, J Virol Meth, 105: 343-348), Европейский патент ЕР 290395; публикацию международной заявки WO 8706614; патенты США №4945050; 5036006 и 5100792, заявку на патент США №08/438666, поданную 10 мая 1995 г., и 07/951715, поданную 25 сентября 1992 г. (все они включены в настоящий документ посредством ссылки).
[00266] Способы временной экспрессии могут быть использованы для экспрессии конструкций по настоящему изобретению (смотрите публикации D'Aoust et al., 2009, Methods in molecular biology, Vol 483, pages41-50; Liu and Lomonossoff, 2002, Journal of Virological Methods, 105:343-348, которые включены в настоящий документ посредством ссылки). Альтернативно, способ временной экспрессии на основе вакуума, как описано в публикации Kapila et al. (1997, Plant Sci. 122, 101-108; которая включена в настоящий документ посредством ссылки) или публикациях международных заявок WO 00/063400, WO 00/037663 (которые включены в настоящий документ посредством ссылки). Эти способы могут включать в себя, например, без ограничения, способ агроинокуляции или агроинфильтрации, шприцевой инфильтрации, однако, как указано выше, могут также использоваться другие временные способы. При агроинокуляции, агроинфильтрации или шприцевой инфильтрации смесь агробактерий, содержащая желаемую нуклеиновую кислоту, проникает в межклеточные пространства ткани, например, в листья, надземную часть растения (включая в себя стебель, листья и цветок), другие часть растения (стебель, корень, цветок) или все растение. После пересечения эпидермиса агробактерий инфицируют и переносят копии т-ДНК в клетки. т-ДНК транскрибируется эписомально, а мРНК транслируется, что приводит к производству представляющего интерес белка в инфицированных клетках, однако прохождение т-ДНК внутри ядра является временным.
[00267] Также рассматриваемой частью настоящего изобретения являются трансгенные растения, растительные клетки или семена, содержащие генную конструкцию по настоящему изобретению, которые можно использовать в качестве платформенных растений, подходящих для описанной в настоящем документе временной экспрессии белка. Способы регенерации целых растений из растительных клеток также известны в настоящей области техники (например, смотрите Guerineau and Mullineaux (1993, Plant transformation and expression vectors. In: Plant Molecular Biology Labfax (Croy RRD ed) Oxford, BIOS Scientific Publishers, pp 121-148). Как правило, трансформированные растительные клетки культивируют в подходящей среде, которая может содержать селективные средства, такие как антибиотики, причем селектируемые маркеры используются для облегчения идентификации трансформированных растительных клеток. После образования каллуса образование побегов можно стимулировать с помощью соответствующих гормонов растений в соответствии с известными способами, и побеги переносят в среду для укоренения для регенерации растений. Затем растения можно использовать для создания повторяющихся поколений либо из семян, либо с использованием способов вегетативного размножения. Трансгенные растения также могут быть получены без использования культуры ткани. Способы стабильной трансформации и регенерации этих организмов известны в настоящей области техники и известны специалисту в настоящей области техники. Доступные способы рассмотрены в Vasil et al. (Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol I, Il and III, Laboratory Procedures and Their Applications, Academic Press, 1984) и Weissbach and Weissbach (Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989). Способ получения трансформированных и регенерированных растений не является критическим для настоящего изобретения.
[00268] Если растения, части растений или растительные клетки должны быть трансформированы или котрансформированы двумя или более конструкциями нуклеиновых кислот, конструкция нуклеиновой кислоты может быть введена в Agrobacterium за один этап трансфекции, так что нуклеиновые кислоты объединяются и бактериальные клетки трансфицируются. В качестве альтернативы конструкции можно вводить серийно. В этом случае первую конструкцию вводят в Agrobacterium, как описано, клетки выращивают в селективных условиях (например, в присутствии антибиотика), где могут расти только однократно трансформированные бактерии. После этого первого этапа отбора в Agrobacterium вводят вторую конструкцию нуклеиновой кислоты, как описано, и клетки выращивают в условиях двойной селекции, при которых могут расти только дважды трансформированные бактерии. Затем дважды трансформированные бактерии могут быть использованы для трансформации растения, части растения или растительной клетки, как описано в настоящем документе, или могут быть подвергнуты дополнительной стадии трансформации для размещения третьей конструкции нуклеиновой кислоты.
[00269] Альтернативно, если растения, части растений или растительные клетки должны быть трансформированы или котрансформированы двумя или более конструкциями нуклеиновых кислот, конструкция нуклеиновой кислоты может быть введена в растение путем совместной инфильтрации смеси клеток Agrobacterium растения, части растения или растительной клетки, каждая клетка Agrobacterium может содержать одну или более конструкций для введения в растение. Для изменения относительных уровней экспрессии в растении, части растения или растительной клетке представляющей интерес нуклеотидной последовательности внутри конструкции во время стадии инфильтрации можно варьировать концентрацию различных популяций Agrobacteria, содержащих желаемые конструкции.
[00270] Настоящее изобретение будет дополнительно проиллюстрировано следующими примерами.
Пример 1. Конструкции НА гриппа
[00271] Конструкции НА гриппа получали с использованием способов, хорошо известных в настоящей области техники. Например, Н3 A-Switzerland/9715293/13 НА дикого типа, N382A A/Switzerland/9715293/13 Н3 НА и CysTM A-Switzerland-9715293-13 клонировали, как описано ниже. Других мутантов Н3 НА получали с использованием аналогичных способов, и праймеры, матрицы и продукты последовательностей НА описаны в примере 3 (производство НА и VLP гриппа в растениях) и в таблице 4.
[00272] Краткое описание белков НА дикого типа и мутантов, праймеров, матриц и продуктов представлено в таблице 4 ниже. Для конструкций Н3 гриппа, отличных от белков Н3 A/Switzerland/9715293/13 НА, которые клонировали в клонирующий вектор 1190 без М2, используемый клонирующий вектор интегрирует ген ионного канала гриппа М2 под контролем промотора и терминатора пластоцианина люцерны в дополнение к кассете экспрессии на основе промотора 2X35S/CPMV 160 + CPMV 3'UTR/NOS. Плазмиду номер 3556 (SEQ ID NO: 66; фиг. 5А) расщепляли рестрикционными эндонуклеазами SacII и Still и использовали для реакции In-Fusion.
Модификация Н3 НА
2X35S/CPMV 160/PDISP-HA0 Н3 A-Switzerland-9715293-13/NOS (конструкция номер 2801)
[00273] Последовательность, кодирующую зрелый НА0 из НА гриппа из Н3 A/Switzerland/9715293/13, слитую с сигнальным пептидом секреции PDI люцерны (PDISP), клонировали в систему экспрессии 2X35S/CPMV 160/NOS с использованием следующего способа на основе ПЦР. Фрагмент, содержащий кодирующую последовательность PDISP-H3 A/Switzerland/9715293/13, амплифицировали с использованием праймеров IF-CPMV (f15'UTR)_SpPDI.c (SEQ ID NO: 15) и IF-H3A-Ala.r (SEQ ID NO: 17), используя последовательность гена PDISP-H1 A/Switzerland/9715293/13 (SEQ ID NO: 9) в качестве матрицы. Продукт ПЦР клонировали в системе экспрессии 2X35S/CPMV 160/NOS с использованием системы клонирования In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). Конструкцию номер 1190 (фиг. 5В) расщепляли рестрикционными эндонуклеазами SacII и StuL и линеаризованную плазмиду использовали для реакции сборки In-Fusion. Конструкция номер 1190 представляет собой акцепторную плазмиду, предназначенную для клонирования «In Fusion» представляющих интерес генов в кассете экспрессии на основе 2X35S/CPMV 160/NOS. Она также включает в себя генную конструкцию для коэкспрессии супрессора сайленсинга TBSV Р19 под промотором и терминатором гена пластоцианина люцерны. Каркас представляет собой бинарную плазмиду pCAMBIA, а последовательность от левой границы к правой границе т-ДНК представлена в SEQ ID NO: 62. Полученной конструкции был присвоен номер 2801 (SEQ ID NO: 103). Аминокислотная последовательность зрелого НАО из НА гриппа из A/Switzerland/9715293/13, слитого с сигнальным пептидом секреции PDI люцерны (PDISP), представлена в SEQ ID NO: 10. Представление плазмиды 2801 представлено на фиг. 8J.
2X35S/CPMV 160/PDISP-HA0 Н3 A-Switzerland-9715293-13 (N382AYNOS (конструкция номер 3023)
[00274] Последовательность, кодирующую зрелый НАО из НА гриппа из A/Switzerland/9715293/13 (N382A), слитую с сигнальным пептидом секреции PDI люцерны (PDISP), клонировали в систему экспрессии 2X35S/CPMV 160/NOS с использованием следующего способа на основе ПЦР. В первом раунде ПЦР фрагмент, содержащий PDISP-H3 A/Switzerland/9715293/13 с мутированной аминокислотой N382A, амплифицировали с использованием праймеров IF-CPMV (f15'UTR) SpPDI.c (SEQ ID NO: 15) и Н3 Swi (N382A).r (SEQ ID NO: 50), используя последовательность гена PDISP-H3 A/Switzerland/9715293/13 (SEQ ID NO: 9) в качестве матрицы. Второй фрагмент, содержащий мутацию N382A с оставшейся частью Н3 A/Switzerland/9715293/13, амплифицировали с использованием H3_Swi (N382A).c (SEQ ID NO: 51) и IF-H3A-Ala.r (SEQ ID NO: 17), используя последовательность гена PDISP-H3 A/Switzerland/9715293/13 (SEQ ID NO: 9) в качестве матрицы. Затем продукты ПЦР из обеих амплификаций смешивали и использовали в качестве матрицы для второго раунда амплификации с использованием IF-CPMV (f15'UTR)_SpPDI.c (SEQ ID NO: 15) и IF-H3A-Ala.r (SEQ ID NO: 17) в качестве праймеров. Конечный продукт ПЦР клонировали в системе экспрессии 2X35S/CPMV 160/NOS с использованием системы клонирования In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). Конструкцию номер 1190 (фиг. 5В) расщепляли рестрикционными эндонуклеазами SacII и StuI, и линеаризованную плазмиду использовали для реакции сборки In-Fusion. Конструкция номер 1190 представляет собой акцепторную плазмиду, предназначенную для клонирования «In Fusion» представляющих интерес генов в кассете экспрессии на основе 2X35S/CPMV 160/NOS. Она также включает в себя генную конструкцию для коэкспрессии супрессора сайленсинга TBSV Р19 под промотором и терминатором гена пластоцианина люцерны. Каркас представляет собой бинарную плазмиду pCAMBIA, а последовательность от левой границы к правой границе т-ДНК представлена в SEQ ID NO: 62. Полученной конструкции был присвоен номер 3023 (SEQ ID NO: 104). Аминокислотная последовательность мутированного PDISP-H3 А-Switzerland-9715293-13 (N382A) представлена в SEQ ID NO: 82. Представление плазмиды 3023 представлено на фиг. 4С.
2X35S/CPMV 160/PDISP-HA0 Н3 A-Switzerland-9715293-13 (CvsTM)/NOS (конструкция номер 2811)
[00275] Последовательность, кодирующую зрелый НАО из НА гриппа из A/Switzerland/9715293/13 (CysTM), слитую с сигнальным пептидом секреции PDI люцерны (PDISP), клонировали в систему экспрессии 2X35S/CPMV 160/NOS с использованием следующего способа на основе ПЦР. В первом раунде ПЦР фрагмент, содержащий PDISP-H3 A/Switzerland/9715293/13 с мутированными аминокислотами CysTM, амплифицировали с использованием праймеров IF-CPMV (f15'UTR)_SpPDI.c (SEQ ID NO: 15) и H3_Swi_SLVLL.r (SEQ ID NO: 18), используя последовательность гена PDISP-H3 A/Switzerland/9715293/13 (SEQ ID NO: 9) в качестве матрицы. Второй фрагмент, содержащий мутации CysTm с оставшейся частью Н3 A/Switzerland/9715293/13, амплифицировали с использованием H3_Swi_SLVLL.c (SEQ ID NO: 19) и IF-H3A-Ala.r (SEQ ID NO: 17), используя последовательность гена PDISP-H3 A/Switzerland/9715293/13 (SEQ ID NO: 9) в качестве матрицы. Затем продукты ПЦР из обеих амплификаций смешивали и использовали в качестве матрицы для второго раунда амплификации с использованием IF-CPMV (fl5TJTR)_SpPDI.c (SEQ ID NO: 15) и IF-H3A-Ala.r (SEQ ID NO: 17) в качестве праймеров. Конечный продукт ПЦР клонировали в системе экспрессии 2X35S/CPMV 160/NOS с использованием системы клонирования In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). Конструкцию номер 1190 (фиг. 5B) расщепляли рестрикционными эндонуклеазами SacII и StuI, и линеаризованную плазмиду использовали для реакции сборки In-Fusion. Конструкция номер 1190 представляет собой акцепторную плазмиду, предназначенную для клонирования «In Fusion» представляющих интерес генов в кассете экспрессии на основе 2X35S/CPMV 160/NOS. Она также включает в себя генную конструкцию для совместной экспрессии супрессора сайленсинга TBSV Р19 под промотором и терминатором гена пластоцианина люцерны. Каркас представляет собой бинарную плазмиду pCAMBIA, а последовательность от левой границы к правой границе т-ДНК представлена в SEQ ID NO: 62. Полученной конструкции был присвоен номер 2811 (SEQ ID NO: 105). Аминокислотная последовательность мутированного PDISP-H3 А-Switzerland-9715293-13 (CysTM) представлена в SEQ ID NO: 49. Представление плазмиды 2811 представлено на фиг. 8K.
Пример 2: Способы
Трансфекция Agrobacterium tumefaciens
[00276] Штамм AGL1 Agrobacterium tumefaciens трансфицировали электропорацией векторами экспрессии НА гриппа дикого типа или мутантного НА гриппа с использованием способов, описанных D'Aoust et al., 2008 (Plant Biotech. J. 6:930-40). Трансфицированные Agrobacterium выращивали в среде YEB с добавлением 10 мМ 2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты (MES), 20 мкМ ацетосирингона, 50 мкг/мл канамицина и 25 мкг/мл карбенициллина с рН 5,6 до OD600 от 0,6 до 1,6. Суспензии Agrobacterium перед использованием центрифугировали и ресуспендировали в среде для инфильтрации (10 мМ MgCl2 и 10 мМ MES рН 5,6).
Приготовление растительной биомассы, инокулята и агроинфильтрация
[00277] Растения N. benthamiana выращивали из семян на ровных поверхностях, заполненных коммерческим субстратом из торфяного мха. Растениям позволяли расти в теплице при фотопериоде 16/8 и температурном режиме 25°С днем/20°С ночью. Через три недели после посева собирали отдельные ростки, пересаживали в горшки и оставляли для роста в теплице еще на три недели при тех же условиях окружающей среды.
[00278] Агробактерии, трансфицированные каждым экспрессирующим вектором НА гриппа дикого типа или мутантным НА гриппа, выращивали в среде YEB с добавлением 10 мМ 2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты (MES), 20 мкМ ацетосирингона, 50 мкг/мл канамицина и 25 мкМ мкг/мл карбенициллина рН 5,6 до тех пор, пока они не достигали OD600 от 0,6 до 1,6. Суспензии Agrobacterium центрифугировали перед использованием и ресуспендировали в среде для инфильтрации (10 мМ MgCl2 и 10 мМ MES рН 5,6) и хранили в течение ночи при температуре 4°С. В день инфильтрации партии культур разводили в 2,5 объемах культур и давали нагреться перед использованием. Целые растения N. benthamiana помещали вверх дном в бактериальную суспензию в герметичный резервуар из нержавеющей стали под вакуумом 20-40 мм рт.ст. на 2 мин. Растения возвращали в теплицу на 6 или 9 дней инкубационного периода до сбора урожая.
Сбор листьев и экстракция общего белка
[00279] Белки экстрагировали из свежей биомассы, разрезанной на части размером ~1 см2, путем ферментативной экстракции в течение ночи при комнатной температуре с использованием орбитального шейкера. Затем суспензию фильтровали через нейлоновый фильтр с большими порами для удаления грубой нерасщепленной растительной ткани.
[00280] Для получения «полных технологических выходов» суспензию центрифугировали для удаления протопластов и внутриклеточных загрязнений. Супернатант очищали глубокой фильтрацией. Осветленную фракцию затем загружали через катионообменную колонку со стадией ступенчатого элюирования с увеличивающимися концентрациями NaCl. Очищенные VLP концентрировали с помощью TFF, подвергали диафильтрации против буфера для состава и пропускали через фильтр. Содержание белка в очищенных VLP анализировали с помощью анализа ВСА, а активность анализировали с помощью анализа гемагглютинации. Относительные выходы получали путем сравнения выходов белков из новой конструкции и нативной конструкции (или с CysTM для штаммов Н3), использованной в качестве контроля
[00281] Для получения «выходов после градиента плотности» суспензию центрифугировали для удаления протопластов и внутриклеточных загрязнений. Супернатант дополнительно центрифугировали для удаления дополнительных частиц. Супернатант осветляли глубокой фильтрацией с использованием стекловолоконного фильтра. Затем осветленную фракцию загружали в прерывистый градиент плотности йодиксанола. Центрифугирование в градиенте плотности разделения выполняли следующим образом: готовили пробирки объемом 38 мл, содержащие прерывистый градиент плотности йодиксанола в Трис-буфере (последовательные слои из 35%, 30%, 25%, 20%, 15, 10% и 5%), которые покрывали осветленным экстрактом. Градиенты центрифугировали при 120000 g в течение 2 часов (4°С). После центрифугирования первые 5 мл, собранные снизу вверх, отбрасывали, а следующие 5 мл собирали для анализа содержания белка (ВСА), измерения активности (анализ гемагглютинации) и измерения интенсивности полосы НАО на ДСН-ПААГ в восстановленных условиях (денситометрия). Относительные выходы получали путем сравнения интенсивности полосы НАО от новой конструкции с нативной конструкцией (или CysTM для штаммов Н3), использованной в качестве контроля.
Анализ гемагглютинации
[00282] Анализ гемагглютинации основывался на способе, описанном Nayak and Reichl (2004). Вкратце, последовательные двойные разведения исследуемых образцов (100 мкл) проводили в 96-луночных микротитрационных планшетах с V-образным дном, содержащих 100 мкл PBS, оставляя 100 мкл разбавленного образца на лунку. В каждую лунку добавляли сто микролитров 0,5% суспензии эритроцитов морской свинки (Bio Link Inc., Сиракузы, Нью-Йорк), и планшеты инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре. Обратную величину наивысшего разведения, показывающую полную гемагглютинацию, регистрировали как активность НА. Параллельно, рекомбинантный стандарт НА (A/Vietnam/1203/2004 H5N1) (Protein Science Corporation, Мериден, Коннектикут) разводили в PBS и использовали в качестве контроля на каждом планшете.
Анализ белков и иммуноблоттинг
[00283] Иммуноблоттинг выполняли при первой инкубации с первичным моноклональным антителом, разведенным 1/500 в 2% обезжиренном молоке в 0,1% TBS-Tween 20. Конъюгированные с пероксидазой козьи антитела к мышиным (Jackson Immunoresearch, номер по каталогу 115-035-146), разведенные 1/10000, использовали в качестве вторичных антител для обнаружения хемилюминесценции в 2% обезжиренном молоке в TBS-Tween 20 0,1%. Иммунореактивные комплексы определяли хемилюминесценцией с использованием люминола в качестве субстрата (Roche Diagnostics Corporation). Конъюгацию человеческого антитела IgG с ферментом пероксидазой хрена проводили с использованием набора для конъюгации активированной пероксидазы EZ-Link Plus® (Pierce, Rockford, Ill.).
Пример 3: Производство НА и VLP гриппа в растениях
Модификация Н3 НА I
[00284] Конструкции НА гриппа получали с использованием способов, хорошо известных в настоящей области техники (смотрите пример 1). Краткое описание белков НА дикого типа и мутировавших белков НА, праймеров, матриц и продуктов представлено в таблице 4 ниже. Используемые последовательности представлены в примере 4 и в списке последовательностей.
Мутант N382A A/Switzerland/9715293/13 Н3
Мутант N382A A/Switzerland/9715293/13 Н3 (конструкция №3023) конструировали путем мутации аспарагина в положении 382 A/Switzerland/9715293/13 Н3 дикого типа в аланин. Как показано на фиг. 2, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №3023, показали приблизительно 30%-ное увеличение титра гемагглютинации экстрактами из растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с использованием A/Switzerland/9715293/13 Н3 дикого типа (конструкция №2801).
Мутант L384VA/Switzerland/9715293/13 Н3
[00285] Мутант L384V A/Switzerland/9715293/13 Н3 (конструкция №3034) конструировали путем мутации лейцина в положении 384 A/Switzerland/9715293/13 Н3 дикого типа в валин. Как показано на фиг. 2, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №3034, демонстрировали приблизительно 100%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованными с использованием A/Switzerland/9715293/13 Н3 дикого типа (конструкция №2801).
Мутант F392D A/Switzerland/9715293/13 Н3
[00286] Мутант F392D A/Switzerland/9715293/13 Н3 конструировали путем мутации фенилаланина в положении 392 A/Switzerland/9715293/13 Н3 дикого типа в аспарагиновую кислоту (конструкция №3045). Как показано на фиг. 2, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №3045, демонстрировали приблизительно 40%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованными с использованием A/Switzerland/9715293/13 Н3 дикого типа (конструкция №2801).
Мутант L431M A/Switzerland/9715293/13 Н3
[00287] Мутант L431M A/Switzerland/9715293/13 Н3 конструировали путем мутации лейцина в положении 431 A/Switzerland/9715293/13 Н3 дикого типа в метионин (конструкция №3022). Как показано на фиг. 2, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №3022, демонстрировали приблизительно 70%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованными с использованием A/Switzerland/9715293/13 Н3 дикого типа (конструкция №2811).
[00288] Одна или более описанных в настоящем документе мутаций специфически увеличивают продукцию белка НА гриппа и выход VLP у растений. Было замечено, что мутации в других положениях значительно снижали или не оказывали значительного влияния на накопление белка НА гриппа или продукцию VLP в растительных клетках.
[00289] Повышенные титры гемагглютинации, достигаемые с белками НА гриппа, содержащими одну или более описанных в настоящем документе мутаций, также наблюдались как специфические для НА гриппа. Подобное увеличение не наблюдалось у растений, агроинфильтрованных конструкциями, кодирующими мутантные НА гриппа, полученные из штаммов, не относящихся к Н3.
[00290] Например, мутант Н5 F393D A/Indonesia/5/2005 конструировали путем мутации фенилаланина в положении 393 A/Indonesia/5/2005 Н5 дикого типа в аспарагиновую кислоту (конструкция №3680). Как показано на фиг. 3, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №3680, демонстрировали приблизительно 98%-ное снижение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с использованием A/Indonesia/5/2005 Н5 дикого типа (конструкция №2295).
[00291] Точно так же очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием мутанта F392D A/Egypt/N04915/2014 Н5 (конструкция №3690), демонстрировали приблизительно 99%-ное снижение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с использованием A/Egypt/N04915/2014 Н5 дикого типа (конструкция №3645) (смотрите фиг. 3, таблицу 7).
Модификация Н3 НА II
Мутант CysTM A/Switzerland/9715293/13 Н3
[00292] Мутант CysTM A/Switzerland/9715293/13 Н3 (конструкция №2811) конструировали путем замещения последовательности «CFLLC» в положениях 524-528 (SEQ ID NO: 99) A/Switzerland/9715293/13 Н3 дикого типа на «SLVLL» (SEQ ID NO: 98). Как показано на фиг. 6А, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №2811, показали приблизительно 60%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с использованием A/Switzerland/9715293/13 Н3 дикого типа (конструкция №2801).
Мутант CysTM A/Pennsylvania/09/2015 Н3
[00293] Мутант CysTM A/Pennsylvania/09/2015 Н3 (конструкция №3313) конструировали путем замещения последовательности «CFLLC» в положениях 524-528 (SEQ ID NO: 99) A/Pennsylvania/09/2015 Н3 дикого типа на «SLVLL» (SEQ ID NO: 98). Как показано на фиг. 7С, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №3313, демонстрировали приблизительно 100%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с использованием A/Pennsylvania/09/2015 Н3 дикого типа (конструкция №3312).
Мутант N382A + CysTM A/Switzerland/9715293/13 Н3
[00294] Мутант N382A + CysTM A/Switzerland/9715293/13 Н3 (конструкция №3063) конструировали путем мутации аспарагина в положении 382 A/Switzerland/9715293/13 Н3 дикого типа в аланин и замещения последовательности «CFLLC» в положениях 524-528 (SEQ ID NO: 99) на «SLVLL» (SEQ ID NO: 98). Как показано на фиг. 7А, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №3063, демонстрировали приблизительно 160%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с использованием A/Switzerland/9715293/13 Н3 дикого типа (конструкция №2801). Как дополнительно показано на фиг. 7В, растения N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №3063, показали приблизительно 30%-ное увеличение выхода VLP после очистки в градиенте йодиксанола по сравнению с растениями, инфильтрованными с использованием мутанта CysTM A/Switzerland/9715293/13 Н3 (конструкция №2811).
Мутант N382A + CysTM A/Pennsylvania/09/2015 Н3
[00295] Мутант N382A + CysTM A/Pennsylvania/09/2015 Н3 (конструкция №3314) конструировали путем мутации аспарагина в положении 382 A/Pennsylvania/09/2015 Н3 дикого типа в аланин и замещения последовательности «CFLLC» в положениях 524-528 (SEQ ID NO: 99) на «SLVLL» (SEQ ID NO: 98). Как показано на фиг. 7С, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №3314, показали приблизительно 300%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с использованием A/Pennsylvania/09/2015 Н3 дикого типа (конструкция №3312).
Мутант L384V + CysTM A/Switzerland/9715293/13 Н3
[00296] Мутант L384V + CysTM A/Switzerland/9715293/13 Н3 (конструкция №3074) конструировали путем мутации лейцина в положении 384 A/Switzerland/9715293/13 Н3 дикого типа в валин и замещения последовательности «CFLLC» в положениях 524-528 (SEQ ID NO: 99) на «SLVLL» (SEQ ID NO: 98). Как показано на фиг. 7С, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №3074, продемонстрировали приблизительно 380%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с использованием A/Switzerland/9715293/13 Н3 дикого типа (конструкция №2801). Кроме того, как показано на фиг. 7В, растения N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №3074, показали приблизительно 50%-ное увеличение выхода VLP после очистки градиентом сахарозы по сравнению с растениями, инфильтрованными с использованием мутанта CysTM A/Switzerland/9715293/13 Н3 (конструкция №2811).
Мутант L384V + CysTM A/Pennsylvania/09/2015 Н3
[00297] Мутант L384V + CysTM A/Pennsylvania/09/2015 Н3 (конструкция №3315) конструировали путем мутации лейцина в положении 384 A/Pennsylvania/09/2015 Н3 дикого типа в валин и замещения последовательности «CFLLC» в положениях 524-528 (SEQ ID NO: 99) на «SLVLL» (SEQ ID NO: 98). Как показано на фиг. 7С, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №3315, демонстрировали приблизительно 380%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованными с использованием A/Pennsylvania/09/2015 Н3 дикого типа (конструкция №3312).
Мутант F392D + CysTM A/Switzerland/9715293/13 Н3
[00298] Мутант F392D + CysTM A/Switzerland/9715293/13 Н3 (конструкция №3085) конструировали путем мутации фенилаланина в положении 392 A/Switzerland/9715293/13 Н3 дикого типа в аспарагиновую кислоту и замещения последовательности «CFLLC» в положениях 524-528 (SEQ ID NO: 99) на «SLVLL» (SEQ ID NO: 98). Как показано на фиг. 7А, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №3085, демонстрировали приблизительно 170%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с использованием A/Switzerland/9715293/13 Н3 дикого типа (конструкция №2801).
Мутант L431M + CysTM A/Switzerland/9715293/13 Н3
[00299] Мутант L431M + CysTM A/Switzerland/9715293/13 Н3 (конструкция №3062) конструировали путем мутации лейцина в положении 431 A/Switzerland/9715293/13 Н3 дикого типа в метионин и замещения последовательности «CFLLC» в положениях 524-528 (SEQ ID NO: 99) на «SLVLL» (SEQ ID NO: 98). Как показано на фиг. 7А, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №3062, демонстрировали приблизительно 150%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с использованием A/Switzerland/9715293/13 Н3 дикого типа (конструкция №2801).
Мутант N382A + L384V + CysTM A/Hong Kong/4801/14 Н3
[00300] Мутант N382A + L384V + CysTM A/Hong Kong/4801/14 Н3 (конструкция №3375) конструировали путем мутации аспарагина в положении 382 A/Hong Kong/4801/14 дикого типа в остаток аланина, лейцина в положении 384 в остаток валина и последовательности «CFLLC» в положениях 524-528 (SEQ ID NO: 99) в «SLVLL» (SEQ ID NO: 98). Как показано на фиг. 7Е, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №3375, демонстрировали приблизительно 300%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с использованием мутанта CysTM A/Hong Kong/4801/14 Н3 (конструкция №3341).
Мутант N382A + L384V + CysTM A/Minnesota/40/15 Н3
[00301] Мутант N382A + L384V + CysTM A/Minnesota/40/15 Н3 (конструкция №3915) конструировали путем мутации аспарагина в положении 382 A/Minnesota/40/15 дикого типа в остаток аланина, лейцин в положении 384 в остаток валина и последовательность «CFLLC» в положениях 524-528 (SEQ ID NO: 99) в «SLVLL» (SEQ ID NO: 98). Как показано на фиг.7Е, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №3915, демонстрировали приблизительно 400%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с использованием мутанта CysTM A/Minnesota/40/15 Н3 (конструкция №3914).
Мутант N382A + L384V + CysTMA/S. Australia/1/1 6 Н3
[00302] Мутант N382A + L384V + CysTM A/S. Australia/1/16 Н3 (конструкция №3925) конструировали путем мутации аспарагина в положении 382 A/S. Australia/1/16 дикого типа в остаток аланина, лейцин в положении 384 в остаток валина и последовательность «CFLLC» в положениях 524-528 (SEQ ID NO: 99) в «SLVLL» (SEQ ID NO: 98). Как показано на фиг. 7D и 7Е, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №3925, демонстрировали приблизительно 400%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с использованием мутанта CysTM A/S. Australia/1/16 Н3 (конструкция №3924).
Мутант N382A + L384V + CysTM A/Bangkok/3007/15 Н3
[00303] Мутант N382A + L384V + CysTM A/Bangkok/3007/15 Н3 (конструкция №3905) конструировали путем мутации аспарагина в положении 382 A/Bangkok/3007/15 дикого типа в остаток аланина, лейцин в положении 384 в остаток валина и последовательность «CFLLC» в положениях 524-528 (SEQ ID NO: 99) в «SLVLL» (SEQ ID NO: 98). Как показано на фиг. 7Е, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №3905, показали приблизительно 400%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с использованием мутанта CysTM A/Bangkok/3007/15 Н3 (конструкция №3904).
[00304] Одна или более описанных в настоящем документе мутаций специфически увеличивают продукцию белка НА гриппа и выход VLP у растений. Было замечено, что мутации в других положениях значительно снижали или не оказывали значительного влияния на накопление белка НА гриппа или продукцию VLP в растительных клетках.
[00305] Повышенные титры гемагглютинации, достигнутые с белками НА гриппа, содержащими одну или более описанных в настоящем документе мутаций, также были специфичны для НА гриппа. Подобное увеличение не наблюдалось у растений, агроинфильтрованных конструкциями, кодирующими мутантные НА гриппа, полученные из штаммов, не относящихся к Н3.
[00306] Например, мутант Н5 F393D A/Indonesia/5/2005 конструировали путем мутации фенилаланина в положении 393 A/Indonesia/5/2005 Н5 дикого типа в аспарагиновую кислоту (конструкция №3680). Как показано на фиг. 3, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №3680, демонстрировали приблизительно 98%-ное снижение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с использованием A/Indonesia/5/2005 Н5 дикого типа (конструкция №2295).
[00307] Точно так же очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с использованием мутанта F392D A/Egypt/N04915/2014 Н5 (конструкция №3690), демонстрировали приблизительно 99%-ное снижение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с использованием A/Egypt/N04915/2014 Н5 дикого типа (конструкция №3690) (смотрите фиг. 3).
Пример 3: Титр гемагглютинации, выходы после градиентов плотности и полные технологические выходы
[00308] Сводная информация измеренного титра гемагглютинации представлена в таблицах 5 и 6А. Титр гемагглютинации измеряли, как описано в примере 2. Относительный титр гемагглютинации получали путем сравнения титра гемагглютинации мутированного или модифицированного белка НА либо с НА дикого типа (таблица 5), либо с мутантным белком НА CysTM (таблица 6А).
[00309] Сводная информация измеренных выходов после градиентов плотности приведена в таблицах А 5В и С5В. Выходы после градиентов плотности измеряли, как описано в примере 2. Относительные выходы получали путем сравнения интенсивности полосы НА0 от мутированного или модифицированного белка НА либо с интенсивностью полосы НА0 НА дикого типа (таблица А 5В), либо с интенсивностью полосы НА0 мутантного белка НА CysTM (таблица 6В).
[00310] Сводная информация измеренного полного технологического выхода приведена в таблице 6С. Полный технологический выход получали, как описано выше в примере 2. Относительные выходы получали путем сравнения выхода белка из мутированного или модифицированного белка НА либо с выходом белка НА дикого типа, либо с выходом мутантного белка НА CysTM (таблица 6С).
Пример 4: Последовательности
[00311] Использовали следующие последовательности (смотрите также таблицу 4):
[00312] Все цитаты включены в настоящий документ посредством ссылки.
[00313] Настоящее изобретение было описано в отношении одного или более вариантов осуществления. Однако специалистам в настоящей области техники будет очевидно, что можно сделать ряд вариаций и модификаций, не выходя за пределы объема настоящего изобретения, определенного в формуле изобретения.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> МЕДИКАГО ИНК.
<120> МУТАНТЫ ГЕМАГГЛЮТИНИНА ВИРУСА ГРИППА
<130> V811304WO1
<150> US 62/690,780
<151> 2018-06-27
<160> 105
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1725
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК PDI-H3 HK
<400> 1
atggcgaaaa acgttgcgat tttcggctta ttgttttctc ttcttgtgtt ggttccttct 60
cagatcttcg cgcaaaaaat tcctggaaat gacaatagca cggcaacgct gtgccttggg 120
catcatgcag taccaaacgg aacgatagtg aaaacaatca cgaatgaccg aattgaagtt 180
actaatgcta ctgagctggt tcagaattcc tcaataggtg aaatatgcga cagtcctcat 240
cagatccttg atggagaaaa ctgcacacta atagatgctc tattgggaga ccctcagtgt 300
gatggctttc aaaataagaa atgggacctt tttgttgaac gaagcaaagc ctacagcaac 360
tgttaccctt atgatgtgcc ggattatgcc tcccttaggt cactagttgc ctcatccggc 420
acactggagt ttaacaatga aagcttcaat tggactggag tcactcaaaa cggaacaagt 480
tctgcttgca taaggagatc tagtagtagt ttctttagta gattaaattg gttgacccac 540
ttaaactaca catacccagc attgaacgtg actatgccaa acaatgaaca atttgacaaa 600
ttgtacattt ggggggttca ccacccgggt acggacaagg accaaatctt cctgtatgct 660
caatcatcag gaagaatcac agtatctacc aaaagaagcc aacaagctgt aatcccaaat 720
atcggatcta gacccagaat aagggatatc cctagcagaa taagcatcta ttggacaata 780
gtaaaaccgg gagacatact tttgattaac agcacaggga atctaattgc tcctaggggt 840
tacttcaaaa tacgaagtgg gaaaagctca ataatgagat cagatgcacc cattggcaaa 900
tgcaagtctg aatgcatcac tccaaatgga agcattccca atgacaaacc attccaaaat 960
gtaaacagga tcacatacgg ggcctgtccc agatatgtta agcatagcac tctgaaattg 1020
gcaacaggaa tgcgaaatgt accagagaaa caaactagag gcatatttgg tgcaatagcg 1080
ggtttcatag aaaatggttg ggagggaatg gtggatggtt ggtacggttt caggcatcaa 1140
aattctgagg gaagaggaca agcagcagat ctcaaaagca ctcaagcagc aatcgatcaa 1200
atcaatggga agctgaatcg attgatcggg aaaaccaacg agaaattcca tcagattgaa 1260
aaagaattct cagaagtaga aggaagaatt caggaccttg agaaatatgt tgaggacact 1320
aaaatagatc tctggtcata caacgcggag cttcttgttg ccctggagaa ccaacataca 1380
attgatctaa ctgactcaga aatgaacaaa ctgtttgaaa aaacaaagaa gcaactgagg 1440
gaaaatgctg aggatatggg caatggttgt ttcaaaatat accacaaatg tgacaatgcc 1500
tgcataggat caataagaaa tggaacttat gaccacaatg tgtacaggga tgaagcatta 1560
aacaaccggt tccagatcaa gggagttgag ctgaagtcag ggtacaaaga ttggatccta 1620
tggatttcct ttgccatatc atgttttttg ctttgtgttg ctttgttggg gttcatcatg 1680
tgggcctgcc aaaagggcaa cattaggtgc aacatttgca tttga 1725
<210> 2
<211> 574
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> АК PDI-H3 HK
<400> 2
Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala Gln Lys Ile Pro Gly Asn Asp Asn
20 25 30
Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly His His Ala Val Pro Asn Gly Thr
35 40 45
Ile Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp Arg Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr
50 55 60
Glu Leu Val Gln Asn Ser Ser Ile Gly Glu Ile Cys Asp Ser Pro His
65 70 75 80
Gln Ile Leu Asp Gly Glu Asn Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly
85 90 95
Asp Pro Gln Cys Asp Gly Phe Gln Asn Lys Lys Trp Asp Leu Phe Val
100 105 110
Glu Arg Ser Lys Ala Tyr Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp
115 120 125
Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe
130 135 140
Asn Asn Glu Ser Phe Asn Trp Thr Gly Val Thr Gln Asn Gly Thr Ser
145 150 155 160
Ser Ala Cys Ile Arg Arg Ser Ser Ser Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn
165 170 175
Trp Leu Thr His Leu Asn Tyr Thr Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met
180 185 190
Pro Asn Asn Glu Gln Phe Asp Lys Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His
195 200 205
Pro Gly Thr Asp Lys Asp Gln Ile Phe Leu Tyr Ala Gln Ser Ser Gly
210 215 220
Arg Ile Thr Val Ser Thr Lys Arg Ser Gln Gln Ala Val Ile Pro Asn
225 230 235 240
Ile Gly Ser Arg Pro Arg Ile Arg Asp Ile Pro Ser Arg Ile Ser Ile
245 250 255
Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr
260 265 270
Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly Tyr Phe Lys Ile Arg Ser Gly Lys
275 280 285
Ser Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala Pro Ile Gly Lys Cys Lys Ser Glu
290 295 300
Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn
305 310 315 320
Val Asn Arg Ile Thr Tyr Gly Ala Cys Pro Arg Tyr Val Lys His Ser
325 330 335
Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr
340 345 350
Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu
355 360 365
Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly
370 375 380
Arg Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln
385 390 395 400
Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Leu Ile Gly Lys Thr Asn Glu Lys Phe
405 410 415
His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp
420 425 430
Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn
435 440 445
Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr
450 455 460
Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe Glu Lys Thr Lys Lys Gln Leu Arg
465 470 475 480
Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys
485 490 495
Cys Asp Asn Ala Cys Ile Gly Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His
500 505 510
Asn Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly
515 520 525
Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe
530 535 540
Ala Ile Ser Cys Phe Leu Leu Cys Val Ala Leu Leu Gly Phe Ile Met
545 550 555 560
Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile Arg Cys Asn Ile Cys Ile
565 570
<210> 3
<211> 1725
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК PDI-H3 Minn
<400> 3
atggcgaaaa acgttgcgat tttcggctta ttgttttctc ttcttgtgtt ggttccttct 60
cagatcttcg cgcaaaaaat tcctggaaat gacaatagca cggcaacgct gtgccttggg 120
caccatgcag taccaaacgg aacgatagtg aaaacaatca caaatgaccg aattgaagtt 180
actaatgcta ctgagttggt tcagaattcc tcaataggtg aaatatgcga cagtcctcat 240
cagatccttg atggagagaa ctgcacacta atagatgctc tattgggaga ccctcagtgt 300
gatggctttc aaaataagaa atgggacctt tttgttgaac gaagcaaagc ctacagcaac 360
tgttaccctt atgatgtgcc ggattatgcc tcccttaggt cactagttgc ctcatccggc 420
acactggagt ttaacaatga aagcttcaat tggactggag tcactcaaaa cggaacaagt 480
tctgcttgca taaggagatc tagtagtagt ttctttagta gattaaattg gttgacccac 540
ttaaactaca catatccagc attgaacgtg actatgccaa acaaggaaca atttgacaaa 600
ttgtacattt ggggggttca ccacccgggt acggacaagg accaaatctt cctgtatgct 660
caatcatcag gaagaatcac agtatctacc aaaagaagcc aacaagctgt aatcccaaat 720
atcggatcta gacccagaat aagggatatc cctagcagaa taagcatcta ttggacaata 780
gtaaaaccgg gagacatact tttgattaac agcacaggga atctaattgc tcctaggggt 840
tacttcaaaa tacgaagtgg gaaaagctca ataatgagat cagatgcacc cattggcaaa 900
tgcaagtctg aatgcatcac tccaaatgga agcattccca atgacaaacc attccaaaat 960
gtaaacagga tcacatacgg ggcctgtccc agatatgtta agcatagcac tctgaaattg 1020
gcaacaggaa tgcgaaatgt accagagaaa caaactagag gcatatttgg cgcaatagcg 1080
ggtttcatag aaaatggttg ggagggaatg gtggatggtt ggtacggttt caggcatcaa 1140
aattctgagg gaagaggaca agcagcagat ctcaaaagca ctcaagcagc aatcgatcaa 1200
atcaatggga agctgaatcg gttgatcggg aaaaccaacg agaaattcca tcagattgaa 1260
aaagaattct cagaagtaga aggaagagtt caagaccttg agaaatatgt tgaggacact 1320
aaaatagatc tctggtcata caacgcggag cttcttgttg ccctggagaa ccaacataca 1380
attgatctaa ctgactcaga aatgaacaaa ctgtttgaaa aaacaaagaa gcaactgagg 1440
gaaaatgctg aggatatggg aaatggttgt ttcaaaatat accacaaatg tgacaatgcc 1500
tgcataggat caataagaaa tgaaacttat gaccacaatg tgtacaggga tgaagcatta 1560
aacaaccggt tccagatcaa gggagttgag ctgaagtcag ggtacaaaga ttggatccta 1620
tggatttcct ttgccatatc atgttttttg ctttgtgttg ctttgttggg gttcatcatg 1680
tgggcctgcc aaaagggcaa cattagatgc aacatttgca tttga 1725
<210> 4
<211> 574
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> АК PDI-H3 Minn
<400> 4
Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala Gln Lys Ile Pro Gly Asn Asp Asn
20 25 30
Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly His His Ala Val Pro Asn Gly Thr
35 40 45
Ile Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp Arg Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr
50 55 60
Glu Leu Val Gln Asn Ser Ser Ile Gly Glu Ile Cys Asp Ser Pro His
65 70 75 80
Gln Ile Leu Asp Gly Glu Asn Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly
85 90 95
Asp Pro Gln Cys Asp Gly Phe Gln Asn Lys Lys Trp Asp Leu Phe Val
100 105 110
Glu Arg Ser Lys Ala Tyr Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp
115 120 125
Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe
130 135 140
Asn Asn Glu Ser Phe Asn Trp Thr Gly Val Thr Gln Asn Gly Thr Ser
145 150 155 160
Ser Ala Cys Ile Arg Arg Ser Ser Ser Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn
165 170 175
Trp Leu Thr His Leu Asn Tyr Thr Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met
180 185 190
Pro Asn Lys Glu Gln Phe Asp Lys Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His
195 200 205
Pro Gly Thr Asp Lys Asp Gln Ile Phe Leu Tyr Ala Gln Ser Ser Gly
210 215 220
Arg Ile Thr Val Ser Thr Lys Arg Ser Gln Gln Ala Val Ile Pro Asn
225 230 235 240
Ile Gly Ser Arg Pro Arg Ile Arg Asp Ile Pro Ser Arg Ile Ser Ile
245 250 255
Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr
260 265 270
Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly Tyr Phe Lys Ile Arg Ser Gly Lys
275 280 285
Ser Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala Pro Ile Gly Lys Cys Lys Ser Glu
290 295 300
Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn
305 310 315 320
Val Asn Arg Ile Thr Tyr Gly Ala Cys Pro Arg Tyr Val Lys His Ser
325 330 335
Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr
340 345 350
Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu
355 360 365
Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly
370 375 380
Arg Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln
385 390 395 400
Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Leu Ile Gly Lys Thr Asn Glu Lys Phe
405 410 415
His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser Glu Val Glu Gly Arg Val Gln Asp
420 425 430
Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn
435 440 445
Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr
450 455 460
Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe Glu Lys Thr Lys Lys Gln Leu Arg
465 470 475 480
Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys
485 490 495
Cys Asp Asn Ala Cys Ile Gly Ser Ile Arg Asn Glu Thr Tyr Asp His
500 505 510
Asn Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly
515 520 525
Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe
530 535 540
Ala Ile Ser Cys Phe Leu Leu Cys Val Ala Leu Leu Gly Phe Ile Met
545 550 555 560
Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile Arg Cys Asn Ile Cys Ile
565 570
<210> 5
<211> 1725
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК PDI-H3 SAus
<400> 5
atggcgaaaa acgttgcgat tttcggctta ttgttttctc ttcttgtgtt ggttccttct 60
cagatcttcg cgcaaaaaat tcctggaaat gacaatagca cggcaacgct gtgccttggg 120
caccatgcag taccaaacgg aacgatagtg aaaacaatca caaatgaccg aattgaagtt 180
actaatgcta ctgagttggt tcagaattcc tcaataggtg aaatatgcga cagtcctcat 240
cagatccttg atggagagaa ctgcacacta atagatgctc tattgggaga ccctcagtgt 300
gatggctttc aaaataagaa atgggacctt tttgttgaac gaagcaaagc ctacagcaac 360
tgttaccctt atgatgtgcc ggattatgcc tcccttaggt cactagttgc ctcatccggc 420
acactggagt ttaaaaatga aagcttcaat tggactggag tcactcaaaa cggaacaagt 480
tctgcttgca taaggagatc tagtagtagt ttctttagta gattaaattg gttgacccac 540
ttaaactaca catatccagc attgaacgtg actatgccaa acaaggaaca atttgacaaa 600
ttgtacattt ggggggttca ccacccgggt acggacaagg accaaatctt cctgtatgct 660
caatcatcag gaagaatcac agtatctacc aaaagaagcc aacaagctgt aatcccaaat 720
atcggatcta gacccagaat aagggatatc cctagcagaa taagcatcta ttggacaata 780
gtaaaaccgg gagacatact tttgattaac agcacaggga atctaattgc tcctaggggt 840
tacttcaaaa tacgaagtgg gaaaagctca ataatgagat cagatgcacc cattggcaaa 900
tgcaagtctg aatgcatcac tccaaatgga agcattccca atgacaaacc attccaaaat 960
gtaaacagga tcacatacgg ggcctgtccc agatatgtta agcatagcac tctgaaattg 1020
gcaacaggaa tgcgaaatgt accagagaaa caaactagag gcatatttgg cgcaatagcg 1080
ggtttcatag aaaatggttg ggagggaatg gtggatggtt ggtacggttt caggcatcaa 1140
aattctgagg gaagaggaca agcagcagat ctcaaaagca ctcaagcagc aatcgatcaa 1200
atcaatggga agctgaatcg gttgatcggg aaaaccaacg agaaattcca tcagattgaa 1260
aaagaattct cagaagtaga aggaagagtt caagaccttg agaaatatgt tgaggacact 1320
aaaatagatc tctggtcata caacgcggag cttcttgttg ccctggagaa ccaacataca 1380
attgatctaa ctgactcaga aatgaacaaa ctgtttgaaa aaacaaagaa gcaactgagg 1440
gaaaatgctg aggatatggg aaatggttgt ttcaaaatat accacaaatg tgacaatgcc 1500
tgcataggat caataagaaa tgaaacttat gaccacaatg tgtacaggga tgaagcatta 1560
aacaaccggt tccagatcaa gggagttgag ctgaagtcag ggtacaaaga ttggatccta 1620
tggatttcct ttgccatatc atgttttttg ctttgtgttg ctttgttggg gttcatcatg 1680
tgggcctgcc aaaagggcaa cattagatgc aacatttgca tttga 1725
<210> 6
<211> 574
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> АК PDI-H3 SAus
<400> 6
Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala Gln Lys Ile Pro Gly Asn Asp Asn
20 25 30
Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly His His Ala Val Pro Asn Gly Thr
35 40 45
Ile Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp Arg Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr
50 55 60
Glu Leu Val Gln Asn Ser Ser Ile Gly Glu Ile Cys Asp Ser Pro His
65 70 75 80
Gln Ile Leu Asp Gly Glu Asn Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly
85 90 95
Asp Pro Gln Cys Asp Gly Phe Gln Asn Lys Lys Trp Asp Leu Phe Val
100 105 110
Glu Arg Ser Lys Ala Tyr Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp
115 120 125
Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe
130 135 140
Lys Asn Glu Ser Phe Asn Trp Thr Gly Val Thr Gln Asn Gly Thr Ser
145 150 155 160
Ser Ala Cys Ile Arg Arg Ser Ser Ser Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn
165 170 175
Trp Leu Thr His Leu Asn Tyr Thr Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met
180 185 190
Pro Asn Lys Glu Gln Phe Asp Lys Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His
195 200 205
Pro Gly Thr Asp Lys Asp Gln Ile Phe Leu Tyr Ala Gln Ser Ser Gly
210 215 220
Arg Ile Thr Val Ser Thr Lys Arg Ser Gln Gln Ala Val Ile Pro Asn
225 230 235 240
Ile Gly Ser Arg Pro Arg Ile Arg Asp Ile Pro Ser Arg Ile Ser Ile
245 250 255
Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr
260 265 270
Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly Tyr Phe Lys Ile Arg Ser Gly Lys
275 280 285
Ser Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala Pro Ile Gly Lys Cys Lys Ser Glu
290 295 300
Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn
305 310 315 320
Val Asn Arg Ile Thr Tyr Gly Ala Cys Pro Arg Tyr Val Lys His Ser
325 330 335
Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr
340 345 350
Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu
355 360 365
Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly
370 375 380
Arg Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln
385 390 395 400
Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Leu Ile Gly Lys Thr Asn Glu Lys Phe
405 410 415
His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser Glu Val Glu Gly Arg Val Gln Asp
420 425 430
Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn
435 440 445
Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr
450 455 460
Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe Glu Lys Thr Lys Lys Gln Leu Arg
465 470 475 480
Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys
485 490 495
Cys Asp Asn Ala Cys Ile Gly Ser Ile Arg Asn Glu Thr Tyr Asp His
500 505 510
Asn Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly
515 520 525
Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe
530 535 540
Ala Ile Ser Cys Phe Leu Leu Cys Val Ala Leu Leu Gly Phe Ile Met
545 550 555 560
Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile Arg Cys Asn Ile Cys Ile
565 570
<210> 7
<211> 1725
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК PDI-H3 Bang
<400> 7
atggcgaaaa acgttgcgat tttcggctta ttgttttctc ttcttgtgtt ggttccttct 60
cagatcttcg cgcaaaaaat tcctggaaat gacaatagca cggcaacgct gtgccttggg 120
caccatgcag taccaaacgg aacgatagtg aaaacaatca caaatgaccg aattgaagtt 180
actaatgcta ctgagctggt tcagaattcc tcaataggtg aaatatgcga cagtcctcat 240
cagatccttg atggagaaaa ctgcacacta atagatgctc tattgggaga ccctcagtgt 300
gatggctttc aaaataagaa atgggacctt tttgttgaac gaagcaaagc ctacagcaac 360
tgttaccctt atgatgtgcc ggattatgcc tcccttaggt cactagttgc ctcatccggc 420
acactggagt ttaacaatga aagcttcaat tggactggag tcactcaaaa cggaacaagt 480
tctgcttgca taaggaaatc tagtagtagt ttctttagta gattaaattg gttgacccac 540
ttaaactaca catacccagc attgaacgtg actgtgccaa acaatgaaca atttgacaaa 600
ttgtacattt ggggggttca ccacccgggt acggacaagg accaaatctt cctgtatgct 660
cgatcatcag gaagaatcac agtatctacc aaaagaagcc aacaagctgt aatcccaaat 720
atcggatcta gacccagaat aagggatatc cctagcagaa taagcatcta ttggacaata 780
gtaaaaccgg gagacatact tttgattaac agcacaggga atctaattgc tcctaggggt 840
tacttcaaaa tacgaagtgg gaaaagctca ataatgagat cagatgcacc cattggcaaa 900
tgcaagtctg aatgcatcac tccaaatgga agcattccca atgacaaacc attccaaaat 960
gtaaacagga tcacatacgg ggcctgtccc agatatgtta agcatagcac tctgaaattg 1020
gcaacaggaa tgcgaaatgt accagagaaa caaactagag gcatatttgg cgcaatagcg 1080
ggtttcatag aaaatggttg ggagggaatg gtggatggtt ggtacggttt caggcatcaa 1140
aattctgagg gaagaggaca agcagcagat ctcaaaagca ctcaagcagc aatcgatcaa 1200
atcaatggga agctgaatcg attgatcggg aaaaccaacg agaaattcca tcagattgaa 1260
aaagaattct cagaagtaga aggaagaatt caggaccttg agaaatatgt tgaggacact 1320
aaaatagatc tctggtcata caacgcggag cttcttgttg ccctggagaa tcaacataca 1380
attgatctaa ctgactcaga aatgaacaaa ctgtttgaaa aaacaaagaa gcaactgagg 1440
gaaaatgctg aggatatggg aaatggttgt ttcaaaatat accacaaatg tgacaatgcc 1500
tgcataggat caataagaaa tggaacttat gaccacaatg tgtacaggga tgaagcatta 1560
aacaaccggt tccagatcaa gggagttgag ctgaagtcag ggtacaaaga ttggatccta 1620
tggatttcct ttgccatatc atgttttttg ctttgtgttg ctttgttggg gttcatcatg 1680
tgggcctgcc aaaagggcaa cattaggtgc aacatttgca tttga 1725
<210> 8
<211> 574
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> АК PDI-H3 Bang
<400> 8
Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala Gln Lys Ile Pro Gly Asn Asp Asn
20 25 30
Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly His His Ala Val Pro Asn Gly Thr
35 40 45
Ile Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp Arg Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr
50 55 60
Glu Leu Val Gln Asn Ser Ser Ile Gly Glu Ile Cys Asp Ser Pro His
65 70 75 80
Gln Ile Leu Asp Gly Glu Asn Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly
85 90 95
Asp Pro Gln Cys Asp Gly Phe Gln Asn Lys Lys Trp Asp Leu Phe Val
100 105 110
Glu Arg Ser Lys Ala Tyr Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp
115 120 125
Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe
130 135 140
Asn Asn Glu Ser Phe Asn Trp Thr Gly Val Thr Gln Asn Gly Thr Ser
145 150 155 160
Ser Ala Cys Ile Arg Lys Ser Ser Ser Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn
165 170 175
Trp Leu Thr His Leu Asn Tyr Thr Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Val
180 185 190
Pro Asn Asn Glu Gln Phe Asp Lys Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His
195 200 205
Pro Gly Thr Asp Lys Asp Gln Ile Phe Leu Tyr Ala Arg Ser Ser Gly
210 215 220
Arg Ile Thr Val Ser Thr Lys Arg Ser Gln Gln Ala Val Ile Pro Asn
225 230 235 240
Ile Gly Ser Arg Pro Arg Ile Arg Asp Ile Pro Ser Arg Ile Ser Ile
245 250 255
Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr
260 265 270
Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly Tyr Phe Lys Ile Arg Ser Gly Lys
275 280 285
Ser Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala Pro Ile Gly Lys Cys Lys Ser Glu
290 295 300
Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn
305 310 315 320
Val Asn Arg Ile Thr Tyr Gly Ala Cys Pro Arg Tyr Val Lys His Ser
325 330 335
Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr
340 345 350
Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu
355 360 365
Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly
370 375 380
Arg Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln
385 390 395 400
Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Leu Ile Gly Lys Thr Asn Glu Lys Phe
405 410 415
His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp
420 425 430
Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn
435 440 445
Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr
450 455 460
Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe Glu Lys Thr Lys Lys Gln Leu Arg
465 470 475 480
Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys
485 490 495
Cys Asp Asn Ala Cys Ile Gly Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His
500 505 510
Asn Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly
515 520 525
Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe
530 535 540
Ala Ile Ser Cys Phe Leu Leu Cys Val Ala Leu Leu Gly Phe Ile Met
545 550 555 560
Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile Arg Cys Asn Ile Cys Ile
565 570
<210> 9
<211> 1725
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК PDI-H3 Switz
<400> 9
atggcgaaaa acgttgcgat tttcggctta ttgttttctc ttcttgtgtt ggttccttct 60
cagatcttcg cgcaaaaact tcctggaaat gacaatagca cggcaacgct gtgccttggg 120
caccatgcag taccaaacgg aacgatagtg aaaacaatca cgaatgaccg aattgaagtt 180
actaatgcta ctgagctggt tcagaattcc tcaataggtg aaatatgcga cagtcctcat 240
cagatccttg atggagaaaa ctgcacacta atagatgctc tattgggaga ccctcagtgt 300
gatggctttc aaaataagaa atgggacctt tttgttgaac gaagcaaagc ctacagcaac 360
tgttaccctt atgatgtgcc ggattatgcc tcccttaggt cactagttgc ctcatccggc 420
acactggagt ttaacaatga aagcttcaat tgggctggag tcactcaaaa cggaacaagt 480
tcttcttgca taaggggatc taatagtagt ttctttagta gattaaattg gttgacccac 540
ttaaactcca aatacccagc attaaacgtg actatgccaa acaatgaaca atttgacaaa 600
ttgtacattt ggggggttca ccacccgggt acggacaagg accaaatctt cctgtatgca 660
caatcatcag gaagaatcac agtatctacc aaaagaagcc aacaagctgt aatcccgaat 720
atcggatcta gacccagaat aagggatatc cctagcagaa taagcatcta ttggacaata 780
gtaaaaccgg gagacatact tttgattaac agcacaggga atctaattgc tcctaggggt 840
tacttcaaaa tacgaagtgg gaaaagctca ataatgagat cagatgcacc cattggcaaa 900
tgcaagtctg aatgcatcac tccaaatgga agcattccca atgacaaacc attccaaaat 960
gtaaacagga tcacatacgg ggcctgtccc agatatgtta agcaaagcac tctgaaattg 1020
gcaacaggaa tgcgaaatgt accagagaga caaactagag gcatatttgg cgcaatagcg 1080
ggtttcatag aaaatggttg ggagggaatg gtggatggtt ggtacggctt caggcatcaa 1140
aattctgagg gaagaggaca agcagcagat ctcaaaagca ctcaagcagc aatcgatcaa 1200
atcaatggga agctgaatcg attgatcggg aaaaccaacg agaaattcca tcagattgaa 1260
aaagaattct cagaagtaga agggagaatt caggaccttg agaaatatgt tgaggacaca 1320
aaaatagatc tctggtcata caacgcggag cttcttgttg ccctggagaa ccaacataca 1380
attgatctaa ctgactcaga aatgaacaaa ctgtttgaaa aaacaaagaa gcaactgagg 1440
gaaaatgctg aggatatggg caatggttgt ttcaaaatat accacaaatg tgacaatgcc 1500
tgcataggat caatcagaaa tggaacttat gaccacgatg tatacaggga tgaagcatta 1560
aacaaccggt tccagatcaa gggagttgag ctgaagtcag ggtacaaaga ttggatccta 1620
tggatttcct ttgccatatc atgttttttg ctttgtgttg ctttgttggg gttcatcatg 1680
tgggcctgcc aaaagggcaa cattaggtgc aacatttgca tttga 1725
<210> 10
<211> 574
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> АК PDI-H3 Switz
<400> 10
Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala Gln Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn
20 25 30
Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly His His Ala Val Pro Asn Gly Thr
35 40 45
Ile Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp Arg Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr
50 55 60
Glu Leu Val Gln Asn Ser Ser Ile Gly Glu Ile Cys Asp Ser Pro His
65 70 75 80
Gln Ile Leu Asp Gly Glu Asn Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly
85 90 95
Asp Pro Gln Cys Asp Gly Phe Gln Asn Lys Lys Trp Asp Leu Phe Val
100 105 110
Glu Arg Ser Lys Ala Tyr Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp
115 120 125
Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe
130 135 140
Asn Asn Glu Ser Phe Asn Trp Ala Gly Val Thr Gln Asn Gly Thr Ser
145 150 155 160
Ser Ser Cys Ile Arg Gly Ser Asn Ser Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn
165 170 175
Trp Leu Thr His Leu Asn Ser Lys Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met
180 185 190
Pro Asn Asn Glu Gln Phe Asp Lys Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His
195 200 205
Pro Gly Thr Asp Lys Asp Gln Ile Phe Leu Tyr Ala Gln Ser Ser Gly
210 215 220
Arg Ile Thr Val Ser Thr Lys Arg Ser Gln Gln Ala Val Ile Pro Asn
225 230 235 240
Ile Gly Ser Arg Pro Arg Ile Arg Asp Ile Pro Ser Arg Ile Ser Ile
245 250 255
Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr
260 265 270
Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly Tyr Phe Lys Ile Arg Ser Gly Lys
275 280 285
Ser Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala Pro Ile Gly Lys Cys Lys Ser Glu
290 295 300
Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn
305 310 315 320
Val Asn Arg Ile Thr Tyr Gly Ala Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gln Ser
325 330 335
Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Arg Gln Thr
340 345 350
Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu
355 360 365
Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly
370 375 380
Arg Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln
385 390 395 400
Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Leu Ile Gly Lys Thr Asn Glu Lys Phe
405 410 415
His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp
420 425 430
Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn
435 440 445
Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr
450 455 460
Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe Glu Lys Thr Lys Lys Gln Leu Arg
465 470 475 480
Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys
485 490 495
Cys Asp Asn Ala Cys Ile Gly Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His
500 505 510
Asp Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly
515 520 525
Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe
530 535 540
Ala Ile Ser Cys Phe Leu Leu Cys Val Ala Leu Leu Gly Phe Ile Met
545 550 555 560
Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile Arg Cys Asn Ile Cys Ile
565 570
<210> 11
<211> 1725
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК PDI-H3 Miss
<400> 11
atggcgaaaa acgttgcgat tttcggctta ttgttttctc ttcttgtgtt ggttccttct 60
cagatcttcg cgcaaaaact tcctggaaat gacaatagca cggcaacgct gtgccttggg 120
caccatgcag taccaaacgg aacgatagtg aaaacaatca cgaatgaccg aattgaagtt 180
actaatgcta ctgagctggt tcagaattcc tcaataggtg aaatatgcga cagtcctcat 240
cagatccttg atggagaaaa ctgcacacta atagatgctc tattgggaga ccctcagtgt 300
gatggctttc aaaataagaa atgggacctt tttgttgaac gaagcagagc ctacagcaac 360
tgttaccctt atgatgtgcc ggattatgcc tcccttaggt cactagttgc ctcatccggc 420
acactggagt ttaacaatga aagcttcaat tgggctggag tcactcaaaa cggaacaagt 480
tcttcttgca taaggggatc taatagtagt ttctttagta gattaaattg gttgacccac 540
ttaaactcca aatacccagc attaaacgtg actatgccaa acaatgaaca atttgacaaa 600
ttgtacattt ggggggttca ccacccgggt acggacaagg accaaatctt cctgtatgca 660
aaaccatcag gaagaatcac agtatctacc aaaagaagcc aacaagctgt aatcccgaat 720
atcggatcta gacccagaat aagggatatc cctagcagaa taagcatcta ttggacaata 780
gtaaaaccgg gagacatact tttgattaac agcacaggga atctaattgc tcctaggggt 840
tacttcaaaa tacgaagtgg gaaaagctca ataatgagat cagatgcacc cattggcaaa 900
tgcaagtctg aatgcatcac tccaaatgga agcattccca atgacaaacc attccaaaat 960
gtaaacagga tcacatacgg ggcctgtccc agatatgtta agcaaaacac tctgaaattg 1020
gcaacaggaa tgcgaaatgt accagagaga caaactagag gcatatttgg cgcaatagcg 1080
ggtttcatag aaaatggttg ggagggaatg gtggatggtt ggtacggctt caggcatcaa 1140
aattctgagg gaagaggaca agcagcagat ctcaaaagca ctcaagcagc aatcgatcaa 1200
atcaatggga agctgaatcg attgatcggg aaaaccaacg agaaattcca tcagattgaa 1260
aaagaattct cagaagtaga agggagaatt caggaccttg agaaatatgt tgaggacaca 1320
aaaatagatc tctggtcata caacgcggag cttcttgttg ccctggagaa ccaacataca 1380
attgatctaa ctgactcaga aatgaacaaa ctgtttgaaa aaacaaagaa gcaactgagg 1440
gaaaatgctg aggatatggg caatggttgt ttcaaaatat accacaaatg tgacaatgcc 1500
tgcataggat caatcagaaa tggaacttat gaccacgatg tatacaggga tgaagcatta 1560
aacaaccggt tccagatcaa gggagttgag ctgaagtcag ggtacaaaga ttggatccta 1620
tggatttcct ttgccatatc atgttttttg ctttgtgttg ctttgttggg gttcatcatg 1680
tgggcctgcc aaaagggcaa cattaggtgc aacatttgca tttga 1725
<210> 12
<211> 574
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> АК PDI-H3 Miss
<400> 12
Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala Gln Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn
20 25 30
Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly His His Ala Val Pro Asn Gly Thr
35 40 45
Ile Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp Arg Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr
50 55 60
Glu Leu Val Gln Asn Ser Ser Ile Gly Glu Ile Cys Asp Ser Pro His
65 70 75 80
Gln Ile Leu Asp Gly Glu Asn Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly
85 90 95
Asp Pro Gln Cys Asp Gly Phe Gln Asn Lys Lys Trp Asp Leu Phe Val
100 105 110
Glu Arg Ser Arg Ala Tyr Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp
115 120 125
Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe
130 135 140
Asn Asn Glu Ser Phe Asn Trp Ala Gly Val Thr Gln Asn Gly Thr Ser
145 150 155 160
Ser Ser Cys Ile Arg Gly Ser Asn Ser Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn
165 170 175
Trp Leu Thr His Leu Asn Ser Lys Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met
180 185 190
Pro Asn Asn Glu Gln Phe Asp Lys Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His
195 200 205
Pro Gly Thr Asp Lys Asp Gln Ile Phe Leu Tyr Ala Lys Pro Ser Gly
210 215 220
Arg Ile Thr Val Ser Thr Lys Arg Ser Gln Gln Ala Val Ile Pro Asn
225 230 235 240
Ile Gly Ser Arg Pro Arg Ile Arg Asp Ile Pro Ser Arg Ile Ser Ile
245 250 255
Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr
260 265 270
Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly Tyr Phe Lys Ile Arg Ser Gly Lys
275 280 285
Ser Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala Pro Ile Gly Lys Cys Lys Ser Glu
290 295 300
Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn
305 310 315 320
Val Asn Arg Ile Thr Tyr Gly Ala Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gln Asn
325 330 335
Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Arg Gln Thr
340 345 350
Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu
355 360 365
Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly
370 375 380
Arg Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln
385 390 395 400
Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Leu Ile Gly Lys Thr Asn Glu Lys Phe
405 410 415
His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp
420 425 430
Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn
435 440 445
Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr
450 455 460
Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe Glu Lys Thr Lys Lys Gln Leu Arg
465 470 475 480
Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys
485 490 495
Cys Asp Asn Ala Cys Ile Gly Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His
500 505 510
Asp Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly
515 520 525
Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe
530 535 540
Ala Ile Ser Cys Phe Leu Leu Cys Val Ala Leu Leu Gly Phe Ile Met
545 550 555 560
Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile Arg Cys Asn Ile Cys Ile
565 570
<210> 13
<211> 1725
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК PDI-H3 Penn
<400> 13
atggcgaaaa acgttgcgat tttcggctta ttgttttctc ttcttgtgtt ggttccttct 60
cagatcttcg cgcaaaaact tcctggaaat gacaatagca cggcaacgct gtgccttggg 120
caccatgcag taccaaacgg aacgatagtg aaaacaatca cgaatgaccg aattgaagtt 180
actaatgcta ctgagctggt tcagaattcc tcaataggtg aaatatgcga cagtcctcat 240
cagatccttg atggaaaaaa ctgcactcta atagatgctc tattgggaga ccctcagtgt 300
gatggctttc aaaataagag atgggacctt tttgttgaac gaagcaaagc ctacagcaac 360
tgttaccctt atgatgtgcc ggattatgcc tcccttaggt cactagttgc ctcatccggc 420
acactggagt ttaacgatga aagcttcaat tgggctggag tcactcaaaa cggaacaagt 480
tctgcttgca taaggggatc taatagtagt ttctttagta gattaaattg gttgacccac 540
tcaaacttca aatacccagc attgaacgtg actatgccaa acaatgaaca atttgacaaa 600
ttgtacattt ggggggttca ccacccgggt acagacaagg accaaatctt cctgtacgct 660
caatcatcag gaagaatcac agtatctacc aaaagaagcc aacaagctgt aatcccgaat 720
atcggatcta gacccagaat aaggaatatc cctagcagaa taagcatcta ttggacaata 780
gtaaaaccgg gagacatact tttgattaac agcacaggga atctaattgc tcctaggggt 840
tacttcaaaa tacaaagtgg gaaaagctca ataatgagat cagatgcacc cattggcaaa 900
tgcaagtctg aatgcatcac tccaaatgga agcattccca atgacaaacc attccaaaat 960
gtaaacagga tcacatacgg ggcctgtccc agatatgtta agcaaagcac tctgaaattg 1020
gcaacaggaa tgcgaaatgt accagagaaa caaactagag gcatatttgg cgcaatagcg 1080
ggtttcatag aaaatggttg ggagggaatg aaggatggtt ggtacggttt caggcatcaa 1140
aattctgagg gaagaggaca agcagcagat ctcaaaagca ctcaagcagc aatcgatcaa 1200
atcaatggga agctgaatcg attgatcggg aaaaccaacg agaaattcca tcagattgaa 1260
aaagaattct cagaagtaga agggagaatt caggaccttg agaaatatgt tgaggacaca 1320
aaaatagatc tctggtcata caacgcggag cttcttgttg ccctggagaa ccaacataca 1380
attgatctaa ctgactcaga aatgaacaaa ctgtttgaaa aaacaaagaa gcaactgagg 1440
gaaaatgctg aggatatggg caatggttgt ttcaaaatat accacaaatg tgacaatgcc 1500
tgcataggat caatcagaaa tggaacttat gaccacgatg tatacaggga tgaagcttta 1560
aacaaccggt tccagatcaa gggagttgag ctgaagtcag ggtacaaaga ttggatccta 1620
tggatttcct ttgccatatc atgttttttg ctttgtgttg ctttgttggg gttcatcatg 1680
tgggcctgcc aaaagggcaa cattaggtgc aacatttgca tttga 1725
<210> 14
<211> 574
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> АК PDI-H3 Penn
<400> 14
Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala Gln Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn
20 25 30
Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly His His Ala Val Pro Asn Gly Thr
35 40 45
Ile Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp Arg Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr
50 55 60
Glu Leu Val Gln Asn Ser Ser Ile Gly Glu Ile Cys Asp Ser Pro His
65 70 75 80
Gln Ile Leu Asp Gly Lys Asn Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly
85 90 95
Asp Pro Gln Cys Asp Gly Phe Gln Asn Lys Arg Trp Asp Leu Phe Val
100 105 110
Glu Arg Ser Lys Ala Tyr Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp
115 120 125
Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe
130 135 140
Asn Asp Glu Ser Phe Asn Trp Ala Gly Val Thr Gln Asn Gly Thr Ser
145 150 155 160
Ser Ala Cys Ile Arg Gly Ser Asn Ser Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn
165 170 175
Trp Leu Thr His Ser Asn Phe Lys Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met
180 185 190
Pro Asn Asn Glu Gln Phe Asp Lys Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His
195 200 205
Pro Gly Thr Asp Lys Asp Gln Ile Phe Leu Tyr Ala Gln Ser Ser Gly
210 215 220
Arg Ile Thr Val Ser Thr Lys Arg Ser Gln Gln Ala Val Ile Pro Asn
225 230 235 240
Ile Gly Ser Arg Pro Arg Ile Arg Asn Ile Pro Ser Arg Ile Ser Ile
245 250 255
Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr
260 265 270
Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly Tyr Phe Lys Ile Gln Ser Gly Lys
275 280 285
Ser Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala Pro Ile Gly Lys Cys Lys Ser Glu
290 295 300
Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn
305 310 315 320
Val Asn Arg Ile Thr Tyr Gly Ala Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gln Ser
325 330 335
Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr
340 345 350
Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu
355 360 365
Gly Met Lys Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly
370 375 380
Arg Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln
385 390 395 400
Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Leu Ile Gly Lys Thr Asn Glu Lys Phe
405 410 415
His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp
420 425 430
Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn
435 440 445
Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr
450 455 460
Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe Glu Lys Thr Lys Lys Gln Leu Arg
465 470 475 480
Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys
485 490 495
Cys Asp Asn Ala Cys Ile Gly Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His
500 505 510
Asp Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly
515 520 525
Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe
530 535 540
Ala Ile Ser Cys Phe Leu Leu Cys Val Ala Leu Leu Gly Phe Ile Met
545 550 555 560
Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile Arg Cys Asn Ile Cys Ile
565 570
<210> 15
<211> 49
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер IF-CPMV(fl5'UTR)_SpPDI.c
<400> 15
tcgtgcttcg gcaccagtac aatggcgaaa aacgttgcga ttttcggct 49
<210> 16
<211> 46
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер IF-H1cTMCT.S1-4r
<400> 16
actaaagaaa ataggccttt aaatacatat tctacactgt agagac 46
<210> 17
<211> 55
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер IF-H3A-Ala.r
<400> 17
actaaagaaa ataggccttc aaatgcaaat gttgcaccta atgttgccct tttgg 55
<210> 18
<211> 51
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер H3_Swi_SLVLL.r
<400> 18
agcaactaac agtacaaggg atgatatggc aaaggaaatc cataggatcc a 51
<210> 19
<211> 53
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> H3_Swi_SLVLL.c
<400> 19
tcctttgcca tatcatccct tgtactgtta gttgctttgt tggggttcat cat 53
<210> 20
<211> 1725
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК PDI-H3 HK-CysTm
<400> 20
atggcgaaaa acgttgcgat tttcggctta ttgttttctc ttcttgtgtt ggttccttct 60
cagatcttcg cgcaaaaaat tcctggaaat gacaatagca cggcaacgct gtgccttggg 120
catcatgcag taccaaacgg aacgatagtg aaaacaatca cgaatgaccg aattgaagtt 180
actaatgcta ctgagctggt tcagaattcc tcaataggtg aaatatgcga cagtcctcat 240
cagatccttg atggagaaaa ctgcacacta atagatgctc tattgggaga ccctcagtgt 300
gatggctttc aaaataagaa atgggacctt tttgttgaac gaagcaaagc ctacagcaac 360
tgttaccctt atgatgtgcc ggattatgcc tcccttaggt cactagttgc ctcatccggc 420
acactggagt ttaacaatga aagcttcaat tggactggag tcactcaaaa cggaacaagt 480
tctgcttgca taaggagatc tagtagtagt ttctttagta gattaaattg gttgacccac 540
ttaaactaca catacccagc attgaacgtg actatgccaa acaatgaaca atttgacaaa 600
ttgtacattt ggggggttca ccacccgggt acggacaagg accaaatctt cctgtatgct 660
caatcatcag gaagaatcac agtatctacc aaaagaagcc aacaagctgt aatcccaaat 720
atcggatcta gacccagaat aagggatatc cctagcagaa taagcatcta ttggacaata 780
gtaaaaccgg gagacatact tttgattaac agcacaggga atctaattgc tcctaggggt 840
tacttcaaaa tacgaagtgg gaaaagctca ataatgagat cagatgcacc cattggcaaa 900
tgcaagtctg aatgcatcac tccaaatgga agcattccca atgacaaacc attccaaaat 960
gtaaacagga tcacatacgg ggcctgtccc agatatgtta agcatagcac tctgaaattg 1020
gcaacaggaa tgcgaaatgt accagagaaa caaactagag gcatatttgg tgcaatagcg 1080
ggtttcatag aaaatggttg ggagggaatg gtggatggtt ggtacggttt caggcatcaa 1140
aattctgagg gaagaggaca agcagcagat ctcaaaagca ctcaagcagc aatcgatcaa 1200
atcaatggga agctgaatcg attgatcggg aaaaccaacg agaaattcca tcagattgaa 1260
aaagaattct cagaagtaga aggaagaatt caggaccttg agaaatatgt tgaggacact 1320
aaaatagatc tctggtcata caacgcggag cttcttgttg ccctggagaa ccaacataca 1380
attgatctaa ctgactcaga aatgaacaaa ctgtttgaaa aaacaaagaa gcaactgagg 1440
gaaaatgctg aggatatggg caatggttgt ttcaaaatat accacaaatg tgacaatgcc 1500
tgcataggat caataagaaa tggaacttat gaccacaatg tgtacaggga tgaagcatta 1560
aacaaccggt tccagatcaa gggagttgag ctgaagtcag ggtacaaaga ttggatccta 1620
tggatttcct ttgccatatc atcccttgta ctgttagttg ctttgttggg gttcatcatg 1680
tgggcctgcc aaaagggcaa cattaggtgc aacatttgca tttga 1725
<210> 21
<211> 574
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> АК PDI-H3 HK-CysTm
<400> 21
Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala Gln Lys Ile Pro Gly Asn Asp Asn
20 25 30
Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly His His Ala Val Pro Asn Gly Thr
35 40 45
Ile Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp Arg Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr
50 55 60
Glu Leu Val Gln Asn Ser Ser Ile Gly Glu Ile Cys Asp Ser Pro His
65 70 75 80
Gln Ile Leu Asp Gly Glu Asn Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly
85 90 95
Asp Pro Gln Cys Asp Gly Phe Gln Asn Lys Lys Trp Asp Leu Phe Val
100 105 110
Glu Arg Ser Lys Ala Tyr Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp
115 120 125
Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe
130 135 140
Asn Asn Glu Ser Phe Asn Trp Thr Gly Val Thr Gln Asn Gly Thr Ser
145 150 155 160
Ser Ala Cys Ile Arg Arg Ser Ser Ser Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn
165 170 175
Trp Leu Thr His Leu Asn Tyr Thr Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met
180 185 190
Pro Asn Asn Glu Gln Phe Asp Lys Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His
195 200 205
Pro Gly Thr Asp Lys Asp Gln Ile Phe Leu Tyr Ala Gln Ser Ser Gly
210 215 220
Arg Ile Thr Val Ser Thr Lys Arg Ser Gln Gln Ala Val Ile Pro Asn
225 230 235 240
Ile Gly Ser Arg Pro Arg Ile Arg Asp Ile Pro Ser Arg Ile Ser Ile
245 250 255
Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr
260 265 270
Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly Tyr Phe Lys Ile Arg Ser Gly Lys
275 280 285
Ser Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala Pro Ile Gly Lys Cys Lys Ser Glu
290 295 300
Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn
305 310 315 320
Val Asn Arg Ile Thr Tyr Gly Ala Cys Pro Arg Tyr Val Lys His Ser
325 330 335
Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr
340 345 350
Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu
355 360 365
Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly
370 375 380
Arg Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln
385 390 395 400
Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Leu Ile Gly Lys Thr Asn Glu Lys Phe
405 410 415
His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp
420 425 430
Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn
435 440 445
Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr
450 455 460
Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe Glu Lys Thr Lys Lys Gln Leu Arg
465 470 475 480
Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys
485 490 495
Cys Asp Asn Ala Cys Ile Gly Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His
500 505 510
Asn Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly
515 520 525
Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe
530 535 540
Ala Ile Ser Ser Leu Val Leu Leu Val Ala Leu Leu Gly Phe Ile Met
545 550 555 560
Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile Arg Cys Asn Ile Cys Ile
565 570
<210> 22
<211> 48
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер H3_HK480114(N382A+L384V).r
<400> 22
ttggttttcc cgatcactcg agccagcttc ccattgattt gatcgatt 48
<210> 23
<211> 48
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер H3_HK480114(N382A+L384V).c
<400> 23
gggaagctgg ctcgagtgat cgggaaaacc aacgagaaat tccatcag 48
<210> 24
<211> 1725
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК PDI-H3 HK-N382A+L384V-CysTm
<400> 24
atggcgaaaa acgttgcgat tttcggctta ttgttttctc ttcttgtgtt ggttccttct 60
cagatcttcg cgcaaaaaat tcctggaaat gacaatagca cggcaacgct gtgccttggg 120
catcatgcag taccaaacgg aacgatagtg aaaacaatca cgaatgaccg aattgaagtt 180
actaatgcta ctgagctggt tcagaattcc tcaataggtg aaatatgcga cagtcctcat 240
cagatccttg atggagaaaa ctgcacacta atagatgctc tattgggaga ccctcagtgt 300
gatggctttc aaaataagaa atgggacctt tttgttgaac gaagcaaagc ctacagcaac 360
tgttaccctt atgatgtgcc ggattatgcc tcccttaggt cactagttgc ctcatccggc 420
acactggagt ttaacaatga aagcttcaat tggactggag tcactcaaaa cggaacaagt 480
tctgcttgca taaggagatc tagtagtagt ttctttagta gattaaattg gttgacccac 540
ttaaactaca catacccagc attgaacgtg actatgccaa acaatgaaca atttgacaaa 600
ttgtacattt ggggggttca ccacccgggt acggacaagg accaaatctt cctgtatgct 660
caatcatcag gaagaatcac agtatctacc aaaagaagcc aacaagctgt aatcccaaat 720
atcggatcta gacccagaat aagggatatc cctagcagaa taagcatcta ttggacaata 780
gtaaaaccgg gagacatact tttgattaac agcacaggga atctaattgc tcctaggggt 840
tacttcaaaa tacgaagtgg gaaaagctca ataatgagat cagatgcacc cattggcaaa 900
tgcaagtctg aatgcatcac tccaaatgga agcattccca atgacaaacc attccaaaat 960
gtaaacagga tcacatacgg ggcctgtccc agatatgtta agcatagcac tctgaaattg 1020
gcaacaggaa tgcgaaatgt accagagaaa caaactagag gcatatttgg tgcaatagcg 1080
ggtttcatag aaaatggttg ggagggaatg gtggatggtt ggtacggttt caggcatcaa 1140
aattctgagg gaagaggaca agcagcagat ctcaaaagca ctcaagcagc aatcgatcaa 1200
atcaatggga agctggctcg agtgatcggg aaaaccaacg agaaattcca tcagattgaa 1260
aaagaattct cagaagtaga aggaagaatt caggaccttg agaaatatgt tgaggacact 1320
aaaatagatc tctggtcata caacgcggag cttcttgttg ccctggagaa ccaacataca 1380
attgatctaa ctgactcaga aatgaacaaa ctgtttgaaa aaacaaagaa gcaactgagg 1440
gaaaatgctg aggatatggg caatggttgt ttcaaaatat accacaaatg tgacaatgcc 1500
tgcataggat caataagaaa tggaacttat gaccacaatg tgtacaggga tgaagcatta 1560
aacaaccggt tccagatcaa gggagttgag ctgaagtcag ggtacaaaga ttggatccta 1620
tggatttcct ttgccatatc atcccttgta ctgttagttg ctttgttggg gttcatcatg 1680
tgggcctgcc aaaagggcaa cattaggtgc aacatttgca tttga 1725
<210> 25
<211> 574
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> АК PDI-H3 HK-N382A+L384V-CysTm
<400> 25
Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala Gln Lys Ile Pro Gly Asn Asp Asn
20 25 30
Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly His His Ala Val Pro Asn Gly Thr
35 40 45
Ile Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp Arg Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr
50 55 60
Glu Leu Val Gln Asn Ser Ser Ile Gly Glu Ile Cys Asp Ser Pro His
65 70 75 80
Gln Ile Leu Asp Gly Glu Asn Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly
85 90 95
Asp Pro Gln Cys Asp Gly Phe Gln Asn Lys Lys Trp Asp Leu Phe Val
100 105 110
Glu Arg Ser Lys Ala Tyr Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp
115 120 125
Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe
130 135 140
Asn Asn Glu Ser Phe Asn Trp Thr Gly Val Thr Gln Asn Gly Thr Ser
145 150 155 160
Ser Ala Cys Ile Arg Arg Ser Ser Ser Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn
165 170 175
Trp Leu Thr His Leu Asn Tyr Thr Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met
180 185 190
Pro Asn Asn Glu Gln Phe Asp Lys Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His
195 200 205
Pro Gly Thr Asp Lys Asp Gln Ile Phe Leu Tyr Ala Gln Ser Ser Gly
210 215 220
Arg Ile Thr Val Ser Thr Lys Arg Ser Gln Gln Ala Val Ile Pro Asn
225 230 235 240
Ile Gly Ser Arg Pro Arg Ile Arg Asp Ile Pro Ser Arg Ile Ser Ile
245 250 255
Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr
260 265 270
Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly Tyr Phe Lys Ile Arg Ser Gly Lys
275 280 285
Ser Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala Pro Ile Gly Lys Cys Lys Ser Glu
290 295 300
Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn
305 310 315 320
Val Asn Arg Ile Thr Tyr Gly Ala Cys Pro Arg Tyr Val Lys His Ser
325 330 335
Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr
340 345 350
Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu
355 360 365
Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly
370 375 380
Arg Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln
385 390 395 400
Ile Asn Gly Lys Leu Ala Arg Val Ile Gly Lys Thr Asn Glu Lys Phe
405 410 415
His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp
420 425 430
Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn
435 440 445
Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr
450 455 460
Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe Glu Lys Thr Lys Lys Gln Leu Arg
465 470 475 480
Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys
485 490 495
Cys Asp Asn Ala Cys Ile Gly Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His
500 505 510
Asn Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly
515 520 525
Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe
530 535 540
Ala Ile Ser Ser Leu Val Leu Leu Val Ala Leu Leu Gly Phe Ile Met
545 550 555 560
Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile Arg Cys Asn Ile Cys Ile
565 570
<210> 26
<211> 1725
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК PDI-H3 Minn-CysTm
<400> 26
atggcgaaaa acgttgcgat tttcggctta ttgttttctc ttcttgtgtt ggttccttct 60
cagatcttcg cgcaaaaaat tcctggaaat gacaatagca cggcaacgct gtgccttggg 120
caccatgcag taccaaacgg aacgatagtg aaaacaatca caaatgaccg aattgaagtt 180
actaatgcta ctgagttggt tcagaattcc tcaataggtg aaatatgcga cagtcctcat 240
cagatccttg atggagagaa ctgcacacta atagatgctc tattgggaga ccctcagtgt 300
gatggctttc aaaataagaa atgggacctt tttgttgaac gaagcaaagc ctacagcaac 360
tgttaccctt atgatgtgcc ggattatgcc tcccttaggt cactagttgc ctcatccggc 420
acactggagt ttaacaatga aagcttcaat tggactggag tcactcaaaa cggaacaagt 480
tctgcttgca taaggagatc tagtagtagt ttctttagta gattaaattg gttgacccac 540
ttaaactaca catatccagc attgaacgtg actatgccaa acaaggaaca atttgacaaa 600
ttgtacattt ggggggttca ccacccgggt acggacaagg accaaatctt cctgtatgct 660
caatcatcag gaagaatcac agtatctacc aaaagaagcc aacaagctgt aatcccaaat 720
atcggatcta gacccagaat aagggatatc cctagcagaa taagcatcta ttggacaata 780
gtaaaaccgg gagacatact tttgattaac agcacaggga atctaattgc tcctaggggt 840
tacttcaaaa tacgaagtgg gaaaagctca ataatgagat cagatgcacc cattggcaaa 900
tgcaagtctg aatgcatcac tccaaatgga agcattccca atgacaaacc attccaaaat 960
gtaaacagga tcacatacgg ggcctgtccc agatatgtta agcatagcac tctgaaattg 1020
gcaacaggaa tgcgaaatgt accagagaaa caaactagag gcatatttgg cgcaatagcg 1080
ggtttcatag aaaatggttg ggagggaatg gtggatggtt ggtacggttt caggcatcaa 1140
aattctgagg gaagaggaca agcagcagat ctcaaaagca ctcaagcagc aatcgatcaa 1200
atcaatggga agctgaatcg gttgatcggg aaaaccaacg agaaattcca tcagattgaa 1260
aaagaattct cagaagtaga aggaagagtt caagaccttg agaaatatgt tgaggacact 1320
aaaatagatc tctggtcata caacgcggag cttcttgttg ccctggagaa ccaacataca 1380
attgatctaa ctgactcaga aatgaacaaa ctgtttgaaa aaacaaagaa gcaactgagg 1440
gaaaatgctg aggatatggg aaatggttgt ttcaaaatat accacaaatg tgacaatgcc 1500
tgcataggat caataagaaa tgaaacttat gaccacaatg tgtacaggga tgaagcatta 1560
aacaaccggt tccagatcaa gggagttgag ctgaagtcag ggtacaaaga ttggatccta 1620
tggatttcct ttgccatatc atcccttgta ctgttagttg ctttgttggg gttcatcatg 1680
tgggcctgcc aaaagggcaa cattagatgc aacatttgca tttga 1725
<210> 27
<211> 574
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> АК PDI-H3 Minn-CysTm
<400> 27
Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala Gln Lys Ile Pro Gly Asn Asp Asn
20 25 30
Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly His His Ala Val Pro Asn Gly Thr
35 40 45
Ile Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp Arg Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr
50 55 60
Glu Leu Val Gln Asn Ser Ser Ile Gly Glu Ile Cys Asp Ser Pro His
65 70 75 80
Gln Ile Leu Asp Gly Glu Asn Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly
85 90 95
Asp Pro Gln Cys Asp Gly Phe Gln Asn Lys Lys Trp Asp Leu Phe Val
100 105 110
Glu Arg Ser Lys Ala Tyr Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp
115 120 125
Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe
130 135 140
Asn Asn Glu Ser Phe Asn Trp Thr Gly Val Thr Gln Asn Gly Thr Ser
145 150 155 160
Ser Ala Cys Ile Arg Arg Ser Ser Ser Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn
165 170 175
Trp Leu Thr His Leu Asn Tyr Thr Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met
180 185 190
Pro Asn Lys Glu Gln Phe Asp Lys Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His
195 200 205
Pro Gly Thr Asp Lys Asp Gln Ile Phe Leu Tyr Ala Gln Ser Ser Gly
210 215 220
Arg Ile Thr Val Ser Thr Lys Arg Ser Gln Gln Ala Val Ile Pro Asn
225 230 235 240
Ile Gly Ser Arg Pro Arg Ile Arg Asp Ile Pro Ser Arg Ile Ser Ile
245 250 255
Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr
260 265 270
Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly Tyr Phe Lys Ile Arg Ser Gly Lys
275 280 285
Ser Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala Pro Ile Gly Lys Cys Lys Ser Glu
290 295 300
Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn
305 310 315 320
Val Asn Arg Ile Thr Tyr Gly Ala Cys Pro Arg Tyr Val Lys His Ser
325 330 335
Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr
340 345 350
Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu
355 360 365
Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly
370 375 380
Arg Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln
385 390 395 400
Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Leu Ile Gly Lys Thr Asn Glu Lys Phe
405 410 415
His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser Glu Val Glu Gly Arg Val Gln Asp
420 425 430
Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn
435 440 445
Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr
450 455 460
Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe Glu Lys Thr Lys Lys Gln Leu Arg
465 470 475 480
Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys
485 490 495
Cys Asp Asn Ala Cys Ile Gly Ser Ile Arg Asn Glu Thr Tyr Asp His
500 505 510
Asn Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly
515 520 525
Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe
530 535 540
Ala Ile Ser Ser Leu Val Leu Leu Val Ala Leu Leu Gly Phe Ile Met
545 550 555 560
Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile Arg Cys Asn Ile Cys Ile
565 570
<210> 28
<211> 60
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер H3Minn(N382A+L384V).r
<400> 28
gttggttttc ccgatcaccc gagccagctt cccattgatt tgatcgattg ctgcttgagt 60
<210> 29
<211> 56
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер H3Minn(N382A+L384V).c
<400> 29
aatcaatggg aagctggctc gggtgatcgg gaaaaccaac gagaaattcc atcaga 56
<210> 30
<211> 1725
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК PDI-H3 Minn-N382A+L384V-CysTm
<400> 30
atggcgaaaa acgttgcgat tttcggctta ttgttttctc ttcttgtgtt ggttccttct 60
cagatcttcg cgcaaaaaat tcctggaaat gacaatagca cggcaacgct gtgccttggg 120
caccatgcag taccaaacgg aacgatagtg aaaacaatca caaatgaccg aattgaagtt 180
actaatgcta ctgagttggt tcagaattcc tcaataggtg aaatatgcga cagtcctcat 240
cagatccttg atggagagaa ctgcacacta atagatgctc tattgggaga ccctcagtgt 300
gatggctttc aaaataagaa atgggacctt tttgttgaac gaagcaaagc ctacagcaac 360
tgttaccctt atgatgtgcc ggattatgcc tcccttaggt cactagttgc ctcatccggc 420
acactggagt ttaacaatga aagcttcaat tggactggag tcactcaaaa cggaacaagt 480
tctgcttgca taaggagatc tagtagtagt ttctttagta gattaaattg gttgacccac 540
ttaaactaca catatccagc attgaacgtg actatgccaa acaaggaaca atttgacaaa 600
ttgtacattt ggggggttca ccacccgggt acggacaagg accaaatctt cctgtatgct 660
caatcatcag gaagaatcac agtatctacc aaaagaagcc aacaagctgt aatcccaaat 720
atcggatcta gacccagaat aagggatatc cctagcagaa taagcatcta ttggacaata 780
gtaaaaccgg gagacatact tttgattaac agcacaggga atctaattgc tcctaggggt 840
tacttcaaaa tacgaagtgg gaaaagctca ataatgagat cagatgcacc cattggcaaa 900
tgcaagtctg aatgcatcac tccaaatgga agcattccca atgacaaacc attccaaaat 960
gtaaacagga tcacatacgg ggcctgtccc agatatgtta agcatagcac tctgaaattg 1020
gcaacaggaa tgcgaaatgt accagagaaa caaactagag gcatatttgg cgcaatagcg 1080
ggtttcatag aaaatggttg ggagggaatg gtggatggtt ggtacggttt caggcatcaa 1140
aattctgagg gaagaggaca agcagcagat ctcaaaagca ctcaagcagc aatcgatcaa 1200
atcaatggga agctggctcg ggtgatcggg aaaaccaacg agaaattcca tcagattgaa 1260
aaagaattct cagaagtaga aggaagagtt caagaccttg agaaatatgt tgaggacact 1320
aaaatagatc tctggtcata caacgcggag cttcttgttg ccctggagaa ccaacataca 1380
attgatctaa ctgactcaga aatgaacaaa ctgtttgaaa aaacaaagaa gcaactgagg 1440
gaaaatgctg aggatatggg aaatggttgt ttcaaaatat accacaaatg tgacaatgcc 1500
tgcataggat caataagaaa tgaaacttat gaccacaatg tgtacaggga tgaagcatta 1560
aacaaccggt tccagatcaa gggagttgag ctgaagtcag ggtacaaaga ttggatccta 1620
tggatttcct ttgccatatc atcccttgta ctgttagttg ctttgttggg gttcatcatg 1680
tgggcctgcc aaaagggcaa cattagatgc aacatttgca tttga 1725
<210> 31
<211> 574
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> АК PDI-H3 Minn-N382A+L384V-CysTm
<400> 31
Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala Gln Lys Ile Pro Gly Asn Asp Asn
20 25 30
Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly His His Ala Val Pro Asn Gly Thr
35 40 45
Ile Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp Arg Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr
50 55 60
Glu Leu Val Gln Asn Ser Ser Ile Gly Glu Ile Cys Asp Ser Pro His
65 70 75 80
Gln Ile Leu Asp Gly Glu Asn Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly
85 90 95
Asp Pro Gln Cys Asp Gly Phe Gln Asn Lys Lys Trp Asp Leu Phe Val
100 105 110
Glu Arg Ser Lys Ala Tyr Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp
115 120 125
Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe
130 135 140
Asn Asn Glu Ser Phe Asn Trp Thr Gly Val Thr Gln Asn Gly Thr Ser
145 150 155 160
Ser Ala Cys Ile Arg Arg Ser Ser Ser Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn
165 170 175
Trp Leu Thr His Leu Asn Tyr Thr Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met
180 185 190
Pro Asn Lys Glu Gln Phe Asp Lys Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His
195 200 205
Pro Gly Thr Asp Lys Asp Gln Ile Phe Leu Tyr Ala Gln Ser Ser Gly
210 215 220
Arg Ile Thr Val Ser Thr Lys Arg Ser Gln Gln Ala Val Ile Pro Asn
225 230 235 240
Ile Gly Ser Arg Pro Arg Ile Arg Asp Ile Pro Ser Arg Ile Ser Ile
245 250 255
Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr
260 265 270
Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly Tyr Phe Lys Ile Arg Ser Gly Lys
275 280 285
Ser Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala Pro Ile Gly Lys Cys Lys Ser Glu
290 295 300
Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn
305 310 315 320
Val Asn Arg Ile Thr Tyr Gly Ala Cys Pro Arg Tyr Val Lys His Ser
325 330 335
Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr
340 345 350
Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu
355 360 365
Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly
370 375 380
Arg Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln
385 390 395 400
Ile Asn Gly Lys Leu Ala Arg Val Ile Gly Lys Thr Asn Glu Lys Phe
405 410 415
His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser Glu Val Glu Gly Arg Val Gln Asp
420 425 430
Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn
435 440 445
Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr
450 455 460
Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe Glu Lys Thr Lys Lys Gln Leu Arg
465 470 475 480
Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys
485 490 495
Cys Asp Asn Ala Cys Ile Gly Ser Ile Arg Asn Glu Thr Tyr Asp His
500 505 510
Asn Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly
515 520 525
Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe
530 535 540
Ala Ile Ser Ser Leu Val Leu Leu Val Ala Leu Leu Gly Phe Ile Met
545 550 555 560
Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile Arg Cys Asn Ile Cys Ile
565 570
<210> 32
<211> 1725
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК PDI-H3 SAus-CysTm
<400> 32
atggcgaaaa acgttgcgat tttcggctta ttgttttctc ttcttgtgtt ggttccttct 60
cagatcttcg cgcaaaaaat tcctggaaat gacaatagca cggcaacgct gtgccttggg 120
caccatgcag taccaaacgg aacgatagtg aaaacaatca caaatgaccg aattgaagtt 180
actaatgcta ctgagttggt tcagaattcc tcaataggtg aaatatgcga cagtcctcat 240
cagatccttg atggagagaa ctgcacacta atagatgctc tattgggaga ccctcagtgt 300
gatggctttc aaaataagaa atgggacctt tttgttgaac gaagcaaagc ctacagcaac 360
tgttaccctt atgatgtgcc ggattatgcc tcccttaggt cactagttgc ctcatccggc 420
acactggagt ttaaaaatga aagcttcaat tggactggag tcactcaaaa cggaacaagt 480
tctgcttgca taaggagatc tagtagtagt ttctttagta gattaaattg gttgacccac 540
ttaaactaca catatccagc attgaacgtg actatgccaa acaaggaaca atttgacaaa 600
ttgtacattt ggggggttca ccacccgggt acggacaagg accaaatctt cctgtatgct 660
caatcatcag gaagaatcac agtatctacc aaaagaagcc aacaagctgt aatcccaaat 720
atcggatcta gacccagaat aagggatatc cctagcagaa taagcatcta ttggacaata 780
gtaaaaccgg gagacatact tttgattaac agcacaggga atctaattgc tcctaggggt 840
tacttcaaaa tacgaagtgg gaaaagctca ataatgagat cagatgcacc cattggcaaa 900
tgcaagtctg aatgcatcac tccaaatgga agcattccca atgacaaacc attccaaaat 960
gtaaacagga tcacatacgg ggcctgtccc agatatgtta agcatagcac tctgaaattg 1020
gcaacaggaa tgcgaaatgt accagagaaa caaactagag gcatatttgg cgcaatagcg 1080
ggtttcatag aaaatggttg ggagggaatg gtggatggtt ggtacggttt caggcatcaa 1140
aattctgagg gaagaggaca agcagcagat ctcaaaagca ctcaagcagc aatcgatcaa 1200
atcaatggga agctgaatcg gttgatcggg aaaaccaacg agaaattcca tcagattgaa 1260
aaagaattct cagaagtaga aggaagagtt caagaccttg agaaatatgt tgaggacact 1320
aaaatagatc tctggtcata caacgcggag cttcttgttg ccctggagaa ccaacataca 1380
attgatctaa ctgactcaga aatgaacaaa ctgtttgaaa aaacaaagaa gcaactgagg 1440
gaaaatgctg aggatatggg aaatggttgt ttcaaaatat accacaaatg tgacaatgcc 1500
tgcataggat caataagaaa tgaaacttat gaccacaatg tgtacaggga tgaagcatta 1560
aacaaccggt tccagatcaa gggagttgag ctgaagtcag ggtacaaaga ttggatccta 1620
tggatttcct ttgccatatc atcccttgta ctgttagttg ctttgttggg gttcatcatg 1680
tgggcctgcc aaaagggcaa cattagatgc aacatttgca tttga 1725
<210> 33
<211> 574
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> АК PDI-H3 SAus-CysTm
<400> 33
Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala Gln Lys Ile Pro Gly Asn Asp Asn
20 25 30
Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly His His Ala Val Pro Asn Gly Thr
35 40 45
Ile Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp Arg Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr
50 55 60
Glu Leu Val Gln Asn Ser Ser Ile Gly Glu Ile Cys Asp Ser Pro His
65 70 75 80
Gln Ile Leu Asp Gly Glu Asn Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly
85 90 95
Asp Pro Gln Cys Asp Gly Phe Gln Asn Lys Lys Trp Asp Leu Phe Val
100 105 110
Glu Arg Ser Lys Ala Tyr Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp
115 120 125
Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe
130 135 140
Lys Asn Glu Ser Phe Asn Trp Thr Gly Val Thr Gln Asn Gly Thr Ser
145 150 155 160
Ser Ala Cys Ile Arg Arg Ser Ser Ser Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn
165 170 175
Trp Leu Thr His Leu Asn Tyr Thr Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met
180 185 190
Pro Asn Lys Glu Gln Phe Asp Lys Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His
195 200 205
Pro Gly Thr Asp Lys Asp Gln Ile Phe Leu Tyr Ala Gln Ser Ser Gly
210 215 220
Arg Ile Thr Val Ser Thr Lys Arg Ser Gln Gln Ala Val Ile Pro Asn
225 230 235 240
Ile Gly Ser Arg Pro Arg Ile Arg Asp Ile Pro Ser Arg Ile Ser Ile
245 250 255
Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr
260 265 270
Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly Tyr Phe Lys Ile Arg Ser Gly Lys
275 280 285
Ser Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala Pro Ile Gly Lys Cys Lys Ser Glu
290 295 300
Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn
305 310 315 320
Val Asn Arg Ile Thr Tyr Gly Ala Cys Pro Arg Tyr Val Lys His Ser
325 330 335
Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr
340 345 350
Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu
355 360 365
Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly
370 375 380
Arg Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln
385 390 395 400
Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Leu Ile Gly Lys Thr Asn Glu Lys Phe
405 410 415
His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser Glu Val Glu Gly Arg Val Gln Asp
420 425 430
Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn
435 440 445
Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr
450 455 460
Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe Glu Lys Thr Lys Lys Gln Leu Arg
465 470 475 480
Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys
485 490 495
Cys Asp Asn Ala Cys Ile Gly Ser Ile Arg Asn Glu Thr Tyr Asp His
500 505 510
Asn Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly
515 520 525
Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe
530 535 540
Ala Ile Ser Ser Leu Val Leu Leu Val Ala Leu Leu Gly Phe Ile Met
545 550 555 560
Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile Arg Cys Asn Ile Cys Ile
565 570
<210> 34
<211> 1725
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК PDI-H3 SAus-N382A+L384V-CysTm
<400> 34
atggcgaaaa acgttgcgat tttcggctta ttgttttctc ttcttgtgtt ggttccttct 60
cagatcttcg cgcaaaaaat tcctggaaat gacaatagca cggcaacgct gtgccttggg 120
caccatgcag taccaaacgg aacgatagtg aaaacaatca caaatgaccg aattgaagtt 180
actaatgcta ctgagttggt tcagaattcc tcaataggtg aaatatgcga cagtcctcat 240
cagatccttg atggagagaa ctgcacacta atagatgctc tattgggaga ccctcagtgt 300
gatggctttc aaaataagaa atgggacctt tttgttgaac gaagcaaagc ctacagcaac 360
tgttaccctt atgatgtgcc ggattatgcc tcccttaggt cactagttgc ctcatccggc 420
acactggagt ttaaaaatga aagcttcaat tggactggag tcactcaaaa cggaacaagt 480
tctgcttgca taaggagatc tagtagtagt ttctttagta gattaaattg gttgacccac 540
ttaaactaca catatccagc attgaacgtg actatgccaa acaaggaaca atttgacaaa 600
ttgtacattt ggggggttca ccacccgggt acggacaagg accaaatctt cctgtatgct 660
caatcatcag gaagaatcac agtatctacc aaaagaagcc aacaagctgt aatcccaaat 720
atcggatcta gacccagaat aagggatatc cctagcagaa taagcatcta ttggacaata 780
gtaaaaccgg gagacatact tttgattaac agcacaggga atctaattgc tcctaggggt 840
tacttcaaaa tacgaagtgg gaaaagctca ataatgagat cagatgcacc cattggcaaa 900
tgcaagtctg aatgcatcac tccaaatgga agcattccca atgacaaacc attccaaaat 960
gtaaacagga tcacatacgg ggcctgtccc agatatgtta agcatagcac tctgaaattg 1020
gcaacaggaa tgcgaaatgt accagagaaa caaactagag gcatatttgg cgcaatagcg 1080
ggtttcatag aaaatggttg ggagggaatg gtggatggtt ggtacggttt caggcatcaa 1140
aattctgagg gaagaggaca agcagcagat ctcaaaagca ctcaagcagc aatcgatcaa 1200
atcaatggga agctggctcg ggtgatcggg aaaaccaacg agaaattcca tcagattgaa 1260
aaagaattct cagaagtaga aggaagagtt caagaccttg agaaatatgt tgaggacact 1320
aaaatagatc tctggtcata caacgcggag cttcttgttg ccctggagaa ccaacataca 1380
attgatctaa ctgactcaga aatgaacaaa ctgtttgaaa aaacaaagaa gcaactgagg 1440
gaaaatgctg aggatatggg aaatggttgt ttcaaaatat accacaaatg tgacaatgcc 1500
tgcataggat caataagaaa tgaaacttat gaccacaatg tgtacaggga tgaagcatta 1560
aacaaccggt tccagatcaa gggagttgag ctgaagtcag ggtacaaaga ttggatccta 1620
tggatttcct ttgccatatc atcccttgta ctgttagttg ctttgttggg gttcatcatg 1680
tgggcctgcc aaaagggcaa cattagatgc aacatttgca tttga 1725
<210> 35
<211> 574
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> АК PDI-H3 SAus-N382A+L384V-CysTm
<400> 35
Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala Gln Lys Ile Pro Gly Asn Asp Asn
20 25 30
Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly His His Ala Val Pro Asn Gly Thr
35 40 45
Ile Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp Arg Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr
50 55 60
Glu Leu Val Gln Asn Ser Ser Ile Gly Glu Ile Cys Asp Ser Pro His
65 70 75 80
Gln Ile Leu Asp Gly Glu Asn Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly
85 90 95
Asp Pro Gln Cys Asp Gly Phe Gln Asn Lys Lys Trp Asp Leu Phe Val
100 105 110
Glu Arg Ser Lys Ala Tyr Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp
115 120 125
Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe
130 135 140
Lys Asn Glu Ser Phe Asn Trp Thr Gly Val Thr Gln Asn Gly Thr Ser
145 150 155 160
Ser Ala Cys Ile Arg Arg Ser Ser Ser Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn
165 170 175
Trp Leu Thr His Leu Asn Tyr Thr Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met
180 185 190
Pro Asn Lys Glu Gln Phe Asp Lys Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His
195 200 205
Pro Gly Thr Asp Lys Asp Gln Ile Phe Leu Tyr Ala Gln Ser Ser Gly
210 215 220
Arg Ile Thr Val Ser Thr Lys Arg Ser Gln Gln Ala Val Ile Pro Asn
225 230 235 240
Ile Gly Ser Arg Pro Arg Ile Arg Asp Ile Pro Ser Arg Ile Ser Ile
245 250 255
Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr
260 265 270
Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly Tyr Phe Lys Ile Arg Ser Gly Lys
275 280 285
Ser Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala Pro Ile Gly Lys Cys Lys Ser Glu
290 295 300
Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn
305 310 315 320
Val Asn Arg Ile Thr Tyr Gly Ala Cys Pro Arg Tyr Val Lys His Ser
325 330 335
Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr
340 345 350
Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu
355 360 365
Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly
370 375 380
Arg Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln
385 390 395 400
Ile Asn Gly Lys Leu Ala Arg Val Ile Gly Lys Thr Asn Glu Lys Phe
405 410 415
His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser Glu Val Glu Gly Arg Val Gln Asp
420 425 430
Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn
435 440 445
Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr
450 455 460
Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe Glu Lys Thr Lys Lys Gln Leu Arg
465 470 475 480
Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys
485 490 495
Cys Asp Asn Ala Cys Ile Gly Ser Ile Arg Asn Glu Thr Tyr Asp His
500 505 510
Asn Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly
515 520 525
Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe
530 535 540
Ala Ile Ser Ser Leu Val Leu Leu Val Ala Leu Leu Gly Phe Ile Met
545 550 555 560
Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile Arg Cys Asn Ile Cys Ile
565 570
<210> 36
<211> 1725
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК PDI-H3 Bang-CysTm
<400> 36
atggcgaaaa acgttgcgat tttcggctta ttgttttctc ttcttgtgtt ggttccttct 60
cagatcttcg cgcaaaaaat tcctggaaat gacaatagca cggcaacgct gtgccttggg 120
caccatgcag taccaaacgg aacgatagtg aaaacaatca caaatgaccg aattgaagtt 180
actaatgcta ctgagctggt tcagaattcc tcaataggtg aaatatgcga cagtcctcat 240
cagatccttg atggagaaaa ctgcacacta atagatgctc tattgggaga ccctcagtgt 300
gatggctttc aaaataagaa atgggacctt tttgttgaac gaagcaaagc ctacagcaac 360
tgttaccctt atgatgtgcc ggattatgcc tcccttaggt cactagttgc ctcatccggc 420
acactggagt ttaacaatga aagcttcaat tggactggag tcactcaaaa cggaacaagt 480
tctgcttgca taaggaaatc tagtagtagt ttctttagta gattaaattg gttgacccac 540
ttaaactaca catacccagc attgaacgtg actgtgccaa acaatgaaca atttgacaaa 600
ttgtacattt ggggggttca ccacccgggt acggacaagg accaaatctt cctgtatgct 660
cgatcatcag gaagaatcac agtatctacc aaaagaagcc aacaagctgt aatcccaaat 720
atcggatcta gacccagaat aagggatatc cctagcagaa taagcatcta ttggacaata 780
gtaaaaccgg gagacatact tttgattaac agcacaggga atctaattgc tcctaggggt 840
tacttcaaaa tacgaagtgg gaaaagctca ataatgagat cagatgcacc cattggcaaa 900
tgcaagtctg aatgcatcac tccaaatgga agcattccca atgacaaacc attccaaaat 960
gtaaacagga tcacatacgg ggcctgtccc agatatgtta agcatagcac tctgaaattg 1020
gcaacaggaa tgcgaaatgt accagagaaa caaactagag gcatatttgg cgcaatagcg 1080
ggtttcatag aaaatggttg ggagggaatg gtggatggtt ggtacggttt caggcatcaa 1140
aattctgagg gaagaggaca agcagcagat ctcaaaagca ctcaagcagc aatcgatcaa 1200
atcaatggga agctgaatcg attgatcggg aaaaccaacg agaaattcca tcagattgaa 1260
aaagaattct cagaagtaga aggaagaatt caggaccttg agaaatatgt tgaggacact 1320
aaaatagatc tctggtcata caacgcggag cttcttgttg ccctggagaa tcaacataca 1380
attgatctaa ctgactcaga aatgaacaaa ctgtttgaaa aaacaaagaa gcaactgagg 1440
gaaaatgctg aggatatggg aaatggttgt ttcaaaatat accacaaatg tgacaatgcc 1500
tgcataggat caataagaaa tggaacttat gaccacaatg tgtacaggga tgaagcatta 1560
aacaaccggt tccagatcaa gggagttgag ctgaagtcag ggtacaaaga ttggatccta 1620
tggatttcct ttgccatatc atcccttgta ctgttagttg ctttgttggg gttcatcatg 1680
tgggcctgcc aaaagggcaa cattaggtgc aacatttgca tttga 1725
<210> 37
<211> 574
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> АК PDI-H3 Bang-CysTm
<400> 37
Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala Gln Lys Ile Pro Gly Asn Asp Asn
20 25 30
Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly His His Ala Val Pro Asn Gly Thr
35 40 45
Ile Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp Arg Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr
50 55 60
Glu Leu Val Gln Asn Ser Ser Ile Gly Glu Ile Cys Asp Ser Pro His
65 70 75 80
Gln Ile Leu Asp Gly Glu Asn Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly
85 90 95
Asp Pro Gln Cys Asp Gly Phe Gln Asn Lys Lys Trp Asp Leu Phe Val
100 105 110
Glu Arg Ser Lys Ala Tyr Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp
115 120 125
Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe
130 135 140
Asn Asn Glu Ser Phe Asn Trp Thr Gly Val Thr Gln Asn Gly Thr Ser
145 150 155 160
Ser Ala Cys Ile Arg Lys Ser Ser Ser Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn
165 170 175
Trp Leu Thr His Leu Asn Tyr Thr Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Val
180 185 190
Pro Asn Asn Glu Gln Phe Asp Lys Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His
195 200 205
Pro Gly Thr Asp Lys Asp Gln Ile Phe Leu Tyr Ala Arg Ser Ser Gly
210 215 220
Arg Ile Thr Val Ser Thr Lys Arg Ser Gln Gln Ala Val Ile Pro Asn
225 230 235 240
Ile Gly Ser Arg Pro Arg Ile Arg Asp Ile Pro Ser Arg Ile Ser Ile
245 250 255
Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr
260 265 270
Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly Tyr Phe Lys Ile Arg Ser Gly Lys
275 280 285
Ser Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala Pro Ile Gly Lys Cys Lys Ser Glu
290 295 300
Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn
305 310 315 320
Val Asn Arg Ile Thr Tyr Gly Ala Cys Pro Arg Tyr Val Lys His Ser
325 330 335
Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr
340 345 350
Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu
355 360 365
Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly
370 375 380
Arg Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln
385 390 395 400
Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Leu Ile Gly Lys Thr Asn Glu Lys Phe
405 410 415
His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp
420 425 430
Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn
435 440 445
Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr
450 455 460
Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe Glu Lys Thr Lys Lys Gln Leu Arg
465 470 475 480
Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys
485 490 495
Cys Asp Asn Ala Cys Ile Gly Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His
500 505 510
Asn Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly
515 520 525
Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe
530 535 540
Ala Ile Ser Ser Leu Val Leu Leu Val Ala Leu Leu Gly Phe Ile Met
545 550 555 560
Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile Arg Cys Asn Ile Cys Ile
565 570
<210> 38
<211> 1725
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК PDI-H3 Bang-N382A+L384V-CysTm
<400> 38
atggcgaaaa acgttgcgat tttcggctta ttgttttctc ttcttgtgtt ggttccttct 60
cagatcttcg cgcaaaaaat tcctggaaat gacaatagca cggcaacgct gtgccttggg 120
caccatgcag taccaaacgg aacgatagtg aaaacaatca caaatgaccg aattgaagtt 180
actaatgcta ctgagctggt tcagaattcc tcaataggtg aaatatgcga cagtcctcat 240
cagatccttg atggagaaaa ctgcacacta atagatgctc tattgggaga ccctcagtgt 300
gatggctttc aaaataagaa atgggacctt tttgttgaac gaagcaaagc ctacagcaac 360
tgttaccctt atgatgtgcc ggattatgcc tcccttaggt cactagttgc ctcatccggc 420
acactggagt ttaacaatga aagcttcaat tggactggag tcactcaaaa cggaacaagt 480
tctgcttgca taaggaaatc tagtagtagt ttctttagta gattaaattg gttgacccac 540
ttaaactaca catacccagc attgaacgtg actgtgccaa acaatgaaca atttgacaaa 600
ttgtacattt ggggggttca ccacccgggt acggacaagg accaaatctt cctgtatgct 660
cgatcatcag gaagaatcac agtatctacc aaaagaagcc aacaagctgt aatcccaaat 720
atcggatcta gacccagaat aagggatatc cctagcagaa taagcatcta ttggacaata 780
gtaaaaccgg gagacatact tttgattaac agcacaggga atctaattgc tcctaggggt 840
tacttcaaaa tacgaagtgg gaaaagctca ataatgagat cagatgcacc cattggcaaa 900
tgcaagtctg aatgcatcac tccaaatgga agcattccca atgacaaacc attccaaaat 960
gtaaacagga tcacatacgg ggcctgtccc agatatgtta agcatagcac tctgaaattg 1020
gcaacaggaa tgcgaaatgt accagagaaa caaactagag gcatatttgg cgcaatagcg 1080
ggtttcatag aaaatggttg ggagggaatg gtggatggtt ggtacggttt caggcatcaa 1140
aattctgagg gaagaggaca agcagcagat ctcaaaagca ctcaagcagc aatcgatcaa 1200
atcaatggga agctggctcg agtgatcggg aaaaccaacg agaaattcca tcagattgaa 1260
aaagaattct cagaagtaga aggaagaatt caggaccttg agaaatatgt tgaggacact 1320
aaaatagatc tctggtcata caacgcggag cttcttgttg ccctggagaa tcaacataca 1380
attgatctaa ctgactcaga aatgaacaaa ctgtttgaaa aaacaaagaa gcaactgagg 1440
gaaaatgctg aggatatggg aaatggttgt ttcaaaatat accacaaatg tgacaatgcc 1500
tgcataggat caataagaaa tggaacttat gaccacaatg tgtacaggga tgaagcatta 1560
aacaaccggt tccagatcaa gggagttgag ctgaagtcag ggtacaaaga ttggatccta 1620
tggatttcct ttgccatatc atcccttgta ctgttagttg ctttgttggg gttcatcatg 1680
tgggcctgcc aaaagggcaa cattaggtgc aacatttgca tttga 1725
<210> 39
<211> 574
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> АК PDI-H3 Bang-N382A+L384V-CysTm
<400> 39
Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala Gln Lys Ile Pro Gly Asn Asp Asn
20 25 30
Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly His His Ala Val Pro Asn Gly Thr
35 40 45
Ile Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp Arg Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr
50 55 60
Glu Leu Val Gln Asn Ser Ser Ile Gly Glu Ile Cys Asp Ser Pro His
65 70 75 80
Gln Ile Leu Asp Gly Glu Asn Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly
85 90 95
Asp Pro Gln Cys Asp Gly Phe Gln Asn Lys Lys Trp Asp Leu Phe Val
100 105 110
Glu Arg Ser Lys Ala Tyr Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp
115 120 125
Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe
130 135 140
Asn Asn Glu Ser Phe Asn Trp Thr Gly Val Thr Gln Asn Gly Thr Ser
145 150 155 160
Ser Ala Cys Ile Arg Lys Ser Ser Ser Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn
165 170 175
Trp Leu Thr His Leu Asn Tyr Thr Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Val
180 185 190
Pro Asn Asn Glu Gln Phe Asp Lys Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His
195 200 205
Pro Gly Thr Asp Lys Asp Gln Ile Phe Leu Tyr Ala Arg Ser Ser Gly
210 215 220
Arg Ile Thr Val Ser Thr Lys Arg Ser Gln Gln Ala Val Ile Pro Asn
225 230 235 240
Ile Gly Ser Arg Pro Arg Ile Arg Asp Ile Pro Ser Arg Ile Ser Ile
245 250 255
Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr
260 265 270
Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly Tyr Phe Lys Ile Arg Ser Gly Lys
275 280 285
Ser Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala Pro Ile Gly Lys Cys Lys Ser Glu
290 295 300
Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn
305 310 315 320
Val Asn Arg Ile Thr Tyr Gly Ala Cys Pro Arg Tyr Val Lys His Ser
325 330 335
Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr
340 345 350
Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu
355 360 365
Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly
370 375 380
Arg Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln
385 390 395 400
Ile Asn Gly Lys Leu Ala Arg Val Ile Gly Lys Thr Asn Glu Lys Phe
405 410 415
His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp
420 425 430
Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn
435 440 445
Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr
450 455 460
Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe Glu Lys Thr Lys Lys Gln Leu Arg
465 470 475 480
Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys
485 490 495
Cys Asp Asn Ala Cys Ile Gly Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His
500 505 510
Asn Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly
515 520 525
Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe
530 535 540
Ala Ile Ser Ser Leu Val Leu Leu Val Ala Leu Leu Gly Phe Ile Met
545 550 555 560
Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile Arg Cys Asn Ile Cys Ile
565 570
<210> 40
<211> 54
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер H3_Swi(F392D).r
<400> 40
ttttcaatct gatggtcttt ctcgttggtt ttcccgatca atcgattcag cttc 54
<210> 41
<211> 48
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер H3_Swi(F392D).c
<400> 41
tcgggaaaac caacgagaaa gaccatcaga ttgaaaaaga attctcag 48
<210> 42
<211> 1725
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК PDI-H3 Switz-F392D
<400> 42
atggcgaaaa acgttgcgat tttcggctta ttgttttctc ttcttgtgtt ggttccttct 60
cagatcttcg cgcaaaaact tcctggaaat gacaatagca cggcaacgct gtgccttggg 120
caccatgcag taccaaacgg aacgatagtg aaaacaatca cgaatgaccg aattgaagtt 180
actaatgcta ctgagctggt tcagaattcc tcaataggtg aaatatgcga cagtcctcat 240
cagatccttg atggagaaaa ctgcacacta atagatgctc tattgggaga ccctcagtgt 300
gatggctttc aaaataagaa atgggacctt tttgttgaac gaagcaaagc ctacagcaac 360
tgttaccctt atgatgtgcc ggattatgcc tcccttaggt cactagttgc ctcatccggc 420
acactggagt ttaacaatga aagcttcaat tgggctggag tcactcaaaa cggaacaagt 480
tcttcttgca taaggggatc taatagtagt ttctttagta gattaaattg gttgacccac 540
ttaaactcca aatacccagc attaaacgtg actatgccaa acaatgaaca atttgacaaa 600
ttgtacattt ggggggttca ccacccgggt acggacaagg accaaatctt cctgtatgca 660
caatcatcag gaagaatcac agtatctacc aaaagaagcc aacaagctgt aatcccgaat 720
atcggatcta gacccagaat aagggatatc cctagcagaa taagcatcta ttggacaata 780
gtaaaaccgg gagacatact tttgattaac agcacaggga atctaattgc tcctaggggt 840
tacttcaaaa tacgaagtgg gaaaagctca ataatgagat cagatgcacc cattggcaaa 900
tgcaagtctg aatgcatcac tccaaatgga agcattccca atgacaaacc attccaaaat 960
gtaaacagga tcacatacgg ggcctgtccc agatatgtta agcaaagcac tctgaaattg 1020
gcaacaggaa tgcgaaatgt accagagaga caaactagag gcatatttgg cgcaatagcg 1080
ggtttcatag aaaatggttg ggagggaatg gtggatggtt ggtacggctt caggcatcaa 1140
aattctgagg gaagaggaca agcagcagat ctcaaaagca ctcaagcagc aatcgatcaa 1200
atcaatggga agctgaatcg attgatcggg aaaaccaacg agaaagacca tcagattgaa 1260
aaagaattct cagaagtaga agggagaatt caggaccttg agaaatatgt tgaggacaca 1320
aaaatagatc tctggtcata caacgcggag cttcttgttg ccctggagaa ccaacataca 1380
attgatctaa ctgactcaga aatgaacaaa ctgtttgaaa aaacaaagaa gcaactgagg 1440
gaaaatgctg aggatatggg caatggttgt ttcaaaatat accacaaatg tgacaatgcc 1500
tgcataggat caatcagaaa tggaacttat gaccacgatg tatacaggga tgaagcatta 1560
aacaaccggt tccagatcaa gggagttgag ctgaagtcag ggtacaaaga ttggatccta 1620
tggatttcct ttgccatatc atgttttttg ctttgtgttg ctttgttggg gttcatcatg 1680
tgggcctgcc aaaagggcaa cattaggtgc aacatttgca tttga 1725
<210> 43
<211> 574
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> АК PDI-H3 Switz-F392D
<400> 43
Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala Gln Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn
20 25 30
Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly His His Ala Val Pro Asn Gly Thr
35 40 45
Ile Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp Arg Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr
50 55 60
Glu Leu Val Gln Asn Ser Ser Ile Gly Glu Ile Cys Asp Ser Pro His
65 70 75 80
Gln Ile Leu Asp Gly Glu Asn Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly
85 90 95
Asp Pro Gln Cys Asp Gly Phe Gln Asn Lys Lys Trp Asp Leu Phe Val
100 105 110
Glu Arg Ser Lys Ala Tyr Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp
115 120 125
Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe
130 135 140
Asn Asn Glu Ser Phe Asn Trp Ala Gly Val Thr Gln Asn Gly Thr Ser
145 150 155 160
Ser Ser Cys Ile Arg Gly Ser Asn Ser Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn
165 170 175
Trp Leu Thr His Leu Asn Ser Lys Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met
180 185 190
Pro Asn Asn Glu Gln Phe Asp Lys Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His
195 200 205
Pro Gly Thr Asp Lys Asp Gln Ile Phe Leu Tyr Ala Gln Ser Ser Gly
210 215 220
Arg Ile Thr Val Ser Thr Lys Arg Ser Gln Gln Ala Val Ile Pro Asn
225 230 235 240
Ile Gly Ser Arg Pro Arg Ile Arg Asp Ile Pro Ser Arg Ile Ser Ile
245 250 255
Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr
260 265 270
Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly Tyr Phe Lys Ile Arg Ser Gly Lys
275 280 285
Ser Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala Pro Ile Gly Lys Cys Lys Ser Glu
290 295 300
Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn
305 310 315 320
Val Asn Arg Ile Thr Tyr Gly Ala Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gln Ser
325 330 335
Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Arg Gln Thr
340 345 350
Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu
355 360 365
Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly
370 375 380
Arg Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln
385 390 395 400
Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Leu Ile Gly Lys Thr Asn Glu Lys Asp
405 410 415
His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp
420 425 430
Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn
435 440 445
Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr
450 455 460
Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe Glu Lys Thr Lys Lys Gln Leu Arg
465 470 475 480
Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys
485 490 495
Cys Asp Asn Ala Cys Ile Gly Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His
500 505 510
Asp Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly
515 520 525
Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe
530 535 540
Ala Ile Ser Cys Phe Leu Leu Cys Val Ala Leu Leu Gly Phe Ile Met
545 550 555 560
Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile Arg Cys Asn Ile Cys Ile
565 570
<210> 44
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер H3_Swi(L431M).r
<400> 44
ttgtatgttg gttctccatg gcaacaagaa gctccgcgtt gtatgaccag 50
<210> 45
<211> 54
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер H3_Swi(L431M).c
<400> 45
ggagcttctt gttgccatgg agaaccaaca tacaattgat ctaactgact caga 54
<210> 46
<211> 1725
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК PDI-H3 Switz-L431M
<400> 46
atggcgaaaa acgttgcgat tttcggctta ttgttttctc ttcttgtgtt ggttccttct 60
cagatcttcg cgcaaaaact tcctggaaat gacaatagca cggcaacgct gtgccttggg 120
caccatgcag taccaaacgg aacgatagtg aaaacaatca cgaatgaccg aattgaagtt 180
actaatgcta ctgagctggt tcagaattcc tcaataggtg aaatatgcga cagtcctcat 240
cagatccttg atggagaaaa ctgcacacta atagatgctc tattgggaga ccctcagtgt 300
gatggctttc aaaataagaa atgggacctt tttgttgaac gaagcaaagc ctacagcaac 360
tgttaccctt atgatgtgcc ggattatgcc tcccttaggt cactagttgc ctcatccggc 420
acactggagt ttaacaatga aagcttcaat tgggctggag tcactcaaaa cggaacaagt 480
tcttcttgca taaggggatc taatagtagt ttctttagta gattaaattg gttgacccac 540
ttaaactcca aatacccagc attaaacgtg actatgccaa acaatgaaca atttgacaaa 600
ttgtacattt ggggggttca ccacccgggt acggacaagg accaaatctt cctgtatgca 660
caatcatcag gaagaatcac agtatctacc aaaagaagcc aacaagctgt aatcccgaat 720
atcggatcta gacccagaat aagggatatc cctagcagaa taagcatcta ttggacaata 780
gtaaaaccgg gagacatact tttgattaac agcacaggga atctaattgc tcctaggggt 840
tacttcaaaa tacgaagtgg gaaaagctca ataatgagat cagatgcacc cattggcaaa 900
tgcaagtctg aatgcatcac tccaaatgga agcattccca atgacaaacc attccaaaat 960
gtaaacagga tcacatacgg ggcctgtccc agatatgtta agcaaagcac tctgaaattg 1020
gcaacaggaa tgcgaaatgt accagagaga caaactagag gcatatttgg cgcaatagcg 1080
ggtttcatag aaaatggttg ggagggaatg gtggatggtt ggtacggctt caggcatcaa 1140
aattctgagg gaagaggaca agcagcagat ctcaaaagca ctcaagcagc aatcgatcaa 1200
atcaatggga agctgaatcg attgatcggg aaaaccaacg agaaattcca tcagattgaa 1260
aaagaattct cagaagtaga agggagaatt caggaccttg agaaatatgt tgaggacaca 1320
aaaatagatc tctggtcata caacgcggag cttcttgttg ccatggagaa ccaacataca 1380
attgatctaa ctgactcaga aatgaacaaa ctgtttgaaa aaacaaagaa gcaactgagg 1440
gaaaatgctg aggatatggg caatggttgt ttcaaaatat accacaaatg tgacaatgcc 1500
tgcataggat caatcagaaa tggaacttat gaccacgatg tatacaggga tgaagcatta 1560
aacaaccggt tccagatcaa gggagttgag ctgaagtcag ggtacaaaga ttggatccta 1620
tggatttcct ttgccatatc atgttttttg ctttgtgttg ctttgttggg gttcatcatg 1680
tgggcctgcc aaaagggcaa cattaggtgc aacatttgca tttga 1725
<210> 47
<211> 574
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> АК PDI-H3 Switz-L431M
<400> 47
Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala Gln Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn
20 25 30
Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly His His Ala Val Pro Asn Gly Thr
35 40 45
Ile Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp Arg Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr
50 55 60
Glu Leu Val Gln Asn Ser Ser Ile Gly Glu Ile Cys Asp Ser Pro His
65 70 75 80
Gln Ile Leu Asp Gly Glu Asn Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly
85 90 95
Asp Pro Gln Cys Asp Gly Phe Gln Asn Lys Lys Trp Asp Leu Phe Val
100 105 110
Glu Arg Ser Lys Ala Tyr Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp
115 120 125
Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe
130 135 140
Asn Asn Glu Ser Phe Asn Trp Ala Gly Val Thr Gln Asn Gly Thr Ser
145 150 155 160
Ser Ser Cys Ile Arg Gly Ser Asn Ser Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn
165 170 175
Trp Leu Thr His Leu Asn Ser Lys Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met
180 185 190
Pro Asn Asn Glu Gln Phe Asp Lys Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His
195 200 205
Pro Gly Thr Asp Lys Asp Gln Ile Phe Leu Tyr Ala Gln Ser Ser Gly
210 215 220
Arg Ile Thr Val Ser Thr Lys Arg Ser Gln Gln Ala Val Ile Pro Asn
225 230 235 240
Ile Gly Ser Arg Pro Arg Ile Arg Asp Ile Pro Ser Arg Ile Ser Ile
245 250 255
Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr
260 265 270
Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly Tyr Phe Lys Ile Arg Ser Gly Lys
275 280 285
Ser Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala Pro Ile Gly Lys Cys Lys Ser Glu
290 295 300
Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn
305 310 315 320
Val Asn Arg Ile Thr Tyr Gly Ala Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gln Ser
325 330 335
Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Arg Gln Thr
340 345 350
Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu
355 360 365
Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly
370 375 380
Arg Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln
385 390 395 400
Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Leu Ile Gly Lys Thr Asn Glu Lys Phe
405 410 415
His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp
420 425 430
Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn
435 440 445
Ala Glu Leu Leu Val Ala Met Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr
450 455 460
Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe Glu Lys Thr Lys Lys Gln Leu Arg
465 470 475 480
Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys
485 490 495
Cys Asp Asn Ala Cys Ile Gly Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His
500 505 510
Asp Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly
515 520 525
Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe
530 535 540
Ala Ile Ser Cys Phe Leu Leu Cys Val Ala Leu Leu Gly Phe Ile Met
545 550 555 560
Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile Arg Cys Asn Ile Cys Ile
565 570
<210> 48
<211> 1725
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК PDI-H3 Switz-CysTm
<400> 48
atggcgaaaa acgttgcgat tttcggctta ttgttttctc ttcttgtgtt ggttccttct 60
cagatcttcg cgcaaaaact tcctggaaat gacaatagca cggcaacgct gtgccttggg 120
caccatgcag taccaaacgg aacgatagtg aaaacaatca cgaatgaccg aattgaagtt 180
actaatgcta ctgagctggt tcagaattcc tcaataggtg aaatatgcga cagtcctcat 240
cagatccttg atggagaaaa ctgcacacta atagatgctc tattgggaga ccctcagtgt 300
gatggctttc aaaataagaa atgggacctt tttgttgaac gaagcaaagc ctacagcaac 360
tgttaccctt atgatgtgcc ggattatgcc tcccttaggt cactagttgc ctcatccggc 420
acactggagt ttaacaatga aagcttcaat tgggctggag tcactcaaaa cggaacaagt 480
tcttcttgca taaggggatc taatagtagt ttctttagta gattaaattg gttgacccac 540
ttaaactcca aatacccagc attaaacgtg actatgccaa acaatgaaca atttgacaaa 600
ttgtacattt ggggggttca ccacccgggt acggacaagg accaaatctt cctgtatgca 660
caatcatcag gaagaatcac agtatctacc aaaagaagcc aacaagctgt aatcccgaat 720
atcggatcta gacccagaat aagggatatc cctagcagaa taagcatcta ttggacaata 780
gtaaaaccgg gagacatact tttgattaac agcacaggga atctaattgc tcctaggggt 840
tacttcaaaa tacgaagtgg gaaaagctca ataatgagat cagatgcacc cattggcaaa 900
tgcaagtctg aatgcatcac tccaaatgga agcattccca atgacaaacc attccaaaat 960
gtaaacagga tcacatacgg ggcctgtccc agatatgtta agcaaagcac tctgaaattg 1020
gcaacaggaa tgcgaaatgt accagagaga caaactagag gcatatttgg cgcaatagcg 1080
ggtttcatag aaaatggttg ggagggaatg gtggatggtt ggtacggctt caggcatcaa 1140
aattctgagg gaagaggaca agcagcagat ctcaaaagca ctcaagcagc aatcgatcaa 1200
atcaatggga agctgaatcg attgatcggg aaaaccaacg agaaattcca tcagattgaa 1260
aaagaattct cagaagtaga agggagaatt caggaccttg agaaatatgt tgaggacaca 1320
aaaatagatc tctggtcata caacgcggag cttcttgttg ccctggagaa ccaacataca 1380
attgatctaa ctgactcaga aatgaacaaa ctgtttgaaa aaacaaagaa gcaactgagg 1440
gaaaatgctg aggatatggg caatggttgt ttcaaaatat accacaaatg tgacaatgcc 1500
tgcataggat caatcagaaa tggaacttat gaccacgatg tatacaggga tgaagcatta 1560
aacaaccggt tccagatcaa gggagttgag ctgaagtcag ggtacaaaga ttggatccta 1620
tggatttcct ttgccatatc atcccttgta ctgttagttg ctttgttggg gttcatcatg 1680
tgggcctgcc aaaagggcaa cattaggtgc aacatttgca tttga 1725
<210> 49
<211> 574
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> АК PDI-H3 Switz-CysTm
<400> 49
Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala Gln Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn
20 25 30
Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly His His Ala Val Pro Asn Gly Thr
35 40 45
Ile Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp Arg Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr
50 55 60
Glu Leu Val Gln Asn Ser Ser Ile Gly Glu Ile Cys Asp Ser Pro His
65 70 75 80
Gln Ile Leu Asp Gly Glu Asn Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly
85 90 95
Asp Pro Gln Cys Asp Gly Phe Gln Asn Lys Lys Trp Asp Leu Phe Val
100 105 110
Glu Arg Ser Lys Ala Tyr Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp
115 120 125
Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe
130 135 140
Asn Asn Glu Ser Phe Asn Trp Ala Gly Val Thr Gln Asn Gly Thr Ser
145 150 155 160
Ser Ser Cys Ile Arg Gly Ser Asn Ser Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn
165 170 175
Trp Leu Thr His Leu Asn Ser Lys Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met
180 185 190
Pro Asn Asn Glu Gln Phe Asp Lys Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His
195 200 205
Pro Gly Thr Asp Lys Asp Gln Ile Phe Leu Tyr Ala Gln Ser Ser Gly
210 215 220
Arg Ile Thr Val Ser Thr Lys Arg Ser Gln Gln Ala Val Ile Pro Asn
225 230 235 240
Ile Gly Ser Arg Pro Arg Ile Arg Asp Ile Pro Ser Arg Ile Ser Ile
245 250 255
Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr
260 265 270
Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly Tyr Phe Lys Ile Arg Ser Gly Lys
275 280 285
Ser Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala Pro Ile Gly Lys Cys Lys Ser Glu
290 295 300
Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn
305 310 315 320
Val Asn Arg Ile Thr Tyr Gly Ala Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gln Ser
325 330 335
Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Arg Gln Thr
340 345 350
Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu
355 360 365
Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly
370 375 380
Arg Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln
385 390 395 400
Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Leu Ile Gly Lys Thr Asn Glu Lys Phe
405 410 415
His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp
420 425 430
Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn
435 440 445
Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr
450 455 460
Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe Glu Lys Thr Lys Lys Gln Leu Arg
465 470 475 480
Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys
485 490 495
Cys Asp Asn Ala Cys Ile Gly Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His
500 505 510
Asp Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly
515 520 525
Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe
530 535 540
Ala Ile Ser Ser Leu Val Leu Leu Val Ala Leu Leu Gly Phe Ile Met
545 550 555 560
Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile Arg Cys Asn Ile Cys Ile
565 570
<210> 50
<211> 48
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер H3_Swi(N382A).r
<400> 50
tttcccgatc aatcgagcca gcttcccatt gatttgatcg attgctgc 48
<210> 51
<211> 54
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер H3_Swi(N382A).c
<400> 51
tcaaatcaat gggaagctgg ctcgattgat cgggaaaacc aacgagaaat tcca 54
<210> 52
<211> 1725
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК PDI-H3 Switz-N382A-CysTm
<400> 52
atggcgaaaa acgttgcgat tttcggctta ttgttttctc ttcttgtgtt ggttccttct 60
cagatcttcg cgcaaaaact tcctggaaat gacaatagca cggcaacgct gtgccttggg 120
caccatgcag taccaaacgg aacgatagtg aaaacaatca cgaatgaccg aattgaagtt 180
actaatgcta ctgagctggt tcagaattcc tcaataggtg aaatatgcga cagtcctcat 240
cagatccttg atggagaaaa ctgcacacta atagatgctc tattgggaga ccctcagtgt 300
gatggctttc aaaataagaa atgggacctt tttgttgaac gaagcaaagc ctacagcaac 360
tgttaccctt atgatgtgcc ggattatgcc tcccttaggt cactagttgc ctcatccggc 420
acactggagt ttaacaatga aagcttcaat tgggctggag tcactcaaaa cggaacaagt 480
tcttcttgca taaggggatc taatagtagt ttctttagta gattaaattg gttgacccac 540
ttaaactcca aatacccagc attaaacgtg actatgccaa acaatgaaca atttgacaaa 600
ttgtacattt ggggggttca ccacccgggt acggacaagg accaaatctt cctgtatgca 660
caatcatcag gaagaatcac agtatctacc aaaagaagcc aacaagctgt aatcccgaat 720
atcggatcta gacccagaat aagggatatc cctagcagaa taagcatcta ttggacaata 780
gtaaaaccgg gagacatact tttgattaac agcacaggga atctaattgc tcctaggggt 840
tacttcaaaa tacgaagtgg gaaaagctca ataatgagat cagatgcacc cattggcaaa 900
tgcaagtctg aatgcatcac tccaaatgga agcattccca atgacaaacc attccaaaat 960
gtaaacagga tcacatacgg ggcctgtccc agatatgtta agcaaagcac tctgaaattg 1020
gcaacaggaa tgcgaaatgt accagagaga caaactagag gcatatttgg cgcaatagcg 1080
ggtttcatag aaaatggttg ggagggaatg gtggatggtt ggtacggctt caggcatcaa 1140
aattctgagg gaagaggaca agcagcagat ctcaaaagca ctcaagcagc aatcgatcaa 1200
atcaatggga agctggctcg attgatcggg aaaaccaacg agaaattcca tcagattgaa 1260
aaagaattct cagaagtaga agggagaatt caggaccttg agaaatatgt tgaggacaca 1320
aaaatagatc tctggtcata caacgcggag cttcttgttg ccctggagaa ccaacataca 1380
attgatctaa ctgactcaga aatgaacaaa ctgtttgaaa aaacaaagaa gcaactgagg 1440
gaaaatgctg aggatatggg caatggttgt ttcaaaatat accacaaatg tgacaatgcc 1500
tgcataggat caatcagaaa tggaacttat gaccacgatg tatacaggga tgaagcatta 1560
aacaaccggt tccagatcaa gggagttgag ctgaagtcag ggtacaaaga ttggatccta 1620
tggatttcct ttgccatatc atcccttgta ctgttagttg ctttgttggg gttcatcatg 1680
tgggcctgcc aaaagggcaa cattaggtgc aacatttgca tttga 1725
<210> 53
<211> 574
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> АК PDI-H3 Switz-N382A-CysTm
<400> 53
Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala Gln Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn
20 25 30
Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly His His Ala Val Pro Asn Gly Thr
35 40 45
Ile Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp Arg Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr
50 55 60
Glu Leu Val Gln Asn Ser Ser Ile Gly Glu Ile Cys Asp Ser Pro His
65 70 75 80
Gln Ile Leu Asp Gly Glu Asn Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly
85 90 95
Asp Pro Gln Cys Asp Gly Phe Gln Asn Lys Lys Trp Asp Leu Phe Val
100 105 110
Glu Arg Ser Lys Ala Tyr Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp
115 120 125
Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe
130 135 140
Asn Asn Glu Ser Phe Asn Trp Ala Gly Val Thr Gln Asn Gly Thr Ser
145 150 155 160
Ser Ser Cys Ile Arg Gly Ser Asn Ser Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn
165 170 175
Trp Leu Thr His Leu Asn Ser Lys Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met
180 185 190
Pro Asn Asn Glu Gln Phe Asp Lys Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His
195 200 205
Pro Gly Thr Asp Lys Asp Gln Ile Phe Leu Tyr Ala Gln Ser Ser Gly
210 215 220
Arg Ile Thr Val Ser Thr Lys Arg Ser Gln Gln Ala Val Ile Pro Asn
225 230 235 240
Ile Gly Ser Arg Pro Arg Ile Arg Asp Ile Pro Ser Arg Ile Ser Ile
245 250 255
Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr
260 265 270
Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly Tyr Phe Lys Ile Arg Ser Gly Lys
275 280 285
Ser Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala Pro Ile Gly Lys Cys Lys Ser Glu
290 295 300
Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn
305 310 315 320
Val Asn Arg Ile Thr Tyr Gly Ala Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gln Ser
325 330 335
Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Arg Gln Thr
340 345 350
Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu
355 360 365
Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly
370 375 380
Arg Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln
385 390 395 400
Ile Asn Gly Lys Leu Ala Arg Leu Ile Gly Lys Thr Asn Glu Lys Phe
405 410 415
His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp
420 425 430
Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn
435 440 445
Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr
450 455 460
Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe Glu Lys Thr Lys Lys Gln Leu Arg
465 470 475 480
Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys
485 490 495
Cys Asp Asn Ala Cys Ile Gly Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His
500 505 510
Asp Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly
515 520 525
Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe
530 535 540
Ala Ile Ser Ser Leu Val Leu Leu Val Ala Leu Leu Gly Phe Ile Met
545 550 555 560
Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile Arg Cys Asn Ile Cys Ile
565 570
<210> 54
<211> 48
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер H3_Swi(L384V).r
<400> 54
ttggttttcc cgatcactcg attcagcttc ccattgattt gatcgatt 48
<210> 55
<211> 48
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер H3_Swi(L384V).c
<400> 55
gggaagctga atcgagtgat cgggaaaacc aacgagaaat tccatcag 48
<210> 56
<211> 1725
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК PDI-H3 Switz-L384V-CysTm
<400> 56
atggcgaaaa acgttgcgat tttcggctta ttgttttctc ttcttgtgtt ggttccttct 60
cagatcttcg cgcaaaaact tcctggaaat gacaatagca cggcaacgct gtgccttggg 120
caccatgcag taccaaacgg aacgatagtg aaaacaatca cgaatgaccg aattgaagtt 180
actaatgcta ctgagctggt tcagaattcc tcaataggtg aaatatgcga cagtcctcat 240
cagatccttg atggagaaaa ctgcacacta atagatgctc tattgggaga ccctcagtgt 300
gatggctttc aaaataagaa atgggacctt tttgttgaac gaagcaaagc ctacagcaac 360
tgttaccctt atgatgtgcc ggattatgcc tcccttaggt cactagttgc ctcatccggc 420
acactggagt ttaacaatga aagcttcaat tgggctggag tcactcaaaa cggaacaagt 480
tcttcttgca taaggggatc taatagtagt ttctttagta gattaaattg gttgacccac 540
ttaaactcca aatacccagc attaaacgtg actatgccaa acaatgaaca atttgacaaa 600
ttgtacattt ggggggttca ccacccgggt acggacaagg accaaatctt cctgtatgca 660
caatcatcag gaagaatcac agtatctacc aaaagaagcc aacaagctgt aatcccgaat 720
atcggatcta gacccagaat aagggatatc cctagcagaa taagcatcta ttggacaata 780
gtaaaaccgg gagacatact tttgattaac agcacaggga atctaattgc tcctaggggt 840
tacttcaaaa tacgaagtgg gaaaagctca ataatgagat cagatgcacc cattggcaaa 900
tgcaagtctg aatgcatcac tccaaatgga agcattccca atgacaaacc attccaaaat 960
gtaaacagga tcacatacgg ggcctgtccc agatatgtta agcaaagcac tctgaaattg 1020
gcaacaggaa tgcgaaatgt accagagaga caaactagag gcatatttgg cgcaatagcg 1080
ggtttcatag aaaatggttg ggagggaatg gtggatggtt ggtacggctt caggcatcaa 1140
aattctgagg gaagaggaca agcagcagat ctcaaaagca ctcaagcagc aatcgatcaa 1200
atcaatggga agctgaatcg agtgatcggg aaaaccaacg agaaattcca tcagattgaa 1260
aaagaattct cagaagtaga agggagaatt caggaccttg agaaatatgt tgaggacaca 1320
aaaatagatc tctggtcata caacgcggag cttcttgttg ccctggagaa ccaacataca 1380
attgatctaa ctgactcaga aatgaacaaa ctgtttgaaa aaacaaagaa gcaactgagg 1440
gaaaatgctg aggatatggg caatggttgt ttcaaaatat accacaaatg tgacaatgcc 1500
tgcataggat caatcagaaa tggaacttat gaccacgatg tatacaggga tgaagcatta 1560
aacaaccggt tccagatcaa gggagttgag ctgaagtcag ggtacaaaga ttggatccta 1620
tggatttcct ttgccatatc atcccttgta ctgttagttg ctttgttggg gttcatcatg 1680
tgggcctgcc aaaagggcaa cattaggtgc aacatttgca tttga 1725
<210> 57
<211> 574
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> АК PDI-H3 Switz-L384V-CysTm
<400> 57
Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala Gln Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn
20 25 30
Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly His His Ala Val Pro Asn Gly Thr
35 40 45
Ile Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp Arg Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr
50 55 60
Glu Leu Val Gln Asn Ser Ser Ile Gly Glu Ile Cys Asp Ser Pro His
65 70 75 80
Gln Ile Leu Asp Gly Glu Asn Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly
85 90 95
Asp Pro Gln Cys Asp Gly Phe Gln Asn Lys Lys Trp Asp Leu Phe Val
100 105 110
Glu Arg Ser Lys Ala Tyr Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp
115 120 125
Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe
130 135 140
Asn Asn Glu Ser Phe Asn Trp Ala Gly Val Thr Gln Asn Gly Thr Ser
145 150 155 160
Ser Ser Cys Ile Arg Gly Ser Asn Ser Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn
165 170 175
Trp Leu Thr His Leu Asn Ser Lys Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met
180 185 190
Pro Asn Asn Glu Gln Phe Asp Lys Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His
195 200 205
Pro Gly Thr Asp Lys Asp Gln Ile Phe Leu Tyr Ala Gln Ser Ser Gly
210 215 220
Arg Ile Thr Val Ser Thr Lys Arg Ser Gln Gln Ala Val Ile Pro Asn
225 230 235 240
Ile Gly Ser Arg Pro Arg Ile Arg Asp Ile Pro Ser Arg Ile Ser Ile
245 250 255
Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr
260 265 270
Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly Tyr Phe Lys Ile Arg Ser Gly Lys
275 280 285
Ser Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala Pro Ile Gly Lys Cys Lys Ser Glu
290 295 300
Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn
305 310 315 320
Val Asn Arg Ile Thr Tyr Gly Ala Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gln Ser
325 330 335
Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Arg Gln Thr
340 345 350
Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu
355 360 365
Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly
370 375 380
Arg Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln
385 390 395 400
Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Val Ile Gly Lys Thr Asn Glu Lys Phe
405 410 415
His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp
420 425 430
Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn
435 440 445
Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr
450 455 460
Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe Glu Lys Thr Lys Lys Gln Leu Arg
465 470 475 480
Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys
485 490 495
Cys Asp Asn Ala Cys Ile Gly Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His
500 505 510
Asp Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly
515 520 525
Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe
530 535 540
Ala Ile Ser Ser Leu Val Leu Leu Val Ala Leu Leu Gly Phe Ile Met
545 550 555 560
Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile Arg Cys Asn Ile Cys Ile
565 570
<210> 58
<211> 1725
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК PDI-H3 Switz-F392D-CysTm
<400> 58
atggcgaaaa acgttgcgat tttcggctta ttgttttctc ttcttgtgtt ggttccttct 60
cagatcttcg cgcaaaaact tcctggaaat gacaatagca cggcaacgct gtgccttggg 120
caccatgcag taccaaacgg aacgatagtg aaaacaatca cgaatgaccg aattgaagtt 180
actaatgcta ctgagctggt tcagaattcc tcaataggtg aaatatgcga cagtcctcat 240
cagatccttg atggagaaaa ctgcacacta atagatgctc tattgggaga ccctcagtgt 300
gatggctttc aaaataagaa atgggacctt tttgttgaac gaagcaaagc ctacagcaac 360
tgttaccctt atgatgtgcc ggattatgcc tcccttaggt cactagttgc ctcatccggc 420
acactggagt ttaacaatga aagcttcaat tgggctggag tcactcaaaa cggaacaagt 480
tcttcttgca taaggggatc taatagtagt ttctttagta gattaaattg gttgacccac 540
ttaaactcca aatacccagc attaaacgtg actatgccaa acaatgaaca atttgacaaa 600
ttgtacattt ggggggttca ccacccgggt acggacaagg accaaatctt cctgtatgca 660
caatcatcag gaagaatcac agtatctacc aaaagaagcc aacaagctgt aatcccgaat 720
atcggatcta gacccagaat aagggatatc cctagcagaa taagcatcta ttggacaata 780
gtaaaaccgg gagacatact tttgattaac agcacaggga atctaattgc tcctaggggt 840
tacttcaaaa tacgaagtgg gaaaagctca ataatgagat cagatgcacc cattggcaaa 900
tgcaagtctg aatgcatcac tccaaatgga agcattccca atgacaaacc attccaaaat 960
gtaaacagga tcacatacgg ggcctgtccc agatatgtta agcaaagcac tctgaaattg 1020
gcaacaggaa tgcgaaatgt accagagaga caaactagag gcatatttgg cgcaatagcg 1080
ggtttcatag aaaatggttg ggagggaatg gtggatggtt ggtacggctt caggcatcaa 1140
aattctgagg gaagaggaca agcagcagat ctcaaaagca ctcaagcagc aatcgatcaa 1200
atcaatggga agctgaatcg attgatcggg aaaaccaacg agaaagacca tcagattgaa 1260
aaagaattct cagaagtaga agggagaatt caggaccttg agaaatatgt tgaggacaca 1320
aaaatagatc tctggtcata caacgcggag cttcttgttg ccctggagaa ccaacataca 1380
attgatctaa ctgactcaga aatgaacaaa ctgtttgaaa aaacaaagaa gcaactgagg 1440
gaaaatgctg aggatatggg caatggttgt ttcaaaatat accacaaatg tgacaatgcc 1500
tgcataggat caatcagaaa tggaacttat gaccacgatg tatacaggga tgaagcatta 1560
aacaaccggt tccagatcaa gggagttgag ctgaagtcag ggtacaaaga ttggatccta 1620
tggatttcct ttgccatatc atcccttgta ctgttagttg ctttgttggg gttcatcatg 1680
tgggcctgcc aaaagggcaa cattaggtgc aacatttgca tttga 1725
<210> 59
<211> 574
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> АК PDI-H3 Switz-F392D-CysTm
<400> 59
Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala Gln Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn
20 25 30
Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly His His Ala Val Pro Asn Gly Thr
35 40 45
Ile Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp Arg Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr
50 55 60
Glu Leu Val Gln Asn Ser Ser Ile Gly Glu Ile Cys Asp Ser Pro His
65 70 75 80
Gln Ile Leu Asp Gly Glu Asn Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly
85 90 95
Asp Pro Gln Cys Asp Gly Phe Gln Asn Lys Lys Trp Asp Leu Phe Val
100 105 110
Glu Arg Ser Lys Ala Tyr Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp
115 120 125
Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe
130 135 140
Asn Asn Glu Ser Phe Asn Trp Ala Gly Val Thr Gln Asn Gly Thr Ser
145 150 155 160
Ser Ser Cys Ile Arg Gly Ser Asn Ser Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn
165 170 175
Trp Leu Thr His Leu Asn Ser Lys Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met
180 185 190
Pro Asn Asn Glu Gln Phe Asp Lys Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His
195 200 205
Pro Gly Thr Asp Lys Asp Gln Ile Phe Leu Tyr Ala Gln Ser Ser Gly
210 215 220
Arg Ile Thr Val Ser Thr Lys Arg Ser Gln Gln Ala Val Ile Pro Asn
225 230 235 240
Ile Gly Ser Arg Pro Arg Ile Arg Asp Ile Pro Ser Arg Ile Ser Ile
245 250 255
Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr
260 265 270
Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly Tyr Phe Lys Ile Arg Ser Gly Lys
275 280 285
Ser Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala Pro Ile Gly Lys Cys Lys Ser Glu
290 295 300
Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn
305 310 315 320
Val Asn Arg Ile Thr Tyr Gly Ala Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gln Ser
325 330 335
Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Arg Gln Thr
340 345 350
Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu
355 360 365
Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly
370 375 380
Arg Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln
385 390 395 400
Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Leu Ile Gly Lys Thr Asn Glu Lys Asp
405 410 415
His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp
420 425 430
Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn
435 440 445
Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr
450 455 460
Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe Glu Lys Thr Lys Lys Gln Leu Arg
465 470 475 480
Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys
485 490 495
Cys Asp Asn Ala Cys Ile Gly Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His
500 505 510
Asp Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly
515 520 525
Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe
530 535 540
Ala Ile Ser Ser Leu Val Leu Leu Val Ala Leu Leu Gly Phe Ile Met
545 550 555 560
Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile Arg Cys Asn Ile Cys Ile
565 570
<210> 60
<211> 1725
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК PDI-H3 Switz-L431M-CysTm
<400> 60
atggcgaaaa acgttgcgat tttcggctta ttgttttctc ttcttgtgtt ggttccttct 60
cagatcttcg cgcaaaaact tcctggaaat gacaatagca cggcaacgct gtgccttggg 120
caccatgcag taccaaacgg aacgatagtg aaaacaatca cgaatgaccg aattgaagtt 180
actaatgcta ctgagctggt tcagaattcc tcaataggtg aaatatgcga cagtcctcat 240
cagatccttg atggagaaaa ctgcacacta atagatgctc tattgggaga ccctcagtgt 300
gatggctttc aaaataagaa atgggacctt tttgttgaac gaagcaaagc ctacagcaac 360
tgttaccctt atgatgtgcc ggattatgcc tcccttaggt cactagttgc ctcatccggc 420
acactggagt ttaacaatga aagcttcaat tgggctggag tcactcaaaa cggaacaagt 480
tcttcttgca taaggggatc taatagtagt ttctttagta gattaaattg gttgacccac 540
ttaaactcca aatacccagc attaaacgtg actatgccaa acaatgaaca atttgacaaa 600
ttgtacattt ggggggttca ccacccgggt acggacaagg accaaatctt cctgtatgca 660
caatcatcag gaagaatcac agtatctacc aaaagaagcc aacaagctgt aatcccgaat 720
atcggatcta gacccagaat aagggatatc cctagcagaa taagcatcta ttggacaata 780
gtaaaaccgg gagacatact tttgattaac agcacaggga atctaattgc tcctaggggt 840
tacttcaaaa tacgaagtgg gaaaagctca ataatgagat cagatgcacc cattggcaaa 900
tgcaagtctg aatgcatcac tccaaatgga agcattccca atgacaaacc attccaaaat 960
gtaaacagga tcacatacgg ggcctgtccc agatatgtta agcaaagcac tctgaaattg 1020
gcaacaggaa tgcgaaatgt accagagaga caaactagag gcatatttgg cgcaatagcg 1080
ggtttcatag aaaatggttg ggagggaatg gtggatggtt ggtacggctt caggcatcaa 1140
aattctgagg gaagaggaca agcagcagat ctcaaaagca ctcaagcagc aatcgatcaa 1200
atcaatggga agctgaatcg attgatcggg aaaaccaacg agaaattcca tcagattgaa 1260
aaagaattct cagaagtaga agggagaatt caggaccttg agaaatatgt tgaggacaca 1320
aaaatagatc tctggtcata caacgcggag cttcttgttg ccatggagaa ccaacataca 1380
attgatctaa ctgactcaga aatgaacaaa ctgtttgaaa aaacaaagaa gcaactgagg 1440
gaaaatgctg aggatatggg caatggttgt ttcaaaatat accacaaatg tgacaatgcc 1500
tgcataggat caatcagaaa tggaacttat gaccacgatg tatacaggga tgaagcatta 1560
aacaaccggt tccagatcaa gggagttgag ctgaagtcag ggtacaaaga ttggatccta 1620
tggatttcct ttgccatatc atcccttgta ctgttagttg ctttgttggg gttcatcatg 1680
tgggcctgcc aaaagggcaa cattaggtgc aacatttgca tttga 1725
<210> 61
<211> 574
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> АК PDI-H3 Switz-L431M-CysTm
<400> 61
Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala Gln Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn
20 25 30
Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly His His Ala Val Pro Asn Gly Thr
35 40 45
Ile Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp Arg Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr
50 55 60
Glu Leu Val Gln Asn Ser Ser Ile Gly Glu Ile Cys Asp Ser Pro His
65 70 75 80
Gln Ile Leu Asp Gly Glu Asn Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly
85 90 95
Asp Pro Gln Cys Asp Gly Phe Gln Asn Lys Lys Trp Asp Leu Phe Val
100 105 110
Glu Arg Ser Lys Ala Tyr Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp
115 120 125
Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe
130 135 140
Asn Asn Glu Ser Phe Asn Trp Ala Gly Val Thr Gln Asn Gly Thr Ser
145 150 155 160
Ser Ser Cys Ile Arg Gly Ser Asn Ser Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn
165 170 175
Trp Leu Thr His Leu Asn Ser Lys Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met
180 185 190
Pro Asn Asn Glu Gln Phe Asp Lys Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His
195 200 205
Pro Gly Thr Asp Lys Asp Gln Ile Phe Leu Tyr Ala Gln Ser Ser Gly
210 215 220
Arg Ile Thr Val Ser Thr Lys Arg Ser Gln Gln Ala Val Ile Pro Asn
225 230 235 240
Ile Gly Ser Arg Pro Arg Ile Arg Asp Ile Pro Ser Arg Ile Ser Ile
245 250 255
Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr
260 265 270
Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly Tyr Phe Lys Ile Arg Ser Gly Lys
275 280 285
Ser Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala Pro Ile Gly Lys Cys Lys Ser Glu
290 295 300
Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn
305 310 315 320
Val Asn Arg Ile Thr Tyr Gly Ala Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gln Ser
325 330 335
Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Arg Gln Thr
340 345 350
Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu
355 360 365
Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly
370 375 380
Arg Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln
385 390 395 400
Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Leu Ile Gly Lys Thr Asn Glu Lys Phe
405 410 415
His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp
420 425 430
Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn
435 440 445
Ala Glu Leu Leu Val Ala Met Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr
450 455 460
Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe Glu Lys Thr Lys Lys Gln Leu Arg
465 470 475 480
Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys
485 490 495
Cys Asp Asn Ala Cys Ile Gly Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His
500 505 510
Asp Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly
515 520 525
Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe
530 535 540
Ala Ile Ser Ser Leu Val Leu Leu Val Ala Leu Leu Gly Phe Ile Met
545 550 555 560
Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile Arg Cys Asn Ile Cys Ile
565 570
<210> 62
<211> 4540
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Клонирующий вектор 1190 от левой границы T-ДНК к правой
<400> 62
tggcaggata tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga caacttaata acacattgcg 60
gacgttttta atgtactgaa ttaacgccga atcccgggct ggtatattta tatgttgtca 120
aataactcaa aaaccataaa agtttaagtt agcaagtgtg tacattttta cttgaacaaa 180
aatattcacc tactactgtt ataaatcatt attaaacatt agagtaaaga aatatggatg 240
ataagaacaa gagtagtgat attttgacaa caattttgtt gcaacatttg agaaaatttt 300
gttgttctct cttttcattg gtcaaaaaca atagagagag aaaaaggaag agggagaata 360
aaaacataat gtgagtatga gagagaaagt tgtacaaaag ttgtaccaaa atagttgtac 420
aaatatcatt gaggaatttg acaaaagcta cacaaataag ggttaattgc tgtaaataaa 480
taaggatgac gcattagaga gatgtaccat tagagaattt ttggcaagtc attaaaaaga 540
aagaataaat tatttttaaa attaaaagtt gagtcatttg attaaacatg tgattattta 600
atgaattgat gaaagagttg gattaaagtt gtattagtaa ttagaatttg gtgtcaaatt 660
taatttgaca tttgatcttt tcctatatat tgccccatag agtcagttaa ctcattttta 720
tatttcatag atcaaataag agaaataacg gtatattaat ccctccaaaa aaaaaaaacg 780
gtatatttac taaaaaatct aagccacgta ggaggataac aggatccccg taggaggata 840
acatccaatc caaccaatca caacaatcct gatgagataa cccactttaa gcccacgcat 900
ctgtggcaca tctacattat ctaaatcaca cattcttcca cacatctgag ccacacaaaa 960
accaatccac atctttatca cccattctat aaaaaatcac actttgtgag tctacacttt 1020
gattcccttc aaacacatac aaagagaaga gactaattaa ttaattaatc atcttgagag 1080
aaaatggaac gagctataca aggaaacgac gctagggaac aagctaacag tgaacgttgg 1140
gatggaggat caggaggtac cacttctccc ttcaaacttc ctgacgaaag tccgagttgg 1200
actgagtggc ggctacataa cgatgagacg aattcgaatc aagataatcc ccttggtttc 1260
aaggaaagct ggggtttcgg gaaagttgta tttaagagat atctcagata cgacaggacg 1320
gaagcttcac tgcacagagt ccttggatct tggacgggag attcggttaa ctatgcagca 1380
tctcgatttt tcggtttcga ccagatcgga tgtacctata gtattcggtt tcgaggagtt 1440
agtatcaccg tttctggagg gtcgcgaact cttcagcatc tctgtgagat ggcaattcgg 1500
tctaagcaag aactgctaca gcttgcccca atcgaagtgg aaagtaatgt atcaagagga 1560
tgccctgaag gtactcaaac cttcgaaaaa gaaagcgagt aagttaaaat gcttcttcgt 1620
ctcctattta taatatggtt tgttattgtt aattttgttc ttgtagaaga gcttaattaa 1680
tcgttgttgt tatgaaatac tatttgtatg agatgaactg gtgtaatgta attcatttac 1740
ataagtggag tcagaatcag aatgtttcct ccataactaa ctagacatga agacctgccg 1800
cgtacaattg tcttatattt gaacaactaa aattgaacat cttttgccac aactttataa 1860
gtggttaata tagctcaaat atatggtcaa gttcaataga ttaataatgg aaatatcagt 1920
tatcgaaatt cattaacaat caacttaacg ttattaacta ctaattttat atcatcccct 1980
ttgataaatg atagtacacc aattaggaag gagcatgctc gcctaggaga ttgtcgtttc 2040
ccgccttcag tttgcaagct gctctagccg tgtagccaat acgcaaaccg cctctccccg 2100
cgcgttggga attactagcg cgtgtcgaca agcttgcatg ccggtcaaca tggtggagca 2160
cgacacactt gtctactcca aaaatatcaa agatacagtc tcagaagacc aaagggcaat 2220
tgagactttt caacaaaggg taatatccgg aaacctcctc ggattccatt gcccagctat 2280
ctgtcacttt attgtgaaga tagtggaaaa ggaaggtggc tcctacaaat gccatcattg 2340
cgataaagga aaggccatcg ttgaagatgc ctctgccgac agtggtccca aagatggacc 2400
cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga agacgttcca accacgtctt caaagcaagt 2460
ggattgatgt gataacatgg tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga 2520
tacagtctca gaagaccaaa gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa 2580
cctcctcgga ttccattgcc cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga 2640
aggtggctcc tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc 2700
tgccgacagt ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga 2760
cgttccaacc acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat atctccactg acgtaaggga 2820
tgacgcacaa tcccactatc cttcgcaaga cccttcctct atataaggaa gttcatttca 2880
tttggagagg tattaaaatc ttaataggtt ttgataaaag cgaacgtggg gaaacccgaa 2940
ccaaaccttc ttctaaactc tctctcatct ctcttaaagc aaacttctct cttgtctttc 3000
ttgcgtgagc gatcttcaac gttgtcagat cgtgcttcgg caccgcggat ggcgaaaaac 3060
gttgcgattt tcggcttatt gttttctctt cttgtgttgg ttccttctca gatcttcgcc 3120
tgcaggctcc tcagccaaaa cgacaccccc atctgtctat ccactggccc ctggatctgc 3180
tgcccaaact aactccatgg tgaccctggg atgcctggtc aagggctatt tccctgagcc 3240
agtgacagtg acctggaact ctggatccct gtccagcggt gtgcacacct tcccagctgt 3300
cctgcagtct gacctctaca ctctgagcag ctcagtgact gtcccctcca gcacctggcc 3360
cagcgagacc gtcacctgca acgttgccca cccggccagc agcaccaagg tggacaagaa 3420
aattgtgccc agggattgtg gttgtaagcc ttgcatatgt acagtcccag aagtatcatc 3480
tgtcttcatc ttccccccaa agcccaagga tgtgctcacc attactctga ctcctaaggt 3540
cacgtgtgtt gtggtagaca tcagcaagga tgatcccgag gtccagttca gctggtttgt 3600
agatgatgtg gaggtgcaca cagctcagac gcaaccccgg gaggagcagt tcaacagcac 3660
tttccgctca gtcagtgaac ttcccatcat gcaccaggac tggctcaatg gcaaggagcg 3720
atcgctcacc atcaccatca ccatcaccat caccattaaa ggcctatttt ctttagtttg 3780
aatttactgt tattcggtgt gcatttctat gtttggtgag cggttttctg tgctcagagt 3840
gtgtttattt tatgtaattt aatttctttg tgagctcctg tttagcaggt cgtcccttca 3900
gcaaggacac aaaaagattt taattttatt aaaaaaaaaa aaaaaaaaga ccgggaattc 3960
gatatcaagc ttatcgacct gcagatcgtt caaacatttg gcaataaagt ttcttaagat 4020
tgaatcctgt tgccggtctt gcgatgatta tcatataatt tctgttgaat tacgttaagc 4080
atgtaataat taacatgtaa tgcatgacgt tatttatgag atgggttttt atgattagag 4140
tcccgcaatt atacatttaa tacgcgatag aaaacaaaat atagcgcgca aactaggata 4200
aattatcgcg cgcggtgtca tctatgttac tagatctcta gagtctcaag cttggcgcgc 4260
ccacgtgact agtggcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg 4320
ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag 4380
aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tgctagagca 4440
gcttgagctt ggatcagatt gtcgtttccc gccttcagtt taaactatca gtgtttgaca 4500
ggatatattg gcgggtaaac ctaagagaaa agagcgttta 4540
<210> 63
<211> 3105
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Конструкция 1314 от промотора 2X35S к терминатору NOS
<400> 63
gtcaacatgg tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca 60
gaagaccaaa gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga 120
ttccattgcc cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc 180
tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt 240
ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc 300
acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat aacatggtgg agcacgacac acttgtctac 360
tccaaaaata tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg caattgagac ttttcaacaa 420
agggtaatat ccggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca ctttattgtg 480
aagatagtgg aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggcc 540
atcgttgaag atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc 600
atcgtggaaa aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc 660
tccactgacg taagggatga cgcacaatcc cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata 720
taaggaagtt catttcattt ggagaggtat taaaatctta ataggttttg ataaaagcga 780
acgtggggaa acccgaacca aaccttcttc taaactctct ctcatctctc ttaaagcaaa 840
cttctctctt gtctttcttg cgtgagcgat cttcaacgtt gtcagatcgt gcttcggcac 900
cagtacaatg gcgaaaaacg ttgcgatttt cggcttattg ttttctcttc ttgtgttggt 960
tccttctcag atcttcgctg acacattatg tataggttat catgcgaaca attcaacaga 1020
cactgtagac acagtactag aaaagaatgt aacagtaaca cactctgtta accttctaga 1080
agacaagcat aacgggaaac tatgcaaact aagaggggta gccccattgc atttgggtaa 1140
atgtaacatt gctggctgga tcctgggaaa tccagagtgt gaatcactct ccacagcaag 1200
ctcatggtcc tacattgtgg aaacacctag ttcagacaat ggaacgtgtt acccaggaga 1260
tttcatcgat tatgaggagc taagagagca attgagctca gtgtcatcat ttgaaaggtt 1320
tgagatattc cccaagacaa gttcatggcc caatcatgac tcgaacaaag gtgtaacggc 1380
agcatgtcct catgctggag caaaaagctt ctacaaaaat ttaatatggc tagttaaaaa 1440
aggaaattca tacccaaagc tcagcaaatc ctacattaat gataaaggga aagaagtcct 1500
cgtgctatgg ggcattcacc atccatctac tagtgctgac caacaaagtc tctatcagaa 1560
tgcagatgca tatgtttttg tggggtcatc aagatacagc aagaagttca agccggaaat 1620
agcaataaga cccaaagtga gggatcaaga agggagaatg aactattact ggacactagt 1680
agagccggga gacaaaataa cattcgaagc aactggaaat ctagtggtac cgagatatgc 1740
attcgcaatg gaaagaaatg ctggatctgg tattatcatt tcagatacac cagtccacga 1800
ttgcaataca acttgtcaaa cacccaaggg tgctataaac accagcctcc catttcagaa 1860
tatacatccg atcacaattg gaaaatgtcc aaaatatgta aaaagcacaa aattgagact 1920
ggccacagga ttgaggaata tcccgtctat tcaatctaga ggactatttg gggccattgc 1980
cggtttcatt gaaggggggt ggacagggat ggtagatgga tggtacggtt atcaccatca 2040
aaatgagcag gggtcaggat atgcagccga cctgaagagc acacagaatg ccattgacga 2100
gattactaac aaagtaaatt ctgttattga aaagatgaat acacagttca cagcagtagg 2160
taaagagttc aaccacctgg aaaaaagaat agagaattta aataaaaaag ttgatgatgg 2220
tttcctggac atttggactt acaatgccga actgttggtt ctattggaaa atgaaagaac 2280
tttggactac cacgattcaa atgtgaagaa cttatatgaa aaggtaagaa gccagctaaa 2340
aaacaatgcc aaggaaattg gaaacggctg ctttgaattt taccacaaat gcgataacac 2400
gtgcatggaa agtgtcaaaa atgggactta tgactaccca aaatactcag aggaagcaaa 2460
attaaacaga gaagaaatag atggggtaaa gctggaatca acaaggattt accagatttt 2520
ggcgatctat tcaactgtcg ccagttcatt ggtactggta gtctccctgg gggcaatcag 2580
tttctggatg tgctctaatg ggtctctaca gtgtagaata tgtatttaaa ggcctatttt 2640
ctttagtttg aatttactgt tattcggtgt gcatttctat gtttggtgag cggttttctg 2700
tgctcagagt gtgtttattt tatgtaattt aatttctttg tgagctcctg tttagcaggt 2760
cgtcccttca gcaaggacac aaaaagattt taattttatt aaaaaaaaaa aaaaaaaaga 2820
ccgggaattc gatatcaagc ttatcgacct gcagatcgtt caaacatttg gcaataaagt 2880
ttcttaagat tgaatcctgt tgccggtctt gcgatgatta tcatataatt tctgttgaat 2940
tacgttaagc atgtaataat taacatgtaa tgcatgacgt tatttatgag atgggttttt 3000
atgattagag tcccgcaatt atacatttaa tacgcgatag aaaacaaaat atagcgcgca 3060
aactaggata aattatcgcg cgcggtgtca tctatgttac tagat 3105
<210> 64
<211> 3105
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Конструкция 2980 от промотора 2X35S к терминатору NOS
<400> 64
gtcaacatgg tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca 60
gaagaccaaa gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga 120
ttccattgcc cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc 180
tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt 240
ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc 300
acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat aacatggtgg agcacgacac acttgtctac 360
tccaaaaata tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg caattgagac ttttcaacaa 420
agggtaatat ccggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca ctttattgtg 480
aagatagtgg aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggcc 540
atcgttgaag atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc 600
atcgtggaaa aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc 660
tccactgacg taagggatga cgcacaatcc cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata 720
taaggaagtt catttcattt ggagaggtat taaaatctta ataggttttg ataaaagcga 780
acgtggggaa acccgaacca aaccttcttc taaactctct ctcatctctc ttaaagcaaa 840
cttctctctt gtctttcttg cgtgagcgat cttcaacgtt gtcagatcgt gcttcggcac 900
cagtacaatg gcgaaaaacg ttgcgatttt cggcttattg ttttctcttc ttgtgttggt 960
tccttctcag atcttcgcgg acacattatg tataggttat catgcgaaca attcaacaga 1020
cactgtagac acagtactag aaaagaatgt aacagtaaca cactctgtta accttctaga 1080
agacaagcat aacgggaaac tatgcaaact aagaggggta gccccattgc atttgggtaa 1140
atgtaacatt gctggctgga tcctgggaaa tccagagtgt gaatcactct ccacagcaag 1200
ctcatggtcc tacattgtgg aaacacctag ttcagacaat ggaacgtgtt acccaggaga 1260
tttcatcgat tatgaggagc taagagagca attgagctca gtgtcatcat ttgaaaggtt 1320
tgagatattc cccaagacaa gttcatggcc caatcatgac tcgaacaaag gtgtaacggc 1380
agcatgtcct catgctggag caaaaagctt ctacaaaaat ttaatatggc tagttaaaaa 1440
aggaaattca tacccaaagc tcagcaaatc ctacattaat gataaaggga aagaagtcct 1500
cgtgctatgg ggcattcacc atccatctac tagtgctgac caacaaagtc tctatcagaa 1560
tgcagatgca tatgtttttg tggggtcatc aagatacagc aagaagttca agccggaaat 1620
agcaataaga cccaaagtga gggatcaaga agggagaatg aactattact ggacactagt 1680
agagccggga gacaaaataa cattcgaagc aactggaaat ctagtggtac cgagatatgc 1740
attcgcaatg gaaagaaatg ctggatctgg tattatcatt tcagatacac cagtccacga 1800
ttgcaataca acttgtcaaa cacccaaggg tgctataaac accagcctcc catttcagaa 1860
tatacatccg atcacaattg gaaaatgtcc aaaatatgta aaaagcacaa aattgagact 1920
ggccacagga ttgaggaata tcccgtctat tcaatctaga ggactatttg gggccattgc 1980
cggtttcatt gaaggggggt ggacagggat ggtagatgga tggtacggtt atcaccatca 2040
aaatgagcag gggtcaggat atgcagccga cctgaagagc acacagaatg ccattgacga 2100
gattactaac aaagtaaatt ctgttattga aaagatgaat acacaggaca cagcagtagg 2160
taaagagttc aaccacctgg aaaaaagaat agagaattta aataaaaaag ttgatgatgg 2220
tttcctggac atttggactt acaatgccga actgttggtt ctattggaaa atgaaagaac 2280
tttggactac cacgattcaa atgtgaagaa cttatatgaa aaggtaagaa gccagctaaa 2340
aaacaatgcc aaggaaattg gaaacggctg ctttgaattt taccacaaat gcgataacac 2400
gtgcatggaa agtgtcaaaa atgggactta tgactaccca aaatactcag aggaagcaaa 2460
attaaacaga gaagaaatag atggggtaaa gctggaatca acaaggattt accagatttt 2520
ggcgatctat tcaactgtcg ccagttcatt ggtactggta gtctccctgg gggcaatcag 2580
tttctggatg tgctctaatg ggtctctaca gtgtagaata tgtatttaaa ggcctatttt 2640
ctttagtttg aatttactgt tattcggtgt gcatttctat gtttggtgag cggttttctg 2700
tgctcagagt gtgtttattt tatgtaattt aatttctttg tgagctcctg tttagcaggt 2760
cgtcccttca gcaaggacac aaaaagattt taattttatt aaaaaaaaaa aaaaaaaaga 2820
ccgggaattc gatatcaagc ttatcgacct gcagatcgtt caaacatttg gcaataaagt 2880
ttcttaagat tgaatcctgt tgccggtctt gcgatgatta tcatataatt tctgttgaat 2940
tacgttaagc atgtaataat taacatgtaa tgcatgacgt tatttatgag atgggttttt 3000
atgattagag tcccgcaatt atacatttaa tacgcgatag aaaacaaaat atagcgcgca 3060
aactaggata aattatcgcg cgcggtgtca tctatgttac tagat 3105
<210> 65
<211> 3105
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Конструкция 2995 от промотора 2X35S к терминатору NOS
<400> 65
gtcaacatgg tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca 60
gaagaccaaa gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga 120
ttccattgcc cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc 180
tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt 240
ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc 300
acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat aacatggtgg agcacgacac acttgtctac 360
tccaaaaata tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg caattgagac ttttcaacaa 420
agggtaatat ccggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca ctttattgtg 480
aagatagtgg aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggcc 540
atcgttgaag atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc 600
atcgtggaaa aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc 660
tccactgacg taagggatga cgcacaatcc cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata 720
taaggaagtt catttcattt ggagaggtat taaaatctta ataggttttg ataaaagcga 780
acgtggggaa acccgaacca aaccttcttc taaactctct ctcatctctc ttaaagcaaa 840
cttctctctt gtctttcttg cgtgagcgat cttcaacgtt gtcagatcgt gcttcggcac 900
cagtacaatg gcgaaaaacg ttgcgatttt cggcttattg ttttctcttc ttgtgttggt 960
tccttctcag atcttcgcgg acacattatg tataggttat catgcgaaca attcaacaga 1020
cactgtagac acagtactag aaaagaatgt aacagtaaca cactctgtta accttctaga 1080
agacaagcat aacgggaaac tatgcaaact aagaggggta gccccattgc atttgggtaa 1140
atgtaacatt gctggctgga tcctgggaaa tccagagtgt gaatcactct ccacagcaag 1200
ctcatggtcc tacattgtgg aaacacctag ttcagacaat ggaacgtgtt acccaggaga 1260
tttcatcgat tatgaggagc taagagagca attgagctca gtgtcatcat ttgaaaggtt 1320
tgagatattc cccaagacaa gttcatggcc caatcatgac tcgaacaaag gtgtaacggc 1380
agcatgtcct catgctggag caaaaagctt ctacaaaaat ttaatatggc tagttaaaaa 1440
aggaaattca tacccaaagc tcagcaaatc ctacattaat gataaaggga aagaagtcct 1500
cgtgctatgg ggcattcacc atccatctac tagtgctgac caacaaagtc tctatcagaa 1560
tgcagatgca tatgtttttg tggggtcatc aagatacagc aagaagttca agccggaaat 1620
agcaataaga cccaaagtga gggatcaaga agggagaatg aactattact ggacactagt 1680
agagccggga gacaaaataa cattcgaagc aactggaaat ctagtggtac cgagatatgc 1740
attcgcaatg gaaagaaatg ctggatctgg tattatcatt tcagatacac cagtccacga 1800
ttgcaataca acttgtcaaa cacccaaggg tgctataaac accagcctcc catttcagaa 1860
tatacatccg atcacaattg gaaaatgtcc aaaatatgta aaaagcacaa aattgagact 1920
ggccacagga ttgaggaata tcccgtctat tcaatctaga ggactatttg gggccattgc 1980
cggtttcatt gaaggggggt ggacagggat ggtagatgga tggtacggtt atcaccatca 2040
aaatgagcag gggtcaggat atgcagccga cctgaagagc acacagaatg ccattgacga 2100
gattactaac aaagtaaatt ctgttattga aaagatgaat acacaggaca cagcagtagg 2160
taaagagttc aaccacctgg aaaaaagaat agagaattta aataaaaaag ttgatgatgg 2220
tttcctggac atttggactt acaatgccga actgttggtt ctaatggaaa atgaaagaac 2280
tttggactac cacgattcaa atgtgaagaa cttatatgaa aaggtaagaa gccagctaaa 2340
aaacaatgcc aaggaaattg gaaacggctg ctttgaattt taccacaaat gcgataacac 2400
gtgcatggaa agtgtcaaaa atgggactta tgactaccca aaatactcag aggaagcaaa 2460
attaaacaga gaagaaatag atggggtaaa gctggaatca acaaggattt accagatttt 2520
ggcgatctat tcaactgtcg ccagttcatt ggtactggta gtctccctgg gggcaatcag 2580
tttctggatg tgctctaatg ggtctctaca gtgtagaata tgtatttaaa ggcctatttt 2640
ctttagtttg aatttactgt tattcggtgt gcatttctat gtttggtgag cggttttctg 2700
tgctcagagt gtgtttattt tatgtaattt aatttctttg tgagctcctg tttagcaggt 2760
cgtcccttca gcaaggacac aaaaagattt taattttatt aaaaaaaaaa aaaaaaaaga 2820
ccgggaattc gatatcaagc ttatcgacct gcagatcgtt caaacatttg gcaataaagt 2880
ttcttaagat tgaatcctgt tgccggtctt gcgatgatta tcatataatt tctgttgaat 2940
tacgttaagc atgtaataat taacatgtaa tgcatgacgt tatttatgag atgggttttt 3000
atgattagag tcccgcaatt atacatttaa tacgcgatag aaaacaaaat atagcgcgca 3060
aactaggata aattatcgcg cgcggtgtca tctatgttac tagat 3105
<210> 66
<211> 6360
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Клонирующий вектор 3556 от левой границы T-ДНК к правой
<400> 66
tggcaggata tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga caacttaata acacattgcg 60
gacgttttta atgtactgaa ttaacgccga atcccgggct ggtatattta tatgttgtca 120
aataactcaa aaaccataaa agtttaagtt agcaagtgtg tacattttta cttgaacaaa 180
aatattcacc tactactgtt ataaatcatt attaaacatt agagtaaaga aatatggatg 240
ataagaacaa gagtagtgat attttgacaa caattttgtt gcaacatttg agaaaatttt 300
gttgttctct cttttcattg gtcaaaaaca atagagagag aaaaaggaag agggagaata 360
aaaacataat gtgagtatga gagagaaagt tgtacaaaag ttgtaccaaa atagttgtac 420
aaatatcatt gaggaatttg acaaaagcta cacaaataag ggttaattgc tgtaaataaa 480
taaggatgac gcattagaga gatgtaccat tagagaattt ttggcaagtc attaaaaaga 540
aagaataaat tatttttaaa attaaaagtt gagtcatttg attaaacatg tgattattta 600
atgaattgat gaaagagttg gattaaagtt gtattagtaa ttagaatttg gtgtcaaatt 660
taatttgaca tttgatcttt tcctatatat tgccccatag agtcagttaa ctcattttta 720
tatttcatag atcaaataag agaaataacg gtatattaat ccctccaaaa aaaaaaaacg 780
gtatatttac taaaaaatct aagccacgta ggaggataac aggatccccg taggaggata 840
acatccaatc caaccaatca caacaatcct gatgagataa cccactttaa gcccacgcat 900
ctgtggcaca tctacattat ctaaatcaca cattcttcca cacatctgag ccacacaaaa 960
accaatccac atctttatca cccattctat aaaaaatcac actttgtgag tctacacttt 1020
gattcccttc aaacacatac aaagagaaga gactaattaa ttaattaatc atcttgagag 1080
aaaatggaac gagctataca aggaaacgac gctagggaac aagctaacag tgaacgttgg 1140
gatggaggat caggaggtac cacttctccc ttcaaacttc ctgacgaaag tccgagttgg 1200
actgagtggc ggctacataa cgatgagacg aattcgaatc aagataatcc ccttggtttc 1260
aaggaaagct ggggtttcgg gaaagttgta tttaagagat atctcagata cgacaggacg 1320
gaagcttcac tgcacagagt ccttggatct tggacgggag attcggttaa ctatgcagca 1380
tctcgatttt tcggtttcga ccagatcgga tgtacctata gtattcggtt tcgaggagtt 1440
agtatcaccg tttctggagg gtcgcgaact cttcagcatc tctgtgagat ggcaattcgg 1500
tctaagcaag aactgctaca gcttgcccca atcgaagtgg aaagtaatgt atcaagagga 1560
tgccctgaag gtactcaaac cttcgaaaaa gaaagcgagt aagttaaaat gcttcttcgt 1620
ctcctattta taatatggtt tgttattgtt aattttgttc ttgtagaaga gcttaattaa 1680
tcgttgttgt tatgaaatac tatttgtatg agatgaactg gtgtaatgta attcatttac 1740
ataagtggag tcagaatcag aatgtttcct ccataactaa ctagacatga agacctgccg 1800
cgtacaattg tcttatattt gaacaactaa aattgaacat cttttgccac aactttataa 1860
gtggttaata tagctcaaat atatggtcaa gttcaataga ttaataatgg aaatatcagt 1920
tatcgaaatt cattaacaat caacttaacg ttattaacta ctaattttat atcatcccct 1980
ttgataaatg atagtacacc aattaggaag gagcatgctc gcctaggaga ttgtcgtttc 2040
ccgccttcag tttgcaagct gctctagccg tgtagccaat acgcaaaccg cctctccccg 2100
cgcgttggga attactagcg cgtgtcgaca cgcgtggcgc gccctggtat atttatatgt 2160
tgtcaaataa ctcaaaaacc ataaaagttt aagttagcaa gtgtgtacat ttttacttga 2220
acaaaaatat tcacctacta ctgttataaa tcattattaa acattagagt aaagaaatat 2280
ggatgataag aacaagagta gtgatatttt gacaacaatt ttgttgcaac atttgagaaa 2340
attttgttgt tctctctttt cattggtcaa aaacaataga gagagaaaaa ggaagaggga 2400
gaataaaaac ataatgtgag tatgagagag aaagttgtac aaaagttgta ccaaaatagt 2460
tgtacaaata tcattgagga atttgacaaa agctacacaa ataagggtta attgctgtaa 2520
ataaataagg atgacgcatt agagagatgt accattagag aatttttggc aagtcattaa 2580
aaagaaagaa taaattattt ttaaaattaa aagttgagtc atttgattaa acatgtgatt 2640
atttaatgaa ttgatgaaag agttggatta aagttgtatt agtaattaga atttggtgtc 2700
aaatttaatt tgacatttga tcttttccta tatattgccc catagagtca gttaactcat 2760
ttttatattt catagatcaa ataagagaaa taacggtata ttaatccctc caaaaaaaaa 2820
aaacggtata tttactaaaa aatctaagcc acgtaggagg ataacaggat ccccgtagga 2880
ggataacatc caatccaacc aatcacaaca atcctgatga gataacccac tttaagccca 2940
cgcatctgtg gcacatctac attatctaaa tcacacattc ttccacacat ctgagccaca 3000
caaaaaccaa tccacatctt tatcacccat tctataaaaa atcacacttt gtgagtctac 3060
actttgattc ccttcaaaca catacaaaga gaagagacta attaattaat taatcatctt 3120
gagagaaaat gagtcttcta accgaggtcg aaacgcctat cagaaacgaa tgggggtgca 3180
gatgcaacga ttcaagtgat cctcttgttg ttgccgcaag tataattggg attgtgcacc 3240
tgatattgtg gattattgat cgcctttttt ccaaaagcat ttatcgtatc tttaaacacg 3300
gtttaaaaag agggccttct acggaaggag taccagagtc tatgagggaa gaatatcgag 3360
aggaacagca gaatgctgtg gatgctgacg atggtcattt tgtcagcata gagctggagt 3420
aagagctcta agttaaaatg cttcttcgtc tcctatttat aatatggttt gttattgtta 3480
attttgttct tgtagaagag cttaattaat cgttgttgtt atgaaatact atttgtatga 3540
gatgaactgg tgtaatgtaa ttcatttaca taagtggagt cagaatcaga atgtttcctc 3600
cataactaac tagacatgaa gacctgccgc gtacaattgt cttatatttg aacaactaaa 3660
attgaacatc ttttgccaca actttataag tggttaatat agctcaaata tatggtcaag 3720
ttcaatagat taataatgga aatatcagtt atcgaaattc attaacaatc aacttaacgt 3780
tattaactac taattttata tcatcccctt tgataaatga tagtacacca attaggaagg 3840
aactaggaga ttgtcgtttc ccgccttcag tttgcaagct gctctagccg tgtagccaat 3900
acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggga attactagcg cgtgtcgaca agcttgcatg 3960
ccggtcaaca tggtggagca cgacacactt gtctactcca aaaatatcaa agatacagtc 4020
tcagaagacc aaagggcaat tgagactttt caacaaaggg taatatccgg aaacctcctc 4080
ggattccatt gcccagctat ctgtcacttt attgtgaaga tagtggaaaa ggaaggtggc 4140
tcctacaaat gccatcattg cgataaagga aaggccatcg ttgaagatgc ctctgccgac 4200
agtggtccca aagatggacc cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga agacgttcca 4260
accacgtctt caaagcaagt ggattgatgt gataacatgg tggagcacga cacacttgtc 4320
tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca gaagaccaaa gggcaattga gacttttcaa 4380
caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga ttccattgcc cagctatctg tcactttatt 4440
gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag 4500
gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg 4560
agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat 4620
atctccactg acgtaaggga tgacgcacaa tcccactatc cttcgcaaga cccttcctct 4680
atataaggaa gttcatttca tttggagagg tattaaaatc ttaataggtt ttgataaaag 4740
cgaacgtggg gaaacccgaa ccaaaccttc ttctaaactc tctctcatct ctcttaaagc 4800
aaacttctct cttgtctttc ttgcgtgagc gatcttcaac gttgtcagat cgtgcttcgg 4860
caccgcggat ggcgaaaaac gttgcgattt tcggcttatt gttttctctt cttgtgttgg 4920
ttccttctca gatcttcgcc tgcaggctcc tcagccaaaa cgacaccccc atctgtctat 4980
ccactggccc ctggatctgc tgcccaaact aactccatgg tgaccctggg atgcctggtc 5040
aagggctatt tccctgagcc agtgacagtg acctggaact ctggatccct gtccagcggt 5100
gtgcacacct tcccagctgt cctgcagtct gacctctaca ctctgagcag ctcagtgact 5160
gtcccctcca gcacctggcc cagcgagacc gtcacctgca acgttgccca cccggccagc 5220
agcaccaagg tggacaagaa aattgtgccc agggattgtg gttgtaagcc ttgcatatgt 5280
acagtcccag aagtatcatc tgtcttcatc ttccccccaa agcccaagga tgtgctcacc 5340
attactctga ctcctaaggt cacgtgtgtt gtggtagaca tcagcaagga tgatcccgag 5400
gtccagttca gctggtttgt agatgatgtg gaggtgcaca cagctcagac gcaaccccgg 5460
gaggagcagt tcaacagcac tttccgctca gtcagtgaac ttcccatcat gcaccaggac 5520
tggctcaatg gcaaggagcg atcgctcacc atcaccatca ccatcaccat caccattaaa 5580
ggcctatttt ctttagtttg aatttactgt tattcggtgt gcatttctat gtttggtgag 5640
cggttttctg tgctcagagt gtgtttattt tatgtaattt aatttctttg tgagctcctg 5700
tttagcaggt cgtcccttca gcaaggacac aaaaagattt taattttatt aaaaaaaaaa 5760
aaaaaaaaga ccgggaattc gatatcaagc ttatcgacct gcagatcgtt caaacatttg 5820
gcaataaagt ttcttaagat tgaatcctgt tgccggtctt gcgatgatta tcatataatt 5880
tctgttgaat tacgttaagc atgtaataat taacatgtaa tgcatgacgt tatttatgag 5940
atgggttttt atgattagag tcccgcaatt atacatttaa tacgcgatag aaaacaaaat 6000
atagcgcgca aactaggata aattatcgcg cgcggtgtca tctatgttac tagatctcta 6060
gagtctcaag cttggcgcgc ccacgtgact agtggcactg gccgtcgttt tacaacgtcg 6120
tgactgggaa aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc 6180
cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct 6240
gaatggcgaa tgctagagca gcttgagctt ggatcagatt gtcgtttccc gccttcagtt 6300
taaactatca gtgtttgaca ggatatattg gcgggtaaac ctaagagaaa agagcgttta 6360
<210> 67
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер IF-H5ITMCT.s1-4r
<400> 67
actaaagaaa ataggccttt aaatgcaaat tctgcattgt aacgatccat 50
<210> 68
<211> 1731
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК PDI-H5 Indo
<400> 68
atggcgaaaa acgttgcgat tttcggctta ttgttttctc ttcttgtgtt ggttccttct 60
cagatcttcg ccgatcagat ttgcattggt taccatgcaa acaattcaac agagcaggtt 120
gacacaatca tggaaaagaa cgttactgtt acacatgccc aagacatact ggaaaagaca 180
cacaacggga agctctgcga tctagatgga gtgaagcctc taattttaag agattgtagt 240
gtagctggat ggctcctcgg gaacccaatg tgtgacgaat tcatcaatgt accggaatgg 300
tcttacatag tggagaaggc caatccaacc aatgacctct gttacccagg gagtttcaac 360
gactatgaag aactgaaaca cctattgagc agaataaacc attttgagaa aattcaaatc 420
atccccaaaa gttcttggtc cgatcatgaa gcctcatcag gagttagctc agcatgtcca 480
tacctgggaa gtccctcctt ttttagaaat gtggtatggc ttatcaaaaa gaacagtaca 540
tacccaacaa taaagaaaag ctacaataat accaaccaag aggatctttt ggtactgtgg 600
ggaattcacc atcctaatga tgcggcagag cagacaaggc tatatcaaaa cccaaccacc 660
tatatttcca ttgggacatc aacactaaac cagagattgg taccaaaaat agctactaga 720
tccaaagtaa acgggcaaag tggaaggatg gagttcttct ggacaatttt aaaacctaat 780
gatgcaatca acttcgagag taatggaaat ttcattgctc cagaatatgc atacaaaatt 840
gtcaagaaag gggactcagc aattatgaaa agtgaattgg aatatggtaa ctgcaacacc 900
aagtgtcaaa ctccaatggg ggcgataaac tctagtatgc cattccacaa catacaccct 960
ctcaccatcg gggaatgccc caaatatgtg aaatcaaaca gattagtcct tgcaacaggg 1020
ctcagaaata gccctcaaag agagagcaga agaaaaaaga gaggactatt tggagctata 1080
gcaggtttta tagagggagg atggcaggga atggtagatg gttggtatgg gtaccaccat 1140
agcaatgagc aggggagtgg gtacgctgca gacaaagaat ccactcaaaa ggcaatagat 1200
ggagtcacca ataaggtcaa ctcaatcatt gacaaaatga acactcagtt tgaggccgtt 1260
ggaagggaat ttaataactt agaaaggaga atagagaatt taaacaagaa gatggaagac 1320
gggtttctag atgtctggac ttataatgcc gaacttctgg ttctcatgga aaatgagaga 1380
actctagact ttcatgactc aaatgttaag aacctctacg acaaggtccg actacagctt 1440
agggataatg caaaggagct gggtaacggt tgtttcgagt tctatcacaa atgtgataat 1500
gaatgtatgg aaagtataag aaacggaacg tacaactatc cgcagtattc agaagaagca 1560
agattaaaaa gagaggaaat aagtggggta aaattggaat caataggaac ttaccaaata 1620
ctgtcaattt attcaacagt ggcgagttcc ctagcactgg caatcatgat ggctggtcta 1680
tctttatgga tgtgctccaa tggatcgtta caatgcagaa tttgcattta a 1731
<210> 69
<211> 576
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> АК PDI-H5 Indo
<400> 69
Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His
20 25 30
Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val
35 40 45
Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys
50 55 60
Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser
65 70 75 80
Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn
85 90 95
Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val Glu Lys Ala Asn Pro Thr Asn Asp
100 105 110
Leu Cys Tyr Pro Gly Ser Phe Asn Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu
115 120 125
Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser
130 135 140
Ser Trp Ser Asp His Glu Ala Ser Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro
145 150 155 160
Tyr Leu Gly Ser Pro Ser Phe Phe Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys
165 170 175
Lys Asn Ser Thr Tyr Pro Thr Ile Lys Lys Ser Tyr Asn Asn Thr Asn
180 185 190
Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala
195 200 205
Ala Glu Gln Thr Arg Leu Tyr Gln Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Ile
210 215 220
Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg
225 230 235 240
Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile
245 250 255
Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile
260 265 270
Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile
275 280 285
Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr
290 295 300
Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser Met Pro Phe His Asn Ile His Pro
305 310 315 320
Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val
325 330 335
Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser Pro Gln Arg Glu Ser Arg Arg Lys
340 345 350
Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp
355 360 365
Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln
370 375 380
Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp
385 390 395 400
Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln
405 410 415
Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu
420 425 430
Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr
435 440 445
Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe
450 455 460
His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu
465 470 475 480
Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His
485 490 495
Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asn
500 505 510
Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser
515 520 525
Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly Thr Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr
530 535 540
Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ile Met Met Ala Gly Leu
545 550 555 560
Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile
565 570 575
<210> 70
<211> 49
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер H5Ind(F393D).r
<400> 70
cttccaacgg cctcgtcctg agtgttcatt ttgtcaatga ttgagttga 49
<210> 71
<211> 49
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> H5Ind(F393D).c
<400> 71
caaaatgaac actcaggacg aggccgttgg aagggaattt aataactta 49
<210> 72
<211> 1731
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК PDI-H5 Indo-F393D
<400> 72
atggcgaaaa acgttgcgat tttcggctta ttgttttctc ttcttgtgtt ggttccttct 60
cagatcttcg cggatcagat ttgcattggt taccatgcaa acaattcaac agagcaggtt 120
gacacaatca tggaaaagaa cgttactgtt acacatgccc aagacatact ggaaaagaca 180
cacaacggga agctctgcga tctagatgga gtgaagcctc taattttaag agattgtagt 240
gtagctggat ggctcctcgg gaacccaatg tgtgacgaat tcatcaatgt accggaatgg 300
tcttacatag tggagaaggc caatccaacc aatgacctct gttacccagg gagtttcaac 360
gactatgaag aactgaaaca cctattgagc agaataaacc attttgagaa aattcaaatc 420
atccccaaaa gttcttggtc cgatcatgaa gcctcatcag gagttagctc agcatgtcca 480
tacctgggaa gtccctcctt ttttagaaat gtggtatggc ttatcaaaaa gaacagtaca 540
tacccaacaa taaagaaaag ctacaataat accaaccaag aggatctttt ggtactgtgg 600
ggaattcacc atcctaatga tgcggcagag cagacaaggc tatatcaaaa cccaaccacc 660
tatatttcca ttgggacatc aacactaaac cagagattgg taccaaaaat agctactaga 720
tccaaagtaa acgggcaaag tggaaggatg gagttcttct ggacaatttt aaaacctaat 780
gatgcaatca acttcgagag taatggaaat ttcattgctc cagaatatgc atacaaaatt 840
gtcaagaaag gggactcagc aattatgaaa agtgaattgg aatatggtaa ctgcaacacc 900
aagtgtcaaa ctccaatggg ggcgataaac tctagtatgc cattccacaa catacaccct 960
ctcaccatcg gggaatgccc caaatatgtg aaatcaaaca gattagtcct tgcaacaggg 1020
ctcagaaata gccctcaaag agagagcaga agaaaaaaga gaggactatt tggagctata 1080
gcaggtttta tagagggagg atggcaggga atggtagatg gttggtatgg gtaccaccat 1140
agcaatgagc aggggagtgg gtacgctgca gacaaagaat ccactcaaaa ggcaatagat 1200
ggagtcacca ataaggtcaa ctcaatcatt gacaaaatga acactcagga cgaggccgtt 1260
ggaagggaat ttaataactt agaaaggaga atagagaatt taaacaagaa gatggaagac 1320
gggtttctag atgtctggac ttataatgcc gaacttctgg ttctcatgga aaatgagaga 1380
actctagact ttcatgactc aaatgttaag aacctctacg acaaggtccg actacagctt 1440
agggataatg caaaggagct gggtaacggt tgtttcgagt tctatcacaa atgtgataat 1500
gaatgtatgg aaagtataag aaacggaacg tacaactatc cgcagtattc agaagaagca 1560
agattaaaaa gagaggaaat aagtggggta aaattggaat caataggaac ttaccaaata 1620
ctgtcaattt attcaacagt ggcgagttcc ctagcactgg caatcatgat ggctggtcta 1680
tctttatgga tgtgctccaa tggatcgtta caatgcagaa tttgcattta a 1731
<210> 73
<211> 576
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> АК PDI-H5 Indo-F393D
<400> 73
Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His
20 25 30
Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val
35 40 45
Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys
50 55 60
Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser
65 70 75 80
Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn
85 90 95
Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val Glu Lys Ala Asn Pro Thr Asn Asp
100 105 110
Leu Cys Tyr Pro Gly Ser Phe Asn Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu
115 120 125
Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser
130 135 140
Ser Trp Ser Asp His Glu Ala Ser Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro
145 150 155 160
Tyr Leu Gly Ser Pro Ser Phe Phe Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys
165 170 175
Lys Asn Ser Thr Tyr Pro Thr Ile Lys Lys Ser Tyr Asn Asn Thr Asn
180 185 190
Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala
195 200 205
Ala Glu Gln Thr Arg Leu Tyr Gln Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Ile
210 215 220
Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg
225 230 235 240
Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile
245 250 255
Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile
260 265 270
Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile
275 280 285
Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr
290 295 300
Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser Met Pro Phe His Asn Ile His Pro
305 310 315 320
Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val
325 330 335
Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser Pro Gln Arg Glu Ser Arg Arg Lys
340 345 350
Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp
355 360 365
Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln
370 375 380
Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp
385 390 395 400
Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln
405 410 415
Asp Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu
420 425 430
Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr
435 440 445
Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe
450 455 460
His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu
465 470 475 480
Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His
485 490 495
Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asn
500 505 510
Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser
515 520 525
Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly Thr Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr
530 535 540
Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ile Met Met Ala Gly Leu
545 550 555 560
Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile
565 570 575
<210> 74
<211> 51
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер IF-H5_Egy.r
<400> 74
actaaagaaa ataggccttt aaatgcaaat tctgcattgt agcgatccat t 51
<210> 75
<211> 1728
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК PDI-H5 Egypt
<400> 75
atggcgaaaa acgttgcgat tttcggctta ttgttttctc ttcttgtgtt ggttccttct 60
cagatcttcg cggatcagat ttgcattggt taccatgcaa acaactcgac agagcaggtt 120
gacacaataa tggaaaagaa tgtcactgtt acacacgccc aagacatact ggaaaagaca 180
cacaacggga aactctgcaa tctagatgga gtgaagcctc tcattttgag agattgtagt 240
gtagctggat ggctcctcgg gaacccaatg tgcgatgaat tcctcaatgt gccggaatgg 300
tcttacatag tggagaaaat caatccagcc aatgacctct gttatccagg gaatttcaac 360
gactatgaag aactgaaaca cctattgagc agaataaacc attttgagaa aattcagatc 420
attcccaaag attcttggtc agatcatgaa gcctcgggag tgagctcagc atgcccatac 480
caaggaagat cctccttttt tagaaatgtt gtatggctta ccaaaaagaa cgatgcatac 540
ccaacaataa agaaaagtta caataatact aaccaagaag atcttttggt actatggggg 600
attcaccatc caaatgatgc tgcagagcag acaaggcttt atcaaaaccc aactacctat 660
atctccgttg ggacatcaac actaaaccag agattggtac ccaaaatagc tactagatct 720
aaggtaaacg ggcaaagtgg aaggatggag ttcttttgga caattttaaa atcgaatgat 780
gcaataaact ttgagagcaa tggaaacttc attgctccag aaaatgcata caaaattgtc 840
aagaaaggag attcaacaat tatgaaaagt gagttggaat atagtaactg caacaccaag 900
tgtcagactc caataggggc gataaactcc agtatgccat tccacaacat ccaccctctc 960
accatcgggg aatgccccaa atatgtgaaa tcaaacagat tagtccttgc tactgggctc 1020
aggaatagcc ctcaaggaga gaaaagaaga aaaaagagag gactattcgg agccatagca 1080
ggctttatag agggaggatg gcagggaatg gtagatggtt ggtatgggta ccaccatagc 1140
aacgagcagg ggagtgggta cgctgcagac aaagaatcca ctcaaagggc tatagatgga 1200
gtcaccaata aggtcaattc gatcattgac aaaatgaaca ctcagtttga ggctgttgga 1260
agggaattta ataacttaga aaggagaata gaaaatttaa acaagaagat ggaagacgga 1320
ttcctagatg tctggactta taatgctgaa cttctggttc tcatggaaaa tgagagaact 1380
ctagactttc atgactcaaa tgtcaagaat ctttatgaca aggtccgact acagcttagg 1440
gataatgcaa aggagcttgg taacggttgt ttcgagttct atcacagatg tgataatgaa 1500
tgtatggaaa gtgtaagaaa cggaacgtat gactaccctc aatattcaga agaagcaaga 1560
ttaaaaagag aggaaataag tggagtaaaa ttggagtcaa taggaactta ccaaatactg 1620
tcaatttatt caacagtggc gagctcccta gcactggcaa tcatggtggc tggtctatct 1680
ttatggatgt gctccaatgg atcgctacaa tgcagaattt gcatttaa 1728
<210> 76
<211> 575
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> АК PDI-H5 Egypt
<400> 76
Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His
20 25 30
Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val
35 40 45
Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys
50 55 60
Leu Cys Asn Leu Asp Gly Val Lys Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser
65 70 75 80
Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn Pro Met Cys Asp Glu Phe Leu Asn
85 90 95
Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val Glu Lys Ile Asn Pro Ala Asn Asp
100 105 110
Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Phe Asn Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu
115 120 125
Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Asp
130 135 140
Ser Trp Ser Asp His Glu Ala Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr
145 150 155 160
Gln Gly Arg Ser Ser Phe Phe Arg Asn Val Val Trp Leu Thr Lys Lys
165 170 175
Asn Asp Ala Tyr Pro Thr Ile Lys Lys Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln
180 185 190
Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala
195 200 205
Glu Gln Thr Arg Leu Tyr Gln Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly
210 215 220
Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser
225 230 235 240
Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu
245 250 255
Lys Ser Asn Asp Ala Ile Asn Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala
260 265 270
Pro Glu Asn Ala Tyr Lys Ile Val Lys Lys Gly Asp Ser Thr Ile Met
275 280 285
Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Ser Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro
290 295 300
Ile Gly Ala Ile Asn Ser Ser Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu
305 310 315 320
Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu
325 330 335
Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser Pro Gln Gly Glu Lys Arg Arg Lys Lys
340 345 350
Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln
355 360 365
Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly
370 375 380
Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln Arg Ala Ile Asp Gly
385 390 395 400
Val Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe
405 410 415
Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn
420 425 430
Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn
435 440 445
Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His
450 455 460
Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg
465 470 475 480
Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Arg
485 490 495
Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr
500 505 510
Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly
515 520 525
Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly Thr Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser
530 535 540
Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ile Met Val Ala Gly Leu Ser
545 550 555 560
Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile
565 570 575
<210> 77
<211> 49
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер H5Egy(F392D).r
<400> 77
cttccaacag cctcgtcctg agtgttcatt ttgtcaatga tcgaattga 49
<210> 78
<211> 49
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер H5Egy(F392D).c
<400> 78
caaaatgaac actcaggacg aggctgttgg aagggaattt aataactta 49
<210> 79
<211> 1728
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК PDI-H5 Egypt-F392D
<400> 79
atggcgaaaa acgttgcgat tttcggctta ttgttttctc ttcttgtgtt ggttccttct 60
cagatcttcg cggatcagat ttgcattggt taccatgcaa acaactcgac agagcaggtt 120
gacacaataa tggaaaagaa tgtcactgtt acacacgccc aagacatact ggaaaagaca 180
cacaacggga aactctgcaa tctagatgga gtgaagcctc tcattttgag agattgtagt 240
gtagctggat ggctcctcgg gaacccaatg tgcgatgaat tcctcaatgt gccggaatgg 300
tcttacatag tggagaaaat caatccagcc aatgacctct gttatccagg gaatttcaac 360
gactatgaag aactgaaaca cctattgagc agaataaacc attttgagaa aattcagatc 420
attcccaaag attcttggtc agatcatgaa gcctcgggag tgagctcagc atgcccatac 480
caaggaagat cctccttttt tagaaatgtt gtatggctta ccaaaaagaa cgatgcatac 540
ccaacaataa agaaaagtta caataatact aaccaagaag atcttttggt actatggggg 600
attcaccatc caaatgatgc tgcagagcag acaaggcttt atcaaaaccc aactacctat 660
atctccgttg ggacatcaac actaaaccag agattggtac ccaaaatagc tactagatct 720
aaggtaaacg ggcaaagtgg aaggatggag ttcttttgga caattttaaa atcgaatgat 780
gcaataaact ttgagagcaa tggaaacttc attgctccag aaaatgcata caaaattgtc 840
aagaaaggag attcaacaat tatgaaaagt gagttggaat atagtaactg caacaccaag 900
tgtcagactc caataggggc gataaactcc agtatgccat tccacaacat ccaccctctc 960
accatcgggg aatgccccaa atatgtgaaa tcaaacagat tagtccttgc tactgggctc 1020
aggaatagcc ctcaaggaga gaaaagaaga aaaaagagag gactattcgg agccatagca 1080
ggctttatag agggaggatg gcagggaatg gtagatggtt ggtatgggta ccaccatagc 1140
aacgagcagg ggagtgggta cgctgcagac aaagaatcca ctcaaagggc tatagatgga 1200
gtcaccaata aggtcaattc gatcattgac aaaatgaaca ctcaggacga ggctgttgga 1260
agggaattta ataacttaga aaggagaata gaaaatttaa acaagaagat ggaagacgga 1320
ttcctagatg tctggactta taatgctgaa cttctggttc tcatggaaaa tgagagaact 1380
ctagactttc atgactcaaa tgtcaagaat ctttatgaca aggtccgact acagcttagg 1440
gataatgcaa aggagcttgg taacggttgt ttcgagttct atcacagatg tgataatgaa 1500
tgtatggaaa gtgtaagaaa cggaacgtat gactaccctc aatattcaga agaagcaaga 1560
ttaaaaagag aggaaataag tggagtaaaa ttggagtcaa taggaactta ccaaatactg 1620
tcaatttatt caacagtggc gagctcccta gcactggcaa tcatggtggc tggtctatct 1680
ttatggatgt gctccaatgg atcgctacaa tgcagaattt gcatttaa 1728
<210> 80
<211> 575
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> АК PDI-H5 Egypt-F392D
<400> 80
Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His
20 25 30
Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val
35 40 45
Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys
50 55 60
Leu Cys Asn Leu Asp Gly Val Lys Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser
65 70 75 80
Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn Pro Met Cys Asp Glu Phe Leu Asn
85 90 95
Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val Glu Lys Ile Asn Pro Ala Asn Asp
100 105 110
Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Phe Asn Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu
115 120 125
Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Asp
130 135 140
Ser Trp Ser Asp His Glu Ala Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr
145 150 155 160
Gln Gly Arg Ser Ser Phe Phe Arg Asn Val Val Trp Leu Thr Lys Lys
165 170 175
Asn Asp Ala Tyr Pro Thr Ile Lys Lys Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln
180 185 190
Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala
195 200 205
Glu Gln Thr Arg Leu Tyr Gln Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly
210 215 220
Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser
225 230 235 240
Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu
245 250 255
Lys Ser Asn Asp Ala Ile Asn Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala
260 265 270
Pro Glu Asn Ala Tyr Lys Ile Val Lys Lys Gly Asp Ser Thr Ile Met
275 280 285
Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Ser Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro
290 295 300
Ile Gly Ala Ile Asn Ser Ser Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu
305 310 315 320
Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu
325 330 335
Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser Pro Gln Gly Glu Lys Arg Arg Lys Lys
340 345 350
Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln
355 360 365
Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly
370 375 380
Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln Arg Ala Ile Asp Gly
385 390 395 400
Val Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Asp
405 410 415
Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn
420 425 430
Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn
435 440 445
Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His
450 455 460
Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg
465 470 475 480
Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Arg
485 490 495
Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr
500 505 510
Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly
515 520 525
Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly Thr Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser
530 535 540
Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ile Met Val Ala Gly Leu Ser
545 550 555 560
Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile
565 570 575
<210> 81
<211> 1725
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК PDI-H3 Switz-N382A
<400> 81
atggcgaaaa acgttgcgat tttcggctta ttgttttctc ttcttgtgtt ggttccttct 60
cagatcttcg cgcaaaaact tcctggaaat gacaatagca cggcaacgct gtgccttggg 120
caccatgcag taccaaacgg aacgatagtg aaaacaatca cgaatgaccg aattgaagtt 180
actaatgcta ctgagctggt tcagaattcc tcaataggtg aaatatgcga cagtcctcat 240
cagatccttg atggagaaaa ctgcacacta atagatgctc tattgggaga ccctcagtgt 300
gatggctttc aaaataagaa atgggacctt tttgttgaac gaagcaaagc ctacagcaac 360
tgttaccctt atgatgtgcc ggattatgcc tcccttaggt cactagttgc ctcatccggc 420
acactggagt ttaacaatga aagcttcaat tgggctggag tcactcaaaa cggaacaagt 480
tcttcttgca taaggggatc taatagtagt ttctttagta gattaaattg gttgacccac 540
ttaaactcca aatacccagc attaaacgtg actatgccaa acaatgaaca atttgacaaa 600
ttgtacattt ggggggttca ccacccgggt acggacaagg accaaatctt cctgtatgca 660
caatcatcag gaagaatcac agtatctacc aaaagaagcc aacaagctgt aatcccgaat 720
atcggatcta gacccagaat aagggatatc cctagcagaa taagcatcta ttggacaata 780
gtaaaaccgg gagacatact tttgattaac agcacaggga atctaattgc tcctaggggt 840
tacttcaaaa tacgaagtgg gaaaagctca ataatgagat cagatgcacc cattggcaaa 900
tgcaagtctg aatgcatcac tccaaatgga agcattccca atgacaaacc attccaaaat 960
gtaaacagga tcacatacgg ggcctgtccc agatatgtta agcaaagcac tctgaaattg 1020
gcaacaggaa tgcgaaatgt accagagaga caaactagag gcatatttgg cgcaatagcg 1080
ggtttcatag aaaatggttg ggagggaatg gtggatggtt ggtacggctt caggcatcaa 1140
aattctgagg gaagaggaca agcagcagat ctcaaaagca ctcaagcagc aatcgatcaa 1200
atcaatggga agctggctcg attgatcggg aaaaccaacg agaaattcca tcagattgaa 1260
aaagaattct cagaagtaga agggagaatt caggaccttg agaaatatgt tgaggacaca 1320
aaaatagatc tctggtcata caacgcggag cttcttgttg ccctggagaa ccaacataca 1380
attgatctaa ctgactcaga aatgaacaaa ctgtttgaaa aaacaaagaa gcaactgagg 1440
gaaaatgctg aggatatggg caatggttgt ttcaaaatat accacaaatg tgacaatgcc 1500
tgcataggat caatcagaaa tggaacttat gaccacgatg tatacaggga tgaagcatta 1560
aacaaccggt tccagatcaa gggagttgag ctgaagtcag ggtacaaaga ttggatccta 1620
tggatttcct ttgccatatc atgttttttg ctttgtgttg ctttgttggg gttcatcatg 1680
tgggcctgcc aaaagggcaa cattaggtgc aacatttgca tttga 1725
<210> 82
<211> 574
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> АК PDI-H3 Switz-N382A
<400> 82
Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala Gln Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn
20 25 30
Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly His His Ala Val Pro Asn Gly Thr
35 40 45
Ile Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp Arg Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr
50 55 60
Glu Leu Val Gln Asn Ser Ser Ile Gly Glu Ile Cys Asp Ser Pro His
65 70 75 80
Gln Ile Leu Asp Gly Glu Asn Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly
85 90 95
Asp Pro Gln Cys Asp Gly Phe Gln Asn Lys Lys Trp Asp Leu Phe Val
100 105 110
Glu Arg Ser Lys Ala Tyr Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp
115 120 125
Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe
130 135 140
Asn Asn Glu Ser Phe Asn Trp Ala Gly Val Thr Gln Asn Gly Thr Ser
145 150 155 160
Ser Ser Cys Ile Arg Gly Ser Asn Ser Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn
165 170 175
Trp Leu Thr His Leu Asn Ser Lys Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met
180 185 190
Pro Asn Asn Glu Gln Phe Asp Lys Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His
195 200 205
Pro Gly Thr Asp Lys Asp Gln Ile Phe Leu Tyr Ala Gln Ser Ser Gly
210 215 220
Arg Ile Thr Val Ser Thr Lys Arg Ser Gln Gln Ala Val Ile Pro Asn
225 230 235 240
Ile Gly Ser Arg Pro Arg Ile Arg Asp Ile Pro Ser Arg Ile Ser Ile
245 250 255
Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr
260 265 270
Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly Tyr Phe Lys Ile Arg Ser Gly Lys
275 280 285
Ser Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala Pro Ile Gly Lys Cys Lys Ser Glu
290 295 300
Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn
305 310 315 320
Val Asn Arg Ile Thr Tyr Gly Ala Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gln Ser
325 330 335
Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Arg Gln Thr
340 345 350
Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu
355 360 365
Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly
370 375 380
Arg Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln
385 390 395 400
Ile Asn Gly Lys Leu Ala Arg Leu Ile Gly Lys Thr Asn Glu Lys Phe
405 410 415
His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp
420 425 430
Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn
435 440 445
Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr
450 455 460
Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe Glu Lys Thr Lys Lys Gln Leu Arg
465 470 475 480
Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys
485 490 495
Cys Asp Asn Ala Cys Ile Gly Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His
500 505 510
Asp Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly
515 520 525
Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe
530 535 540
Ala Ile Ser Cys Phe Leu Leu Cys Val Ala Leu Leu Gly Phe Ile Met
545 550 555 560
Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile Arg Cys Asn Ile Cys Ile
565 570
<210> 83
<211> 1725
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК PDI-H3 Switz-L384V
<400> 83
atggcgaaaa acgttgcgat tttcggctta ttgttttctc ttcttgtgtt ggttccttct 60
cagatcttcg cgcaaaaact tcctggaaat gacaatagca cggcaacgct gtgccttggg 120
caccatgcag taccaaacgg aacgatagtg aaaacaatca cgaatgaccg aattgaagtt 180
actaatgcta ctgagctggt tcagaattcc tcaataggtg aaatatgcga cagtcctcat 240
cagatccttg atggagaaaa ctgcacacta atagatgctc tattgggaga ccctcagtgt 300
gatggctttc aaaataagaa atgggacctt tttgttgaac gaagcaaagc ctacagcaac 360
tgttaccctt atgatgtgcc ggattatgcc tcccttaggt cactagttgc ctcatccggc 420
acactggagt ttaacaatga aagcttcaat tgggctggag tcactcaaaa cggaacaagt 480
tcttcttgca taaggggatc taatagtagt ttctttagta gattaaattg gttgacccac 540
ttaaactcca aatacccagc attaaacgtg actatgccaa acaatgaaca atttgacaaa 600
ttgtacattt ggggggttca ccacccgggt acggacaagg accaaatctt cctgtatgca 660
caatcatcag gaagaatcac agtatctacc aaaagaagcc aacaagctgt aatcccgaat 720
atcggatcta gacccagaat aagggatatc cctagcagaa taagcatcta ttggacaata 780
gtaaaaccgg gagacatact tttgattaac agcacaggga atctaattgc tcctaggggt 840
tacttcaaaa tacgaagtgg gaaaagctca ataatgagat cagatgcacc cattggcaaa 900
tgcaagtctg aatgcatcac tccaaatgga agcattccca atgacaaacc attccaaaat 960
gtaaacagga tcacatacgg ggcctgtccc agatatgtta agcaaagcac tctgaaattg 1020
gcaacaggaa tgcgaaatgt accagagaga caaactagag gcatatttgg cgcaatagcg 1080
ggtttcatag aaaatggttg ggagggaatg gtggatggtt ggtacggctt caggcatcaa 1140
aattctgagg gaagaggaca agcagcagat ctcaaaagca ctcaagcagc aatcgatcaa 1200
atcaatggga agctgaatcg agtgatcggg aaaaccaacg agaaattcca tcagattgaa 1260
aaagaattct cagaagtaga agggagaatt caggaccttg agaaatatgt tgaggacaca 1320
aaaatagatc tctggtcata caacgcggag cttcttgttg ccctggagaa ccaacataca 1380
attgatctaa ctgactcaga aatgaacaaa ctgtttgaaa aaacaaagaa gcaactgagg 1440
gaaaatgctg aggatatggg caatggttgt ttcaaaatat accacaaatg tgacaatgcc 1500
tgcataggat caatcagaaa tggaacttat gaccacgatg tatacaggga tgaagcatta 1560
aacaaccggt tccagatcaa gggagttgag ctgaagtcag ggtacaaaga ttggatccta 1620
tggatttcct ttgccatatc atgttttttg ctttgtgttg ctttgttggg gttcatcatg 1680
tgggcctgcc aaaagggcaa cattaggtgc aacatttgca tttga 1725
<210> 84
<211> 574
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> АК PDI-H3 Switz-L384V
<400> 84
Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala Gln Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn
20 25 30
Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly His His Ala Val Pro Asn Gly Thr
35 40 45
Ile Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp Arg Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr
50 55 60
Glu Leu Val Gln Asn Ser Ser Ile Gly Glu Ile Cys Asp Ser Pro His
65 70 75 80
Gln Ile Leu Asp Gly Glu Asn Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly
85 90 95
Asp Pro Gln Cys Asp Gly Phe Gln Asn Lys Lys Trp Asp Leu Phe Val
100 105 110
Glu Arg Ser Lys Ala Tyr Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp
115 120 125
Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe
130 135 140
Asn Asn Glu Ser Phe Asn Trp Ala Gly Val Thr Gln Asn Gly Thr Ser
145 150 155 160
Ser Ser Cys Ile Arg Gly Ser Asn Ser Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn
165 170 175
Trp Leu Thr His Leu Asn Ser Lys Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met
180 185 190
Pro Asn Asn Glu Gln Phe Asp Lys Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His
195 200 205
Pro Gly Thr Asp Lys Asp Gln Ile Phe Leu Tyr Ala Gln Ser Ser Gly
210 215 220
Arg Ile Thr Val Ser Thr Lys Arg Ser Gln Gln Ala Val Ile Pro Asn
225 230 235 240
Ile Gly Ser Arg Pro Arg Ile Arg Asp Ile Pro Ser Arg Ile Ser Ile
245 250 255
Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr
260 265 270
Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly Tyr Phe Lys Ile Arg Ser Gly Lys
275 280 285
Ser Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala Pro Ile Gly Lys Cys Lys Ser Glu
290 295 300
Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn
305 310 315 320
Val Asn Arg Ile Thr Tyr Gly Ala Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gln Ser
325 330 335
Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Arg Gln Thr
340 345 350
Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu
355 360 365
Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly
370 375 380
Arg Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln
385 390 395 400
Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Val Ile Gly Lys Thr Asn Glu Lys Phe
405 410 415
His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp
420 425 430
Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn
435 440 445
Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr
450 455 460
Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe Glu Lys Thr Lys Lys Gln Leu Arg
465 470 475 480
Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys
485 490 495
Cys Asp Asn Ala Cys Ile Gly Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His
500 505 510
Asp Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly
515 520 525
Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe
530 535 540
Ala Ile Ser Cys Phe Leu Leu Cys Val Ala Leu Leu Gly Phe Ile Met
545 550 555 560
Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile Arg Cys Asn Ile Cys Ile
565 570
<210> 85
<211> 1725
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК PDI-H3 Penn-CysTm
<400> 85
atggcgaaaa acgttgcgat tttcggctta ttgttttctc ttcttgtgtt ggttccttct 60
cagatcttcg cgcaaaaact tcctggaaat gacaatagca cggcaacgct gtgccttggg 120
caccatgcag taccaaacgg aacgatagtg aaaacaatca cgaatgaccg aattgaagtt 180
actaatgcta ctgagctggt tcagaattcc tcaataggtg aaatatgcga cagtcctcat 240
cagatccttg atggaaaaaa ctgcactcta atagatgctc tattgggaga ccctcagtgt 300
gatggctttc aaaataagag atgggacctt tttgttgaac gaagcaaagc ctacagcaac 360
tgttaccctt atgatgtgcc ggattatgcc tcccttaggt cactagttgc ctcatccggc 420
acactggagt ttaacgatga aagcttcaat tgggctggag tcactcaaaa cggaacaagt 480
tctgcttgca taaggggatc taatagtagt ttctttagta gattaaattg gttgacccac 540
tcaaacttca aatacccagc attgaacgtg actatgccaa acaatgaaca atttgacaaa 600
ttgtacattt ggggggttca ccacccgggt acagacaagg accaaatctt cctgtacgct 660
caatcatcag gaagaatcac agtatctacc aaaagaagcc aacaagctgt aatcccgaat 720
atcggatcta gacccagaat aaggaatatc cctagcagaa taagcatcta ttggacaata 780
gtaaaaccgg gagacatact tttgattaac agcacaggga atctaattgc tcctaggggt 840
tacttcaaaa tacaaagtgg gaaaagctca ataatgagat cagatgcacc cattggcaaa 900
tgcaagtctg aatgcatcac tccaaatgga agcattccca atgacaaacc attccaaaat 960
gtaaacagga tcacatacgg ggcctgtccc agatatgtta agcaaagcac tctgaaattg 1020
gcaacaggaa tgcgaaatgt accagagaaa caaactagag gcatatttgg cgcaatagcg 1080
ggtttcatag aaaatggttg ggagggaatg aaggatggtt ggtacggttt caggcatcaa 1140
aattctgagg gaagaggaca agcagcagat ctcaaaagca ctcaagcagc aatcgatcaa 1200
atcaatggga agctgaatcg attgatcggg aaaaccaacg agaaattcca tcagattgaa 1260
aaagaattct cagaagtaga agggagaatt caggaccttg agaaatatgt tgaggacaca 1320
aaaatagatc tctggtcata caacgcggag cttcttgttg ccctggagaa ccaacataca 1380
attgatctaa ctgactcaga aatgaacaaa ctgtttgaaa aaacaaagaa gcaactgagg 1440
gaaaatgctg aggatatggg caatggttgt ttcaaaatat accacaaatg tgacaatgcc 1500
tgcataggat caatcagaaa tggaacttat gaccacgatg tatacaggga tgaagcttta 1560
aacaaccggt tccagatcaa gggagttgag ctgaagtcag ggtacaaaga ttggatccta 1620
tggatttcct ttgccatatc atcccttgta ctgttagttg ctttgttggg gttcatcatg 1680
tgggcctgcc aaaagggcaa cattaggtgc aacatttgca tttga 1725
<210> 86
<211> 574
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> АК PDI-H3 Penn-CysTm
<400> 86
Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala Gln Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn
20 25 30
Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly His His Ala Val Pro Asn Gly Thr
35 40 45
Ile Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp Arg Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr
50 55 60
Glu Leu Val Gln Asn Ser Ser Ile Gly Glu Ile Cys Asp Ser Pro His
65 70 75 80
Gln Ile Leu Asp Gly Lys Asn Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly
85 90 95
Asp Pro Gln Cys Asp Gly Phe Gln Asn Lys Arg Trp Asp Leu Phe Val
100 105 110
Glu Arg Ser Lys Ala Tyr Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp
115 120 125
Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe
130 135 140
Asn Asp Glu Ser Phe Asn Trp Ala Gly Val Thr Gln Asn Gly Thr Ser
145 150 155 160
Ser Ala Cys Ile Arg Gly Ser Asn Ser Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn
165 170 175
Trp Leu Thr His Ser Asn Phe Lys Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met
180 185 190
Pro Asn Asn Glu Gln Phe Asp Lys Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His
195 200 205
Pro Gly Thr Asp Lys Asp Gln Ile Phe Leu Tyr Ala Gln Ser Ser Gly
210 215 220
Arg Ile Thr Val Ser Thr Lys Arg Ser Gln Gln Ala Val Ile Pro Asn
225 230 235 240
Ile Gly Ser Arg Pro Arg Ile Arg Asn Ile Pro Ser Arg Ile Ser Ile
245 250 255
Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr
260 265 270
Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly Tyr Phe Lys Ile Gln Ser Gly Lys
275 280 285
Ser Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala Pro Ile Gly Lys Cys Lys Ser Glu
290 295 300
Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn
305 310 315 320
Val Asn Arg Ile Thr Tyr Gly Ala Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gln Ser
325 330 335
Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr
340 345 350
Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu
355 360 365
Gly Met Lys Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly
370 375 380
Arg Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln
385 390 395 400
Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Leu Ile Gly Lys Thr Asn Glu Lys Phe
405 410 415
His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp
420 425 430
Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn
435 440 445
Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr
450 455 460
Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe Glu Lys Thr Lys Lys Gln Leu Arg
465 470 475 480
Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys
485 490 495
Cys Asp Asn Ala Cys Ile Gly Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His
500 505 510
Asp Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly
515 520 525
Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe
530 535 540
Ala Ile Ser Ser Leu Val Leu Leu Val Ala Leu Leu Gly Phe Ile Met
545 550 555 560
Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile Arg Cys Asn Ile Cys Ile
565 570
<210> 87
<211> 1725
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК PDI-H3 Penn-N382A-CysTm
<400> 87
atggcgaaaa acgttgcgat tttcggctta ttgttttctc ttcttgtgtt ggttccttct 60
cagatcttcg cgcaaaaact tcctggaaat gacaatagca cggcaacgct gtgccttggg 120
caccatgcag taccaaacgg aacgatagtg aaaacaatca cgaatgaccg aattgaagtt 180
actaatgcta ctgagctggt tcagaattcc tcaataggtg aaatatgcga cagtcctcat 240
cagatccttg atggaaaaaa ctgcactcta atagatgctc tattgggaga ccctcagtgt 300
gatggctttc aaaataagag atgggacctt tttgttgaac gaagcaaagc ctacagcaac 360
tgttaccctt atgatgtgcc ggattatgcc tcccttaggt cactagttgc ctcatccggc 420
acactggagt ttaacgatga aagcttcaat tgggctggag tcactcaaaa cggaacaagt 480
tctgcttgca taaggggatc taatagtagt ttctttagta gattaaattg gttgacccac 540
tcaaacttca aatacccagc attgaacgtg actatgccaa acaatgaaca atttgacaaa 600
ttgtacattt ggggggttca ccacccgggt acagacaagg accaaatctt cctgtacgct 660
caatcatcag gaagaatcac agtatctacc aaaagaagcc aacaagctgt aatcccgaat 720
atcggatcta gacccagaat aaggaatatc cctagcagaa taagcatcta ttggacaata 780
gtaaaaccgg gagacatact tttgattaac agcacaggga atctaattgc tcctaggggt 840
tacttcaaaa tacaaagtgg gaaaagctca ataatgagat cagatgcacc cattggcaaa 900
tgcaagtctg aatgcatcac tccaaatgga agcattccca atgacaaacc attccaaaat 960
gtaaacagga tcacatacgg ggcctgtccc agatatgtta agcaaagcac tctgaaattg 1020
gcaacaggaa tgcgaaatgt accagagaaa caaactagag gcatatttgg cgcaatagcg 1080
ggtttcatag aaaatggttg ggagggaatg aaggatggtt ggtacggttt caggcatcaa 1140
aattctgagg gaagaggaca agcagcagat ctcaaaagca ctcaagcagc aatcgatcaa 1200
atcaatggga agctggctcg attgatcggg aaaaccaacg agaaattcca tcagattgaa 1260
aaagaattct cagaagtaga agggagaatt caggaccttg agaaatatgt tgaggacaca 1320
aaaatagatc tctggtcata caacgcggag cttcttgttg ccctggagaa ccaacataca 1380
attgatctaa ctgactcaga aatgaacaaa ctgtttgaaa aaacaaagaa gcaactgagg 1440
gaaaatgctg aggatatggg caatggttgt ttcaaaatat accacaaatg tgacaatgcc 1500
tgcataggat caatcagaaa tggaacttat gaccacgatg tatacaggga tgaagcttta 1560
aacaaccggt tccagatcaa gggagttgag ctgaagtcag ggtacaaaga ttggatccta 1620
tggatttcct ttgccatatc atcccttgta ctgttagttg ctttgttggg gttcatcatg 1680
tgggcctgcc aaaagggcaa cattaggtgc aacatttgca tttga 1725
<210> 88
<211> 574
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> АК PDI-H3 Penn-N382A-CysTm
<400> 88
Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala Gln Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn
20 25 30
Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly His His Ala Val Pro Asn Gly Thr
35 40 45
Ile Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp Arg Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr
50 55 60
Glu Leu Val Gln Asn Ser Ser Ile Gly Glu Ile Cys Asp Ser Pro His
65 70 75 80
Gln Ile Leu Asp Gly Lys Asn Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly
85 90 95
Asp Pro Gln Cys Asp Gly Phe Gln Asn Lys Arg Trp Asp Leu Phe Val
100 105 110
Glu Arg Ser Lys Ala Tyr Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp
115 120 125
Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe
130 135 140
Asn Asp Glu Ser Phe Asn Trp Ala Gly Val Thr Gln Asn Gly Thr Ser
145 150 155 160
Ser Ala Cys Ile Arg Gly Ser Asn Ser Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn
165 170 175
Trp Leu Thr His Ser Asn Phe Lys Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met
180 185 190
Pro Asn Asn Glu Gln Phe Asp Lys Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His
195 200 205
Pro Gly Thr Asp Lys Asp Gln Ile Phe Leu Tyr Ala Gln Ser Ser Gly
210 215 220
Arg Ile Thr Val Ser Thr Lys Arg Ser Gln Gln Ala Val Ile Pro Asn
225 230 235 240
Ile Gly Ser Arg Pro Arg Ile Arg Asn Ile Pro Ser Arg Ile Ser Ile
245 250 255
Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr
260 265 270
Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly Tyr Phe Lys Ile Gln Ser Gly Lys
275 280 285
Ser Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala Pro Ile Gly Lys Cys Lys Ser Glu
290 295 300
Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn
305 310 315 320
Val Asn Arg Ile Thr Tyr Gly Ala Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gln Ser
325 330 335
Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr
340 345 350
Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu
355 360 365
Gly Met Lys Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly
370 375 380
Arg Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln
385 390 395 400
Ile Asn Gly Lys Leu Ala Arg Leu Ile Gly Lys Thr Asn Glu Lys Phe
405 410 415
His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp
420 425 430
Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn
435 440 445
Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr
450 455 460
Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe Glu Lys Thr Lys Lys Gln Leu Arg
465 470 475 480
Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys
485 490 495
Cys Asp Asn Ala Cys Ile Gly Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His
500 505 510
Asp Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly
515 520 525
Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe
530 535 540
Ala Ile Ser Ser Leu Val Leu Leu Val Ala Leu Leu Gly Phe Ile Met
545 550 555 560
Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile Arg Cys Asn Ile Cys Ile
565 570
<210> 89
<211> 1725
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК PDI-H3 Penn-L384V-CysTm
<400> 89
atggcgaaaa acgttgcgat tttcggctta ttgttttctc ttcttgtgtt ggttccttct 60
cagatcttcg cgcaaaaact tcctggaaat gacaatagca cggcaacgct gtgccttggg 120
caccatgcag taccaaacgg aacgatagtg aaaacaatca cgaatgaccg aattgaagtt 180
actaatgcta ctgagctggt tcagaattcc tcaataggtg aaatatgcga cagtcctcat 240
cagatccttg atggaaaaaa ctgcactcta atagatgctc tattgggaga ccctcagtgt 300
gatggctttc aaaataagag atgggacctt tttgttgaac gaagcaaagc ctacagcaac 360
tgttaccctt atgatgtgcc ggattatgcc tcccttaggt cactagttgc ctcatccggc 420
acactggagt ttaacgatga aagcttcaat tgggctggag tcactcaaaa cggaacaagt 480
tctgcttgca taaggggatc taatagtagt ttctttagta gattaaattg gttgacccac 540
tcaaacttca aatacccagc attgaacgtg actatgccaa acaatgaaca atttgacaaa 600
ttgtacattt ggggggttca ccacccgggt acagacaagg accaaatctt cctgtacgct 660
caatcatcag gaagaatcac agtatctacc aaaagaagcc aacaagctgt aatcccgaat 720
atcggatcta gacccagaat aaggaatatc cctagcagaa taagcatcta ttggacaata 780
gtaaaaccgg gagacatact tttgattaac agcacaggga atctaattgc tcctaggggt 840
tacttcaaaa tacaaagtgg gaaaagctca ataatgagat cagatgcacc cattggcaaa 900
tgcaagtctg aatgcatcac tccaaatgga agcattccca atgacaaacc attccaaaat 960
gtaaacagga tcacatacgg ggcctgtccc agatatgtta agcaaagcac tctgaaattg 1020
gcaacaggaa tgcgaaatgt accagagaaa caaactagag gcatatttgg cgcaatagcg 1080
ggtttcatag aaaatggttg ggagggaatg aaggatggtt ggtacggttt caggcatcaa 1140
aattctgagg gaagaggaca agcagcagat ctcaaaagca ctcaagcagc aatcgatcaa 1200
atcaatggga agctgaatcg agtgatcggg aaaaccaacg agaaattcca tcagattgaa 1260
aaagaattct cagaagtaga agggagaatt caggaccttg agaaatatgt tgaggacaca 1320
aaaatagatc tctggtcata caacgcggag cttcttgttg ccctggagaa ccaacataca 1380
attgatctaa ctgactcaga aatgaacaaa ctgtttgaaa aaacaaagaa gcaactgagg 1440
gaaaatgctg aggatatggg caatggttgt ttcaaaatat accacaaatg tgacaatgcc 1500
tgcataggat caatcagaaa tggaacttat gaccacgatg tatacaggga tgaagcttta 1560
aacaaccggt tccagatcaa gggagttgag ctgaagtcag ggtacaaaga ttggatccta 1620
tggatttcct ttgccatatc atcccttgta ctgttagttg ctttgttggg gttcatcatg 1680
tgggcctgcc aaaagggcaa cattaggtgc aacatttgca tttga 1725
<210> 90
<211> 574
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> АК PDI-H3 Penn-L384V-CysTm
<400> 90
Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala Gln Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn
20 25 30
Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly His His Ala Val Pro Asn Gly Thr
35 40 45
Ile Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp Arg Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr
50 55 60
Glu Leu Val Gln Asn Ser Ser Ile Gly Glu Ile Cys Asp Ser Pro His
65 70 75 80
Gln Ile Leu Asp Gly Lys Asn Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly
85 90 95
Asp Pro Gln Cys Asp Gly Phe Gln Asn Lys Arg Trp Asp Leu Phe Val
100 105 110
Glu Arg Ser Lys Ala Tyr Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp
115 120 125
Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe
130 135 140
Asn Asp Glu Ser Phe Asn Trp Ala Gly Val Thr Gln Asn Gly Thr Ser
145 150 155 160
Ser Ala Cys Ile Arg Gly Ser Asn Ser Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn
165 170 175
Trp Leu Thr His Ser Asn Phe Lys Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met
180 185 190
Pro Asn Asn Glu Gln Phe Asp Lys Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His
195 200 205
Pro Gly Thr Asp Lys Asp Gln Ile Phe Leu Tyr Ala Gln Ser Ser Gly
210 215 220
Arg Ile Thr Val Ser Thr Lys Arg Ser Gln Gln Ala Val Ile Pro Asn
225 230 235 240
Ile Gly Ser Arg Pro Arg Ile Arg Asn Ile Pro Ser Arg Ile Ser Ile
245 250 255
Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr
260 265 270
Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly Tyr Phe Lys Ile Gln Ser Gly Lys
275 280 285
Ser Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala Pro Ile Gly Lys Cys Lys Ser Glu
290 295 300
Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn
305 310 315 320
Val Asn Arg Ile Thr Tyr Gly Ala Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gln Ser
325 330 335
Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr
340 345 350
Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu
355 360 365
Gly Met Lys Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly
370 375 380
Arg Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln
385 390 395 400
Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Val Ile Gly Lys Thr Asn Glu Lys Phe
405 410 415
His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp
420 425 430
Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn
435 440 445
Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr
450 455 460
Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe Glu Lys Thr Lys Lys Gln Leu Arg
465 470 475 480
Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys
485 490 495
Cys Asp Asn Ala Cys Ile Gly Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His
500 505 510
Asp Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly
515 520 525
Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe
530 535 540
Ala Ile Ser Ser Leu Val Leu Leu Val Ala Leu Leu Gly Phe Ile Met
545 550 555 560
Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile Arg Cys Asn Ile Cys Ile
565 570
<210> 91
<211> 550
<212> Белок
<213> Вирус Alphainfluenza A
<400> 91
Gln Lys Ile Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly
1 5 10 15
His His Ala Val Pro Asn Gly Thr Ile Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp
20 25 30
Arg Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Asn Ser Ser Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Cys Asp Ser Pro His Gln Ile Leu Asp Gly Glu Asn Cys
50 55 60
Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro Gln Cys Asp Gly Phe Gln
65 70 75 80
Asn Lys Lys Trp Asp Leu Phe Val Glu Arg Ser Lys Ala Tyr Ser Asn
85 90 95
Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val
100 105 110
Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Asn Asn Glu Ser Phe Asn Trp Thr
115 120 125
Gly Val Thr Gln Asn Gly Thr Ser Ser Ala Cys Ile Arg Lys Ser Ser
130 135 140
Ser Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu Thr His Leu Asn Tyr Thr
145 150 155 160
Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Val Pro Asn Asn Glu Gln Phe Asp Lys
165 170 175
Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His Pro Gly Thr Asp Lys Asp Gln Ile
180 185 190
Phe Leu Tyr Ala Arg Ser Ser Gly Arg Ile Thr Val Ser Thr Lys Arg
195 200 205
Ser Gln Gln Ala Val Ile Pro Asn Ile Gly Ser Arg Pro Arg Ile Arg
210 215 220
Asp Ile Pro Ser Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly
225 230 235 240
Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly
245 250 255
Tyr Phe Lys Ile Arg Ser Gly Lys Ser Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala
260 265 270
Pro Ile Gly Lys Cys Lys Ser Glu Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile
275 280 285
Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Arg Ile Thr Tyr Gly Ala
290 295 300
Cys Pro Arg Tyr Val Lys His Ser Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met
305 310 315 320
Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala
325 330 335
Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly
340 345 350
Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly Arg Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys
355 360 365
Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Leu
370 375 380
Ile Gly Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser
385 390 395 400
Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr
405 410 415
Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu
420 425 430
Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe
435 440 445
Glu Lys Thr Lys Lys Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn
450 455 460
Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn Ala Cys Ile Gly Ser
465 470 475 480
Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His Asn Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu
485 490 495
Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys
500 505 510
Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser Cys Phe Leu Leu Cys
515 520 525
Val Ala Leu Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile
530 535 540
Arg Cys Asn Ile Cys Ile
545 550
<210> 92
<211> 550
<212> Белок
<213> Вирус Alphainfluenza A
<400> 92
Gln Lys Ile Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly
1 5 10 15
His His Ala Val Pro Asn Gly Thr Ile Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp
20 25 30
Arg Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Asn Ser Ser Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Cys Asp Ser Pro His Gln Ile Leu Asp Gly Glu Asn Cys
50 55 60
Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro Gln Cys Asp Gly Phe Gln
65 70 75 80
Asn Lys Lys Trp Asp Leu Phe Val Glu Arg Ser Lys Ala Tyr Ser Asn
85 90 95
Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val
100 105 110
Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Asn Asn Glu Ser Phe Asn Trp Thr
115 120 125
Gly Val Thr Gln Asn Gly Thr Ser Ser Ala Cys Ile Arg Arg Ser Ser
130 135 140
Ser Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu Thr His Leu Asn Tyr Thr
145 150 155 160
Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn Glu Gln Phe Asp Lys
165 170 175
Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His Pro Gly Thr Asp Lys Asp Gln Ile
180 185 190
Phe Leu Tyr Ala Gln Ser Ser Gly Arg Ile Thr Val Ser Thr Lys Arg
195 200 205
Ser Gln Gln Ala Val Ile Pro Asn Ile Gly Ser Arg Pro Arg Ile Arg
210 215 220
Asp Ile Pro Ser Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly
225 230 235 240
Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly
245 250 255
Tyr Phe Lys Ile Arg Ser Gly Lys Ser Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala
260 265 270
Pro Ile Gly Lys Cys Lys Ser Glu Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile
275 280 285
Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Arg Ile Thr Tyr Gly Ala
290 295 300
Cys Pro Arg Tyr Val Lys His Ser Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met
305 310 315 320
Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala
325 330 335
Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly
340 345 350
Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly Arg Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys
355 360 365
Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Leu
370 375 380
Ile Gly Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser
385 390 395 400
Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr
405 410 415
Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu
420 425 430
Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe
435 440 445
Glu Lys Thr Lys Lys Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn
450 455 460
Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn Ala Cys Ile Gly Ser
465 470 475 480
Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His Asn Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu
485 490 495
Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys
500 505 510
Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser Cys Phe Leu Leu Cys
515 520 525
Val Ala Leu Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile
530 535 540
Arg Cys Asn Ile Cys Ile
545 550
<210> 93
<211> 550
<212> Белок
<213> Вирус Alphainfluenza A
<400> 93
Gln Lys Ile Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly
1 5 10 15
His His Ala Val Pro Asn Gly Thr Ile Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp
20 25 30
Arg Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Asn Ser Ser Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Cys Asp Ser Pro His Gln Ile Leu Asp Gly Glu Asn Cys
50 55 60
Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro Gln Cys Asp Gly Phe Gln
65 70 75 80
Asn Lys Lys Trp Asp Leu Phe Val Glu Arg Ser Lys Ala Tyr Ser Asn
85 90 95
Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val
100 105 110
Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Asn Asn Glu Ser Phe Asn Trp Thr
115 120 125
Gly Val Thr Gln Asn Gly Thr Ser Ser Ala Cys Ile Arg Arg Ser Ser
130 135 140
Ser Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu Thr His Leu Asn Tyr Thr
145 150 155 160
Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Lys Glu Gln Phe Asp Lys
165 170 175
Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His Pro Gly Thr Asp Lys Asp Gln Ile
180 185 190
Phe Leu Tyr Ala Gln Ser Ser Gly Arg Ile Thr Val Ser Thr Lys Arg
195 200 205
Ser Gln Gln Ala Val Ile Pro Asn Ile Gly Ser Arg Pro Arg Ile Arg
210 215 220
Asp Ile Pro Ser Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly
225 230 235 240
Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly
245 250 255
Tyr Phe Lys Ile Arg Ser Gly Lys Ser Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala
260 265 270
Pro Ile Gly Lys Cys Lys Ser Glu Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile
275 280 285
Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Arg Ile Thr Tyr Gly Ala
290 295 300
Cys Pro Arg Tyr Val Lys His Ser Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met
305 310 315 320
Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala
325 330 335
Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly
340 345 350
Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly Arg Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys
355 360 365
Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Leu
370 375 380
Ile Gly Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser
385 390 395 400
Glu Val Glu Gly Arg Val Gln Asp Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr
405 410 415
Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu
420 425 430
Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe
435 440 445
Glu Lys Thr Lys Lys Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn
450 455 460
Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn Ala Cys Ile Gly Ser
465 470 475 480
Ile Arg Asn Glu Thr Tyr Asp His Asn Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu
485 490 495
Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys
500 505 510
Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser Cys Phe Leu Leu Cys
515 520 525
Val Ala Leu Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile
530 535 540
Arg Cys Asn Ile Cys Ile
545 550
<210> 94
<211> 550
<212> Белок
<213> Вирус Alphainfluenza A
<400> 94
Gln Lys Ile Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly
1 5 10 15
His His Ala Val Pro Asn Gly Thr Ile Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp
20 25 30
Arg Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Asn Ser Ser Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Cys Asp Ser Pro His Gln Ile Leu Asp Gly Glu Asn Cys
50 55 60
Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro Gln Cys Asp Gly Phe Gln
65 70 75 80
Asn Lys Lys Trp Asp Leu Phe Val Glu Arg Ser Lys Ala Tyr Ser Asn
85 90 95
Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val
100 105 110
Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Lys Asn Glu Ser Phe Asn Trp Thr
115 120 125
Gly Val Thr Gln Asn Gly Thr Ser Ser Ala Cys Ile Arg Arg Ser Ser
130 135 140
Ser Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu Thr His Leu Asn Tyr Thr
145 150 155 160
Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Lys Glu Gln Phe Asp Lys
165 170 175
Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His Pro Gly Thr Asp Lys Asp Gln Ile
180 185 190
Phe Leu Tyr Ala Gln Ser Ser Gly Arg Ile Thr Val Ser Thr Lys Arg
195 200 205
Ser Gln Gln Ala Val Ile Pro Asn Ile Gly Ser Arg Pro Arg Ile Arg
210 215 220
Asp Ile Pro Ser Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly
225 230 235 240
Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly
245 250 255
Tyr Phe Lys Ile Arg Ser Gly Lys Ser Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala
260 265 270
Pro Ile Gly Lys Cys Lys Ser Glu Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile
275 280 285
Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Arg Ile Thr Tyr Gly Ala
290 295 300
Cys Pro Arg Tyr Val Lys His Ser Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met
305 310 315 320
Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala
325 330 335
Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly
340 345 350
Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly Arg Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys
355 360 365
Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Leu
370 375 380
Ile Gly Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser
385 390 395 400
Glu Val Glu Gly Arg Val Gln Asp Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr
405 410 415
Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu
420 425 430
Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe
435 440 445
Glu Lys Thr Lys Lys Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn
450 455 460
Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn Ala Cys Ile Gly Ser
465 470 475 480
Ile Arg Asn Glu Thr Tyr Asp His Asn Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu
485 490 495
Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys
500 505 510
Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser Cys Phe Leu Leu Cys
515 520 525
Val Ala Leu Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile
530 535 540
Arg Cys Asn Ile Cys Ile
545 550
<210> 95
<211> 550
<212> Белок
<213> Вирус Alphainfluenza A
<400> 95
Gln Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly
1 5 10 15
His His Ala Val Pro Asn Gly Thr Ile Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp
20 25 30
Arg Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Asn Ser Ser Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Cys Asp Ser Pro His Gln Ile Leu Asp Gly Lys Asn Cys
50 55 60
Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro Gln Cys Asp Gly Phe Gln
65 70 75 80
Asn Lys Arg Trp Asp Leu Phe Val Glu Arg Ser Lys Ala Tyr Ser Asn
85 90 95
Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val
100 105 110
Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Asn Asp Glu Ser Phe Asn Trp Ala
115 120 125
Gly Val Thr Gln Asn Gly Thr Ser Ser Ala Cys Ile Arg Gly Ser Asn
130 135 140
Ser Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu Thr His Ser Asn Phe Lys
145 150 155 160
Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn Glu Gln Phe Asp Lys
165 170 175
Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His Pro Gly Thr Asp Lys Asp Gln Ile
180 185 190
Phe Leu Tyr Ala Gln Ser Ser Gly Arg Ile Thr Val Ser Thr Lys Arg
195 200 205
Ser Gln Gln Ala Val Ile Pro Asn Ile Gly Ser Arg Pro Arg Ile Arg
210 215 220
Asn Ile Pro Ser Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly
225 230 235 240
Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly
245 250 255
Tyr Phe Lys Ile Gln Ser Gly Lys Ser Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala
260 265 270
Pro Ile Gly Lys Cys Lys Ser Glu Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile
275 280 285
Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Arg Ile Thr Tyr Gly Ala
290 295 300
Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gln Ser Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met
305 310 315 320
Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala
325 330 335
Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Lys Asp Gly Trp Tyr Gly
340 345 350
Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly Arg Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys
355 360 365
Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Leu
370 375 380
Ile Gly Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser
385 390 395 400
Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr
405 410 415
Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu
420 425 430
Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe
435 440 445
Glu Lys Thr Lys Lys Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn
450 455 460
Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn Ala Cys Ile Gly Ser
465 470 475 480
Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His Asp Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu
485 490 495
Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys
500 505 510
Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser Cys Phe Leu Leu Cys
515 520 525
Val Ala Leu Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile
530 535 540
Arg Cys Asn Ile Cys Ile
545 550
<210> 96
<211> 550
<212> Белок
<213> Вирус Alphainfluenza A
<400> 96
Gln Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly
1 5 10 15
His His Ala Val Pro Asn Gly Thr Ile Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp
20 25 30
Arg Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Asn Ser Ser Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Cys Asp Ser Pro His Gln Ile Leu Asp Gly Glu Asn Cys
50 55 60
Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro Gln Cys Asp Gly Phe Gln
65 70 75 80
Asn Lys Lys Trp Asp Leu Phe Val Glu Arg Ser Lys Ala Tyr Ser Asn
85 90 95
Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val
100 105 110
Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Asn Asn Glu Ser Phe Asn Trp Ala
115 120 125
Gly Val Thr Gln Asn Gly Thr Ser Ser Ser Cys Ile Arg Gly Ser Asn
130 135 140
Ser Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu Thr His Leu Asn Ser Lys
145 150 155 160
Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn Glu Gln Phe Asp Lys
165 170 175
Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His Pro Gly Thr Asp Lys Asp Gln Ile
180 185 190
Phe Leu Tyr Ala Gln Ser Ser Gly Arg Ile Thr Val Ser Thr Lys Arg
195 200 205
Ser Gln Gln Ala Val Ile Pro Asn Ile Gly Ser Arg Pro Arg Ile Arg
210 215 220
Asp Ile Pro Ser Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly
225 230 235 240
Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly
245 250 255
Tyr Phe Lys Ile Arg Ser Gly Lys Ser Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala
260 265 270
Pro Ile Gly Lys Cys Lys Ser Glu Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile
275 280 285
Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Arg Ile Thr Tyr Gly Ala
290 295 300
Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gln Ser Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met
305 310 315 320
Arg Asn Val Pro Glu Arg Gln Thr Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala
325 330 335
Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly
340 345 350
Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly Arg Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys
355 360 365
Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Leu
370 375 380
Ile Gly Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser
385 390 395 400
Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr
405 410 415
Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu
420 425 430
Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe
435 440 445
Glu Lys Thr Lys Lys Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn
450 455 460
Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn Ala Cys Ile Gly Ser
465 470 475 480
Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His Asp Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu
485 490 495
Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys
500 505 510
Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser Cys Phe Leu Leu Cys
515 520 525
Val Ala Leu Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile
530 535 540
Arg Cys Asn Ile Cys Ile
545 550
<210> 97
<211> 550
<212> Белок
<213> Вирус Alphainfluenza A
<400> 97
Gln Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly
1 5 10 15
His His Ala Val Pro Asn Gly Thr Ile Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp
20 25 30
Arg Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Asn Ser Ser Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Cys Asp Ser Pro His Gln Ile Leu Asp Gly Glu Asn Cys
50 55 60
Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro Gln Cys Asp Gly Phe Gln
65 70 75 80
Asn Lys Lys Trp Asp Leu Phe Val Glu Arg Ser Arg Ala Tyr Ser Asn
85 90 95
Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val
100 105 110
Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Asn Asn Glu Ser Phe Asn Trp Ala
115 120 125
Gly Val Thr Gln Asn Gly Thr Ser Ser Ser Cys Ile Arg Gly Ser Asn
130 135 140
Ser Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu Thr His Leu Asn Ser Lys
145 150 155 160
Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn Glu Gln Phe Asp Lys
165 170 175
Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His Pro Gly Thr Asp Lys Asp Gln Ile
180 185 190
Phe Leu Tyr Ala Lys Pro Ser Gly Arg Ile Thr Val Ser Thr Lys Arg
195 200 205
Ser Gln Gln Ala Val Ile Pro Asn Ile Gly Ser Arg Pro Arg Ile Arg
210 215 220
Asp Ile Pro Ser Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly
225 230 235 240
Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly
245 250 255
Tyr Phe Lys Ile Arg Ser Gly Lys Ser Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala
260 265 270
Pro Ile Gly Lys Cys Lys Ser Glu Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile
275 280 285
Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Arg Ile Thr Tyr Gly Ala
290 295 300
Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met
305 310 315 320
Arg Asn Val Pro Glu Arg Gln Thr Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala
325 330 335
Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly
340 345 350
Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly Arg Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys
355 360 365
Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Leu
370 375 380
Ile Gly Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser
385 390 395 400
Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr
405 410 415
Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu
420 425 430
Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe
435 440 445
Glu Lys Thr Lys Lys Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn
450 455 460
Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn Ala Cys Ile Gly Ser
465 470 475 480
Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His Asp Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu
485 490 495
Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys
500 505 510
Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser Cys Phe Leu Leu Cys
515 520 525
Val Ala Leu Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile
530 535 540
Arg Cys Asn Ile Cys Ile
545 550
<210> 98
<211> 5
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность CysTM (аминокислоты)
<400> 98
Ser Leu Val Leu Leu
1 5
<210> 99
<211> 5
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Нативная TMCT (аминокислоты)
<400> 99
Cys Phe Leu Leu Cys
1 5
<210> 100
<211> 15
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность CysTM (нуклеотиды)
<400> 100
tcccttgtac tgtta 15
<210> 101
<211> 15
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Нативная TMCT (нуклеотиды)
<400> 101
tgttttttgc tttgt 15
<210> 102
<211> 1701
<212> ДНК
<213> Вирус Alphainfluenza A
<400> 102
atgaagacta tcattgcttt gagctacatt ctatgtctgg ttttcgctca aaaaattcct 60
ggaaatgaca atagcacggc aacgctgtgc cttgggcacc atgcagtacc aaacggaacg 120
atagtgaaaa caatcacgaa tgaccgaatt gaagttacta atgctactga gctggttcag 180
aattcctcaa taggtgaaat atgcgacagt cctcatcaga tccttgatgg agaaaactgc 240
acactaatag atgctctatt gggagaccct cagtgtgatg gctttcaaaa taagaaatgg 300
gacctttttg ttgaacgaag caaagcctac agcaactgtt acccttatga tgtgccggat 360
tatgcctccc ttaggtcact agttgcctca tccggcacac tggagtttaa caatgaaagc 420
ttcaattgga ctggagtcac tcaaaacgga acaagttctg cttgcataag gagatctagt 480
agtagtttct ttagtagatt aaattggttg acccacttaa actacacata cccagcattg 540
aacgtgacta tgccaaacaa tgaacaattt gacaaattgt acatttgggg ggttcaccac 600
ccgggtacgg acaaggacca aatcttcctg tatgctcaat catcaggaag aatcacagta 660
tctaccaaaa gaagccaaca agctgtaatc ccaaatatcg gatctagacc cagaataagg 720
gatatcccta gcagaataag catctattgg acaatagtaa aaccgggaga catacttttg 780
attaacagca cagggaatct aattgctcct aggggttact tcaaaatacg aagtgggaaa 840
agctcaataa tgagatcaga tgcacccatt ggcaaatgca agtctgaatg catcactcca 900
aatggaagca ttcccaatga caaaccattc caaaatgtaa acaggatcac atacggggcc 960
tgtcccagat atgttaagca tagcactctg aaattggcaa caggaatgcg aaatgtacca 1020
gagaaacaaa ctagaggcat atttggcgca atagcgggtt tcatagaaaa tggttgggag 1080
ggaatggtgg atggttggta cggtttcagg catcaaaatt ctgagggaag aggacaagca 1140
gcagatctca aaagcactca agcagcaatc gatcaaatca atgggaagct gaatcgattg 1200
atcgggaaaa ccaacgagaa attccatcag attgaaaaag aattctcaga agtagaagga 1260
agaattcagg accttgagaa atatgttgag gacactaaaa tagatctctg gtcatacaac 1320
gcggagcttc ttgttgccct ggagaaccaa catacaattg atctaactga ctcagaaatg 1380
aacaaactgt ttgaaaaaac aaagaagcaa ctgagggaaa atgctgagga tatgggcaat 1440
ggttgtttca aaatatacca caaatgtgac aatgcctgca taggatcaat aagaaatgga 1500
acttatgacc acaatgtgta cagggatgaa gcattaaaca accggttcca gatcaaggga 1560
gttgagctga agtcagggta caaagattgg atcctatgga tttcctttgc catatcatgt 1620
tttttgcttt gtgttgcttt gttggggttc atcatgtggg cctgccaaaa gggcaacatt 1680
aggtgcaaca tttgcatttg a 1701
<210> 103
<211> 3108
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Конструкция 2801 от промотора 2X35S к терминатору NOS
<400> 103
gtcaacatgg tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca 60
gaagaccaaa gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga 120
ttccattgcc cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc 180
tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt 240
ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc 300
acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat aacatggtgg agcacgacac acttgtctac 360
tccaaaaata tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg caattgagac ttttcaacaa 420
agggtaatat ccggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca ctttattgtg 480
aagatagtgg aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggcc 540
atcgttgaag atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc 600
atcgtggaaa aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc 660
tccactgacg taagggatga cgcacaatcc cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata 720
taaggaagtt catttcattt ggagaggtat taaaatctta ataggttttg ataaaagcga 780
acgtggggaa acccgaacca aaccttcttc taaactctct ctcatctctc ttaaagcaaa 840
cttctctctt gtctttcttg cgtgagcgat cttcaacgtt gtcagatcgt gcttcggcac 900
cagtacaatg gcgaaaaacg ttgcgatttt cggcttattg ttttctcttc ttgtgttggt 960
tccttctcag atcttcgcgc aaaaacttcc tggaaatgac aatagcacgg caacgctgtg 1020
ccttgggcac catgcagtac caaacggaac gatagtgaaa acaatcacga atgaccgaat 1080
tgaagttact aatgctactg agctggttca gaattcctca ataggtgaaa tatgcgacag 1140
tcctcatcag atccttgatg gagaaaactg cacactaata gatgctctat tgggagaccc 1200
tcagtgtgat ggctttcaaa ataagaaatg ggaccttttt gttgaacgaa gcaaagccta 1260
cagcaactgt tacccttatg atgtgccgga ttatgcctcc cttaggtcac tagttgcctc 1320
atccggcaca ctggagttta acaatgaaag cttcaattgg gctggagtca ctcaaaacgg 1380
aacaagttct tcttgcataa ggggatctaa tagtagtttc tttagtagat taaattggtt 1440
gacccactta aactccaaat acccagcatt aaacgtgact atgccaaaca atgaacaatt 1500
tgacaaattg tacatttggg gggttcacca cccgggtacg gacaaggacc aaatcttcct 1560
gtatgcacaa tcatcaggaa gaatcacagt atctaccaaa agaagccaac aagctgtaat 1620
cccgaatatc ggatctagac ccagaataag ggatatccct agcagaataa gcatctattg 1680
gacaatagta aaaccgggag acatactttt gattaacagc acagggaatc taattgctcc 1740
taggggttac ttcaaaatac gaagtgggaa aagctcaata atgagatcag atgcacccat 1800
tggcaaatgc aagtctgaat gcatcactcc aaatggaagc attcccaatg acaaaccatt 1860
ccaaaatgta aacaggatca catacggggc ctgtcccaga tatgttaagc aaagcactct 1920
gaaattggca acaggaatgc gaaatgtacc agagagacaa actagaggca tatttggcgc 1980
aatagcgggt ttcatagaaa atggttggga gggaatggtg gatggttggt acggcttcag 2040
gcatcaaaat tctgagggaa gaggacaagc agcagatctc aaaagcactc aagcagcaat 2100
cgatcaaatc aatgggaagc tgaatcgatt gatcgggaaa accaacgaga aattccatca 2160
gattgaaaaa gaattctcag aagtagaagg gagaattcag gaccttgaga aatatgttga 2220
ggacacaaaa atagatctct ggtcatacaa cgcggagctt cttgttgccc tggagaacca 2280
acatacaatt gatctaactg actcagaaat gaacaaactg tttgaaaaaa caaagaagca 2340
actgagggaa aatgctgagg atatgggcaa tggttgtttc aaaatatacc acaaatgtga 2400
caatgcctgc ataggatcaa tcagaaatgg aacttatgac cacgatgtat acagggatga 2460
agcattaaac aaccggttcc agatcaaggg agttgagctg aagtcagggt acaaagattg 2520
gatcctatgg atttcctttg ccatatcatg ttttttgctt tgtgttgctt tgttggggtt 2580
catcatgtgg gcctgccaaa agggcaacat taggtgcaac atttgcattt gaaggcctat 2640
tttctttagt ttgaatttac tgttattcgg tgtgcatttc tatgtttggt gagcggtttt 2700
ctgtgctcag agtgtgttta ttttatgtaa tttaatttct ttgtgagctc ctgtttagca 2760
ggtcgtccct tcagcaagga cacaaaaaga ttttaatttt attaaaaaaa aaaaaaaaaa 2820
agaccgggaa ttcgatatca agcttatcga cctgcagatc gttcaaacat ttggcaataa 2880
agtttcttaa gattgaatcc tgttgccggt cttgcgatga ttatcatata atttctgttg 2940
aattacgtta agcatgtaat aattaacatg taatgcatga cgttatttat gagatgggtt 3000
tttatgatta gagtcccgca attatacatt taatacgcga tagaaaacaa aatatagcgc 3060
gcaaactagg ataaattatc gcgcgcggtg tcatctatgt tactagat 3108
<210> 104
<211> 3108
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Конструкция 3023 от промотора 2X35S к терминатору NOS
<400> 104
gtcaacatgg tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca 60
gaagaccaaa gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga 120
ttccattgcc cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc 180
tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt 240
ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc 300
acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat aacatggtgg agcacgacac acttgtctac 360
tccaaaaata tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg caattgagac ttttcaacaa 420
agggtaatat ccggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca ctttattgtg 480
aagatagtgg aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggcc 540
atcgttgaag atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc 600
atcgtggaaa aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc 660
tccactgacg taagggatga cgcacaatcc cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata 720
taaggaagtt catttcattt ggagaggtat taaaatctta ataggttttg ataaaagcga 780
acgtggggaa acccgaacca aaccttcttc taaactctct ctcatctctc ttaaagcaaa 840
cttctctctt gtctttcttg cgtgagcgat cttcaacgtt gtcagatcgt gcttcggcac 900
cagtacaatg gcgaaaaacg ttgcgatttt cggcttattg ttttctcttc ttgtgttggt 960
tccttctcag atcttcgcgc aaaaacttcc tggaaatgac aatagcacgg caacgctgtg 1020
ccttgggcac catgcagtac caaacggaac gatagtgaaa acaatcacga atgaccgaat 1080
tgaagttact aatgctactg agctggttca gaattcctca ataggtgaaa tatgcgacag 1140
tcctcatcag atccttgatg gagaaaactg cacactaata gatgctctat tgggagaccc 1200
tcagtgtgat ggctttcaaa ataagaaatg ggaccttttt gttgaacgaa gcaaagccta 1260
cagcaactgt tacccttatg atgtgccgga ttatgcctcc cttaggtcac tagttgcctc 1320
atccggcaca ctggagttta acaatgaaag cttcaattgg gctggagtca ctcaaaacgg 1380
aacaagttct tcttgcataa ggggatctaa tagtagtttc tttagtagat taaattggtt 1440
gacccactta aactccaaat acccagcatt aaacgtgact atgccaaaca atgaacaatt 1500
tgacaaattg tacatttggg gggttcacca cccgggtacg gacaaggacc aaatcttcct 1560
gtatgcacaa tcatcaggaa gaatcacagt atctaccaaa agaagccaac aagctgtaat 1620
cccgaatatc ggatctagac ccagaataag ggatatccct agcagaataa gcatctattg 1680
gacaatagta aaaccgggag acatactttt gattaacagc acagggaatc taattgctcc 1740
taggggttac ttcaaaatac gaagtgggaa aagctcaata atgagatcag atgcacccat 1800
tggcaaatgc aagtctgaat gcatcactcc aaatggaagc attcccaatg acaaaccatt 1860
ccaaaatgta aacaggatca catacggggc ctgtcccaga tatgttaagc aaagcactct 1920
gaaattggca acaggaatgc gaaatgtacc agagagacaa actagaggca tatttggcgc 1980
aatagcgggt ttcatagaaa atggttggga gggaatggtg gatggttggt acggcttcag 2040
gcatcaaaat tctgagggaa gaggacaagc agcagatctc aaaagcactc aagcagcaat 2100
cgatcaaatc aatgggaagc tggctcgatt gatcgggaaa accaacgaga aattccatca 2160
gattgaaaaa gaattctcag aagtagaagg gagaattcag gaccttgaga aatatgttga 2220
ggacacaaaa atagatctct ggtcatacaa cgcggagctt cttgttgccc tggagaacca 2280
acatacaatt gatctaactg actcagaaat gaacaaactg tttgaaaaaa caaagaagca 2340
actgagggaa aatgctgagg atatgggcaa tggttgtttc aaaatatacc acaaatgtga 2400
caatgcctgc ataggatcaa tcagaaatgg aacttatgac cacgatgtat acagggatga 2460
agcattaaac aaccggttcc agatcaaggg agttgagctg aagtcagggt acaaagattg 2520
gatcctatgg atttcctttg ccatatcatg ttttttgctt tgtgttgctt tgttggggtt 2580
catcatgtgg gcctgccaaa agggcaacat taggtgcaac atttgcattt gaaggcctat 2640
tttctttagt ttgaatttac tgttattcgg tgtgcatttc tatgtttggt gagcggtttt 2700
ctgtgctcag agtgtgttta ttttatgtaa tttaatttct ttgtgagctc ctgtttagca 2760
ggtcgtccct tcagcaagga cacaaaaaga ttttaatttt attaaaaaaa aaaaaaaaaa 2820
agaccgggaa ttcgatatca agcttatcga cctgcagatc gttcaaacat ttggcaataa 2880
agtttcttaa gattgaatcc tgttgccggt cttgcgatga ttatcatata atttctgttg 2940
aattacgtta agcatgtaat aattaacatg taatgcatga cgttatttat gagatgggtt 3000
tttatgatta gagtcccgca attatacatt taatacgcga tagaaaacaa aatatagcgc 3060
gcaaactagg ataaattatc gcgcgcggtg tcatctatgt tactagat 3108
<210> 105
<211> 3108
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Конструкция 2811 от промотора 2X35S к терминатору NOS
<400> 105
gtcaacatgg tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca 60
gaagaccaaa gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga 120
ttccattgcc cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc 180
tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt 240
ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc 300
acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat aacatggtgg agcacgacac acttgtctac 360
tccaaaaata tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg caattgagac ttttcaacaa 420
agggtaatat ccggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca ctttattgtg 480
aagatagtgg aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggcc 540
atcgttgaag atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc 600
atcgtggaaa aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc 660
tccactgacg taagggatga cgcacaatcc cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata 720
taaggaagtt catttcattt ggagaggtat taaaatctta ataggttttg ataaaagcga 780
acgtggggaa acccgaacca aaccttcttc taaactctct ctcatctctc ttaaagcaaa 840
cttctctctt gtctttcttg cgtgagcgat cttcaacgtt gtcagatcgt gcttcggcac 900
cagtacaatg gcgaaaaacg ttgcgatttt cggcttattg ttttctcttc ttgtgttggt 960
tccttctcag atcttcgcgc aaaaacttcc tggaaatgac aatagcacgg caacgctgtg 1020
ccttgggcac catgcagtac caaacggaac gatagtgaaa acaatcacga atgaccgaat 1080
tgaagttact aatgctactg agctggttca gaattcctca ataggtgaaa tatgcgacag 1140
tcctcatcag atccttgatg gagaaaactg cacactaata gatgctctat tgggagaccc 1200
tcagtgtgat ggctttcaaa ataagaaatg ggaccttttt gttgaacgaa gcaaagccta 1260
cagcaactgt tacccttatg atgtgccgga ttatgcctcc cttaggtcac tagttgcctc 1320
atccggcaca ctggagttta acaatgaaag cttcaattgg gctggagtca ctcaaaacgg 1380
aacaagttct tcttgcataa ggggatctaa tagtagtttc tttagtagat taaattggtt 1440
gacccactta aactccaaat acccagcatt aaacgtgact atgccaaaca atgaacaatt 1500
tgacaaattg tacatttggg gggttcacca cccgggtacg gacaaggacc aaatcttcct 1560
gtatgcacaa tcatcaggaa gaatcacagt atctaccaaa agaagccaac aagctgtaat 1620
cccgaatatc ggatctagac ccagaataag ggatatccct agcagaataa gcatctattg 1680
gacaatagta aaaccgggag acatactttt gattaacagc acagggaatc taattgctcc 1740
taggggttac ttcaaaatac gaagtgggaa aagctcaata atgagatcag atgcacccat 1800
tggcaaatgc aagtctgaat gcatcactcc aaatggaagc attcccaatg acaaaccatt 1860
ccaaaatgta aacaggatca catacggggc ctgtcccaga tatgttaagc aaagcactct 1920
gaaattggca acaggaatgc gaaatgtacc agagagacaa actagaggca tatttggcgc 1980
aatagcgggt ttcatagaaa atggttggga gggaatggtg gatggttggt acggcttcag 2040
gcatcaaaat tctgagggaa gaggacaagc agcagatctc aaaagcactc aagcagcaat 2100
cgatcaaatc aatgggaagc tgaatcgatt gatcgggaaa accaacgaga aattccatca 2160
gattgaaaaa gaattctcag aagtagaagg gagaattcag gaccttgaga aatatgttga 2220
ggacacaaaa atagatctct ggtcatacaa cgcggagctt cttgttgccc tggagaacca 2280
acatacaatt gatctaactg actcagaaat gaacaaactg tttgaaaaaa caaagaagca 2340
actgagggaa aatgctgagg atatgggcaa tggttgtttc aaaatatacc acaaatgtga 2400
caatgcctgc ataggatcaa tcagaaatgg aacttatgac cacgatgtat acagggatga 2460
agcattaaac aaccggttcc agatcaaggg agttgagctg aagtcagggt acaaagattg 2520
gatcctatgg atttcctttg ccatatcatc ccttgtactg ttagttgctt tgttggggtt 2580
catcatgtgg gcctgccaaa agggcaacat taggtgcaac atttgcattt gaaggcctat 2640
tttctttagt ttgaatttac tgttattcgg tgtgcatttc tatgtttggt gagcggtttt 2700
ctgtgctcag agtgtgttta ttttatgtaa tttaatttct ttgtgagctc ctgtttagca 2760
ggtcgtccct tcagcaagga cacaaaaaga ttttaatttt attaaaaaaa aaaaaaaaaa 2820
agaccgggaa ttcgatatca agcttatcga cctgcagatc gttcaaacat ttggcaataa 2880
agtttcttaa gattgaatcc tgttgccggt cttgcgatga ttatcatata atttctgttg 2940
aattacgtta agcatgtaat aattaacatg taatgcatga cgttatttat gagatgggtt 3000
tttatgatta gagtcccgca attatacatt taatacgcga tagaaaacaa aatatagcgc 3060
gcaaactagg ataaattatc gcgcgcggtg tcatctatgt tactagat 3108
<---
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| МУТАНТЫ ГЕМАГГЛЮТИНИНА ВИРУСА ГРИППА | 2019 |
|
RU2809237C2 |
| ВИРУС ГРИППА, СПОСОБНЫЙ ИНФИЦИРОВАТЬ СОБАЧЬИХ, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ | 2020 |
|
RU2802222C2 |
| АНТИТЕЛА, ПОДХОДЯЩИЕ ДЛЯ ПАССИВНОЙ ИММУНИЗАЦИИ ПРОТИВ ГРИППА, И ИХ КОМПОЗИЦИИ, КОМБИНАЦИИ И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ | 2015 |
|
RU2720282C1 |
| КОМПОЗИЦИИ ГЕМАГГЛЮТИНИНА ГРИППА С ГЕТЕРОЛОГИЧНЫМИ ЭПИТОПАМИ И/ИЛИ ИЗМЕНЕННЫМИ САЙТАМИ РАСЩЕПЛЕНИЯ ПРИ СОЗРЕВАНИИ | 2017 |
|
RU2769406C2 |
| ВИРУСОПОДОБНЫЕ ЧАСТИЦЫ С ВЫСОКОПЛОТНЫМ ПОКРЫТИЕМ ДЛЯ ИНДУКЦИИ ЭКСПРЕССИИ АНТИТЕЛ | 2017 |
|
RU2813282C2 |
| МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РЕСПИРАТОРНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ У СОБАК | 2020 |
|
RU2811752C2 |
| МУТАНТНЫЙ БЕЛОК F RSV И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ | 2020 |
|
RU2807742C1 |
| РЕКОМБИНАНТНЫЕ ВЕКТОРЫ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИЕ АНТИГЕНЫ ВИРУСА ПТИЧЬЕГО ГРИППА, И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2017 |
|
RU2761869C2 |
| ВАКЦИННЫЕ КОМПОЗИЦИИ, ХАРАКТЕРИЗУЮЩИЕСЯ УЛУЧШЕННОЙ СТАБИЛЬНОСТЬЮ И ИММУНОГЕННОСТЬЮ | 2016 |
|
RU2730625C2 |
| САМОСОБИРАЮЩИЕСЯ НАНОСТРУКТУРНЫЕ ВАКЦИНЫ | 2019 |
|
RU2811439C2 |
Изобретение относится к биотехнологии. Описан модифицированный белок гемагглютинин (НА) гриппа H3 для получения вирусоподобной частицы (VLP), причем белок НА содержит аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей мере одну замену по сравнению с соответствующей аминокислотной последовательностью дикого типа, причем указанная по меньшей мере одна замена представляет собой замену одной или более чем одной аминокислот, соответствующих аминокислотам в положении 382, 384, 392 или 431 эталонной последовательности SEQ ID NO: 92. Также описана нуклеиновая кислота для получения модифицированного белка НА гриппа H3, причем нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую модифицированный белок НА гриппа H3. Кроме того, представлена вирусоподобная частица (VLP) для индукции иммунного ответа к инфекции гриппа у субъекта, причем VLP содержит модифицированный белок гемагглютинин (HA) гриппа H3 и способ получения такой VLP в растении, части растения или растительной клетке. Представлено такое растение или часть растения, или растительная клетка. Описано применение VLP для индукции иммунитета к инфекции гриппа у субъекта, в том числе в виде композиции. Также представлен способ увеличения выхода продукции вирусоподобных частиц гриппа (VLP) в растении, части растения или растительной клетке. Изобретение расширяет арсенал средств для предупреждения гриппа. 12 н. и 5 з.п. ф-лы, 9 ил., 7 табл., 4 пр.
1. Модифицированный белок гемагглютинин (НА) гриппа H3 для получения вирусоподобной частицы (VLP), причем белок НА содержит аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей мере одну замену по сравнению с соответствующей аминокислотной последовательностью дикого типа, причем указанная по меньшей мере одна замена представляет собой замену одной или более чем одной аминокислот, соответствующих аминокислотам в положении 382, 384, 392 или 431 эталонной последовательности SEQ ID NO: 92.
2. Модифицированный белок НА гриппа H3 по п. 1, причем:
по меньшей мере одна замена аминокислоты, соответствующей аминокислоте в положении 382 эталонной последовательности SEQ ID NO: 92 представляет собой замену на не аспарагин;
по меньшей мере одна замена аминокислоты, соответствующей аминокислоте в положении 382 эталонной последовательности SEQ ID NO: 92 представляет собой замену на аланин или консервативную замену аланина;
по меньшей мере одна замена аминокислоты, соответствующей аминокислоте в положении 384 эталонной последовательности SEQ ID NO: 92 представляет собой замену на не лейцин;
по меньшей мере одна замена аминокислоты, соответствующей аминокислоте в положении 384 эталонной последовательности SEQ ID NO: 92 представляет собой замену на валин или консервативную замену валина;
по меньшей мере одна замена аминокислоты, соответствующей аминокислоте в положении 392 эталонной последовательности SEQ ID NO: 92 представляет собой замену на не фенилаланин;
по меньшей мере одна замена аминокислоты, соответствующей аминокислоте в положении 392 эталонной последовательности SEQ ID NO: 92 представляет собой замену на аспарагиновую кислоту или консервативную замену аспарагиновой кислоты;
по меньшей мере одна замена аминокислоты, соответствующей аминокислоте в положении 431 эталонной последовательности SEQ ID NO: 92 представляет собой замену на не лейцин и/или
по меньшей мере одна замена аминокислоты, соответствующей аминокислоте в положении 431 эталонной последовательности SEQ ID NO: 92 представляет собой замену на метионин или консервативную замену метионина.
3. Модифицированный белок НА гриппа H3 по п. 2, причем:
консервативная замена аланина представляет собой серин, глицин, треонин, цистеин или валин;
консервативная замена валина представляет собой изолейцин, метионин, аланин или треонин;
консервативная замена аспарагиновой кислоты представляет собой глутаминовую кислоту, глутамин или серин; и
консервативная замена метионина представляет собой изолейцин, глутамин, валин или фенилаланин.
4. Нуклеиновая кислота для получения модифицированного белка НА гриппа H3, причем нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую модифицированный белок НА гриппа H3 по любому из пп. 1-3.
5. Вирусоподобная частица (VLP) для индукции иммунного ответа к инфекции гриппа у субъекта, причем VLP содержит модифицированный белок гемагглютинин (HA) гриппа H3 по любому из пп. 1-3.
6. Способ получения вирусоподобной частицы гриппа (VLP) в растении, части растения или растительной клетке, предусматривающий:
а) i) введение нуклеиновой кислоты по п. 4 в растение, часть растения или растительную клетку и, необязательно, дополнительное введение второй нуклеиновой кислоты, кодирующей белок протонного канала, такой как белок М2 подтипа А гриппа; или
ii) предоставление растения, части растения или растительной клетки, содержащей нуклеиновую кислоту по п. 4, необязательно, причем растение, часть растения или растительная клетка дополнительно содержит вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую белок протонного канала, такой как белок М2 подтипа А гриппа; и
b) инкубацию растения, части растения или растительной клетки в условиях, которые допускают экспрессию белка НА гриппа, кодируемого нуклеиновой кислотой, тем самым производя VLP, и, необязательно, дополнительную инкубацию растения, части растения или растительной клетки в условиях, которые допускают экспрессию белка протонного канала, кодируемого второй нуклеиновой кислотой, и
c) необязательно, сбор растения, части растения или растительной клетки и очистку VLP.
7. VLP, полученная способом по п. 6 для индукции иммунного ответа к инфекции гриппа у субъекта, причем VLP содержит модифицированный белок HA гриппа H3 по любому из пп. 1-3.
8. VLP по п. 7, дополнительно содержащая один или более чем один липид, полученный из растения, части растения или растительной клетки, специфические для растений N-гликаны, модифицированные N-гликаны или их комбинацию.
9. Растение или часть растения для получения вирусоподобной частицы (VLP), причем растение или часть растения содержит нуклеиновую кислоту по п. 4.
10. Растительная клетка для получения вирусоподобной частицы (VLP), причем растительная клетка содержит нуклеиновую кислоту по п. 4.
11. Растение или часть растения для получения вирусоподобной частицы (VLP), причем растение или часть растения содержит модифицированный белок НА гриппа H3 по любому из пп. 1-3 или VLP по любому из пп. 5, 7 или 8.
12. Растительная клетка для получения вирусоподобной частицы (VLP), причем растительная клетка содержит модифицированный белок НА гриппа H3 по любому из пп. 1-3 или VLP по любому из пп. 5, 7 или 8.
13. Композиция для индукции иммунного ответа к инфекции гриппа у субъекта, причем композиция содержит эффективную дозу VLP по любому из пп. 5, 7 или 8 и фармацевтически приемлемый носитель, адъювант, наполнитель или вспомогательное вещество.
14. Применение VLP по любому из пп. 5, 7 или 8 для индукции иммунитета к инфекции гриппа у субъекта.
15. Применение по п.14 при котором VLP применяют субъекту перорально, интраназально, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно или подкожно.
16. Способ увеличения выхода продукции вирусоподобных частиц гриппа (VLP) в растении, части растения или растительной клетке, предусматривающий:
а) i) введение нуклеиновой кислоты по п. 4 в растение, часть растения или растительную клетку или
ii) предоставление растения, части растения или растительной клетки, содержащих нуклеиновую кислоту, по п. 4; а также
b) инкубацию растения, части растения или растительной клетки в условиях, которые допускают экспрессию белка НА, кодируемого нуклеиновой кислотой, тем самым производя VLP с более высоким выходом по сравнению с растением, частью растения или растительной клеткой, экспрессирующей немодифицированный белок НА гриппа; и
с) необязательно сбор растения, части растения или растительной клетки и очистку VLP.
17. Белок гемагглютинин (НА) гриппа H3 для получения вирусоподобной частицы (VLP), причем НА содержит:
аминокислотную замену, соответствующую положению 382 эталонной последовательности SEQ ID NO: 92, причем аминокислотная замена представляет собой замену на аланин или консервативную замену аланина;
аминокислотную замену, соответствующую положению 384 эталонной последовательности SEQ ID NO: 92, причем аминокислотная замена представляет собой замену на валин или консервативную замену валина;
аминокислотную замену, соответствующую положению 392 эталонной последовательности SEQ ID NO: 92, причем аминокислотная замена представляет собой замену на аспарагиновую кислоту или консервативную замену аспарагиновой кислоты; и/или
аминокислотную замену, соответствующую положению 431 эталонной последовательности SEQ ID NO: 92, причем аминокислотная замена представляет собой замену на метионин или консервативную замену метионина.
| WO 2009009876 A1, 22.01.2009 | |||
| ХИМЕРНЫЕ ВИРУСОПОДОБНЫЕ ЧАСТИЦЫ, СОДЕРЖАЩИЕ ГЕМАГГЛЮТИНИН, СХОДНЫЕ С ЧАСТИЦАМИ ВИРУСА ГРИППА | 2010 |
|
RU2569195C9 |
| Щербинин Д.Н., Алексеева С.В., Анализ В-клеточных эпитопов гемагглютинина вирусов гриппа, ACTA NATURAE,ТОМ 8, N 1, (28) 2016, стр.14 | |||
| Aleksandar Antanasijevic, Arnab Basu et al., Mutagenesis Studies of the H5 Influenza Hemagglutinin Stem Loop Region, J Biol Chem | |||
| Способ защиты переносных электрических установок от опасностей, связанных с заземлением одной из фаз | 1924 |
|
SU2014A1 |
