ТЕРМОСТАБИЛЬНЫЕ ПРЕПАРАТЫ ВАКЦИН И МИКРОИГЛЫ Российский патент 2020 года по МПК A61K39/12 A61K39/165 A61P31/16 A61P31/12 

Перекрестная ссылка на связанную заявку

[0001] Данная заявка заявляет приоритет Предварительной Патентной Заявки США №61/873419, поданной 4 сентября 2013 года, и Предварительной Патентной Заявки США №61/873032, поданной 3 сентябрей 2013 года, раскрытие которых включено в данное описание посредством ссылки.

Заявление относительно исследования или разработки, финансируемых из Федерального бюджета

[0002] Данное изобретение осуществлено при правительственной поддержке США, в рамках контракта № U01EB012495 с Национальными Институтами Здоровья.

Уровень техники

[0003] Настоящая заявка относится к препаратам и способам стабилизации вирусов, используемых в вакцинах, особенно вакцинах против гриппа и кори. Заявка дополнительно относится к сухим твердым препаратам вакцин против гриппа и кори, пригодным для применения в растворимых микроиглах или микроиглах с покрытием.

[0004] Статистика Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) указывает на то, что миллионы людей ежегодно страдают от инфекционных болезней. Например, согласно оценкам, грипп вызывает тяжелое заболевание у 3-5 миллионов человек ежегодно и приводит к порядка 250000-500000 смертельных случаев. Корью, согласно оценкам, заражаются более 20 миллионов человек ежегодно, что приводит к более чем 150000 смертельных случаев (в основном, среди детей в возрасте до пяти лет). Основным путем предупреждения таких инфекций являются успешные кампании по вакцинации.

[0005] Например, по оценкам ВОЗ, прекращение передачи кори требует охвата вакцинацией более 90%. Такой высокий показатель требует высокоактивной вакцины и скоординированных усилий производителей вакцин, экспертов здравоохранения и медицинского персонала, который вводит вакцины на месте. Таким образом, существуют многочисленные препятствия, которые усложняют широкое распространение таких вакцин.

[0006] Несмотря на то, что еще с начала 1960-х существует живая вакцина против кори, которая чрезвычайно эффективна при правильном введении, требования к условиям хранения могут препятствовать ее широкому распространению, поскольку она рассматривается как одна из наиболее нестабильных живых вакцин, одобренных для применения у человека. По оценкам ВОЗ, более 60% запаса вакцины против кори, доставленной на места, не могут быть применены из-за порчи, неправильного обращения или неправильного разведения.

[0007] Подобные препятствия существуют в случае вакцин против гриппа, которые в настоящий момент доступны только в виде жидких препаратов, требующих хранения при температуре 2-8°С. Таким образом, существует потребность в сухих твердых препаратах вакцин, которые позволяют получение вакцин с улучшенной стабильностью, легче транспортируются и более пригодны для массовой вакцинации. Тем не менее, несмотря на существующую потребность, разработка сухих препаратов вакцин включает многочисленные переменные, которые необходимо рассматривать. См. например, Chen et al., «Opportunities and challenges of developing thermostable vaccines», Expert Rev. Vaccines 8 (5), 547-557 (2009).

[0008] Некоторые из ключевых соображений при получении сухих препаратов вакцин включают контакт вируса с различными видами теплового и механического стресса, а также выбор вспомогательных веществ таким образом, чтобы минимизировать такие повреждения. Кроме того, компоненты препарата должны быть совместимы с выбранным способом обработки.

[0009] Сушка вымораживанием и распылительная сушка являются двумя из наиболее широко применяемых способов сушки растворов активных фармацевтических ингредиентов (АФИ) в фармацевтической промышленности. Сушку вымораживанием применяют для получения некоторых коммерческих продуктов АФИ, в том числе вакцины против кори. Некоторые из сложностей применения способа сушки вымораживанием к нестабильной биомолекуле включают контакт вируса с низкой температурой, адсорбцию вирусных частиц на поверхности ледяного кристалла и дегидратационный стресс.

[0010] Распылительная сушка обеспечивает преимущества высокой производительности объема продукта (>5000 фунт/час) и сокращения длительности производства, по сравнению с другими технологиями консервации/сушки белка, такими как сушка вымораживанием. Сложность применения способа распылительной сушки состоит в стабилизации термически лабильных АФИ, таких как вирусы, что включает контроль трех ключевых областей: условия распыления, условия сушки и получаемые в результате свойства сухого материала как твердого вещества. Например, в ходе распыления, способ расщепления потока жидкости на мелкие капельки может включать чрезмерный стресс сдвига, поверхностное натяжение и давление, применяемое к продукту, что ведет к потере биологической активности. Другая сложность включает контроль скорости высыхания капелек и ее воздействия на компоненты в пределах каждой капельки. В зависимости от параметров процесса, например, скорости сушки и размера капельки, а также компонентов препарата, например, поверхностной активности и размера молекул (т.е., скорости диффузии), существует возможность манипуляции свойствами получающихся в результате сухих частиц, что включает размер частицы, состав поверхности и морфологию поверхности. Такой контроль важен, поскольку на стабильность биофармацевтического средства в процессе хранения, в общем, влияют степень обогащения его поверхности, а также пористость и площадь поверхности высушенных распылением частиц. Таким образом, с наиболее широко применяемыми способами получения препаратов вакцин связаны многочисленные недостатки, включая множество недостатков, связанных с чаще всего применяемыми способами дегидратации.

[0011] Таким образом, было бы желательно предложить улучшенные препараты вакцин против гриппа и улучшенные препараты вакцин против кори, более стабильные и более подходящие для массовой вакцинации, путем обеспечения простых, удобных, легких в применении лекарственных форм. Кроме того, было бы желательно предложить улучшенные способы получения сухих стабильных препаратов вакцин.

Краткое описание сущности изобретения

[0012] Настоящая заявка направлена на одно или более из вышеизложенных желаний и потребностей, предлагая сухие твердые препараты вакцин против гриппа и кори, обладающих улучшенной стабильностью. Дополнительно предложены способы их получения, наряду с устройствами и способами для их введения пациентам.

[0013] В одном аспекте предложена композиция вакцины, которая содержит антиген гриппа и вспомогательное вещество, выбранное из группы, состоящей из мальтодекстрина 17, мальтодекстрина 4, аргинина, мальтозы, гистидина, гептаглюконата кальция, мальтодекстрина 13, гепарина, рафинозы, мио-инозитола, сахарозы, сорбита, арабита, фруктозы, глюконата калия, адонита, ксилита, тиосульфата натрия, аспарагина, 2-гидроксипропил-β-циклодекстрина, ТРИС, цитрата натрия, дульцита и их комбинации.

[0014] В другом аспекте предложена композиция вакцины, которая содержит антиген гриппа и смесь вспомогательных веществ, выбранных из группы, состоящей из трегалозы и аргинина; трегалозы и гептаглюконата кальция; трегалозы и мальтодекстрина 13; сахарозы и аргинина; аргинина и гептаглюконата кальция; аргинина и мальтодекстрина 13; гептаглюконата кальция и мальтодекстрина 13; мальтодекстрина 13 и цитрата натрия; мальтодекстрина 13 и лактозы; и сорбита, и цитрата натрия.

[0015] Еще в одном аспекте, предложена композиция вакцины, которая содержит антиген кори и вспомогательное вещество, выбранное из группы, состоящей из серина, сахарозы, аспарагина, глицина, треонина, гистидина, трегалозы, пролина, сорбита, мальтозы, таурина, дульцита и их комбинаций.

[0016] В другом аспекте композиция вакцины содержит антиген кори и смесь вспомогательных веществ, включающую аминокислоту и углевод. Аминокислота может быть выбрана из группы, состоящей из серина, аспарагина, глицина, треонина, гистидина, пролина, таурина и их комбинаций. Углевод может быть выбран из группы, состоящей из сахарозы, трегалозы, сорбита, мальтозы, дульцита и их комбинаций.

[0017] Еще в одном аспекте предложен трансдермальный пластырь, содержащий массив микроигл, которые содержат одну из предложенных композиций вакцины.

[0018] В другом аспекте предложены способы получения композиций вакцины, включающие получение водного раствора, который содержит антиген гриппа, или антиген кори и одно или более конкретных вспомогательных веществ или смесь вспомогательных веществ, и сушку раствора при температуре окружающей среды, с получением сухой твердой композиции вакцины.

[0019] В дополнительном аспекте предложены способы вакцинации пациента. В одном варианте реализации изобретения способ включает введение одной или более микроигл сквозь роговой слой кожи пациента, причем указанные одна или более микроигл содержат одну из предложенных композиций вакцины. В другом варианте реализации изобретения способ включает разведение одной из предложенных композиций вакцины в физиологически приемлемом жидком носителе с получением инъекционного раствора или суспензии и введение инъекционного раствора или суспензии пациенту.

[0020] Дополнительные аспекты будут частично сформулированы в следующем описании, а частично будут очевидными из описания, или их Идеи могут возникнуть в результате практики описанных ниже аспектов. Преимущества, описанные ниже, будут реализованы и достигнуты с помощью элементов и комбинаций, конкретно указанных в приложенной формуле изобретения. Необходимо понимать, что как вышеизложенное общее описание, так и последующее детальное описание являются только иллюстративными и поясняющими, но не ограничивающими.

Краткое описание графических материалов

[0021] Фиг. 1 представляет собой вид сбоку множества микроигл, содержащих композицию вакцины согласно варианту реализации изобретения.

[0022] Фиг. 2 представляет собой гистограмму, иллюстрирующую относительную активность гемагглютинина (ГА), остающуюся после сушки различных препаратов вакцины.

[0023] Фиг. 3 представляет собой гистограмму, иллюстрирующую относительную активность ГА, остающуюся после сушки различных смесей вспомогательных веществ, по сравнению с индивидуальными вспомогательными веществами.

[0024] Фиг. 4 представляет собой линейный график, иллюстрирующий относительную активность ГА, остающуюся после сушки различных препаратов вакцины после хранения на протяжении различных периодов.

[0025] Фиг. 5 представляет собой гистограмму, иллюстрирующую активность ГА после сушки различных трехвалентных субъединичных препаратов вакцины против гриппа в пластырях с микроиглами и после хранения на протяжении различных периодов.

[0026] Фиг. 6 представляет собой гистограмму, иллюстрирующую активность ГА после сушки различных одновалентных субъединичных препаратов вакцины против гриппа в пластырях с микроиглами и после хранения на протяжении различных периодов.

[0027] Фиг. 7 представляет собой гистограмму, иллюстрирующую относительную активность ГА, остающуюся после сушки одновалентных субъединичных препаратов вакцины в пластырях с микроиглами и после ускоренного хранения на протяжении различных периодов.

[0028] Фиг. 8 представляет собой гистограмму, иллюстрирующую относительную активность eGFP-MeV, остающуюся после сушки различных препаратов вакцины против кори с различными вспомогательными веществами и хранения на протяжении одной недели при 37°С.

[0029] Фиг. 9 представляет собой гистограмму, иллюстрирующую относительную активность eGFP-MeV, остающуюся после сушки различных препаратов вакцины против кори с различными вспомогательными веществами и хранения на протяжении одного месяца при 37°С.

[0030] Фиг. 10 представляет собой гистограмму, иллюстрирующую относительную активность eGFP-MeV, остающуюся после сушки различных препаратов вакцины со смесями вспомогательных веществ и хранения на протяжении одного месяца при 37°С.

[0031] Фиг. 11 представляет собой гистограмму, иллюстрирующую относительную активность eGFP-MeV, остающуюся после сушки различных препаратов вакцины со смесями вспомогательных веществ и хранения на протяжении одного месяца при 45°С.

[0032] Фиг. 12 представляет собой линейный график, иллюстрирующий относительную активность eGFP-MeV, остающуюся после сушки препарата вакцины, содержащего смесь треонина и сахарозы, и хранения на протяжении различных периодов и при различных температурах.

[0033] Фиг. 13А-13С иллюстрируют стабильность типичного препарата вакцины против кори в пластырях с микроиглами, хранящихся в пакетах с десиккантом (Фиг. 13С), по сравнению с разведенной коммерческой вакциной против кори (Фиг. 13А) и коммерческой лиофилизированной вакциной против кори (Фиг. 13В).

Подробное описание сущности изобретения

[0034] Разработаны сухие твердые формы композиций вакцины против гриппа или кори, обладающие улучшенной стабильностью. Способы скрининга применялись для идентификации вспомогательных веществ или смесей вспомогательных веществ, неожиданно обеспечивающих улучшенную термостабильность антигенам гриппа или кори, из числа многочисленных вспомогательных веществ, известных из уровня техники для применения в фармацевтических препаратах. Обнаружено, что путем обеспечения сухих твердых форм композиций вакцины, содержащих антиген, объединенный с определенными вспомогательными веществами, можно избежать многих проблем, обычно связанных со снижением активности и порчей вакцин, таким образом, уменьшая потери вакцины и увеличивая количество доступного продукта в кампаниях вакцинации или других сценариях вакцинации.

[0035] Если иное не определено в настоящем описании или в остальной части описания ниже, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют значение, обычно придаваемое им обычным специалистом в области, к которой принадлежит настоящее изобретение. Кроме того, необходимо понимать, что терминология, используемая в настоящем описании, применяется только с целью описания конкретных вариантов, но не ограничения. В описании и формуле настоящего изобретения будет использоваться следующая терминология, в соответствии с определениями, установленными ниже.

[0036] Термин «около» в настоящем описании указывает на значение заданного количества и может включать величины, варьирующие в пределах 10% от заявленного количества или необязательно в пределах 5% значения или, в некоторых вариантах реализации изобретения, в пределах 1% значения.

[0037] В настоящем описании термин «температура окружающей среды» обозначает типичные значения температуры в помещении, например, от около 16°С до около 27°С, или чаще от около 18°С до около 24°С, и часто около 22°С.

[0038] «Стабильным» препаратом или композицией является такой, в котором биологически активный материал при хранении в существенной мере сохраняет свою физическую стабильность и/или химическую стабильность и/или биологическую активность. Стабильность может быть измерена при выбранной температуре на протяжении выбранного периода. Анализ тенденций может применяться для оценки ожидаемого срока хранения до того, как материал фактически будет храниться на протяжении указанного периода времени.

[0039] В настоящем описании термин «сухой» или «сушка» со ссылкой на твердые препараты вакцин, описанные в настоящем описании, обозначает композицию, из которой удалена значительная часть воды, чтобы получить твердую композицию. Применение термина не требует полного отсутствия влажности. Композиции вакцины, описанные в настоящем описании, в общем содержат влагу в количестве от около 0,1% масс. до около 25% масс.

[0040] Варианты реализации изобретения в настоящей заявке включают композиции вакцины, содержащие один или более антигенов и одно или более выбранных вспомогательных веществ в сухом твердом препарате. Обнаружено, что одно или более выбранных вспомогательных веществ благоприятным образом улучшают стабильность одного или более антигенов в ходе сушки и хранения композиций вакцины.

[0041] В предпочтительном варианте реализации изобретения композиция вакцины находится в форме микроиглы или покрытия на микроигле, выполненной из другого материала. Композиция вакцины солюбилизируется in vivo после введения микроиглы в биологическую ткань, например, в кожу пациента. Здесь и далее, препарат в форме микроиглы или препарат в форме покрытия обозначаются как «растворимые». В альтернативном варианте реализации изобретения сухая твердая форма препарата вакцины может приобретать форму частиц или другую форму, подходящую для разведения перед введением пациенту. Например, композиция вакцины может быть разведена в физиологически приемлемой жидкости для получения раствора или суспензии, подходящих для инъекции через полую иглу или полую микроиглу.

[0042] Типичный массив микроигл со множеством растворимых микроигл проиллюстрирован на Фиг. 1. Массив микроигл 10 содержит базовый субстрат 12 со множеством микроигл 14. В вариантах реализации изобретения множество микроигл 14 имеют высоту от около 100 мкм до около 2000 мкм, от около 100 мкм до около 1500 мкм, от около 100 мкм до около 1000 мкм или от около 500 мкм до около 1000 мкм. Массив микроигл может иметь любую подходящую плотность. Например, микроиглы в массиве могут быть организованы в виде равномерных или зигзагообразных рядов, в которых каждая микроигла отделена от ближайшей граничащей с ней микроиглы расстоянием, приблизительно равным высоте микроиглы. Массив может содержать по существу любое подходящее количество микроигл. В одном варианте реализации изобретения общая масса композиции вакцины в массиве микроигл является подходящей для доставки профилактически эффективного количества антигена пациенту. В неограничивающих примерах массив может содержать от 5 до 10000 микроигл, например, от 50 до 1000 микроигл или от 50 до 200 микроигл.

[0043] В некоторых вариантах реализации изобретения растворимые микроиглы могут быть сформированы сушкой композиции вакцины в подходящем шаблоне, с применением описанных ниже способов. В других вариантах реализации изобретения композиция вакцины может быть нанесена в виде покрытия на одну или более микроигл, содержащих биосовместимый материал, такой как металл, полимер или кремний. Неограничивающие примеры таких микроигл и способов их производства раскрыты в патенте США №6334856 и Публикации патента США №2008/0213461.

[0044] Композиции вакцины могут содержать биологически эффективное количество одного или более антигенов. В настоящем описании «биологически эффективное количество» обозначает количество одного или более антигенов, необходимое для стимуляции или инициации желательного иммунологического ответа. Таким образом, количество одного или более антигенов, необходимое для достижения желательной иммунологической реакции, обязательно будет варьировать в зависимости от различных факторов, включая вид антигена, участка введения (например, подкожного или внутримышечного) и кинетики растворения и высвобождения для доставки антигена. Например, в вариантах реализации изобретения желательно, чтобы композиция вакцины была составлена для растворения in vivo на протяжении периода растворения от около 1 минуты до около 60 минут. В настоящем описании «период растворения» или «время растворения» обозначает, в случае растворимых микроигл, время, которое необходимо для достаточного увлажнения микроиглы в ходе введения, таким образом, что микроигла в существенной мере отсоединяется от базового субстрата, или, в случае покрытия на микроигле, время, необходимое для того, чтобы покрытие на микроигле в существенной мере отсоединилось от микроиглы в ходе введения.

Препараты вакцины против гриппа

[0045] В вариантах реализации изобретения антиген представляет собой антиген гриппа. Антиген может быть получен из вирионов гриппа или экспрессирован в рекомбинантном хозяине и применен в очищенной форме. Антиген может принимать форму живого вируса или инактивированного вируса и может представлять собой цельный вирус, расщепленный вирус, субъединицу вируса или вирусоподобную частицу. Например, антиген гриппа может быть цельным инактивированным вирусом гриппа, расщепленным инактивированным вирусом гриппа, субъединицей инактивированного вируса гриппа, подобной вирусу гриппа частицей или их комбинацией.

[0046] Антиген гриппа может включать один или более штаммов вируса гриппа, которые распределены по таким категориям, как грипп А, грипп В или грипп С. Композиции могут содержать один антиген (одновалентная), два антигена (2-валентная), три антигена (трехвалентная/3-валентная) или четыре или более антигенов (4-валентная или n-валентная). Например, в вариантах реализации изобретения антиген гриппа может быть комбинацией двух штаммов гриппа А и одного штамма гриппа В или комбинацией двух штаммов гриппа А и двух штаммов гриппа В. Неограничивающие примеры штаммов гриппа А включают подтипы гемагглютинина (ГА) Н1, Н2, Н3, Н4, Н5, Н6, Н7, Н8, Н9, Н10, Н11, Н12, Н13, Н14, Н15, Н16, Н17 или Н18 и подтипы нейраминидазы (НА) N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 или N9. Конкретные штаммы антигена гриппа могут включать H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H5N3, H7N1, H7N7, H7N9 или H9N2.

[0047] Количество одного или более антигенов гриппа в препарате вакцины может быть скорректировано таким образом, чтобы получить желательный иммунологический ответ. В вариантах реализации изобретения биологически эффективное количество антигена гриппа может составлять от около 1 мкг до около 100 мкг ГА на штамм антигена гриппа. Например, биологически эффективное количество антигена гриппа в щадящей вакцине против гриппа может составлять от около 1 мкг до около 10 мкг ГА на штамм антигена гриппа; биологически эффективное количество антигена гриппа в обычной дозе сезонной вакцины против гриппа может составлять около 15 мкг ГА на штамм антигена гриппа; или биологически эффективное количество антигена гриппа в высокой дозе сезонной вакцины против гриппа может составлять около 60 мкг ГА на штамм антигена гриппа. Например, содержание ГА каждого штамма в трехвалентной вакцине обычно устанавливают в количестве 15 мкг на дозу для одного человека, т.е., 45 мкг общего ГА.

[0048] Композиции вакцины против гриппа дополнительно содержат одно или более выбранных вспомогательных веществ, способных повышать стабильность антигена гриппа в сухом твердом препарате, по сравнению с сухим твердым препаратом антигена гриппа без каких-либо вспомогательных веществ. В вариантах реализации изобретения вспомогательные вещества, которые повышают стабильность антигенов гриппа, включают мальтодекстрин 17, мальтодекстрин 4, аргинин, трегалозу, мальтозу, гистидин, гептаглюконат кальция, мальтодекстрин 13, гепарин, рафинозу, мио-инозитол, сахарозу, глюкозу, лактозу, сорбит, арабит, фруктозу, глюконат калия, циклодекстрин-γ, адонит, ксилит, тиосульфат натрия, аспарагин, 2-гидроксипропил-β-циклодекстрин, ТРИС, натрия цитрат и дульцит. Вспомогательное вещество может присутствовать в композиции вакцины в количестве от около 1% до около 90% масс., от около 2% до около 75% масс., от около 5% до около 50% масс. или от около 5% до около 20% масс.

[0049] В конкретных вариантах реализации изобретения композиции вакцины против гриппа дополнительно содержат выбранную смесь двух или более вспомогательных веществ, способных повышать стабильность антигена гриппа в сухом твердом препарате, по сравнению с сухим твердым препаратом антигена гриппа без каких-либо вспомогательных веществ. В конкретных вариантах реализации изобретения смесь двух или более вспомогательных веществ неожиданно оказывает более выраженное влияние, чем какое-либо из вспомогательных веществ по отдельности, и в некоторых случаях обеспечивает более, чем аддитивное влияние нескольких вспомогательных веществ на стабильность антигенов гриппа. В вариантах реализации изобретения смесь вспомогательных веществ, которые повышают стабильность антигенов гриппа, содержит трегалозу и аргинин; трегалозу и гептаглюконат кальция; трегалозу и сахарозу, трегалозу и мальтодекстрин 13; сахарозу и аргинин; аргинин и гептаглюконат кальция; аргинин и мальтодекстрин 13; гептаглюконат кальция и мальтодекстрин 13; мальтодекстрин 13 и цитрат натрия; мальтодекстрин 13 и лактозу; и сорбит и цитрат натрия.

[0050] Смесь вспомогательных веществ может присутствовать в композиции в общем количестве от около 1% до около 90% масс. Например, смесь вспомогательных веществ может присутствовать в композиции в общем количестве от около 2% до около 75%, от около 5% до около 50% или от около 5% до около 20%. Доля каждого вспомогательного вещества в смеси может варьировать. В некоторых вариантах реализации изобретения вспомогательные вещества в смеси двух вспомогательных веществ присутствуют в композиции вакцины в соотношении от около 1:15 до около 15:1. Например, вспомогательные вещества в смеси могут присутствовать в композиции в соотношении от около 1:9 до около 9:1, около 1:2 или около 1:1.

[0051] В вариантах реализации изобретения композиция вакцины дополнительно содержит один или более адъювантов, которые усиливают иммунный ответ пациента на антиген. Подходящие для усиления иммунного ответа адъюванты, включают, но не ограничиваясь этим, гели алюминия или соли алюминия. Например, адъювант может быть гидроксидом алюминия, фосфатом алюминия или сульфатом калия алюминия. Дополнительные адъюванты могут включать поли(I:С), имихимод и другие известные из уровня техники.

[0052] Композиции вакцины против гриппа, предложенные в настоящем описании, предпочтительно могут быть охарактеризованы как обладающие улучшенной стабильностью. В настоящем описании «улучшенная стабильность» композиции вакцины против гриппа может быть определена с применением одномерной радиальной иммунодиффузии (ОРИД) или твердофазного иммуноферментного анализа (ТИФА), чтобы измерить активность ГА в композиции при растворении в водном растворе после хранения на протяжении заданного времени и при заданной температуре. Например, ТИФА может быть типичным сэндвичевым ТИФА, в котором специфичным в отношении штамма антителом покрыт микролуночный планшет, и водный раствор вакцины инкубируют, чтобы позволить связывание антигена-мишени с иммобилизированным антителом. Далее второму специфичному в отношении штамма антителу, конъюгированному с пероксидазой хрена (ПХ), позволяют связаться с антигеном-мишенью. Добавление 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМБ) в микролунки осуществляет превращение ПХ с появлением голубого сигнала, который можно считать и сравнить с контролем.

[0053] Например, композиция вакцины может быть охарактеризована антигеном гриппа, обладающим улучшенной стабильностью в составе композиции на протяжении одного месяца, по сравнению с референтной композицией, содержащей антиген гриппа без вспомогательного вещества, на протяжении трех месяцев, по сравнению с такой же референтной композицией, на протяжении шести месяцев, по сравнению с такой же референтной композицией, на протяжении девяти месяцев, по сравнению с такой же референтной композицией, или на протяжении одного года, по сравнению с такой же референтной композицией.

[0054] В некоторых вариантах реализации изобретения на стабильность композиции указывает относительная активность антигена гриппа после хранения при комнатной температуре или при повышенных температурах до 40°С, по сравнению с начальной активностью антигена гриппа. Например, стабильность композиции может быть охарактеризована антигеном гриппа, сохраняющим по меньшей мере 50% своей активности через три месяца хранения при температурах до 40°С, по меньшей мере 60% своей активности через три месяца хранения при температурах до 40°С, по меньшей мере 70% своей активности через три месяца хранения при температурах до 40°С, по меньшей мере 75% своей активности через три месяца хранения при температурах до 40°С, по меньшей мере 80% своей активности через три месяца хранения при температурах до 40°С или по меньшей мере 90% своей активности через три месяца хранения при температурах до 40°С.

Препараты вакцины против кори

[0055] В другом аспекте антиген представляет собой антиген кори. Хотя антиген может находиться в форме живого вируса или инактивированного вируса, антиген кори обычно находится в форме живого аттенуированного вируса. В некоторых вариантах реализации изобретения антиген кори может быть объединен с антигеном свинки, антигеном краснухи, антигеном ветряной оспы или их комбинациями (каждый из которых чаще всего находится в форме живого аттенуированного вируса).

[0056] Количество антигена кори в композиции вакцины может быть скорректировано таким образом, чтобы получить желательный иммунологический ответ. Например, содержание кори в вакцинах обычно установлено на уровне от 1000 TCID₅₀ до около 10000 TCID₅₀ (где TCID₅₀ определена как медианная инфекционная доза для культуры ткани) в одной дозе для человека. Например, биологически эффективное количество вакцины против кори в композиции вакцины может составлять около 1000 TCID₅₀.

[0057] Композиции вакцины против кори дополнительно содержат одно или более выбранных вспомогательных веществ, способных повышать стабильность антигена кори в сухом твердом препарате, по сравнению с сухим твердым препаратом антигена кори без каких-либо вспомогательных веществ. В вариантах реализации изобретения вспомогательные вещества, которые повышают стабильность антигенов кори, включают серии, сахарозу, аспарагин, глицин, треонин, гистидин, трегалозу, пролин, сорбит, мальтозу, таурин, дульцит и их комбинации.

[0058] В конкретных вариантах реализации изобретения композиции вакцины против кори дополнительно содержат выбранную смесь вспомогательных веществ, содержащую одну или более аминокислот и углеводов. В некоторых вариантах реализации изобретения смесь содержит одну или более аминокислот, выбранных из группы, состоящей из серина, аспарагина, глицина, треонина, гистидина, пролина, таурина и их комбинаций, и один или более углеводов, выбранных из группы, состоящей из сахарозы, трегалозы, сорбита, мальтозы, дульцита и их комбинаций. В предпочтительных вариантах реализации изобретения аминокислота включает таурин или треонин, и углевод включает сахарозу, трегалозу или сорбит. Другие смеси вспомогательных веществ, которые эффективно стабилизируют антиген кори, включают треонин и сахарозу; треонин и трегалозу; треонин и сорбит; аспарагин и трегалозу; аспарагин и сорбит; серии и сахарозу; серии и сорбит; глицин и сахарозу; глицин и трегалозу; гистидин и сахарозу; таурин и сахарозу; и таурин и трегалозу.

[0059] Смесь вспомогательных веществ может присутствовать в композиции вакцины против кори в общем количестве от около 1% до около 90% масс. Например, смесь вспомогательных веществ может присутствовать в композиции в общем количестве от около 2 до около 75%, от около 5% до около 50% или от около 5% до около 20%. Доля каждого вспомогательного вещества в смеси может варьировать. В некоторых вариантах реализации изобретения вспомогательные вещества в смеси двух вспомогательных веществ присутствуют в композиции вакцины в соотношении от около 1:15 до около 15:1. Например, вспомогательные вещества смеси могут присутствовать в композиции в соотношении от около 1:9 до около 9:1, около 1:2 или около 1:1.

[0060] Композиции вакцины против кори, предложенные в настоящем описании, предпочтительно могут быть охарактеризованы как обладающие улучшенной стабильностью. В настоящем описании «улучшенная стабильность» композиции вакцины против кори может быть определена с применением анализа инфицирования культуры ткани (TCID₅₀) после хранения на протяжении заданного времени и при заданной температуре. В качестве альтернативы, улучшенная стабильность может быть определена с применением генетически сконструированного варианта кори, который при репликации продуцирует GFP, как описано в Примере 8.

[0061] Например, композиция вакцины может быть охарактеризована антигеном кори как обладающая улучшенной стабильностью на протяжении одного месяца в составе композиции, по сравнению с референтной композицией, содержащей антиген кори без вспомогательного вещества, на протяжении трех месяцев, по сравнению с такой же референтной композицией, на протяжении шести месяцев, по сравнению с такой же референтной композицией, на протяжении девяти месяцев, по сравнению с такой же референтной композицией, или на протяжении одного года, по сравнению с такой же референтной композицией.

[0062] В вариантах реализации изобретения стабильность композиции может быть продемонстрирована относительной активностью антигена кори после хранения при комнатной температуре или при повышенных температурах до 40°С, по сравнению с начальной активностью антигена кори. Например, стабильность композиции может быть охарактеризована антигеном кори, сохраняющим по меньшей мере 10% своей активности после одной недели хранения при температурах до 40°С, по меньшей мере 10% своей активности после одного месяца хранения при температурах до 40°С, по меньшей мере 25% своей активности после одного месяца хранения при температурах до 40°С, по меньшей мере 50% своей активности после одного месяца хранения при температурах до 40°С, по меньшей мере 80% своей активности после одного месяца хранения при температурах до 40°С, по меньшей мере 10% своей активности через три месяца хранения при температурах до 40°С, по меньшей мере 50% своей активности через три месяца хранения при температурах до 40°С, по меньшей мере 80% своей активности через три месяца хранения при температурах до 40°С, по меньшей мере 10% своей активности после шести месяцев хранения при температурах до 40°С, по меньшей мере 50% своей активности через три месяца хранения при температурах до 40°С или по меньшей мере 80% своей активности после шести месяцев хранения при температурах до 40°С.

Способы производства

[0063] Препараты вакцины против гриппа и кори, описанные в настоящем описании, в общем получают сушкой водного раствора, содержащего антиген и выбранное(ые) вспомогательное(ые) вещество(а) на подходящем субстрате. Водный раствор может быть получен смешиванием одного или более антигенов и одного или более вспомогательных веществ в растворе, содержащем водную буферную соль, неограничивающие примеры которой включают ГЭПЭС, ацетат аммония, фосфатно-солевой буфер и двухосновный калия фосфат.

[0064] Водный раствор можно сушить на множестве подходящих субстратов; однако, предпочтительно выбирать субстрат таким образом, чтобы минимизировать снижение активности антигена в ходе процесса сушки. Например, водный раствор может быть высушен на металлическом субстрате, полимерном субстрате, кремниевом субстрате или текстильном субстрате. В вариантах реализации изобретения водный раствор сушат полидиметилсилоксановом (ПДМС) субстрате. В варианте реализации изобретения субстрат представляет собой шаблон для формирования одной или более микроигл.

[0065] Водный раствор можно сушить при любых подходящих режимах температуры и давления, которые предпочтительно выбирают таким образом, чтобы сохранять биологическую активность антигена. В предпочтительном варианте реализации изобретения водный раствор сушат при температуре окружающей среды на протяжении времени, достаточного для образования сухой твердой формы из композиции вакцины. Например, водный раствор можно сушить при температуре окружающей среды в течение периода от около 30 минут до около одной недели, чтобы получить сухой твердый препарат вакцины (например, от около 45 минут до около одной недели, от около одного часа до около одной недели, от около одного часа до около одного дня и т.п.). В других вариантах реализации изобретения водный раствор можно сушить под вакуумом или сушить с применением комбинации сушки на воздухе и сушки под вакуумом. Хотя для сушки водного раствора могут применяться различные уровни температуры и влажности, препараты предпочтительно сушат при температуре от 1°С до 60°С (например, от 15°С до около 45°С, от около 25°С до около 45°С или около при температуре окружающей среды) и 0-10% относительной влажности.

[0066] В одном варианте реализации изобретения, в котором композиция вакцины находится в форме растворимой микроиглы, водный раствор наливают в шаблон для формирования микроиглы или массива микроигл для высыхания раствора. В настоящем описании «налитый» или «наливание» водного раствора включает любой подходящий способ заполнения шаблона водным раствором, неограничивающие примеры которого включают методы отложения, нанесения покрытия, впечатывания, распыления и микрозаполнения.

[0067] В вариантах реализации изобретения, в которых препарат находится в форме микроиглы с покрытием, массив микроигл или микроиглу покрывают водным раствором для высыхания раствора, например, с применением методов нанесения покрытия окунанием, описанных в Публикации патента США №2008/0213461.

[0068] После производства и до применения, композиции вакцины упаковывают и хранят в прохладном месте, например при температуре от около 2°С до около 8°С; в морозильной камере, например при температуре ниже 0°С; при температуре окружающей среды; или при неконтролируемой температуре, например, до 50°С. Хранение может продолжаться на протяжении срока годности или на протяжении периода менее срока годности продукта. Мониторы на флаконе с вакциной или другие индикаторы температуры могут применяться для идентификации превышения допустимого уровня нагрева для композиции вакцины. Предпочтительно, композиции вакцины, предложенные в настоящем описании, обладают большей термостабильностью, чем ранее существовавшие препараты, таким образом, минимизируя загрязнение, разложение и снижение активности, которые могут происходить при воздействии на композиции вакцины вариабельных температур. Таким образом, температура хранения композиций вакцины, предложенных в настоящем описании, менее критична, чем для ранее существовавших препаратов.

Способы введения

[0069] Препараты вакцины против гриппа и кори, предложенные в настоящем описании, можно вводить пациентам любыми подходящими средствами. В настоящем описании термин «пациент» обычно обозначает ребенка или взрослого человека, нуждающегося в вакцинации. Примеры подходящего средства для введения включают инъекцию и/или трансдермальную доставку через микроиглу. Например, пациенту может быть проведена вакцинация путем введения одной или более микроигл, которые образованы или покрыты композицией вакцины, сквозь роговой слой кожи пациента.

[0070] В другом примере композицию вакцины разводят в физиологически приемлемом жидком носителе, чтобы получить инъекционный раствор или суспензию, а затем инъекционный раствор или суспензию вводят пациенту инъекцией. Препарат вакцины можно разводить непосредственно в шприце для подкожного введения или в стерильном флаконе или другой емкости. Далее разведенную композицию вакцины можно ввести пациенту инъекционно, например, внутримышечной, внутрикожной или подкожной инъекцией.

[0071] Варианты реализации настоящего изобретения будут более понятны на основании следующих неограничивающих примеров.

Пример 1

[0072] Растворы вакцины против гриппа были получены с применением различных поверхностно-активных веществ для идентификации отрицательного воздействия на активность антигена гриппа. Поверхностно-активные вещества (Lutrol F68, Твин 20, НДС, ЦТАБ, ХАПС) были добавлены к растворам субъединичной вакцины против гриппа (B/Brisbane/60/2008, 60 мкг/мл ГА) без других вспомогательных веществ, после чего их сушили на поверхностях из нержавеющей стали при температуре окружающей среды на протяжении 40 минут. Далее вакцину снова растворяли в растворе натрия хлорида. Полученный раствор оценивали в твердофазном иммуноферментном анализе (ТИФА) для измерения активности ГА и сравнения с запасной вакциной, которую не подвергали сушке. По результатам количественной оценки влияния поверхностно-активного вещества на контрольный раствор, не было обнаружено существенного отличия между любыми из протестированных поверхностно-активных веществ с точки зрения воздействия на стабильность вакцины после сушки (данные не показаны).

Пример 2

[0073] Субъединичную вакцину против гриппа (B/Brisbane/60/2008, 60 мкг/мл ГА) смешивали с различными возможными вспомогательными веществами в концентрациях 15 масс/об % в 150 мМ ацетате аммония (Табл. 1). Полученные растворы сушили на поверхностях из полидиметилсилоксана при температуре окружающей среды и хранили с десиккантом, в целом на протяжении 24 часов. После этого вакцину снова растворяли в растворе натрия хлорида и проводили анализ активности, как описано в Примере 1.

[0074] Результаты проиллюстрированы на Фиг. 2 (значения р<0,05 при сравнении с вакциной без вспомогательных веществ). Прямоугольник на правой стороне фигуры представляет вакцину без дополнительных вспомогательных веществ. В общем, вспомогательные вещества были распределены по категориям на 3 категории: вспомогательные вещества, которые продемонстрировали положительное влияние и оказывали стабилизирующее воздействие (мальтодекстрин 4, аргинин, трегалоза, мальтоза, гистидин, гептаглюконат кальция, мальтодекстрин 13, сахароза, глюкоза, гепарин, рафиноза, мио-инозитол, лактоза, сорбит, арабит, фруктоза, цикподекстрин-γ, глюконат калия, адонит, ксилит, тиосульфат натрия, аспарагин, 2-гидроксипропил-β-циклодекстрин, ТРИС, цитрат натрия и дульцит), вспомогательные вещества, которые не оказывали статистически значимого влияния (цитрат калия, овальбумин, глицин, метилглюкозид, циклодекстрин-β, лизин, фосфат натрия, валин, треонин, галактоза, аланин, метионин, пролин, маннит, сывороточный альбумин человека 2, глутамин, сывороточный альбумин человека 1, триптофан, тирозин, серин, бычий сывороточный альбумин, креатин, лейцин и сульфат калия), и вспомогательные вещества, которые дополнительно снижали активность вакцины при сушке (сукцинат натрия, изолейцин, этиллактат, фенилаланин, арабиноза, фосфат калия, ксилоза, сульфит калия, цистеин, глицерин и тиогликолят натрия).

Пример 3

[0075] Комбинации вспомогательных веществ были выбраны для сравнения со стабильностью, обеспечиваемой отдельными составляющими вспомогательными веществами. Субъединичную вакцину против гриппа (B/Brisbane/60/2008, 60 мкг/мл ГА) составляли с одним или двумя вспомогательными веществами в такой же общей концентрации вспомогательного вещества (15 масс/об %), затем сушили на поверхностях из полидиметилсилоксана при температуре окружающей среды на протяжении одного часа и хранили в течение 1 недели при 40°С с десиккантом. Вакцину снова растворяли в растворе натрия хлорида, а затем проводили анализ активности, как описано в Примере 1. Результаты проиллюстрированы на Фиг. 3. Большинство комбинаций сохранило уровень активности в пределах диапазона для составляющих вспомогательных веществ; однако, две комбинации продемонстрировали превосходящую активность, по сравнению с моносоставляющими, - мальтодекстрин 17/лактоза и сорбит/цитрат натрия.

Пример 4

[0076] Препараты субъединичной вакцины против гриппа (B/Brisbane/60/2008, 60 мкг/мл ГА) с различными вспомогательными веществами (15 масс/об %) сушили на поверхностях из полидиметилсилоксана при температуре окружающей среды в течение одного часа и хранили с десиккантом при 40°С до одного месяца. Вакцину снова растворяли в растворе натрия хлорида, после чего проводили анализ активности, как описано в Примере 1. Результаты проиллюстрированы на Фиг. 4.

[0077] Вакцина без вспомогательных веществ утратила свою активность очень быстро. Все другие препараты продемонстрировали хорошие показатели в течение краткосрочного хранения; однако только для нескольких препаратов отсутствовало статистически значимое различие в активности на протяжении всего исследования. Эти препараты содержали комбинации вспомогательных веществ, такие как трегалоза/сахароза, сахароза/аргинин и аргинин/гептаглюконат кальция.

Пример 5

[0078] Трехвалентную субъединичную вакцину против гриппа (B/Brisbane/60/2008, A/Brisbane/59/2007 (H1N1) и A/Victoria/210/2009 (H3N2), 1700-1850 мкг/мл) составляли с различными комбинациями вспомогательных веществ (общая концентрация 15 масс/об %). С использованием этих препаратов получали пластыри с растворимыми микроиглами путем сушки препарата в полидиметилсилоксановом шаблоне при температуре окружающей среды и под вакуумом в течение 4 часов, с последующей дополнительной сушкой в эксикаторе при температуре окружающей среды в течение 2 дней, после чего микроиглы извлекали из формы, упаковывали в алюминиевые пакеты с десиккантом и хранили при 25°С. В заданных точках времени, некоторые пластыри растворяли в растворе натрия хлорида и проводили анализ активности трех штаммов, как описано в Примере 1. Результаты проиллюстрированы на Фиг. 5.

Пример 6

[0079] Одновалентную субъединичную вакцину против гриппа (B/Brisbane/60/2008, 630 мкг/мл) составляли с различными вспомогательными веществами (10 масс/об %) или комбинациями вспомогательных веществ (общая концентрация 10 масс/об % в равных пропорциях). С использованием этих препаратов получали пластыри с растворимыми микроиглами, как описано в Примере 5, и хранили с десиккантом при 25°С. В заданных точках времени, некоторые пластыри растворяли в растворе натрия хлорида и проводили анализ активности, как описано в Примере 1. Результаты проиллюстрированы на Фиг. 6.

Пример 7

[0080] Субъединичную вакцину против Гриппа (B/Brisbane/60/2008, 60 мкг/мл) составляли со вспомогательными веществами (10 масс/об %) или комбинациями вспомогательных веществ (общая концентрация 10 масс/об % в равных пропорциях). Далее полученные препараты сушили на поверхностях из полидиметилсилоксана при температуре окружающей среды в течение одного часа и хранили при 40°С с десиккантом. В заданных точках времени, вакцину снова растворяли в растворе натрия хлорида и проводили анализ активности, как описано в Примере 1. Результаты проиллюстрированы на Фиг. 7.

Пример 8

[0081] Разработан высокопроизводительный анализ с применением eGFP-MeV для исследования стабильности вируса кори после сушки и хранения в диапазоне температур. Генетически модифицированный вирус вакцины против кори, сконструированный таким образом, чтобы продуцировать eGFP при репликации, был приобретен у лаборатории Д-ра Paul DuPrex в Бостонском университете. Затем данная популяция была разведена в клетках Vero, как было описано выше, для увеличения вирусного титра. Конечный титр, измеренный с помощью анализа TCID50, составил 3,0×10⁵ вирусных единиц/мл.

[0082] Различные вспомогательные вещества были выбраны для оценки стабильности модифицированного вируса кори. Перечень вспомогательных веществ и протестированных концентраций приведен в Табл. 2. Все приведенные проценты представляют собой массовый процент от объема водного раствора до сушки.

[0083] Все препараты вспомогательных веществ были смешаны в соотношении 1:1 с популяцией вируса вакцины против кори eGFP (eGFP-MeV) с титром 3,0×10⁵ ТСID₅₀/мл. Далее образцом данного препарата объемом 3 мкл покрывали микрочипы из нержавеющей стали, которые помещали в пробирки для центрифугирования и хранили в непрозрачном пакете, вместе с меняющим цвет десиккантом (Drierite, Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури), который был запечатан для защиты от влажности. Все образцы сушили в течение 24 часов при 22°С в вытяжном шкафу перед хранением на протяжении различных периодов времени. После хранения десиккант каждого образца проверяли на предмет индикации влажности. Если была обнаружена влага, образец отбрасывали.

[0084] Сухие образцы разбавляли 1 мл раствора модифицированной Дульбекко среды Игла (МДСИ) (Gibco, Гранд-Айленд, Небраска), содержащей 2% сыворотки телячьего эмбриона (СТЭ, Gibco), и проверяли активность флуоресценции с помощью 96-луночных планшетов, содержащих монослой клеток Vera. В каждую лунку на планшете добавляли 100 мкл раствора разбавленного вируса. Планшеты инкубировали в течение 72 часов при 37°С, чтобы стимулировать распространение вируса. После инкубации каждую лунку промывали 300 мкл стерильного фосфатно-солевого буфера (ФСБ, Sigma-Aldrich), чтобы удалить среду и неинфицированные вирусные частицы. Перед тестом остатки раствора удаляли из лунок аспирацией. Детектирование флуоресценции осуществляли, измеряя показания каждой лунки с помощью устройства для считывания 96-луночных планшетом при длине волны облучения 485 и длине волны эмиссии 520. Обнаруженный сигнал каждого образца сравнивали с положительным контролем, содержащим такую же концентрацию жидкого eGFP-MeV.

[0085] Образцы, содержащие перечисленные вспомогательные вещества, хранили на протяжении различных периодов времени и при различных температурах, чтобы оценить их способность сохранять активность eGF-MeV после сушки. Вспомогательные вещества исключали из рассмотрения пошаговым способом, после приведения в контакт с более строгими условиями.

[0086] Стабилизирующий раствор, состоящий из 300 мМ треонина (Sigma-Aldrich) и 15 масс/об % сахарозы (Sigma-Aldrich) в ДМ-Н₂O, был создан для завершающего эксперимента с хранением. Образцы получали с применением описанного выше способа и хранили при 4°С, 22°С и 45°С в течение периода от 1 до 24 недель. Дополнительно был включен контроль, состоящий из сухого образца eGFP-MeV, не содержащего стабилизаторов, который хранили при 22°С в течение 1-4 недель.

[0087] Все статистические вычисления проводили с применением программного обеспечения Prism версии 6.02 (Graphpad, Ла-Хойя, Калифорния). Сравнение между индивидуальными образцами осуществляли с применением непарного t-теста с порогом значимости р<0,05. Сравнение нескольких образцов проводили с применением двухстороннего дисперсионного анализа с апостериорным критерием Тьюки и порогом значимости р<0,05. Экспоненциальная наилучшая эмпирическая кривая была определена с применением Excel 2013 (Microsoft, Редмонд, Вашингтон). Средние величины всех результатов представляют собой арифметическое среднее для тестированных образцов.

[0088] До перехода к скринингу стабильности, для лучшего понимания параметров анализа eGFP, были выполнены начальные эксперименты. Несколько 96-луночных планшетов, содержащих слитые слои клеток Vero, были инфицированы с уменьшением концентрации eGFP-MeV, а затем их инкубировали в течение 2, 3 или 4 дней, чтобы определить изменение активности флуоресценции во времени. Результаты показали, что через 3 дня инкубации наблюдалась линейная корреляция между концентрацией вируса и интенсивностью флуоресценции, начиная с концентрации 250 TCID₅₀/мл (не показано). Данное время инкубации было выбрано для всех последующих экспериментов.

[0089] С целью быстрой оценки стабилизирующего потенциала для начального перечня вспомогательных веществ, выполняли исследование с кратковременным хранением при высокой температуре. Результатом начального скринингового исследования стало отбрасывание большинства из выбранных вспомогательных веществ. После хранения в течение 7 дней при 37°С, около 41% протестированных образцов сохранили менее 1% своей начальной активности. Было выбрано пороговое значение остаточной активности 10%, поскольку оно соответствует требованию ВОЗ к живой аттенуированной вакцине против кори, которая хранилась в течение 1 недели при 37°С. Это привело к отбрасыванию около 60% из начального списка (Фиг. 8). После начального скрининга 14 образцов были отобраны для дальнейшего исследования во втором скрининговом эксперименте.

[0090] Для дальнейшей оценки стабилизирующего потенциала оставшихся вспомогательных веществ было выбрано условие более длительного хранения для второго скрининга. Через 1 месяц при 37°С, только 4 образца продемонстрировали сохранение активности более 1% (Фиг. 9), В ходе данного вторичного скрининга было отмечено, что хотя вспомогательные вещества глицин и сахароза по отдельности продемонстрировали крайне низкую стабилизирующую активность (остаточная активность 0,53% и 0,61%, соответственно); однако, когда эти вспомогательные вещества были объединены, остаточная активность сухой вакцины значительно увеличилась, до 30,45% (р<0,0005). Результатом этого стало исследование эффекта применения большего диапазона сахарного углевода и аминокислот для стабилизации вакцины против кори.

[0091] Были получены комбинации всех вспомогательных веществ в этих двух категориях, которые продемонстрировали какую-либо стабилизирующую активность в ходе начального скрининга. Дополнительно, все аминокислоты были протестированы индивидуально, чтобы они могли служить контролем. После хранения на протяжении 1 месяца при 37°С результаты соответствовали более ранним наблюдениям, причем каждая протестированная аминокислота демонстрировала более выраженную способность к стабилизации при объединении с сахарным углеводом (Фиг. 10). Сахароза была определена как самый активный вторичный стабилизатор, поскольку комбинации, содержащие сахарозу, демонстрировали наиболее высокую остаточную активность для 6 из 7 проверенных аминокислот. Для данного скрининга применялся порог значимости 40%, чтобы исключить стабилизирующие комбинации с более низкой активностью.

[0092] Заключительный скрининг проводили для определения лучшей комбинации вспомогательных веществ с целью применения в более масштабных экспериментах по изучению стабильности. После хранения в течение 1 месяца при 45°С тестировали остаточную активность каждого образца. Данный скрининг продемонстрировал, что комбинация аминокислоты треонина и сахара сахарозы обладает самым высоким стабилизирующим потенциалом (Фиг. 11), сохраняя около 14% своей первоначальной активности после хранения при данном жестком температурном режиме.

[0093] Далее смесь вспомогательных веществ с наиболее высокими показателями изучали в более длительном эксперименте, чтобы дополнительно изучить ее способность поддерживать вирулентность eGFP-MeV. Образцы хранили при диапазоне температур до 2 месяцев. После хранения в течение 1 недели при комнатной температуре (25°С), контрольная выборка, которая не содержала стабилизирующих вспомогательных веществ, утратила 100% своей вирулентности, по данным измерений в анализе eGFP. Показатели образцов, содержащих стабилизирующий раствор (треонин + сахароза), были намного лучше (Фиг. 12). Образцы, которые хранили при 4°С и 25°С, сохранили в среднем 95% и 89% своей активности, соответственно, после 1 месяца хранения. В образцах, которые хранили при более высокой температуре (45°С), потеря активности в этой временной точке была значительно выше, с сохранением только 32% их вирулентности, по данным детектирования флуоресценции eGFP. В конечной временной точке 6 месяцев, образцы, которые хранили при более низких температурах, оказались в высокой степени стабильными. Образцы 4°С и 25°С сохранили 100% и 90% своей первоначальной вирулентности, соответственно. Образцы, которые хранили при 45°С, в этой временной точке сохранили менее 1% своей вирулентности. Скорость разложения для образца 45°С, вычисленная на основе экспоненциальной наилучшей эмпирической кривой с R²=0,9961 была установлена как k=-0,216. Скорость разложения для образцов 4°С и 25°С не была вычислена, поскольку для них не наблюдалось значительного снижения активности в точке времени 6 месяцев.

[0094] Хотя стабилизация живой аттенуированной вакцины против кори ранее изучалась, сушка при температуре и давлении окружающей среды представляет собой альтернативу, которая тщательно не изучалась. Многие системы введения вакцин, такие как пластырь с микроиглами, не очень хорошо подходят для соединений, высушенных с применением распылительной сушки, лиофилизации или подобных способов. Таким образом, в данных экспериментах рассматривалась способность коммерчески доступных, одобренных для применения у человека вспомогательных веществ, стабилизировать вакцину против кори после сушки и при последующем хранении. Препараты вспомогательных веществ, которые содержали сахар и аминокислоту, продемонстрировали намного более превосходящий потенциал стабилизации, чем продемонстрировало любое вспомогательное вещество в отдельности. Самый эффективный препарат содержал смесь треонина и сахарозы и был способен сохранять практически полную активность вакцины против кори, по данным наших анализов eGFP, через 6 месяцев при 4°С и 25°С. Кроме того, он был способен сохранять более 10% активности при 45°С более чем в течение 8 недель.

Пример 9

[0095] Пластырь, содержащий полимерные иглы микронного масштаба, был составлен таким образом, чтобы инкапсулировать вакцину против кори. Пластыри с микроиглами получали в ходе двухстадийного способа, в котором стабилизированной вакциной против кори заполняли микрошаблоны, локализуя вакцину в направлении кончиков микроигл. Затем раствор материала матрицы микроигл наносили на шаблоны, чтобы сформировать остальную часть микроигл и основу пластыря.

[0096] Пластырь с микроиглами содержал 100 пирамидальных микроигл, каждая высотой 600 мкм, шириной 300 мкм у основания, заостренных на кончике до радиуса менее 3 мкм. Микроиглы содержали стандартную дозу живой аттенуированной вакцины против кори, инкапсулированную в каждом пластыре.

[0097] Стабильность вакцины против кори в форме микроигл оценивали, измеряя титр вируса вакцины на пластырях с микроиглами, которые хранились при различных температурах почти в течение 4 месяцев. Разведенная жидкая вакцина против кори была нестабильной и утрачивала по существу всю активность в пределах 28 дней при 25°С и менее чем за одну неделю при 40°С (Фиг. 13А-13С). Кроме того, коммерчески доступная лиофилизированная вакцина продемонстрировала нестабильность при 40°С, со снижением вирулентности более чем в 100 раз через 28 дней и более чем в 1000 раз в пределах 3 месяцев. В противоположность этому, пластырь с микроиглами сохранял полную активность почти в течение четырех месяцев при 25°С, со снижением вирулентности менее чем в 10 раз после почти 4 месяцев при 40°С.

[0098] Сравнение Фиг. 13А и 13В демонстрирует, что препараты, эффективные с точки зрения стабилизации вакцины против кори в твердом состоянии, необязательно будут эффективными с точки зрения стабилизации вакцины против кори в жидком состоянии. Хотя один и тот же препарат вакцины использовался в жидком и твердом состоянии, профили стабильности для жидкого и твердого состояния значительно отличались. Эти наблюдения более широко поддерживаются исследованиями, которые продемонстрировали, что стабильность препаратов вакцины может быть существенно снижена при разбавлении сухой вакцины жидкостью.

[0099] Непредсказуемость того, будет ли вспомогательное вещество эффективным с точки зрения стабилизации жидкого или твердого препарата вакцины также служит доказательством наблюдаемых отличий между предшествующими исследования стабильности жидкой вакцины из уровня техники и результатами настоящей заявки. Например, несмотря на то, что предыдущие исследования идентифицировали лактозу как стабилизатор жидких препаратов вакцины против кори, лактоза не была способна стабилизировать сухие препараты вакцины против кори. Сравните, например, Kissmann J, et al., «Stabilization of measles virus for vaccine formulation», Hum. Vaccine 4 (5): 350-9 (2008), и Пример 8. Однако, сахароза была эффективной с точки зрения стабилизации как жидких, так и твердых форм препаратов вакцины против кори. ld.

Пример 10

[00100] Иммунный ответ после вакцинации против кори с применением пластыря с микроиглами из Примера 9, оценивали у макак резус. Макака резус является хорошо изученной моделью для исследования вакцинации против кори, поскольку иммунный ответ у макак демонстрирует выраженную корреляцию с иммунным ответом у человека. Одна группа обезьян получила стандартную для человека дозу живой аттенуированной вакцины против кори посредством пластыря с микроиглами, и группа положительного контроля получила такую же дозу вакцины посредством подкожной инъекции.

[00101] Пластырь с микроиглами может быть вдавлен в кожу с силой 28 Н, что соответствует 0,28 Н на микроиглу, и хорошо согласуется с предыдущими полученными данными. Такая сила легко может быть приложена большим пальцем человека. При введении в кожу трупа свиньи микроиглы быстро растворялись. Кончики микроигл растворялись в пределах одной минуты. В пределах 10 минут, микроиглы растворялись практически полностью.

[00102] С целью минимизации потерь вакцины и точного дозирования, было подтверждено, что вакцина против кори сконцентрирована скорее в пределах микроигл, которые входят в кожу, чем в основе пластыря. Перед применением, каждый пластырь, используемый для вакцинации обезьян, содержал около 3100 ТСID₅₀ вакцины против кори. Через десять минут после наложения на кожу макак резус вручную, тыльная часть пластыря с микроиглами и оставшиеся обломки микроигл содержали 9,4±2,2% первоначальной вакцины, помещенной в пластырь с микроиглами, указывая на доставку более чем 90% дозы вакцины в кожу.

[00103] Образцы сыворотки получали еженедельно и тестировали на антитела к вирусу кори. Чтобы контролировать прогресс иммунного ответа, образцы сыворотки проверяли на присутствие специфичного для кори IgM методом ТИФА. Специфичный для кори IgM был обнаружен у каждого животного в обеих группах всего на 14 день после вакцинации. Присутствие специфичных для кори антител IgM подтвердило, что все животные генерировали первичный иммунный ответ на корь после вакцинации.

[00104] Нейтрализующие антитела впервые были обнаружены, начиная с 21 дня после вакцинации, причем их уровень возрастал до пика на 28 день, около 4700 мМЕ/мл в обеих группах. Пиковые титры и кратность пикового титра не отличались существенно между двумя группами (р>0,05). Как в группе пластыря с микроиглами, так и в группе подкожной инъекции, все животные продемонстрировали сероконверсию, причем у всех животных присутствовал титр >120 мМЕ/мл, который считается защитным для человека. Титры нейтрализующих антител сохранялись по меньшей мере в течение 133 дней после вакцинации. В общем, обе вакцины генерировали робастный ответ в форме антител у макак резус, и полученные данные показывают, что вакцинация против кори с применением пластыря с микроиглами индуцировала нейтрализующие титры антител, эквивалентные вакцинации обычной подкожной инъекцией. Развитие во времени и масштаб ответа в форме антител был сходен с наблюдаемым после экспериментальной вакцинации макак резус подкожной инъекцией в предыдущих исследованиях.

[00105] Иммуногенность пластыря с микроиглами сравнивали с подкожной инъекцией у макак резус (Масаса mulatta), как это одобрено Институциональными Комиссиями по использованию животных и уходу за ними ЦКЗ и Технологическим институтом Джорджии. Титры нейтрализующих антител против кори измеряли в анализе нейтрализации с уменьшением бляшки. Тестировали двукратные разведения сыворотки, начиная с разведения 1:4. Твердофазный иммуноферментный анализ IgM, ранее разработанный в CDC41, применяли для обнаружения сывороточных IgM антител против вируса кори. Результаты были определены с применением стандартных пороговых значений.

[00106] Пластырь с микроиглами не требовал разведения разбавителем, растворялся в коже в пределах 10 минут и вызывал только мягкую, кратковременную эритему кожи. Обе группы макак резуса генерировали ответ в форме нейтрализующих антител против кори, что согласовалось с защитой, причем титры нейтрализующих антител были эквивалентными. Кроме того, пластыри с микроиглами сохраняли приемлемый уровень активности после хранения при повышенной температуре, обеспечивая улучшенную термостабильность, по сравнению со стандартом, лиофилизированной вакциной. Таким образом, вакцина против кори в форме пластыря с микроиглами была иммуногенной у негуманоидных приматов, и данный подход обеспечивает многообещающий способ введения, который может способствовать улучшению охвата вакцинации.

[00107] Хотя изобретение подробно описано с учетом конкретных вариантов его реализации, необходимо понимать, что специалистам в данной области, при достижении понимания вышеизложенного, могут с легкостью прийти в голову модификации, вариации и эквиваленты указанных вариантов реализации изобретения. Соответственно, контекст должен определяться приложенной формулой изобретения и любыми ее эквивалентами.

Предложены препараты и способы стабилизации антигенов в сухих твердых вакцинах. Один из аспектов относится к сухим твердым препаратам вакцин против гриппа, содержащим одно или более вспомогательных веществ, идентифицированных как повышающие стабильность антигенов гриппа. Другой аспект относится к сухим твердым препаратам вакцин против кори, содержащим одно или более вспомогательных веществ, идентифицированных как повышающих стабильность антигена кори. Препараты могут находиться в форме, подходящей для разведения в физиологически приемлемом жидком носителе с образованием инъекционного раствора или суспензии для введения пациенту, или в форме растворимых микроигл, или микроигл с покрытием. 8 н. и 22 з.п. ф-лы, 13 ил., 10 пр., 2 табл.

1. Композиция вакцины, содержащая:

антиген гриппа, и

вспомогательное вещество, выбранное из группы, состоящей из мальтодекстрина 17, мальтодекстрина 4, аргинина, гистидина, гептаглюконата кальция, мальтодекстрина 13, гепарина, рафинозы, арабита, фруктозы, глюконата калия, адонита, ксилита, тиосульфата натрия, аспарагина, 2-гидроксипропил-β-циклодекстрина, ТРИС, цитрата натрия, дульцита и их комбинаций,

отличающаяся тем, что композиция находится в сухой твердой форме, при этом она находится в форме растворимой микроиглы или растворимого покрытия на микроигле.

2. Композиция вакцины по п. 1, отличающаяся тем, что вспомогательное вещество присутствует в количестве от 1 до 20% по массе.

3. Композиция вакцины по п. 1, отличающаяся тем, что антиген гриппа выбран из группы, состоящей из гриппа А, гриппа В, гриппа С и их комбинаций.

4. Композиция вакцины по п. 1, отличающаяся тем, что антиген гриппа включает цельный инактивированный вирус гриппа, расщепленный инактивированный вирус гриппа, субъединичный инактивированный вирус гриппа, частицу, подобную вирусу гриппа, или их комбинацию.

5. Композиция вакцины по п. 1, отличающаяся тем, что дополнительно содержит один или более адъювантов.

6. Композиция вакцины по п. 1, отличающаяся тем, что антиген гриппа характеризуется как обладающий улучшенной стабильностью на протяжении шести месяцев в составе композиции, по сравнению с референтной композицией, содержащей антиген гриппа без вспомогательного вещества.

7. Композиция вакцины по п. 1, отличающаяся тем, что антиген гриппа характеризуется как обладающий улучшенной стабильностью на протяжении трех месяцев в составе композиции, по сравнению с референтной композицией, содержащей антиген гриппа без вспомогательного вещества.

8. Композиция вакцины по п. 1, отличающаяся тем, что антиген гриппа сохраняет по меньшей мере 50% своей активности через три месяца хранения при температурах до 40°С.

9. Композиция вакцины по п. 1, отличающаяся тем, что антиген гриппа сохраняет по меньшей мере 75% своей активности через три месяца хранения при температурах до 40°С.

10. Композиция вакцины, содержащая:

антиген гриппа, и

смесь вспомогательных веществ, выбранную из группы, состоящей из трегалозы и аргинина; трегалозы и гептаглюконата кальция; трегалозы и мальтодекстрина 13; сахарозы и аргинина; аргинина и гептаглюконата кальция; аргинина и мальтодекстрина 13; гептаглюконата кальция и мальтодекстрина 13; мальтодекстрина 13 и цитрата натрия; мальтодекстрина 13 и лактозы; а также сорбита и цитрата натрия,

отличающаяся тем, что композиция находится в сухой твердой форме, при этом она находится в форме растворимой микроиглы или растворимого покрытия на микроигле.

11. Композиция вакцины по п. 10, отличающаяся тем, что смесь вспомогательных веществ присутствует в композиции в общем количестве от 1 до 20% по массе.

12. Композиция вакцины по п. 10, отличающаяся тем, что вспомогательные вещества смеси присутствуют в композиции в соотношении от 1:15 до 15:1.

13. Композиция вакцины по п. 10, отличающаяся тем, что вспомогательные вещества смеси присутствуют в композиции в соотношении 1:1.

14. Композиция вакцины по п. 10, отличающаяся тем, что антиген гриппа выбран из группы, состоящей из гриппа А, гриппа В, гриппа С и их комбинации.

15. Композиция вакцины по п. 10, отличающаяся тем, что антиген гриппа включает цельный инактивированный вирус гриппа, расщепленный инактивированный вирус гриппа, субъединичный инактивированный вирус гриппа, частицу, подобную вирусу гриппа, или их комбинацию.

16. Композиция вакцины по п. 10, дополнительно содержащая один или более адъювантов.

17. Композиция вакцины по п. 10, отличающаяся тем, что антиген гриппа характеризуется как обладающий улучшенной стабильностью на протяжении шести месяцев в составе композиции, по сравнению с референтной композицией, содержащей антиген гриппа без одного или более вспомогательных веществ.

18. Композиция вакцины по п. 10, отличающаяся тем, что антиген гриппа характеризуется как обладающий улучшенной стабильностью на протяжении трех месяцев в составе композиции, по сравнению с референтной композицией, содержащей антиген гриппа без одного или более вспомогательных веществ.

19. Композиция вакцины по п. 10, отличающаяся тем, что антиген гриппа сохраняет по меньшей мере 50% своей активности через три месяца хранения при температурах до 40°С.

20. Композиция вакцины по п. 10, отличающаяся тем, что антиген гриппа сохраняет по меньшей мере 75% своей активности через три месяца хранения при температурах до 40°С.

21. Композиция вакцины, содержащая:

антиген гриппа, и

смесь вспомогательных веществ, содержащую сахарозу и аргинин,

отличающаяся тем, что композиция находится в сухой твердой форме, при этом она находится в форме растворимой микроиглы или растворимого покрытия на микроигле.

22. Композиция вакцины по любому из пп. 1-21, отличающаяся тем, что высота микроиглы составляет от 100 до 2000 мкм.

23. Способ получения композиции вакцины, включающий:

получение водного раствора, который содержит антиген гриппа и вспомогательное вещество, выбранное из группы, состоящей из мальтодекстрина 17, мальтодекстрина 4, аргинина, гистидина, гептаглюконата кальция, мальтодекстрина 13, гепарина, рафинозы, арабита, фруктозы, глюконата калия, адонита, ксилита, тиосульфата натрия, аспарагина, 2-гидроксипропил-β-циклодекстрина, ТРИС, цитрата натрия, дульцита и их комбинаций; и

сушку раствора при температуре от 1 до 60°С с образованием сухой твердой композиции вакцины, которая находится в форме растворимой микроиглы или растворимого покрытия на микроигле.

24. Способ получения композиции вакцины, включающий:

получение водного раствора, который содержит антиген гриппа и смесь вспомогательных веществ, выбранную из группы, состоящей из трегалозы и аргинина; трегалозы и гептаглюконата кальция; трегалозы и мальтодекстрина 13; сахарозы и аргинина; аргинина и гептаглюконата кальция; аргинина и мальтодекстрина 13; гептаглюконата кальция и мальтодекстрина 13; мальтодекстрина 13 и цитрата натрия; мальтодекстрина 13 и лактозы; а также сорбита и цитрата натрия; и

сушку раствора при температуре от 1 до 60°С с образованием сухой твердой композиции вакцины, которая находится в форме растворимой микроиглы или растворимого покрытия на микроигле.

25. Способ по п. 23 или 24, отличающийся тем, что водный раствор наливают в шаблон для формирования массива микроигл до сушки раствора.

26. Трансдермальный пластырь, содержащий основу и массив микроигл, которые выступают из основы и содержат композицию вакцины по любому из пп. 1-21.

27. Композиция вакцины, содержащая:

антиген гриппа,

вспомогательное вещество, выбранное из группы, состоящей из мальтодекстрина 17, мальтодекстрина 4, аргинина, мальтозы, гистидина, гептаглюконата кальция, мальтодекстрина 13, гепарина, рафинозы, мио-инозитола, сахарозы, сорбита, арабита, фруктозы, глюконата калия, адонита, ксилита, тиосульфата натрия, аспарагина, 2-гидроксипропил-β-циклодекстрина, ТРИС, цитрата натрия, дульцита и их комбинаций, и

буферную соль, включающую ГЭПЭС, ацетат аммония или двухосновный фосфат калия,

отличающаяся тем, что композиция находится в сухой твердой форме, при этом она находится в форме растворимой микроиглы или растворимого покрытия на микроигле.

28. Композиция вакцины по п. 10, отличающаяся тем, что композиция дополнительно содержит ГЭПЭС, ацетат аммония или двухосновный фосфат калия.

29. Композиция вакцины по п. 21, отличающаяся тем, что композиция дополнительно содержит ГЭПЭС, ацетат аммония или двухосновный фосфат калия.

30. Композиция вакцины, содержащая:

антиген гриппа,

вспомогательное вещество, выбранное из сахарозы, трегалозы, аргинина, мальтодекстрина, гептаглюконата кальция и их комбинаций, и

буферную соль, выбранную из ГЭПЭС, ацетата аммония и двухосновного фосфата калия,

отличающаяся тем, что композиция находится в сухой твердой форме, при этом она находится в форме растворимой микроиглы или растворимого покрытия на микроигле.