ЛЕЧЕНИЕ РАКОВЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ С ПРИМЕНЕНИЕМ АНТИ-NKG2A СРЕДСТВ Российский патент 2020 года по МПК C07K16/28 A61K39/395 A61P35/00 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании заявки на патент США №62/067642, поданной 23 октября 2014 г., которая полностью включена в настоящую заявку посредством ссылки; включая любые фигуры.

ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Настоящая заявка подается вместе с «Перечнем последовательностей» в электронном формате. «Перечень последовательностей» представлен в виде файла с названием «NKG2A-HN_ST25», созданным 20 октября 2015 г., который имеет размер 27 кБ. Информация в электронном формате «Перечня последовательностей» полностью включена в настоящую заявку посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к применению средств, направленно воздействующих на NKG2A, для лечения раковых заболеваний, а именно раковых заболеваний головы и шеи. Согласно настоящему изобретению также предложены дающие преимущество схемы комбинированного лечения для применения со средствами, направленно воздействующими на NKG2A, для лечения раковых заболеваний.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Активность клеток-натуральных киллеров (NK-клеток) регулируется сложным механизмом, который включает как активирующие, так и ингибирующие сигналы. Были идентифицированы несколько отдельных NK-специфичных рецепторов, которые играют важную роль в опосредованном NK-клетками распознавании и уничтожении клеток-мишеней, дефицитных по человеческим лейкоцитарным антигенам (HLA-антигенам) I класса. Рецепторы естественной цитотоксичности (NCR) относятся к классу активирующих рецепторных белков, и гены, экспрессирующие их, специфически экспрессируются в NK-клетках. Примеры рецепторов NCR включают NKp30, NKp44 и NKp46 (см., например, Lanier (2001) Nat Immunol 2:23-27, Pende et al. (1999) J Exp Med. 190:1505-1516, Cantoni et al. (1999) J Exp Med. 189:787-796, Sivori et al (1997) J. Exp. Med. 186:1129-1136, Pessino et al. (1998) J Exp Med. 188(5):953-60; Mandelboim et al. (2001) Nature 409:1055-1060, полное содержание которых включено в настоящую заявку посредством ссылки). Эти рецепторы являются членами суперсемейства иммуноглобулинов (Ig) и их перекрестная сшивка, вызванная специфическими моноклональными антителами (МАТ), приводит к сильной активации NK-клеток, в результате чего повышается внутриклеточные уровни Са⁺⁺, запуская цитотоксичность и высвобождение лимфокинов и активацию цитотоксичности NK-клеток против многочисленных типов клеток-мишеней.

CD94/NKG2A представляет собой ингибиторный рецептор, обнаруживаемый на субпопуляциях клеток-натуральных киллеров (NK-клетках), Т-клетках-натуральных киллерах (NKT-клетках) и Т-клетках (α/β и γ/δ). CD94/NKG2A ограничивает высвобождение цитокинов и цитотоксические ответы вышеупомянутых лимфоцитов по отношению к клеткам, экспрессирующим HLA-E, лиганд CD94/NKG2A (см, например, WO 99/28748). Было обнаружено, что HLA-E также секретируется в растворимой форме определенными опухолевыми клетками (Derre et al., J Immunol 2006;177:3100-7) и активированными эндотелиальными клетками (Coupel et al., Blood 2007;109:2806-14). Антитела, которые ингибируют путь сигнализации CD94/NKG2A, могут увеличивать высвобождение цитокинов и цитолитическую активность лимфоцитов в отношении HLA-Е-положительных клеток-мишеней, такую как ответы CD94/NKG2А-положительных NK-клеток в отношении инфицированных вирусами клеток. Следовательно, терапевтические антитела, которые ингибируют CD94/NKG2A, но не провоцируют уничтожение экспрессирующих CD94/NKG2A клеток, (то есть не истощающие антитела), могут индуцировать контроль над опухолевым ростом у раковых больных.

Дополнительно, определенные лимфомы, такие как, например, NK-лимфомы, характеризуются экспрессией CD94/NKG2A. У таких пациентов терапевтические антитела, которые направленно воздействуют и уничтожают экспрессирующие CD94/NKG2A клетки, (то есть истощающие антитела), могут быть способны уничтожать опухолевые клетки посредством антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) или комплементзависимой цитотоксичности (CDC). Aнти-NKG2A антитела также были предложены для применения при лечении аутоиммунных или воспалительных заболеваний (см., например, US 20030095965, WO 2006070286).

Различные антитела против NKG2A описаны в данной области техники. WO 2008/009545 описывает гуманизированное анти-NKG2A антитело Z270, тогда как WO2009/092805 описывает гуманизированное анти-NKGA антитело Z199. Vance et al. (J Exp Med 1999;190: 1801-12) обращается к антителу крысы против NKG2 мыши 20D5 (в настоящее время доступному коммерчески через BD Biosciences Pharmingen, каталожный №550518, США); и публикация заявки на патент США №20030095965 описывает антитело мыши 3S9, которое предположительно связывается с NKG2A, NKG2C и NKG2E.

Число случаев плоскоклеточной карциномы головы и шеи (ПКГШ) составляет примерно 600000 случаев в год, и уровень смертности от нее составляет приблизительно 50%. Главными факторами риска возникновения ПКГШ являются курение, потребление алкоголя и инфицирование вирусом папилломы человека (ВПЧ, HPV). Несмотря на накопление новых знаний о ее эпидемиологии и патогенезе, выживаемость при многих типах ПКГШ лишь незначительно улучшилась за последние сорок лет. Общая 5-летняя выживаемость пациентов с ПКГШ составляет лишь приблизительно 50%. Курение, потребление алкоголя и вирусные агенты являются главными факторами риска развития ПКГШ. Эти факторы риска вместе с генетической предрасположенностью приводят к накоплению многочисленных генетических и эпигенетических изменений в многоступенчатом процессе развития рака, и понимание указанного молекулярного канцерогенеза ПКГШ применяют для разработки средств направленного действия для лечения ПКГШ.

Идея об иммунотерапии в качестве способа лечения ПКГШ существует уже несколько десятилетий, и попытки лечения ПКГШ включали направленное воздействие на специфичные для опухоли антигены. Несмотря на сделанные улучшения при использовании подобных иммуностимулирующих стратегий для лечения различных солидных раков, использований данных стратегий у пациентов с плоскоклеточной карциномой головой и шеи (ПКГШ) отстает. Иммунотерапевтические подходы для ПКГШ особенно осложняются глубокой иммуносупрессией, вызванной ПКГШ, которая потенциально снижает эффективность попыток стимулировать иммунную систему. Обзор механизмов, с помощью которых ПКГШ избегает противоопухолевого иммунного ответа, таких как угнетающая модуляция HLA-антигенов I класса, представлен в Duray et al. (2010) Clin. Dev. Immunol. Article ID 701657; 2010: 1-15

Следовательно, в данной области техники существует необходимость в улучшенном лечебно-профилактическом действии для пациентов с раковыми заболеваниям головы и шеи.

РАСКРЫТИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение является результатом, помимо прочего, открытия, совершенного авторами настоящего изобретения, что блокада ингибиторного рецептора NKG2A с использованием анти-NKG2A антитела позволяет NK-клеткам эффективно уничтожать клетки рака головы и шеи. В частности, при раке головы и шеи HLA-E служит опухоли в качестве механизма избегания негативного воздействия, даже когда рак лечат другими лекарственными средствами, и включая пациентов с ВПЧ. В настоящей заявке показано, что клетки рака головы и шеи экспрессируют HLA-E на уровнях, которые вызывают ингибирование NK-клеток и/или Т-клеток, экспрессирующих NKG2A, и анти-NKG2A антитело может обратить подобное ингибирование. Кроме того, даже когда клетка рака головы и шеи лечат ингибитором рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), экспрессируемый опухолевыми клетками HLA-E продолжает ингибировать лизис NK-клетками и/или Т-клетками, и такое ингибирование может быть обращено применением анти-NKG2A антитела.

Соответственно, в одном из вариантов реализации предложен способ лечения или профилактики рака головы и шеи у индивидуума, способ, включающий введение индивидууму, имеющему рак головы и шеи, терапевтически активного количества соединения, которое нейтрализует ингибиторную активность полипептида NKG2A человека. В одном аспекте предложена композиция, содержащая соединение, которое нейтрализует ингибиторную активность полипептида NKG2A человека, для применения при лечении или профилактике плоскоклеточной карциномы головы и шеи (ПКГШ). В одном аспекте соединение, которое нейтрализует ингибиторную активность полипептида NKG2A человека, представляет собой антитело, способное связывать NKG2A бивалентным образом. В одном аспекте соединение, которое нейтрализует ингибиторную активность полипептида NKG2A человека, представляет собой неистощающее антитело (например, антитело, у которого нет Fc-домена или у которого Fc-домен минимально связывается или не связывается с одним или более Fcγ-рецепторами). В одном из вариантов реализации предложено соединение, которое ингибирует полипептид NKG2A на NK-клетках и/или Т-клетках и вызывает лизис подобными NK-клетками и/или Т-клетками клеток ПКГШ, экспрессирующих HLA-E, для применения при лечении или профилактике ПКГШ у индивидуума. Необязательно указанное лечение или профилактика включает введение соединения, которое ингибирует полипептид NKG2A, индивидууму, имеющему ПКГШ.

В одном из вариантов реализации рак представляет собой опухоль ротоглотки, опухоль гортани, опухоль полости рта или опухоль гипофаринкса. В одном из вариантов реализации ПКГШ представляет собой плоскоклеточную карциному ротовой полости (ПКРП). ПКРП включает плоскоклеточную карциному губы, 2/3 передней части языка, дна ротовой полости, слизистой щеки, десны, твердого неба и ретромолярного треугольника.

В одном из вариантов реализации ПКГШ представляет собой метастатический рак.

В одном из вариантов реализации индивидуум является ВПЧ-положительным (например, характеризуется наличием вируса папилломы человека, положителен по генотипу ВПЧ, связанному с высоким риском развития рака или плохим прогнозом в отношении развития рака, положителен по генотипу ВПЧ 16 и/или положителен по экспрессии Р16^INKa).

В одном из вариантов реализации индивидуум имеет рак головы и шеи, характеризующийся наличием лимфоцитов в окружении опухоли (например, внутри опухолевой ткани и/или внутри прилегающей к опухоли ткани).

В одном из вариантов реализации анти-NKG2A антитело вводят в количестве, которое приводит к нейтрализации ингибиторной активности CD94/NKG2A человека у пациента (in vivo), необязательно при этом анти-NKG2A антитело вводят в дозе, которая приводит к насыщению полипептидов NKG2A на NK-клетках и Т-лимфоцитах периферической крови по меньшей мере в течение двух недель, необязательно по меньшей мере в течение четырех недель. В одном из вариантов реализации анти-NKG2A антитело вводят в дозе от 1 мг/кг до 10 мг/кг, необязательно в дозе приблизительно 4 мг/кг, необязательно в дозе приблизительно 10 мг/кг.

В одном из вариантов реализации схема лечения или курс лечения с помощью соединения (например, антитела), которое нейтрализует ингибиторную активность полипептида NKG2A человека, применяют у индивидуума, имеющего рак головы и шеи, перед хирургической операцией по удалению раковых клеток, то есть в качестве предоперационного лечения.

Необязательно, HLA-E-статус рака можно оценить перед началом лечения с помощью анти-NKGA средства. В одном из вариантов реализации предложен способ, совмещающий этап определения HLA-E-статуса для идентификации пациентов, имеющих HLA-E-положительную ПКГШ; в дальнейшем этих пациентов можно лечить средством, которое нейтрализует ингибиторную активность полипептида NKG2A.

В одном аспекте предложен способ оценки, подходит ли индивидуум, имеющий ПКГШ, для лечения соединением, которое нейтрализует ингибиторную активность полипептида NKG2A человека, способ, включающий определение статуса в отношении полипептида HLA-E у злокачественных опухолевых клеток, полученных от индивидуума, имеющего ПКГШ, при этом определение, что у пациента экспрессируется полипептид HLA-E в злокачественных опухолевых клетках (например, экспрессируется в значительной степени; на уровне, повышенном по сравнению с контрольным уровнем; на уровне, повышенном по сравнению с соответствующей тканью от здоровых индивидуумов, и/или на уровне, который соответствует (по меньшей мере) уровню у пациентов, получающих положительный эффект от лечения анти-NKG2A средством) указывает, что подобный индивидуум является подходящим для лечения соединением, которое нейтрализует ингибиторную активность полипептида NKG2A человека.

В одном из вариантов реализации любого из терапевтических применений или способов лечения или профилактики ПКГШ согласно настоящей заявке лечение или профилактика ПКГШ у индивидуума включает:

a) определение статуса в отношении полипептида HLA-E у злокачественных опухолевых клеток, полученных от индивидуума, имеющего ПКГШ, и

b) при определении, что у пациента экспрессируется полипептид HLA-E злокачественными опухолевыми клетками (например, по меньшей мере на величину или у доли опухолевых клеток, по меньшей мере средняя или сильная степень окрашивания и т.д.), введение индивидууму соединения, которое нейтрализует ингибиторную активность полипептида NKG2А человека.

В одном из вариантов реализации любого из терапевтических применений или способов лечения или профилактики ПКГШ согласно настоящей заявке лечение или профилактика ПКГШ у индивидуума включает:

a) определение статуса в отношении полипептида HLA-E у злокачественных опухолевых клеток внутри индивидуума, имеющего ПКГШ, и

b) при определении, что злокачественные опухолевые клетки экспрессируют полипептид HLA-E на уровне, который равен или повышен по сравнению с контрольным уровнем (например, повышен по сравнению с контрольным уровнем для здорового индивидуума или с контрольным уровнем индивидуума, не получающего положительный эффект от лечения анти-NKG2A средством; по меньшей мере на контрольном уровне, который соответствует уровню пациентов, получающих положительный эффект от лечения анти-NKG2A средством), введение индивидууму соединения, которое нейтрализует ингибиторную активность полипептида NKG2A человека.

В одном из вариантов реализации любого из способов определение статуса в отношении полипептида HLA-E на этапе (а) включает определение уровня экспрессии полипептида HLA-E злокачественными опухолевыми клетками в биологическом образце и сравнение этого уровня с контрольным уровнем (например, величиной, долей HLA-E-положительных злокачественных опухолевых клеток и/или слабым окрашиванием или отсутствием окрашивания и т.д.), соответствующим здоровому индивидууму или индивидууму, который не получает положительного эффекта от лечения анти-NKG2A средством. Определение, что биологический образец экспрессирует полипептид HLA-E на уровне, повышенном по сравнению с контрольным уровнем, указывает, что пациент имеет рак головы и шеи, который можно лечить с помощью средства, ингибирующего NKG2A.

В одном из вариантов реализации любого из способов определение статуса в отношении полипептида HLA-E на этапе (а), включает определение уровня экспрессии полипептида HLA-E злокачественными опухолевыми клетками в биологическом образце и сравнение этого уровня с контрольным уровнем (например, величиной, долей HLA-E-положительных злокачественных опухолевых клеток и/или промежуточным или сильным окрашиванием клеточной поверхности и т.д.). Определение, что биологический образец экспрессирует полипептид HLA-E на уровне, по меньшей мере равном контрольному уровню, указывает, что пациент имеет рак головы и шеи, который можно лечить с помощью средства, ингибирующего NKG2A.

В одном из вариантов реализации любого из способов определение статуса в отношении полипептида HLA-E на этапе (а), включает определение уровня экспрессии полипептида HLA-E злокачественными опухолевыми клетками в биологическом образце и сравнение этого уровня с контрольным уровнем (например, величиной, долей HLA-E-положительных злокачественных опухолевых клеток и/или промежуточным или сильным окрашиванием клеточной поверхности и т.д.), соответствующим индивидууму (например, имеющему рак, рак головы и шеи), который получает положительный эффект от лечения с помощью анти-NKG2A средства. Определение, что биологический образец экспрессирует полипептид HLA-E на уровне, по меньшей мере эквивалентном контрольному уровню, соответствующему индивидууму, который получает положительный эффект от лечения с помощью анти-NKG2A средства, указывает, что пациент имеет рак головы и шеи, который можно лечить с помощью средства, ингибирующего NKG2A.

В одном аспекте любого варианта реализации определение, что злокачественные опухолевые клетки от индивидуума имеют промежуточный или высокий уровень экспрессии полипептида HLA-E (например, промежуточное или сильное окрашивание при определении иммуногистохимическим анализом), указывает, что пациент имеет рак головы и шеи, что индивидуума можно лечить с помощью средства, ингибирующего NKG2A. В одном аспекте любого варианта реализации определение, что у значительной доли (например, по меньшей мере приблизительно 25%, необязательно по меньшей мере 50%) злокачественных опухолевых клеток от индивидуума есть экспрессия полипептида HLA-E (например, промежуточное или сильное окрашивание при определении иммуногистохимическим анализом), указывает, что пациент имеет рак головы и шеи, что индивидуума можно лечить с помощью средства, ингибирующего NKG2A. В одном аспекте любого варианта реализации определение, что у значительной доли (например, по меньшей мере приблизительно 25%, необязательно по меньшей мере 50%) злокачественных опухолевых клеток от индивидуума есть экспрессия полипептида HLA-E (например, промежуточное или сильное окрашивание при определении иммуногистохимическим анализом), и индивидуум имеет плохой прогноз в отношении развития рака (например, метастатическое заболевание, генотип ВПЧ, активное заболевание или заболевание на поздних стадиях), указывает, что пациент имеет рак головы и шеи, что индивидуум можно лечить с помощью средства, ингибирующего NKG2A. В одном аспекте любого варианта реализации определение, что злокачественные опухолевые клетки от индивидуума имеют высокий уровень экспрессии полипептида HLA-E, что подтверждено сильным сигналом, диффузно выраженным среди всех клеток в пределах клеточного подтипа, у них есть экспрессия полипептида HLA-E (например, сильное окрашивание при определении иммуногистохимическим анализом), указывает, что пациент имеет рак головы и шеи, что индивидуум можно лечить с помощью средства, ингибирующего NKG2A.

В одном из вариантов реализации анти-NKG2A средство можно успешно применять у пациента, который является ВПЧ-положительным (например, характеризуется наличием вируса папилломы человека у пациента, положителен по генотипу ВПЧ, связанному с высоким риском развития рака или плохим прогнозом в отношении развития рака, положителен по генотипу ВПЧ16 и/или положителен по экспрессии P16INKa). В одном из вариантов реализации инфицирование ВПЧ вызывает повышенную экспрессию на опухолевых клетках лигандов, которые распознаются активирующими рецепторами на NK-клетках и/или Т-клетках (например, повышающая регуляция в отношении лигандов NKG2D, таких как MICA или MICB), а также повышенная экспрессия HLA-E на поверхности опухолевых клеток, так что терапия, блокирующая NKG2A, будет особенно эффективной у ВПЧ-положительных индивидуумов.

В одном из вариантов реализации предложен способ лечения или профилактики рака у индивидуума, который является ВПЧ-положительным, способ, включающий введение ВПЧ-положительному индивидууму, имеющему рак, терапевтически активного количества соединения, которое нейтрализует ингибиторную активность полипептида NKG2A человека. В одном из вариантов реализации рак представляет собой солидную опухоль, например, солидную опухоль на поздней стадии. В одном из вариантов реализации рак представляет собой рак головы и шеи.

Необязательно, ВПЧ-статус индивидуума можно оценить перед лечением с помощью анти-NKG2A средства. В одном из вариантов реализации предложен способ лечения индивидуума, имеющего рак головы и шеи, способ, включающий:

(a) определение, является ли индивидуум, имеющий рак головы и шеи, ВПЧ-положительным;

(b) если индивидуум является ВПЧ-положительным, лечение индивидуума (например, введение индивидууму) терапевтически активного количества соединения, которое нейтрализует ингибиторную активность полипептида NKG2А человека.

В одном из вариантов реализации предложен способ лечение индивидуума, имеющего рак, (например, применение соединения, которое нейтрализует ингибиторную активность полипептида NKG2A человека, для лечения или профилактики рака у индивидуума), способ, включающий:

a) определение, имеет ли индивидуум опухоль, для которой характерно присутствие лимфоцитов в окружении опухоли (например, внутри опухолевой ткани и/или внутри прилегающей к опухоли ткани); и

b) при обнаружении, что индивидуум имеет опухоль, для которой характерно присутствие лимфоцитов в окружении опухоли, введение индивидууму соединения, которое нейтрализует ингибиторную активность полипептида NKG2A человека. Необязательно, опухоль представляет собой солидную опухоль, необязательно опухоль представляет собой рак головы и шеи.

В другом варианте реализации индивидуум, имеющий рак головы и мозга, является ВПЧ-отрицательным. В одном из вариантов реализации предложен способ лечения ВПЧ-отрицательного пациента, имеющего рак головы и шеи, включающий введение индивидууму соединения, которое нейтрализует ингибиторную активность полипептида NKG2A.

В одном из вариантов реализации анти-NKG2A антитело вводят в качестве монотерапии. В одном из вариантов реализации анти-NKG2A антитело вводят в составе комбинированного лечения с одним или несколькими другими противоопухолевыми средствами.

В одном из вариантов реализации предложен способ лечения или профилактики рака у индивидуума, способ, включающий введение индивидууму (а) терапевтически активного количества соединения, которое ингибирует полипептид NKG2A человека, и (b) терапевтически активного количества соединения, которое связывает и/или ингибирует полипептид EGFR человека. В одном из вариантов реализации рак представляет собой ПКГШ. В одном из вариантов реализации соединение, которое связывает и/или ингибирует EGFR человека, представляет собой анти-EGFR антитело.

В одном из вариантов реализации анти-NKG2A антитело вводят в эффективном количестве, что приводит к нейтрализации ингибиторной активности CD94/NKG2A у пациента (in vivo), необязательно при этом анти-NKG2A антитело вводят в дозе, которая приводит к насыщению полипептидов NKG2A на NK-клетках и Т-лимфоцитах периферической крови по меньшей мере в течение двух недель, необязательно по меньшей мере в течение четырех недель. В одном из вариантов реализации анти-EGFR антитело вводят в эффективном количестве, которое вызывает антителозависимую клеточную цитотоксичность в отношении экспрессирующих EGFR опухолевых клеток у пациента (in vivo). В одном из вариантов реализации анти-EGFR антитело вводят в эффективном количестве, которое приводит к нейтрализации активности EGFR человека у пациента (in vivo). В одном аспекте комбинацию вводят (или она для введения) в соответствии с конкретной клинической схемой приема, а именно в конкретном количестве дозы и в соответствии с конкретной схемой приема (например, в количестве дозы и/или в соответствии с конкретной схемой приема, представленной в настоящей заявке).

В одном из вариантов реализации предложен способ лечения или профилактики рака у индивидуума, включающий:

a) определение статуса в отношении полипептида HLA-E у злокачественных опухолевых клеток внутри индивидуума, имеющего рак,

b) определение статуса в отношении полипептида EGFR злокачественных опухолевых клеток внутри индивидуума, имеющего рак, и

c) при определении, что полипептиды HLA-E и EGFR экспрессируются на поверхности злокачественных опухолевых клеток, полученных от индивидуума, на уровне, который повышен по сравнению с контрольным уровнем, применение у индивидуума схемы лечения, которая содержит соединение, которое нейтрализует ингибиторную активность полипептида NKG2A человека, и средства, которое связывает и/или ингибирует EGFR.

В одном из вариантов реализации любого из терапевтических применений или способов лечения или профилактики ПКГШ согласно настоящей заявке лечение или профилактика ПКГШ у индивидуума включает:

а) определение статуса в отношении полипептида HLA-E у злокачественных опухолевых клеток внутри индивидуума, имеющего рак,

b) определение статуса в отношении полипептида EGFR у злокачественных опухолевых клеток внутри индивидуума, имеющего рак, и

c) при определении, что полипептиды HLA-E и EGFR экспрессируются на поверхности злокачественных опухолевых клеток, полученных от индивидуума, на уровне, который повышен по сравнению с контрольным уровнем, применение у индивидуума схемы лечения, которая содержит соединение, которое нейтрализует ингибиторную активность полипептида NKG2A человека, и средства, которое связывает и/или ингибирует EGFR.

В любом из способов согласно настоящей заявке определение статуса в отношении полипептида или его экспрессии (например, HLA-E, NKG2A или EGFR) можно осуществлять напрямую (путем определения полипептида) или косвенно (например, путем определения нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид).

Соединение, которое нейтрализует ингибиторную активность полипептида NKG2A (анти-NKG2A средство) представляет собой соединение, которое повышает способность NK-клеток и/или Т-клеток, экспрессирующих NKG2A, вызывать смерть клеток, экспрессирующих HLA-E. Необязательно, соединение, которое нейтрализует ингибиторную активность полипептида NKG2A, представляет собой полипептид, необязательно антитело (например, моноклональное антитело), которое связывает полипептид NKG2 А.

В одном из вариантов реализации анти-NKG2A средство уменьшает ингибиторную активность NKG2A путем блокирования связывания его лиганда, HLA-E, то есть анти-NKG2A средство мешает связыванию NKG2A полипептидом HLA-E. Антитело, имеющее тяжелые цепи любой последовательности из последовательностей SEQ ID NO: 2-6 и легкую цепь последовательности SEQ ID NO: 7 соответственно, представляет собой пример подобного антитела. В одном из вариантов реализации анти-NKG2A средство снижает ингибиторную активность NKG2A без блокировки связывания его лиганда, HLA-Е, то есть анти-NKG2A средство не является конкурирующим антагонистом и не мешает связыванию NKG2A полипептидом HLA-E. Антитело, имеющее вариабельные области тяжелой и легкой цепи соответственно последовательностей SEQ ID NO: 16 и 17, представляет собой пример подобного антитела.

В одном из вариантов реализации анти-NKG2A средство представляет собой антитело, которое связывается со значительно большей аффинностью с NKG2A, чем с одним или более активирующими NKG2-рецепторами. Например, в одном из вариантов реализации средство представляет собой антитело, которое связывается со значительно большей аффинностью с NKG2A, чем с NKG2C. В дополнительном или альтернативном варианте реализации средство представляет собой антитело, которое связывается со значительно большей аффинностью с NKG2A, чем с NKG2E. В дополнительном или альтернативном варианте реализации средство представляет собой антитело, которое связывается со значительно большей аффинностью с NKG2A, чем с NKG2H. Антитело, имеющее тяжелые цепи любой последовательности из последовательностей SEQ ID NO: 2-6 и легкую цепь последовательности SEQ ID NO: 7 соответственно, связывает NKG2A без связывания по существу с NKG2C, NKG2E или NKG2H.

В дополнительном или альтернативном варианте реализации анти-NKG2A средство конкурирует с антителом, имеющим тяжелые цепи любой последовательности из последовательностей SEQ ID NO: 2-6 и легкую цепь последовательности SEQ ID NO: 7, и/или антителом, имеющим вариабельные области тяжелой и легкой цепи соответственно последовательностей SEQ ID NO: 16 и 17, за связывание с CD94/NKG2A. Средство может представлять собой, например, анти-NKG2A антитело человека или гуманизированное анти-NKG2A антитело.

В одном из вариантов реализации анти-NKG2A антитело представляет собой гуманизированное антитело, имеющее тяжелые цепи любой последовательности из последовательностей SEQ ID NO: 2-6 и легкую цепь последовательности SEQ ID NO: 7. Предложены в качестве примера остатки или последовательности определяющих комплементарность участков (CDR) и/или сайты для аминокислотных замен в каркасных участках (FR) подобных гуманизированных антител, имеющих улучшенные свойства, такие как, например, пониженная иммуногенность, улучшенные антигенсвязывающие или другие функциональные свойства и/или улучшенные физико-химические свойства, такие как, например, улучшенная стабильность.

В других вариантах реализации предложены фармацевтические композиции и наборы, а также способы их применения.

Данные аспекты более подробно описаны в описании настоящего изобретения, представленного в настоящей заявке, и дополнительные аспекты, признаки и преимущества будут очевидны из данного описания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фигурах 1А и 1В показана способность анти-NKG2A антитела улучшать распознавание линий клеток ПКГШ NK-клетками. Указаны считывания CD107 (вверху) и CD137 (внизу) с использованием сортировки флуоресцентно-активированных клеток (FACS) на NKG2A-oтpицaтeльныx (NKG2A-) NK-клетках (слева) или на NKG2A-положительных (NKG2A+) NK-клетках (справа) в присутствии указанных линий клеток-мишеней ПКГШ и в присутствии или отсутствии анти-NKG2A антитела в насыщающей дозе 10 мкг/мл. Клеточные линии расположены слева направо в соответствии с уровнем экспрессии HLA-E на поверхности клеток. Каждая точка представляет собой мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) от здорового добровольца. На фигуре 1А показаны контроли и линию клеток-мишеней К562 с низкими или высокими уровнями экспрессии поверхностного HLA-E, а на фигуре 1В показано, что анти-NKG2A антитело может восстановить лизис ПКГШ с эндогенной экспрессией HLA-E. Этот эффект наблюдается только на NKG2А-положительных NK-клетках и зависит от уровня экспрессии HLA-E.

На фигуре 2 показана усиленная насыщающими дозами анти-NKG2A антитела антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC) NK-клеток в отношении клеток ПКГШ линии FaDu, индуцированная субоптимальными дозами анти-EGFR антитела, цетуксимаба (ctx).

На фигурах 3А и 3В показан эффект от увеличивающихся доз анти-NKG2A антитела и увеличивающихся доз анти-EGFR антитела (цетуксимаба). На фигуре 3А показано считывание CD 107 на контролях без клеток-мишеней и с трансфектантами K562-HLA-E. Каждый здоровый доброволец представлен разными символами: квадратиками или кружками. Зачеркнутые пустые символы соответствуют условию, когда анти-NKG2A антитело заменяли 10 мкг/мл IgG4 человека (hIgG4) в качестве изотипического контроля, инкубированным совместно с 0,1 мкг/мл цетуксимаба. На фигуре 3В показано считывание CD107 на линиях клеток ПКГШ. Для каждой концентрации цетуксимаба, символы (квадратики или кружки) для каждой концентрации анти-NKG2A соответствуют слева направо концентрациям 0 мкг/мл, 0,1 мкг/мл, 1 мкг/мл и 10 мкг/мл.

На фигуре 4 показано окрашивание по HLA-E в диапазоне от 1+ до 3+ при различных локализациях опухоли/типах плоскоклеточной карциномы головы и шеи. Интересно, что окрашивание было 3+ во всех образцах опухоли, тип которой общепризнан как имеющей самый худший прогноз (миндалина).

На фигуре 5 показаны подробности статуса в отношении ВПЧ16 и Р16 для пациентов с различными опухолями.

На фигуре 6 показаны типы опухолей (метастатической или первичной опухоли) как функция статуса в отношении ВПЧ16 и Р16^INKA.

На фигуре 7 показано, что для ВПЧ-положительных опухолей была характерна сильная лимфоцитарная инфильтрация.

Определения

Используемые в настоящем описании изобретения формы единственного числа могут обозначать один или более одного объекта. Используемые в формуле изобретения совместно со словом «содержащий» формы единственного числа могут обозначать один или более одного объекта. Используемый в настоящей заявке термин «другой» может означать по меньшей мере второй или более объектов.

В случаях, когда используется термин «содержащий» он может быть заменен в некоторых случаях терминами «состоящий по существу из» или «состоящий из».

NKG2A (OMIM 161555, полное описание данной записи базы данных включено в настоящую заявку посредством ссылки) является членом NKG2-грyппы транскриптов (Houchins, et al. (1991) J. Exp. Med. 173:1017-1020). NKG2A кодируется 7 экзонами, охватывающими 25 тыс. оснований, демонстрирующими в некоторой степени дифференциальный сплайсинг. Вместе с CD94 NKG2A образует гетеродимерный ингибиторный рецептор CD94/NKG2A, обнаруживаемый на поверхности субпопуляций NK-клеток, Т-клеток α/β, Т-клеток γ/δ и NKT-клеток. Подобно ингибиторным рецепторам KIR данный рецептор имеет иммунорецепторный тирозиновый ингибирующий мотив (ITIM) в своем цитоплазматическом домене. Используемый в настоящей заявке термин «NKG2A» относится к любому варианту, производному или изоформе гена или закодированного белка NKG2A. Также термин охватывает любые последовательности нуклеиновых кислот или белков, имеющие одно или несколько биологических свойств или функций общих с диким типом, полноразмерным NKG2A, и имеющие по меньшей мере 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше нуклеотидной или аминокислотной идентичности с ним. NKG2A человека содержит 233 аминокислот в 3 доменах с цитоплазматическим доменом, содержащим остатки 1-70, трансмембранным участком, содержащим остатки 71-93, и внеклеточным участком, содержащим остатки 94-233, следующей последовательности:

NKG2C (OMIM 602891, полное описание данной записи базы данных включено в настоящую заявку посредством ссылки) и NKG2E (OMIM 602892, полное описание данной записи базы данных включено в настоящую заявку посредством ссылки) являются двумя другими членами NKG2-группы транскриптов (Gilenke, et al. (1998) Immunogenetics 48:163-173). Рецепторы CD94/NKG2C и CD94/NKG2E представляют собой активирующие рецепторы, обнаруживаемые на поверхности субпопуляций лимфоцитов, таких как NK-клетки и Т-клетки.

HLA-E (OMIM 143010, полное описание данной записи базы данных включено в настоящую заявку посредством ссылки) представляет собой неклассическую молекулу главного комплекса гистосовместимости (МНС), которая экспрессируется на клеточной поверхности и регулируется связыванием пептидов, например, таких как фрагменты, полученные из сигнальной последовательности других молекул МНС I класса. Растворимые версии HLA-E также были идентифицированы. Дополнительно к свойствам связывания Т-клеточного рецептора HLA-E связывает субпопуляции клеток-натуральных киллеров (NK-клеток), Т-клеток-натуральных киллеров (NKT-клеток) и Т-клеток (α/β и γ/δ) путем связывания специфически с рецепторами CD94/NKG2A, CD94/NKG2B и CD94/NKG2C (см., например, Braud et al. (1998) Nature 391:795-799, полное описание данной публикации включено в настоящую заявку посредством ссылки). Экспрессия на поверхности HLA-E защищает клетки-мишени от лизиса CD94/NKG2А-положительными клонами NK-клеток, Т-клеток или NKT-клеток. Используемый в настоящей заявке термин «HLA-Е» относится к любому варианту, производному или изоформе гена или закодированного белка HLA-Е. Также термин охватывает любые последовательности нуклеиновых кислот или белков, имеющие одно или несколько биологических свойств или функций общих с диким типом, полноразмерным HLA-Е, и имеющие по меньшей мере 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше нуклеотидной или аминокислотной идентичности с ним.

В контексте настоящего описания термин «CD94/NKG2А-положительный лимфоцит» относится к клеткам лимфоидного ряда (например, NK-клеткам, NKT-клеткам и Т-клеткам), экспрессирующим CD94/NKG2A на поверхности клетки, которые можно определить, например, с помощью проточной цитометрии с использованием антител, которые специфически распознают комбинированный эпитоп на CD94 и NKG2A или эпитоп только на NKG2A. Термин «CD94/NKG2А-положительный лимфоцит» также включает бессмертные линии клеток лимфоидного ряда (например, линии NKL, NK-92).

В контексте настоящего описания термин «снижает ингибиторную активность NKG2A», нейтрализует «NKG2A» или «нейтрализует ингибиторную активность NKG2A» относится к процессу, в ходе которого CD94/NKG2A ингибируется по своей способности негативно влиять на внутриклеточные процессы, ведущие к формированию ответов лимфоцитов, таких как высвобождение цитокинов и цитотоксические ответы. Это можно измерить, например, в анализе цитотоксичности на основе NK-клеток или Т-клеток, в котором измеряют способность лекарственного соединения стимулировать уничтожение HLA-E-положительных клеток CD94/NKG2А-положительными лимфоцитами. В одном из вариантов реализации препарат из антител вызывает по меньшей мере 10% усиление цитотоксичности CD94/NKG2A-ограниченных лимфоцитов, предпочтительно по меньшей мере 40% или 50% усиление цитотоксичности лимфоцитов или более предпочтительно по меньшей мере 70% усиление цитотоксичности NK-клеток, и относится к описанным анализам цитотоксичности. Если анти-NKG2A антитело снижает или блокирует взаимодействия CD94/NKG2A с HLA-Е, оно может увеличивать цитотоксичность CD94/NKG2A-ограниченных лимфоцитов. Это можно оценить, например, в стандартном 4-часовом in vitro анализе цитотоксичности с использованием, например, NK-клеток, которые экспрессируют CD94/NKG2A, и клеток-мишеней, которые экспрессируют HLA-Е. Подобные NK-клетки не эффективно убивают клетки-мишени, которые экспрессируют HLA-Е, потому что CD94/NKG2A распознает HLA-Е, что ведет к инициации и распространению ингибиторной сигнализации, которая препятствует опосредованному лимфоцитами цитолизу. Подобный in vitro цитотоксический анализ можно осуществить с помощью стандартных методик, которые хорошо известны в данной области техники, как описано, например в Coligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993). Высвобождение хрома и/или другие параметры для оценки способности антитела стимулировать лимфоциты на уничтожение клеток-мишеней, таких как клетки линий Р815, K562 или подходящие опухолевые клетки, описаны в Sivori et al., J. Exp. Med. 1997;186:1129-1136; Vitale et al., J. Exp. Med. 1998; 187:2065-2072; Pessino et al. J. Exp. Med. 1998;188:953-960; Neri et al. Clin. Diag. Lab. Immun. 2001;8:1131-1135; Pende et al. J. Exp. Med. 1999;190:1505-1516, полное описание каждой из публикаций включено в настоящую заявку посредством ссылки. Клетки-мишени метят ⁵¹Cr перед добавлением NK-клеток, а затем количество уничтоженных клеток оценивают пропорционально высвобождению ⁵¹Cr из клеток в среду в результате убийства. Добавление антитело, которое препятствует связыванию CD94/NKG2A с HLA-Е, приводит к предотвращению инициации и распространению ингибиторной сигнализации через рецептор CD94/NKG2A. Таким образом, добавление подобных средств приводит к усилению опосредованного лимфоцитами уничтожения клеток-мишеней. Таким образом, данный этап идентифицирует средства, которые предотвращают индуцированную CD94/NKG2A сигнализацию путем, например, блокировки связывания лиганда. В отдельном цитотоксическим анализе на основе высвобождения ⁵¹Cr эффекторные NK-клетки, экспрессирующие CD94/NKG2A, могут убивать HLA-E-отрицательные клетки-мишени линии LCL 721, но делают это хуже, чем в случае контрольных клеток LCL 721.221-Cw3, экспрессирующих HLA-Е. Напротив, эффекторные клетки YTS, у которых отсутствует CD94/NKG2A, эффективно убивают обе линии клеток. Таким образом, эффекторные NK-клетки убивают менее эффективно клетки HLA-E-положительные LCL 721.221-Cw3 по причине индуцированного HLA-E ингибиторной сигнализации через рецептор CD94/NKG2A. В случае, когда NK-клетки предварительно инкубируются с блокирующими анти-CD94/NKG2A антителами согласно настоящему изобретению при проведении подобного анализа цитотоксичности на основе высвобождения ⁵¹Cr, клетки LCL 721.221-Cw3, экспрессирующие HLA-Е, более эффективно уничтожаются в дозозависимой от концентрации антитела манере. Ингибиторная активность (то есть усиливающий цитотоксичность потенциал) анти-NKG2A антитела также может быть оценена любым способом из целого ряда других способов, например, по его воздействию на внутриклеточный свободный кальций, как описано, например в публикации Sivori et al., J. Exp. Med. 1997;186:1129-1136, описание которой включено в настоящую заявку посредством ссылки. Активация цитотоксичности NK-клеток можно оценить, например, по измерению повышения выработки цитокинов (например, выработке интерферона-γ (ИФН-γ) или маркеров цитотоксичности (например, мобилизация CD107 или CD137). В приводимом в качестве примера протоколе выработку ИФН-γ мононуклеарными клетками периферической крови (МКПК) оценивают окрашиванием клеточной поверхности и внутриклеточной цитоплазмы и анализа проточной цитометрией после 4 дней культивирования. Вкратце, добавляют брефелдин А (Sigma Aldrich) до конечной концентрации 5 мкг/мл в течение последних 4 часов культивирования. Клетки затем инкубируют с анти-CD3 и анти-CD56 МАТ перед пермебиализацией (IntraPrep™; Beckman Coulter) и окрашиванием с помощью РЕ-анти-ИФН-γ или PE-IgG1 (Pharmingen), меченными R-фикоэритрином (РЕ). Выработку гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) и ИФН-γ поликлональными активированными NK-клетками измеряют в супернатантах с использованием твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) (ГМ-КСФ: DuoSet Elisa, R&D Systems, Миннеаполис, штат Миннесота, ИФН-γ: набор OptElA, Pharmingen).

Во всех случаях, когда в рамках настоящего описания изобретения упоминается термин «лечение ПКГШ» или тому подобное в отношении анти-NKG2A связывающего средства (например, антитела), это означает: (а) способ лечения ПКГШ, указанный способ, включающий этап введения (для по меньшей мере одного курса лечения) анти-NKG2A связывающего средства (предпочтительно в материале фармацевтически приемлемого носителя) индивидууму, млекопитающему, особенно человеку, который нуждается в подобном лечении, в дозе, которая позволяет осуществлять лечение ПКГШ (терапевтически эффективное количество), предпочтительно в дозе (количестве), как указано в настоящей заявке; (b) применение анти-NKG2A связывающего средства для лечения ПКГШ или анти-NKG2A связывающее средство для применения в указанном лечении (особенно у человека); (с) применение анти-NKG2A связывающего для получения лекарственного средства для лечения ПКГШ, способ применения анти-NKG2A связывающего для получения лекарственного средства для лечения ПКГШ, включающий смешивание анти-NKG2A связывающего средства с фармацевтически приемлемым носителем, или лекарственное средство, включающее эффективную дозу анти-NKG2A связывающего средства, которая подходит для лечения ПКГШ; или (d) любую комбинацию а), b) и с) в соответствии с предметом изобретения, который является патентоспособным в стране, где данная заявка подана.

Термин «биопсия», используемый в настоящей заявке, определяется как удаление ткани с целью исследования, такого как установление диагноза. Примеры типов биопсии включают путем применения аспирации, например, через иглу, присоединенную к шприцу; путем инструментального удаления фрагмента ткани; путем удаления с помощью подходящих инструментов через эндоскоп; путем удаления хирургическим путем, например, целого очага поражения, и тому подобное.

Термин «антитело», используемый в настоящей заявке, относится к поликлональным и моноклональным антителам. В зависимости от типа константного домена в тяжелых цепях антителам присваивают один из пяти основных классов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. Несколько из них дополнительно делятся на подклассы или изотипы, такие как IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 и тому подобное. Приводимая в качестве примера иммуноглобулиновая (принадлежащая антителу) структурная единица включает тетрамер. Каждый тетрамер состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, каждая пара имеет одну «легкую» (около 25 кДа) и одну «тяжелую» цепь (около 50-70 кДа). N-конец каждой цепи определяет вариабельный участок из приблизительно 100-110 или более аминокислот, который главным образом ответственен за распознавание антигенов. Термины «вариабельная легкая цепь (V_L)» и «вариабельная тяжелая цепь (V_H)» относятся соответственно к этим легкой и тяжелой цепям. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам иммуноглобулинов, обозначаются соответственно «альфа», «дельта», «эпсилон», «гамма» и «мю». Строение подклассов и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны. IgG являются примером классов антител, применяемых в настоящей заявке, потому что они самые распространенные антитела при нормальной физиологической ситуации и потому что их проще всего получить в лабораторных условиях. Необязательно антитело представляет собой моноклональное антитело. Конкретные примеры антител представляют собой гуманизированные, химерные, человеческие или другие подходящие для человека антитела. Термин «антитела» также включает любой фрагмент или производное любого из антител.

Термин «специфически связывается с» означает, что антитело может предпочтительно связываться в анализе конкурентного связывания с партнером по связыванию, например NKG2A, как оценено с использованием либо рекомбинантных форм белков, эпитопов на них или нативных белков, представленных на поверхности выделенных клеток-мишеней. Анализы конкурентного связывания и другие способы определения специфического связывания хорошо известны в данной области техники. Например, связывание можно определить с помощью радиометок, физических способов, таких как масс-спектрометрия, или прямых или непрямых флуоресцентных меток, детектируемых с использованием, например, цитофлуориметрического анализа (например, системы FACScan). Связывание выше количества, наблюдаемого в случае с контрольным неспецифическим агентом, указывает, что средство связывается с мишенью. Средство, которое специфически связывает NKG2A, может связывать только NKG2A или NKG2A в виде димера с CD94.

В случае, когда говорится, что антитело «конкурирует с» конкретным моноклональным антителом, это означает, что антитело конкурирует с моноклональным антителом в анализе связывания с использованием либо рекомбинантных молекул (например, NKG2A) или экспрессируемых на поверхности молекул (например, NKG2A). Например, если исследуемое антитело уменьшает связывание антитела, имеющего тяжелую цепь любой последовательности из последовательностей SEQ ID NO: 2 и легкую цепь последовательности SEQ ID NO: 7, с полипептидом NKG2A или клеткой, экспрессирующей NKG2A, в ходе анализа связывания, говорят, что данное антитело «конкурирует», соответственно, с таким антителом.

Термин «аффинность», используемый в настоящей заявке, означает силу связывания антитела с эпитопом. Аффинность антитела задается константой диссоциации Kd, определяемой как [AT]×[АГ]/[АТ-АГ], где [АТ-АГ] - это молярная концентрация комплекса антитело-антиген, [AT] - молярная концентрация несвязанного антитела и [АГ] - молярная концентрация несвязанного антигена. Константа аффинности К_а определяется как 1/Kd. Способы определения аффинности МАТ можно найти в Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988), Coligan et al, eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993) и Muller, Meth. Enzymol. 92:589-601 (1983), описания которых полностью включены в настоящую заявку посредством ссылки. Один стандартный способ определения аффинности МАТ, хорошо известный в данной области техники, представляет собой применение скрининга с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SPR) (например, анализ с помощью аналитического устройства для SPR BIAcore™).

В контексте настоящей заявки термин «детерминанта» обозначает сайт взаимодействия или связывания на полипептиде.

Термин «эпитоп» относится к антигенной детерминанте и представляет собой область или участок на антигене, с которым связывается антитело. Эпитоп белка может содержать аминокислотные остатки, напрямую участвующие в связывании, а также аминокислотные остатки, которые эффективно блокируются специфическими антигенсвязывающим антителом или пептидом, то есть аминокислотные остатки внутри «футпринта» антитела (области узнавания антитела). Это является самой простой формой или самой малой структурной областью на сложной молекуле антигена, которая может объединяться с, например, антителом или рецептором. Эпитопы могут быть линейными или конформационными/структурными. Термин «линейный эпитоп» определяется как эпитоп, состоящий из аминокислотных остатков, которые являются непрерывными на линейной последовательности аминокислот (первичная структура). Термин «конформационный или структурный эпитоп» определяется как эпитоп, состоящий из аминокислотных остатков, не все их которых являются непрерывными, и, таким образом представляет собой отдельные части линейной последовательности аминокислот, которые сближены друг с другом посредством фолдинга молекулы (вторичная, третичная и/или четвертичная структуры). Конформационный эпитоп зависит от 3-мерной структуры. Таким образом, термин «конформационный» часто используется взаимозаменяемо с термином «структурный».

Термин «средство», используемый в настоящей заявке, для обозначения химического соединения, смеси химических соединений, биологической макромолекулы или экстракта, полученного из биологических материалов. Термин «лекарственное средство» относится к средству, которое имеет биологическую активность.

Для целей настоящей заявки термин «гуманизированное» или «человеческое» антитело относится к антителу, в котором константный и вариабельный каркасный участок одного или более иммуноглобулинов человека гибридизирован со связывающим участком, например, CDR, иммуноглобулина животного. Такие антитела разрабатывают для поддержания специфичности связывания нечеловеческих антител, из которых получены связывающие участки, но с целью избежать иммунной реакции против нечеловеческого антитела. Такие антитела можно получить из трансгенных мышей или других животных, которые были «сконструированы» для получения специфических антител человека в ответ на провокацию антигеном (см., например, Green et al. (1994) Nature Genet 7:13; Lonberg et al. (1994) Nature 368:856; Taylor et al. (1994) Int Immun 6:579, принципы которых полностью включены в настоящую заявку посредством ссылки). Полностью человеческое антитело также может быть сконструировано с помощью способов генной или хромосомной трансфекции, а также технологии фагового дисплея, все из них известны в данной области техники (см., например, McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-553). Антитела человека также можно получить с помощью активированных in vitro В-клеток (см., например, патент США №№5567610 и 5229275, которые полностью включены посредством ссылки).

«Химерное антитело» представляет собой молекулу антитела, в которой (а) константная область или ее часть изменена, заменена или поменяна местами, так что антигенсвязывающий участок (вариабельная область) связан с константной областью другого или измененного класса антитела, эффекторной функции и/или вида или с совершенно другой молекулой, которая придает химерному антителу новые свойства, например, ферментом, токсином, гормоном, фактором роста, лекарственным средством и т.д.; или (с) вариабельная область или ее часть изменена, заменена или поменяна местами с вариабельной областью, имеющей другую или измененную антигенную специфичность.

Термины «Fc-домен», «Fc-часть» и «Fc-область» относятся к С-концевому фрагменту тяжелой цепи антитела, например, от приблизительно 230 аминокислот (ак) до приблизительно 450 аминокислот тяжелой цепи γ (гамма) человека или к его аналогичной последовательности в других типах тяжелых цепей антител (например, α, δ, ε и μ для антител человека), или к встречающимся в природе их аллотипам. Если не указано иначе, в настоящем описании изобретения используется общепринятая нумерация аминокислотных остатков для иммуноглобулинов по Кабату (см. Kabat et al. (1991) Sequences of Protein of Immunological Interest, 5th ed., United States Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD).

Термины «выделенный», «очищенный» или «биологически чистый» относятся к материалу, который по существу свободен от компонентов, которые в норме сопутствуют ему, как обнаружено для его естественного состояния. Чистота и гомогенность, как правило, определяют с использованием аналитических химических способов, таких как электрофорез в полиакриламидном геле или высокоэффективная жидкостная хроматография. Белок, который является преимущественным видом, представленным в лекарственном средстве, по существу очищен.

Термины «полипептид», «пептид» и «белок» используются взаимозаменяемо в настоящей заявке для обозначения полимера из аминокислотных остатков. Термины относятся к аминокислотным полимерам, в которых один или более аминокислотный остаток представляют собой искусственный химический миметик соответствующей встречающейся в природе аминокислоты, а также к встречающимся в природе аминокислотным полимерами и не встречающимся в природе аминокислотным полимерам.

Термин «рекомбинантный» в случаях, когда используется со ссылкой, например, на клетку, или нуклеиновую кислоту, или вектор, указывает, что клетка, нуклеиновая кислота, белок или вектор были изменены путем введения гетерологичной нуклеиновой кислоты или белка или путем изменения нативной нуклеиновой кислоты или белка, или что клетка получена от клетки, модифицированной таким образом. Таким образом, например, рекомбинантные клетки экспрессируют гены, которые не обнаруживаются внутри природных (нерекомбинантных) форм клетки или экспрессируют природные гены, которые в ином случае экспрессируются при патологии, экспрессируются на низком уровне или не экспрессируются вовсе.

В контексте настоящей заявки антитело, которое «связывает» полипептид или эпитоп, обозначает антитело, которое связывает указанную детерминанту со специфичностью и/или аффинностью.

Термин «идентичность» или «идентичный» при использовании при описании отношения между последовательностями двух или более полипептидов, относится к степени родства между полипептидами, как определяется по числу совпадений между нитями двух или более аминокислотных остатков. «Идентичность» измеряет процент идентичных совпадений между меньшими из двух или более последовательностей с выравниванием гапов (если есть), определяемая с помощью конкретной математической модели или компьютерной программы (то есть «алгоритмов»). Идентичность родственных полипептидов можно легко вычислить с помощью известных способов. Подобные способы включают способы, описанные в Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; и Carillo et al., SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988), но не ограничиваются ими.

Способы определения идентичности разработаны для получения самого большого совпадения между исследуемыми последовательностями. Способы определения идентичности описаны в общедоступных компьютерных программах. Способы с использованием компьютерных программ для определения идентичности между двумя последовательностями включают программный пакет GCG, включающий алгоритмы GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res. 12, 387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN, и FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990)). Программа BLASTX общедоступна из Национального центра биотехнологической информации (NCBI) и в других источниках (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al, ранее). Хорошо известный алгоритм Смита-Ватермана также можно использовать для определения идентичности.

Получение антител

Анти-NKG2A средство связывается с внеклеточной частью рецептора CD94/NKG2A человека и снижает ингибиторную активность рецептора CD94/NKG2A человека, экспрессируемого на поверхности CD94/NKG2А-положительного лимфоцита. В одном из вариантов реализации средство конкурирует с HLA-Е за связывание с CD94/NKG2A, то есть средство блокирует взаимодействие между CD94/NKG2A и его лигандом HLA-Е. В другом варианте реализации средство не конкурирует с HLA-Е за связывание с CD94/NKG2A; то есть средство способно связывать CD94/NKG2A одновременно с HLA-Е. Данное антитело может связывать комбинированный эпитоп на CD94 и NKG2A или эпитоп только на NKG2A. В одном из вариантов реализации антитело связывает эпитоп на NKG2A, который по меньшей мере частично перекрывается с сайтом связывания HLA-E.

В одном аспекте анти-NKG2A средство представляет собой антитело, выбранное из полностью человеческого антитела, гуманизированного антитела и химерного антитела. В одном аспекте средство включает константный домен, полученный из антитела человека, являющегося IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. В одном аспекте средство представляет собой фрагмент антитела, выбранный из антитела, являющегося IgA, IgD, IgG, IgE и IgM. В одном аспекте средство представляет собой фрагмент антитела, выбранный из Fab-фрагмента, Fab'-фрагмента, Fab'-SH-фрагмента, F(ab)2-фрагмента, F(аb')2-фрагмента, Fv-фрагмента, тяжелой цепи иммуноглобулина (Ig) (Ig ламы или верблюда), V_HH-фрагмента, одиночного FV-домена и одноцепочечного фрагмента антитела. В одном аспекте средство представляет собой синтетическую или полусинтетическую полученную из антитела молекулу, выбранную из одноцепочечного FV-фрагмента (scFV), двухцепочечного FV-фрагмента (dsFV), миниантитела, диатела, триатела, каппа-тела, антитела IgNAR; и мультиспецифичного антитела.

Предпочтительно, анти-NKG2A антитела не демонстрируют существенное специфичное связывание с Fcγ-рецепторами, например, CD 16. Такие антитела могут содержать константные области различных тяжелых цепей, которые известно, что не связываются с Fc-рецепторами. Одним из таких примеров является константная область IgG4. Альтернативно, фрагменты антител, которые не содержат константные области, такие как фрагменты Fab или F(ab')2, можно использовать, чтобы избежать связывания с Fc-рецепторами. Связывание с Fc-рецепторами можно оценить в соответствии со способами, известными в данной области техники, включая, например, исследование связывания антитела с белком Fc-рецептора в анализе с использованием BIACORE. Также можно использовать любой тип антитела человека (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), у которого была изменена Fc-часть для минимизации или элиминации связывания с Fc-рецепторами (см., например, патент WO 03101485, описание которого включено в настоящую заявку посредством ссылки). Анализы, такие как, например, анализ на основе клеток, для оценки связывания с Fc-рецептором, хорошо известны в данной области техники и описаны, например, в WO 03101485.

Таким образом, настоящее описание изобретения затрагивает антитела или другие средства, связывающиеся с NKG2A. В одном аспекте антитело связывается с NKG2A с константой диссоциации KD по меньшей мере в 100 раз ниже, чем для NKG2C и/или NKG2E человека.

В одном аспекте настоящего описания средство снижает опосредованное CD94/NKG2A ингибирование лимфоцита, экспрессирующего CD94/NKG2A, вмешиваясь в сигнальный путь CD94/NKG2A путем, например, создания помех связыванию HLA-E рецептором NKG2A, предотвращая или индуцируя конформационные изменения в рецепторе CD94/NKG2A и/или воздействуя на димеризацию и/или образование кластеров рецептора CD94/NKG2A.

В одном аспекте настоящего описания средство связывается с внеклеточной частью NKG2A с KD по меньшей мере в 100 раз ниже, чем для NKG2C. В дополнительном предпочтительном аспекте средство связывается с внеклеточной частью NKG2A с KD по меньшей мере в 150, 200, 300, 400 или 10000 раз меньше, чем для NKG2C. В другом аспекте настоящего изобретения средство связывается с внеклеточной частью NKG2A с KD по меньшей мере в 100 раз меньше, чем для молекул NKG2C, NKG2E и/или NKG2H. В дополнительном предпочтительном аспекте средство связывается с внеклеточной частью NKG2A с KD по меньшей мере в 150, 200, 300, 400 или 10000 раз меньше, чем для молекул NKG2C, NKG2C и/или NKG2H. Это можно измерить, например, в опытах с использованием BiaCore, в которых способность средств связываться с внеклеточной частью иммобилизованного рецептора CD94/NKG2A (например, очищенного из клеток, экспрессирующих CD94/NKG2, или полученного в биосистеме) измеряют и сравнивают со связыванием средств с полученным сходным образом рецептором CD94/NKG2C и/или другими вариантами CD94/NKG2 в том же анализе. Альтернативно, связывание средств с клетками, которые естественно экспрессируют или сверхэкспрессируют (например, после транзиентной или стабильной трансфекции) CD94/NKG2A, можно измерить и сравнить со связыванием клеток, экспрессирующих CD94/NKG2C и/или другие варианты CD94/NKG2. Анти-NKG2A антитела могут необязательно связывать NKG2B, который представляет собой сплайс-вариант NKG2A, образующий ингибиторный рецептор вместе с CD94. В одном из вариантов реализации аффинность можно измерить с использованием способов, описанных в патенте США №8206709, например, путем оценки связывания с ковалентно иммобилизованным гибридным белком NKG2A-CD94-Fc с помощью Biacore, как показано в примере 8 патента США №8206709, описание которого включено в настоящую заявку посредством ссылки.

Антитело может, например, иметь 50% эффективную концентрацию (EC₅₀) по связыванию (высокая аффинность) с клетками, экспрессирующими NKG2A, составляющую от 0,5 до 10 нг/мл, необязательно от 1 до 5 нг/мл, необязательно от 1 до 10 нг/мл, необязательно от 1 до 20 нг/мл, например, приблизительно 4 нг/мл. Клетки, экспрессирующие NKG2A, могут, например, представлять собой клетки, экспрессирующие NKG2A, в МКПК человека. В одном из вариантов реализации клетки, экспрессирующие NKG2A, представляют собой клетки, полученные для экспрессирования CD94/NKG2A, например, клетки линии Ba/F3, стабильно сверхэкспрессирующие CD94/NKG2A, как показано в примере 13 патента США №8206709, описание которого включено посредством ссылки. В одном из вариантов реализации антитело имеет аффинность связывания (K_D), необязательно при этом аффинность связывания является бивалентной, к полипептиду NKG2A человека, равную менее 10^-9 М, необязательно менее 10^-10 М или необязательно менее 10^-11 М, необязательно от 10^-10 М и 10^-12 М, необязательно от 10^-10 М до 10^-11 М. Аффинность можно оценить, например, по связыванию с одноцепочечной конструкции NKG2A-CD94-mFc, как описано в патенте США №7932055, описание которого включено посредством ссылки).

Анти-NKG2A антитело может представлять собой человеческое или гуманизированное антитело, например, содержащее соответствующие VH- и VL-области антитела, показанные в таблице ниже.

Анти-NKG2A антитело может представлять собой человеческое или гуманизированное антитело, например, содержащее акцепторную каркасную последовательность VH-области человека из акцепторной последовательности человека, выбранной из, например, VH1_18, VH5_a, VH5_51, VH1_f и VH1_46, и J-сегмент JH6, или другую каркасную последовательность VH-области зародышевой линии человека, известную в данной области техники. Акцепторная последовательность VL-области человека может представлять собой, например, VKI_02/JK4.

В одном из вариантов реализации антитело представляет собой гуманизированное антитело на основе антитела Z270. Различные гуманизированные цепи Z270VH показаны в последовательностях SEQ ID NO: 2-6 (аминокислоты домена вариабельной области подчеркнуты). Гуманизированная легкая цепь Z270VH показана в последовательности SEQ ID NO: 7. Антитело HumZ270 также описано в патенте США №8206709 (описание которого включено в настоящую заявку посредством ссылки). Основой HumZ270VH6 (SEQ ID NO: 3) является VH5_51; основой HumZ270VH1 (SEQ ID NO: 2) является VH1_18; основой humZ270VH5 (SEQ ID NO: 4) является VH5_a; основой humZ270VH7 (SEQ ID NO: 5) является VH1_f; и основой humZ270VH8 (SEQ ID NO: 6) является VH1_46; все они имеют J-сегмент JH6. Каждое из этих антител сохраняет высокую аффинность связывания с NKG2A, с низкой вероятность возникновения иммунного ответа на данное антитело у человека, так как 6 С-концевых аминокислотных остатка участка CDR-H2 по Кабату каждой из гуманизированных конструкций идентичны акцепторным каркасным последовательностям человека. Используя программу для выравнивания VectorNTI, были получены следующие значения идентичности между humZ270VHl и humZ270VH5, -6, -7 и -8: 78,2% (VH1 в сравнении с VH5), 79,0% (VH1 в сравнении с VH6), 88,7% (VH1 в сравнении с VH7) и 96,0% (VH1 в сравнении с VH8).

В одном аспекте средство включает (i) вариабельную область тяжелой цепи любой последовательности из последовательностей SEQ ID NO: 2-6 или аминокислотную последовательность по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичную им, и (ii) вариабельную область легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 7, или аминокислотную последовательность по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 80%), 90%, 95%), 98%о или 99% идентичную ей. В одном аспекте средство содержит (i) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность любой последовательности из последовательностей SEQ ID NO: 2-6 или аминокислотную последовательность по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичную им, и (ii) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 или аминокислотную последовательность по меньшей мере на 50%, 60%), 70%, 80%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичную ей. Антитело, имеющее тяжелую цепь, содержащую последовательность из любой последовательности SEQ ID NO: 2-6, и легкую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 7, нейтрализует ингибиторную активность NKG2A, но по существу не связывает активирующие рецепторы NKG2C, NKGE или NKG2H. Кроме того, данное антитело, конкурирует с HLA-Е за связывание с NKG2A на поверхности клетки. В одном аспекте средство содержит последовательности HCDR1, HCDR2 и/или HCDR3, полученные из тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность любой последовательности из последовательностей SEQ ID NO: 2-6. В одном аспекте настоящего изобретения средство содержит последовательности LCDR1, LCDR2 и/или LCDR3, полученные из легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7.

Тяжелые цепи (вариабельные области подчеркнуты)

VH1:

VH6:

VH5:

VH7:

VH8:

Легкая цепь

В одном аспекте анти-NKG2A антитело представляет собой антитело, содержащее участок CDR-H1, соответствующий остаткам 31-35 любой последовательности из последовательностей SEQ ID NO: 2-6 (аминокислотная последовательность SYWMN (SEQ ID NO: 8)), участок CDR-H2, соответствующий остаткам 50-60 (аминокислотная последовательность RIDPYDSETHY (SEQ ID NO: 9)) (необязательно остаткам 50-66 при включении 6 концевых аминокислот человека, то есть последовательность RIDPYDSETHYSPSFQG (SEQ ID NO: 10) для тяжелой цепи VH6, последовательность RIDPYDSETHYAQKLQG (SEQ ID NO: 11) для тяжелой цепи VH1 и т.д.) любой последовательности из последовательностей SEQ ID NO: 2-6, и участок CDR-H3, соответствующий остаткам 99-114 (95-102 по Кабату) любой последовательности из последовательностей SEQ ID NO: 2-6 (аминокислотная последовательность GGYDFDVGTLYWFFDV (SEQ ID NO: 12)). В одном из вариантов реализации участок CDR-H2, соответствующий остаткам 50-66 любой последовательности из последовательностей SEQ ID NO: 2-6. Необязательно CDR может содержать один, два, три, четыре или более аминокислотных замен.

В одном аспекте анти-NKG2A антитело представляет собой антитело, содержащее участок CDR-L1, соответствующий остаткам 24-34 последовательности SEQ ID NO: 7 (аминокислотная последовательность RASENIYSYLA (SEQ ID NO: 13)), участок CDR-L2, соответствующий остаткам 50-56 последовательности SEQ ID NO: 7 (аминокислотная последовательность NAKTLAE (SEQ ID NO: 14)), и участок CDR-L3, соответствующий остаткам 89-97 последовательности SEQ ID NO: 7 (аминокислотная последовательность QHHYGTPRT (SEQ ID NO: 15)). Необязательно CDR может содержать один, два, три, четыре или более аминокислотных замен.

В одном аспекте анти-NKG2A антитело, содержащее участок CDR-H1, соответствующий остаткам 31-35 любой последовательности из последовательностей SEQ ID NO: 2-6, участок CDR-H2, соответствующий остаткам 50-60 (необязательно 50-66) любой последовательности из последовательностей SEQ ID NO: 2-6, и участок CDR-H3, соответствующий остаткам 99-114 (95-102 по Кабату) любой последовательности из последовательностей SEQ ID NO: 2-6, участок CDR-L1, соответствующий остаткам 24-34 последовательности SEQ ID NO: 7, участок CDR-L2, соответствующий остаткам 50-56 последовательности SEQ ID NO: 7 и участок CDR-L3, соответствующий остаткам 89-97 последовательности SEQ ID NO: 7.

В одном аспекте средство представляет собой полностью антитело человека, которое было выработано против эпитопа CD94/NKG2A, с которым связывается любое из упомянутых выше антител.

Следует понимать, что, хотя можно применять упомянутые выше антитела, можно получить и другие антитела. Например, любой фрагмент NKG2A, предпочтительно, но не исключительно NKG2A человека, или любую комбинацию фрагментов NKG2A можно использовать в качестве иммуногенов для выработки антител, и антитела могут распознавать эпитопы на любом месте в пределах полипептида NKG2A при условии, что они могут это делать на NK-клетках, экспрессирующих NKG2A, как описано в настоящей заявке. Более предпочтительно, эпитоп представляет собой эпитоп, специфически распознаваемый антителом, имеющим тяжелую цепь любой последовательности из последовательностей SEQ ID NO: 2-6 и легкую цепь последовательности SEQ ID NO: 7.

В одном аспекте средство содержит последовательности HCDR1, HCDR2 и/или HCDR3, полученные из VH-области, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16. В одном аспекте настоящего описания средство содержит последовательности LCDR1, LCDR2 и/или LCDR3, полученные из VL-области, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17. В одном аспекте средство содержит последовательности HCDR1, HCDR2 и/или HCDR3, полученные из VH-области, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, и последовательности LCDR1, LCDR2 и/или LCDR3, полученные из VL-области, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17. Антитело, имеющее тяжелую цепь последовательности SEQ ID NO: 16 и легкую цепь последовательности SEQ ID NO: 17, нейтрализует ингибиторную активность NKG2A, а также связывает активирующие рецепторы NKG2C, NKGE или NKG2H. Антитело не конкурирует с HLA-Е за связывание с NKG2A на поверхности клетки (т.е. оно является неконкурентным антагонистом NKG2A).

В одном аспекте средство содержит аминокислотные остатки 31-35, 50-60, 62, 64, 66 и 99-108 вариабельного тяжелого (V_H) домена (SEQ ID NO: 16) и аминокислотные остатки 24-33, 49-55 и 88-96 вариабельного легкого (V_L) домена (SEQ ID NO: 17) необязательно с одной, двумя, тремя, четырьмя или более аминокислотными заменами.

В одном аспекте средство представляет собой полностью антитело человека, которое было выработано против эпитопа CD94/NKG2A, с которым связывается любое из упомянутых выше антител.

Следует понимать, что, хотя можно применять упомянутые выше антитела, другие антитела могут распознавать и быть выработаны против любой части полипептида NKG2A при условии, что антитело вызывает нейтрализацию ингибиторной активности NKG2A. Например, любой фрагмент NKG2A, предпочтительно, но не исключительно NKG2A человека, или любую комбинацию фрагментов NKG2A можно использовать в качестве иммуногенов для выработки антител, и антитела могут распознавать эпитопы на любом месте в пределах полипептида NKG2A при условии, что они могут это делать на NK-клетках, экспрессирующих NKG2A, как описано в настоящей заявке. В одном из вариантов реализации эпитоп представляет собой эпитоп, специфически распознаваемый антителом, имеющим тяжелую цепь любой последовательности из последовательностей SEQ ID NO: 2-6 и легкую цепь последовательности SEQ ID NO: 7.

В одном аспекте средство конкурирует с антителом humZ270, описанном в патенте США №8206709 (описание которого включено в настоящую заявку посредством ссылки), за связывание с внеклеточной частью рецептора CD94/NKG2A человека. В одном аспекте средство конкурирует с гуманизированным антителом Z199, описанным в патенте США №8796427 (описание которого включено посредством ссылки в настоящую заявку), за связывание с внеклеточной частью рецептора CD94/NKG2A человека. Конкурентное связывание можно измерить, например, в экспериментах с использованием BiaCore, в которых измеряют способность средств связывать внеклеточную часть иммобилизованного рецептора CD94/NKG2A (например, очищенного из клеток, экспрессирующих CD94/NKG2A, или полученного в биосистеме), насыщенного humZ270. Альтернативно, измеряют связывание средств с клетками, которые либо естественно экспрессируют, либо сверхэкспрессируют (например, после транзиентной или стабильной трансфекции) рецептор CD94/NKG2A и которые предварительно инкубировали с насыщающими дозами Z270. В одном из вариантов реализации конкурентное связывание можно измерить с использованием способов, описанных в патенте США №8206709, например, путем оценки связывания с клетками линии Ba/F3-CD94-NKG2A с помощью проточной цитометрии, как показано в примере 15 патента США №8206709, описание которого включено в настоящую заявку посредством ссылки.

Лекарственные составы с антителами

Анти-NKG2A средство, такое как антитело, можно включить в фармацевтический состав, содержащий его в концентрации от 1 мг/мл до 500 мг/мл, где указанный состав имеет pH от 2,0 до 10,0. Данный состав может дополнительно содержать буферную системы, консервант(ы), регулятор(ы) тоничности, хелатирующий агент(ы), стабилизаторы и поверхностно-активные вещества. В одном из вариантов реализации фармацевтический состав представляет собой водный состав, то есть состав, содержащий воду. Подобный состав, как правило, представляет собой раствор или суспензию. В дополнительном варианте реализации фармацевтический состав представляет собой водный раствор. Термин «водный состав» определяется как раствор, содержащий по меньшей мере 50% воды по объему, и термин «водная суспензия» определяется как суспензия, содержащая по меньшей мере 50% воды по объему.

В другом варианте реализации лекарственная форма представляет собой лиофилизированную форму, к которой врач или пациент добавляет растворитель и/или разбавитель перед использованием.

В другом варианте реализации лекарственная форма представляет собой высушенную форму (например, лиофилизированную или высушенную распылением), готовую для использования без дополнительного растворения.

В дополнительном аспекте фармацевтический состав содержит водный раствор подобного антитела, буфера, при этом антитело присутствует в концентрации от 1 мг/мл или выше, и при этом указанный состав имеет pH от приблизительно 2,0 до приблизительно 10,0.

В другом варианте реализации pH состава находится в диапазоне, выбранном из списка, состоящего из от приблизительно 2,0 до приблизительно 10,0, от приблизительно 3,0 до приблизительно 9,0, от приблизительно 4,0 до приблизительно 8,5, от приблизительно 5,0 до приблизительно 8,0 и от приблизительно 5,5 до приблизительно 7,5.

В дополнительном варианте реализации буфер выбирают из группы, состоящей из натрия ацетата, натрия карбоната, цитрата, глицилглицина, гистидина, глицина, лизина, аргинина, дигидрофосфата натрия, двузамещенного гидрофосфата натрия, фосфата натрия и трис(гидроксиметил)аминометана, бицина, трицина, яблочной кислоты, сукцината, малеиновой кислоты, фумаровой кислоты, винной кислоты, аспарагиновой кислоты или их смесей.

В дополнительном варианте реализации состав дополнительно содержит фармацевтически приемлемый консервант. В дополнительном варианте реализации состав дополнительно содержит изотонический агент. В дополнительном варианте реализации состав дополнительно содержит хелатирующий агент. В дополнительном варианте реализации состав дополнительно содержит стабилизатор. В дополнительном варианте реализации состав дополнительно содержит поверхностно-активное вещество. Для удобства дается ссылка на Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19^th edition, 1995.

Вполне возможно присутствие других ингредиентов в пептидном фармацевтическом составе. Подобные дополнительные ингредиенты могут включать смачивающие средства, эмульгаторы, антиоксиданты, объемообразующие агенты, модификаторы тоничности, хелатирующие агенты, ионы металлов, масляные носители, белки (например, человеческий сывороточный альбумин, желатин или белки) и цвиттерионы (например, аминокислоту, такую как бетаин, таурин, аргинин, глицин, лизин и гистидин). Подобные дополнительные ингредиенты, конечно, не должны негативно влиять на общую стабильность фармацевтического состава.

Фармацевтические композиции, содержащие антитело, можно вводить пациенту, который нуждается в подобном лечении, в нескольких местах, например, местно, например, на кожу или слизистую оболочку, в местах, которые минуют абсорбцию, например, введение в артерию, в вену, в сердце, и в местах, которые включают абсорбцию, например, введение в кожу, под кожу, в мышцу или в брюшинную полость. Введение фармацевтических композиций может быть осуществлено несколькими способами введения, например, подкожно, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно, лингвально, сублингвально, буккально, в рот, перорально, в желудок и кишечник, назально, легочным путем, например, через бронхиолы и альвеолы или их комбинацию, эпидермально, дермально, трансдермально, вагинально, ректально, через глаз, например, через конъюнктиву, уретрально и парентерально пациентам, нуждающимся в таком лечении.

Подходящие составы с антителами можно определить путем изучения опыта с другими уже разработанными терапевтическими моноклональными антителами. Несколько моноклональных антител продемонстрировали эффективность в клинических случаях, такие как «Ритуксан» (ритуксимаб), «Герцептин» (трастузумаб), «Ксолар» (омализумаб), «Бексар» (тозитумомаб), «Кампат» (алемтузумаб), «Зевалин», «Онколим» и похожие составы можно использовать с антителами согласно описанию настоящего изобретения. Например, моноклональное антитело может поставляться в концентрации 10 мг/мл либо в 100 мг (10 мл), либо в 500 мг (50 мл) одноразовых флаконах в виде лекарственной формы для внутривенного (в/в) введения в составе 9,0 мг/мл натрия хлорида, 7,35 мг/мл натрия цитрата дигидрата, 0,7 мг/мл полисорбата 80 и стерильной воды для инъекций. Значение pH доводят до 6,5. В другом варианте реализации антитело поставляют в составе, содержащем 20 мМ Na цитрата, приблизительно 150 мМ NaCl при pH приблизительно 6,0.

Диагностика и лечение злокачественных опухолей

Описаны способы, пригодные для применения при диагностике, прогнозировании, осуществлении мониторинга, лечении и профилактике рака головы и шеи у индивидуума. ПКГШ представляет собой плоскоклеточную или базалоидную опухоль, которая начинается в области головы или шеи и включает опухоли носовой полости, синусов, губ, рта и оральной полости, слюнных желез, глотки и гортани. Анти-NKG2A средства могут быть особенно полезными, например, при лечении ротоглоточных опухолей, опухолей гортани, опухолей ротовой полости и опухолей гипофаринкса. Подобные опухоли рутинно идентифицируют практикующие врачи в области онкологии, такие как терапевты, медицинские онкологи, гистопатологи и онкологические клиницисты. Лечение ПКГШ также включает лечение ее предракового поражения. Предраковые поражения ПКГШ могут включать, например, дисплазию, гиперплазию, лейкоплакию, эритроплакию или волосатый язык.

Соединение (например, антитело), которое нейтрализует ингибиторную активность полипептида NKG2A человека, можно вводить индивидууму, имеющему рак головы и шеи, который не подвергался хирургическому вмешательству для удаления раковых клеток, или который в настоящий период не получал подобной хирургической операции. Однако следует понимать, что соединение также можно вводить пациенту, который получал или который перенес хирургическое вмешательство для удаления раковых клеток. Когда анти-NKG2A соединение вводят индивидууму, который не подвергался хирургическому вмешательству для удаления раковых клеток (например, для удаления клеток ПКГШ), соединение, связывающее NKG2A, можно, например, вводить за приблизительно 0-30 день перед хирургической операцией. В одном из вариантов реализации проводят по меньшей мере один (например, один, два, три, четыре или более) курс приема для лечения с помощью анти-NKG2A соединения перед хирургической операцией. В одном из вариантов реализации курс приема составляет от 2 недель до 8 недель.

Пациента с раком головы и шеи можно лечить анти-NKG2A средствами с или без предварительного этапа определения для оценки экспрессии HLA-Е на поверхности опухолевых клеток. Предпочтительно, способы лечения могут включать этап определения нуклеиновой кислоты или полипептида HLA-Е в биологическом образце опухоли (например, на опухолевой клетке), полученном от индивидуума. Определение, что биологический образец экспрессирует HLA-Е (например, заметно экспрессирует; экспрессирует HLA-Е на высоком уровне, с высокой интенсивностью окрашивания анти-HLA-E антителом по сравнению с контролем), указывает, что пациент имеет рак головы и шеи, который может получить значительный положительный эффект от лечения средством, который ингибирует NKG2A. В одном из вариантов реализации способ включает определение уровня экспрессии нуклеиновой кислоты или полипептида HLA-E в биологическом образце и сравнение этого уровня с контрольным уровнем (например, величиной, слабым окрашиванием клеточной поверхности и т.д.), соответствующим здоровому индивидууму или индивидууму, который не получает положительного эффекта от лечения средством, которое ингибирует NKG2A. Определение, что биологический образец экспрессирует нуклеиновую кислоту или полипептид HLA-Е на уровне, который повышен по сравнению с контрольным уровнем, указывает, что пациент имеет рак головы и шеи, который можно лечить с помощью средства, ингибирующего NKG2A. Необязательно, определение полипептида HLA-Е в биологическом образце включает определение полипептида HLA-Е, экспрессируемого на поверхности злокачественной опухолевой клетки ПКГШ. В одном из вариантов реализации определение, что биологический образце заметно экспрессирует нуклеиновую кислоту или полипептид HLA-Е, указывает, что пациент имеет рак головы и шеи, и его можно лечить с помощью средства, ингибирующего NKG2A. Термин «заметно экспрессирует» при указании на полипептид HLA-Е означает, что полипептид HLA-Е экспрессируется на существенном количестве опухолевых клеток, отобранных у данного пациента. Хотя определение термина «заметно экспрессируется» не связано с точной величиной в процентах, в некоторых примерах рецептор, указанный как «заметно экспрессируется», будет присутствовать на по меньшей мере 30%, 40%, 50°%, 60%, 70%), 80% или более клетках ПКГШ, отобранных от пациента.

Определение, имеет ли индивидуум клетки рака головы и шеи, которые экспрессируют полипептид HLA-Е, может, например, включать получение биологического образца (например, путем проведения биопсии) от индивидуума, который содержит клетки рака головы и шеи, приведение указанных клеток в контакт с антителом, которое связывает полипептид HLA-Е, и определение, экспрессируют ли клетки HLA-Е на своей поверхности. Необязательно определение, имеет ли индивидуум клетки рака головы и шеи, которые экспрессируют HLA-Е, включает проведение иммуногистохимического анализа. Необязательно определение, имеет ли индивидуум клетки рака головы и шеи, которые экспрессируют HLA-Е, включает проведение анализа проточной цитометрией.

Пациента с раком головы и шеи можно лечить с помощью анти-NKG2A средств с или без предварительного этапа определения для оценки, является ли пациент (или опухоль пациента) ВПЧ-положительной. В одном аспекте предложен способ прогнозирования, принесет ли пользу пациенту, имеющему опухоль, лечение с помощью анти-NKG2A средства. В одном из вариантов реализации способ включает определение, является ли пациент ВПЧ-положительным.

В одном из вариантов реализации этап определения, является ли индивидуум, имеющий ПКГШ, ВПЧ-положительным включает определение и идентификацию молекулы ВПЧ у субъекта, например, в образце от субъекта. В одном из вариантов реализации молекула ВПЧ представляет собой нуклеиновую кислоту ВПЧ или белок ВПЧ у субъекта, например, в образце. В некоторых вариантах реализации нуклеиновая кислота ВПЧ идентифицируют с помощью гибридизации in situ (ISH), полимеразной цепной реакции (ПЦР), нозерн-блоттинга или секвенирования нуклеиновых кислот в образце. Белок ВПЧ можно идентифицировать, например, иммуногистохимией (ИГХ), вестерн-блоттингом. В одном из вариантов реализации ВПЧ определяют ИГХ для определения белка р16 (кодируемого CDKN2A). Образец от субъекта может быть, например, образцом крови или сыворотки, или образцом мочи, или образцом ткани, таким как образец опухолевой ткани (например, в результате биопсии) или буккальным мазком. Образец может быть свежим или замороженным. В одном из вариантов реализации индивидуум, который является ВПЧ-положительным, является положительным в отношении ВПЧ типа 16 или необязательно типа ВПЧ 18, 31 и 33. Необязательно этап определения, является ли индивидуум, имеющий ПКГШ, ВПЧ-положительным, включает определение ВПЧ типа 16 и/или ВПЧ типа 18, 31 и/или 33.

В целом, можно использовать любую подходящую методологию анализа на ВПЧ. Примеры одобренных Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США (FDA) анализов на ВПЧ включают тест на ДНК ВПЧ Digene Hybrid Capture 2 High-Risk HPV DNA Test (Qiagen Corp), микропланшетный анализ in vitro, основанный на гибридизации нуклеиновой кислоты с амплификацированным сигналом, который использует хемилюминесценцию для качественного определения 18 типов ДНК вируса папилломы человека (ВПЧ) в цервикальных образцах. Другим примером являются тесты Cervista™ HPV от Third Wave Technologies. Другой примером является тест cobas HPV Test от Roche Molecular Systems, Inc., Калифорния. Дополнительным примером является анализ APTIMA® HPV Assay от Gen-Probe, Inc. Пациент, который является ВПЧ-положительным, может затем, например, отнесен к индивидууму, подходящему для лечения анти-NKG2A средством, или отнесен к индивидууму, отвечающему на лечение анти-NKG2A средством, и необязательно может дополнительно проходить лечение анти-NKG2A средством.

Необязательно, индивидуума оценивают на присутствие одного или более ПКГШ-ассоциированных генетических маркеров. ПКГШ-ассоциированный ген может иметь абберантную потерю функцию или приобретение функции в данном или ассоциированном генах. Анти-NKG2A средства могут быть полезными отдельно для мутаций в ПКГШ-ассоциированных генах и/или может быть полезным в усилении противоопухолевого ответа у индивидуумов, имеющих плохие прогнозы в отношении развития рака, например, на основе одного или более генетических маркеров. Таким образом, анти-NKG2A средства могут быть полезными для лечения пациента, имеющего (или не имеющего) ПКГШ с мутацией в ПКГШ-ассоциированном гене, например, гене, выбранном из группы, состоящей из киназы PI3 (PI3K), PIK3CA, PIK3CG, ТР63, CCND1, CCNE1, MYC, YAP1, HRAS, NOTCH 1, NOTCH 2, NOTCH 3, IRF6, CDKN2A, ТР53, CASP8, PTEN, FAT1, RIPK4, EZH1, EZH2, MED1, MLL2, CDH1, FBXW7, PCLO, RIMS2, RBI, NSD1, EP300 и NFE2L2. Приводимые в качестве примера абберантные получившие функцию гены ПКГШ могут включать ТР63, CCND1, CCNE1, MYC, YAP1, HRAS, PIK3CA, PIK3CG или NFE2L2. Приводимые в качестве примера абберантные потерявшие функцию гены ПКГШ NOTCH 1, NOTCH 2, NOTCH 3, IRF6, CDKN2A, ТР53, CASP8, PTEN, FAT1, RIPK4, EZH1, EZH2, MED1, MLL2, CDH1, FBXW7, PCLO, RIMS2, RBI, NSD1 или EP300. ПКГШ-ассоциированные гены также описаны в публикации Stransky et al., "The Mutational Landscape of Head and Neck Squamous Cell Carcinoma", Science, Vol 333, 26 August 2011, содержание которой полностью включено в настоящую заявку.

В одном приводимом в качестве примера аспекте предложен способ уменьшения прогрессирования ПКГШ у млекопитающего (например, человека), имеющего выявляемый уровень опухолевых клеток, включающий введение анти-NKG2A средства (например, анти-NKG2A антитела), композиции анти-NKG2A антитела или родственной композиции (например, нуклеиновой кислоты, кодирующей анти-NKG2A антитело) в количестве, достаточном для выявляемого снижения прогрессирования ПКГШ у пациента.

Подходящие протоколы лечения для лечения человека, имеющего рак, включают, например, введение пациенту эффективного количества антитела, которое нейтрализует ингибиторную активность NKG2A человека, при этом способ включает по меньшей мере один курс приема, в котором по меньшей мере одну дозу анти-NKG2A антитела вводят в дозе 1-10 мг/кг массы тела. В одном из вариантов реализации курс приема составляет от 2 недель до 8 недель.

В одном из вариантов реализации анти-NKG2A вводят в количестве, эффективном для насыщения рецепторов NKG2A на лимфоцитах в течение по меньшей мере одной недели, двух недель, трех недель или четырех недель. В определенных вариантах реализации дозу (например, каждую дозу) анти-NKG2A антитела вводят в количестве приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 мг/кг.

В одном аспекте любого из вариантов реализации в настоящей заявке анти-NKG2A антитело вводят один раз приблизительно каждые две или четыре недели.

Доставка анти-NKG2A антител субъекту (либо путем прямого введения или экспрессии из нуклеиновой кислоты внутри организма, например, с вектора для переноса генов на основе вируса оспы, содержащего последовательность (последовательности) нуклеиновой кислоты, кодирующей анти-NKG2A) и применения на практике других способов согласно настоящей заявке можно использовать для уменьшения, лечения, предотвращения или иного уменьшения интенсивности любого подходящего аспекта прогрессирования рака (а именно прогрессирования ПКГШ). Способы могут быть особенно полезными в снижении и/или уменьшении интенсивности роста опухоли (например, процента (количество опухолевых клеток по сравнению со здоровыми Т-клетками), числа опухолевых клеток в кровотоке) и любого параметра или симптома, связанного с этим (например, биомаркеров). Способы, которые снижают, предотвращают или иным способом уменьшают интенсивность подобных аспектов прогрессирования рака, индивидуально или коллективно, представляют собой дающие преимущество признаки.

В другом аспекте предложен способ уменьшения риска прогрессирования рака, снижения риска дальнейшего прогрессирования рака в популяции клеток, которые прошли инициацию, и/или обеспечения схемы лечения для уменьшения прогрессирования рака у человека, который включает применение у пациента одной или более терапий первой линии (например, индукционной терапии, такой как химиотерапевтическое средство) в количестве и по схеме, достаточной для достижения ответа (частичного или полного ответа), а затем введения количества анти-NKG2A антитела или родственного соединения (или применения комбинированного способа введения) пациенту.

В дополнительном аспекте предложен способ стимулирования ремиссии ПКГШ у млекопитающего, например, человека, включающий введение композиции, содержащей анти-NKG2A антитело пациенту с целью индуцировать ремиссию ПКГШ у него.

В еще одном дополнительном аспекте предложен способ уменьшения риска развития ПКГШ, уменьшения времени до дебюта ракового состояния и/или уменьшения тяжести ПКГШ, диагностированного на ранних стадиях, включающий введения пациенту профилактического эффективного количества анти-NKG2A антитела или родственного соединения с целью достижения требуемого физиологического эффекта(ов).

В дополнительном аспекте предложен способ увеличения вероятности выживаемости в течение соответствующего периода у человека, у которого диагностировали ПКГШ. В другом аспекте предложен способ улучшения качества жизни ПКГШ пациента, включающий введение пациенту композиции в количестве, эффективном для улучшения качества его жизни. В дополнительном аспекте способы, описанные в настоящей заявке, можно применять для значительного уменьшения числа ПКГШ клеток у позвоночного, такого как, например, уменьшение общего числа клеток ПКГШ. Близко к этому предложен способ уничтожения (например, либо прямое, либо косвенное приведение к смерти) клеток ПКГШ у позвоночного, такого как раковый пациент, являющийся человеком.

Анти-NKG2A средство (например, анти-NKG2A антитело) можно вводить в качестве монотерапии или в составе дополнительного или комбинированного применения (совместное введение) со вторым лекарственным средством. Дополнительное или комбинированное введение включает одновременное введение соединений в одинаковых или разных лекарственных формах или раздельное введение соединений (например, последовательное введение). Таким образом, анти-NKG2A средство и второе лекарственное средство можно одновременно вводить в составе одной формы. Альтернативно, анти-NKG2A средство и второе лекарственное средство могут иметь лекарственные формы для раздельного введения, и вводится параллельно или последовательно. Второе лекарственное средство в норме будет вводиться в количествах и по схемам лечения, как правило, применяемым для этого средства при монотерапии конкретного заболевания или состояния, подвергающегося лечению.

В одном из вариантов реализации второе лекарственное средство представляет собой антитело, которое способно опосредовать ADCC (например, связываться через Fc-домен с одним или более Fcγ-рецептором человека, например, CD16). В одном из вариантов реализации антитело содержит один или более антигенсвязывающих доменов (например, пары VH-VL), которые связываются с полипептидом, экспрессируемым опухолевой клеткой, и с Fc-доменом, который связывает через Fc-домен с одним или более Fcγ-рецептором человека, например, CD16. В одном из вариантов реализации антитело, которое опосредует ADCC, вводят в эффективном количестве, вызывающим антителозависимую клеточную цитотоксичность в отношении опухолевых клеток у пациента (in vivo), которые экспрессируют полипептид, являющийся мишенью второго противоопухолевого средства.

В одном из примеров второе лекарственно средство представляет собой средство, которое связывает и/или ингибирует эпидермальный фактор роста (EGFR).

В одном из вариантов реализации используемое анти-EGFR антитело представляет собой антитело, описанное в WO 2006/082515 и WO 2008/017963, WO 2002/100348, WO 2004/056847, WO 2005/056606, WO 2005/012479, WO 2005/10151, патенте США №6794494, ЕР 1454917, WO 2003/14159, WO 2002/092771, WO 2003/12072, WO 2002/066058, WO 2001/88138, WO 98/50433, WO 98/36074, WO 96/40210, WO 96/27010, US 2002065398, WO 95/20045, ЕР 586002, патенте США №5459061 или патенте США №4943533. Таким образом, средство, которое связывает и/или ингибирует, может быть анти-EGFR антителом, например, химерным антителом, антителом человека или гуманизированным антителом. Анти-EGFR антитело, применяемое в способе согласно настоящему описанию, может иметь любую подходящую аффинность и/или авидность для одного или более эпитопов, содержащихся в EGFR. Предпочтительно, используемое антитело связывается с EGFR человека с равновесной константой диссоциации (K_D) не более 10^-8 М, предпочтительно не более 10^-10 М. В одном из вариантов реализации анти-EGFR антитело содержит Fc-домен, который сохраняет способность связываться с Fcγ-рецептором (например, CD16). В одном из вариантов реализации анти-EGFR антитело содержит Fc-домен изотипа IgG1 или IgG3 человека.

Антитело с225 (цетуксимаб, «ЭРБИТУКС®») является примером анти-EGFR антитела; было показано, что цетуксимаб ингибирует опосредованный эпидермальным фактором роста (EGF) рост опухолевых клеток in vitro и ингибирует колоректальные опухоли человека in vivo, он получил зарегистрированное разрешение в 2003. Цитуксимаб представляет собой химерное (человек/мышь) моноклональное антитело, которое направлено против рецептора эпидермального фактора роста (EGFR). Известно, что другие анти-EGFR антитела, которые разделяют некоторые или все биологические активности цетуксимаба, такие как предотвращение связывания EGFR, предотвращение активации рецептора EGFR и блокирование нисходящей сигнализации по пути EGFR, что приводит к нарушению роста клеток. Другие примеры антител для применения согласно настоящему описанию включают залутумумаб (2F8, описан в WO 02/100348 и WO 04/056847), нимотузумаб (h-R3), панитумумаб (ABX-EGF) и матузумаб (EMD72000), антитела, имеющие участки CDR антитела крысы ICR62 (WO 2010/112413), неситумумаб (IMC-11F8, Eli Lilly) или вариант любого из этих антител или антитело, которое способно конкурировать с любым из этих антител, например, антитело, распознающее такой же эпитоп, как любое из этих антител. Конкуренция может быть определена с помощью подходящей методики. В одном из вариантов реализации конкуренцию определяют с помощью анализа ELISA. Часто конкуренция отмечена значительно более высокой величиной относительного ингибирования, чем 5%, 10% или 25%, как определено с помощью анализа ELISA.

Анти-EGFR антитело ил другое антитело, которое опосредует ADCC, также может быть получено предпочтительно с модификациями, которые увеличивают его способность связывать Fc-рецепторы, которые могут, например, влиять на эффекторные функции, такие как антителозависимая цитотоксичность, дегрануляция тучных клеток и фагоцитоз, а также иммуномодуляторные сигналы, такие как регуляция пролиферации лимфоцитов и секреция антител. Типичные модификации включают модифицированные константные области, включающие по меньшей мере одну аминокислотную модификацию (например, замену, делеции, вставки), и/или измененные типы гликозилирования, например, гипофукозилирование. Подобные модификации могут влиять на взаимодействие с Fc-рецепторами: FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) и FcγRIII (CD16). FcγRI (CD64), FcγRIIA (CD32A) и FcγRIII (CD16) представляют собой активирующие (то есть усиливающие иммунную систему) рецепторы, тогда как FcγRIIB (CD32B) представляет собой ингибирующий (то есть угнетающий иммунную систему) рецептор. Модификация может, например, увеличивать связывание Fc-домена с активирующим Fcγ-рецептором, например, FcγRIIIa, на эффекторных (например, NK-клетках) клетках или может снижать связывание Fc-домена с ингибирующим Fcγ-рецептором, например, FcγRIIB. Можно получить любую комбинацию модификаций Fc, например, любую комбинацию различных модификаций, описанную в патентах США №№7632497; 7521542; 7425619; 7416727; 7371826; 7355008; 7335742; 7332581; 7183387; 7122637; 6821505 и 6737056; в публикациях согласно РСТ №№WO2011/109400; WO 2008/105886; WO 2008/002933; WO 2007/021841; WO 2007/106707; WO 06/088494; WO 05/115452; WO 05/110474; WO 04/1032269; WO 00/42072; WO 06/088494; WO 07/024249; WO 05/047327; WO 04/099249 и WO 04/063351; и в Presta, L.G. et al. (2002) Biochem. Soc. Trans. 30(4):487-490; Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 26; 277(30):26733-26740 и Shields, R.L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276(9):6591-6604).

Анти-EGFR антитело или другие антитела, которые опосредуют ADCC, может содержать вариант Fc-области, при этом вариант Fc-области содержит по меньшей мере одну модификацию аминокислоты (например, обладает 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более модификациями аминокислот) по сравнению с Fc-областью дикого типа, так что молекула имеет улучшенную эффекторную функцию по сравнению с молекулой, содержащей Fc-область дикого типа, необязательно при этом вариант Fc-области содержит замену в любом одном или более положениях 221, 243, 247, 255, 256, 258, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 300, 301, 303, 305, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 316, 320, 322, 326, 329, 330, 332, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 359, 360, 370, 373, 376, 378, 392, 396, 399, 402, 404, 416, 419, 421, 430, 434, 435, 437, 438 и/или 439. В одном из вариантов реализации вариант Fc-области содержит замену в любом одном или более положениях 329, 298, 330, 332, 333 и/или 334 (например, замены S239D, S298A, A330L, I332E, Е333А и/или Л334А). Анти-EGFR антитела могут содержать вариант Fc-области, при этом вариант Fc-области содержит по меньшей мере одну модификацию аминокислоты (например, обладает 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более модификациями аминокислот) по сравнению с Fc-областью дикого типа, так что молекула имеет улучшенную эффекторную функцию по сравнению с молекулой, содержащей Fc-область дикого типа, необязательно при этом вариант Fc-области содержит замену в любом одном или более положениях 329, 298, 330, 332, 333 и/или 334 (замену например, S239D, S298A, A330L, I332E, Е333А и/или K334А).

В одном из вариантов реализации антитела, имеющие Fc-области дикого типа или варианты, могут иметь измененные профили гликозилирования, которые увеличивают способность антител связываться с Fc-рецептором. Подобные модификации углеводами могут быть получены, например, путем экспрессирования антитела в клетке-хозяине с измененным аппаратом гликозилирования. Клетки с измененным аппаратом гликозилирования описаны в данной области техники и могут быть использованы в качестве клеток-хозяев, в которых экспрессируют рекомбинантные антитела согласно настоящему описанию, тем самым получая антитело с измененным гликозилированием. См., например, Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-1, а также европейский патент №ЕР 1176195; публикации согласно РСТ WO 06/133148; WO 03/035835; WO 99/54342, каждый из этих документов полностью включен в настоящую заявку посредством ссылки. В целом, подобные антитела с измененным гликозилированием являются «гликооптимизированными», так что антитело имеет конкретную N-гликановую структуру, которая дает определенные требуемые свойства, включая (но не ограничиваются только ими) усиленную ADCC и связывающую активность в отношении рецепторов эффекторных клеток по сравнению с немодифицированными антителами или антителами, имеющими встречающуюся в природе константную область, и получены с помощью клеток NSO миеломы мыши и клеток яичника китайского хомячка (СНО) (Chu and Robinson, Current Opinion Biotechnol. 2001, 12: 180-7), клеток HEK293T, экспрессирующих антитела, или других клеточных линий млекопитающих, обычно используемых для получения рекомбинантных терапевтических антител.

Моноклональные антитела, получаемые в линиях клеток млекопитающих, содержат N-связанный сайт гликозилирования Asn297 на каждой тяжелой цепи. Гликаны на антителах, как правило, представлены сложными биразветленными структурами с очень низким содержанием или отсутствием N-ацетилглюкозамина в точках разветвления (GlcNAc в точках разветвления) и высокими уровнями фукозилирования кора. Концы гликанов содержат очень мало или не содержат концевые сиаловые кислоты и вариабельные количества галактозы. С целью обзора влияния гликозилирования на функцию антител, см., например, Wright & Morrison, Trend Biotechnol. 15:26-31(1997). Значительное количество работ показывает, что изменения композиции Сахаров в структуре гликанов антитела может изменять эффекторные функции Fc-домена. Полагают, что важными углеводными структурами, вносящими вклад в активность антитела, являются остатки фукозы, присоединенные через альфа-1,6-связь с самыми внутренними остатками N-ацетилглюкозамина (GlacNAc) Fc-области N-связанных олигосахаридов (Shields et al., 2002).

Как показывает опыт, антитела, получаемые в клетках СНО, составляющие приблизительно 2-6% от популяции, являются нефукозилированными. Клеточные линии YB2/0 (миелома крысы) и Lecl3 (мутант линии СНО по лектину, который содержит дефицитную ГДФ-маннозо-4,6-дегидратазу, приводящие к дефициту ГДФ-фукозы или промежуточных соединений ГДФ с сахарами, которые являются субстратами альфа-6-фукозилтрансферазы) по сообщениям продуцируют антитела с 78-98% нефукозилированными видами. В других примерах можно использовать способы РНК-интерференции (РНКи) или нокаута генов для конструирования клеток с целью либо снизить уровни мРНК-транскрипта FUT8, либо нокаутировать экспрессию гена полностью, и подобные антитела по сообщениям содержат до 70% нефукозилированного гликана.

Анти-EGFR антитело или другое антитело, которое опосредует ADCC, может, например, быть гликозилировано углеводной цепью в положении Asn297, указанное антитело, демонстрирующее повышенную аффинность связывания через свою Fc-часть с FcγRIII. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения антитело будет содержать константную область, содержащую по меньшей мере одно изменение аминокислоты в Fc-области, которое улучшает связывание антитела с FcγRIIIa и/или ADCC.

Используемый в настоящей заявке термин «дополнительное или комбинированное применение (совместное введение)» включает одновременное введение соединений в одинаковых или разных лекарственных формах или раздельное введение соединений (например, последовательное введение). Таким образом, анти-NKG2A средство и второе лекарственное средство можно одновременно вводить в составе одной формы. Альтернативно, анти-NKG2A средство и второе лекарственное средство могут иметь лекарственные формы для раздельного введения, и вводится параллельно или последовательно.

В способах лечения анти-NKG2A антитело и второе лекарственное средство могут вводиться раздельно, вместе или последовательно или в смеси. В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающее соединение вводят перед введение второго лекарственного средства. Например, анти-NKG2A антитело можно вводить приблизительно от 0 до 30 дней до введение второго лекарственного средства. В некоторых вариантах реализации анти-NKG2A антитело вводят от приблизительно 30 минут до приблизительно 2 недель, от приблизительно 30 минут до приблизительно 1 недели, от приблизительно 1 часа до приблизительно 2 часов, от приблизительно 2 часов до приблизительно 4 часов, от приблизительно 4 часов до приблизительно 6 часов, от приблизительно 6 часов до приблизительно 8 часов, от приблизительно 8 часов до 1 дня или от приблизительно 1 до 5 дней перед введением второго лекарственного средства. В некоторых вариантах реализации анти-NKG2A антитело вводят параллельно с введением второго лекарственного средства. В некоторых вариантах реализации анти-NKG2A антитело вводят после введения второго лекарственного средства. Например, анти-NKG2A антитело может быть введено приблизительно от 0 до 30 дней после введения второго лекарственного средства. В некоторых вариантах реализации анти-NKG2A антитело вводят от приблизительно 30 минут до приблизительно 2 недель, от приблизительно 30 минут до приблизительно 1 недели, от приблизительно 1 часа до приблизительно 2 часов, от приблизительно 2 часов до приблизительно 4 часов, от приблизительно 4 часов до приблизительно 6 часов, от приблизительно 6 часов до приблизительно 8 часов, от приблизительно 8 часов до 1 дня или от приблизительно 1 до 5 дней после введения второго лекарственного средства.

Подходящие протоколы лечения для лечения человека, имеющего рак, включают, например, введение пациенту эффективного количества каждого из антитела, которое ингибирует NKG2A, и антитела, которое связывает и/или ингибирует EGFR человека, при этом способ включает по меньшей мере один курс приема, в котором по меньшей мере одну дозу анти-NKG2A антитела вводят в дозе 1-10 мг/кг массы тела и по меньшей мере одну дозу анти-EGFR антитела вводят в дозе 1-20 мг/кг массы тела. В одном из вариантов реализации курс приема составляет от 2 недель до 8 недель.

В одном из вариантов реализации при введении в комбинации с анти-EGFR антителом анти-NKG2A антитело вводят в количестве, эффективном для нейтрализации NKG2A-рецептора на лимфоцитах в течение по меньшей мере одной недели, двух недель, трех недель или четырех недель. Анти-NKG2A антитело, имеющее аффинность (значение KD) к одноцепочечным полипептидам NKG2A-CD94-mFc в пикомолярном диапазоне, а именно антитело, имеющее тяжелую и легкие цепи последовательностей SEQ ID NO: 2 и 7, соответственно имеющие аффинность (значение KD) к одноцепочечным полипептидам NKG2A-CD94-mFc, равную 67 пМ), в дозе 1-10 мг/кг приводит к нейтрализации NKG2A на лимфоцитах периферической крови при введении каждые две недели.

В одном из вариантов реализации способ включает по меньшей мере один курс приема, при этом курс представляет собой период в восемь недель или меньше, при этом в ходе каждого из по меньшей мере одного курса, две, три или четыре дозы анти-NKG2A вводят в дозе 1-10 мг/кг массы тела и две, три или четыре дозы анти-EGFR антитела вводят в дозе 0,1-20 мг/кг массы тела.

В определенных вариантах реализации дозу (например, каждую дозу) анти-NKG2A антитела вводят в количестве 10 мг/кг. В определенных вариантах реализации дозу (например, каждую дозу) анти-EGFR антитела вводят в количестве 1-20 мг/кг, необязательно 1-10 мг/кг, необязательно 1-5 мг/кг (например, приблизительно 1, 2, 3, 4 или 5 мг/кг).

В одном из вариантов реализации цетуксимаб вводят в первоначальной дозе 400 мг/м2 с последующей дозой 20 мг/м2 еженедельно, необязательно каждые 2 недели. В одном из вариантов реализации цетуксимаб («Вектибикс», Amgen) вводят в дозе 6 мг/кг каждые 2 недели.

В определенных вариантах реализации комбинированная терапия позволяет вводить анти-EGFR антитело в более низкой дозе, чем максимальная или разрешенная доза (например, в качестве монотерапии или в отсутствии анти-NKG2A антитела).

В одном из вариантов реализации анти-NKG2A антитело и анти-EGFR антитело вводят в соответствующих дозах:

(а) 10 мг/кг анти-NKG2A антитела и 1-10 мг/кг (например, 250 мг/м²) анти-EGFR антитела;

(b) менее чем 10 мг/кг анти-NKG2A антитела (например, по меньшей мере 1 мг/кг) и 1-10 мг/кг (например, 250 мг/м²) анти-EGFR антитела.

В одном аспекте любого из вариантов реализации в настоящей заявке анти-NKG2A антитело вводят один раз каждые две или четыре недели. В одном аспекте любого из вариантов реализации в настоящей заявке анти-EGFR антитело вводят один раз каждую неделю. В одном аспекте любого из вариантов реализации в настоящей заявке анти-EGFR антитело вводят один раз каждые две недели. В одном аспекте любого из вариантов реализации в настоящей заявке анти-EGFR антитело вводят один раз каждые четыре недели.

В одном примере способ включает по меньшей мере один курс приема, в котором одну дозу анти-NKG2A антитела вводят в дозе 1-10 мг/кг массы тела и по меньшей мере одну дозу анти-EGFR антитела вводят в дозе 1-10 мг/кг массы тела, где анти-NKG2A антитело вводят один раз каждые две недели, необязательно один раз каждые четыре недели, и анти-EGFR антитело вводят один раз приблизительно каждую неделю или один раз каждые две недели. В одном из вариантов реализации курс приема составляет от 2 недель до 8 недель. В одном из вариантов реализации курс приема составляет 2 недели.

В одном примере анти-EGFR антитело представляет собой цетуксимаб, и его вводят один раз каждые две недели. Например, лечение включает по меньшей мере один курс прима, в котором одну дозу анти-NKG2A антитела вводят в дозе 1-10 мг/кг массы тела и по меньшей мере одну дозу анти-EGFR антитела вводят в дозе 1-10 мг/кг массы тела (необязательно с более высокой дозой анти-EGFR антитела для первого введения анти-EGFR антитела), где анти-NKG2A антитело вводят один раз каждые две недели и анти-EGFR антитело вводят один раз приблизительно каждые две недели.

В одном из вариантов реализации предложен способ оценки, подходит ли индивидуум для лечения средством, которое ингибирует NKG2A, и средством, которое связывает (и, например, индуцирует ADCC в отношении) и/или ингибирует активность EGFR человека, способ, включающий определение опухолевой клетки (например, опухолевой клетки ПКГШ), которая экспрессирует как нуклеиновую кислоту или полипептид HLA-Е, так и нуклеиновую кислоту или полипептид EGFR, в биологическом образце от индивидуума. Определение, что индивидуум имеет опухолевую клетку (или популяции опухолевых клеток), которая экспрессирует как нуклеиновую кислоту или полипептид HLA-Е, так и нуклеиновую кислоту или полипептид EGFR, указывает, что у пациента есть рак, который можно лечить средством, которое ингибирует NKG2A, в комбинации со средством, которое связывает и/или ингибирует активность EGFR человека.

ПРИМЕРЫ

Пример 1 - Влияние дозозависимого эффекта анти-NKG2A на активацию NK-клеток

Иммунотерапевтические подходы к лечению ПКГШ особенно затруднены глубокой иммуносупрессией, которая индуцирована ПКГШ, потенциально снижающей эффективность попыток стимулировать иммунную систему (см, например, Duray et al. (2010) Clin. Dev. Immunol. 2010: 1-15). Целью эксперимента было исследовать, способно ли анти-NKG2A антитело, мишенью которого является NKG2A, элиминировать клетки ПКГШ.

Влияние дозозависимого ответа анти-NKG2A на активацию NK-клеток определяли путем анализа экспрессии CD107 и CD137. Мобилизация CD107 через 4 часа является маркером высвобождения литических гранул NK-клетками (Alter et al., (2004) J Immunol Methods 294(1-2): 15-22). Увеличение уровня экспрессии CD137 через 24 часа коррелирует с активацией нескольких видов лимфоцитов, включая NK-клетки (Kohrt et al. (2011) Blood 117(8):2423-2432). Анализ экспрессии CD107 и CD137 осуществляли на NK-клетках, экспрессирующих или не экспрессирующих NKG2A (соответственно NKG2A + NK-клетки или NKG2A - NK-клетки). Поскольку мишенью антитела является NKG2A, ожидается, что воздействие антитела будет наблюдаться только в отношении NKG2A-пoлoжитeльныx NK-клеток, и, таким образом, NKG2A-oтpицaтeльныe NK-клетки можно считать внутренним контролем в экспериментах.

Используемые эффекторные клетки представляли собой свежевыделенные МКПК, полученные от здоровых добровольцев, и клетки-мишени представляли собой линии клеток ПКГШ или клоны линии клеток K562, трансфицированной HLA-Е. Определяли количество клеток и пересаживали их каждые два дня на полную среду. Клетки держали в среде до 12 пассажей. За день до эксперимента определяли количество клеток и доводили его до 100000 клеток/лунку. Измеряли жизнеспособность, она должна была быть свыше 90%.

Клеточные линии К562 представляли собой клон Е6 линии клеток K562 (HLA-E-положительные, низкая экспрессия CD32) и клон F7 линии клеток K562 (HLA-E-отрицательные или с низкой экспрессией HLA-Е, низкая экспрессия CD32). Осуществляли скрининг линий клеток рака головы и шеи с помощью проточной цитометрии для определения экспрессии HLA-Е (см. Таблицу C, ниже). Выбирали три клеточные линии для проведения функциональных тестов: FaDu (АТСС, номер НТВ-43), H-N (DSMZ, номер АСС 417) и CAL-27 (DSMZ, номер АСС 446).

Таблица C

Используемые эффекторные клетки представляли собой свежевыделенные МКПК от здоровых добровольцев. Клетки-мишени представляли собой линии клеток ПКГШ (FaDu, H-N и CAL-27) и клоны клеточной линии K562, трансфицированной HLA-Е (клон Е6 = HLA-E-положительный, клон F7 = HLA-E-отрицательный) с соотношением эффекторных клеток к клеткам-мишеням (Э:М), равном 2,5/1. Сравнивали считывание CD 107 через 4 часа с CD 137 через 24 часа. Исследовали 7 доноров (FaDu и H-N) и 2 доноров (CAL-27). Использовали анти-NKG2A антитело, чья аминокислотная последовательность тяжелой цепи показана в последовательности SEQ ID NO: 2 и чья аминокислотная последовательность легкой цепи показана в последовательности SEQ ID NO: 7, с конечной концентрацией 10 мкг/мл.

На фигурах 1А и 1В показаны считывания CD107 (вверху) и CD137 (внизу) с использованием сортировки флуоресцентно-активированных клеток (FACS) на NKG2A-отрицательных (NKG2A-) NK-клетках (слева) или на NKG2А-положительных (NKG2A+) NK-клетках (справа) в присутствии контролей или указанных линий клеток-мишеней ПКГШ и в присутствии или отсутствии анти-NKG2A антитела в насыщающей дозе 10 мкг/мл. Клеточные линии расположены слева направо в соответствии с уровнем экспрессии HLA-Е на поверхности клеток. Каждая точка представляет собой мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) от здорового добровольца. На фигуре 1А показаны контроли и линию клеток-мишеней К562 с низкими или высокими уровнями экспрессии поверхностного HLA-Е, а на фигуре 1В показано, что анти-NKG2A антитело может восстановить лизис ПКГШ с эндогенной экспрессией HLA-Е или лизис клеточной линии K562, трансфицированной HLA-Е. Этот эффект наблюдается только на NKG2A-пoлoжитeльныx NK-клетках и зависит от уровня экспрессии HLA-E. Действительно, эффект анти-NKG2A антитела наблюдается на клеточных линиях с уровнем экспрессии HLA-Е от среднего до высокого.

Анти-NKG2A антитело может индуцировать NK-опосредованный лизис линии клеток, экспрессирующих HLA-Е, путем блокировки взаимодействия ингибиторного рецептора NKG2A с HLA-Е. Этот эффект наблюдается на клеточной линии K562, трансфицированной HLA-Е, но, что более важно, на клеточных линиях ПКГШ с экспрессией эндогенного HLA-Е, таких как клеточные линии FaDu и CAL-27. Распространенность анти-NKG2A эффекта зависит от уровня экспрессии HLA-Е на поверхности клеток-мишеней.

Пример 2 - Супрессия HLA-E анти-EGFR активности может быть преодолена с помощью анти-NKG2A антитела

Рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), (также ErbB-1; HER1 у человека), является универсальным экспрессируемым трансмембранным гликопротеином в семействе ErbB/HER рецепторов тирозинкиназы. Высокая экспрессия EGFR встречается у большинства эпителиальных злокачественных опухолей, включая ПКГШ, и связана с плохим прогнозом. Его активация через природные лиганды приводит к инициации внутриклеточных сигнальных путей, которые регулируют активацию клеточной пролиферации, инвазии, ангиогенез и управляемый метастазами рост опухоли.

Предполагают, что анти-EGFR моноклональное антитело цетуксимаб действует посредством блокировки онкогенного пути сигнализации рецептора эпидермального фактора роста (EGF) и путем индуцирования опосредованного Fcγ-рецептором антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC). Однако при ПКГШ на ADCC может повлиять глубокая индуцированная иммуносупрессия. В тоже время блокирование онкогенного пути сигнализации рецептора EGF приводит к посттрансляционной регуляции в опухолевых клетках антигенов, связанных с главным комплексом гистосовместимости (МНС) I класса, семейств белков MICA/B и ULBP, которые распознаются активирующим рецептором NKG2D на NK-клетках и субпопуляциях Т-клеток. В частности, экспрессия опухолевыми клетками этих связанных со стрессом антигенов, которые являются природными лигандами NKG2D, снижается клиническими ингибиторами EGFR, таким образом, потенциально снижая видимость опухолевых клеток для NK-клеток и Т-клеток (Vantourout et al., Sci. Transl. Med. 6: 231ra49 (2014).

Данный эксперимент был разработан для исследования влияния ингибирующих EGFR антител на способность анти-NKG2A антител активировать NK-клетки при ПКГШ. Влияние дозозависимого эффекта цетуксимаба на активацию NK-клеток определяли анализом экспрессии CD107 и CD137 (см. пример 1 для обзора методов), используя в качестве эффекторных клеток МКПК, свежевыделенные от здоровых добровольцев, и в качестве клеток мишеней линии клеток ПКГШ (FaDu и H-N) в соотношении Э:М равном 2,5/1. Сравнивали считывание CD107 через 4 часа с CD137 через 24 часа с использованием 3 доноров (считывание CD107 через 4 ч) и четырех доноров (считывание CD137 через 24 ч). Исследовали цетуксимаб на дозозависимый эффект, последовательное разведение 1/10 с начальной концентрацией 10 мкг/мл. Для одного здорового добровольца NK-клетки разделили на субпопуляции NKG2A-пoлoжитeльныx и NKG2A-oтpицaтeльныx клеток. Для дальнейших опытов выбирали субоптимальные дозы цетуксимаба для исследования влияния ингибирующих EGFR антител на способность анти-NKG2A антител активировать NK-клетки при ПКГШ. Доза 0,001 мкг/мл (1 нг/мл) является отправной точкой для влияния цетуксимаба, наблюдаемого в отношении обоих процессах считывания CD107 и CD137. Доза 0,01 мкг/мл (10 нг/мл) является приблизительно равной ЕС50 цетуксимаба.

Комбинированный эффект анти-NKG2A и субоптимальную дозу ингибитора EGFR оценивали с помощью анализа экспрессии CD107 и CD137 (см. пример 1 для обзора методов), используя в качестве эффекторных клеток МКПК, свежевыделенные от здоровых добровольцев, и в качестве клеток мишеней линии клеток ПКГШ (FaDu, H-N и CAL-27), клоны клеточной линии K562, трансфицированной HLA-Е (клон Е6 = HLA-E-положительный, клон F7 = HLA-E-отрицательный), в соотношении Э:М равном 2,5/1. Сравнивали считывание CD107 через 4 часа с CD137 через 24 часа с использованием 7 доноров (FaDu and H-N)) и двух доноров (CAL-27).

Использовали анти-NKG2A антитело, чья аминокислотная последовательность тяжелой цепи показана в последовательности SEQ ID NO: 2 и чья аминокислотная последовательность легкой цепи показана в последовательности SEQ ID NO: 7, с конечной концентрацией 10 мкг/мл, соответствующей насыщающей дозе, и использовали ингибитор EGFR цетуксимаб в двух субоптимальных дозах, равных 0,001 мкг/мл или 0,01 мкг/мл.

Насыщающие дозы анти-NKG2A усиливали ADCC в отношении линий клеток ПКГШ, индуцированный субоптимальными дозами цетуксимаба. Не наблюдали цетуксимаб-зависимой ADCC в отношении трансфицированных клеточных линий K562, поскольку они не экспрессируют EGFR. Эффект анти-NKG2A антитела наблюдается только в отношении NKG2A-пoлoжитeльныx NK-клеток и зависит от уровня экспрессии HLA-Е. Действительно, анти-NKG2A эффект виден на клеточных линиях с уровнем экспрессии HLA-Е от среднего до высокого (FaDu, CAL-27 и клон Е6 линии K562-HLA-Е). Фигура 2 является типичным примером, показанным для клеток FaDu. На фигуре 2 можно увидеть, что насыщающие дозы анти-NKG2A усиливали ADCC в отношении линий клеток ПКГШ, индуцированную субоптимальными дозами цетуксимаба (ctx).

Пример 3 - Комбинированный эффект возрастающих доз анти-NKG2A с возрастающими дозами цетуксимаба

Эффект от комбинации возрастающих доз ингибирующего EGFR антитела и возрастающих доз анти-NKG2A антител оценивали по способности активировать NK-клетки в отношении клеток-мишеней ПКГШ. Эксперименты стремились оценить, может ли анти-NKG2A терапия все еще усиливать ADCC в случае использования цетуксимаба в насыщающей дозе и является ли анти-NKG2A эффект дозозависимым.

Вкратце использованные эффекторные клетки представляли собой свежевыделенные МКПК от здоровых добровольцев и клетки-мишени представляли собой линии клеток ПКГШ (FaDu, H-N и CAL-27) и клоны клеточной линии K562, трансфицированной HLA-E (клон Е6 = HLA-E-положительный, клон F7 = HLA-E-отрицательный), и соотношение Э:М было равно 2,5/1. Сравнивали считывание CD107 через 4 часа с CD137 через 24 часа с использованием 2 доноров. Использовали анти-NKG2A антитело, чья аминокислотная последовательность тяжелой цепи показана в последовательности SEQ ID NO: 2 и чья аминокислотная последовательность легкой цепи показана в последовательности SEQ ID NO: 7, в двух субоптимальных дозах, равных 0,1 и 1 мкг/мл, и в насыщающей дозе 10 мкг/мл. Цетуксимаб использовали в двух субоптимальных дозах, равных 0,001 мкг/мл и 0,01 мкг/мл (приблизительно ЕС50), и в насыщающей дозе 0,1 мкг/мл при данных условиях проведения эксперимента.

Результаты показаны на фигурах 3А и 3В. На фигуре 3А показано считывание CD107 на контролях без клеток-мишеней и с трансфектантами K562-HLA-E. Каждый здоровый доброволец представлен разными символами: квадратиками или кружками. Зачеркнутые пустые символы соответствуют условию, когда анти-NKG2A антитело заменяли 10 мкг/мл IgG4 человека (hIgG4) в качестве изотипического контроля, инкубированным совместно с 0,1 мкг/мл цетуксимаба. Видно, что эффект анти-NKG2A антитела является дозозависимым, зависит от уровня экспрессии HLA-Е и все еще наблюдается при насыщающей дозе цетуксимаба в 0,1 мкг/мл у клона Е6, который экспрессирует HLA-Е на высоких уровнях. В клоне F7 (низкие уровни экспрессии HLA-E) эффект анти-NKG2A антитела был ограничен и высокие дозы (например, насыщающие дозы) анти-NKG2A антитела не увеличивали дальше эффект дополнительно.

На фигуре 3В показано считывание CD 107 на линиях клеток ПКГШ. Каждый здоровый доброволец представлен разными символами: квадратиками или кружками. Зачеркнутые пустые символы соответствуют условию, когда анти-NKG2A антитело заменяли 10 мкг/мл IgG4 человека (hIgG4) в качестве изотипического контроля, инкубированным совместно с 0,1 мкг/мл цетуксимаба. Видно, что эффект анти-NKG2A антитела является дозозависимым, зависит от уровня экспрессии HLA-Е и все еще наблюдается при насыщающей дозе цетуксимаба в 0,1 мкг/мл у клеток FaDu или CAL-27, которые экспрессируют на высоком уровне HLA-E/сильно окрашиваются по HLA-E.

Эффект анти-NKG2A антитела является дозозависимым, зависит от уровня экспрессии HLA-Е и все еще наблюдается при насыщающей дозе цетуксимаба в 0,1 мкг/мл.

Пример 4 - HLA-E постоянно экспрессируется в ПКГШ, включая генотипы ВПЧ16

Изучали экспрессию HLA-Е на опухолях пациентов с ПКГШ. Образцы получали от 20 пациентов, имеющих заболевания на III, IV или IVA клинической стадии плоскоклеточной карциномы головы и шеи без дополнительных уточнений (16 первичных опухолей и 4 метастатические опухоли (лимфоузлы) с I по IV степенью опухоли. Разбивка была следующая: полость рта и/или дно ротовой полости (n=3), гортань (n=6), глотка (n=1), язык, (n=7), миндалина (n=3). Генотип HPV16 (14/20 положительные) и определение HPV Р16^inka (7/14 положительные).

Окрашивание проводили на замороженных срезах ткани с использованием IgG1 мыши против HLA-Е человека (3D12) с концентрацией 5 мкг/мл для окрашивания HLA-E и IgG1 мыши против NKG2A (Z270) с концентрацией 5 мкг/мл для окрашивания NKG2A при сравнении с изотипическим контролем: IgG1 мыши (DAKO A/S, Дания) с концентрацией 5 мкг/мл, определение осуществляли с использованием набора для детектирования Envision™ (DAKO A/S, Дания). Были включены здоровые ткани человека в качестве положительного контроля (плацента, миндалина и лимфоузел), а также трансфицированные клеточные линии. По отдельности было оценено в образцах опухолевой ткани лифмоцитарная инфильтрация в опухоль и строму.

Использованный протокол окрашивания HLA-Е и NKG2A был следующим: привести к комнатной температуре, регидратировать фосфатно-солевым буфером (ФСБ), блокировать эндогенную пероксидазу 0,3% Н₂О₂ в ФСБ, промыть 3 раза ФСБ, насытить 5% сывороткой козы в ФСБ, инкубировать с 100 мкл антителами, разведенными в ФСБ, промыть 3 раза ФСБ, инкубировать с набором envision (2 капли), промыть 3 раза ФСБ, инкубировать с 100 мкл диаминобензидина (ДАБ), ополоснуть деионизованной Н₂О, инкубировать с гематоксилином (2 капли), ополоснуть деионизованной Н₂О, окунуть в OTTIX shaper, окунуть в OTTIX plus и закрепить с помощью устройства для монтирования и нарезания срезов Diamount.

Кроме оценки уровня окрашивания от 0 до 3, регистрировали клеточный тип и расположение сигнала в клетке, когда оно присутствовало. Классифицировали как мембранное, цитоплазматическое и внеклеточное расположение в клетке.

ИГХ оценку выставляли следующим образом:

0: отрицательный сигнал

1: от очень слабого до слабого сигнала у менее 25-50% клеточного типа

2: промежуточный по интенсивности сигнал, но экспрессируется у более 50% клеточного типа, или сильный сигнал, но экспрессируется у менее 25-50% клеточного типа

3: сильный сигнал, диффузно экспрессируемый среди всех клеток в пределах клеточного подтипа

Результаты показали диффузное цитоплазматическое окрашивание по HLA-Е в диапазоне 1+ до 3+. Окрашивание HLA-Е наблюдали среди различных локализаций/типов опухоли и включало ВПЧ-положительных пациентов, включая генотип ВПЧ16 и образцы, характеризуемые экспрессией ВПЧ Р16^INKA.

На фигуре 4 показано окрашивание по HLA-Е в диапазоне от 1+ до 3+ при различных локализациях/типах опухоли. Интересно, что окрашивание было 3+ во всех образцах опухоли, тип которой общепризнан как имеющей самый худший прогноз (миндалина).

Результаты также показали, что HLA-Е постоянно экспрессируется у ВПЧ-положительных пациентов, включая генотип ВПЧ16. На фигуре 5 показаны подробности статуса в отношении ВПЧ16 и Р16 для пациентов с различными опухолями; все образцы типа опухоли (миндалина), общепризнанной как имеющей самый худший прогноз, были как ВПЧ16-положительными, так и Р16^INKA-положительными. Опухоли гортани и глотки также были преимущественно ВПЧ16-положительными и со значительной долей Р16^INKA -положительных образцов. На фигуре 6 показан тип опухоли (метастатическая или первичная опухоль) как функция статуса в отношении ВПЧ16 и P16^INKA; все метастатические опухоли были как ВПЧ16-положительными, так и P16^INKA-положительными. Результаты дополнительно показали, что для экспрессия HLA-E, а также для ВПЧ-положительных опухолей характерна сильная инфильтрация лимфоцитов, как показано на фигуре 7. Кроме того, лимфоциты в образцах опухоли экспрессировали NKG2A с самым сильным окрашиванием по NKG2A у пациентов, которые были как ВПЧ16-положительными, так и P16^INKA-положительными.

Пример 5 - Клиническое исследования на людях лечения рака повторными инъекциями гуманизированного Z270 в качестве монотерапии

Первичная цель исследования состоит в оценки противоопухолевой активности предоперационного средства IPH2201 (гуманизированного анти-NKG2A антитела Z270, содержащего мутацию S241P) у пациентов с операбельной плоскоклеточной карциномой ротовой полости. Вторичные цели состоят в оценки безопасности IPH2201, фармакокинетики, иммуногенности и фармакодинамики, включая внутриопухолевые биомаркеры.

Дизайн исследования:

Исследование является открытым несравнительным исследованием фазы Ib-II, включающим вводную часть. Не проходившие лечение ранее пациенты с измеряемым клиническим промежуточными или высоким риском, плоскоклеточной карциномой ротовой полости на стадии III или IVa будут получать лечение единственным средством IPH2201 в/в каждые 2 недели (1 раз в 2 недели) в 4 приема внутривенным (в/в) способом в течение 1 часа. Первые 6 пациентов будут получать IPH2201 в дозе 4 мг/кг 1 раз в 2 недели в 4 приема. Минимальный интервал в 1 неделю будет наблюдаться между первым введением IPH2201 первым 3 пациентам, которые получают лечение с дозой 4 мг/кг. Последующие пациенты будут проходить лечение дозой 10 мг/кг 1 раз в 2 недели в 4 приема, увеличение дозы будет разрешаться комитетом по безопасности после минимального последующего наблюдения в течение 4 недель после первого введение последнего пациенту дозы в 4 мг/кг. После последнего введения IPH2201 будет инициирована стандартная локорегиональное лечение хирургическим вмешательством с последующей дополнительной терапией (радиотерапией (РТ) или радиохимиотерапией (РХТ) в соответствии с гистопатологическими факторами риска. В случае прогрессирования опухоли локорегиональное лечение будет начато немедленно.

Противоопухолевая активность оценивают клинически и радиологически перед третьим приемом IPH2201 и спустя 2 недели после последнего введения IPH2201 перед хирургической операцией. Получают измерения опухоли на целевых очагах поражения согласно критериям RECIST 1.1 (руководства "Критерии оценки ответа при солидных опухолях"). Одни и те же способы визуализации используются для оценки эффективности на исходном уровне и в ходе предоперационного периода, доя оценки первичной конечной токи и/или после хирургического вмешательства, для мониторинга потенциальных рецидивов. Оценка с помощью подходящих способов визуализации по усмотрению исследователя (компьютерная томография (КТ) и/или магнитно-резонансная томография (МРТ)) проводят у всех пациентов, а также фотографирование доступных очагов поражения опухолью.

Свежие образцы опухоли получают с помощью биопсии на исходном уровне и образцы резецированного материала собирают во время хирургической операции. Наблюдение за пациентами будет проводиться в течение до одного года после первого курса приема. После последнего визита, предусмотренного исследованием, возникновение рецидивов и выживаемость будут задокументированы в период после исследования в соответствии с местными практиками в течение 2 дополнительных лет.

Все ссылки, включая публикации, заявки на патенты и патенты, цитируемые в настоящей заявке, настоящим включены полностью в настоящую заявку посредством ссылки и в той же степени, как если бы каждая ссылка была отдельно и специально указана, что включена посредством ссылки и представлена в ее полном объеме (в максимальном объеме, разрешенном законом), в независимости от любых отдельных представленных включений конкретных документов, сделанных в другом месте настоящей заявки.

Применение форм единственного числа в контексте описываемого изобретения подразумевает покрывать как формы единственного, так и множественного числа, если не указано иначе в настоящей заявке или это прямо не противоречит контексту.

Если не указано иначе, все конкретные величины, представленные в настоящей заявке, являются представлениями соответствующих приблизительных величин (например, все конкретные приводимые в качестве примера величины, представленные в настоящей заявке, с учетом конкретного фактора или измерения можно рассматривать как обеспечивающие также соответствующее приблизительное измерение, модифицированный термином «приблизительно», где целесообразно). В случае, когда термин «приблизительно» используется в связи с числом, он может быть определен как включающий значения, соответствующие +/-10% от конкретного числа.

Описание в настоящей заявке любого аспекта или варианта реализации настоящего изобретения с использованием терминов, таких как «содержащий», «имеющий», «включающий», в отношении к элементу или элементам предполагают обеспечивать поддержку схожего аспекта или варианта реализации настоящего изобретения, который «состоит из», «состоит по существу из» или «по существу содержит» этот конкретный элемент или элементы, если не указано иначе или это прямо не противоречит контексту (например, композиция, описанная в настоящей заявке, как включающая конкретный элемент должна пониматься, как также описывающая композицию, состоящую из этого элемента, если не указано иначе или это прямо не противоречит контексту).

Применение любого и всех примеров или языка для иллюстрации примеров (например, «такой как»), представленный в настоящей заявке, имеет целью просто лучше осветить настоящее изобретение и не накладывает ограничения на объем настоящего изобретения, если не утверждается иначе. Никакой язык в описании настоящего изобретения не подразумевается как указывающий на любой незаявленный элемент как существенный для практического выполнения настоящего изобретения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> INNATE PHARMA

<120> ЛЕЧЕНИЕ РАКОВЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ С ПРИМЕНЕНИЕМ АНТИ-NKG2A СРЕДСТВ

<130> NKG2A HN

<150> 62/067642

<151> 2014-10-23

<160> 17

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 233

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Asp Asn Gln Gly Val Ile Tyr Ser Asp Leu Asn Leu Pro Pro Asn

1 5 10 15

Pro Lys Arg Gln Gln Arg Lys Pro Lys Gly Asn Lys Ser Ser Ile Leu

20 25 30

Ala Thr Glu Gln Glu Ile Thr Tyr Ala Glu Leu Asn Leu Gln Lys Ala

35 40 45

Ser Gln Asp Phe Gln Gly Asn Asp Lys Thr Tyr His Cys Lys Asp Leu

50 55 60

Pro Ser Ala Pro Glu Lys Leu Ile Val Gly Ile Leu Gly Ile Ile Cys

65 70 75 80

Leu Ile Leu Met Ala Ser Val Val Thr Ile Val Val Ile Pro Ser Thr

85 90 95

Leu Ile Gln Arg His Asn Asn Ser Ser Leu Asn Thr Arg Thr Gln Lys

100 105 110

Ala Arg His Cys Gly His Cys Pro Glu Glu Trp Ile Thr Tyr Ser Asn

115 120 125

Ser Cys Tyr Tyr Ile Gly Lys Glu Arg Arg Thr Trp Glu Glu Ser Leu

130 135 140

Leu Ala Cys Thr Ser Lys Asn Ser Ser Leu Leu Ser Ile Asp Asn Glu

145 150 155 160

Glu Glu Met Lys Phe Leu Ser Ile Ile Ser Pro Ser Ser Trp Ile Gly

165 170 175

Val Phe Arg Asn Ser Ser His His Pro Trp Val Thr Met Asn Gly Leu

180 185 190

Ala Phe Lys His Glu Ile Lys Asp Ser Asp Asn Ala Glu Leu Asn Cys

195 200 205

Ala Val Leu Gln Val Asn Arg Leu Lys Ser Ala Gln Cys Gly Ser Ser

210 215 220

Ile Ile Tyr His Cys Lys His Lys Leu

225 230

<210> 2

<211> 452

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Мышь/человек, химерная

<400> 2

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ala Gln Lys Leu

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe

100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

115 120 125

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser

130 135 140

Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

145 150 155 160

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

165 170 175

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

180 185 190

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys

195 200 205

Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu

210 215 220

Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Leu Gly Lys

450

<210> 3

<211> 452

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Мышь/человек, химерная

<400> 3

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe

100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

115 120 125

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser

130 135 140

Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

145 150 155 160

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

165 170 175

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

180 185 190

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys

195 200 205

Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu

210 215 220

Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Leu Gly Lys

450

<210> 4

<211> 452

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Мышь/человек, химерная

<400> 4

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe

100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

115 120 125

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser

130 135 140

Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

145 150 155 160

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

165 170 175

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

180 185 190

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys

195 200 205

Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu

210 215 220

Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Leu Gly Lys

450

<210> 5

<211> 452

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Мышь/человек, химерная

<400> 5

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ala Glu Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Gly Gly Tyr Asp Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe

100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

115 120 125

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser

130 135 140

Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

145 150 155 160

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

165 170 175

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

180 185 190

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys

195 200 205

Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu

210 215 220

Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Leu Gly Lys

450

<210> 6

<211> 452

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Мышь/человек, химерная

<400> 6

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe

100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

115 120 125

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser

130 135 140

Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

145 150 155 160

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

165 170 175

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

180 185 190

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys

195 200 205

Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu

210 215 220

Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Leu Gly Lys

450

<210> 7

<211> 214

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Мышь/человек, химерная

<400> 7

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 8

<211> 5

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 8

Ser Tyr Trp Met Asn

1 5

<210> 9

<211> 11

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 9

Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr

1 5 10

<210> 10

<211> 17

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Мышь/человек, химерная

<400> 10

Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ser Pro Ser Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 11

<211> 17

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Мышь/человек, химерная

<400> 11

Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ala Gln Lys Leu Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 12

<211> 16

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 12

Gly Gly Tyr Asp Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe Asp Val

1 5 10 15

<210> 13

<211> 11

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 13

Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 14

Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu

1 5

<210> 15

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 15

Gln His His Tyr Gly Thr Pro Arg Thr

1 5

<210> 16

<211> 119

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 16

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Glu Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val

50 55 60

Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Ile Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg His Gly Asp Tyr Pro Arg Phe Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 17

<211> 107

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 17

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Gly Asn Pro Tyr Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<---

Изобретение относится к области биохимии, в частности к применению антитела, которое cпецифично связывает полипептид NKG2A человека и нейтрализует ингибиторную активность NKG2A, для лечения или профилактики плоскоклеточной карциномы головы и шеи (ПКГШ) у индивидуума. Также раскрыты способы лечения или профилактики плоскоклеточной карциномы головы и шеи (ПКГШ) у индивидуума, предусматривающие использование вышеуказанного антитела. Изобретение позволяет эффективно осуществлять лечение или профилактику плоскоклеточной карциномы головы и шеи (ПКГШ) у индивидуума. 4 н. и 30 з.п. ф-лы, 7 ил., 2 табл., 5 пр.

1. Применение антитела, которое cпецифично связывает полипептид NKG2A человека и нейтрализует ингибиторную активность NKG2A, для лечения или профилактики плоскоклеточной карциномы головы и шеи (ПКГШ) у индивидуума.

2. Применение по п. 1, отличающееся тем, что ПКГШ представляет собой плоскоклеточную карциному ротовой полости.

3. Применение по п. 1, отличающееся тем, что ПКГШ представляет собой опухоль ротоглотки.

4. Применение по п. 1, отличающееся тем, что ПКГШ представляет собой опухоль гортани.

5. Применение по п. 1, отличающееся тем, что ПКГШ представляет собой опухоль гипофаринкса.

6. Применение по любому из пп. 1-5, отличающееся тем, что индивидуум является положительным по наличию вируса папилломы человека (ВПЧ-положительным).

7. Применение по любому из пп. 1-6, отличающееся тем, что лечение или профилактика ПКГШ у индивидуума включает:

a) определение, является ли индивидуум, имеющий ПКГШ, ВПЧ-положительным, и

b) при определении, что индивидуум является ВПЧ-положительным, введение индивидууму указанного антитела, которое связывает полипептид NKG2A.

8. Применение по любому из пп. 1-7, отличающееся тем, что лечение или профилактика ПКГШ у индивидуума включает:

a) определение, экспрессируется ли полипептид HLA-E злокачественными клетками, полученными от индивидуума, имеющего ПКГШ, и

b) при определении, что злокачественные клетки экспрессируют полипептид HLA-E на уровне, равном или выше уровня, который соответствует уровню экспрессии HLA-E у индивидуума, который имеет ПКГШ и получает положительный эффект от лечения с помощью антитела против NKG2A, введение указанному индивидууму антитела, которое нейтрализует ингибиторную активность полипептида NKG2A человека.

9. Применение по п. 8, отличающееся тем, что определение, экспрессируется ли полипептид HLA-E злокачественными клетками, включает получение от индивидуума биологического образца, который содержит клетки ПКГШ, приведение указанных клеток в контакт с антителом, которое связывает полипептид HLA-E и детекция клеток, которые экспрессируют HLA-E.

10. Применение по любому из пп. 1-9, отличающееся тем, что антитело, которое специфично связывает полипептид NKG2A человека и нейтрализует ингибиторную активность NKG2A, по существу не связывает активирующие рецепторы NKG2C, NKGE или NKG2H.

11. Применение по любому из пп. 1-10, отличающееся тем, что антитело, которое специфично связывает полипептид NKG2A человека и нейтрализует ингибиторную активность NKG2A, конкурирует с HLA-E за связывание с NKG2A на поверхности клетки.

12. Применение по любому из пп. 1-11, отличающееся тем, что антитело, которое специфично связывает полипептид NKG2A человека и нейтрализует ингибиторную активность NKG2A, содержит HCDR1, HCDR2 и/или HCDR3, содержащиеся в тяжелой цепи, имеющей любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 2-6, и последовательности LCDR1, LCDR2 и/или LCDR3, содержащиеся в легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7.

13. Применение по любому из пп. 1-12, отличающееся тем, что антитело, которое специфично связывает полипептид NKG2A человека и нейтрализует ингибиторную активность NKG2A, содержит тяжелую цепь, которая имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2-6, и легкую цепь, которая содержит последовательность SEQ ID NO: 7.

14. Способ лечения или профилактики рака у индивидуума, при этом указанный способ включает:

a) определение статуса в отношении полипептида HLA-E у злокачественных клеток, полученных от индивидуума, имеющего рак,

b) определение статуса в отношении полипептида рецептора эпителиального фактора роста (EGFR) у злокачественных клеток, полученных от индивидуума, имеющего рак, и

c) при определении, что полипептиды HLA-E и EGFR экспрессируются злокачественными клетками, полученными от индивидуума, на уровнях, которые равны или выше уровня, который соответствует уровню экспрессии полипептидов HLA-E и EGFR у индивидуума, который имеет ПКГШ и получает положительный эффект от лечения с помощью антитела против NKG2A, применение у индивидуума схемы лечения, которая включает применение антитела, которое специфично связывает полипептид NKG2A человека и нейтрализует ингибиторную активность полипептида NKG2A человека, и антитела, которое связывает EGFR и ингибирует биологическую активность EGFR, причём указанный рак представляет собой ПКГШ.

15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что индивидуум имеет ПКГШ на поздней стадии.

16. Способ по любому из пп. 14-15, отличающийся тем, что антитело, которое нейтрализует ингибиторную активность полипептида NKG2A человека, вводят индивидууму при определении, что злокачественные клетки, полученные от индивидуума, имеют повышенный уровень экспрессии полипептида HLA-E по сравнению с уровнем, соответствующим здоровому индивидууму.

17. Способ лечения или профилактики рака у индивидуума, при этом указанный способ включает:

a) определение, имеет ли индивидуум рак, для которого характерно наличие лимфоцитов в окружении опухоли; и

b) при определении, что индивидуум имеет рак, для которого характерно наличие лимфоцитов в окружении опухоли, введение индивидууму антитела, которое специфично связывает полипептид NKG2A человека и нейтрализует ингибиторную активность полипептида NKG2A человека, при этом указанный рак представляет собой ПКГШ.

18. Способ по любому из пп. 14-17, отличающийся тем, что указанное антитело содержит константную область IgG4 человека.

19. Способ по любому из пп. 14-18, отличающийся тем, что указанное антитело содержит сконструированную константную Fc-область, содержащую аминокислотную модификацию, которая снижает связывание с Fcγ-рецептором человека.

20. Способ по любому из пп. 14-18, отличающийся тем, что указанное антитело против NKG2A конкурирует с антителами, имеющими тяжелые и легкие цепи, содержащие соответственно последовательности SEQ ID NO: 2 и 7, за связывание с NKG2A человека.

21. Способ по любому из пп. 14-20, отличающийся тем, что указанное антитело против NKG2A содержит домены CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, имеющей последовательность SEQ ID NO: 2, и домены CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, имеющей последовательность SEQ ID NO: 7.

22. Способ по любому из пп. 14-21, отличающийся тем, что указанное антитело против NKG2A вводят в форме фармацевтически приемлемой композиции, содержащей терапевтически эффективное количество антитела против NKG2A.

23. Способ по п. 22, отличающийся тем, что указанная композиция не содержит никакие другие фармацевтически активные средства.

24. Способ по любому из пп. 14-23, отличающийся тем, что указанное антитело против NKG2A вводят несколько раз с частотой приема от одного раза каждую неделю до одного раза в месяц.

25. Способ лечения или профилактики рака у пациента, представляющего собой человека, включающий введение пациенту эффективного количества каждого из следующих средств: (a) антитела, которое специфично связывает полипептид NKG2A человека и нейтрализует ингибиторную активность NKG2A человека, и (b) антитела, которое связывает EGFR и ингибирует биологическую активность EGFR, причём указанный рак представляет собой ПКГШ.

26. Способ по п. 25, отличающийся тем, что антитело, которое связывает EGFR, представляет собой антитело, которое индуцирует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в отношении опухолевых клеток, экспрессирующих EGFR.

27. Способ по п. 25 или 26, отличающийся тем, что антитело, которое связывает EGFR, представляет собой цетуксимаб.

28. Способ по любому из пп. 25-27, отличающийся тем, что ПКГШ представляет собой плоскоклеточную карциному ротовой полости.

29. Способ по любому из пп. 25-28, отличающийся тем, что указанный способ включает по меньшей мере один курс приема, при этом курс составляет период в две недели, при этом в ходе каждого из по меньшей мере одного курсов вводят одну дозу антитела, которое нейтрализует ингибиторную активность NKG2A человека, и вводят две дозы антитела, которое связывает EGFR.

30. Способ по любому из пп. 25-29, отличающийся тем, что указанный способ включает по меньшей мере один курс приема, при этом курс составляет период в две недели, при этом в ходе каждого из по меньшей мере одного курсов вводят одну дозу антитела, которое нейтрализует ингибиторную активность NKG2A человека, в дозе 1-10 мг/кг и вводят две дозы антитела, которое связывает EGFR, в дозе 1-10 мг/кг.

31. Способ по любому из пп. 14-30, отличающийся тем, что антитело, которое специфично связывает полипептид NKG2A человека и нейтрализует ингибиторную активность NKG2A, по существу не связывает активирующие рецепторы NKG2C, NKGE или NKG2H.

32. Способ по любому из пп. 14-31, отличающийся тем, что антитело, которое специфично связывает полипептид NKG2A человека и нейтрализует ингибиторную активность NKG2A, конкурирует с HLA-E за связывание с NKG2A на поверхности клетки.

33. Способ по любому из пп. 14-32, отличающийся тем, что антитело, которое специфично связывает полипептид NKG2A человека и нейтрализует ингибиторную активность NKG2A, содержит HCDR1, HCDR2 и/или HCDR3, содержащиеся в тяжелой цепи, имеющей любую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 2-6, и последовательности LCDR1, LCDR2 и/или LCDR3, содержащиеся в легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7.

34. Способ по любому из пп. 14-33, отличающийся тем, что антитело, которое специфично связывает полипептид NKG2A человека и нейтрализует ингибиторную активность NKG2A, содержит тяжелую цепь, которая имеет последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2-6, и легкую цепь, которая содержит последовательность SEQ ID NO: 7.