Средство стимуляции роста меристемной культуры Solanum tuberosum Российский патент 2020 года по МПК A01N63/00 C12N1/20 

Изобретение относится к области сельскохозяйственной биотехнологии, а именно к регуляторам роста растений, содержащих микроорганизмы или вещества полученные из них и может быть использовано в биотехнологическом производстве, сельском хозяйстве и биологии.

Современное высоко урожайное растениеводство заинтересовано в поиске новых экологически "чистых" препаратов стимулирующих рост растений. Одним из наиболее перспективных направлений по созданию препаратов стимулирующих рост растений являются биотехнологический синтез их на основе микроорганизмов и их метаболитов.

Известен и описан ряд штаммов стимулирующих рост растений использующихся в растениеводстве.

Известен патент №2495119 «Штамм бактерий Bacillus subtilis 8А в качестве средства повышения продуктивности растений и их защиты от фитопатогенных микроорганизмов» [2]. Штамм бактерий Bacillus subtilis 8А, депонированный в коллекции ГНУ ВНИСХМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ под номером RCAM 00876. Он обладает ростостимулирующей активностью по отношению к различным сельскохозяйственным культурам.

Известен патент №2551968 «Штамм бактерий Bacillus pumillus А 1.5 в качестве средства повышения продуктивности растений и их защиты от болезней, вызываемых фитопатогенными микроорганизмами» [3]. Штамм обладает антагонистической активностью по отношению к фитопатогенным бактериям и грибам и ростостимулирующей активностью по отношению к растениям. Для обработки семян сельскохозяйственных растений на основе штамма Bacillus pumillus А 1.5 готовится препарат «Эндохит» с титром бактерий не менее 3×10⁸ КОЕ/мл. Обработка семян производится 10% раствором препарата.

Известен патент №2284353 «Штамм микроорганизмов Bacillus mycoides var. В.А. для получения биопрепарата, используемого для стимуляции роста и защиты растений от болезней», положительно влияющий на рост растений [1].

Известен патент №2624032 "Штамм микроорганизма Bacillus cereus 875 TS в качестве средства повышения продуктивности растений", повышающий продуктивность зерновых [4].

Известен патент №2607028 "Штамм микроорганизмов Achromobacter spanius 10-50-TS2 в качестве средства повышения устойчивости растений к хлоридному засолению"[5], повышающий прорастание и всхожесть семян овса после их предпосевной обработки в условиях хлоридного засоления почв.

У всех перечисленных выше технических решений есть общий недостаток отсутствие стабильной эффективности при практическом применении, так как точно предсказать воздействие конкретных условий внешней среды на активность функционирования микроорганизмов и выработку их метаболитов, посредством которых они действуют на живые объекты, на сегодняшний день невозможно. Выходом из сложившейся ситуации может быть применение комплексов белковых метаболитов полученных из микроорганизмов при стандартных лабораторных условиях. Они представляют собой смесь пептидов различной молекулярной массой и являясь химическими веществами, обладают относительно стабильными эффектами при изменении условий внешней среды.

Задачей изобретения является использование штамма микроорганизма Achromobacteer spanius ВКПМ В-12405 в сельском хозяйстве в качестве средства стимулятора роста меристемной культуры Solanum tuberosum. Поставленная задача решается благодаря тому, что в качестве средств стимулятора роста меристемной культуры Solanum tuberosum используются фильтраты из биомассы клеток штамма бактерий Achromobacter spanius. 10-ВКПМ В-12405, выделенного из образцов многолетнемерзлых пород галоценового периода.

Штамм Achromobacter spanius. 10-50-TS2 депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУПГосНИИГенетика за №В-12405 (копия справки о депонировании прилагается), выделен из многолетнемерзлых пород (сине-серых пластичномерзлых глин), отобранных из бурового керна с глубины 30 м. при бурении скважины в районе Тарко-Сале (Тюменская область) Координаты скважины: N 65 01 316, Е 77 32 523.

Штамм Achromobacter spanius. 10-50-TS2 ВКПМ В-12405 характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Культурально-морфологические особенности штамма Achromobacter spanius. 10-50-TS2 ВКПМ В-12405. Колонии на ГРМ-агаре полупрозрачные, мелкие, круглые, с ровным краем, Грамотрицательныее палочки, отсутствие спор.

Культивирование штамма Achromobacter spanius 10-50-TS2 ВКПМ В-12405 осуществляют в термостате посевом клеток бактерий штрихом в стандартные пробирки на скошенный питательный агар для культивирования микроорганизмов (ГРМ-агар (г. Оболенск, ТУ 9398-020-78095326-2006) или питательный агар для культивирования широкого спектра микроорганизмов (ООО «НПЦ «Биокомпас-С», г. Углич, ТУ 9385-001-64786015-2012)) в аэробных условиях, в термостате при t° от +25 до +36°С 24 часа. Все работы по культивированию осуществляют при соблюдении стерильности.

Физиолого-биохимические особенности штамма Achromobacter spanius. 10-50-TS2 №В-12405: каталаза+, оксидаза+, рост на ЖСА-, лецитиназа-, кровяной агар+, гемолиз-, МПБ+, МПА+, рост на среде Сабуро-, анаэробный рост-, рост на цитратной среде-, глюкоза КГ+, арабиноза КГ+, ксилоза КГ+, манит-, крахмал-, казеин-, восстановление нитратов-, индол+.

Чувствительность к антибиотикам: штамм Achromobacter spanius. 10-50-TS2 ВКПМ В-12405. Заявляемый штамм чувствителен к пенициллину и налидиксовой кислоте, устойчив к линкомицину, эритромицину, стрептомицину.

Срок хранения высеянного в пробирки на питательную среду штамма Achromobacter spanius. 10-50-TS2 ВКПМ В-12405 в холодильнике (2°С - 5°С) 2 месяца.

Штамм бактерий Achromobacter spanius. 10-50-TS2 ВКПМ В-12405 не является зоопатогенным или фитопатогенным.

Метаболиты штамма бактерий Achromobacter spanius ВКПМ В-12405 в виде фильтрата из биомассы клеток были проверены в лабораторных условиях на способность стимулировать рост меристемной культуры Solanum tuberosum, путем ее предварительной обработки их раствором.

Достижение указанного технического результата изобретения проводилось следующим образом.

Культивирование штамма бактерий Achromobacter spanius. 10-50-TS2 ВКПМ В-12405 осуществляли по описанной выше методике. Штамм бактерий высевали штрихом в 5 пробирок на скошенный, приготовленный стандартным методом питательный агар (ГРМ-агар, г. Оболенск, ТУ 9398-020-78095326-2006) и культивировали в термостате 48 часа при t=26°C. Затем производили смыв микроорганизмов из каждой пробирки 5 мл дистиллированной воды. Концентрацию микроорганизмов определяли культуральным методом серийных разведений по количеству КОЕ на агаризованной питательной среде в чашках Петри (Герхард, 1984). После определения количества клеток бактерий Achromobacter spanius 10-50-TS2 в исходной маточной суспензии плотность культур доводили до рабочей концентрации в 1×109 м.к./мл (микробных клеток в 1 мл физиологического раствора). Затем суспензию клеток замораживали на 24 часа при Т-15^оС после чего ее оттаивали при Т-22^оС в течение 18 часов. Цикл замораживания-оттаивания повторяли 3 раза. По нашим экспериментальным данным этот способ увеличивает выход вторичных метаболитов бактерий в водную среду в 2 раза. Общая масса пептидных комплексов в фильтратах определялась биуретовым методом и методом жидкостной препаративной хроматографии на хроматографе фирмы «Gilson») и составляла 200 мкг/мл.

Получали стерильный раствор метаболитов методом фильтрования бактериальной суспензии через фильтр фирмы «Millipor» с диаметром пор 0,22 мкм (Durapore membrane filters, type 0.22 mm GV). Полученные фильтраты, содержащие метаболиты, использовали для дальнейшей работы. Для проведения исследований по влиянию метаболитов бактерий на развитие меристемных растений картофеля их в количестве (дозе) 250 мкл. (50 мкг по пептидным комплексам) раскапывали (наносили) на поверхность питательной среды Мурасиге-Скуга, разлитую в пробирки по 5 мл. В контрольном варианте, в том же объеме, добавляли отфильтрованный смыв с поверхности питательного агара для культивирования микроорганизмов. Через 60 минут в эти пробирки начинали высаживать микрочеренки меристемных растений Solanum tuberosum.

Исследование влияния микробных метаболитов в виде фильтрата из биомассы клеток проводилось на меристемных культурах Solanum tuberosum сорта «Жуковский ранний», селекции Всероссийского научно-исследовательского института картофельного хозяйства имени А.Г. Лорха. Микроклоны получали, вырезая участок побега каллусных растений с пазушной почкой размером 15 мм, с последующим их культивированием на среде Мурасиге-Скуга без гормонов. На поверхность среды, после высадки микрочеренков, добавляли по 250 мкл раствора бактериальных метаболитов (50 мкг по пептидным комплексам). В контрольном варианте, в том же объеме, добавляли отфильтрованный смыв с поверхности питательного агара для культивирования микроорганизмов. Оценка результатов эксперимента проводилась через 10, 20 и 30 суток. Критерием оценки являлся индекс отношения общей площади листовой поверхности к общей площади поверхности корневой системы меристемной культуры Solanum tuberosum.

Статистический обсчет материала проводился согласно международным требованиям, предъявляемым к обработке результатов данных научных исследований, при помощи программы для персональных компьютеров «SPSS 11,5 for Windows».

По сравнению с контрольной группой меристемных растений на всех этапах оценки в динамике эксперимента меристемные растения предварительно обработанные раствором метаболитами штамма бактерий Achromobacter spanius. 10-50-TS2 ВКПМ В-12405 в виде фильтрата из биомассы клеток обладали статистически достоверно (р<0,05) более высокими значениями, 0,561±0,014 и 0,675±0,019 соответственно, индекса отношения общей площади листовой поверхности к общей площади поверхности корневой системы меристемной культуры Solanum tuberosum. Данный факт однозначно указывают на способность метаболитов штамма бактерий Achromobacter spanius. 10-50-TS2 ВКПМ В-12405 в виде фильтрата из биомассы клеток в лабораторных условиях стимулировать, при предварительной обработке их раствором, рост меристемной культуры Solanum tuberosum.

Технико-экономическая эффективность предлагаемого технического решения, обусловлена получением более высоких значений индекса отношения общей площади листовой поверхности к общей площади поверхности корневой системы меристемной культуры Solanum tuberosum, что безусловно существенно сокращает сроки ее производства и увеличивает его экономическую эффективность.

Источники информации

1. Патент РФ №2005113784/13, 05.05.2005. Иванов А.А., Темнова О.В., Быкова Н.В., Орлова Н.А. Штамм микроорганизмов Bacillus mycoides var. В.А. для получения биопрепарата, используемого для стимуляции

2. Патент РФ №2012151104/10, 29.11.2012. Чеботарь В.К., Михеева М.А., Чижевская Е.П., Щербаков А.В., Петров В.Б, Быкова Н.В., Орлова Н.А., Темнова О.В. Штамм бактерий Bacillus subtilis 8А в качестве средства повышения продуктивности растений и их защиты от фитопатогенных микроорганизмов // Патент России №2495119. 2013. Бюл. №28.

3. Патент РФ №2013136149/10, 01.08.2013. Чеботарь В.К., Ерофеев С.В., Щербаков А.В., Чижевская Е.П. Штамм бактерий Bacillus pumillus А 1.5, в качестве средства повышения продуктивности растений и их защиты от болезней, вызываемых фитопатогенными микроорганизмами // Патент России №2551968. 2015. Бюл. №16.

4. Патент РФ №2016114388, 13.04.2016. Субботин A.M., Нарушко М.В., Петров С.А., Симонова Е.О., Доманская О. В. Штамм микроорганизма Bacillus cereus 875 TS в качестве средства повышения продуктивности растений // Патент России №2624032. 2017. Бюл. №19.

5. Патент РФ №2016125612, 27.06.2016. Субботин A.M., Симонова Е.О., Петров С.А. Штамм микроорганизмов Achromobacter spanius 10-50-TS2 в качестве средства повышения устойчивости растений к хлоридному засолению // Патент России №2607028. 2017. Бюл. №1.

Изобретение относится к области сельскохозяйственной биотехнологии. Штамм микроорганизма Achromobacteer spanius ВКПМ В-12405 может быть использован для стимуляции роста меристемной культуры Solanum tuberosum. Изобретение позволяет повысить выход меристемной культуры Solanum tuberosum.

Применение метаболитов штамма микроорганизма Achromobacteer spanius ВКПМ В-12405 в виде фильтрата из биомассы клеток в качестве средства для стимуляции роста меристемной культуры Solanum tuberosum.