Штамм микроорганизма Bacillus cereus 875 TS в качестве средства повышения продуктивности растений Российский патент 2017 года по МПК C12N1/20 A01N63/02 C12R1/85 

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии, в частности к штамму микроорганизмов для получения средства, используемого для стимуляции физиологических свойств растений, роста растений, фотосинтеза и повышения урожайности растений.

Современное высокоэффективное растениеводство заинтересовано в поиске препаратов биологического и, в частности, микробиологического происхождения для интенсификации производства без использования химических средств защиты растений и удобрений с целью получения экологически чистой продукции и уменьшения вредного влияния на окружающую среду.

Известен и описан ряд штаммов для использование в сельском хозяйстве, в частности для растениеводства.

Известен «Штамм бактерий Bacillus subtilis 8А в качестве средства повышения продуктивности растений и их защиты от фитопатогенных микроорганизмов», по патенту №2495119 С1 с приоритетом от 29.11.2012 г. Штамм бактерий Bacillus subtilis 8А, депонированный в коллекции ГНУ ВНИСХМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ под номером RCAM 00876, обладает ростостимулирующей активностью по отношению к различным сельскохозяйственным культурам.

Известен «Штамм бактерий Bacillus pumillus А 1.5 в качестве средства повышения продуктивности растений и их защиты от болезней, вызываемых фитопатогенными микроорганизмами» по патенту №2551968 С2 с приоритетом от 01.08.2013 г. Штамм обладает антагонистической активностью по отношению к фитопатогенным бактериям и грибам и ростостимулирующей активностью по отношению к растениям. Для обработки семян сельскохозяйственных растений на основе штамма Bacillus pumillus А 1.5 готовится препарат «Эндохит» с титром бактерий не менее 3×10⁸ КОЕ/мл. Обработка семян производится 10% раствором препарата.

Известен «Штамм микроорганизмов Bacillus mycoides var. В.A. для получения биопрепарата, используемого для стимуляции роста и защиты растений от болезней» патент №2284353 С1 с приоритетом от 05.05.2005 г. Указанный штамм выделен из ризосферной зоны проса обыкновенного.

Задачей изобретения является использование штамма микроорганизма в сельском хозяйстве в качестве средства повышения продуктивности растений. Указанная задача решается тем, что в качестве средств повышения продуктивности растений берется выделенный из образцов многолетнемерзлых пород галоценового периода штамм бактерий Bacillus cereus 875 TS.

Штамм Bacillus cereus 875 TS депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика за № В-12242 (копия справки о депонировании прилагается), выделен из многолетнемерзлых пород возрастом 10-12 тысяч лет, отобранных из бурового керна с глубины 10 м при бурении скважины в районе Тарко-Сале (Тюменская область).

Штамм Bacillus cereus 875 TS характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Культурально-морфологические особенности штамма Bacillus cereus № В-12242. Колонии на ГРМ-агаре матовые, шероховатые, мелкие, с неровным краем. Грамположительные палочки имеют центральное расположение споры.

Условия и состав сред для выращивания штамма Bacillus cereus № В-12242. Культивирование указанного штамма осуществляют в термостате посевом клеток бактерий штрихом в стандартные пробирки на скошенный питательный агар для культивирования микроорганизмов (ГРМ-агар (г. Оболенск, ТУ 9398-020-78095326-2006) или питательный агар для культивирования широкого спектра микроорганизмов (ООО «НПЦ «Биокомпас-С», г. Углич, ТУ 9385-001-64786015-2012)) в аэробных условиях, в термостате при t° от +22 до +36°С 18-24 часа. Оптимальная температура культивирования 26-30°С. Все работы по культивированию осуществляют при соблюдении стерильности.

Физиолого-биохимические особенности штамма Bacillus cereus 875 TS №В-12242: каталаза+, оксидаза+, рост на ЖСА+, лецитиназа-, желатиназа-, кровяной агар+, гемолиз-, МПБ+, МПА+, среда Сабуро-, анаэробный рост-, рост на цитратной среде+, глюкоза K+, манит-, арабиноза К+, ксилоза К+, крахмал-, казеин+, восстановление нитратов+, сероводород-, индол-.

Чувствительность к антибиотикам: штамм Bacillus cereus 875 TS №В-12242. Заявляемый штамм чувствителен к эритромицину, налидиксовой кислоте, стрептомицину и условно чувствителен к пенициллину, устойчив к линкомицину.

Срок хранения высеянного в пробирки на питательную среду штамма Bacillus cereus №В-12242 в холодильнике (2-5°С) 2 месяца.

Штамм бактерий Bacillus cereus 875 TS, № В-12242 не является зоопатогенным или фитопатогенным.

Штамм бактерий Bacillus cereus 875 TS, № В-12242 был проверен на способность повышать энергию прорастания и всхожесть семян пшеницы сорта Иргина, на морфометрические и фотосинтетические показатели проростков пшеницы после предпосевной обработки семян.

Достижение указанного технического результата изобретения проводилось следующим образом.

Культивирование штамма бактерий Bacillus cereus 875 TS № В-12242 осуществляли по описанной ниже методике. Штамм бактерий высевали штрихом в 5 пробирок на скошенный, приготовленный стандартным методом питательный агар (ГРМ-агар, г. Оболенск, ТУ 9398-020-78095326-2006) и культивировали в термостате 24 часа при t=26°C. Затем производили смыв микроорганизмов из каждой пробирки 5 мл дистиллированной воды. Концентрацию микроорганизмов определяли культуральным методом серийных разведений по количеству КОЕ на агаризованной питательной среде в чашках Петри (Герхард, 1984). После определения количества клеток бактерий Bacillus cereus в исходной маточной суспензии плотность культур доводили до рабочей концентрации в 1-3 × 10⁷ или 1-3 × 10⁹ КОЕ в 1 мл стерильной дистиллированной воды. Для приготовления рабочих водных суспензий штамма бактерий Bacillus cereus 875 TS, № В-12242 из маточных суспензий в производственных условиях пригодна водопроводная вода.

Семена пшеницы сорта Иргина (n=100) помещали в 50 мл бактериальной суспензии на 2 часа. Для увеличения адгезии МО в раствор для обработки семян добавляли сахарозу из расчета 50 г на 1 л дистиллированной воды. Посевы проводились в песок, двукратно прокаленный при t=250°C в течение часа. В отдельные вегетационные сосуды объемом 0,5 л высевали по 25 семян и однократно поливали 50 мл бактериальной суспензией. Повторность опыта 4-кратная. Семена проращивали в лабораторных условиях при температуре 22±1,5°С. На 5 сутки определяли энергию прорастания, на 10 сутки - лабораторную всхожесть семян. На 20 сутки эксперимента производили измерения морфофизиологических показателей растений.

Количество хлорофиллов (хл а, b) и каротиноидов определяли спектрофотометрическим методом. Навеску растительного материала растирали с Na₂SO₄ и 96% этиловым спиртом. Полученный гомогенат фильтровали и количественно переносили в мерную колбу. Для расчета концентраций хлорофиллов а, b и каротиноидов в вытяжке пигментов определяли ее оптическую плотность на спектрофотометре ПЭ-5400УФ при длинах волн, соответствующих максимумам поглощения определяемых пигментов в данном растворителе λ=662, 644 и 440 нм. Контроль - чистый растворитель (96%-ный спирт). Концентрацию пигментов в вытяжке рассчитывали по следующим формулам (Шульгин, 1974): Са = 9,78Д662-0,99Д644; Св = 21,43Д644-4,65Д662; Ск = 4,7Д440 - (1,38Д662 - 5,48Д644), где Д - оптическая плотность при данной длине волны, С - концентрация хлорофилла или каротиноидов.

Статистическая обработка полученных данных проводилась с помощью программы «SPSS ver. 11.5. for Windows».

Результаты измерений приведены в таблицах 1-3.

Результаты опытов влияние штамма бактерий Bacillus cereus 875 TS № В-12242 на способность повышать энергию прорастания и всхожесть семян пшеницы сорта Иргина, на морфометрические и фотосинтетические показатели проростков пшеницы после предпосевной обработки семян показали следующее. Заявленный штамм повысил энергию прорастания на 97%, лабораторную всхожесть на 17%, привел к увеличению длины побега проростков пшеницы на 10%, длины колеоптиля на 19%, длины и площади первого листа около 30%, количеству корней на 9%. При этом наблюдается активация системы фотосинтеза: значительное увеличение в проростках растений хлорофила а, хлорофила b, каротиноидов и, соответственно, их суммарного количества.

Заявленное изобретение позволяет использовать штамм Bacillus cereus 875 TS, выделенный из многолетнемерзлых пород и сохранивший в них свою жизнеспособность, для разработки биопрепаратов с целью повышения продуктивности растений (роста и развития растений, повышения энергии прорастания семян, их всхожести, стимуляции развития корневой системы и работы фотосинтетического аппарата, увеличения урожайности), в том числе для зон рискованного земледелия.

Приведенные результаты исследования подтверждают достижение технического результата и соответствие заявленного штамма критериям новизна, изобретательский уровень, промышленная применимость.

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии. Штамм Bacillus cereus 875 TS обладает способностью стимулировать рост растений. Штамм Bacillus cereus депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика под регистрационным номером ВКПМ В-12242 и может быть использован для стимуляции физиологических свойств растений, роста растений и фотосинтеза. Изобретение позволяет повысить урожайность растений. 3 табл.

Штамм микроорганизма Bacillus cereus 875 TS, депонированный во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика под № В-12242, в качестве средства повышения продуктивности растений.