Штамм микроорганизмов Bacillus megaterium 2-06-TS1 в качестве активатора фотосинтеза и энергии прорастания растений Российский патент 2017 года по МПК A01N63/02 C12N1/20 C12R1/11 

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии, в частности к штамму микроорганизмов для получения средства, используемого для стимуляции физиологических свойств растений, активации системы фотосинтеза и повышения урожайности растений.

Для интенсификации производства без использования химических средств защиты растений и удобрений с целью получения экологически чистой продукции и уменьшения вредного влияния на окружающую среду современное высокоэффективное растениеводство заинтересованно в поиске препаратов биологического и, в частности, микробиологического происхождения.

Известен и описан ряд штаммов для использования в сельском хозяйстве, в частности для растениеводства.

Известен «Многофункциональный биоактиватор плодообразования», по патенту №2225383 С2 с приоритетом от 06.02.2001 г. Предложен многофункциональный активатор плодообразования на основе природных фитогормонов, содержащий микро- и макроэлементы. Активатор содержит одновременно два фитогормона: цитокинины, продуцируемые консорциумом молочнокислых бактерий (ВКПМ В-5973), состоящим из Lactobacillus lactis, Lactobacillus salivarius, var. salivarius, Lactobacillus acidophilus, и гиббереллины в виде солей гиббереллиновых кислот, карбамид, микроэлементы в виде калиевых солей фосфорной и серной кислот, микроэлементы Zn, В, Mn, Mg, Fe, Cu, а также стабилизаторы, природные биополимеры, поверхностно-активное вещество, сухой обрат или молочную сыворотку, цитрат калия. При этом многофункциональный биоактиватор плодообразования содержит сухой обрат или молочную сыворотку в количестве 20-30%, макроэлементы в виде калийных солей фосфорной и серной кислот в соотношении ₂НРО₄:KH₂PO₄:K₂SO₄ - 3:3:1 соответственно в количестве 0,9-45; 0,9-45; 0,5-13%, а микроэлементы Zn, В, Mn, Mg, Fe, Cu в количестве 0,16-2% суммарно в форме солей или комплексонатов, карбамид в количестве 4,8-55%, природные биополимеры в количестве 0,1-0,5%, цитрат калия в количестве 0,1-1,5%), стабилизаторы - в количестве 0,1-0,3%), поверхностно-активное вещество в количестве 1-2%. Изобретение способствует увеличению числа женских цветков, лучшему опылению цветков и завязыванию плодов, повышению интенсивности фотосинтеза, адсорбционно-поглотительной способности корней растений, урожая и его качества, защите растений от болезней, продлению периода сбора урожая.

Известен «Активатор фотосинтеза» патент №2092472 С1 с приоритетом от 30.12.1992 г. Сущность изобретения: активатор фотосинтеза содержит (в %) жидкую культуру консорциума термофильных молочнокислых бактерий (Lactobacillus lactis, Lactobacillus salivarius var salivarius, Lactobacillus acidophilus ВКПМ B-5973, выращенных на обезжиренном молоке до рН 3,8-4,0 в количестве 30,00-35,00; натрий бензоат 0,20-0,25; кальций пропионат 0,20-0,25; сухие водоросли 1,00-2,00; аскорбиновую кислоту 0,10-0,12; комплексонаты металлов Cu, Mn, Mo, Fe, Mg, Zn в виде калиевых или натриевых солей ОЭДФ или ЭДЦЯК 0,10-0,12, мочевину 1,00-1,40; калий фосфорнокислый однозамещенный 0,08-0,10 и воду до 100%, при этом рН активатора 4,5-4,7. Активатор фотосинтеза может дополнительно содержать пропинол Б-400 в количестве 3,0-5,0% от общего объема. Активатор способствует увеличению интенсивности фотосинтеза, что приводит к увеличению урожая сельскохозяйственных культур на 15-40%.

Известен «Штамм бактерий Bacillus pumillus А 1.5, в качестве средства повышения продуктивности растений и их защиты от болезней, вызываемых фитопатогенными микроорганизмами» по патенту №2551968 С2 с приоритетом от 01.08.2013 г. Штамм обладает антагонистической активностью по отношению к фитопатогенным бактериям и грибам и ростстимулирующей активностью по отношению к растениям. Для обработки семян сельскохозяйственных растений на основе штамма Bacillus pumillus А 1.5 готовится препарат «Эндохит» с титром бактерий не менее 3×10⁸ КОЕ/мл. Обработка семян производится 10% раствором препарата.

Задачей изобретения является использование штамма микроорганизма в сельском хозяйстве в качестве средства повышения продуктивности растений и расширения арсенала подобных средств. Указанная задача решается за счет того, что в качестве средства повышения энергии прорастания и всхожести семян, содержания фотосинтетических пигментов растений берется выделенный из образцов многолетнемерзлых пород галоценового периода штамм бактерий Bacillus megaterium 2-06-TS1.

Штамм Bacillus megaterium 2-06-TS1 депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУПГосНИИГенетика за № В-12402 (копия справки о депонировании прилагается), выделен из многолетнемерзлых пород (отторфованая глина), отобранных из бурового керна с глубины 10 м при бурении скважины в районе Тарко-Сале (Тюменская область). Координаты N 65.02.489, Е 77.29.998.

Штамм Bacillus megaterium 2-06-TS1 характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Культурально-морфологические особенности штамма Bacillus megaterium 2-06-TS1 №В-12402. Колонии на ГРМ-агаре матовые, шероховатые, мелкие, с неровным краем. Грамположительные палочки имеют центральное расположение споры.

Условия и состав сред для выращивания штамма Bacillus megaterium 2-06-TS1 № В-12402. Культивирование указанного штамма осуществляют в термостате посевом клеток бактерий штрихом в стандартные пробирки на скошенный питательный агар для культивирования микроорганизмов (ГРМ-агар (г. Оболенск, ТУ 9398-020-78095326-2006) или питательный агар для культивирования широкого спектра микроорганизмов (ООО «НПЦ «Биокомпас-С», г. Углич, ТУ 9385-001-64786015-2012)) в аэробных условиях, в термостате при t° от +25°C до +36°C, 18-24 часа. Все работы по культивированию осуществляют при соблюдении стерильности.

Физиолого-биохимические особенности штамма Bacillus megaterium 2-06-TS1 № В-12402: каталаза+, оксидаза+, рост на среде ЖСА+, лецитиназа-, желатиназа-, рост на кровяном агаре+, гемолиз+, рост на среде МПБ+, рост на среде МПА+, рост на среде Сабуро-, анаэробный рост-, рост на цитратной среде+, глюкоза К+, манит К+, арабиноза КГ+, ксилоза К+, крахмал-, казеин+, восстановление нитратов+, сероводород-, индол-.

Чувствительность к антибиотикам: штамм Bacillus megaterium 2-06-TS1 № В-12402. Заявляемый штамм чувствителен к пенициллину, налидиксовой кислоте, стрептомицину и условно чувствителен к эритромицину и линкомицину.

Срок хранения высеянного в пробирки на питательную среду штамма Bacillus megaterium 2-06-TS1 в холодильнике (2-5°C) 2 месяца.

Штамм бактерий Bacillus megaterium 2-06-TS1, № В-12402 не является зоопатогенным или фитопатогенным.

Штамм бактерий Bacillus megaterium 2-06-TS1, № В-12402 был проверен на способность повышать энергию прорастания и всхожесть семян пшеницы сорта Иргина, на морфометрические и фотосинтетические показатели проростков пшеницы после предпосевной обработки семян.

Достижение указанного технического результата изобретения проводилось следующим образом.

Культивирование штамма бактерий Bacillus megaterium 2-06-TS1 № В-12402 осуществляли по описанной ниже методике. Штамм бактерий высевали штрихом в 5 пробирок на скошенный, приготовленный стандартным методом питательный агар (ГРМ-агар, г. Оболенск, ТУ 9398-020-78095326-2006) и культивировали в термостате 24 часа при t=26°C. Затем производили смыв микроорганизмов из каждой пробирки 5 мл дистиллированной воды. Концентрацию микроорганизмов определяли культуральным методом серийных разведений по количеству КОЕ на агаризованной питательной среде в чашках Петри (Герхард, 1984). После определения количества клеток бактерий Bacillus megaterium в исходной маточной суспензии плотность культур доводили до рабочей концентрации в 1-3 × 10⁷ или 1-3 × 10⁹ КОЕ в 1 мл стерильной дистиллированной воды. Для приготовления рабочих водных суспензий штамма бактерий Bacillus megaterium 2-06-TS1, № В-12402 из маточных суспензий в производственных условиях пригодна водопроводная вода.

Семена пшеницы сорта Иргина (n=100) помещали в 50 мл бактериальной суспензии на 2 часа. Для увеличения адгезии микроорганизмов в раствор для обработки семян добавляли сахарозу из расчета 50 г на 1 л дистиллированной воды. Посевы проводились в песок, двукратно прокаленный при t=250°C в течение часа. В отдельные вегетационные сосуды объемом 0,5 л высевали по 25 семян и однократно поливали 50 мл бактериальной суспензией. Повторность опыта 4-кратная. Семена проращивали в лабораторных условиях при температуре 22±1,5°C. На 5 сутки определяли энергию прорастания, на 10 сутки - лабораторную всхожесть семян. На 20 сутки эксперимента производили измерения морфофизиологических показателей растений.

Количество хлорофиллов a, b и каротиноидов определяли спектрофотометрическим методом. Навеску растительного материала растирали с Na₂SO₄ и 96%-ным этиловым спиртом. Полученный гомогенат фильтровали и количественно переносили в мерную колбу. Для расчета концентраций хлорофиллов a, b и каротиноидов в вытяжке пигментов определяли ее оптическую плотность на спектрофотометре ПЭ-5400УФ при длинах волн, соответствующих максимумам поглощения определяемых пигментов в данном растворителе, λ=662, 644 и 440 нм. Контроль - чистый растворитель (96% спирт). Концентрацию пигментов в вытяжке рассчитывали по следующим формулам (Шульгин, 1974): Са=9,78Д662-0,99Д644; Cb=21.43Д644-4,65Д662; Cк=4,7Д440-(1,38Д662-5,48Д644), где Д - оптическая плотность при данной длине волны, С-концентрация хлорофилла или каротиноидов.

Статистическая обработка полученных данных проводилась с помощью программы «SPSS ver. 11.5. for Windows».

Результаты измерений приведены в таблицах 1-3.

Результаты опытов по влиянию штамма бактерий Bacillus megaterium 2-06-TS1 № В-12402 на способность повышать энергию прорастания и всхожесть семян пшеницы сорта Иргина, на морфометрические и фотосинтетические показатели проростков пшеницы после предпосевной обработки семян показали следующее. Заявленный штамм повысил энергию прорастания на 35%, лабораторную всхожесть на 23%, привел к увеличению количества корней на 22%, не оказав достоверного влияния на другие морфометрические показатели. При этом наблюдается активация системы фотосинтеза: значительное увеличение в проростках растений хлорофила b на 35%, каротиноидов на 10% и суммарного количества пигментов фотосинтеза растений на 14%.

Заявленное изобретение позволяет использовать штамм Bacillus megaterium 2-06-TS1, выделенный из многолетнемерзлых пород, для разработки биопрепаратов с целью повышения продуктивности растений (повышения энергии прорастания семян, их всхожести, стимуляции развития корневой системы и работы фотосинтетического аппарата).

Приведенные результаты исследования подтверждают достижение технического результата и соответствие заявленного штамма критериям новизна, изобретательский уровень, промышленная применимость.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения препарата для стимуляции роста растений. Штамм бактерий Bacillus megaterium 2-06-TS1 депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУПГосНИИГенетика под регистрационным номером ВКПМ В-12402. Изобретение позволяет повысить энергию прорастания семян, всхожесть растений, увеличить развитие корневой системы и увеличить в проростках растений содержание хлорофилла b, каротиноидов и суммарного количества пигментов фотосинтеза растений. 3 табл.

Штамм микроорганизмов Bacillus megaterium 2-06-TS1, депонированный во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУПГосНИИГенетика под номером ВКПМ В-12402 в качестве активатора фотосинтеза и энергии прорастания растений.