НЕПРИРОДНЫЕ СЕМАФОРИНЫ КЛАССА 3 И ИХ МЕДИЦИНСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2020 года по МПК C07K14/47 C07K16/18 C07K16/26 A61K38/00 A61P19/10 A61P25/00 

Данное изобретение относится к неприродным мутантным молекулам семафорина класса 3. В частности, данное изобретение относится к мутантному семафорину класса 3 или его функциональному фрагменту, который демонстрирует улучшенные свойства и фармакологические эффекты, например при лечении ангиогенного заболевания и рака. Кроме того, данное изобретение относится к молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим такие полипептиды, а также к векторам и хозяевам, содержащим такие нуклеиновые кислоты. Данное изобретение также относится к способам получения полипептидов согласно данному изобретению и к способам их применения в лечении заболеваний, в частности, в медицинском вмешательстве при ангиогенных заболеваниях, опухолях и/или раке.

Развитие, прогрессирование и метастазирование рака в решающей степени зависят от ангиогенеза, т.е. от формирования новых кровеносных сосудов. Тем не менее из-за аномалий, таких как извилистость, утечка из-за слабых межклеточных контактов между клетками сосудистого эндотелия (endothelial cells, ЕС), которые выстилают их стенки, а также отсутствие выстилающих пристенных перицитов, кровеносные сосуды раковых опухолей являются структурно и функционально аберрантными (Goel et al., 2011). В результате сосудистая проницаемость, как правило, повышена в раковых тканях, белки и жидкости накапливаются во внесосудистом компартменте, в котором значительно повышается интерстициальное давление, что в конечном итоге ухудшает доставку противораковых лекарственных препаратов (Goel et al., 2011). Кроме того, хроническая нехватка кислорода усиливает сигналинг гепатоцитарного фактора роста/тирозинкиназы Met (Michieli, 2009), что в сочетании с аномальной сосудистой проницаемостью значительно способствует интравазии раковых клеток, распространению через кровоток и метастазированию. Нормализация архитектуры и функции кровеносных сосудов раковой опухоли может привести к значительному повышению эффективности стандартной противораковой терапии, которая в противном случае может быть снижена вследствие неправильного упрощения кровеносных сосудов, связанного со стандартными антиангиогенными способами лечения (Van der Veldt et al., 2012). Примечательно, что четкие доказательства указывают на то, что наиболее эффективные преимущества терапии, нормализующей сосудистую сеть, являются результатом смягчения при раках различных явлений, связанных с гипоксией, таких как значительное увеличение раковых стволовых клеток (Conley et al., 2012), индукция дедифференцировки раковых клеток (Michieli, 2009) и стимуляция инвазии и метастазирования рака (Michieli, 2009; Sennino and McDonald, 2012). Таким образом, для достижения способности превращать аберрантные кровеносные сосуды раковой опухоли в квазинормальную сосудистую сеть необходимо идентифицировать молекулы, которые поддерживают физиологический сосудистый морфогенез и поэтому являются медицинским применением в лечении, например, нарушений, при которых происходит аберрантный сосудистый морфогенез, и/или при которых нарушается нормальный сосудистый морфогенез, как в (солидных) раковых опухолях.

Семафорин 3А (также известный как Sema3A у мышей и SEMA3A у людей) представляет собой молекулу, нормализующую физиологическую сосудистую сеть. В проведенных ранее исследованиях были идентифицированы молекулы, которые в принципе могут быть фармакологическим образом использованы для лечения, направленного на нормализацию сосудистой сети/аномального сосудистого генеза раковой опухоли (Goel et al., 2011). Ингибирование проангиогенных факторов, таких как фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), может нормализовать сосудистую сеть раковой опухоли. Тем не менее, основным препятствием такого рода клинического вмешательства является тот факт, что эти проангиогенные факторы проявляют ограниченную во времени эффективность (Goel et al., 2011). Кроме того, сосудистые сети находятся под одновременным и сбалансированным контролем проангиогенных и антиангиогенных факторов, функция которых изменяется в раковых тканях (Maione et al., 2012; Maione et al., 2009).

В ходе развития эмбрионального сосуда ЕС создают аутокринные хеморегуляторные сигналы секретируемого 3-го класса семафоринов (также известных как Sema3), которые путем ингибирования интегринов, которые являются основным классом рецепторов внеклеточного матрикса (extracellular matrix, ЕСМ) в многоклеточных организмах, придают сосудистой системе требуемую пластичность для ее перестройки (Serini et al., 2003). Различные трансгенные мышиные модели рака помогли выяснить, что во время ракового ангиогенеза семафорин 3А также экспрессируется в ЕС, где он выступает в качестве эндогенного ингибитора, который присутствует в предзлокачественных поражениях, но теряется при прогрессировании рака (Maione et al., 2009). Важно отметить, что отсутствие семафорина 3А в явных раковых поражениях четко коррелировало с резким увеличением активации интегрина в ЕС (Maione et al., 2009). Повторное введение семафорина 3А в раковые опухоли путем соматического переноса генов восстанавливало физиологические количества активных эндотелиальных интегринов, что в конечном итоге приводило к снижению плотности кровеносных сосудов, структурной и функциональной нормализации сосудистой сети, ингибированию роста и метастазирования рака и значительному увеличению выживаемости (Maione et al., 2012; Maione et al., 2009). Таким образом, семафорин 3А может быть агентом, нормализующим физиологическую сосудистую сеть (Serini et al., 2012).

Семафорин 3А принадлежит семейству семафоринов (обозначаемому как Sema), которое классифицируется на семь разных классов на основании сходстве уникальных доменов, расположенных на их С-конце (Tran et al., 2007). Их N-конец содержит "sema-домен", семилопастный β-пропеллер (Gherardi et al., 2004), за которым следует домен плексин-семафорин-интегрин (Plexin-Semaphorin-lntegrin, PSI).

Семафорины представляют собой гомодимерные лиганды, которые передают сигнал через плексины (Kumanogoh and Kikutani, 2013; Tamagnone et al., 1999), класс рецепторов, содержащих sema-домен, наделенных внеклеточным sema-доменом и активностью цитозольного ГТФаза-активирующего белка (GTPase-activating protein, GAP), который ингибирует R-Ras (Kumanogoh and Kikutani, 2013; Tran et al., 2007) и Rap1 (Bos and Pannekoek, 2012; Wang et al., 2012), две небольшие ГТФазы, известные своей способностью стимулировать клеточную адгезию, опосредованную интегрином, с белками ЕСМ (Kinbara et al., 2003; Shattil et al., 2010). Семафорин 3А передает сигнал посредством активации и фосфорилирования внеклеточных сигнально-регулируемых киназ 1 и 2 (ERK 1/2) (Kruger et al., 2005). Гомодимеры sema-домена семафоринов, связанных с мембраной, напрямую связываются с высокой аффинностью с sema-доменами плексинов. Это вызывает димеризацию и активацию плексина (Janssen et al., 2010; Nogi et al., 2010). В некоторых семафоринах, таких как семафорин 3А, рецепторный комплекс образован нейропилином 1 (Nrp1) в сочетании с плексинами типа A (Plexin A) ((Tamagnone et al., 1999), представляющими связывающие лиганд и трансдуцирующие сигнал субъединицы (Kumanogoh and Kikutani, 2013). Последовательно, после sema-PSI- и иммуноглобулин(Ig)-подобных доменов, семафорин 3А и другие секретируемые семафорины содержат С-концевую основную аминокислотную область (растяжку). В то время как связанные дисульфидным мостиком Ig-подобные домены могут физически стабилизировать гомодимеризацию sema-доменов, С-концевая основная область требуется для высокоаффинного связывания семафина 3А с субдоменом М во внеклеточной группировке Nrp1 (фиг. 1) (Kumanogoh and Kikutani, 2013).

Семафорин 3А содержит многочисленные мотивы распознавания фуриновых протеаз, которые после расщепления могут привести к высвобождению этой С-концевой части молекулы. Это приводит как к ухудшению связывания семафорина 3А с Nrp1, так и к стабилизации гомодимеров семафорина 3А (Adams et al., 1997; Koppel and Raper, 1998; Parker et al., 2010; Parker et al., 2012). Поскольку семафорин 3А напрямую не связывает плексин с высокой аффинностью (Tamagnone et al., 1999), то его фурин-зависимое расщепление и отсутствие связывания с Nrp1, как было установлено, приводят к резкой потере активности в некоторых биологических условиях, в частности, при коллапсе конуса роста нейронов (Koppel and Raper, 1998). Примечательно, что фуриновые протеазы широко присутствуют в ткани, что обеспечивает встроенный регуляторный механизм для семафорина 3А. Тем не менее эти протеазы также могут приводить к короткоживущей активности семафорина 3А.

Связывание семафорина 3А с Nrp1 отвечает за индуцированный семафорином 3А вход макрофагов в сосудистые области раковой опухоли, способствующий прогрессированию рака (Casazza et al., 2013). Поэтому высокоаффинное взаимодействие семафорина 3А дикого типа с Nrp1 ограничивает возможность его использования в качестве эффективного противоракового препарата и даже потенциально способствует прогрессированию рака.

Техническая проблема, лежащая в основе данного изобретения, заключается в предоставлении средств и способов для улучшенной терапии ангиогенных нарушений, опухолевых заболеваний и/или рака.

Данная техническая проблема решается путем предоставления воплощений, предусмотренных в данном документе ниже и охарактеризованных в прилагаемой формуле изобретения.

Данное изобретение относится к неприродному/генетически модифицированному/мутантному семафорину класса 3, в частности, к неприродному/генетически модифицированному/мутантному семафорину, выбранному из группы, состоящей из семафорина 3А, семафорина 3В, семафорина 3С и семафорина 3D, наиболее предпочтительно к неприродному/генетически модифицированному/мутантному семафорину 3А.

Соответственно, данное изобретение относится к мутантному семафорину 3 (или его функциональному фрагменту, функционирующему в качестве ингибитора ангиогенеза или гибридного белка/полипептида, содержащего указанный мутантный семафорин или указанный функциональный фрагмент), который (a) содержит гидрофильную аминокислоту на месте аланина, соответствующего позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2; или

(b) содержит гидрофильную аминокислоту на месте аланина в позиции, которая при сравнении гомологии соответствует в других белках семафоринах 3 позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2; а также

(c) где указанный семафорин 3 выбран из группы семафорина 3А, семафорина 3В, семафорина 3С и семафорина 3D, где предпочтительно указанный семафорин 3 представляет собой семафорин 3А.

Таким образом, данное изобретение в целом предусматривает семафорины 3А, 3В, 3С и 3D, которые являются неприродными и которые содержат гидрофильную аминокислоту вместо аланина в позиции 106 иллюстративного семафорина 3А, показанного в SEQ ID NO 2.

Ниже приведены соответствующие позиции этой мутации в других белках семафоринах 3 помимо семафорина 3А, а именно в семафоринах 3В, С и D.

Примерами этих мутантных семафоринов 3 являются семафорины, содержащие указанную гидрофильную аминокислоту на месте аланина, соответствующего позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2; указанную гидрофильную аминокислоту на месте аланина, соответствующего позиции 105 семафорина 3В дикого типа, показанного в SEQ ID NO 6; причем указанная гидрофильная аминокислота на месте аланина соответствует позиции 104 семафорина 3С дикого типа, показанного в SEQ ID NO 10; или указанная гидрофильная аминокислота на месте аланина соответствует позиции 120 семафорина 3D дикого типа, показанного в SEQ ID NO 14.

Другими словами, данное изобретение предусматривает неприродный/генетически модифицированный/мутантный семафорин 3А, семафорин 3В, семафорин 3С и/или семафорин 3D, где указанный семафорин 3, указанный его функциональный фрагмент и/или указанный гибридный белок/полипептид содержит аминокислотную последовательность CX₁X₂A₃GKD где:

Х₁ представляет собой K или N;

Х₂ представляет собой аминокислоту, выбранную среди W, М и L; и

А₃ представляет собой гидрофильную аминокислоту, которая замещает указанный аланин.

Приведенный в данном документе консенсусный мотив CX₁X₂A₃GKD идентифицирован впервые в данном изобретении.

Данное изобретение также относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей неприродные полипептиды согласно данному изобретению, т.е. мутантный семафорин 3, выбранный из группы, состоящей из мутантного семафорина 3А, мутантного семафорина 3В, мутантного семафорина 3С и/или мутантного семафорина 3D, охарактеризованного и описанного в данном документе. Также представлены молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют описанные в данном документе функциональные фрагменты неприродных семафоринов 3, а также молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие гибридные белки/полипептиды, содержащие предлагаемые в данном изобретении неприродные семафорины 3 или указанные функциональные фрагменты. Как указано в данном документе, функциональные фрагменты, а также гибридные полипептиды/белки согласно данному изобретению сохраняют удивительно высокое ингибирование ангиогенеза и/или способны к неожиданно высокой сосудистой нормализации болезненных тканей (например, в раковой ткани и/или опухолях). Соответственно, данное изобретение предусматривает молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют полипептиды согласно данному изобретению. Полипептиды согласно данному изобретению представляют собой мутантные семафорины 3 или их функциональные фрагменты, описанные в данном документе. Полипептиды согласно данному изобретению также содержат гибридные белки, которые содержат мутантный семафорин 3 (или функциональный фрагмент такого мутантного семафорина 3, описанный в данном документе). Полипептиды согласно данному изобретению, в частности, гибридные белки, определенные в данном документе, действуют как ингибиторы ангиогенеза и/или как сосудистые нормализующие агенты, где аланин, соответствующий позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, или аланин в позиции, которая при сравнении гомологии соответствует в других белках семафоринах 3 позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, заменен гидрофильной аминокислотой, где указанный семафорин 3 выбран из группы семафорина 3А, семафорина 3В, семафорина 3С и семафорина 3D.

В частности, данное изобретение относится к молекулам нуклеиновых кислот, где закодированный мутантный семафорин 3 (или указанный его функциональный фрагмент или указанный гибридный полипептид/белок) содержит консенсусный мотив аминокислотной последовательности CX₁X₂A₃GKD, где

Х₁ представляет собой аминокислоту, которая представляет собой K или N;

Х₂ представляет собой аминокислоту, выбранную среди W, М и L;

и где аланин (А₃) замещен указанной гидрофильной аминокислотой, в частности лизином, аргинином, аспарагином, глутамином, серином, треонином, глутаминовой кислотой, аспарагиновой кислотой или гистидином, более предпочтительно лизином или аргинином, наиболее предпочтительно лизином.

Предусмотренные в данном документе

неприродные/искусственные/мутантные семафорины (или описанные в данном документе их функциональные фрагменты и/или гибридные белки, содержащие указанные неприродные/искусственные/мутантные семафорины или указанные неприродные/искусственные/мутантные функциональные фрагменты указанных семафоринов) имеют высокий медицинский потенциал. Как проиллюстрировано в прилагаемых примерах, медицинское применение предусмотренных в данном документе молекул согласно данному изобретию состоит в удивительном снижении прогрессирования и метастазирования рака на моделях рака in vivo. Этот эффект in vivo неожиданно превосходит любой эффект, задокументированный или замеченный для природных семафоринов, таких как семафорин 3А дикого типа. Этот удивительный эффект проиллюстрирован в данном документе некоторыми выбранными семафоринами (семафоринами класса 3, выбранными из группы, состоящей из семафорина 3А, семафорина 3В, семафорина 3С и семафорина 3D), содержащими искусственную замену (природного) аланина (А₃) на гидрофильную аминокислоту в указанном в данном документе консенсусном мотиве CX₁X₂A₃GKD семафорина 3, описанного в данном документе. Эта замена в указанных семафоринах (или в их функциональных фрагментах, которые содержат указанный мотив) приводит к неожиданно повышенной аффинности к его рецептору плексину по сравнению с немодифицированной природной версией дикого типа указанных семафоринов (выбранных из группы, состоящей из семафорина 3А, семафорина 3В, семафорина 3С и семафорина 3D). Другими словами, данное изобретение предусматривает неприродные мутантные семафорины класса 3, выбранные из группы, состоящей из мутантного семафорина 3А, мутантного семафорина 3В, мутантного семафорина 3С и мутантного семафорина 3D. Соответственно, данное изобретение предусматривает неприродные мутантные семафорины класса 3, которые выбраны из группы, состоящей из мутантного семафорина 3А, мутантного семафорина 3В, мутантного семафорина 3С и мутантного семафорина 3D. Описанные в данном документе мутантные семафорины 3 (или функциональный фрагмент этих мутантных семафоринов согласно данному изобретению, а также гибридные белки, содержащие описанные в данном документе мутантные неприродные семафорины или их функциональные фрагменты) связываются с рецептором плексином с удивительно высокой аффинностью. Повышенная аффинность связывания обходит необходимость вовлечения амбивалентного белка Nrp1. Кроме того, высокоаффинное связывание мутантного семафорина 3 (или описанного в данном документе его функционального фрагмента или описанных в данном документе гибридных белков) с рецептором плексином эффективно инициирует его последующий сигналинг, что приводит к желательной нормализации сосудов и/или физиологическому неболезненному ангиогенезу. Без привязки к конкретной теории предполагается, что мутантные семафорины 3 согласно данному изобретению (или функциональные фрагменты или гибридные белки согласно данному изобретению, содержащие их) обеспечивают высокоаффинное связывание рецептора плексина независимо от Ig-подобного домена/основной области, которая содержит многочисленные мотивы распознавания фуриновой протеазы. В некоторых воплощениях данное изобретение относится к мутантному семафорину 3 или его фрагменту, где Ig-подобный домен/основной участок удален. Из-за отсутствия участков расщепления протеазой (фурином), описанных выше, и как показано на прилагаемой фиг. 2, время удерживания белков согласно данному изобретению может быть увеличено.

Как описано в приведенных ниже примерах in vitro и in vivo, было неожиданно обнаружено, что замещение аланина А₃ гидрофильной аминокислотой в консенсусном мотиве CX₁X₂A₃GKD семафорина 3 (или его функциональных фрагментов), выбранного из группы, состоящей из семафорина 3А, семафорина 3В, семафорина 3С и семафорина 3D, приводит к увеличению связывания с его рецептором плексином. Таким образом, неприродные мутантные семафорины 3 согласно данному изобретению (или их функциональные фрагменты или гибридные полипептиды/белки, содержащие указанные семафорины 3 или их функциональные фрагменты) связываются с высокой аффинностью с их рецептором плексином независимо от Nrp1. В данном документе также подтверждено, что замена аланина гидрофильной аминокислотой в консенсусном мотиве CX₁X₂A₃GKD семафорина 3 (или в функциональных фрагментах указанного семафорина 3, содержащего указанный консенсусный мотив с его мутацией/модификацией) приводит к неожиданно усиленной активации рецепторов плексинов и к неожиданно увеличенному ингибированию гаптотактической миграции человеческих ЕС. Связывание и активация рецептора плексина является критическим этапом в управлении активацией интегрина, клеточной адгезией и миграцией к белкам ЕСМ. Без привязки к конкретной теории предполагается, что активация рецепторов плексинов через семафорины инактивирует интегрины и таким образом снижает подвижность клеток в ЕСМ. Клеточная миграция имеет решающее значение для прогрессирования рака и распространения метастазов. Следовательно, мутантный семафорин 3 (и его функциональные фрагменты) согласно данному изобретению может быть использован для эффективного ингибирования прогрессирования и метастазирования рака. Без привязки к конкретной теории предполагается, что мутантные семафорины 3 согласно данному изобретению (и/или их функциональные фрагменты и/или гибридные белки/полипептиды, содержащие указанные мутантные семафорины или описанные в данном документе функциональные фрагменты), связываются с высокой аффинностью с соответствующим рецептором плексином, эффективно активируют соответствующий нисходящий путь и эффективно ингибируют подвижность клеток. Как показано и описано в примерах, описанная в данном документе искусственно введенная модификация в некоторых семафоринах класса 3 (семафорин 3А, семафорин 3В, семафорин 3С и семафорин 3D) приводит к образованию неожиданно эффективных молекул, которые даже in vivo демонстрируют усиленное снижение прогрессирования и/или метастазирования рака. Описанные в данном документе мутантные/неприродные семафорин-подобные молекулы демонстрируют неожиданно улучшенные свойства in vivo и/или in vitro по сравнению с природными семафоринами 3. В данном документе описано и показано в прилагаемых примерах, что замена аланина в консенсусном мотиве CX₁X₂A₃GKD семафоринов 3 (или в их функциональных фрагментах или в гибридных полипептидах/белках, содержащих описанные в данном документе неприродные семафорины 3 или содержащих описанные в данном документе функциональные фрагменты с указанным мутантным мотивом) приводит к усиленному снижению прогрессирования и метастазирования рака. Замена указанного аланина (А₃) предпочтительно представляет собой гидрофильную аминокислоту, наиболее предпочтительно лизин. Это полученное уменьшение прогрессирования и метастазирования рака с помощью неприродного мутантного семафорина 3 неожиданно превосходит эффект, наблюдаемый с обычными или природными семафоринами, такими как семафорин 3А дикого типа. В частности, данные in vivo, предусмотренные в данном документе, доказывают неожиданно повышенное ингибирование роста раковой опухоли и объема метастазов. Две мышиные модели человеческого рака подтверждают благоприятный фармакологический эффект.

Соответственно, как описано в прилагаемых примерах и как объяснено в данном документе, предлагаемые в данном изобретении семафорины (и/или их функциональный фрагмент и/или гибридные полипептиды/белки, описанные в данном документе) являются превосходными в терапии ангиогенных нарушений и/или опухолевого заболевания по сравнению с обычными или природными семафоринами.

Превосходный эффект семафоринов согласно данному изобретению (или их функционального фрагмента(ов)) или гибридных полипептидов/белков, содержащих неприродные семафорины согласно данному изобретению или содержащие указанные функциональные фрагменты) обусловлен заменой аланина (А₃) гидрофильной аминокислотой в консенсусном мотиве CX₁X₂A₃GKD, например, A106K в семафорине 3А (замена аланина в позиции 106 на лизин) в приложенных примерах (например, в семафорине 3А A106K ΔIg-b, показанном в SEQ ID NO 18 или 20); см. прилагаемую фиг. 3. Как показано в прилагаемых примерах, конструкции семафорина 3 имеют ту же архитектуру, что и семафорин 3А A106K, за исключением отсутствия точечной мутации в консервативном мотиве CX₁X₂A₃GKD (семафорин 3А ΔIg-b, например, закодированный последовательностями нуклеиновых кислот, показанными в SEQ ID NO 43 или 44), см. прилагаемую фиг. 2, не демонстрируя благоприятных фармакологических эффектов. Соответственно, неожиданный благоприятный эффект, описанный в данном изобретении, можно отнести к описанной в данном документе мутации в CX₁X₂A₃GKD мышиного и/или человеческого Sema3A, Sema3B, Sema3C и Sema3D. Предпочтительно, данное изобретение относится к человеческим семафоринам 3, выбранным из группы, состоящей из Sema 3А, Sema 3В, Sema 3С и Sema 3D (или функциональных фрагментов этих человеческих семафоринов, содержащих консенсусный мотив, описанный в данном документе), включающим указанную в данном документе мутацию в аланине (А₃). Наиболее предпочтительно данное изобретение относится к мутантному человеческому Sema3A (или функциональным фрагментам указанного человеческого Sema3A), содержащему описанный в данном документе мотив с описанной в данном документе заменой аланина (А₃) в мотиве с последовательностью CX₁X₂A₃GKD. Указанная замена представляет собой замену на гидрофильную аминокислоту, наиболее предпочтительно замещение лизином (K). Мутантный аланин (А₃) является частью высоко консервативного мотива с последовательностью CX₁X₂A₃GKD, который может быть обнаружен в мышином и человеческом Sema3A, Sema3B, Sema3C и Sema3D; см. прилагаемую фиг. 3. Следовательно, равные положительные эффекты, которые показаны в прилагаемых примерах, предполагаются и правдоподобны при замене указанного аланина гидрофильной аминокислотой (такой как K) в (человеческом) Sema3B, Sema3C и/или Sema3D.

Человеческие и мышиные Sema3E, Sema3G и Sema3F имеют природную гидрофильную аминокислоту, где аланин А₃ остается в консенсусной последовательности CX₁X₂A₃GKD. Следовательно, они имеют гидрофильную аминокислоту в позиции, соответствующей позиции 106 семафорина 3А, показанного в SEQ ID NO 2. Оба Sema3E и Sema3G содержат лизин, a Sema3F содержит серии в этой позиции. Тем не менее, Sema 3Е и Sema 3F не проявляют свойств согласно данному изобретению, показанных для предлагаемых в данном изобретении семафоринов 3, как объяснено ниже и как описано в прилагаемых примерах. Замена серина лизином в позиции 107 в Sema3F не приводит к увеличению связывания с рецепторами плексинами А, В, С или D. Кроме того, этот мутант не может ингибировать миграцию ЕС более эффективно, чем его аналог дикого типа, демонстрирующий серии в позиции 107, который описан в данном документе для мутантного семафорина 3 или функционального фрагмента согласно данному изобретению, см. прилагаемый пример 2 и фиг. 12. Кроме того, Fc-меченный семафорин 3Е и семафорин 3F не могут ингибировать миграцию ЕС так же сильно, как иллюстративный мутантный семафорин 3А, содержащий предусмотренную в данном изобретении замену аланина гидрофильной аминокислотой; см. иллюстративную фиг. 13. Следовательно, предусмотренные в данном документе мутантные семафорины, а именно мутантный семафорин 3А, мутантный семафорин 3В, мутантный семафорин 3С и мутантный семафорин 3D, являются удивительно превосходящими ингибиторами клеточной подвижности ЕС по сравнению с семафоринами 3, содержащими природную гидрофильную аминокислоту в позиции, соответствующей позиции 106 семафорина 3А, как указано в SEQ ID NO 2. Показанное сильное ингибирование подвижности клеток является показателем того, что мутантные белки семафорины 3 согласно данному изобретению являются превосходными для терапии ангиогенных нарушений и/или опухолевого заболевания по сравнению с природными семафоринами 3 (см. также ниже).

Соответственно, данное изобретение не относится к (человеческому) Sema 3Е, Sema 3F и/или Sema 3G.

Замена аланина (А₃), например, на лизин в консенсусном мотиве CX₁X₂A₃GKD в Sema 3А/3В/3С или 3D (или в их функциональных фрагментах) (например, помимо прочего, замена A106K в Sema3A) приводит к увеличению ингибирования роста раковой опухоли и образования метастазов в двух разных моделях трансгенных мышей, т.е. спонтанного нейроэндокринного рака поджелудочной железы (RipTag2) и протоковой аденокарциномы поджелудочной железы (PDAC); см. пример 2. Мышь PDAC является моделью частого и смертельного гистотипа человеческого рака поджелудочной железы. Самое главное и удивительное, что парентерально введенный Sema3A A106K демонстрирует превосходный фармакологический эффект у мышей PDAC по сравнению с белком Sema3A AAV8 дикого типа. Если подробно, Sema3A A106K ингибировал рост раковой опухоли на 64%, см. прилагаемую фиг. 11А, частоту метастазов в печени на 81%, см. прилагаемую фиг. 11В, и уменьшал объем метастазов на 78%. Введенный Sema3A дикого типа, доставленный с помощью AAV-8, только ингибировал рост раковой опухоли на 52%, см. прилагаемую фиг. 10А, и частоту метастазов в печени на 59%. Кроме того, Sema3A A106K уменьшал площадь сосудов и способствовал нормализации сосудов раковой опухоли за счет усиления покрытия перицитами, увеличения перфузии кровеносных сосудов и ингибирования гипоксии раковой опухоли в мышиных моделях, имитирующих человеческий рак, см. прилагаемую фиг. 11С.

Соответственно, мутантные/неприродные семафорины согласно данному изобретению, такие как Sema3A A106K, оказывают превосходное влияние на снижение прогрессирования рака и распространения метастазов по сравнению с обычными, немодифицированными семафоринами.

Кроме того, парентерально вводимый Sema3A A106K увеличивал выживаемость мышей RIP-Tag2 аналогично полноразмерному Sema3A, доставляемому аденоассоциированным вирусом-8 (AAV8). Sema3A A106K i) вызывал уменьшение объема рака на 67%; ii) эффективно уменьшал площадь кровеносных сосудов на 51%, см. прилагаемую фиг. 9А; iii) благоприятствовал нормализации кровеносных сосудов раковой опухоли в плане увеличения покрытия перицитами, см. прилагаемую фиг. 9В; iv) повышал перфузию, см. прилагаемую фиг. 9С, и уменьшал гипоксию тканей, см. прилагаемую фиг. 9D. Таким образом, данное изобретение демонстрирует его удивительный терапевтический эффект, который не зависит от связывания Nrp1.

Более того, превосходный эффект мутантных белков семафоринов 3 (и/или их функциональных фрагментов и/или гибридных белков/полипептидов, включающих указанные мутантные семафорины или их определенные фрагменты) также доказан в экспериментах in vitro, см. прилагаемые примеры. Замена аланина (А₃) гидрофильной аминокислотой в консенсусном мотиве CX₁X₂A₃GKD семафорина 3 или его функционального фрагмента, такая как найдена в мутантном семафорине 3А A106K, приводит к высокоаффинному связыванию с плексином А4 по сравнению с Sema3A и Sema3A Δ1g-b дикого типа, см. прилагаемые примеры. Кроме того, мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент, например Sema3A A106K, демонстрирует повышенное ингибирование ГТФ-загрузки малой ГТФазы Rap1, см. прилагаемую фиг. 8А, и повышенное фосфорилирование киназы ERK 1/2 по сравнению с обычными семафоринами, см. прилагаемую фиг. 8В. Следовательно, мутантный семафорин 3 (или его функциональный фрагмент или гибридные полипептиды/белки, содержащие их) связывается с субъединицами плексина с исключительно высокой аффинностью и эффективно инициирует его дальнейший сигналинг, ведущий к нормализации сосудов раковой опухоли, по сравнению с обычными семафоринами, такими как природный человеческий Sema3A.

Кроме того, белки семафорины 3 контролируют клеточную подвижность через интегрины, например, гаптотактическую миграцию ЕС к белкам ЕСМ. Опосредованная интегрином подвижность клеток к белкам ЕСМ играет важную роль в некоторых физиологических и патологических условиях, таких как формирование кровеносных сосудов (ангиогенез) и распространение раковых клеток по всему организму (метастазирование) (Desgrosellier and Cheresh, 2010). Соответственно, была проанализирована миграция клеток в ответ на обычные или неприродные семафорины 3 или их функциональные фрагменты. Неожиданно замещение аланина (А₃) гидрофильной аминокислотой в консенсусном мотиве CX₁X₂A₃GKD семафорина 3 или его функционального фрагмента приводит к усиленному ингибированию направленной миграции человеческих эндотелиальных клеток пупочной вены (ЕС) по сравнению с обычными семафоринами, см. прилагаемые фиг. 6А-С. Коммерческий человеческий семафорин 3А дикого типа и мышиный семафорин 3А ΔIg-b нарушает подвижность ЕС только на 19-25% (таблица 3). Важно отметить, что мутантные белки семафорины 3 (и/или их функциональные фрагменты и/или гибридные белки/полипептиды, содержащие указанные мутантные семафорины или их определенные фрагменты), такие как Sema3A A106K, являются наиболее эффективными ингибиторами подвижности ЕС. В частности, хотя максимальная (3,5 нМ) доза коммерческого человеческого SEMA3A WT (от англ. wild type - дикий тип) ингибировала направленную миграцию ЕС на 20%, доза человеческого SEMA3A A106K (например, SEQ ID NO 18) в 17,5 раз ниже (0,2 нМ) ингибировала подвижность ЕС на 46% (таблица 4).

Соответственно, мутантные семафорины 3 согласно данному изобретению (или их функциональные фрагменты и/или гибридные полипептиды/белки согласно данному изобретению, содержащие мутантные неприродные семафорины или их функциональные фрагменты) являются превосходными ингибиторами подвижности клеток по сравнению с обычными семафоринами. Ингибирование подвижности клеток также ухудшает метастатическое распространение раковых клеток. Следовательно, предлагаемые в данном документе мутантные семафорины 3 (или их функциональный фрагмент и/или гибридные полипептиды/белки согласно данному изобретению, содержащие мутантные неприродные семафорины или их функциональные фрагменты) являются превосходными ингибиторами формирования раковых клеток и метастатического распространения по сравнению с обычными семафоринами.

Соответственно, экспериментальные данные в прилагаемых примерах обеспечивают четкое обоснование применению мутантных семафоринов 3 (или их функционального фрагмента или гибридных белков/полипептидов, содержащих их) в улучшенной терапии ангиогенных нарушений и/или опухолевого заболевания/рака.

Данное изобретение имеет, помимо прочего, следующие преимущества по сравнению с обычными антиангиогенными агентами. Одним из преимуществ данного изобретения является тот факт, что соединения согласно данному изобретению, т.е. мутантные семафорины/их функциональные фрагменты/гибридные белки/полипептиды, описанные в данном документе, связываются с рецепторами плексинами с высокой аффинностью, но, тем не менее, обходят Nrp-1-зависимый индуцированный семафорином вход макрофагов в бессосудистые области опухоли, что способствует прогрессированию рака. В качестве дополнительного преимущества соединения согласно данному изобретению эффективно вызывают передачу сигналов от рецептора плексина. В качестве еще одного предпочтительного свойства соединения согласно данному изобретению активируют рецептор плексина независимо от Nrp1. Кроме того, соединения согласно данному изобретению более эффективно ингибируют миграцию ЕС по сравнению с обычными белками семафоринами 3. Соединения согласно данному изобретению не расщепляются протеазами, что приводит к увеличению времени удерживания. В качестве дополнительного преимущества соединения согласно данному изобретению (белки, а также молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие их) могут быть доставлены парентерально. Соединения согласно данному изобретению являются превосходными в предотвращении формирования новых кровеносных сосудов, тем самым останавливая или замедляя рост или распространение опухолей. Соединения согласно данному изобретению превосходят в уменьшении площади кровеносных сосудов, нормализуют кровеносные сосуды раковой опухоли, усиливают перфузию кровеносных сосудов и/или уменьшают тканевую гипоксию. Соединения согласно данному изобретению могут быть использованы в качестве агента, нормализующего сосудистую сеть, т.е. кровеносные сосуды раковой опухоли нормализуются, улучшается перфузия кровеносных сосудов раковой опухоли и/или уменьшается гипоксия тканей. Дополнительным преимуществом данного изобретения является то, что рост рака ингибируется более эффективно. В качестве еще одного предпочтительного свойства белки и/или молекулы нуклеиновых кислот согласно данному изобретению уменьшают количество метастазов и сокращают объем метастазов. Следовательно, данное изобретение обладает превосходным эффектом в отношении ингибирования прогрессирования рака и распространения метастазов.

Используемый в данном документе термин "мутантный семафорин 3", "генетически модифицированный семафорин 3", "семафорин 3 неприродного происхождения" или "неприродный семафорин 3" в соответствии с данным изобретением относится к мутированной форме семафорина 3А, семафорина 3В, семафорина 3С или семафорина 3D, которые определены в данном документе. Мутантный семафорин 3 отличается от семафорина 3 дикого типа или его функционального фрагмента по меньшей мере одной мутацией, которая выбрана из группы, состоящей из аминокислотной замены (замен), добавления(-й), делеции(-й) и дупликации(-й). В частности, мутантная форма семафорина 3 включает замещение аланина гидрофильной аминокислотой в позиции, которая при сравнении гомологии соответствует позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2. Другими словами, аланин (А₃) в консенсусном мотиве CX₁X₂A₃GKD (также показанном в SEQ ID NO 73) в белках семафоринах 3 заменен гидрофильной аминокислотой (таблица 1). Соответственно, мутантный семафорин 3А содержит аминокислотную последовательность, в которой аланин в позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2 или 4, заменен гидрофильной аминокислотой. Мутантный семафорин 3В содержит аминокислотную последовательность, в которой аланин в позиции 105 семафорина 3В дикого типа, показанного в SEQ ID NO 6 или 8, заменен гидрофильной аминокислотой. Мутантный семафорин 3С содержит аминокислотную последовательность, в которой аланин в позиции 104 семафорина 3С дикого типа, показанного в SEQ ID NO 10 или 12, заменен гидрофильной аминокислотой. Мутантный семафорин 3D содержит аминокислотную последовательность, в которой аланин в позиции 120 семафорина дикого типа 3D, показанного в SEQ ID NO 14 или 16, заменен гидрофильной аминокислотой. Указанной гидрофильной аминокислотой могут быть, например, лизин, аргинин, аспарагин, глутамин, серии, треонин, глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота или гистидин, более предпочтительно лизин или аргинин, наиболее предпочтительно лизин. В данном документе также предусматривается, что гидрофильная аминокислота может быть непротеиногенной или нестандартной а-аминокислотой (такой как, например, орнитин и цитруллин). В данном документе выше и в прилагаемых примерах показано, что замена аланина гидрофильной аминокислотой приводит к усилению ингибирования роста раковой опухоли и формирования метастазов. В целом, замена на гидрофильную аминокислоту в семафоринах 3 приводит к высокой аффинности связывания с рецепторами плексинами. Повышенное связывание мутантного семафорина 3 приводит к увеличению активации рецепторов плексинов и последующей передачи их сигналов. Рецепторы плексины имеют решающее значение для контроля активации интегрина, клеточной адгезии и миграции на или к белкам ЕСМ, которые являются ключевыми аспектами прогрессирования и метастазирования раковых клеток. Соответственно, мутантный семафорин 3 согласно данному изобретению может быть использован в качестве ингибитора ангиогенеза и в качестве нормализующего сосудистого агента.

В частности, данное изобретение относится к мутантным белкам семафоринам 3, что означает, что мутантные семафорины выбраны из группы семафорина 3А, семафорина 3В, семафорина 3С и семафорина 3D. Аналогично, если делается ссылка на мутантный семафорин 3 или мутантные белки семафорины 3 в контексте данного изобретения, это предназначено для обозначения мутантного семафорина 3А, мутантного семафорина 3В, мутантного семафорина 3С и мутантного семафорина 3D. В наиболее предпочтительных аспектах данного изобретения мутантный семафорин 3 является мутантным семафорином 3А. В данном документе понимается, что мутантный семафорин 3 не является семафорином 3Е, семафорином 3F или семафорином 3G. Кроме того, в данном документе понимается, что мутантный семафорин 3 согласно данному изобретению не включает изоформу Х2 семафорина 3В, например от Equus przewalskii, или изоформу Х6 семафорина 3В, например от Panthera tigris altaica. Такие семафорины не содержат аминокислотную последовательность CX₁X₂A₃GKD где аланин А₃ замещен гидрофильной аминокислотой. Кроме того, мутантный семафорин 3 согласно данному изобретению функционирует как ингибитор ангиогенеза и/или как агент, нормализующий сосудистую сеть.

Термины "семафорин 3А", "семафорин 3В", "семафорин 3С" и "семафорин 3D", "Sema3A", "Sema3B", "Sema3C" и "Sema3D", SEMA3A", "SEMA3B", "SEMA3C" и "SEMA3D", используемые в данном документе, относятся в первую очередь к белку. "Sema3A", "Sema3B", "Sema3C" и "Sema3D", которые определены в данном документе и используются согласно данному изобретению, предпочтительно представляют собой человеческие "Sema3A", "Sema3B", "Sema3C" и "Sema3D". "Семафорин 3А", "семафорин 3В", "семафорин 3С" и "семафорин 3D", которые определены в данном документе и используются согласно данному изобретению, предпочтительно представляют собой человеческие "Sema3A", "Sema3B", "Sema3C" и "Sema3D". "SEMA3A", "SEMA3B", "SEMA3C" и "SEMA3D", которые определены в данном документе и используются согласно данному изобретению, предпочтительно представляют собой человеческие "Sema3A", "Sema3B", "Sema3C" и "Sema3D".

Sema3A A106K или семафорин 3А A106K также обозначен в данном документе и в прилагаемых примерах как Fc-меченный Sema3A A106K ΔIg-b.

Аминокислотные последовательности и кодирующие нуклеотидные последовательности семафорина 3 дикого типа хорошо известны в данной области. Последовательности нуклеиновых кислот можно получить из публичных баз данных, таких как NCBI, используя следующие номера доступа (следующие последовательности были получены из базы данных NCBI):

Homo sapiens SEMA3A, >gi|100913215|ref|NM_006080.2|, соответствующая SEQ ID NO 1; Mus musculus Sema3A, >gi| 340523098|ref| NM_009152.4|), соответствующая SEQ ID NO 3; Homo sapiens SEMA3B, >gi| 586798179|ref| NM_001290060.11, соответствующая SEQ ID NO 5; Mus musculus Sema3B, >gi| 615276319|ref| NM_001042779.2|, соответствующая SEQ ID NO 7; Homo sapiens SEMA3C >gi| 335057525|ref| NM_006379.3|, соответствующая SEQ ID NO 9; Mus musculus Sema3C, >gi| 118130842|ref| NM_013657.5|, соответствующая SEQ ID NO 11; Homo sapiens SEMA3D, >gi| 41406085|ref| NM_152754.2|, соответствующая SEQ ID NO 13; или Mus musculus Sema3D >gi| 282847343|ref| NM_028882.4|, соответствующая SEQ ID NO 15.

SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 13 или SEQ ID NO 15 кодируют полноразмерные белки семафоринов 3 дикого типа.

Соответствующие аминокислотные последовательности можно получить из публичных баз данных, таких как NCBI. Следующие последовательности были получены из базы данных NCBI.

Homo sapiens SEMA3A, |ref|NP_006071.1|, соответствующая SEQ ID NO 2;

Mus musculus Sema3A, |ref|NP_033178.2|, соответствующая SEQ ID NO 4;

Homo sapiens SEMA3B, |ref|NP_001276989.1|, соответствующая SEQ ID NO 6;

Mus musculus Sema3B, |ref|NP_001036244.11, соответствующая SEQ ID NO 8;

Homo sapiens SEMA3C |ref|NP_006370.1|, соответствующая SEQ ID NO 10;

Mus musculus Sema3C, |ref|NP_038685.3|, соответствующая SEQ ID NO 12;

Homo sapiens SEMA3D, |ref|NP_689967.2|, соответствующая SEQ ID NO 14;

или

Mus musculus Sema3D, |ref|NP_083158.3|, соответствующая SEQ ID NO 16.

SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 14 или SEQ ID NO 16 содержат аминокислотные последовательности полноразмерных белков семафоринов 3 полной длины.

Аминокислотные последовательности семафорина 3 согласно данному изобретению также могут быть получены из Uniprot, например, для мышиных и человеческих семафорина 3А, семафорина 3В, семафорина 3С и семафорина 3D.

В одном воплощении данное изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность мутантного семафорина 3, где аланин, соответствующий позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, или аланин в позиции, которая в других белках семафоринах 3 при сравнении гомологии соответствует позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, заменен гидрофильной аминокислотой, где указанный семафорин 3 выбран из группы семафорина 3А, семафорина 3В, семафорина 3С и семафорина 3D.

В другом воплощении данное изобретение относится к мутантному семафорину 3, где указанный мутантный семафорин 3 содержит аминокислотную последовательность, в которой аланин, соответствующий позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, или аланин в позиции, которая в других белках семафоринах 3 при сравнении гомологии соответствует позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, заменен гидрофильной аминокислотой, где указанный семафорин 3 выбран из группы семафорина 3А, семафорина 3В, семафорина 3С и семафорина 3D.

В другом воплощении данное изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность мутантного семафорина 3 или его фрагмента, в которой аланин, соответствующий позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, или аланин в позиции, которая в других белках семафоринах 3 при сравнении гомологии соответствует позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, заменен гидрофильной аминокислотой, где указанный семафорин 3 выбран из группы семафорина 3А, семафорина 3В, семафорина 3С и семафорина 3D.

В другом воплощении данное изобретение относится к мутантному семафорину 3 или его фрагменту, где указанный мутантный семафорин 3 или его фрагмент содержит аминокислотную последовательность, в которой аланин, соответствующий позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, или аланин в позиции, которая в других белках семафоринах 3 при сравнении гомологии соответствует позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, заменен гидрофильной аминокислотой, где указанный семафорин 3 выбран из группы семафорина 3А, семафорина 3В, семафорина 3С и семафорина 3D.

Как объяснялось выше, мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент содержит гидрофильную аминокислоту на месте аланина, соответствующего позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, или содержит аланин в позиции, которая в других белках семафоринах 3 при сравнении гомологии соответствует позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, и где указанный семафорин 3 выбран из группы семафорина 3А, семафорина 3В, семафорина 3С и семафорина 3D.

Как объяснено выше и проиллюстрировано в таблице 1, аланин, соответствующий позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, относится к конкретному аланину семафорина 3А в позиции 106 в SEQ ID NO 2 или к конкретному аминокислотному остатку аланина в известной последовательности семафорина дикого типа 3А, 3В, 3С или 3D, предпочтительно семафорина 3А, соответствующему указанному конкретному аланину семафорина 3А в позиции 106 в SEQ ID NO 2. Он также обозначает конкретный аминокислотный остаток в известной последовательности дикого типа, например, семафорина 3А, 3В, 3С или 3D, который гомологичен указанному специфическому аланину в позиции 106 в SEQ ID NO 2, в позиции 105 в SEQ ID NO 6, в позиции 104 в SEQ ID NO 10 или в позиции 120 в SEQ ID NO 14. Примерами гомологичных аминокислотных остатков могут быть аланин, валин, изолейцин, лейцин, метионин, фенилаланин, тирозин или триптофан. Наиболее предпочтительно конкретный аминокислотный остаток представляет собой аланин.

Соответствующий аминокислотный остаток в других последовательностях дикого типа в соответствующей позиции может быть выбран предпочтительно стандартными методиками скрининга на гомологию или методиками скрининга, основанными на ПЦР для соответствующих последовательностей, как описано ниже. Указанный аланин или соответствующий аланин заменен или превращен в гидрофильную аминокислоту в мутантном семафорине 3 согласно данному изобретению.

Как упоминается и объясняется в данном документе, аланин в позиции, которая в других белках семафоринах 3 при сравнении гомологии соответствует позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, относится к конкретному аминокислотному остатку аланину в известной последовательности семафорина дикого типа 3В, 3С или 3D, соответствующему указанному конкретному аланину семафорина 3А в позиции 106 в SEQ ID NO 2. Соответствующий аланин заменен гидрофильной аминокислотой в мутантном семафорине 3В, 3С или 3D. Другими словами, аланин, соответствующий позиции 105 семафорина 3В дикого типа, показанного в SEQ ID NO 6, аланин, соответствующий позиции 104 семафорина 3С дикого типа, показанного в SEQ ID NO 10; или аланин, соответствующий позиции 120 семафорина 3D дикого типа, показанного в SEQ ID NO 14, заменен гидрофильной аминокислотой.

Аланин, соответствующий позиции 105 семафорина 3В дикого типа, показанного в SEQ ID NO 6, относится к конкретному аланину семафорина 3В в позиции 105 в SEQ ID NO 6 или к конкретному аминокислотному остатку аланину в известной последовательности семафорина 3В дикого типа, соответствующему указанному специфическому аланину семафорина 3В в позиции 105 в SEQ ID NO 6.

Аланин, соответствующий позиции 104 семафорина 3С дикого типа, показанного в SEQ ID NO 10, относится к конкретному аланину семафорина 3С в позиции 104 в SEQ ID NO 10 или к конкретному аминокислотному остатку аланину в известной последовательности семафорина 3С дикого типа, соответствующему указанному специфическому аланину семафорина 3С в позиции 104 в SEQ ID NO 10.

Аланин, соответствующий позиции 120 семафорина 3D дикого типа, показанного в SEQ ID NO 14, относится к конкретному аланину семафорина 3D в позиции 120 в SEQ ID NO 14 или к конкретному аминокислотному остатку аланину в известной последовательности семафорина 3D дикого типа, соответствующему указанному специфическому аланину семафорина 3D в позиции 120 в SEQ ID NO 14.

Как упоминается и подробно описано в данном документе, соответствующий аминокислотный остаток в соответствующей позиции может быть выбран предпочтительно путем сравнения гомологии. Гомология среди полипептидов или нуклеотидных последовательностей, как правило, выведена из сходства их последовательностей. Выравнивания множества последовательностей могут быть использованы в данном документе для указания того, какие области или конкретные аминокислоты в каждой последовательности являются гомологичными. Аминокислотные последовательности семафорина 3А, В, С и D могут быть использованы в качестве (а) референсных последовательностей. Гомология существует предпочтительно на протяжении нескольких аминокислот, например, 10, более предпочтительно 20, более предпочтительно 30, более предпочтительно 50 или более предпочтительно 100 аминокислотных остатков, или, наиболее предпочтительно, гомология существует на протяжении всей аминокислотной последовательности. Иллюстративное выравнивание аминокислотных последовательностей белков семафоринов 3 показано в таблице 1. Соответствующий аланин наиболее предпочтительно представляет собой А₃ в аминокислотной последовательности CX₁X₂A₃GKD, содержащейся в мутантном семафорине 3. Таким образом, мутация согласно данному изобретению также может быть идентифицирована с помощью аминокислотной последовательности CX₁X₂A₃GKD.

Как описано в данном документе, данное изобретение относится к мутантному семафорину 3 или его функциональному фрагменту, который содержит гидрофильную аминокислоту на месте аланина, соответствующего позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, или содержит гидрофильную аминокислоту на месте аланина в позиции, которая в других белках семафоринах 3 при сравнении гомологии соответствует позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, где указанный семафорин 3 выбран из группы семафорина 3А, семафорина 3В, семафорина 3С и семафорина 3D.

Другими словами, мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент содержит гидрофильную аминокислоту на месте аланина, соответствующего позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, или содержит гидрофильную аминокислоту на месте аланина в позиции, которая при сравнении гомологии в семафорине 3В, С или D соответствует позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2; где указанный семафорин 3 выбран из группы семафорина 3А, семафорина 3В, семафорина 3С и семафорина 3D. Другими словами, другими семафоринами являются семафорин 3В, 3С и 3D.

Другими словами, мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент, где указанный семафорин 3 выбран из группы, состоящей из семафорина 3А, семафорина 3В, семафорина 3С и семафорина 3D, и где указанный мутантный семафорин 3 содержит

гидрофильную аминокислоту на месте аланина, соответствующего позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2;

гидрофильную аминокислоту на месте аланина, соответствующего позиции 105 семафорина 3В дикого типа, показанного в SEQ ID NO 6;

гидрофильную аминокислоту на месте аланина, соответствующего позиции 104 семафорина 3С дикого типа, показанного в SEQ ID NO 10; или

гидрофильную аминокислоту на месте аланина, соответствующего позиции 120 семафорина 3D дикого типа, показанного в SEQ ID NO 14.

В наиболее предпочтительных воплощениях данного изобретения мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент содержит гидрофильную аминокислоту на месте аланина, соответствующего позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, и указанный семафорин 3 представляет собой семафорин 3А. Другими словами, данное изобретение относится к мутантному семафорину 3А или его функциональному фрагменту, где указанный мутантный семафорин 3А содержит гидрофильную аминокислоту вместо аланина, соответствующего позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2.

Как указано выше и как показано в прилагаемых примерах, замена аланина (А₃) в аминокислотной последовательности CX₁X₂A₃GKD делает полипептиды семафорины 3А, В, С или D сильными ингибиторами ангиогенеза. Поэтому в аминокислотной последовательности CX₁X₂A₃GKD, содержащейся в мутантных семафоринах, аланин (А₃) замещен гидрофильной аминокислотой, т.е. данное изобретение относится к мутантному семафорину 3 или его функциональному фрагменту, где указанный мутантный семафорин 3 выбран из группы, состоящей из семафорина 3А, семафорина 3В, семафорина 3С и семафорина 3D, и где указанный мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент содержит

гидрофильную аминокислоту на месте аланина, соответствующего позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2;

гидрофильную аминокислоту на месте аланина, соответствующего позиции 105 семафорина 3В дикого типа, показанного в SEQ ID NO 6;

гидрофильную аминокислоту на месте аланина, соответствующего позиции 104 семафорина 3С дикого типа, показанного в SEQ ID NO 10; или

гидрофильную аминокислоту на месте аланина, соответствующего позиции 120 семафорина 3D дикого типа, показанного в SEQ ID NO 14; и где

указанный мутантный семафорин 3 или указанный его функциональный фрагмент содержит аминокислотную последовательность CX₁X₂A₃GKD, где

X₁ представляет собой аминокислоту, которая представляет собой K или N,

Х₂ представляет собой аминокислоту, выбранную среди W, М и L,

и где аланин (А₃) замещен указанной гидрофильной аминокислотой.

Другими словами, данное изобретение относится к мутантному семафорину 3 или его функциональному фрагменту, где указанный мутантный семафорин 3 выбран из группы, состоящей из семафорина 3А, семафорина 3В, семафорина 3С и семафорина 3D, и

где указанный мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент содержит аминокислотную последовательность CX₁X₂A₃GKD, где

X₁ представляет собой аминокислоту, которая представляет собой K или N,

Х₂ представляет собой аминокислоту, выбранную среди W, М и L,

и где аланин (А₃) замещен гидрофильной аминокислотой; и где указанный мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент содержит

указанную гидрофильную аминокислоту на месте аланина, соответствующего позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2;

указанную гидрофильную аминокислоту на месте аланина, соответствующего позиции 105 семафорина 3В дикого типа, показанного в SEQ ID NO 6;

указанную гидрофильную аминокислоту на месте аланина, соответствующего позиции 104 семафорина 3С дикого типа, показанного в SEQ ID NO 10; или

указанную гидрофильную аминокислоту на месте аланина, соответствующего позиции 120 семафорина 3D дикого типа, показанного в SEQ ID NO 14.

Следующее ниже описание включает все различные воплощения. Следующее описание относится к предусмотренным в данном документе неприродным/искусственным/мутантным белкам семафоринам 3 или описанным в данном документе их функциональным фрагментам или описанным в данном документе функциональным sema-доменам и/или гибридным белкам/полипептидам, содержащим указанные неприродные/искусственные/мутантные белки семафорины 3 или указанные неприродные/искусственные/мутантные функциональные фрагменты или указанные функциональные sema-домены указанных белков семафоринов 3, которые в первую очередь обладают активностью в качестве ингибитора ангиогенеза. Другими словами, соединения согласно данному изобретению, т.е. мутантные белки семафорины 3/их функциональные фрагменты/их функциональные sema-домены/гибридные белки/полипептиды, описанные в данном документе, в первую очередь обладают активностью для функционирования в качестве ингибитора ангиогенеза. Как правило, ингибитор ангиогенеза предотвращает формирование новых кровеносных сосудов, тем самым останавливая или замедляя рост или распространение опухолей. Как показано в данном документе, соединения согласно данному изобретению уменьшают площадь кровеносных сосудов, нормализуют кровеносные сосуды раковой опухоли, т.е. увеличивают покрытие перицитами, усиливают перфузию кровеносных сосудов раковой опухоли и/или уменьшают тканевую гипоксию. Соответственно, аминокислотные последовательности и/или нуклеиновые последовательности согласно данному изобретению относятся к прямому и/или косвенному ингибитору ангиогенеза. Как правило, ингибиторы ангиогенеза также связываются с рецепторами на поверхности клеток, такими как ЕС, и/или с другими белками в нисходящих сигнальных путях, блокируя их активность. Как показано в прилагаемых примерах, мутантный семафорин 3, его функциональный фрагмент, функциональный sema-домен, гибридный белок или полипептид согласно данному изобретению связывается с его рецептором плексином, например, типа А, таким как плексин А4 или плексин А2, с высокой аффинностью, т.е. демонстрируя константу диссоциации K_D в очень низконамолярном/субнаномолярном диапазоне. Соответственно, аминокислотные последовательности и/или нуклеиновые последовательности согласно данному изобретению непосредственно и/или косвенно ингибируют ангиогенез. В частности, мутантный семафорин 3, его функциональный фрагмент или гибридный бел о к/пол и пептид согласно данному изобретению имеет аффинность к его рецептору плексину с константой диссоциации K_D ниже 6 нМ. В предпочтительных аспектах мутантный семафорин 3, его функциональный фрагмент или гибридный белок/полипептид согласно данному изобретению имеет аффинность к его рецептору плексину с константой диссоциации K_D ниже 4 нМ. В еще более предпочтительных аспектах мутантный семафорин 3, его функциональный фрагмент или гибридный белок/полипептид согласно данному изобретению имеет аффинность к его рецептору плексину с константой диссоциации K_D ниже 2 нМ. В наиболее предпочтительных аспектах мутантный семафорин 3, его функциональный фрагмент или гибридный белок/полипептид согласно данному изобретению имеет аффинность к его рецептору плексину с константой диссоциации K_D ниже 1 нМ. Константа диссоциации K_D может быть измерена стандартными способами, известными в данной области, такими как анализ, который явствует из прилагаемых примеров. В прилагаемых примерах задокументировано, что мутантный семафорин 3А связывается с рецептором плексином А4 с высокой аффинностью, т.е. демонстрирует константу диссоциации K_D в очень низконамолярном/субнаномолярном диапазоне. Кроме того, задокументировано, что мутантный семафорин 3В связывается с рецептором плексином А2 с высокой аффинностью, т.е. демонстрирует константу диссоциации K_D в очень низконамолярном/субнаномолярном диапазоне.

Кроме того, мутантный семафорин 3, его функциональный фрагмент, функциональный sema-домен или гибридный белок/полипептид согласно данному изобретению ингибирует ГТФ-загрузку Rap1 (на 65%). Соответственно, аминокислотные последовательности и/или нуклеиновые последовательности согласно данному изобретению опосредуют дальнейшие пути передачи сигналинга, релевантные в ангиогенезе. Следовательно, мутантный семафорин 3, его функциональный фрагмент или гибридный белок/полипептид согласно данному изобретению прямо и/или косвенно ингибирует ангиогенез, как показано в прилагаемых примерах. В частности, мутантный семафорин 3, его функциональный фрагмент или гибридный белок/полипептид согласно данному изобретению ингибирует ГТФ-загрузку Rap1 по меньшей мере на 50%. В предпочтительных аспектах мутантный семафорин 3, его функциональный фрагмент или гибридный белок/полипептид согласно данному изобретению ингибирует ГТФ-загрузку Rap1 по меньшей мере на 55%. В еще более предпочтительных аспектах мутантный семафорин 3, его функциональный фрагмент или гибридный белок/полипептид согласно данному изобретению ингибирует ГТФ-загрузку Rap1 по меньшей мере на 55%. В наиболее предпочтительных аспектах мутантный семафорин 3, его функциональный фрагмент или гибридный белок/полипептид согласно данному изобретению ингибирует ГТФ-загрузку Rap1 по меньшей мере на 65%. Ингибирование ГТФ-загрузки Rap1 можно измерить стандартными способами, известными в данной области, такими как анализ, который явствует из прилагаемых примеров. Кроме того, мутантный семафорин 3, его функциональный фрагмент, функциональный sema-домен или гибридный белок/полипептид согласно данному изобретению активирует фосфорилирование ERK 1/2 (в 3,9 раз). В частности, мутантный семафорин 3, его функциональный фрагмент или гибридный белок/полипептид согласно данному изобретению активирует фосфорилирование ERK 1/2 по меньшей мере в 2,5 раза. В предпочтительных аспектах мутантный семафорин 3, его функциональный фрагмент или гибридный белок/пол и пептид согласно данному изобретению активирует фосфорилирование ERK 1/2 по меньшей мере в 3,0 раза. В еще более предпочтительных аспектах мутантный семафорин 3, его функциональный фрагмент или гибридный белок/полипептид согласно данному изобретению активирует фосфорилирование ERK 1/2 по меньшей мере в 3,5 раза. В наиболее предпочтительных аспектах мутантный семафорин 3, его функциональный фрагмент или гибридный белок/полипептид согласно данному изобретению активирует фосфорилирование ERK 1/2 по меньшей мере в 4,9 раз. Активацию фосфорилирования ERK 1/2 можно измерить стандартными способами, известными в данной области, такими как анализ, который явствует из прилагаемых примеров.

Кроме того, мутантный семафорин 3, его функциональный фрагмент, функциональный sema-домен, гибридный белок или полипептид согласно данному изобретению ингибирует подвижность клеток, таких как ЕС (на 46%). Соответственно, мутантный семафорин 3 согласно данному изобретению, его функциональный фрагмент и гибридный белок/полипептид согласно данному изобретению являются (превосходными) ингибиторами подвижности клеток и/или ингибиторами метастатического распространения раковых клеток. Таким образом, мутантный семафорин 3, его функциональный фрагмент или гибридный белок/полипептид согласно данному изобретению ингибирует метастатическое распространение раковых клеток. В частности, мутантный семафорин 3, его функциональный фрагмент или гибридный белок/полипептид согласно данному изобретению ингибирует подвижность клеток, таких как эндотелиальные клетки, по меньшей мере на 30%. В предпочтительных аспектах мутантный семафорин 3, его функциональный фрагмент или гибридный белок/полипептид согласно данному изобретению ингибирует подвижность клеток, таких как эндотелиальные клетки, по меньшей мере на 35%. В еще более предпочтительных аспектах мутантный семафорин 3, его функциональный фрагмент или гибридный белок/полипептид согласно данному изобретению ингибирует подвижность клеток, таких как эндотелиальные клетки, по меньшей мере на 40%. В наиболее предпочтительных аспектах мутантный семафорин 3, его функциональный фрагмент или гибридный белок/полипептид согласно данному изобретению ингибирует подвижность клеток, таких как эндотелиальные клетки, по меньшей мере на 45%. Подвижность клеток может быть измерена стандартными способами, известными в данной области, такими как анализ, который явствует из прилагаемых примеров.

В другом воплощении данное изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность мутантного семафорина 3 или его функционального фрагмента, который функционирует как ингибитор ангиогенеза, где аланин, соответствующий позиции 106 семафорина дикого типа 3А, показанного в SEQ ID NO 2, или аланин в позиции, которая при сравнении гомологии в других белках семафоринах 3 соответствует позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, заменен гидрофильной аминокислотой, где указанный семафорин 3 выбран из группы семафорина 3А, семафорина 3В, семафорина 3С и семафорина 3D.

В другом воплощении данное изобретение относится к мутантному семафорину 3 или его функциональному фрагменту, где указанный мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент, который функционирует как ингибитор ангиогенеза, содержит аминокислотную последовательность, в которой аланин, соответствующий позиции 106 семафорина дикого типа 3А, показанного в SEQ ID NO 2, или аланин в позиции, которая при сравнении гомологии в других белках семафоринах 3 соответствует позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, заменен гидрофильной аминокислотой, где указанный семафорин 3 выбран из группы семафорина 3А, семафорина 3В, семафорина 3С и семафорина 3D.

В другом воплощении данное изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность генетически модифицированного семафорина 3 или его функционального фрагмента, который функционирует как ингибитор ангиогенеза, где аланин, соответствующий позиции 106 семафорина дикого типа 3А, показанного в SEQ ID NO 2, или аланин в позиции, которая при сравнении гомологии в других белках семафоринах 3 соответствует позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, заменен гидрофильной аминокислотой, где указанный семафорин 3 выбран из группы семафорина 3А, семафорина 3В, семафорина 3С и семафорина 3D.

В другом воплощении данное изобретение относится к генетически модифицированному семафорину 3 или его функциональному фрагменту, где указанный мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент, который функционирует как ингибитор ангиогенеза, содержит аминокислотную последовательность, в которой аланин, соответствующий позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, или аланин в позиции, которая при сравнении гомологии в других белках семафоринах 3 соответствует позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, заменен гидрофильной аминокислотой, где указанный семафорин 3 выбран из группы семафорина 3А, семафорина 3В, семафорина 3С и семафорина 3D.

В другом воплощении предусмотренные в данном документе неприродные/искусственные/мутантные белки семафорины 3 или их функциональные фрагменты, описанные в данном документе, и/или гибридные белки/полипептиды, содержащие указанные неприродные/искусственные/мутантные белки семафорины 3 или указанные неприродные/искусственные/мутантные функциональные фрагменты или указанные функциональные sema-домены указанных белков семафоринов 3, или предусмотренные в данном документе полипептиды обладают активностью для функционирования в качестве агента, нормализующего сосудистую сеть. Другими словами, соединения согласно данному изобретению, т.е. мутантные белки семафорины 3/их функциональные фрагменты/функциональные sema-домены/гибридные полипептиды/белки, описанные в данном документе, обладают активностью для функционирования в качестве агента, нормализующего сосудистую сеть, где агент, нормализующий сосудистую сеть, нормализует кровеносные сосуды раковой опухоли, т.е. увеличивает покрытие перицитами, усиливает перфузию кровеносных сосудов раковой опухоли, уменьшает тканевую гипоксию и/или улучшает доставку лекарственного препарата к раковой опухоли. Соответственно, аминокислотные последовательности и/или нуклеиновые последовательности согласно данному изобретению относятся к прямому и/или косвенному агенту, нормализующему сосудистую сеть.

Таким образом, данное изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность мутантного семафорина 3 или его функционального фрагмента, который функционирует в качестве агента, нормализующего сосудистую сеть, где аланин, соответствующий позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, или аланин в позиции, которая в других белках семафоринах 3 при сравнения гомологии соответствует позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, заменен гидрофильной аминокислотой, где указанный семафорин 3 выбран из группы семафорина 3А, семафорина 3В, семафорина 3С и семафорина 3D.

Кроме того, данное изобретение относится к мутантному семафорину 3 или его функциональному фрагменту, где указанный мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент, который функционирует в качестве агента, нормализующего сосудистую сеть, содержит аминокислотную последовательность, в которой аланин, соответствующий позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, или аланин в позиции, которая при сравнении гомологии в других белках семафоринах 3 соответствует позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, заменен гидрофильной аминокислотой, где указанный семафорин 3 выбран из группы семафорина 3А, семафорина 3В, семафорина 3С и семафорина 3D.

Следующее ниже описание относится к каждому из воплощений данного изобретения, описанных выше, если явно не указано иное.

Мутантные белки семафорины 3, генетически модифицированные белки семафорины 3 или родственные полипептиды (их функциональные фрагменты и/или гибридные белки, содержащие указанные мутантные белки семафорины 3 или указанные мутантные функциональные фрагменты указанных белков семафоринов 3, обладающие по меньшей мере 55% идентичностью с конкретными белками семафоринами 3, предусмотренными и определенными в данном документе, и т.п.) обладают в основном активностью в качестве ингибитора ангиогенеза.

Кроме того, мутантные белки семафорины 3, генетически модифицированные белки семафорины 3 или родственные полипептиды (их функциональные фрагменты и/или гибридные белки, содержащие указанные мутантные белки семафорины 3 или указанные мутантные функциональные фрагменты указанных белков семафоринов 3, обладающие по меньшей мере 55% идентичностью с конкретными белками семафоринами 3, предусмотренными и определенными в данном документе, и т.п.) в основном обладают активностью в качестве агента, нормализующего сосудистую сеть.

В предпочтительных аспектах молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая предусмотренный в данном документе мутантный семафорин 3, предпочтительно по меньшей мере на 50% гомологична/идентична последовательности нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID NO 1. Понятно, что такие последовательности нуклеиновой кислоты могут также включать

ортологичные/гомологичные/идентичные (и, следовательно, родственные) последовательности. Более предпочтительно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая предусмотренный в данном документе мутантный семафорин 3, по меньшей мере на 52%, 53%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91% 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% или 98% гомологична/идентична последовательности нуклеиновой кислоты, показанной в любой из SEQ ID NO 1, где более высокие значения идентичности последовательности являются предпочтительными.

В некоторых аспектах молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая предусмотренный в данном документе мутантный семафорин 3, предпочтительно по меньшей мере на 48% гомологична/идентична последовательности нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID NO 5. Понятно, что такие последовательности нуклеиновыхй кислот могут также включать

ортологичные/гомологичные/идентичные (и, следовательно, родственные) последовательности. Более предпочтительно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая предусмотренный в данном документе мутантный семафорин 3, по меньшей мере на 50%, 52%, 53%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91% 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% или 98% гомологична/идентична последовательности нуклеиновой кислоты, показанной в любой из SEQ ID NO 5, где более высокие значения идентичности последовательности являются предпочтительными.

В некоторых аспектах молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая предусмотренный в данном документе мутантный семафорин 3, предпочтительно по меньшей мере на 55% гомологична/идентична последовательности нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID NO 9. Понятно, что такие последовательности нуклеиновых кислот могут также включать ортологичные/гомологичные/идентичные (и, следовательно, родственные) последовательности. Более предпочтительно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая предусмотренный в данном документе мутантный семафорин 3, по меньшей мере на 57%, 60%, 63%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% или 98% гомологична/идентична последовательности нуклеиновой кислоты, показанной в любой из SEQ ID NO 9, где более высокие значения идентичности последовательности являются предпочтительными.

В некоторых аспектах молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая предусмотренный в данном документе мутантный семафорин 3, предпочтительно по меньшей мере на 45% гомологична/идентична последовательности нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID NO 13. Понятно, что такие последовательности нуклеиновых кислот могут также включать ортологичные/гомологичные/идентичные (и, следовательно, родственные) последовательности. Более предпочтительно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая предусмотренный в данном документе мутантный семафорин 3, по меньшей мере на 48%, 50%, 53%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% или 98% гомологична/идентична последовательности нуклеиновой кислоты, показанной в любой из SEQ ID NO 13, где более высокие значения идентичности последовательности являются предпочтительными.

В некоторых аспектах молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая предусмотренный в данном документе мутантный семафорин 3, предпочтительно по меньшей мере на 55% гомологична/идентична последовательности нуклеиновой кислоты, показанной в любой из SEQ ID NO 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 или 71. Понятно, что такие последовательности нуклеиновых кислот могут также включать ортологичные/гомологичные/идентичные (и, следовательно, родственные) последовательности. Более предпочтительно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая предусмотренный в данном документе мутантный семафорин 3, по меньшей мере на 56%, 58%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% или 98% гомологична/идентична последовательности нуклеиновой кислоты, показанной в любой из SEQ ID NO 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 или 71, где предпочтительными являются более высокие значения идентичности последовательности. Более предпочтительно, последовательность нуклеиновой кислоты согласно всем аспектам, кодирующая предусмотренный в данном документе мутантный семафорин 3, по меньшей мере на 60% гомологична/идентична последовательности нуклеиновой кислоты, показанной в любой из SEQ ID NO 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 или 71. Более предпочтительно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая предусмотренный в данном документе мутантный семафорин 3, по меньшей мере на 70% гомологична/идентична последовательности нуклеиновой кислоты, показанной в любой из SEQ ID NO 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 или 71. Еще более предпочтительно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая предусмотренный в данном документе мутантный семафорин 3, по меньшей мере на 80% гомологична/идентична последовательности нуклеиновой кислоты, показанной в любой из SEQ ID NO 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 или 71. Наиболее предпочтительно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая предусмотренный в данном документе мутантный семафорин 3, по меньшей мере на 90% гомологична/идентична последовательности нуклеиновой кислоты, показанной в любой из SEQ ID NO 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 или 71. Указанные выше ортологичные/гомологичные/идентичные последовательности также могут быть включены в более длинные или более короткие изоформы, варианты сплайсинга и гибридные транскрипты. Используемый в данном документе термин "ортологичный белок" или "ортологичный ген" относится к белкам и генам, соответственно, от разных видов, которые похожи друг на друга, потому что они происходят от общего предка.

Анализы гибридизации для характеризации ортологов или других родственных последовательностей известных последовательностей нуклеиновых кислот хорошо известны в данной области; см., например, Sambrook, Russell "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001); Ausubel, "Current Protocols in Molecular Biology", Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989).

Термин "гибридизация", используемый в данном документе в связи с нуклеиновыми кислотами, относится к гибридизации в условиях любой степени жесткости. В целом, гибридизации нуклеиновых кислот, такие как саузерн- или нозерн-гибридизации, могут быть выполнены в экспериментальных условиях различной степени жесткости. Как правило, нуклеиновая кислота, иммобилизованная на твердом носителе, таком как мембрана, контактирует с жидкостью, содержащей другую, подобную нуклеиновую кислоту (называемую зондом) в подходящих буферных и температурных условиях, чтобы взаимодействие зонда с иммобилизованной нуклеиновой кислотой было селективным, при этом зонд имеет определенную степень идентичности последовательности с иммобилизованной нуклеиновой кислотой, подлежащей анализу. Обычно буфер, используемый для гибридизации, в частности, на этапах промывания после гибридизации, представляет собой стандартный натрий-цитратный буфер (sodium citrate buffer, SSC, также называемый солевым буфером цитрата натрия). 20-кратный концентрированный SSC-буфер содержит 3 М NaCl и 0,3 М цитрат натрия, доведенный до рН 7,0 с использованием HCI, и он коммерчески доступен, например, от Sigma Aldrich. Концентрация Na⁺ в соответствующем 20-кратном SSC-буфере составляет 3,3 М (т.е. 3,3 моль/л), и она составляет 1,65 М в 10-кратном SSC-буфере, 0,825 М в 5-кратном SSC-буфере, 0,33 М в 2-кратном SSC-буфере, 0,165 М в 1-кратном SSC-буфере и 0,0165 М в 0,1-кратном SSC-буфере. Формамид или додецилсульфат натрия (sodium dodecyl sulfate, SDS) можно добавить в SSC-буфер для уменьшения неспецифического связывания зонда. Жесткость гибридизации зависит от процента нуклеотидов G и С, присутствующих в последовательности зонда (%G + C), и от условий гибридизации, в частности температуры, концентрации Na⁺ и концентрации формамида или SDS (если они присутствуют). В целом, чем выше температура гибридизации и чем ниже концентрация натрия (Na⁺), тем выше будет жесткость. Таким образом, жесткость гибридизации можно контролировать путем подходящего выбора температуры для гибридизации, концентрации SSC-буфера (и, следовательно, концентрации натрия) и, возможно, концентрации формамида (или SDS), добавляемого в SSC-буфер. Если на разных этапах процедуры гибридизации используются разные концентрации SSC-буфера, то концентрация натрия и формамида в наиболее концентрированном SSC-буфере (который обычно является буфером, используемым для заключительного этапа промывания) являются решающими.

Соответственно, при данном содержании GC в зонде и при определенных концентрациях натрия и формамида (если он присутствует) в наиболее концентрированном буфере, используемом для промывания после гибридизации (как правило, буфер, используемый для заключительного этапа промывания), жесткость гибридизации можно регулировать, регулируя температуру гибридизации на определенное число градусов Цельсия (например, 25°С или ниже) ниже эффективной температуры плавления (Tm), которую можно рассчитать по следующей формуле (для ДНК-ДНК-гибридизации):

Tm=81,5+16,6(log М [Na⁺])+0,41(%G+C)-0,72(%формамида)

В приведенной выше формуле "Tm" представляет собой температуру, при которой последовательность анализируемой иммобилизованной нуклеиновой кислоты должна соответствовать на 100% последовательности зонда, чтобы обе последовательности гибридизовались друг с другом; "log М [Na⁺]" представляет собой логарифм по основанию 10 (1одю) концентрации натрия (Na⁺) в моль/л в буфере; "%G + C" представляет собой процентное содержание нуклеотидов G и С в последовательности зонда (содержание GC); а "% формамида" представляет собой концентрацию формамида в % (объем/объем) в буфере. Как хорошо известно, длина зонда, подлежащего определению, является дополнительным параметром условий гибридизации.

Чем ниже температура гибридизации относительно Tm, тем ниже будет жесткость гибридизации. В частности, для каждого 1,4°С температуры гибридизации ниже рассчитанной Tm гибридизация будет по-прежнему происходить в присутствии 1% несоответствия последовательности, т.е. несоответствие х% последовательностей зонда и иммобилизованной нуклеиновой кислоты, подлежащей анализу, все равно приведет к гибридизации, если температура гибридизации будет по меньшей мере на х⋅1,4°С ниже расчетной Tm. Например, если Tm рассчитывается как 90°С, и эксперимент по гибридизации проводится при 55°С (т.е. на 35°С ниже Tm), то последовательности нуклеиновых кислот, соответствующие по меньшей мере 82,1% последовательности зонда, будут гибридизоваться (т.е. 35°С/1,4°С = 25,0, что означает, что 100% - 25,0% = 75,0%).

Используемый в данном документе термин гибридизация в "жестких условиях" предпочтительно означает, что температура гибридизации примерно на 35°С или меньшее число градусов ниже Tm (рассчитанной с использованием формулы, объясненной выше), что соответствует минимальной идентичности последовательности примерно 75,0%, необходимой для гибридизации с (т.е. 100% - (35°С/1,4°С)%). Более предпочтительно гибридизация в жестких условиях означает, что температура гибридизации примерно на 30°С или меньшее число градусов ниже Tm (что соответствует минимальной идентичности последовательности, составляющей примерно 78,6%, необходимой для гибридизации), еще более предпочтительно гибридизация в жестких условиях означает, что температура гибридизации примерно на 25°С или меньшее число градусов ниже Tm (что соответствует минимальной идентичности последовательности, составляющей примерно 82,1%, необходимой для гибридизации), еще более предпочтительно гибридизация в жестких условиях означает, что температура гибридизации примерно на 20°С или меньшее число градусов ниже Tm (что соответствует минимальной идентичности последовательности, составляющей примерно 85,7%, необходимой для гибридизации), еще более предпочтительно примерно на 15°С или меньшее число градусов ниже Tm (что соответствует минимальной идентичности последовательности, составляющей примерно 89,3%, необходимой для гибридизации), еще более предпочтительно примерно на 10°С или меньшее число градусов ниже Tm (что соответствует минимальной идентичности последовательности, составляющей примерно 92,9%, необходимой для гибридизации), еще более предпочтительно примерно на 7°С или меньшее число градусов ниже Tm (что соответствует минимальной идентичности последовательности, составляющей примерно 95,0%, необходимой для гибридизации), еще более предпочтительно примерно на 5°С или меньшее число градусов ниже Tm (что соответствует минимальной идентичности последовательности, составляющей примерно 96,4%, необходимой для гибридизация), и еще более предпочтительно примерно на 3°С или меньшее число градусов ниже Tm (что соответствует минимальной идентичности последовательности, составляющей примерно 97,9%, необходимой для гибридизации). И наоборот, гибридизация в "нежестких условиях" означает, что температура гибридизации является более низкой, чем указанная выше температура, необходимая для жесткой гибридизации. Если не указано дополнительно, то условия предпочтительно являются нежесткими. Указанные условия гибридизации могут быть определены в соответствии со стандартными протоколами, описанными, например, в Sambrook (2001) см. цит.; Ausubel (1989) см. цит., или Higgins and Hames (Eds.) "Nucleic acid hybridization, a practical approach" IRL Press Oxford, Washington DC, (1985). Определение условий находится в рамках квалификации специалиста и может быть проведено согласно протоколам, описанным в данной области.

В соответствии с данным изобретением термины "гомология", или "процент гомологии", или "идентичный", или "процент идентичности", или "процентная идентичность", или "идентичность последовательности" в контексте двух или более последовательностей нуклеиновых кислот относятся к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые являются одинаковыми или которые имеют определенный процент нуклеотидов, которые являются одинаковыми, при сравнении и выравнивании для поиска максимального соответствия в окне сравнения (предпочтительно по всей длине) или в определенной области (например, функциональном sema-домене), измеренный с использованием алгоритма сравнивания последовательностей, известного в данной области, или путем ручного выравнивания и визуального контроля. Последовательности, имеющие, например, 70-90% или большую идентичность последовательностей, можно считать по существу идентичными. Такое определение также относится к комплементу анализируемой последовательности. Предпочтительно описанная идентичность существует в области, которая имеет длину по меньшей мере от примерно 15 до примерно 25 нуклеотидов, более предпочтительно в области, которая имеет длину по меньшей мере от примерно 50 до примерно 100 нуклеотидов, еще более предпочтительно в области, которая имеет длину по меньшей мере от примерно 800 до примерно 1200 нуклеотидов в длину, и наиболее предпочтительно по всей длине. Специалисты в данной области знают, как определять процент идентичности между/среди последовательностей, используя, например, алгоритмы, такие как алгоритмы, основанные на компьютерной программе CLUSTALW (Thompson Nucl. Acids Res. 2 (1994), 4673-4680) или FASTDB (Brutlag Сотр. App. Biosci. 6 (1990), 237-245), известной в данной области.

Хотя алгоритм FASTDB, как правило, не рассматривает в своем вычислении внутренние несоответствующие делеции или добавления в последовательности, т.е. разрывы, это можно исправить вручную, чтобы избежать переоценки % идентичности. Тем не менее CLUSTALW учитывает разрывы последовательностей в своих расчетах идентичности. Также доступными для специалистов, обладающих навыками в данной области, являются алгоритмы BLAST и BLAST 2.0 (Altschul, (1997) Nucl. Acids Res. 25:3389-3402; Altschul (1993) J. Mol. Evol. 36:290-300; Altschul (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410). Программа BLASTN для последовательностей нуклеиновых кислот использует по умолчанию длину слова (W) 11, математическое ожидание (Е) 10, М=5, N=4 и сравнение обеих нитей. Оценочная матрица BLOSUM62 (Henikoff (1989) PNAS 89: 10915) использует выравнивания (В) 50, математическое ожидание (Е) 10, М=5, N=4 и сравнение обеих нитей.

Чтобы определить, соответствует ли нуклеотид в последовательности нуклеиновой кислоты определенной позиции в нуклеотидной последовательности, например, в SEQ ID NO 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 или 71, соответственно, специалист может использовать средства и способы, хорошо известные в данной области, например, выравнивание, либо вручную, либо с использованием компьютерных программ, таких как упомянутые в данном документе. Например, BLAST 2.0, который расшифровывается как Basic Local Alignment Search Tool (базовый инструмент поиска локального выравнивания) (Altschul (1997), loc. cit.; Altschul (1993), см. цит.; Altschul (1990), см. цит.), может использоваться для поиска локальных выравниваний последовательностей. BLAST, как обсуждалось выше, производит выравнивание нуклеотидных последовательностей для определения сходства последовательностей. Из-за локального характера выравниваний BLAST особенно полезен при определении точных совпадений или при выявлении подобных последовательностей. Основным блоком вывода алгоритма BLAST является пара сегментов с высокой оценкой (High-scoring Segment Pair, HSP). HSP состоит из двух фрагментов последовательностей произвольной, но одинаковой длины, выравнивание которых является локально максимальным, и для которых оценка выравнивания соответствует или превышает пороговую или отсечную оценку, установленную пользователем. Подход BLAST состоит в том, чтобы искать HSP между последовательностью запроса и последовательностью базы данных, оценивать статистическую значимость всех найденных совпадений и сообщать только о тех соответствиях, которые удовлетворяют выбранному пользователем пороговому значению. Параметр Е устанавливает статистически значимый порог для сопоставления последовательности базы данных. Е интерпретируется как верхняя граница ожидаемой частоты случайного возникновения HSP (или набора HSP) в контексте всего поиска по базе данных. О любой последовательности из базы данных, соответствие которой удовлетворяет Е, сообщается в выводе программы.

Аналогичные компьютерные методики с использованием BLAST (Altschul (1997), см. цит.; Altschul (1993), loc. cit.; Altschul (1990), см. цит.) используются для поиска идентичных или родственных молекул в нуклеотидных базах данных, таких как GenBank или EMBL. Этот анализ является намного более быстрым, чем множественные гибридизации на основе мембран. Кроме того, чувствительность компьютерного поиска можно изменить, чтобы определить, классифицировано ли какое-либо конкретное соответствие как точное или подобное. Основой поиска является оценка продукта, которая определяется как:

и она учитывает как степень сходства двух последовательностей, так и длину совпадения последовательностей. Например, с полученной оценкой 40 совпадение будет точным в пределах 1-2% ошибки; а при 70 совпадение будет точным. Похожие молекулы, как правило, выявляют, выбирая те, которые демонстрируют оценку от 15 до 40, хотя более низкие оценки могут выявлять родственные молекулы. Другим примером программы, способной создавать выравнивания последовательностей, является компьютерная программа CLUSTALW (Thompson (1994) Nucl. Acids Res. 2:4673-4680) или FASTDB (Brutlag (1990) Сотр. App.Biosci. 6:237-245), которые известны в данной области.

Объяснения и определения, приведенные в данном документе выше в отношении "гомологии/идентичности последовательностей нуклеиновых кислот", применяются, с необходимыми изменениями, к "аминокислотным последовательностям" членов мутантного семафорина 3 или их функциональных фрагментов или полипептида, в частности, к аминокислотным последовательностям, показанным в SEQ ID NO 2 (Homo sapiens SEMA3A), SEQ ID NO 6 (Homo sapiens SEMA3B), SEQ ID NO 10 (Homo sapiens SEMA3C), SEQ ID NO 14 (Homo sapiens SEMA3D), SEQ ID NO 4 (Mus musculus Sema3A), SEQ ID NO 8 (Mus musculus Sema3B), SEQ ID NO 12 (Mus musculus Sema3C) и SEQ ID NO 16 (Mus musculus Sema3D). Иллюстративные последовательности белков семафоринов 3, содержащих лизин в позиции, которая при сравнении гомологии соответствует позиции 106 семафорина 3А человека дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, приведены в SEQ ID NO 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 или 72.

Мутантные белки семафорины 3 или генетически модифицированные белки семафорины 3 имеют по меньшей мере 55% гомологию/идентичность с белком/полипептидом семафорином 3 дикого типа, имеющим аминокислотную последовательность, например, изображенную в SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 или 16, и функционирующим как ангиогенез ингибитора.

В предпочтительных аспектах предусмотренный мутантный семафорин 3 согласно данному изобретению предпочтительно по меньшей мере на 50% гомологичен/идентичен аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO 2. Понятно, что такие аминокислотные последовательности могут также включать ортологичные/гомологичные/идентичные (и, следовательно, родственные) последовательности. Более предпочтительно, аминокислотная последовательность, кодирующая предусмотренный в данном документе мутантный семафорин 3, по меньшей мере на 52%, 53%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91% 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% или 98% гомологична/идентична аминокислотной последовательности, показанной в любой из SEQ ID NO 2, где предпочтительными являются более высокие значения идентичности последовательностей.

В определенных аспектах предусмотренный в данном документе мутантный семафорин 3 согласно данному изобретению предпочтительно по меньшей мере на 48% гомологичен/идентичен аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO 6. Понятно, что такие аминокислотные последовательности могут также включать ортологичные/гомологичные/идентичные (и, следовательно, родственные) последовательности. Более предпочтительно аминокислотная последовательность, кодирующая предусмотренный в данном документе мутантный семафорин 3, по меньшей мере на 50%, 52%, 53%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91% 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% или 98% гомологична/идентична аминокислотной последовательности, показанной в любой из SEQ ID NO 6, где предпочтительными являются более высокие значения идентичности последовательностей.

В определенных аспектах предусмотренный в данном документе мутантный семафорин 3 согласно данному изобретению предпочтительно по меньшей мере на 55% гомологичен/идентичен аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO 10. Понятно, что такие аминокислотные последовательности могут также включать ортологичные/гомологичные/идентичные (и, следовательно, родственные) последовательности. Более предпочтительно аминокислотная последовательность, кодирующая предусмотренный в данном документе мутантный семафорин 3, по меньшей мере на 57%, 60%, 63%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 91% 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% или 98% гомологична/идентична аминокислотной последовательности, показанной в любой из SEQ ID NO 10, где предпочтительными являются более высокие значения идентичности последовательностей.

В определенных аспектах предусмотренный в данном документе мутантный семафорин 3 согласно данному изобретению предпочтительно по меньшей мере на 45% гомологичен/идентичен аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO 14. Понятно, что такие аминокислотные последовательности могут также включать ортологичные/гомологичные/идентичные (и, следовательно, родственные) последовательности. Более предпочтительно аминокислотная последовательность, кодирующая предусмотренный в данном документе мутантный семафорин 3, по меньшей мере на 48%, 50%, 53%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% или 98% гомологична/идентична аминокислотной последовательности, показанной в любой из SEQ ID NO 14, где предпочтительными являются более высокие значения идентичности последовательностей.

В некоторых аспектах предусмотренный в данном документе мутантный семафорин 3 согласно данному изобретению предпочтительно по меньшей мере на 55% гомологичен/идентичен аминокислотной последовательности, показанной в любой из SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 или 16. Более предпочтительно мутантный семафорин 3 по меньшей мере на 57, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95%, 96%, 97% или 98% гомологичен/идентичен белку/полипептиду семафорину 3 дикого типа, имеющему аминокислотную последовательность, например, изображенную в SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 и 16, соответственно, причем более высокие значения являются предпочтительными. Наиболее предпочтительно мутантный семафорин 3 по меньшей мере на 99% гомологичен белку/полипептиду семафорину 3 дикого типа, имеющему аминокислотную последовательность, например, изображенную в SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 или 16.

Данное изобретение также содержит полипептиды, отклоняющиеся от аминокислотных последовательностей дикого типа, описанных выше, где указанное отклонение может быть, например, результатом аминокислотной и/или нуклеотидной замены (замен), делеции(-й), добавления(-й), вставки(-ок), дупликации(-й), инверсии (-й) и/или рекомбинации(й) либо по отдельности, либо в комбинации. Эти отклонения могут иметь природное происхождение или могут быть получены с помощью методик рекомбинантной ДНК, хорошо известных в данной области; см., например, методики, описанные в Sambrook (Molecular Cloning; А Laboratory Manual, 2^nd Edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY (1989)) и Ausubel, "Current Protocols in Molecular Biology", Green Publishing Associates; and Wiley Interscience, N.Y. (1989). Аллельными вариациями могут быть природные аллельные варианты, а также синтезированные или генно-инженерные варианты. Полипептиды, пептиды или фрагменты белка, закодированные различными производными, аллельными вариантами, гомологами или аналогами описанных выше молекул нуклеиновых кислот, кодирующих мутантный семафорин 3 и/или его фрагмент, могут иметь общие характеристики, такие как молекулярную массу, иммунологическую реактивность, конформацию и т.д., а также физические свойства, такие как электрофоретическую подвижность, хроматографическое поведение, коэффициенты седиментации, оптимальный рН, стабильность, растворимость, спектроскопические свойства и т.д.

Термины "комплемент", "обратный комплемент" и "обратная последовательность", упомянутые в данном документе, описаны в следующем примере: для последовательности 5'AGTGAAGT3' комплемент представляет собой 3'ТСАСТТСА5', обратный комплемент представляет собой 3'АСТТСАСТ5', а обратная последовательность представляет собой 5'TGAAGTGA3'.

Данное изобретение относится к мутантному семафорину 3 или его функциональному фрагменту, определенному в данном документе, который может быть выбран из следующей группы:

(a) полипептид, который закодирован последовательностью нуклеиновой кислоты, выбранной среди SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 9 и SEQ ID NO 13,

где нуклеотиды GCT в позиции с 631 по 633 в SEQ ID NO 1 заменены нуклеотидами, кодирующими указанную гидрофильную аминокислоту,

где нуклеотиды GCA в позиции с 559 по 556 в SEQ ID NO 5 заменены нуклеотидами, кодирующими указанную гидрофильную аминокислоту,

где нуклеотиды GCT в позиции с 872 по 874 в SEQ ID NO 9 заменены нуклеотидами, кодирующими указанную гидрофильную аминокислоту, и

где нуклеотиды GCC в позиции с 398 по 400 SEQ ID NO 13 заменены нуклеотидами, кодирующими указанную гидрофильную аминокислоту;

(b) полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную среди SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 10 и SEQ ID NO 14, где остаток аланина в позиции 106 в SEQ ID NO 2, в позиции 105 в SEQ ID NO 6, в позиции 104 в SEQ ID NO 10 или в позиции 120 в SEQ ID NO 14, заменен указанной гидрофильной аминокислотой;

(c) полипептид, который закодирован последовательностью нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в жестких условиях с комплементарной нитью молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, определенный в (а) или (b);

(d) полипептид, который функционирует как ингибитор ангиогенеза и обладает по меньшей мере 55% идентичностью с любым из полипептидов, упомянутых в (b).

В наиболее предпочтительных воплощениях данное изобретение относится к мутантному семафорину 3А или его функциональному фрагменту, определенному в данном документе, который может быть выбран из следующей группы:

(а) полипептид, который закодирован последовательностью нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID NO 1

где нуклеотиды GCT в позиции с 631 по 633 в SEQ ID NO 1 заменены нуклеотидами, кодирующими указанную гидрофильную аминокислоту,

(b) полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO 2, где остаток аланина в позиции 106 в SEQ ID NO 2, заменен указанной гидрофильной аминокислотой;

(c) полипептид, который закодирован последовательностью нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в жестких условиях с комплементарной нитью молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, определенный в (а) или (b);

(d) полипептид, который функционирует как ингибитор ангиогенеза и имеет по меньшей мере 50% идентичность с любым из полипептидов, упомянутых в (b).

В некоторых аспектах мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент, определенный в данном документе, может быть выбран из следующей группы:

(a) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, закодированную молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную среди SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 9 и SEQ ID NO 13,

где нуклеотиды GCT в позиции с 631 по 633 SEQ ID NO 1 заменены нуклеотидами, кодирующими указанную гидрофильную аминокислоту,

где нуклеотиды GCA в позиции с 559 по 556 SEQ ID NO 5 заменены нуклеотидами, кодирующими указанную гидрофильную аминокислоту,

где нуклеотиды GCT в позиции с 872 по 874 SEQ ID NO 9 заменены нуклеотидами, кодирующими указанную гидрофильную аминокислоту, и

где нуклеотиды GCC в позиции с 398 по 400 SEQ ID NO 13 заменены нуклеотидами, кодирующими указанную гидрофильную аминокислоту;

(b) полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную среди SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 10 и SEQ ID NO 14, где остаток аланина, соответствующий позиции 106 в SEQ ID NO 2, соответствующий позиции 105 в SEQ ID NO 6, соответствующий позиции 104 в SEQ ID NO 10 или соответствующий позиции 120 в SEQ ID NO 14, заменен указанной гидрофильной аминокислотой;

(c) полипептид, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную среди SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 10 и SEQ ID NO 14, где остаток аланина, соответствующий позиции 106 в SEQ ID NO 2, соответствующий позиции 105 в SEQ ID NO 6, соответствующий позиции 104 в SEQ ID NO 10 или соответствующий позиции 120 в SEQ ID NO 14, заменен указанной гидрофильной аминокислотой;

(d) полипептид, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в жестких условиях с комплементарной нитью молекулы нуклеиновой кислоты, определенной в (а) или (с);

(e) полипептид, обладающий по меньшей мере 55% идентичностью с полипептидом согласно любому из пунктов (a)-(d) и функционирующий как ингибитор ангиогенеза; а также

(f) полипептид, который функционирует как ингибитор ангиогенеза, включающий аминокислотную последовательность, закодированную молекулой нуклеиновой кислоты, которая является вырожденной в результате генетического кода до нуклеотидной последовательности молекулы нуклеиновой кислоты, определенной в любом из (а), (с) и (d).

В некоторых аспектах мутантный семафорин 3, его функциональный фрагмент или полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную среди SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 12 и SEQ ID NO 14, где остаток аланина, соответствующий позиции 106 в SEQ ID NO 2; где остаток аланина, соответствующий позиции 106 в SEQ ID NO 4; где остаток аланина, соответствующий позиции 105 в SEQ ID NO 6; где остаток аланина, соответствующий позиции 105 в SEQ ID NO 8; где остаток аланина, соответствующий позиции 104 в SEQ ID NO 10; где остаток аланина, соответствующий позиции 104 в SEQ ID NO 12; где остаток аланина, соответствующий позиции 120 в SEQ ID NO 14; или где остаток аланина, соответствующий позиции 120 в SEQ ID NO 16, заменен гидрофильной аминокислотой.

В наиболее предпочтительных воплощениях мутантный семафорин 3А, его функциональный фрагмент или полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы SEQ ID NO 2, где остаток аланина, соответствующий позиции 106 в SEQ ID NO 4, заменен гидрофильной аминокислотой.

Другими словами, данное изобретение относится к мутантному семафорину 3 или его фрагменту, где аланин, соответствующий позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2; аланин, соответствующий позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 4; аланин, соответствующий позиции 105 семафорина 3В дикого типа, показанного в SEQ ID NO 6; аланин, соответствующий позиции 105 семафорина ЗВ дикого типа, показанного в SEQ ID NO 8; аланин, соответствующий позиции 104 семафорина 3С дикого типа, показанного в SEQ ID NO 10; аланин, соответствующий позиции 104 семафорина 3С дикого типа, показанного в SEQ ID NO 12; аланин, соответствующий позиции 120 семафорина 3D дикого типа, показанного в SEQ ID NO 14; или аланин, соответствующий позиции 120 семафорина 3D дикого типа, показанного в SEQ ID NO 16, заменен гидрофильной аминокислотой.

Соответственно, специалист в данной области понимает, что в случае, если мутация согласно изобретению определена в данном документе конкретной позицией, например, аланином в позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, то становится очевидным, что также можно указать соответствующую аминокислоту (позицию) в других белках семафоринах 3, таких как другие полипептиды семафорины 3А, или полипептиды семафорины 3В, С или D, которые, например, могут быть найдены при сравнении гомологии. Следовательно, в данном документе понимается, что для выявления других последовательностей дикого типа и/или для обнаружения соответствующего специфического аминокислотного остатка, соответствующего аланину в позиции 106 семафорина 3А дикого типа, который мутирован в соответствии со стандартом изобретения, могут использоваться гомологичные скрининги (например, выравнивания последовательностей) или методики скрининга, основанные на ПЦР.

В наиболее предпочтительных воплощениях данное изобретение относится к мутантному семафорину 3А или его функциональному фрагменту, где аланин, соответствующий позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, заменен гидрофильной аминокислотой.

SEQ ID NO 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 или 72 относится к полноразмерному человеческому или мышиному мутантному семафорину 3А, В, С или D, где лизин находится в позиции, которая при сравнении гомологии соответствует позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2. Таким образом, "содержащий гидрофильную аминокислоту на месте" означает, что специфический аланин, например, соответствующий позиции 106, показанной в SEQ ID NO 2, который присутствует в природном семафорине 3А, В, С или D, мутирован или заменен гидрофильной аминокислотой, предпочтительно лизином, в мутантном семафорине 3А, В, С или D.

Иллюстративный полипептид, содержащий мутантный человеческий семафорин 3А, имеет аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO 58, где лизин находится в позиции 106.

Иллюстративный полипептид, содержащий мутантный мышиный семафорин 3А, имеет аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO 60, где лизин находится в позиции 106.

Иллюстративный полипептид, содержащий мутантный человеческий семафорин 3В, имеет аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO 62, где лизин находится в позиции 105.

Иллюстративный полипептид, содержащий мутантный мышиный семафорин 3В, имеет аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO 64, где лизин находится в позиции 105.

Иллюстративный полипептид, содержащий мутантный человеческий семафорин 3С, имеет аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO 66, где лизин находится в позиции 104.

Иллюстративный полипептид, содержащий мутантный мышиный семафорин 3С, имеет аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO 68, где лизин находится в позиции 104.

Иллюстративный полипептид, содержащий мутантный человеческий семафорин 3D, имеет аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO 70, где лизин находится в позиции 120.

Иллюстративный полипептид, содержащий мутантный мышиный семафорин 3D, имеет аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO 72, где лизин находится в позиции 120.

Таким образом, данное изобретение относится к мутантному семафорину 3 или его функциональному фрагменту, где мутантный семафорин 3 содержит аминокислотную последовательность, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO 58, SEQ ID NO 60, SEQ ID NO 62, SEQ ID NO 64, SEQ ID NO 66, SEQ ID NO 68, SEQ ID NO 70 и SEQ ID NO 72 или их функциональных фрагментов. В предпочтительных аспектах данное изобретение относится к мутантному семафорину 3А или его функциональному фрагменту, где мутантный семафорин 3А содержит аминокислотную последовательность, которая представляет собой SEQ ID NO 58 или SEQ ID NO 60. В предпочтительных аспектах функциональный фрагмент является sema-доменом, подробно описанным ниже.

Кроме того, данное изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент, молекула нуклеиновой кислоты согласно данному изобретению может быть выбрана из следующей группы:

(a) молекула нуклеиновой кислоты, выбранная среди SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 9 и SEQ ID NO 13,

где нуклеотиды GCT в позиции с 631 по 633 в SEQ ID NO 1 заменены нуклеотидами, кодирующими указанную гидрофильную аминокислоту,

где нуклеотиды GCA в позиции с 559 по 561 в SEQ ID NO 5 заменены нуклеотидами, кодирующими указанную гидрофильную аминокислоту,

где нуклеотиды GCT в позиции с 872 по 874 в SEQ ID NO 9 заменены нуклеотидами, кодирующими указанную гидрофильную аминокислоту, и

где нуклеотиды GCC в позиции с 398 по 400 в SEQ ID NO 13 заменены нуклеотидами, кодирующими указанную гидрофильную аминокислоту;

(b) молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, выбранный среди SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 10 и SEQ ID NO 14, где остаток аланина в позиции 106 в SEQ ID NO 2, в позиции 105 в SEQ ID NO 6, в позиции 104 в SEQ ID NO 10 или в позиции 120 в SEQ ID NO 14 заменен указанной гидрофильной аминокислотой;

(c) молекула нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в жестких условиях с комплементарной нитью молекулы нуклеиновой кислоты, определенной в (а) или (b);

(d) молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, который функционирует в качестве ингибитора ангиогенеза и обладает по меньшей мере 55% идентичностью с одним из полипептидов, определенных в (b); и

(e) молекула нуклеиновой кислоты, которая дегенерирована в результате генетического кода до нуклеотидной последовательности молекулы нуклеиновой кислоты, определенной в одном из (a)-(d), где дегенерированная молекула нуклеиновой кислоты кодирует полипептид, который функционирует в качестве ингибитора ангиогенеза.

В определенных аспектах закодированный мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент, определенный в данном документе, может быть выбран из группы, включающей:

(a) молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность ДНК, выбранную среди SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 9 и SEQ ID NO 13,

где нуклеотиды GCT в позиции с 631 по 633 в SEQ ID NO 1 заменены нуклеотидами, кодирующими указанную гидрофильную аминокислоту,

где нуклеотиды GCA в позиции с 559 по 561 в SEQ ID NO 5 заменены нуклеотидами, кодирующими указанную гидрофильную аминокислоту,

где нуклеотиды GCT в позиции с 872 по 874 в SEQ ID NO 9 заменены нуклеотидами, кодирующими указанную гидрофильную аминокислоту, и

где нуклеотиды GCC в позиции с 398 по 400 в SEQ ID NO 13 заменены нуклеотидами, кодирующими указанную гидрофильную аминокислоту;

(b) молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную среди SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 10 и SEQ ID NO 14, где остаток аланина в позиции 106 в SEQ ID NO 2, в позиции 105 в SEQ ID NO 6, в позиции 104 в SEQ ID NO 10 или в позиции 120 в SEQ ID NO 14 заменен указанной гидрофильной аминокислотой;

(c) молекулу нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в жестких условиях с комплементарной нитью молекулы нуклеиновой кислоты, определенной в (а) или (b);

(d) молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, который функционирует в качестве ингибитора ангиогенеза и обладает по меньшей мере 55% идентичностью с одним из полипептидов, определенных в (b); и

(e) молекулу нуклеиновой кислоты, которая дегенерирована в результате генетического кода до нуклеотидной последовательности молекулы нуклеиновой кислоты, определенной в одном из (a)-(d), где дегенерированная молекула нуклеиновой кислоты кодирует полипептид, который функционирует в качестве ингибитора ангиогенеза.

В наиболее предпочтительных воплощениях закодированный мутантный семафорин 3А или его функциональный фрагмент, определенный в данном документе, может быть выбран из группы:

(a) молекулы нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID NO 1, где нуклеотиды GCT в позиции с 631 по 633 в SEQ ID NO 1 заменены нуклеотидами, кодирующими указанную гидрофильную аминокислоту,

(b) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, показанный в SEQ ID NO 2, где остаток аланина в позиции 106 в SEQ ID NO 2 заменен указанной гидрофильной аминокислотой;

(c) молекулы нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в жестких условиях с комплементарной нитью молекулы нуклеиновой кислоты, определенной в (а) или (b);

(d) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, который функционирует в качестве ингибитора ангиогенеза и обладает по меньшей мере 50% идентичностью с одним из полипептидов, определенных в (b); и

(e) молекулы нуклеиновой кислоты, которая дегенерирована в результате генетического кода до нуклеотидной последовательности молекулы нуклеиновой кислоты, определенной в одном из (a)-(d), где дегенерированная молекула нуклеиновой кислоты кодирует полипептид, который функционирует в качестве ингибитора ангиогенеза.

В определенных аспектах закодированный мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент, определенный в данном документе, может быть выбран из группы:

молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, определенную в SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 11,SEQ ID NO 13 и SEQ ID NO 15,

где нуклеотиды GCT в позиции с 631 по 633 в SEQ ID NO 1 заменены нуклеотидами, кодирующими указанную гидрофильную аминокислоту,

где нуклеотиды GCT в позиции с 965 по 967 в SEQ ID NO 3 заменены нуклеотидами, кодирующими указанную гидрофильную аминокислоту,

где нуклеотиды GCA в позиции с 559 по 561 в SEQ ID NO 5 заменены нуклеотидами, кодирующими указанную гидрофильную аминокислоту,

где нуклеотиды GCT в позиции с 712 по 714 в SEQ ID NO 7 заменены нуклеотидами, кодирующими указанную гидрофильную аминокислоту,

где нуклеотиды GCT в позиции с 872 по 874 в SEQ ID NO 9 заменены нуклеотидами, кодирующими указанную гидрофильную аминокислоту,

где нуклеотиды GCT в позиции с 498 по 500 в SEQ ID NO 11 заменены нуклеотидами, кодирующими указанную гидрофильную аминокислоту,

где нуклеотиды GCC в позиции с 398 по 400 в SEQ ID NO 13 заменены нуклеотидами, кодирующими указанную гидрофильную аминокислоту, или

где нуклеотиды GCT в позиции с 904 по 906 в SEQ ID NO 15 заменены нуклеотидами, кодирующими указанную гидрофильную аминокислоту.

SEQ ID NO 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 или 71 относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полноразмерный человеческий или мышиный мутантный семафорин 3А, В, С или D, где лизин находится в позиции, которая при сравнении гомологии соответствует позиции 106 семафорина дикого типа 3А, показанного в SEQ ID NO 2.

Иллюстративная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая мутантный человеческий семафорин 3А, содержит молекулу нуклеиновой кислоты, определенную в SEQ ID NO 57, где нуклеотиды в позиции с 631 по 633 в SEQ ID NO 57 кодируют аминокислоту лизин.

Иллюстративная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая мутантный мышиный семафорин 3А, содержит молекулу нуклеиновой кислоты, определенную в SEQ ID NO 59, где нуклеотиды в позиции с 965 по 967 в SEQ ID NO 59 кодируют аминокислоту лизин.

Иллюстративная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая мутантный человеческий семафорин 3В, содержит молекулу нуклеиновой кислоты, определенную в SEQ ID NO 61, где нуклеотиды в позиции с 559 по 561 в SEQ ID NO 61 кодируют аминокислоту лизин.

Иллюстративная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая мутантный мышиный семафорин 3В, содержит молекулу нуклеиновой кислоты, определенную в SEQ ID NO 63, где нуклеотиды в позиции с 712 по 714 в SEQ ID NO 63 кодируют аминокислоту лизин.

Иллюстративная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая мутантный человеческий семафорин 3С, содержит молекулу нуклеиновой кислоты, определенную в SEQ ID NO 65, где нуклеотиды в позиции с 872 по 874 в SEQ ID NO 65 кодируют аминокислоту лизин.

Иллюстративная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая мутантный мышиный семафорин 3С, содержит молекулу нуклеиновой кислоты, определенную в SEQ ID NO 67, где нуклеотиды в позиции с 498 по 500 в SEQ ID NO 67 кодируют аминокислоту лизин.

Иллюстративная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая мутантный человеческий семафорин 3D, содержит молекулу нуклеиновой кислоты, определенную в SEQ ID NO 69, где нуклеотиды в позиции с 398 по 400 в SEQ ID NO 69 кодируют аминокислоту лизин.

Иллюстративная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая мутантный мышиный семафорин 3D, содержит молекулу нуклеиновой кислоты, определенную в SEQ ID NO 71, где нуклеотиды в позиции с 904 по 906 в SEQ ID NO 71 кодируют аминокислоту лизин.

Нуклеиновая кислота, данная в SEQ ID NO 57, SEQ ID NO 59, SEQ ID NO 61, SEQ ID NO 63, SEQ ID NO 65, SEQ ID NO 67, SEQ ID NO 69 или SEQ ID NO 71, кодирует полноразмерные мутантные белки семафорины 3. Таким образом, данное изобретение относится к мутантному семафорину 3 или его функциональному фрагменту, где мутантный семафорин 3 закодирован молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеиновую кислоту, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO 57, SEQ ID NO 59, SEQ ID NO 61, SEQ ID NO 63, SEQ ID NO 65, SEQ ID NO 67, SEQ ID NO 69 и SEQ ID NO 71. В предпочтительных аспектах данного изобретения мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент представляет собой мутантный семафорин 3А или его функциональный фрагмент, где мутантный семафорин 3А закодирован молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеиновую кислоту SEQ ID NO 57 или SEQ ID NO 59. В предпочтительных аспектах функциональный фрагмент представляет собой sema-домен, подробно описанный в данном документе ниже.

В определенных аспектах закодированный мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент, определенный в данном документе, может быть выбран из группы:

молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, определенную в SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 9 и SEQ ID NO 13,

где кодон в нуклеотидной позиции с 631 по 633 в SEQ ID NO 1 заменен кодоном, кодирующим указанную гидрофильную аминокислоту,

где кодон в нуклеотидной позиции с 559 по 561 в SEQ ID NO 5 заменен кодоном, кодирующим указанную гидрофильную аминокислоту,

где кодон в нуклеотидной позиции с 872 по 874 в SEQ ID NO 9 заменен кодоном, кодирующим указанную гидрофильную аминокислоту, и

где кодон в нуклеотидной позиции с 398 по 400 в SEQ ID NO 13 заменен кодоном, кодирующим указанную гидрофильную аминокислоту; Кодон, кодирующий гидрофильные аминокислоте, в соответствии с данным изобретением означает кодон, который в соответствии со стандартным генетическим кодом (как показано, в частности, в Stryer (1995), "Biochemistry", Freeman and Company, ISBN 0-7167-2009-4) кодирует "гидрофильную аминокислоту". В некоторых аспектах К закодирован кодоном, кодирующим К. В конкретных предпочтительных аспектах К закодирован кодоном AAG или AAA. Вырождение генетического кода позволяет кодировать и транслировать одну и ту же аминокислотную последовательность различными способами. Например, лейцин, серии и аргинин кодируются шестью различными кодонами, тогда как валин, пролин, треонин, аланин и глицин кодируются четырьмя различными кодонами. Тем не менее частота использования таких синонимичных кодонов варьирует от генома к геному среди эукариот и прокариот. Например, синонимичные паттерны выбора кодонов среди млекопитающих очень похожи, в то время как эволюционно отдаленные организмы, такие как дрожжи (S. cerevisiae), бактерии (такие как Е. coli) и насекомые (такие как D. melanogaster), демонстрируют совершенно другой паттерн частоты геномного использования кодонов. Таким образом, в данном изобретении могут быть использованы кодон-оптимизированные гены. Разработка кодон-оптимизированных генов должна учитывать множество факторов, включая частоту использования кодонов в организме, частоты ближайших соседей, стабильность РНК, потенциал образования вторичных структуры, путь синтеза и предполагаемые в будущем манипуляции с ДНК этого гена.

В данном документе предполагается, что могут быть использованы последовательности нуклеиновых кислот, оптимизированные по кодонам. Такие гены, оптимизированные по кодонам (SEQ ID NO 17, 19, 43 и 44), были использованы в прилагаемых примерах.

Как было показано в данном документе, замена аланина гидрофильной аминокислотой в консенсусном мотиве CX₁X₂A₃GKD приводит к благоприятным фармакологическим эффектам.

Таким образом, аминокислотные последовательности согласно данному изобретению относятся к мутантному семафорину 3 или его функциональному фрагменту, где указанный мутантный семафорин 3 или указанный его функциональный фрагмент содержит аминокислотную последовательность CX₁X₂A₃GKD, где

Х₁ представляет собой аминокислоту, которая представляет собой K или N,

Х₂ представляет собой аминокислоту, выбранную среди W, М и L, и где аланин (А₃) замещен указанной гидрофильной аминокислотой. Другими словами, данное изобретение относится к мутантному семафорину 3 или его функциональному фрагменту, где указанный мутантный семафорин 3 выбран из группы, состоящей из семафорина 3А, семафорина 3В, семафорина 3С и семафорина 3D, где предпочтительно указанный мутантный семафорин представляет собой семафорин 3А, где указанный мутантный семафорин 3 или указанный его функциональный фрагмент содержит аминокислотную последовательность CX₁X₂A₃GKD, где

X₁ представляет собой аминокислоту, которая представляет собой K или N,

Х₂ представляет собой аминокислоту, выбранную среди W, М и L, и где аланин (А₃) замещен указанной гидрофильной аминокислотой. В данном документе понимается, что А₃ относится к аланину, соответствующему позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2; к аланину, соответствующему позиции 105 семафорина 3В дикого типа, показанного в SEQ ID NO 6, к аланину, соответствующему позиции 104 семафорина 3С дикого типа, показанного в SEQ ID NO 10, или к аланину, соответствующему позиции 120 семафорина 3D дикого типа, показанного в SEQ ID NO 14. "А₃", как правило, относится к конкретному аланину; тем не менее, "А₃" также может относиться к аминокислотному остатку, который гомологичен аланину, такому как валин, изолейцин, лейцин, метионин, фенилаланин, тирозин или триптофан. Наиболее предпочтительно "А₃" представляет собой аланин. Кроме того, аминокислотные остатки, обозначенные "С", "Х₁, "Х₂", "G", "K" и "D", также могут относиться к аминокислотным остаткам, которые являются гомологичными указанным соответствующим определенным аминокислотным остаткам до тех пор, пока мутантный семафорин 3 выбран из группы, состоящей из семафорина 3А, В, С и D. Согласно данному изобретению мутантный семафорин 3 не является семафорином 3Е, F или G. В предпочтительных аспектах данного изобретения представляет собой не изолейцин или валин.

Указанная гидрофильная аминокислота выбрана из группы, состоящей из лизина, аргинина, аспарагина, глутамина, серина, треонина, глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты и гистидина. Более предпочтительно указанная гидрофильная аминокислота представляет собой лизин или аргинин, и наиболее предпочтительно указанная гидрофильная аминокислота представляет собой лизин.

Термин "гидрофильная аминокислота" предпочтительно означает аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из N, Q, S, Т, Е, D, K, R и Н. В соответствии со стандартным трехбуквенным аминокислотным кодом и однобуквенным кодом аргинин может быть сокращен как (Arg) или (R). Лизин может быть сокращен как (Lys) или (K). Аспарагиновая кислота может быть сокращена как (Asp) или (D). Глутаминовая кислота может быть сокращена как (Glu) или (Е). Глутамин может быть сокращен как (Gin) или (Q). Аспарагин может быть сокращен как (Asn) или (N). Гистидин может быть сокращен как (His) или (Н). Серии может быть сокращен как (Ser) или (S). Треонин может быть сокращен как (Thr) или (Т). N, Q, S и Т представляют собой гидрофильные незаряженные аминокислоты, а Е, D, K, R и Н представляют собой гидрофильные заряженные аминокислоты. В данном документе также предусматривается, что указанная гидрофильная аминокислота может быть непротеиногенной и/или нестандартной α-аминокислотой (такой как, например, орнитин и цитруллин).

Данное изобретение относится к аминокислотным последовательностям, содержащим мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент, где указанная гидрофильная аминокислота выбрана среди K, R, N, Q, S, Т, Е, D и Н. В предпочтительных аспектах данное изобретение относится к аминокислотным последовательностям, содержащим мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент, где указанная гидрофильная аминокислота выбрана среди K, R, Е, D и Н. В еще более предпочтительных аспектах данное изобретение относится к аминокислотным последовательностям, содержащим мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент, где указанная гидрофильная аминокислота представляет собой K или R. В наиболее предпочтительных аспектах данное изобретение относится к аминокислотным последовательностям, содержащим мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент, где указанная гидрофильная аминокислота представляет собой K.

В некоторых аспектах данное изобретение относится к аминокислотным последовательностям, содержащим мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент, где аланин (А₃) в мотиве аминокислотной последовательности CX₁X₂A₃GKD заменен указанной гидрофильной аминокислотой, выбранной среди K, R, N, Q, S, Т, Е, D и Н. В некоторых аспектах данное изобретение относится к мутантному семафорину 3 или его функциональному фрагменту, где аланин (А₃) в мотиве аминокислотной последовательности CX₁X₂A₃GKD заменен указанной гидрофильной аминокислотой, выбранной среди K, R, Е, D и Н. В предпочтительных аспектах данное изобретение относится к мутантному семафорину 3 или его функциональному фрагменту, где аланин (А₃) в мотиве аминокислотной последовательности CX₁X₂A₃GKD заменен указанной гидрофильной аминокислотой, которая представляет собой K или R. В особенно предпочтительных аспектах данное изобретение относится к мутантному семафорину 3 или его функциональному фрагменту, где аланин (А₃) в мотиве аминокислотной последовательности CX₁X₂A₃GKD заменен указанной гидрофильной аминокислотой, которая представляет собой K.

Кроме того, данное изобретение относится к полипептидам, содержащим мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент, где указанный мутантный семафорин 3 или указанный его функциональный фрагмент содержит указанную гидрофильную аминокислоту в позиции 106 в SEQ ID NO 2, в позиции 105 в SEQ ID NO 6, в позиции 104 в SEQ ID NO 10 или в позиции 120 в SEQ ID NO 14. В некоторых аспектах полипептиды согласно данному изобретению содержат по меньшей мере одну дополнительную мутацию, выбранную из группы, состоящей из аминокислотной замены (замен), добавления(-й), делеции(-й), инверсии(-й) и дупликации(-й). Наиболее предпочтительно данное изобретение относится к полипептиду, содержащему мутантный семафорин 3А или его функциональный фрагмент, где указанный мутантный семафорин 3А или указанный его функциональный фрагмент содержит указанную гидрофильную аминокислоту в позиции 106 в SEQ ID NO 2 и содержит по меньшей мере одну дополнительную мутацию, выбранную из группы, состоящей из аминокислотной замены (замен), добавления(-й), делеции(-й), инверсии(-й) и дупликации(-й).

Другими словами, аминокислотные последовательности согласно данному изобретению относятся к мутантному семафорину 3 или его функциональному фрагменту, где мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент содержит указанную гидрофильную аминокислоту в позиции 106 в SEQ ID NO 2, в позиции 105 в SEQ ID NO 6, в позиции 104 в SEQ ID NO 10 или в позиции 120 в SEQ ID NO 14 и содержит по меньшей мере одну дополнительную мутацию, выбранную из группы, состоящей из аминокислотной замены (замен), добавления(-й), делеции(-й), инверсии(-й) и дупликации(-й).

В некоторых аспектах аминокислотные последовательности согласно данному изобретению относятся к мутантному семафорину 3 или его функциональному фрагменту, где указанный мутантный семафорин 3 или указанный его функциональный фрагмент содержит указанную гидрофильную аминокислоту в позиции 106 в SEQ ID NO 2; в позиции 106 в SEQ ID NO 4; в позиции 105 в SEQ ID NO 6; в позиции 105 в SEQ ID NO 8; в позиции 104 в SEQ ID NO 10; в позиции 104 в SEQ ID NO 12; в позиции 120 в SEQ ID NO 14; или в позиции 120 в SEQ ID NO 16 и содержит по меньшей мере одну дополнительную мутацию, выбранную из группы, состоящей из аминокислотной замены (замен), добавления(-й), делеции(-й), инверсии(-й) и дупликации(-й).

Следующее описание относится к мутантным белкам семафоринам 3, которые включены в гибридные белки/полипептиды. Мутантный белок семафорин 3, включенный в гибридный белок/полипептид, также может быть функциональным фрагментом мутантного белка семафорина 3. Другими словами, следующее ниже описание относится к предусмотренным в данном документе функциональным фрагментам неприродных/искусственных/мутантных белков семафоринов 3 или предусмотренным в данном документе функциональным фрагментам неприродных/искусственных/мутантных белков семафоринов 3, которые содержатся в гибридном белке/полипептиде:

В наиболее предпочтительных воплощениях предусмотренный в данном изобретении функциональный фрагмент мутантного семафорина 3 включает функциональный sema-домен, где sema-домен содержит гидрофильную аминокислоту в позиции, которая при сопоставлении гомологии соответствует позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, и где sema-домен обладает свойствами мутантного семафорина 3А, В, С или D. Термин "sema-домен" относится к структурному домену белков семафоринов 3. Как правило, семафорины содержат sema-доменную складку [NCBI Position-Specific Scoring Matrix (PSSM)-ID: 214747; Conserved Domain Database (CDD): smart00630 и cl], которая была описана ранее как вариация так называемой 6-пропеллерной топологии длиной примерно 500 аминокислот (Chen et al., 2011; Gherardi et al., 2004). В более общем смысле белки с В-пропеллерной складкой представляют собой большое семейство дискообразных структур, создаваемых циркулярно организованными структурными модулями, также известными как лезвия, вокруг центрального канала.

Каждое лезвие представляет собой четырехнитевой антипараллельный β-лист.

Нити обозначаются как нити A-D, начиная с N-конца каждой из них (Chen et al., 2011; Gherardi et al., 2004). Внутренняя нить каждого лезвия (А) направляет канал в центр пропеллера, причем нити В и С одного и того же повтора направлены наружу, а нить D следующего повтора образует внешний край лезвия. Тот факт, что внутренняя нить каждого листа (нить А) проходит параллельно центральной оси, тогда как внешняя (нить D) проходит перпендикулярно (скручивая каждый β-лист таким образом, что он выглядит как лопасть пропеллера), дает домену его вид, сходный с пропеллером. В целом, sema-домен, описанный в предшествующем уровне техники, представляет собой пропеллер с семью лопастями и является самым крупным из известных вариантов β-пропеллерной складки. Большой размер sema-домена обусловлен наличием дополнительных элементов вторичной структуры, вставленных в несколько лезвий и образующих несколько длинных петель, главным образом на верхней поверхности β-пропеллера, которые Love и коллеги назвали экструзиями, когда они описали первую кристаллическую структуру семафорина (Love et al., 2003). В sema-домене представлены две экструзии, называемые экструзией 1 (между лезвием 1 и лезвием 2) и экструзией 2 (внутреннее лезвие 5). В sema-домене используется система "петля и крюк", чтобы закрыть круг между первым и последним лезвиями. Сгиб стабилизируется за счет гидрофобных контактов между складками и в большинстве структур за счет замыкания кольца типа "липучек", где N-концевая β-нить закрывает круг, образуя самую удаленную цепь (D) седьмого (С-концевого) лезвия. β-пропеллер также стабилизируется удлинением с N-конца, обеспечивающим дополнительную пятую β-нить на внешней кромке лезвия 6. Например, в семафорине 3А: i) лезвие 1 имеет дополнительную нить и спираль; ii) лезвие 4 имеет дополнительную спираль; лезвие 5 имеет самую большую вставку, состоящую из трех спиралей и двух нитей (Antipenko et al., 2003). Sema-домена может быть охарактеризован консервативным набором остатков цистеина, которые образуют четыре дисульфидные связи для стабилизации структуры: Cys 103 - Cys 114, Cys 132 - Cys 144, Cys 269 - Cys 381 и Cys 293 - Cys 341. Следовательно, sema-домен согласно данному изобретению может содержать по меньшей мере одну или все из следующих связей: Cys 103 - Cys 114, Cys 132 - Cys 144, Cys 269 - Cys 381 и Cys 293 - Cys 341.

В семафоринах С-концевая β-нить лезвия 7 sema-домена ведет непосредственно к домену PSI (Plexin Semaphorin Integrin, плексин-семафорин-интегрин) длиной примерно 50 аминокислот (NCBI PSSM-ID: 214655, smart00423), который прилегает к стороне лезвия 6 β-пропеллера sema-домена (Love et al., 2003).

PSI представляет собой домен, образованный двунитевым антипараллельным β-листом с двумя фланкирующими короткими α-спиралями, связанными тремя дисульфидными мостиками, образующими внутреннее ядро домена. Этот повторяющийся мотив обнаружен в семафоринах, в нескольких различных внеклеточных рецепторах, включая плексины, и в β-субъединице αβ-гетеродимеров интегрина (Xiong et al., 2004). Ключевое различие между плексин-, семафорин- и интегрин-PSI-доменами заключается в значительно более короткой межнитевой АВ-петле в плексинах и семафоринах. Общие структуры плексин-, семафорин- и интегрин-PSI-доменов различаются в С-концевой половине домена, показывая, как функция этой части PSI определяется ее специфическим структурным контекстом.

Поверхность раздела гетеродимера между sema-доменом семафорина и sema-доменом рецептора плексина может включать три мотива/последовательности/консенсусных мотива, включенных в sema-домен семафоринов. Как описано выше, sema-домен семафоринов содержит внутри своей структурной складки две экструзии, называемые экструзией 1 (между лезвием 1 и лезвием 2) и экструзией 2 (внутри лезвия 5). Три консенсусных мотива/последовательности/мотива, которые включены в поверхность раздела между семафорином и рецептором плексином, локализованы в семафорине 3А, В, С или D в:

i) экструзии 1, обозначенной в данном документе как мотив-1 (например, аминокислоты SEMA3A 104-113 в SEQ ID NO 2, соответствующие SEQ ID NO 25, аминокислоты SEMA3B 103-112 в SEQ ID NO 6, соответствующие SEQ ID NO 28, аминокислоты SEMA3C 102-111 в SEQ ID NO 10, соответствующие SEQ ID NO 31; аминокислоты SEMA3D 118-127 в SEQ ID NO 14, соответствующие SEQ ID NO 34);

ii) лезвии 3, обозначаемом в данном документе как мотив-2 (например, аминокислоты SEMA3A 214-221 в SEQ ID NO 2, соответствующие SEQ ID NO 26, аминокислоты SEMA3B 213-220 в SEQ ID NO 6, соответствующие SEQ ID NO 29; аминокислоты SEMA3C 211-218 в SEQ ID NO 10, соответствующие SEQ ID NO 32; аминокислоты SEMA3D 231-238 в SEQ ID NO 14, соответствующие SEQ ID NO 35); и

iii) лезвии 4, обозначаемом в данном документе как мотив-3 (например, аминокислоты SEMA3A 274-287 в SEQ ID NO 2, соответствующие SEQ ID NO 27; аминокислоты SEMA3B 274-287 в SEQ ID NO 6, соответствующие SEQ ID NO 30; аминокислоты SEMA3C 271-284 в SEQ ID NO 10, соответствующие SEQ ID NO 33; аминокислоты SEMA3D 291-304 в SEQ ID NO 14, соответствующие SEQ ID NO 36). Соответственно, sema-домен согласно данному изобретению может содержать мотив-1, мотив-2 и/или мотив-3.

Аминокислотная последовательность (экструзии 1/мотива-1), показанная в SEQ ID NO 25, 28, 31 или 34 (соответствующая аминокислотным последовательностям семафорина А, В, С или D, соответственно), соответствует аминокислотной последовательности CX₁X₂A₃GKD (где Х₁ представляет собой K или N; Х₂ представляет собой аминокислоту, выбранную среди W, М и L), где SEQ ID NO 25, 28, 31 или 34 не имеют N-концевого цистеина (С) и содержат другие аминокислоты на С-конце. Аминокислотная последовательность (экструзии 1/мотива-1), показанная в SEQ ID NO 25, 28, 31 или 34, содержится в описанном в данном документе мутантном семафорине 3, его функциональном фрагменте или в функциональном sema-домене согласно данному изобретению, где аланин в позиции, которая при сравнении гомологии соответствует позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, заменен гидрофильной аминокислотой. Таким образом, функциональный фрагмент мутантного семафорина 3 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO 25, 28, 31 и 34, где аланин в позиции, которая при сравнении гомологии соответствует позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, заменен гидрофильной аминокислотой. В предпочтительных воплощениях функциональный фрагмент мутантного семафорина 3А содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO 25, где аланин, соответствующий позиции 106 семафорина ЗА дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, заменен гидрофильной аминокислотой.

Аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO 53, SEQ ID NO 54, SEQ ID NO 55 или SEQ ID NO 56 (соответствующих аминокислотным последовательностям мутантного семафорина 3А, В, С или D, соответственно), соответствует SEQ ID NO 25, 28, 31 или 34 (мотив-1), соответственно, с той разницей, что аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO 53, SEQ ID NO 54, SEQ ID NO 55 или SEQ ID NO 56, имеет лизин в позиции, которая при сравнении гомологии соответствует позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2. Аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO 53, SEQ ID NO 54, SEQ ID NO 55 или SEQ ID NO 56, в данном документе упоминается как "мотив-1*". Описанный в данном документе мутантный семафорин 3, его функциональный фрагмент или функциональный sema-домен согласно данному изобретению содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO 53, SEQ ID NO 54, SEQ ID NO 55 и SEQ ID NO 56. В наиболее предпочтительных воплощениях функциональный фрагмент мутантного семафорина 3А согласно данному изобретению содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO 53.

Таким образом, описанный в данном документе функциональный фрагмент неприродного/искусственного/мутантного семафорина 3 содержит:

аминокислотную последовательность CX₁X₂A₃GKD, где X₁ представляет собой аминокислоту, которая представляет собой K или N, Х₂ представляет собой аминокислоту, выбранную среди W, М и L, и где аланин (А₃) заменен гидрофильной аминокислотой;

аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO 25, 28, 31 и 34, где аланин в позиции, которая при сравнении гомологии соответствует позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, заменен гидрофильной аминокислотой; или

аминокислотную последовательность SEQ ID NO 53, SEQ ID NO 54, SEQ ID NO 55 или SEQ ID NO 56,

и где функциональный фрагмент обладает свойствами/характеристиками мутантного семафорина 3А, В, С или D и не обладает свойствами/характеристиками семафорина 3Е, F или G.

Функциональный фрагмент мутантного семафорина 3 может также содержать аминокислотную последовательность мотива 1* (SEQ ID NO 53, SEQ ID NO 54, SEQ ID NO 55 или SEQ ID NO 56), аминокислотную последовательность мотива-2 (SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 29, SEQ ID NO 32 или SEQ ID NO 35) и/или аминокислотную последовательность мотива-3 (SEQ ID NO 27, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 33 или SEQ ID NO 36). Соответственно, мутантный семафорин 3 или функциональный фрагмент мутантного семафорина 3 согласно изобретению содержит дополнительно к аминокислотной последовательности CX₁X₂A₃GKD одну или более чем одну из следующих аминокислотных последовательностей, определенных в любой из SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 27, SEQ ID NO 29, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 32, SEQ ID NO 33, SEQ ID NO 35 или SEQ ID NO 36, где X₁ представляет собой аминокислоту, которая представляет собой K или N, Х₂ представляет собой аминокислоту, выбранную среди W, М и L, и где аланин (А₃) заменен гидрофильной аминокислотой, и где функциональный фрагмент должен иметь характеристики мутантного семафорина 3А, В, С или D. В данном документе понимается, что функциональный фрагмент мутантного семафорина 3 согласно данному изобретению не должен обладать характеристиками семафорина 3Е, F или G. В предпочтительных воплощениях функциональный фрагмент мутантного семафорина 3А дополнительно содержит дополнительно к аминокислотной последовательности CX₁X₂A₃GKD одну или более чем одну из следующих аминокислотных последовательностей, определенных в любой из SEQ ID NO 26 или SEQ ID NO 27, где X₁ представляет собой K, Х₂ представляет собой W, и где аланин (А₃) заменен гидрофильной аминокислотой, и где функциональный фрагмент должен иметь характеристики мутантного семафорина 3А.

PSI-домен стабилизирует структурную конформацию и/или структурную целостность функционального sema-домена, функционального фрагмента мутантного семафорина 3 или гибридного белка/полипептида. Функциональный фрагмент мутантного семафорина 3 может содержать фрагменты домена PSI до тех пор, пока фрагмент домена PSI обладает функцией стабилизации мутантного семафорина 3 или его функционального фрагмента или гибридного белка/полипептида, более предпочтительно функционального sema-домена. PSI-домен семафоринов 3А, В, С или D имеет общие консервативные аминокислотные последовательности, проиллюстрированные в консенсусных мотивах/последовательностях/мотивах SEQ ID NO 45, SEQ ID NO 46, SEQ ID NO 47 или SEQ ID NO 48, соответственно. Соответственно, домен PSI согласно данному изобретению содержит одну или более чем одну из следующих последовательностей: SEQ ID NO 45, SEQ ID NO 46, SEQ ID NO 47 или SEQ ID NO 48. Иллюстративная аминокислотная последовательность домена PSI человеческого семафорина 3А охватывает аминокислотные остатки с 517 по 567 в SEQ ID NO 2. Как показано в прилагаемых примерах и, следовательно, более предпочтительно, иллюстративная аминокислотная последовательность более короткого домена PSI, которая не имеет сайтов расщепления фуриновой протеазой, охватывает аминокислотные остатки с 517 по 548 в SEQ ID NO 2. Иллюстративные домены PSI приведены далее: иллюстративная аминокислотная последовательность домена PSI человеческого семафорина 3А охватывает аминокислотные остатки с 517 по 548 в SEQ ID NO 2, иллюстративная аминокислотная последовательность домена PSI человеческого семафорина 3В охватывает аминокислотные остатки с 516 по 547 в SEQ ID NO 6, иллюстративная аминокислотная последовательность домена PSI человеческого семафорина 3С охватывает аминокислотные остатки с 514 по 545 в SEQ ID NO 10, и иллюстративная аминокислотная последовательность домена PSI человеческого семафорина 3D охватывает аминокислотные остатки с 534 по 565 в SEQ ID NO 14.

Кроме того, предлагаемый в данном документе мутантный семафорин 3 или функциональный фрагмент мутантного семафорина 3 может содержать дополнительно к аминокислотной последовательности CX₁X₂A₃GKD одну или более чем одну из следующих аминокислотных последовательностей, определенных в любой из SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 27, SEQ ID NO 29, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 32, SEQ ID NO 33, SEQ ID NO 35, SEQ ID NO 36, SEQ ID NO 45, SEQ ID NO 46, SEQ ID NO 47 или SEQ ID NO 48, где Х₁ представляет собой аминокислоту, которая представляет собой K или N, Х₂ представляет собой аминокислоту, выбранную среди W, М и L, и где аланин (А₃) заменен гидрофильной аминокислотой, и где функциональный фрагмент должен иметь характеристики мутантного семафорина 3А, В, С или D. В данном документе понимается, что функциональный фрагмент мутантного семафорина 3 согласно данному изобретению не должен обладать характеристиками семафорина 3Е, F или G. В предпочтительных воплощениях мутантный семафорин 3 или функциональный фрагмент мутантного семафорина 3А содержит дополнительно к аминокислотной последовательности CX₁X₂A₃GKD одну или более чем одну из следующих аминокислотных последовательностей, определенных в любой из SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 27 или SEQ ID NO 45, где X₁ представляет собой K, Х₂ представляет собой W, и где аланин (А₃) заменен гидрофильной аминокислотой, и где функциональный фрагмент должен иметь характеристики мутантного семафорина 3А. В данном документе понимается, что приведенные выше аминокислотные последовательности, в частности SEQ ID NO 53, SEQ ID NO 54, SEQ ID NO 55 или SEQ ID NO 56, могут рассматриваться в контексте аминокислотной последовательности природных белков семафоринов 3. Также в данном документе предусматривается, что эти аминокислотные последовательности могут быть связаны с искусственными аминокислотными линкерами, например, серин-глициновыми линкерами. Длина функциональных фрагментов мутантных белков семафоринов 3 не ограничена до тех пор, пока функциональные фрагменты согласно данному изобретению функционируют, например, в качестве ингибитора ангиогенеза и/или в качестве агента, нормализующего сосудистую сеть, как описано выше для мутантного семафорина 3, его функционального фрагмента, гибридного белка, содержащего функциональный фрагмент или функциональный sema-домен. В данном документе предполагается, что такие функциональные фрагменты могут иметь длину, например, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 200, 250, 300, 400, 500 или 600 аминокислот. Предпочтительно такие фрагменты имеют длину приблизительно от 400 до 500 аминокислот. Предпочтительно такие фрагменты имеют длину приблизительно от 300 до 400 аминокислот. Предпочтительно такие фрагменты имеют длину приблизительно от 100 до 300 аминокислот. В соответствии с этим предполагается, что аминокислотная последовательность предусмотренных в данном документе функциональных фрагментов неприродных/искусственных/мутантных белков семафоринов 3 может быть усечена на N-конце, С-конце и/или в середине аминокислотной последовательности. Предполагается, что, например, может быть удалено 10, 20, 30, 40 или 50 аминокислот. Эти делеции/модификации не отходят от объема данного изобретения до тех пор, пока функциональный фрагмент обладает характеристиками мутантного семафорина 3А, В, С или D. Кроме того, эти делеции/модификации не ограничены до тех пор, пока предусмотренный в данном документе функциональный фрагмент или гибридный белок/полипептид, содержащий предусмотренный в данном документе функциональный фрагмент, который содержит гидрофильную аминокислоту вместо аланина в позиции, которая при сравнении гомологии соответствует позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, имеет функцию/активность, определенную в данном документе выше, например, в качестве ингибитора ангиогенеза и/или в качестве агента, нормализующего сосудистую сеть, мутантного семафорина 3, его функционального фрагмента, гибридного белка, включающего функциональный фрагмент или функциональный sema-домен.

В наиболее предпочтительных воплощениях функциональный фрагмент мутантного семафорина 3 согласно данному изобретению содержит функциональный sema-домен, где указанный sema-домен содержит гидрофильную аминокислоту в позиции, которая при сравнении гомологии соответствует позиции 106 семафорина дикого типа 3А, показанного в SEQ ID NO 2.

Другими словами, мутантный семафорин 3 согласно данному изобретению может содержать функциональный sema-домен, где указанный sema-домен содержит гидрофильную аминокислоту в позиции, которая при сравнении гомологии соответствует позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2. Функциональный sema-домен согласно данному изобретению содержит аминокислотную последовательность, описанную в мотиве-1*, или содержит аминокислотную последовательность CX₁X₂A₃GKD, где X₁ представляет собой аминокислоту, которая представляет собой K или N, Х₂ представляет собой аминокислоту, выбранную среди W, М и L, и где аланин (А₃) замещен гидрофильной аминокислотой, и где указанный sema-домен должен иметь характеристики мутантного семафорина 3А, В, С или D. В данном документе понимается, что описанный в данном документе функциональный sema-домен мутантного семафорина 3 не должен обладать характеристиками семафорина 3Е, F или G. Кроме того, функциональный sema-домен согласно данному изобретению может дополнительно к аминокислотной последовательности мотива-1* (SEQ ID NO 53, SEQ ID NO 54, SEQ ID NO 55 и SEQ ID NO 56) содержать аминокислотную последовательность мотива-2 (SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 29, SEQ ID NO 32 или SEQ ID NO 35) и/или аминокислотную последовательность мотива-3 (SEQ ID NO 27, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 33, SEQ ID NO 36, SEQ ID NO 45, SEQ ID NO 46, SEQ ID NO 47 или SEQ ID NO 48). Кроме того, функциональный sema-домен может содержать по меньшей мере одну дополнительную мутацию, выбранную из группы, состоящей из аминокислотной замены (замен), добавления(-й), делеции(-й), инверсии(-й) и дупликации(-й). Кроме того, функциональный sema-домен может содержать дополнительную аминокислотную делецию (делеции). В данном документе предусматривается, что аминокислотная последовательность функционального sema-домена может быть усечена на N-конце, С-конце и/или в середине аминокислотной последовательности. В данном документе предусматривается, что, например, может быть удалено 10, 20, 30, 40, 50 или 100 аминокислот. Эти делеции/модификации не отходят от объема данного изобретения до тех пор, пока функциональный sema-домен обладает характеристиками мутантного семафорина 3А, В, С или D, определенными в данном документе выше. Кроме того, эти делеции/модификации не ограничены до тех пор, пока предусмотренный в данном документе функциональный sema-домен или предусмотренный в данном документе гибридный белок, содержащий указанный sema-домен, который содержит гидрофильную аминокислоту на месте аланина в позиции, которая при сравнении гомологии соответствует позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, имеет функцию/активность, определенную в данном документе выше, например, в качестве ингибитора ангиогенеза и/или в качестве агента, нормализующего сосудистую сеть, мутантного семафорина 3 или его функционального фрагмента или гибридного белка, включающего функциональный фрагмент или функциональный sema-домен. В данном документе понимается, что функциональный sema-домен взаимодействует с другим функциональным sema-доменом семафоринов и рецептором плексином. Это может происходить посредством открытых областей различных поверхностей sema-домена. Без ограничения конкретной теорией предполагается, что sema-домен демонстрирует по меньшей мере две различные области на своей поверхности. Первой является область, которая поддерживает его связывание с другим sema-доменом семафорина, а вторая область вовлечена в его связывание с рецептором плексином.

Иллюстративная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая функциональный sema-домен или функциональный фрагмент мутантного семафорина 3 согласно данному изобретению, может содержать:

нуклеотиды с 601 по 1206 в SEQ ID NO 1, где нуклеотиды GCT в позиции с 631 по 633 в SEQ ID NO 1 заменены нуклеотидами, кодирующими гидрофильную аминокислоту;

нуклеотиды с 529 по 1137 в SEQ ID NO 5, где нуклеотиды GCA в позиции с 559 по 561 в SEQ ID NO 5 заменены нуклеотидами, кодирующими гидрофильную аминокислоту;

нуклеотиды с 842 по 1444 в SEQ ID NO 9, где нуклеотиды GCT в позиции с 872 по 874 в SEQ ID NO 9 заменены нуклеотидами, кодирующими гидрофильную аминокислоту; или

нуклеотиды с 368 по 982 в SEQ ID NO 13, где нуклеотиды GCC в позиции с 398 по 400 в SEQ ID NO 13 заменены нуклеотидами, кодирующими гидрофильную аминокислоту.

SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 9 или SEQ ID NO 13 представляет собой полноразмерную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую человеческий семафорин дикого типа 3А, В, С или D, соответственно.

В предпочтительных воплощениях молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая функциональный sema-домен или функциональный фрагмент мутантного семафорина ЗА согласно данному изобретению, содержит нуклеотиды с 601 по 1206 в SEQ ID NO 1, где нуклеотиды GCT в позиции с 631 по 633 в SEQ ID NO 1 заменены нуклеотидами, кодирующими гидрофильную аминокислоту.

Также иллюстративная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая функциональный sema-домен или функциональный фрагмент мутантного семафорина 3 согласно данному изобретению, может содержать нуклеотиды с 601 по 1206 в SEQ ID NO 57; нуклеотиды с 529 по 1137 в SEQ ID NO 61; нуклеотиды с 842 по 1444 в SEQ ID NO 65; или нуклеотиды с 368 по 982 в SEQ ID NO 69. SEQ ID NO 57, 61, 65 или 65 содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую мутантный семафорин 3А, В, С или D, соответственно, где лизин находится в позиции, которая при сравнении гомологии соответствует позиции 106 семафорина дикого типа 3А, показанного в SEQ ID NO 2. В предпочтительных воплощениях молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая функциональный sema-домен или функциональный фрагмент мутантного семафорина 3А согласно данному изобретению, содержит нуклеотиды с 601 по 1206 в SEQ ID NO 57.

Кроме того, иллюстративный полипептид содержит функциональный фрагмент мутантного семафорина 3, где функциональный фрагмент содержит или является функциональным sema-доменом мутантного семафорина 3 согласно данному изобретению, как показано в:

Другими словами, мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент содержит или является функциональным доменом мутантного семафорина 3 согласно данному изобретению, как показано в:

SEQ ID NO 21, где остаток аланина, соответствующий позиции 106 в SEQ ID NO 2, заменен гидрофильной аминокислотой;

SEQ ID NO 22, где остаток аланина, соответствующий позиции 105 в SEQ ID NO 6, заменен гидрофильной аминокислотой;

SEQ ID NO 23, где остаток аланина, соответствующий позиции 104 в SEQ ID NO 10, заменен гидрофильной аминокислотой; или

SEQ ID NO 24, где остаток аланина, соответствующий позиции 120 в SEQ ID NO 14, заменен гидрофильной аминокислотой.

В предпочтительных воплощениях аминокислотная последовательность функционального sema-домена или функционального фрагмента мутантного семафорина 3А согласно данному изобретению содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO 21, где остаток аланина, соответствующий позиции 106 в SEQ ID NO 2, заменен гидрофильной аминокислотой.

SEQ ID NO 49, 50, 51 или 52 содержит аминокислотную последовательность иллюстративного функционального sema-домена или иллюстративного функционального фрагмента мутантного семафорина 3А, В, С или D, соответственно, где аланин заменен лизином в позиции, которая при сравнении гомологии соответствует позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2. Таким образом, иллюстративная аминокислотная последовательность функционального sema-домена или функционального фрагмента мутантного семафорина 3 согласно данному изобретению может содержать аминокислотную последовательность, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO 49, SEQ ID NO 50, SEQ ID NO 51 и SEQ ID NO 52. В предпочтительных воплощениях аминокислотная последовательность функционального sema-домена или функционального фрагмента мутантного семафорина 3А согласно данному изобретению содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO 49. В данном документе также предусмотрены фрагменты функционального sema-домена. Например, sema-домен может также содержать укороченные версии описанных в данном документе иллюстративных sema-доменов.

Следующее ниже описание относится к наиболее предпочтительному воплощению изобретения, гибридному белку/полипептиду. В наиболее предпочтительных воплощениях полипептид согласно данному изобретению представляет собой гибридный белок. Гибридный белок содержит неприродный/искусственный/мутантный белок семафорин 3,

неприродный/искусственный/мутантный функциональный фрагмент семафорина 3, неприродный/искусственный/мутантный функциональный sema-домен семафорина 3, домен-стабилизатор и/или домен димеризации. Любой из описанных выше функциональных фрагментов мутантного семафорина 3 может быть включен в гибридный белок, где функциональные фрагменты имеют характеристики/свойства мутантного семафорина 3А, В, С или D, но не семафорина 3Е, F или G Другими словами, гибридный белок может содержать мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент согласно данному изобретению.

Соответственно, гибридный белок согласно данному изобретению содержит мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент, где мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO 25, 28, 31 и 34, где аланин в позиции, которая при сравнении гомологии соответствует позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, заменен гидрофильной аминокислотой. Возможно, гибридный белок согласно данному изобретению содержит мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент, где мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент содержит аминокислотную последовательность CX₁X₂A₃GKD, где X₁ представляет собой аминокислоту, которая представляет собой K или N, Х₂ представляет собой аминокислоту, выбранную среди W, М и L, и где аланин (А₃) заменен гидрофильной аминокислотой. Возможно, гибридный белок согласно данному изобретению содержит мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент, где мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO 53, SEQ ID NO 54, SEQ ID NO 55 и SEQ ID NO 56.

В предпочтительных воплощениях гибридный белок согласно данному изобретению содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO 25, где аланин, соответствующий позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, заменен гидрофильной аминокислотой. Возможно, в предпочтительных воплощениях гибридный белок согласно данному изобретению содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO 53.

Кроме того, гибридный белок согласно данному изобретению содержит мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент, где мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент дополнительно к аминокислотной последовательности CX₁X₂A₃GKD содержит одну или более чем одну или более чем одну из следующих аминокислотных последовательностей, определенных в любой из SEQ ID N0 26, SEQ ID NO 27, SEQ ID NO 29, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 32, SEQ ID NO 33, SEQ ID NO 35 или SEQ ID NO 36, где X₁ представляет собой аминокислоту, которая представляет собой K или N, Х₂ представляет собой аминокислоту, выбранную среди W, М и L, и где аланин (А₃) заменен гидрофильной аминокислотой, и где функциональный фрагмент должен иметь характеристики мутантного семафорина 3А, В, С или D. В данном документе понимается, что функциональный фрагмент мутантного семафорина 3 согласно данному изобретению не должен обладать характеристиками семафорина 3Е, F или G. В предпочтительных воплощениях гибридный белок согласно данному изобретению включает мутантный семафорин 3А или его функциональный фрагмент, где мутантный семафорин 3А или его функциональный фрагмент дополнительно к аминокислотной последовательности CX₁X₂A₃GKD содержит одну или более чем одну или более чем одну из следующих аминокислотных последовательностей, определенных в SEQ ID NO 26 или SEQ ID NO 27, где Х₁ представляет собой K, Х₂ представляет собой W, и где аланин (А₃) заменен гидрофильной аминокислотой, и где функциональный фрагмент должен иметь характеристики мутантного семафорина 3А.

Кроме того, гибридный белок согласно данному изобретению содержит мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент, где мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент дополнительно к аминокислотной последовательности CX₁X₂A₃GKD содержит одну или более чем одну или более чем одну из следующих аминокислотных последовательностей, определенных в любой из SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 27, SEQ ID NO 29, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 32, SEQ ID NO 33, SEQ ID NO 35, SEQ ID NO 36, SEQ ID NO 45, SEQ ID NO 46, SEQ ID NO 47 и SEQ ID NO 48, где X₁ представляет собой аминокислоту, которая представляет собой K или N, Х₂ представляет собой аминокислоту, выбранную среди W, М и L, и где аланин (А₃) заменен гидрофильной аминокислотой, и где функциональный фрагмент должен иметь характеристики мутантного семафорина 3А, В, С или D. В данном документе понимается, что функциональный фрагмент мутантного семафорина 3 согласно данному изобретению не должен обладать характеристиками семафорина 3Е, F или G. В предпочтительных воплощениях гибридный белок изобретения содержит мутантный семафорин 3А или его функциональный фрагмент, где мутантный семафорин 3А или его функциональный фрагмент дополнительно к аминокислотной последовательности CX₁X₂A₃GKD содержит одну или более чем одну или более чем одну из следующих аминокислотных последовательностей, определенных в любой из SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 27 или SEQ ID NO 45, где X₁ представляет собой K, X₂ представляет собой W, и где аланин (А₃) заменен гидрофильной аминокислотой, и где функциональный фрагмент должен иметь характеристики мутантного семафорина 3А.

В наиболее предпочтительных воплощениях данное изобретение относится к гибридному белку, содержащему функциональный sema-домен, где в функциональном sema-домене мутантного семафорина 3 аланин, соответствующий позиции 106 семафорина 3А дикого типа SEQ ID NO 2, заменен гидрофильной аминокислотой, или где аланин, соответствующий указанному аланину 106 в семафорине 3В, 3С или 3D, заменен гидрофильной аминокислотой. Другими словами, гибридный белок согласно данному изобретению включает функциональный фрагмент мутантного семафорина 3, где указанный функциональный фрагмент содержит функциональный sema-домен, где sema-домен содержит гидрофильную аминокислоту в позиции, которая при сравнении гомологии соответствует позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2. Другими словами, гибридный белок согласно данному изобретению содержит функциональный sema-домен, где sema-домен содержит гидрофильную аминокислоту в позиции, которая при сравнении гомологии соответствует позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2.

Функциональный sema-домен, содержащийся в гибридном белке согласно данному изобретению, содержит аминокислотную последовательность, показанную в мотиве-1* (SEQ ID NO 53, SEQ ID NO 54, SEQ ID NO 55 и SEQ ID NO 56), либо функциональный sema-домен, содержащийся в гибридном белке согласно данному изобретению, содержит аминокислотную последовательность CX₁X₂A₃GKD, где Х₁ представляет собой аминокислоту, которая представляет собой K или N, Х₂ представляет собой аминокислоту, выбранную среди W, М и L, и где аланин (А₃) заменен гидрофильной аминокислотой, и где функциональный sema-домен должен обладать характеристиками семафорина 3А, В, С или D. В данном документе понимается, что функциональный sema-домен мутантного семафорина 3, содержащийся в гибридном белке согласно данному изобретению, не должен обладать характеристиками семафорина 3Е, F или G, но должен обладать характеристиками мутантного семафорина 3А, В, С или D. Кроме того, гибридный белок, содержащий функциональный sema-домен согласно данному изобретению, может дополнительно к аминокислотной последовательности мотива 1* (SEQ ID NO 53, SEQ ID NO 54, SEQ ID NO 55 и SEQ ID NO 56) содержать аминокислотную последовательность мотива-2 (SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 29, SEQ ID NO 32 или SEQ ID NO 35) и/или аминокислотную последовательность мотива-3 (SEQ ID NO 27, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 33 или SEQ ID NO 36). Кроме того, функциональный sema-домен или функциональный фрагмент мутантного семафорина 3, содержащийся в гибридном белке, может содержать по меньшей мере одну дополнительную мутацию, выбранную из группы, состоящей из аминокислотной замены (замен), добавления(-й), делеции(-й), инверсии(-й) и дупликации(-й). В данном документе предполагается, что аминокислотная последовательность функционального sema-домена или функционального фрагмента мутантного семафорина 3, содержащегося в гибридном белке, может быть усечена на N-конце, С-конце и/или в середине аминокислотной последовательности. Предусмотрено, например, что могут быть удалены 10, 20, 30, 40, 50 или 100 аминокислот. Эти делеции/модификации не отходят от объема изобретения до тех пор, пока функциональный фрагмент или функциональный sema-домен имеет характеристики мутантного семафорина 3А, В, С или D. Кроме того, эти делеции/модификации не ограничены до тех пор, пока гибридный белок, содержащий функциональный sema-домен или функциональный фрагмент мутантного семафорина 3, демонстрирует описанную выше определенную функцию/активность гибридного белка/полипептида, содержащего указанные

неприродные/искусственные/мутантные белки семафорины 3 или указанные неприродные/искусственные/мутантные функциональные фрагменты или функциональные sema-домены указанных белков семафоринов 3, например, в качестве ингибитора ангиогенеза и/или в качестве агента, нормализующего сосудистую сеть. Гибридный белок может также содержать короткую изоформу мутантного семафорина 3.

Иллюстративная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая функциональный sema-домен или функциональный фрагмент мутантного семафорина 3, который может быть включен в гибридный белок, приведена далее:

нуклеотиды с 601 по 1206 в SEQ ID NO 1, где нуклеотиды GCT в позиции с 631 по 633 в SEQ ID NO 1 заменены нуклеотидами, кодирующими гидрофильную аминокислоту;

нуклеотиды с 529 по 1137 в SEQ ID NO 5, где нуклеотиды GCA в позиции с 559 по 561 в SEQ ID NO 5 заменены нуклеотидами, кодирующими гидрофильную аминокислоту;

нуклеотиды с 842 по 1444 в SEQ ID NO 9, где нуклеотиды GCT в позиции с 872 по 874 в SEQ ID NO 9 заменены нуклеотидами, кодирующими гидрофильную аминокислоту; или нуклеотиды с 368 по 982 в SEQ ID NO 13, где нуклеотиды GCC в позиции с 398 по 400 в SEQ ID NO 13 заменены нуклеотидами, кодирующими гидрофильную аминокислоту.

В предпочтительных воплощениях гибридный белок содержит функциональный sema-домен согласно данному изобретению, где sema-домен закодирован молекулой нуклеиновой кислоты, которая содержит нуклеотиды с 601 по 1206 в SEQ ID NO 1, где нуклеотиды GCT в позиции с 631 по 633 в SEQ ID NO 1 заменены нуклеотидами, кодирующими гидрофильную аминокислоту.

Иллюстративная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая функциональный sema-домен или функциональный фрагмент мутантного семафорина 3, содержащийся в гибридном белке, может содержать нуклеотиды с 601 по 1206 из SEQ ID NO 57; нуклеотиды с 529 по 1137 из SEQ ID NO 61; нуклеотиды с 842 по 1444 из SEQ ID NO 65; или нуклеотиды с 368 по 982 из SEQ ID NO 69. SEQ ID NO 57, 61, 65 или 65 содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полноразмерный мутантный семафорин 3А, В, С или D, соответственно, где лизин находится в позиции, которая при сравнении гомологии соответствует позиции 106 семафорина дикого типа 3А, показанного в SEQ ID NO 2. В предпочтительных воплощениях молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая функциональный sema-домен мутантного семафорина 3А, содержащийся в гибридном белке, содержит нуклеотиды с 601 по 1206 в SEQ ID NO 57.

Кроме того, иллюстративный гибридный белок/полипептид может содержать функциональный фрагмент мутантного семафорина 3, где функциональный фрагмент содержит или представляет собой функциональный sema-домен мутантного семафорина 3 определенный в:

SEQ ID NO 21, где остаток аланина, соответствующий позиции 106 в SEQ ID NO 2, заменен гидрофильной аминокислотой;

SEQ ID NO 22, где остаток аланина, соответствующий позиции 105 в SEQ ID NO 6, заменен гидрофильной аминокислотой;

SEQ ID NO 23 где остаток аланина, соответствующий позиции 104 в SEQ ID NO 10, заменен гидрофильной аминокислотой; или

SEQ ID NO 24, где остаток аланина, соответствующий позиции 120 в SEQ ID NO 14, заменен гидрофильной аминокислотой.

В предпочтительных воплощениях аминокислотная последовательность функционального sema-домена мутантного семафорина 3А, содержащегося в гибридном белке, содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO 21, где остаток аланина, соответствующий позиции 106 в SEQ ID NO 2, заменен гидрофильной аминокислотой.

SEQ ID NO 49, 50, 51 и 52 содержат аминокислотные последовательности иллюстративных функциональных sema-доменов или функциональных фрагментов мутантного семафорина 3А, В, С и D, соответственно, которые могут содержаться в гибридном белке, где аланин заменен лизином в позиции, которая при сравнении гомологии соответствует позиции 106 семафорина дикого типа 3А, показанного в SEQ ID NO 2. Таким образом, иллюстративный гибридный белок может содержать функциональный фрагмент мутантного семафорина 3, где функциональный фрагмент содержит или представляет собой sema-домен, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO 49, SEQ ID NO 50, SEQ ID NO 51 и SEQ ID NO 52. В предпочтительных воплощениях аминокислотная последовательность функционального sema-домена мутантного семафорина 3А, содержащегося в гибридном белке, содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO 49.

В предпочтительных воплощениях гибридный белок содержит в дополнение к мутантному семафорину 3 или его функциональному фрагменту стабилизирующий домен. Указанный стабилизирующий домен стабилизирует структурную конформацию и/или структурную целостность

неприродного/искусственного/мутантного белка семафорина 3, предусмотренного в данном документе функционального фрагмента

неприродного/искусственного/мутантного белка семафорина 3 или предусмотренного в данном документе функционального sema-домена. Определенный в данном документе выше, такой стабилизирующий домен может быть PSI-доменом или его фрагментами. Таким образом, гибридный белок, содержащий мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент, может быть стабилизирован PSI-доменом. Стабилизирующий домен может быть PSI-доменом или его фрагментом, где указанный PSI-домен может содержать один из следующих мотивов консенсусных последовательностей SEQ ID NO 45, SEQ ID NO 46, SEQ ID NO 47 или SEQ ID NO 48. Иллюстративная аминокислотная последовательность PSI-домена человеческого семафорина 3А простирается от аминокислотного остатка 517 до 567 в SEQ ID NO 2. Как показано в прилагаемых примерах и таким образом является более предпочтительным, иллюстративная аминокислотная последовательность PSI-домена простирается от аминокислотного остатка 517 до 548 в SEQ ID NO 2. Иллюстративные PSI-домены, которые могут содержаться в гибридном белке, приведены далее: иллюстративная аминокислотная последовательность PSI-домена человеческого семафорина 3А простирается от аминокислотного остатка 517 до 548 в SEQ ID NO 2, иллюстративная аминокислотная последовательность PSI-домена человеческого семафорина 3В простирается от аминокислотного остатка 516 до 547 в SEQ ID NO 6, иллюстративная аминокислотная последовательность PSI-домена человеческого семафорина 3С простирается от аминокислотного остатка 514 до 545 в SEQ ID NO 10, и иллюстративная аминокислотная последовательность PSI-домена человеческого семафорина 3D простирается от аминокислотного остатка 534 до 565 в SEQ ID NO 14.

В предпочтительных воплощениях гибридный белок может содержать мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент, где функциональный фрагмент содержит sema-домен и PSI-домен. Таким образом, иллюстративный гибридный белок может содержать мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент, где его функциональный фрагмент содержит аминокислотную последовательность:

которая простирается от аминокислотного остатка 1 до 548 в SEQ ID NO 2, где остаток аланина в позиции 106 в SEQ ID NO 2 заменен гидрофильной аминокислотой;

которая простирается от аминокислотного остатка 1 до 547 в SEQ ID NO 6, где остаток аланина в позиции 105 в SEQ ID NO 6 заменен гидрофильной аминокислотой;

которая простирается от аминокислотного остатка 1 до 565 в SEQ ID NO 10, где остаток аланина в позиции 104 в SEQ ID NO 10 заменен гидрофильной аминокислотой; или

которая простирается от аминокислотного остатка 1 до 545 в SEQ ID NO 14, где остаток аланина в позиции 120 в SEQ ID NO 14 заменен гидрофильной аминокислотой. В предпочтительных воплощениях функциональный фрагмент мутантного семафорина 3А, содержащийся в гибридном белке, содержит полипептид, который простирается от аминокислотного остатка 1 до 548 в SEQ ID NO 2, где остаток аланина в позиции 106 в SEQ ID NO 2 заменен гидрофильной аминокислотой.

Другими словами, гибридный белок может содержать мутантный семафорин 3, содержащий sema-домен и PSI-домен. Таким образом, иллюстративный гибридный белок может содержать мутантный семафорин 3, содержащий аминокислотную последовательность:

которая простирается от аминокислотного остатка 1 до 548 в SEQ ID NO 2, где остаток аланина в позиции 106 в SEQ ID NO 2 заменен гидрофильной аминокислотой;

которая простирается от аминокислотного остатка 1 до 547 в SEQ ID NO 6, где остаток аланина в позиции 105 в SEQ ID NO 6 заменен гидрофильной аминокислотой;

которая простирается от аминокислотного остатка 1 до 565 в SEQ ID NO 10, где остаток аланина в позиции 104 в SEQ ID NO 10 заменен гидрофильной аминокислотой; или

которая простирается от аминокислотного остатка 1 до 545 в SEQ ID NO 14, где остаток аланина в позиции 120 в SEQ ID NO 14 заменен гидрофильной аминокислотой.

Как указано в прилагаемых примерах и как объяснялось выше, димеризация мутантных белков семафоринов 3 увеличивает ингибирующий эффект на миграцию ЕС. Следовательно, мутантные белки семафорины 3 согласно данному изобретению предпочтительно находятся в форме димера. Функциональный sema-домен мутантных белков семафоринов 3 может быть ответственен за димеризацию и связывание с рецепторами плексинами. Связывание семафорина 3 с его рецептором плексином приводит к активации цитоплазматической области рецептора плексина, что приводит к активной последующей передаче сигналов. Без ограничения конкретной теорией предполагается, что рецепторы плексины активируются путем индуцированной семафорином димеризации. Следовательно, в наиболее предпочтительных воплощениях согласно данному изобретению предусмотренный в данном документе мутантный семафорин 3 или функциональный sema-домен или функциональный фрагмент мутантного семафорина 3 находится в форме димера с другим предусмотренным в данном документе мутантным семафорином 3 или функциональным sema-доменом или функциональным фрагментом мутантного семафорина 3. Димеризация неприродных/искусственных/мутантных белков семафоринов 3 или предусмотренных в данном документе функциональных фрагментов неприродных/искусственных/мутантных белков семафоринов 3, которые содержатся в гибридном белке, может быть индуцирована указанными функциональными фрагментами, например, самим функциональным sema-доменом, и/или может быть индуцирована/усилена доменом димеризации.

В наиболее предпочтительных воплощениях гибридный белок содержит домен димеризации в дополнение к мутантному семафорину 3, функциональному фрагменту мутантного семафорина 3 и/или стабилизирующему домену. Другими словами, гибридный белок содержит в дополнение к мутантному семафорину 3 или его функциональному фрагменту стабилизирующий домен, который стабилизирует структурную целостность молекулы, и/или домен димеризации, который индуцирует образование гомо- или гетеродимеров. Другими словами, гибридный белок может содержать стабилизирующий домен и/или домен димеризации. "Домен димеризации" относится к домену, который индуцирует/способствует пространственной близости неприродных/искусственных/мутантных белков семафоринов 3, предусмотренных в данном документе функциональных фрагментов неприродных/искусственных/мутантных белков семафоринов 3 или предусмотренных в данном документе функциональных sema-доменов. В данном документе понимается, что "димер" представляет собой олигомер, состоящий из двух структурно аналогичных мономеров, соединенных связями, которые могут быть либо слабыми, либо сильными, т.е. межмолекулярными или ковалентными. Два мономера, которые формируют димер, могут содержаться в одном и том же гибридном белке или в двух гибридных белках. Домен димеризации может быть любым доменом димеризации до тех пор, пока два домена димеризации имеют константу диссоциации KD друг с другом в диапазоне от 10^-5 М до 10^-6 М. Аффинность связывания двух sema-доменов семафорина 3 находится в диапазоне от 10^-5 М до 10^-6 М (Antipenko et al., 2003). Домен димеризации может быть выбран из группы С-концевого константного домена IgG, сконструированный белок с анкириновым повтором (DARPin, от англ. - designed ankyrin repeat protein) и лейциновой застежки. В предпочтительном воплощении домен димеризации является константным доменом IgG. В еще более предпочтительном воплощении домен димеризации представляет собой домен IgG1 или IgG3. В еще более предпочтительном воплощении домен димеризации представляет собой IgG1. Такие иллюстративные аминокислотные последовательности и кодирующие последовательности нуклеиновых кислот человеческого IgG1 приведены в SEQ ID NO 37, 38 и 41. В наиболее предпочтительном воплощении константный фрагмент домена IgG1 используют в качестве домена димеризации, включающего аминокислотную последовательность, охватывающую позиции с 104 по 330. Такая иллюстративная аминокислотная последовательность изображена в SEQ ID NO 41. Также можно использовать константный фрагмент мышиного IgG1, соответствующий аминокислотной последовательности и последовательности нуклеиновой кислоты, изображенным в SEQ ID NO 39, 40 и 42. Силу аффинности, с которой, например, лейциновая застежка и/или константные домены, такие как СН3-или Fc-фрагменты иммуноглобулина, гетеро- и гомодимеризуются, оценивают как константу диссоциации K_D в диапазоне примерно от 10^-5 М до 10^-6 М. Константу диссоциации димера sema-доменов оценивали в диапазоне от 10^-5 М до 10^-6 М (Antipenko et al., 2003). Как правило, K_D, упомянутые в данном документе, (i) применимы к, (ii) являются значениями при или (iii) должны быть измерены при температуре от 4 до 38°С, предпочтительно при температуре от 4 до 20°С (например, 10°С) или от 20 до 38°С (например, 30°С) и/или при значениях рН от 4,5 до 8 (например, рН 7). Как показано в прилагаемых примерах, домены димеризации, например, домен IgG1, могут быть стабилизированы дисульфидными мостиками. Два мономера доменов димеризации, например, доменов IgG1, могут быть стабилизированы дисульфидными мостиками внутри димера.

В наиболее предпочтительных воплощениях

неприродные/искусственные/мутантные белки семафорины 3 или их функциональные фрагменты или гибридные белки, содержащие указанный белок (белки) семафорин 3 или указанный его функциональный фрагмент(ы), образуют гомо- или гетеродимеры друг с другом. Термин "гомодимер" означает, что два идентичных мономера находятся в форме димера. Термин "гетеродимер" означает, что два разных мономера находятся в форме димера.

В некоторых аспектах два мономера, образующих димер, могут содержаться в одном гибридном белке. В данном документе предусматривается, что два неприродных/искусственных/мутантных белка семафорина 3, два предусмотренных в данном документе функциональных фрагмента

неприродных/искусственных/мутантных белков семафоринов 3 или два предусмотренных в данном документе функциональных sema-домена могут содержаться в одном гибридном белке. В других аспектах белок дикого типа вместе с неприродным/искусственным/мутантным белком семафорином 3, предусмотренным в данном документе функциональным фрагментом неприродного/искусственного/мутантного семафорина 3 или предусмотренным в данном документе функциональным sema-доменом также может формировать димер. Таким образом, семафорин 3 дикого типа или его фрагмент могут быть объединены с неприродным/искусственным/мутантным белком семафорином 3, предусмотренным в данном документе функциональным фрагментом неприродного/искусственного/мутантного белка семафорина 3 или предусмотренным в данном документе функциональным sema-доменом в одном гибридном белке, где гибридный белок обладает характеристиками мутантного семафорина 3А, В, С или D. В данном документе понимается, что термин "первый полипептид" относится к первому мономеру в димере. Термин "второй полипептид" относится ко второму мономеру в димере. В определенных аспектах гибридный белок может содержать два неприродных/искусственных/мутантных белка семафорина 3, два предусмотренных в данном документе функциональных фрагмента неприродного/искусственного/мутантного белка(-ов) семафорина 3 или два предусмотренных в данном документе функциональных sema-домена, два стабилизирующих домена и/или один или два домена димеризации. Гибридный белок может содержать мутантный семафорин 3, его функциональный фрагмент, функциональные sema-домены и/или описанные в данном документе полипептиды согласно данному изобретению в любой комбинации, где гибридный белок обладает характеристиками мутантного семафорина 3А, В, С или D. В следующих аспектах приведены примеры таких комбинаций:

В некоторых аспектах гибридный белок согласно данному изобретению содержит первый полипептид, содержащий мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент, который функционирует как ингибитор ангиогенеза, где аланин, соответствующий позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, или аланин в позиции, которая при сравнении гомологии в других белках семафоринах 3 соответствует позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, заменен гидрофильной аминокислотой, и второй полипептид, содержащий семафорин 3 или его функциональный фрагмент, который функционирует как ингибитор ангиогенеза, где указанные белки семафорины 3 выбраны из группы семафорина 3А, семафорина 3В, семафорина 3С и семафорина 3D.

В некоторых аспектах гибридный белок согласно данному изобретению содержит первый полипептид, содержащий мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент, который функционирует как ингибитор ангиогенеза, где аланин, соответствующий позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, или аланин в позиции, которая при сравнении гомологии в других белках семафоринах 3 соответствует позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, заменен гидрофильной аминокислотой, и второй полипептид, содержащий мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент, который функционирует как ингибитор ангиогенеза, где аланин, соответствующий позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, или аланин в позиции, которая при сравнении гомологии в других белках семафоринах 3 соответствует позиции 106 семафорин 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, заменен гидрофильной аминокислотой, где указанные белки семафорины 3 выбраны из группы семафорина 3А, семафорина 3В, семафорина 3С и семафорина 3D.

В некоторых аспектах гибридный белок согласно данному изобретению содержит первый полипептид, содержащий мутантный семафорин 3А или его функциональный фрагмент, который функционирует как ингибитор ангиогенеза, где аланин, соответствующий позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, заменен гидрофильной аминокислотой, и второй полипептид, содержащий семафорин 3 или его функциональный фрагмент, который функционирует как ингибитор ангиогенеза, где указанный белок семафорин 3 выбран из группы семафорина 3А, семафорина 3В, семафорина 3С и семафорина 3D.

В некоторых аспектах гибридный белок согласно данному изобретению содержит первый полипептид, содержащий мутантный семафорин 3А или его функциональный фрагмент, который функционирует как ингибитор ангиогенеза, где аланин, соответствующий позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, заменен гидрофильной аминокислотой, и второй полипептид, содержащий мутантный семафорин 3А или его функциональный фрагмент, который функционирует как ингибитор ангиогенеза, где аланин, соответствующий позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, заменен гидрофильной аминокислотой.

В некоторых аспектах гибридный белок согласно данному изобретению содержит первый полипептид, содержащий мутантный семафорин 3А или его функциональный фрагмент, который функционирует как ингибитор ангиогенеза, где аланин, соответствующий позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, заменен гидрофильной аминокислотой, и второй полипептид, содержащий мутантный семафорин 3В или его функциональный фрагмент, который функционирует как ингибитор ангиогенеза, где аланин, соответствующий позиции 105 семафорина 3В дикого типа, показанного в SEQ ID NO 6, заменен гидрофильной аминокислотой.

В некоторых аспектах гибридный белок согласно данному изобретению содержит первый полипептид, содержащий мутантный семафорин 3А или его функциональный фрагмент, который функционирует как ингибитор ангиогенеза, где аланин, соответствующий позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, заменен гидрофильной аминокислотой, и второй полипептид, содержащий мутантный семафорин 3С или его функциональный фрагмент, который функционирует как ингибитор ангиогенеза, где аланин, соответствующий позиции 104 семафорина 3С дикого типа, показанного в SEQ ID NO 10, заменен гидрофильной аминокислотой.

В некоторых аспектах гибридный белок согласно данному изобретению содержит первый полипептид, содержащий мутантный семафорин 3А или его функциональный фрагмент, который функционирует как ингибитор ангиогенеза, где аланин, соответствующий позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, заменен гидрофильной аминокислотой, и второй полипептид, содержащий мутантный семафорин 3D или его функциональный фрагмент, который функционирует как ингибитор ангиогенеза, где аланин, соответствующий позиции 120 семафорина 3D дикого типа, показанного в SEQ ID NO 14, заменен гидрофильной аминокислотой.

В некоторых аспектах гибридный белок согласно данному изобретению содержит первый полипептид, содержащий мутантный семафорин 3В или его функциональный фрагмент, который функционирует как ингибитор ангиогенеза, где аланин, соответствующий позиции 105 семафорина 3В дикого типа, показанного в SEQ ID NO 6, заменен гидрофильной аминокислотой, и второй полипептид, содержащий семафорин 3 или его функциональный фрагмент, где указанный белок семафорин 3 выбран из группы семафорина 3А, семафорина 3В, семафорина 3С и семафорина 3D.

В некоторых аспектах гибридный белок согласно данному изобретению содержит первый полипептид, содержащий мутантный семафорин 3В или его функциональный фрагмент, который функционирует как ингибитор ангиогенеза, где аланин, соответствующий позиции 105 семафорина 3В дикого типа, показанного в SEQ ID NO 6, заменен гидрофильной аминокислотой, и второй полипептид, содержащий мутантный семафорин ЗВ или его функциональный фрагмент, который функционирует как ингибитор ангиогенеза, где аланин, соответствующий позиции 105 семафорина 3В дикого типа, показанного в SEQ ID NO 6, заменен гидрофильной аминокислотой.

В некоторых аспектах гибридный белок согласно данному изобретению содержит первый полипептид, содержащий мутантный семафорин 3В или его функциональный фрагмент, который функционирует как ингибитор ангиогенеза, где аланин, соответствующий позиции 105 семафорина 3В дикого типа, показанного в SEQ ID NO 6, заменен гидрофильной аминокислотой, и второй полипептид, содержащий мутантный семафорин 3С или его функциональный фрагмент, который функционирует как ингибитор ангиогенеза, где аланин, соответствующий позиции 104 семафорина 3С дикого типа, показанного в SEQ ID NO 10, заменен гидрофильной аминокислотой.

В некоторых аспектах гибридный белок согласно данному изобретению содержит первый полипептид, содержащий мутантный семафорин 3В или его функциональный фрагмент, который функционирует как ингибитор ангиогенеза, где аланин, соответствующий позиции 105 семафорина 3В дикого типа, показанного в SEQ ID NO 6, заменен гидрофильной аминокислотой, и второй полипептид, содержащий мутантный семафорин 3D или его функциональный фрагмент, который функционирует как ингибитор ангиогенеза, где аланин, соответствующий позиции 120 семафорина 3D дикого типа, показанного в SEQ ID NO 14, заменен гидрофильной аминокислотой.

В некоторых аспектах гибридный белок согласно данному изобретению содержит первый полипептид, содержащий мутантный семафорин 3С или его функциональный фрагмент, который функционирует как ингибитор ангиогенеза, где аланин, соответствующий позиции 104 семафорина 3С дикого типа, показанного в SEQ ID NO 10, заменен гидрофильной аминокислотой, и второй полипептид, содержащий семафорин 3 или его функциональный фрагмент, где указанный белок семафорин 3 выбран из группы семафорина 3А, семафорина 3В, семафорина 3С и семафорина 3D.

В некоторых аспектах гибридный белок согласно данному изобретению содержит первый полипептид, содержащий мутантный семафорин 3С или его функциональный фрагмент, который функционирует как ингибитор ангиогенеза, где аланин, соответствующий позиции 104 семафорина 3С дикого типа, показанного в SEQ ID NO 10, заменен гидрофильной аминокислотой, и второй полипептид, содержащий мутантный семафорин 3С или его функциональный фрагмент, который функционирует как ингибитор ангиогенеза, где аланин, соответствующий позиции 104 семафорина 3С дикого типа, показанного в SEQ ID NO 10, заменен гидрофильной аминокислотой.

В некоторых аспектах гибридный белок согласно данному изобретению содержит первый полипептид, содержащий мутантный семафорин 3С или его функциональный фрагмент, который функционирует как ингибитор ангиогенеза, где аланин, соответствующий позиции 104 семафорина 3С дикого типа, показанного в SEQ ID NO 10, заменен гидрофильной аминокислотой, и второй полипептид, содержащий мутантный семафорин 3D или его функциональный фрагмент, который функционирует как ингибитор ангиогенеза, где аланин, соответствующий позиции 120 семафорина 3D дикого типа, показанного в SEQ ID NO 14, заменен гидрофильной аминокислотой.

В некоторых аспектах гибридный белок согласно данному изобретению содержит первый полипептид, содержащий мутантный семафорин 3D или его функциональный фрагмент, который функционирует как ингибитор ангиогенеза, где аланин, соответствующий позиции 120 семафорина 3D дикого типа, показанного в SEQ ID NO 14, заменен гидрофильной аминокислотой, и второй полипептид, содержащий семафорин 3 или его функциональный фрагмент, где указанный белок семафорин 3 выбран из группы семафорина 3А, семафорина 3В, семафорина 3С и семафорина 3D.

В некоторых аспектах гибридный белок согласно данному изобретению содержит первый полипептид, содержащий мутантный семафорин 3D или его функциональный фрагмент, который функционирует как ингибитор ангиогенеза, где аланин, соответствующий позиции 120 семафорина 3D дикого типа, показанного в SEQ ID NO 14, заменен гидрофильной аминокислотой, и второй полипептид, содержащий мутантный семафорин 3D или его функциональный фрагмент, который функционирует как ингибитор ангиогенеза, где аланин, соответствующий позиции 120 семафорина 3D дикого типа, показанного в SEQ ID NO 14, заменен гидрофильной аминокислотой.

В данном документе также предусматривается, что гибридный белок мутантного семафорина 3 включает следующие домены:

(i) sema-домен;

(ii) PSI-домен; а также

(iii) С-концевой константный домен IgG, слитый с С-концом PSI-домена,

и также характеризуется тем, что остаток аланина (А₃), содержащийся в мотиве CX₁X₂A₃GKD семафорина 3, мутирован в лизин, где семафорин 3 выбран из группы, состоящей из семафорина 3А, В, С и D.

Гибридный белок содержит функциональный sema-домен, где указанный sema-домен содержит гидрофильную аминокислоту на месте аланина в позиции, которая при сравнении гомологии соответствует позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, а также домен димеризации и/или стабилизирующий домен.

Другими словами, гибридный белок содержит функциональный sema-домен, где указанный sema-домен выбран из группы, состоящей из семафорина 3А, семафорина 3В, семафорина 3С и семафорина 3D, где указанный sema-домен содержит

гидрофильную аминокислоту вместо аланина, соответствующего позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2;

гидрофильную аминокислоту вместо аланина, соответствующего позиции 105 семафорина 3В дикого типа, показанного в SEQ ID NO 6;

гидрофильную аминокислоту вместо аланина, соответствующего позиции 104 семафорина 3С дикого типа, показанного в SEQ ID NO 10; или

гидрофильную аминокислоту вместо аланина, соответствующего позиции 120 семафорина 3D дикого типа, показанного в SEQ ID NO 14;

и где указанный гибридный белок также содержит домен димеризации и/или стабилизирующий домен.

Наиболее предпочтительно гибридный белок содержит функциональный sema-домен, где в указанном функциональном sema-домене аланин, соответствующий позиции 106 семафорина 3А дикого типа SEQ ID NO 2, заменен гидрофильной аминокислотой, или где аланин, соответствующий указанному аланину 106 в семафорине 3В, 3С или 3D, заменен гидрофильной аминокислотой и доменом димеризации, где домен димеризации представляет собой IgG1, и/или стабилизирующим доменом, где стабилизирующий домен представляет собой PSI-домен. В наиболее предпочтительных аспектах гибридный белок содержит функциональный sema-домен 3А, где указанный sema-домен содержит гидрофильную аминокислоту вместо аланина, соответствующего позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, и где указанный гибридный белок также содержит домен димеризации и/или стабилизирующий домен.

В наиболее предпочтительных воплощениях изобретения гибридные белки/полипептиды согласно данному изобретению могут содержать функциональный sema-домен, который слит с доменом PSI (как показано в прилагаемых примерах). Образованный sema-PSI-домен слит с доменом димеризации, например, константным фрагментом домена IgG1. Кроме того, такие гибридные белки не имеют связывающей Nrp1 и/или расщепляемой фурином Ig-подобной (аминокислоты, охватывающие 580-670 SEQ ID NO 2)/основной области (аминокислоты, охватывающие 715-771 SEQ ID NO 2). Такие гибридные белки являются в данном случае наиболее предпочтительными воплощениями, а иллюстративные молекулы нуклеиновых кислот такого закодированного гибридного белка могут содержать последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую:

последовательность нуклеиновой кислоты, охватывающую нуклеотиды 316-1959 в SEQ ID NO 1, и последовательность нуклеиновой кислоты, охватывающую нуклеотиды 295-990 в SEQ ID NO 37, где нуклеотиды GCT в позиции с 631 по 633 в SEQ ID NO 1 заменены нуклеотидами, кодирующими гидрофильную аминокислоту;

последовательность нуклеиновой кислоты, охватывающую нуклеотиды 247-1887 в SEQ ID NO 5, и последовательность нуклеиновой кислоты, охватывающую нуклеотиды 295-990 в SEQ ID NO 37, где нуклеотиды GCT в позиции с 559 по 556 в SEQ ID NO 5 заменены нуклеотидами, кодирующими гидрофильную аминокислоту;

последовательность нуклеиновой кислоты, охватывающую нуклеотиды 563-2977 в SEQ ID NO 9, и последовательность нуклеиновой кислоты, охватывающую нуклеотиды 295-990 в SEQ ID NO 37, где нуклеотиды GCT в позиции с 872 по 874 в SEQ ID NO 1 заменены нуклеотидами, кодирующими гидрофильную аминокислоту; или

последовательность нуклеиновой кислоты, охватывающую нуклеотиды 41-1735 в SEQ ID NO 13, и последовательность нуклеиновой кислоты, охватывающую нуклеотиды 295-990 в SEQ ID NO 37, где нуклеотиды GCT в позиции с 398 по 400 в SEQ ID NO 13 заменены нуклеотидами, кодирующими гидрофильную аминокислоту.

В наиболее предпочтительных воплощениях гибридный белок мутантного семафорина ЗА закодирован последовательностью нуклеиновой кислоты, охватывающей нуклеотиды 316-1959 в SEQ ID NO 1, и последовательностью нуклеиновой кислоты, охватывающей нуклеотиды 295-990 в SEQ ID NO 37, где нуклеотиды GCT в позиции с 631 по 633 SEQ ID NO 1 заменены нуклеотидами, кодирующими гидрофильную аминокислоту.

В данном документе предполагается, что могут быть использованы последовательности нуклеиновых кислот, оптимизированные по кодонам, как показано в прилагаемых примерах (SEQ ID NO 17, 19, 43 и 44).

В наиболее предпочтительных воплощениях гибридный белок содержит sema-домен, стабилизирующий домен и домен димеризации. Функциональный sema-домен слит со стабилизирующим доменом, например, доменом PSI. Полученный в результате sema-PSI-домен слит с доменом димеризации, например, константным фрагментом домена IgG1, показанного в SEQ ID NO 38 или 41. Такой иллюстративный гибридный белок содержит sema-домен, PSI и домен димеризации, где гибридный белок содержит аминокислотную последовательность:

которая простирается от аминокислотного остатка 1 до 548 в SEQ ID NO 2, и аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO 41, где остаток аланина в позиции 106 в SEQ ID NO 2 заменен гидрофильной аминокислотой;

которая простирается от аминокислотного остатка 1 до 547 в SEQ ID NO 6, и аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO 41, где остаток аланина в позиции 105 в SEQ ID NO 6 заменен гидрофильной аминокислотой;

которая простирается от аминокислотного остатка 1 до 565 в SEQ ID NO 10, и аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO 41, где остаток аланина в позиции 104 в SEQ ID NO 10 заменен гидрофильной аминокислотой; или

которая простирается от аминокислотного остатка 1 до 545 SEQ ID NO 14, и аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO 41, где остаток аланина в позиции 120 в SEQ ID NO 14 заменен гидрофильной аминокислотой.

В наиболее предпочтительных воплощениях гибридный белок мутантного семафорина 3А содержит полипептид, который простирается от аминокислотного остатка 1 до 548 в SEQ ID NO 2, и аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO 41, где остаток аланина в позиции 106 в SEQ ID NO 2 заменен гидрофильной аминокислотой.

Иллюстративный гибридный белок, содержащий функциональный sema-домен мутантного семафорина 3А, домен PSI, домен IgG1, показан в SEQ ID NO 18 или 20. Иллюстративный гибридный белок, содержащий функциональный sema-домен мутантного семафорина 3В, мутантного семафорина 3С или мутантного семафорина 3D и домен PSI, домен IgG1, показан в SEQ ID NO 76, 78 или 79, соответственно. SEQ ID NO 18 показывает гибридный белок, содержащий функциональный sema-домен мутантного человеческого семафорина 3А, где аланин в позиции, которая при сравнении гомологии соответствует позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, заменен лизином, а также домен PSI и человеческий константный фрагмент IgG1. Соответствующая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая гибридный белок, содержащий функциональный sema-домен человеческого мутантного семафорина 3А, где аланин в позиции, которая при сравнении гомологии соответствует позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, замещен лизином, а также домен PSI и человеческий константный фрагмент IgG1, показана в SEQ ID NO 17. SEQ ID NO 74 и 75 показывают аминокислотную последовательность и кодирующую последовательность нуклеиновой кислоты иллюстративного гибридного белка семафорина 3В без мутации согласно данному изобретению.

SEQ ID NO 20 показывает гибридный белок, содержащий функциональный sema-домен мышиного мутантного семафорина 3А, где аланин в позиции, которая при сравнении гомологии соответствует позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, заменен лизином, а также домен PSI и человеческий константный фрагмент IgG1. Соответствующая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая гибридный белок, включающий функциональный sema-домен мышиного мутантного семафорина 3А, где аланин в позиции, которая при сравнении гомологии соответствует позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, замещен лизином, а также домен PSI и константный фрагмент мыши IgG1, приведена в SEQ ID NO 19.

Гибридный белок, описанный в данном документе, может быть гетерологичным белком, где неприродный/искусственный/мутантный белок семафорин 3, неприродный/искусственный/мутантный функциональный фрагмент семафорина 3 или неприродный/искусственный/мутантный функциональный sema-домен семафорина 3, домен димеризации и/или стабилизирующий домен получены из разных источников, например, от разных видов. В данном документе понимается, что неприродный/искусственный/мутантный белок семафорин 3, неприродный/искусственный/мутантный функциональный фрагмент семафорина 3, неприродный/искусственный/мутантный функциональный sema-домен семафорина 3, домен димеризации и/или стабилизирующий домен могут быть связаны/слиты вместе таким образом, как это происходит в природных белках семафоринах 3, где сохраняется характер мутантного семафорина 3А, В, С или D. Кроме того, неприродный/искусственный/мутантный белок семафорин 3, неприродный/искусственный/мутантный функциональный фрагмент семафорина 3, неприродный/искусственный/мутантный функциональный sema-домен семафорина 3, домен димеризации и/или стабилизирующий домен могут быть связаны/слиты вместе таким образом, как это не встречается в природе. Неприродный/искусственный/мутантный белок семафорин 3,

неприродный/искусственный/мутантный функциональный фрагмент семафорина 3, неприродный/искусственный/мутантный функциональный sema-домен семафорина 3, домен димеризации и/или стабилизирующий домен могут быть конъюгированы/связаны вместе посредством аминокислотных линкеров, например, серин-глициновых линкеров. Такие линкеры известны в данной области и могут быть, например, короткими пептидными последовательностями, которые находятся между белковыми доменами. Линкеры часто состоят из гибких остатков, таких как глицин и серии, так что смежные белковые домены свободно перемещаются относительно друг друга. Более длинные линкеры используются, когда необходимо, чтобы два соседних домена стерически не мешали друг другу. В данном документе также предусматриваются непептидные связи. Такие непептидные связи могут включать дисульфидные связи, например, между боковыми цепями Cys, тиоэфирные связи или непептидные ковалентные связи, индуцированные химическими сшивающими линкерами, такими как дисукцинимидилсуберат (DSS) или сульфосукцинимидил-4-[пара-малеимидофенил]бутират (сульфо-SMPB), металл-хелатирующие/комплексообразующие группы, а также нековалентные белок-белковые взаимодействия. Это лишь воплощения данного изобретения, и специалистам в данной области будет очевидно, что в гибридных белках могут быть легко осуществлены и использованы модификации без отхода от сущности данного изобретения.

В данном документе также предусматривается, что стабильность мутантного семафорина 3 или его функционального фрагмента может быть оптимизирована путем добавления иммуноглобулиноподобных доменов и одновременного улучшения фармакокинетических свойств, таких как пролонгированный период полужизни в сыворотке крови и защита от протеолитического расщепления протеазами. Более того, стабильность форматов может быть повышена за счет оптимизации продукции. Поскольку линкерные последовательности, которые используются для ковалентного соединения доменов, часто приводят к образованию агрегатов, были созданы продуцирующие линии, которые сначала продуцируют два или три полипептида, которые можно легко собрать для получения функционального лекарственного препарата. Такие методики используют направленные дисульфидные мостики или сшивающие реагенты для ковалентного соединения двух разных полипептидов. Другие методики используют домены гетеро- или гомодимеризации, такие как домены лейциновой застежки, Fc-домены и другие, такие как методики типа "ключ в замке" (см., например, WO 2007/062466).

Данное изобретение также относится к вектору, содержащему последовательность(и) нуклеиновой(х) кислоты(кислот) согласно данному изобретению.

Специалистам в области молекулярной биологии известны многие подходящие векторы, выбор которых будет зависеть от желаемой функции, и они включают плазмиды, космиды, вирусы, бактериофаги и другие векторы, традиционно используемые в генной инженерии. Способы, которые хорошо известны специалистам в данной области, могут быть использованы для конструирования различных плазмид и векторов; см., например, методики, описанные в Sambrook et al. (см. цит.) и Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates и Wiley Interscience, N.Y. (1989), (1994). Альтернативно, пол и нуклеотиды и векторы согласно данному изобретению могут быть введены в липосомы для доставки в клетки-мишени. Релевантные последовательности могут быть перенесены в экспрессионные векторы, где требуется экспрессия конкретного полипептида. Типичные клонирующие векторы включают pBluescript SK, pGEM, pUC9, pBR322 и pGBT9. Типичные экспрессионные векторы включают pTRE, pCAL-n-EK, pESP-1, рОР13САТ.

Предпочтительно указанным вектором является вектор для нацеливания на ген (таргетинга) и/или вектор для переноса гена. Генная терапия, основанная на введении терапевтических генов (например, для вакцинации) в клетки методиками ex vivo или in vivo, является одним из наиболее важных применений переноса генов. Подходящие векторы, векторные системы и способы генной терапии in vitro или in vivo описаны в литературе и известны специалистам в данной области; см., например, Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992), 808-813, Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716; WO 94/29469; WO 97/00957, Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640; или Verma, Nature 389 (1997), 239-242, и ссылки, цитируемые в них. В некоторых аспектах указанный вектор представляет собой вектор на основе аденоассоциированного вируса (AAV). В конкретных аспектах AAV-вирус представляет собой AAV8, и, таким образом, вектор представляет собой AAV8-вектор. AAV-векторы привлекательны для генной терапии. Система AAV имеет ряд преимуществ, в том числе длительную экспрессию генов, невозможность автономной репликации без вспомогательного вируса, трансдукцию делящихся и неделящихся клеток и отсутствие патогенности от инфекций дикого типа. В данном документе предусматривается, что серотипы AAV проявляют различный органный тропизм. Соответственно, могут быть использованы различные серотипы AAV для нацеливания белков/полипептидов согласно данному изобретению на раковые опухоли различных органов. Предполагается, что различные AAV-векторы могут быть использованы в генной терапии в соответствии со стандартными протоколами (Grieger et al., 2012 и Asokan et al., 2012).

Молекулы нуклеиновых кислот согласно данному изобретению и векторы, описанные выше, могут быть предназначены для прямого введения в клетку или для введения через липосомы или вирусные векторы (например, аденовирусные, ретровирусные). Кроме того, в качестве эукариотической экспрессионной системы для молекул нуклеиновых кислот согласно данному изобретению могут быть использованы бакуловирусные системы или системы на основе вируса осповакцины или вируса леса Семлики. В дополнение к рекомбинантной продукции фрагменты белка, гибридный белок или антигенные фрагменты согласно данному изобретению могут быть получены прямым пептидным синтезом с использованием твердофазных методик (см. Stewart et al. (1969) Solid Phase Peptide Synthesis, WH Freeman Co, San Francisco; Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85 (1963), 2149-2154). Синтез белка in vitro может быть выполнен с использованием ручных методик или путем автоматизации. Автоматический синтез может быть проведен, например, с помощью Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer, Фостер-Сити, Калифорния) в соответствии с инструкциями производителя. Различные фрагменты могут быть химически синтезированы по отдельности и объединены с использованием химических способов для получения полноразмерной молекулы.

В некоторых аспектах данный вектор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая представляет собой регуляторную последовательность, функционально связанную с указанной последовательностью нуклеиновой кислоты, определенной в данном документе.

Термин "регуляторная последовательность" относится к последовательностям ДНК, которые необходимы для осуществления экспрессии кодирующих последовательностей, с которыми они лигированы. Характер таких контрольных последовательностей отличается в зависимости от организма-хозяина. В прокариотах контрольные последовательности обычно включают промотор, сайт связывания рибосомы и терминаторы. В эукариотах обычные контрольные последовательности включают промоторы, терминаторы и в некоторых случаях энхансеры, трансактиваторы или транскрипционные факторы. Термин "контрольная последовательность" предназначен для включения как минимум всех компонентов, присутствие которых необходимо для экспрессии, и также может включать дополнительные полезные компоненты.

Термин "функционально связанный" относится к сопоставлению, в котором описанные выше компоненты находятся в отношениях, позволяющих им функционировать по назначению. Контрольная последовательность, "функционально связанная" с кодирующей последовательностью, лигируется таким образом, что экспрессия кодирующей последовательности достигается в условиях, совместимых с контрольными последовательностями. В случае, когда контрольная последовательность является промотором, для специалиста в данной области очевидно, что предпочтительно использовать двухцепочечную нуклеиновую кислоту.

Указанный вектор также может быть экспрессионным вектором. "Экспрессионный вектор" представляет собой конструкцию, которая может быть использована для трансформации выбранного хозяина и обеспечивает экспрессию кодирующей последовательности в выбранном хозяине. Экспрессионные векторы могут, например, быть клонирующими векторами, бинарными векторами или интегрирующими векторами. Экспрессия включает транскрипцию молекулы нуклеиновой кислоты предпочтительно в трансляционную мРНК. Специалистам в данной области хорошо известны регуляторные элементы, обеспечивающие экспрессию в прокариотических и/или эукариотических клетках. В случае эукариотических клеток они содержат нормальные промоторы, обеспечивающие инициацию транскрипции, и возможно, поли-А-сигналы, обеспечивающие прекращение транскрипции и стабилизацию транскрипта. Возможные регуляторные элементы, допускающие экспрессию в прокариотических клетках-хозяевах, включают, например, промотор P_L Iac, trp или tac в Е. coli, а примерами регуляторных элементов, допускающих экспрессию в эукариотических клетках-хозяевах, являются промотор АОХ1 или GAL1 у дрожжей или CMV-, SV40-, RSV-промотор (вирус саркомы Рауса), CMV-энхансер, SV40-энхансер или интрон глобина в клетках млекопитающих и других животных.

Помимо элементов, которые ответственны за инициацию транскрипции, такие регуляторные элементы могут также содержать сигналы терминации транскрипции, такие как сайт SV40-poly-A или сайт tk-poly-A, следующие за полинуклеотидом. Кроме того, в зависимости от используемой экспрессионной системы к кодирующей последовательности указанной последовательности нуклеиновой кислоты могут быть добавлены и хорошо известны в данной области лидерные последовательности, способные направлять полипептид в клеточный компартмент или секретировать его в среду. Лидерная последовательность(и) собрана в соответствующей фазе с последовательностями инициации и терминации трансляции и предпочтительно является лидерной последовательностью, способной направлять секрецию транслированного белка или его части в периплазматическое пространство или внеклеточную среду. Соответственно, такая лидерная последовательность также может быть сигнальным пептидом. Таким образом, мутантные полипептиды семафорины 3 могут содержать сигнальный пептид. Сигнальный пептид представляет собой короткий участок аминокислот, обычно присутствующий на N-конце белков, который предназначен для направления на секреторный путь. Такие белки включают те, которые находятся либо внутри определенных органелл, таких как эндоплазматический ретикулум, аппарат гольджи или эндосомы, либо выделяются из клетки. Сигнальный пептид отщепляется, и активные полипептиды, как правило, не содержат сигнальных пептидов. Возможно, гетерологичная последовательность может кодировать гибридный белок, включающий N-концевой идентификационный пептид, придающий желаемые характеристики, например, стабилизацию или упрощенную очистку экспрессированного рекомбинантного продукта; см. выше. В этом контексте в данной области известны подходящие экспрессионные векторы, такие как экспрессионный вектор для клонирования кДНК Окаямы-Берг pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNAI, pcDNA3 (Invitrogen), pEF-DHFR, pEF-ADA или pEF-neo (Mack et al. PNAS (1995) 92, 7021-7025; и Raum et al. Cancer Immunol Immunother (2001) 50(3), 141-150) или pSPORTI (GIBCO BRL).

Предпочтительно экспрессионные контрольные последовательности будут эукариотическими промоторными системами в векторах, способных трансформировать трансфекционные эукариотические клетки-хозяева, но также могут быть использованы контрольные последовательности для прокариотических хозяев. Как только вектор встраивается в соответствующую клетку-хозяина, клетку-хозяина поддерживают в условиях, подходящих для экспрессии нуклеотидных последовательностей на высоком уровне, и, при желании, далее следует сбор и очистка полипептида согласно данному изобретению; см., например, прилагаемые примеры.

Данное изобретение относится к хозяину, трансформированному вектором согласно данному изобретению, или к хозяину, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты согласно данному изобретению. Указанным хозяином может быть любая прокариотическая или эукариотическая клетка. Подходящими прокариотическими/бактериальными клетками являются те, которые обычно используются для клонирования, такие как Е. coli или Bacillus subtilis. Указанный эукариотический хозяин может быть клеткой млекопитающего.

В предпочтительном воплощении указанная клетка млекопитающего представляет собой нейрональную клетку и/или культивированную клетку, такую как, помимо прочего, эмбриональная клетка почки человека HEK 293 (от англ. - human embryonic kidney), СНО (от англ. Chinese Hamster Ovary - клетки яичников китайского хомячка), HeLa, NIH3T3, BHK (от англ. Baby Hamster Kidney - клетки почки детеныша хомяка) или клетку РС12. В особенно предпочтительном воплощении клеточная линия HEK293 стабильно экспрессирует ядерный антиген-1 вируса Эпштейна-Барр (HEK293-EBNA1 или 293Е). Как правило, это наиболее часто используемая клеточная линия для крупномасштабной трансфекции (CSH Protocols, 2008; doi: 10.1101/pdb.prot4976).

В частности, предполагается, что указанный хозяин может быть клеткой млекопитающего. Особенно предпочтительные клетки-хозяева включают клетки HEK, клетки HEK293E, клеточную линию HEK293, стабильно экспрессирующую ядерный антиген-1 вируса Эпштейна-Барр (HEK293-EBNA1 или 293Е).

Термин "клетка" или "клетка млекопитающего", используемый в этом контексте, также может содержать множество клеток, а также клетки, составляющие ткань. Клетка, которая будет использоваться в способе скрининга или валидации, может быть получена из образцов от (трансгенного) животного или человека, страдающего от заболевания, например, ангиогенного заболевания, рака или заболевания, связанного с семафорин-зависимой активацией рецептора плексина. Клетка (например, опухолевая клетка и т.п.) также может быть получена или дериватизована из образцов пациентов (например, биопсий), в частности из биоптата/биоптатов от пациента/субъекта, страдающего от заболевания, определенного в данном документе выше или ниже. Соответственно, клетка может быть человеческой клеткой. Опять же, такая клетка, которая будет использоваться в данных способах скрининга или валидации, может содержаться в ткани или в образце ткани, например, в биопсии образца. Изобретение также предусматривает, что хозяин трансформирован или трансфицирован вектором согласно данному изобретению. Указанный хозяин может быть получен путем введения описанного выше вектора согласно данному изобретению или описанной выше молекулы нуклеиновой кислоты согласно данному изобретению хозяину. Присутствие по меньшей мере одного вектора или по меньшей мере одной молекулы нуклеиновой кислоты в хозяине может опосредовать экспрессию гена, кодирующего описанный выше мутантный семафорин 3 или его фрагмент. Описанная молекула нуклеиновой кислоты или вектор согласно данному изобретению, который вводится в организм хозяина, может либо интегрироваться в геном хозяина, либо может поддерживаться внехромосомно. Хозяин может быть любой прокариотической или эукариотической клеткой.

Альтернативной экспрессионной системой является система насекомых или экспрессионная система клеток насекомых. В одной из таких систем вирус ядерного полиэдроза Autographa californica (AcNPV) используется в качестве вектора для экспрессии чужеродных генов в клетках Spodoptera frugiperda или у личинок Trichoplusia. Кодирующая последовательность приведенной молекулы нуклеиновой кислоты может быть клонирована в несущественную область вируса, такую как ген полиэдрина, и помещена под контроль промотора полиэдрина. Успешная вставка указанной кодирующей последовательности сделает ген полиэдрина неактивным и создаст рекомбинантный вирус, лишенный белкового покрытия. Затем рекомбинантные вирусы используют для инфицирования клеток S. frugiperda или личинок Trichoplusia, в которых экспрессируется белок согласно данному изобретению (Smith, J. Virol. 46 (1983), 584; Engelhard, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91 (1994), 3224-3227). В некоторых аспектах вектор pFBDM может использоваться для экспрессии. Вставка в бакуловирусную ДНК MultiBac опосредуется через последовательность транспонирования Тп7 после трансформации клеток DH10 MultiBac Е. coli (Berger et al., 2004; Fitzgerald et al., 2006). Амплификация и экспрессия вируса может быть выполнена в клетках Sf21 (Spodoptera frugiperda) (Gibco, Invitrogen) и/или High Five (Trichoplusia ni) (Gibco, Invitrogen).

Дополнительные регуляторные элементы могут включать энхансеры транскрипции и трансляции. Преимущественно описанные выше векторы согласно данному изобретению содержат селектируемый маркер и/или маркер для подсчета.

Гены селектируемых маркеров, используемые для отбора трансформированных клеток и, например, растительной ткани и растений, хорошо известны специалистам в данной области и включают, например, антиметаболитовую устойчивость в качестве основы селекции по dhfr, которая придает устойчивость к метотрексату (Reiss, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.) 13 (1994), 143-149); npt, который придает устойчивость к аминогликозидам неомицину, канамицину и паромицину (Herrera-Estrella, EMBO J. 2 (1983), 987-995), и hygro, который придает устойчивость к гигромицину (Marsh, Gene 32 (1984), 481-485). Были описаны дополнительные селектируемые гены, а именно trpB, который позволяет клеткам использовать индол вместо триптофана; hisD, который позволяет клеткам использовать гистинол вместо гистидина (Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8047); манноза-6-фосфат-изомераза, которая позволяет клеткам использовать маннозу (WO 94/20627) и ODC (орнитиндекарбоксилазу), которая придает устойчивость к ингибитору орнитиндекарбоксилазы, 2-(дифторметил)-DL-орнитину (2-(difluoromethyl)-DL-ornithine, DFMO) (McConlogue, 1987, In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Cold Harbor Laboratory ed.), или деаминаза от Aspergillus terreus, которая придает устойчивость к бластицидину S (Tamura, Biosci. Biotechnol, Biochem., 59 (1995), 2336-2338).

Используемые маркеры для подсчета также известны специалистам в данной области и являются коммерчески доступными. Преимущественно указанный маркер представляет собой ген, кодирующий люциферазу (Giacomin, PI. Sci. 116 (1996), 59-72; Scikantha, J. Bact. 178 (1996), 121), зеленый флуоресцентный белок (Gerdes, FEBS Lett. 389 (1996), 44-47) или G-глюкуронидазу (Jefferson, EMBO J. 6 (1987), 3901-3907). Это воплощение, в частности, может быть использовано для простого и быстрого скрининга клеток, тканей и организмов, содержащих указанный вектор.

Как описано выше, указанная молекула нуклеиновой кислоты может использоваться по отдельности или как часть вектора для экспрессии полипептида согласно данному изобретению в клетках, например, для очистки, но также и для целей генной терапии. Молекулы нуклеиновых кислот или векторы, содержащие последовательность(и) ДНК, кодирующую любой из вышеописанных полипептидов согласно данному изобретению, вводят в клетки, которые, в свою очередь, продуцируют полипептид, представляющий интерес. Генная терапия, основанная на внедрении терапевтических генов в клетки методиками ex vivo или in vivo, является одним из наиболее важных применений переноса генов. Подходящие векторы, способы или системы доставки генов для генной терапии in vitro или in vivo описаны в литературе и известны специалистам в данной области; см., например, Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992), 808-813; Verma, Nature 389 (1994), 239; Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086; Onodera, Blood 91 (1998), 30-36; Verma, Gene Ther. 5 (1998), 692-699; Nabel, Ann. N.Y. Acad. Sci. 811 (1997), 289-292; Verzeletti, Hum. Gene Ther. 9 (1998), 2243-51; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716; WO 94/29469; WO 97/00957, US 5580859; US 5589466; или Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640. Указанные молекулы нуклеиновых кислот и векторы могут быть сконструированы для прямого введения или для введения через липосомы или вирусные векторы (например, аденовирусные, ретровирусные) в клетку. Предпочтительно указанная клетка представляет собой клетку зародышевой линии, эмбриональную клетку или яйцеклетку или полученную из нее, наиболее предпочтительно указанная клетка представляет собой стволовую клетку. Примером эмбриональной стволовой клетки может быть, в частности, стволовая клетка, описанная в Nagy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 8424-8428.

Термин "прокариот" предназначен для включения всех бактерий, которые могут быть трансформированы или трансфицированы молекулами ДНК или РНК для экспрессии белка согласно данному изобретению. Прокариотические хозяева могут включать грамотрицательные, а также грамположительные бактерии, такие как, например, Е. coli, S. typhimurium, Serratia marcescens и Bacillus subtilis. Термин "эукариот" предназначен для включения клеток дрожжей, высших растений, насекомых и, предпочтительно, млекопитающих. В зависимости от хозяина, используемого в процедуре рекомбинантной продукции, белок, кодируемый полинуклеотидом согласно данному изобретению, может быть гликозилированным или может быть негликозилированным. Особенно предпочтительным является использование плазмиды или вируса, содержащего кодирующую последовательность полипептида согласно данному изобретению и генетически слитую с ним метку для белка А. Описанный выше полинуклеотид может быть использован для трансформации или трансфекции хозяина с использованием любой из методик, широко известных специалистам в данной области. Кроме того, в данной области хорошо известны способы получения гибридных функционально связанных генов и способы их экспрессии, например, в клетках млекопитающих и в бактериях (Sambrook, см. цит.).

В данном документе также представлен способ получения полипептида, который должен использоваться в соответствии с данным изобретением, причем указанный способ включает культивирование/выращивание хозяина согласно данному изобретению в условиях, обеспечивающих экспрессию полипептида согласно данному изобретению и, возможно, извлечение/выделение полученного полипептида из культуры.

Трансформированных хозяев можно выращивать в ферментерах и культивировать в соответствии с методиками, известными в данной области, для достижения оптимального роста клеток. Затем полипептид согласно данному изобретению можно выделить из ростовой среды, клеточных лизатов или фракций клеточной мембраны. Выделение и очистка, например, микробиологически экспрессируемых полипептидов согласно данному изобретению могут быть проведены любыми общепринятыми способами, такими как, например, препаративные хроматографические выделения и иммунологические выделения, такими как способы, включающие использование моноклональных или поликлональных антител, направленных, например, против метки полипептида согласно данному изобретению, или как описано в прилагаемых примерах.

Условия культивирования хозяина, которые делают возможной экспрессию, известны в данной области и зависят от системы хозяина и экспрессионной системы/вектора, используемого в таком процессе. Параметры, подлежащие модификации для достижения условий, делающих возможной экспрессию рекомбинантного полипептида, известны в данной области. Таким образом, подходящие условия могут быть определены специалистом в данной области в отсутствие дополнительного изобретательского ввода.

После экспрессии полипептид согласно данному изобретению может быть очищен в соответствии со стандартными процедурами в данной области, включая осаждение сульфатом аммония, аффинные колонки, колоночную хроматографию, гель-электрофорез и т.п.; см. Scopes, "Protein Purification", Springer-Verlag, N.Y. (1982). Для фармацевтических целей предпочтительными являются по существу чистые полипептиды, имеющие однородность по меньшей мере примерно от 90 до 95%, и наиболее предпочтительными являются имеющие однородность от 98 до 99% или более. После очистки, частичной или до однородности по желанию, полипептид согласно данному изобретению может использоваться терапевтически (в том числе экстракорпорально) или в разработке и проведении аналитических процедур. Кроме того, примеры способов выделения полипептида согласно данному изобретению из культуры описаны в прилагаемых примерах.

Как подробно описано в данном документе, данное изобретение также относится к антителу, специфически связывающемуся с мутантным семафорином 3, его функциональным фрагментом или гибридным белком согласно данному изобретению, содержащим указанный мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент. В частности, в данном документе предложено антитело, специфически связывающееся с мутантным семафорином 3 или его функциональным фрагментом, где указанное антитело специфически связывается с эпитопом, содержащим гидрофильную аминокислоту, которая заменяет аланин, соответствующий позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, или аланин в позиции, которая при сравнении гомологии в других белках семафоринах 3 соответствует позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2, заменен гидрофильной аминокислотой, где указанный семафорин 3 выбран из группы семафорина 3А, семафорина 3В, семафорина 3С и семафорина 3D. Соответственно, данное изобретение относится к антителу, специфически связывающемуся с мутантным семафорином 3 или его функциональным фрагментом, где указанное антитело специфически связывается с эпитопом, содержащим гидрофильную аминокислоту на месте аланина, соответствующего позиции 106 семафорина 3А дикого типа, показанного в SEQ ID NO 2; гидрофильную аминокислоту на месте аланина, соответствующего позиции 105 семафорина 3В дикого типа, показанного в SEQ ID NO 6; гидрофильную аминокислоту на месте аланина, соответствующего позиции 104 семафорина 3С дикого типа, показанного в SEQ ID NO 10; или гидрофильную аминокислоту на месте аланина, соответствующего позиции 120 семафорина 3D дикого типа, показанного в SEQ ID NO 14, и где указанный семафорин 3 выбран из группы, состоящей из семафорина 3А, семафорина 3В, семафорина 3С и семафорина 3D.

Термин "антитело" согласно данному изобретению включает поликлональные и моноклональные антитела, а также их производные или их фрагменты, которые все еще сохраняют специфичность связывания. Методики получения антител хорошо известны в данной области и описаны, например, в Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; и Harlow and Lane "Using Antibodies: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999. Термин "антитело" согласно данному изобретению также включает такие воплощения как химерные, одноцепочечные и гуманизированные антитела, а также фрагменты антител, такие как, помимо прочего, Fab-фрагменты, гибридные белки, содержащие Eph-рецепторы, внеклеточные домены эфрина или фосфатазы и Fc. Фрагменты или производные антител также содержат F(ab')2, Fv-фрагменты, scFv, однодоменные VH или V-подобные домены, такие как VhH- или V-NAR-домены, а также мультимерные форматы, такие как миниантитела, димерные антитела, тетрамерные антитела или химически конъюгированные Fab'-многомеры; см., например, Harlow and Lane (1988) и (1999), Altshuler (2010) Biochemistry (Moscow) 75, 1584-605, или Holliger (2005) Nature Biotechnology 23, 1126-36. Различные процедуры известны в данной области и могут быть использованы для получения таких антител и/или фрагментов. Так, производные (антител) могут быть получены с помощью пептидомиметиков. Кроме того, методики, описанные для получения одноцепочечных антител (см., помимо прочего, патент US 4946778), могут быть адаптированы для получения одноцепочечных антител, специфичных для полипептида(ов) и гибридных белков согласно данному изобретению. Кроме того, трансгенные животные могут быть использованы для экспрессии гуманизированных антител, специфичных для полипептидов и гибридных белков согласно данному изобретению. Наиболее предпочтительно антитело согласно данному изобретению представляет собой моноклональное антитело. Для получения моноклональных антител можно использовать любую методику, которая предусматривает антитела, полученные с помощью непрерывных культур клеточных линий. Примеры таких методик включают оригинальную гибридомную методику (Kohler and Milstein, 1975) Nature 256, 495) как дальнейшее развитие в данной области техники, триомную методику, методику человеческой В-клеточной гибридомы (Kozbor (1983) Immunology Today 4, 72) и EBV-гибридомную методику для получения человеческих моноклональных антител (Cole et al., 1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., 77). Термин "антитело" также относится к гуманизированным антителам. "Гуманизированные" формы нечеловеческих (например, мышиных или кроличьих) антител представляют собой химерные иммуноглобулины, иммуноглобулиновые цепи или их фрагменты (такие как Fv, Fab, Fab', F(ab')2 или другие антигенсвязывающие подпоследовательности антител), которые содержат минимальную последовательность, полученную из нечеловеческого иммуноглобулина. Часто гуманизированными антителами являются человеческие иммуноглобулины (антитело-реципиент), в которых остатки реципиентной области, определяющей комплементарность (complementary determining region, CDR), заменены остатками CDR нечеловеческих (донорских) антител, таких как мышиные, крысиные или кроличьи, имеющих нужную специфичность, аффинность и силу. В некоторых случаях остатки Fv-каркасной области человеческого иммуноглобулина заменены соответствующими нечеловеческими остатками. Кроме того, гуманизированное антитело может содержать остатки, которые не обнаруживаются ни в реципиентном антителе, ни в импортированной CDR или каркасных последовательностях. Эти модификации сделаны для дальнейшего уточнения и оптимизации эффективности антител. В целом, гуманизированное антитело будет содержать по существу все, по меньшей мере один, а как правило два вариабельных домена, в которых все или практически все CDR-области соответствуют тем или иным нечеловеческим иммуноглобулинам, и все или практически все области FR являются консенсусными последовательностями человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело также может содержать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), как правило, человеческого иммуноглобулина. Для получения дополнительной информации см. Jones Nature 321 (1986), 522-525; Reichmann Nature 332 (1998), 323-327; и Presta Curr Op Struct Biol 2 (1992), 593-596.

Популярный способ гуманизации антител включает пересадку CDR, где функциональный антигенсвязывающий сайт из нечеловеческого "донорного" антитела прививается на человеческое "акцепторное" антитело. Способы прививания CDR известны в данной области и описаны, например, в патентах US 5225539, US 5693761 и US 640721. Другим связанным с этим способом является продукция гуманизированных антител с помощью трансгенных животных, которые были генетически модифицированы таким образом, чтобы содержать один или более чем один гуманизированный локус иммуноглобулина, способный подвергаться перегруппировке генов и конверсии генов (см., например, US 7129084). Другие способы конструирования и продукции гуманизированных антител описаны в US 07/290975, US 07/310252 и US 2003/0229208 или в Queen PNAS (1989), 10029-10033.

Поверхностный плазмонный резонанс, используемый в системе BIAcore, может быть использован для повышения эффективности, такой как эффективность и/или селективность фаговых антител, которые связываются с эпитопом полипептида согласно данному изобретению (Schier (1996) Human Antibodies Hybridomas 7, 97; Malmborg (1995) J. Immunol. Methods 183, 7). В контексте данного изобретения также предусмотрено, что термин "антитело" включает конструкции антител, которые могут быть экспрессированы в клетках, например, конструкции антитела, которые могут быть трансфицированы и/или трансдуцированы, помимо прочего, с помощью вирусов или плазмидных векторов. Антитело, описанное в контексте данного изобретения, способно специфически связываться/взаимодействовать с эпитопом упомянутого полипептида или мутантного семафорина 3, определенного в данном документе. Термин "специфически связывающийся/взаимодействующий с", используемый в соответствии с данным изобретением, означает, что антитело не реагирует или по существу не реагирует перекрестно с эпитопом аналогичной структуры. Перекрестная реактивность панели исследуемых антител может быть проверена, например, путем оценки связывания указанной панели антител в стандартных условиях с представляющим интерес эпитопом, а также с рядом более или менее (структурно и/или функционально) тесно связанных эпитопов. Только те антитела, которые связываются с представляющим интерес эпитопом в релевантном контексте (например, конкретный мотив в структуре мутантного семафорина 3 или его функционального фрагмента), но не связываются или по существу не связываются с любыми другими эпитопами, считаются специфическими для представляющего интерес эпитопа и, таким образом, являются антителами в соответствии с данным изобретением. Соответствующие способы описаны, например, в Harlow and Lane, 1988 и 1999, см. цит. Антитело специфически связывается/взаимодействует с конформационными или непрерывными эпитопами, которые являются уникальными для указанного полипептида, предпочтительно мутантного семафорина 3. Конформационный или прерывистый эпитоп характеризуется для полипептидных антигенов наличием двух или более дискретных аминокислотных остатков, которые разделены в первичной последовательности, но сходятся на поверхности молекулы, когда полипептид складывается в нативный белок/антиген (Sela (1969) Science 166, 1365; Laver(1990) Cell 61, 553). Два или более двух дискретных аминокислотных остатков, участвующих в образовании эпитопа, присутствуют на отдельных участках одной или более чем одной полипептидной цепи. Эти остатки собираются вместе на поверхности молекулы, когда полипептидная цепь (цепи) складывается в трехмерную структуру, чтобы образовать эпитоп. Напротив, непрерывный или линейный эпитоп состоит из двух или более дискретных аминокислотных остатков, которые присутствуют в одном линейном сегменте полипептидной цепи.

Были разработаны различные методики получения фрагментов антител. Традиционно эти фрагменты получали путем протеолитического расщепления интактных антител (см. Morimoto et al., (1992) Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117; и Brennan et al., (1985) Science 229:81). Фрагменты антител также могут быть получены непосредственно с помощью рекомбинантных клеток-хозяев и библиотек фаговых антител, рассмотренных выше. Фрагменты Fab'-SH могут быть непосредственно извлечены из Е. coli и химически связаны с формированием фрагментов F(ab')2 (Carter et al., (1992) Bio/Technology 10:163-167). Согласно другому подходу фрагменты F(ab')2 могут быть выделены непосредственно из культуры рекомбинантных клеток-хозяев. Специалистам в данной области будут очевидны другие методики получения фрагментов антител. В других воплощениях антителом выбора является одноцепочечный Fv-фрагмент (single chain Fv fragment, scFv). См. WO 93/16185; патент US 5571894; и патент US 5587458. Фрагмент антитела также может быть "линейным антителом", например, описанным в патенте US 5641870. Такие линейные фрагменты антител могут быть моноспецифическими или биспецифическими.

Биспецифические антитела со специфичностью связывания по меньшей мере для двух разных эпитопов (Millstein et al (1983), Nature 305:537-539) могут связываться с двумя различными эпитопами мутантного семафорина 3. Также описаны методики получения биспецифических антител из фрагментов антител, такие как использование химической связи, где интактные антитела подвергают протеолитическому расщеплению с образованием фрагментов F(ab')2 (Brennan et al (1985) Science 229:81). Фрагменты Fab'-SH могут быть выделены из Е. coli и химически связаны с формированием биспецифических антител (Shalaby et al., (1992) J. Exp.Med. 175:217-225). Методика "димерного антитела" предусматривает альтернативный способ получения биспецифических фрагментов антител (Hollinger et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448).

"Fab-фрагмент", как правило, состоит из одной легкой цепи и C_H1 и вариабельных областей одной тяжелой цепи. Тяжелая цепь молекулы Fab не может образовывать дисульфидную связь с другой молекулой тяжелой цепи. Область "Fc", как правило, содержит два фрагмента тяжелой цепи, содержащих домены антитела C_H2 и C_H3. Два фрагмента тяжелой цепи удерживаются вместе двумя или более чем двумя дисульфидными связями и гидрофобными взаимодействиями доменов C_H3. "Fab-фрагмент", как правило, содержит одну легкую цепь и часть одной тяжелой цепи, которая содержит домен VH и домен C_H1, а также область между доменами C_H1 и C_H2, так что между двумя тяжелыми цепями двух Fab'-фрагментов может сформироваться межцепочечная дисульфидная связь с формированием молекулы F(ab')2. "Фрагмент F(ab')2", как правило, содержит две легкие цепи и две тяжелые цепи, содержащие часть константной области между доменами C_H1 и C_H2, так что между двумя тяжелыми цепями образуется межцепочечная дисульфидная связь. Таким образом, Р(ab’)2-фрагмент состоит из двух Fab'-фрагментов, которые удерживаются вместе дисульфидной связью между двумя тяжелыми цепями. "Область Fv", как правило, содержит вариабельные области как из тяжелой, так и из легкой цепей, но не имеет константных областей. Рассматриваются антитела с более чем двумя валентностями. Многовалентные антитела "Octopus" с тремя или более сайтами связывания антигена и двумя или более вариабельными доменами могут быть легко получены путем рекомбинантной экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептидные цепи антитела (US 2002/0004586, WO 01/77342). Например, могут быть получены триспецифические антитела (Tutt et al., (1991) J. Immunol. 147:60).

Связывающие молекулы/антитела/антигенсвязывающие фрагменты, предусмотренные в данном документе, предпочтительно находятся в каркасной области IgG1 или IgG3, более предпочтительно в человеческой каркасной области IgG1 или IgG3. Связывающие молекулы, антитела или антигенсвязывающие фрагменты этих антител в каркасной области IgG1 или IgG3, предпочтительно в человеческой каркасной области IgG1 или IgG3, особенно предпочтительны для использования в вакцинотерапии.

Следующий иллюстративный анализ может быть использован для определения того, что антитело-кандидат действительно специфически связывается с мутантным семафорином 3 или его функциональным фрагментом в соответствии с данным изобретением.

Антитела, которые селективно и специфически связываются с эпитопом, содержащим гидрофильную аминокислоту, в позиции, которая при сравнении гомологии соответствует позиции 106 семафорина 3А, показанного в SEQ ID NO 2, могут быть идентифицированы, например, с помощью анализа захвата ELISA. Для того чтобы провести такой анализ, 96-луночные прозрачные полистироловые микропланшеты высоко связывания Corning 96 Well Clear Polystyrene High Bind Stripwell Microplate (продукт №2592) покрывают в течение ночи повышающимися количествами (от 0,02 нМ до 3,5 нМ) аффинно очищенного мутантного семафорина 3 (или его функционального фрагмента) или очищенного семафорина 3 дикого типа (или его функционального фрагмента) в 0,05 М Na₂CO₃ (рН 9,6) при 4°С. Затем реакцию блокируют PBS, содержащим 0,05% Tween-20 (PBS-T), с 5% BSA в течение 2 часов при комнатной температуре. Растворы, содержащие равные количества созданных антител, захватывают путем инкубации в течение ночи при 4°С. Несвязанный материал удаляют путем тщательного промывания PBS-T. Связывание антител против мутантного семафорина 3 обнаруживают путем инкубации лунок с соответствующими вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена, в PBS-T, содержащем 1% BSA, в течение 1 часа при 4°С. После последующего промывания связанные с мутантным семафорином 3 (или его функциональным фрагментом) или очищенным семафорином 3 дикого типа (или его функциональным фрагментом) антитела против зрелого семафорина 3 обнаруживают путем хромогенной реакции с ортофенилендиамином. Отбирают антитела, которые специфически связываются с мутантным семафорином 3 (или его функциональным фрагментом), но не связываются с семафорином 3 дикого типа (или его функциональным фрагментом).

В другом воплощении молекула нуклеиновой кислоты, вектор, мутантный семафорин 3, его функциональный фрагмент или гибридный белок/полипептид согласно данному изобретению могут быть использованы в качестве лекарственного препарата, т.е. мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент, предусмотренный и описанный в данном документе, предназначены для применения в медицине. Термины "лекарственный препарат" и "фармацевтическая композиция" используются в данном документе взаимозаменяемо. Соответственно, определения и пояснения, предусмотренные в данном документе в отношении "фармацевтических композиций", применимы, с необходимыми правками, и к термину "лекарственный препарат".

Используемый в данном документе термин "лечение нарушения или заболевания", такой как "лечение рака", хорошо известен в данной области. "Лечение нарушения или нарушения" подразумевает, что нарушение или заболевание подозреваются или были диагностированы у пациента/субъекта. Пациент/субъект, у которого подозревается нарушение или заболевание, как правило, демонстрирует специфические клинические и/или патологические симптомы, которые квалифицированный специалист может приписать конкретному патологическому состоянию (т.е. диагностировать нарушение или заболевание).

"Лечение" нарушения или заболевания может, например, приводить к остановке прогрессирования нарушения или заболевания (например, нет усиления симптомов) или задержке прогрессирования нарушения или заболевания (в случае, когда остановка прогрессирования носит временный характер). "Лечение" нарушения или заболевания может также приводить к частичному ответу (например, ослаблению симптомов) или полному ответу (например, исчезновению симптомов) у субъекта/пациента, страдающего от нарушения или заболевания. Соответственно, "лечение" нарушения или заболевания может также относиться к уменьшению нарушения или заболевания, которое может, например, приводить к остановке прогрессирования нарушения или заболевания или к задержке прогрессирования нарушения или заболевания. За таким частичным или полным ответом может следовать рецидив. Следует понимать, что субъект/пациент может испытывать широкий диапазон ответов на лечение (например, иллюстративные ответы, описанные в данном документе выше). Лечение нарушения или заболевания может, помимо прочего, включать лечение с лечебной целью (предпочтительно приводящее к полному ответу и, в конечном счете, к исцелению от нарушения или заболевания) и паллиативное лечение (включая симптоматическое облегчение). Таким образом, термин "лечение" означает получение желаемого фармакологического и/или физиологического эффекта. Эффект может также быть профилактическим с точки зрения полного или частичного предотвращения заболевания/состояния здоровья/нарушения или его симптомов и/или может быть терапевтическим с точки зрения частичного или полного излечения заболевания/состояния/нарушения и/или неблагоприятного воздействия, связанного с заболеванием/состоянием здоровья/нарушением.

Используемый в данном документе термин "профилактика нарушения или заболевания", такой как "профилактика рака", также хорошо известен в данной области. Например, пациент/субъект, у которого подозревается склонность к нарушению или заболеванию, определенному в данном документе, может, в частности, извлечь пользу из предотвращения нарушения или заболевания. Субъект/пациент может иметь восприимчивость или предрасположенность к нарушению или заболеванию, включая наследственную предрасположенность, но не ограничиваясь ею. Такую предрасположенность можно определить стандартными анализами с использованием, например, генетических маркеров или фенотипических показателей. Следует понимать, что нарушение или заболевание, которое следует предотвратить в соответствии с данным изобретением, не было диагностировано или не может быть диагностировано у пациента/субъекта (например, пациент/субъект не демонстрирует какие-либо клинические или патологические симптомы). Таким образом, термин "профилактика" включает применение соединений согласно данному изобретению до тех пор, пока какие-либо клинические и/или патологические симптомы не будут диагностированы или определены или не смогут быть диагностированы или определены лечащим врачом.

Данное изобретение предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую молекулу нуклеиновой кислоты согласно данному изобретению, мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент согласно данному изобретению, гибридный белок или полипептид согласно данному изобретению. Фармацевтическая композиция может содержать фармацевтический эксципиент.В данном случае понятно, что указанный фармацевтический эксципиент может содержать или является фармацевтическим носителем и/или разбавителем. В одном конкретном воплощении указанный фармацевтический носитель представляет собой вирус.В предпочтительном воплощении указанный вирус представляет собой аденоассоциированный вирус (AAV), где аденоассоциированный вирус представляет собой AAV8. AAV можно применять, например, в генной терапии. Таким образом, в одном из аспектов данное изобретение предусматривает нуклеотидную последовательность, которая содержит элементы генома аденовируса, а также мутантный семафорин 3 или его фрагменты, которые находятся под контролем эукариотического транскрипционного промотора. Эта молекула нуклеиновой кислоты может функционировать как вектор, позволяющий экспрессировать вышеупомянутый гетерологичный ген при введении вектора в клетку индивидуума.

Кроме того, данное изобретение предусматривает фармацевтическую композицию для применения в качестве лекарственного средства. Кроме того, данное изобретение предусматривает фармацевтическую композицию для применения в лечении ангиогенного нарушения, рака, опухоли, опухолевого заболевания, сосудистой ретинопатии, изменений проницаемости гематоэнцефалического барьера, нейровоспалительных заболеваний, воспалительных заболеваний, остеопороза, псориаза, ожирения, микобактериальных инфекций и/или гранулем. Кроме того, данное изобретение относится к фармацевтической композиции для применения в лечении опухоли, где опухоль представляет собой солидную опухоль. В частности, данное изобретение предусматривает фармацевтическую композицию для применения в лечении опухоли, где опухоль представляет собой опухоль поджелудочной железы. Кроме того, данное изобретение предусматривает фармацевтическую композицию для применения в лечении рака, где рак выбран из группы, состоящей из рака поджелудочной железы, рака шейки матки, рака молочной железы, рака толстой кишки, меланомы, рака предстательной железы, рака мочевого пузыря и рака языка. В частности, данное изобретение предусматривает фармацевтическую композицию для применения в лечении рака поджелудочной железы. Кроме того, данное изобретение предусматривает фармацевтическую композицию, где затронута нормализация сосудов, уменьшение роста опухоли, уменьшение метастазирования или увеличение продолжительности жизни. Кроме того, данное изобретение предусматривает фармацевтическую композицию, молекулу нуклеиновой кислоты, вектор, мутантный семафорин 3, его функциональный фрагмент и/или гибридный белок/полипептид, который должен вводиться в комбинации с антипролиферативным лекарственным препаратом, противораковым лекарственным препаратом, цитостатическим лекарственным препаратом, цитотоксическим лекарственным препаратом и/или лучевой терапией. В конкретных предпочтительных аспектах фармацевтическая композиция, молекула нуклеиновой кислоты, вектор, мутантный семафорин 3, его функциональный фрагмент и/или гибридный белок/полипептид должны вводиться парентерально.

Кроме того, данное изобретение предусматривает фармацевтическую композицию, мутантный семафорин 3, его функциональный фрагмент и/или гибридный белок/полипептид или кодирующую молекулу нуклеиновой кислоты для применения в лечении опухоли или рака для ингибирования роста рака, снижения числа метастазов в печени или объема метастазов, уменьшения сосудистой площади и/или усиления нормализации сосудов раковой опухоли, усиления покрытия перицитами и/или увеличения перфузии кровеносных сосудов и ингибирования гипоксии раковой опухоли.

Фармацевтическая композиция, молекула нуклеиновой кислоты, вектор, указанный мутантный семафорин 3, его функциональный фрагмент и/или гибридный белок/полипептид могут использоваться в комбинации с другими терапевтическими агентами. Когда соединение согласно данному изобретению используется в комбинации со вторым терапевтическим агентом, активным в отношении того же заболевания, доза каждого соединения может отличаться от той дозы, которая используется при ведении соединения по отдельности. Комбинация соединения согласно данному изобретению со вторым терапевтическим агентом может содержать введение второго терапевтического агента с соединением согласно данному изобретению. Такое введение может содержать одновременное/сопутствующее введение. Тем не менее также предусматривается последовательное/раздельное введение, как объясняется ниже.

Предпочтительно, чтобы второй терапевтический агент, предназначенный для введения в комбинации с соединениями согласно данному изобретению, был противораковым лекарственным препаратом. Противораковый лекарственный препарат, который предназначен для введения в комбинации с фармацевтической композицией, молекулой нуклеиновой кислоты, вектором, мутантным семафорином 3, его функциональным фрагментом и/или гибридным белком/полипептидом согласно данному изобретению, может представлять собой: ингибитор ангиогенеза опухоли (например, ингибитор протеазы, ингибитор киназного рецептора эпидермального фактора роста или ингибитор киназного рецептора эндотелиального фактора роста); цитотоксический лекарственный препарат (например, антиметаболит, такой как антиметаболиты аналога пурина и пиримидина); антимитотический агент (например, препарат, стабилизирующий микротрубочки, или антимитотический алкалоид); координационный комплекс платины; противоопухолевый антибиотик; алкилирующий агент (например, азотистый иприт или нитрозомочевина); эндокринный агент (например, адренокортикостероид, андроген, антиандроген, эстроген, антиэстроген, ингибитор ароматазы, агонист гонадотропин-высвобождающего гормона или аналог соматостатина); или соединение, которое нацелено на фермент или рецептор, который сверхэкспрессируется и/или иным образом участвует в конкретном метаболическом пути, который неправильно регулируется в опухолевой клетке (например, ингибиторы фосфодиэстеразы для АТФ и ГТФ, ингибиторы гистондеацетилазы, ингибиторы протеинкиназы (такие как ингибиторы сериновой, треониновой и тирозиновой киназы (например, белковой тирозинкиназы Абелсона)) и различные факторы роста, их рецепторы и соответствующие ингибиторы киназ (такие как ингибиторы киназного рецептора эпидермального фактора роста, ингибиторы киназного рецептора эндотелиального фактора роста, ингибиторы фактора роста фибробластов, ингибиторы рецепторов инсулиноподобных факторов роста и ингибиторы киназного рецептора фактора роста тромбоцитов)); ингибиторы метионина, аминопептидазы, ингибиторы протеасомы, ингибиторы циклооксигеназы (например, ингибиторы циклооксигеназы-1 или циклооксигеназы-2) и ингибиторы топоизомеразы (например, ингибиторы топоизомеразы I или ингибиторы топоизомеразы II).

Алкилирующий агент, который может быть использован в качестве противоопухолевого лекарственного препарата в комбинации с фармацевтической композицией, нуклеиновой кислотой, вектором, мутантным семафорином 3, его функциональным фрагментом и/или гибридным бел ком/пол и пептидом согласно данному изобретению, может представлять собой, например, азотистый иприт (такой как циклофосфамид, мехлорэтамин (хлорметин), урамустин, мелфалан, хлорамбуцил, ифосфамид, бендамустин или трофосфамид), нитрозомочевину (такую как кармустин, стрептозоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, преднимустин, ранимустин или семустин), алкилсульфонат (такой как бусульфан, манносульфан или треосульфан), азиридин (такой как гексаметилмеламин (алтретамин), триэтиленмеламин, тиотепа (N,N'N'-триэтилентиофосфорамид), карбоквон или триазиквон), гидразин (такой как прокарбазин), триазен (такой как дакарбазин) или имидазотетразины (такие как темозоломид).

Координационный комплекс платины, который может быть использован в качестве противоракового лекарственного препарата в комбинации с фармацевтической композицией, молекулой нуклеиновой кислоты, вектором, мутантным семафорином 3, его функциональным фрагментом и/или гибридным белком/полипептидом согласно данному изобретению, может представлять собой, например, цисплатин, карбоплатин, недаплатин, оксалиплатин, сатраплатин или триплатин тетранитрат.

Цитотоксический лекарственный препарат, который может быть использован в качестве противоракового лекарственного препарата в комбинации с фармацевтической композицией, молекулой нуклеиновой кислоты, вектором, мутантным семафорином 3, его функциональным фрагментом и/или гибридным белком/полипептидом согласно данному изобретению, может представлять собой, например, антиметаболит, включая антиметаболиты-аналоги фолиевой кислоты (такие как аминоптерин, метотрексат, пеметрексед или ралтитрекс), пуриновые аналоги-антиметаболиты (такие как кладрибин, клофарабин, флударабин, 6-меркаптопурин (включая его пролекарственную форму азатиоприн), пентостатин или 6-тиогуанин) и пиримидининовые аналоги-антиметаболиты (такие как цитарабин, децитабин, 5-фторурацил (включая его пролекарственные формы капецитабин и тегафур), флоксуридин, гемцитабин, эноцитабин или сапацитабин).

Антимитотический агент, который может быть использован в качестве противоракового лекарственного препарата в комбинации с фармацевтической композицией, молекулой нуклеиновой кислоты, вектором, мутантным семафорином 3, его функциональным фрагментом и/или гибридным белком/полипептидом согласно данному изобретению, может представлять собой, например, таксан (например, доцетаксел, ларотаксел, ортатаксел, паклитаксел/таксол или тезетексел), алкалоид Винка (например, винбластин, винкристин, винфлунин, виндезин или винорелбин), эпотилон (такой как эпотилон А, эпотилон В, эпотилон С, эпотилон D, эпотилон Е или эпотилон F) или аналог эпотилона В (такой как иксабепилон/азаэпотилон В).

Противоопухолевый антибиотик, который может быть использован в качестве противоракового лекарственного препарата в комбинации с фармацевтической композицией, молекулой нуклеиновой кислоты, вектором, мутантным семафорином 3, его функциональным фрагментом и/или гибридным белком/полипептидом согласно данному изобретению, может представлять собой, например, антрациклин (такой как акларубицин, даунорубицин, доксорубицин, эпирубицин, идарубицин, амрубицин, пирарубицин, валрубицин или зорубицин), антрацендион (такой как митоксантрон или пиксантрон) или противоопухолевый антибиотик, выделенный из Streptomyces (такой как актиномицин (включая актиномицин D), блеомицин, митомицин (включая митомицин С) или пликамицин).

Ингибитор тирозинкиназы, который может быть использован в качестве противоракового лекарственного препарата в комбинации с фармацевтической композицией, молекулой нуклеиновой кислоты, вектором, мутантным семафорином 3, его функциональным фрагментом и/или гибридным белком/полипептидом согласно данному изобретению, может представлять собой, например, акситиниб, бозутиниб, седираниб, дазатиниб, эрлотиниб, гефитиниб, иматиниб, лапатиниб, лестауртиниб, нилотиниб, семаксаниб, сорафениб, сунитиниб или вандетаниб.

Ингибитор топоизомеразы, который может быть использован в качестве противоракового лекарственного препарата в комбинации с фармацевтической композицией, молекулой нуклеиновой кислоты, вектором, мутантным семафорином 3, его функциональным фрагментом и/или гибридным белком/полипептидом согласно данному изобретению, может представлять собой, например, ингибитор топоизомеразы I (такой как иринотекан, топотекан, камптотецин, белотекан, рубитекан или ламелларин D) или ингибитор топоизомеразы II (такой как амсакрин, этопозид, этопозид фосфат, тенипозид или доксорубицин).

Другие противораковые лекарственные препараты могут использоваться в комбинации с фармацевтической композицией, молекулой нуклеиновой кислоты, вектором, мутантным семафорином 3, его функциональным фрагментом и/или гибридным белком/полипептидом согласно данному изобретению. Противораковые лекарственные средства могут содержать биологические или химические молекулы, такие как связанный с TNF (от англ. tumor necrosis factor - фактор некроза опухоли) апоптоз-индуцирующий лиганд (TNF-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL), тамоксифен, амсакрин, бексаротен, эстрамустин, ирофулвен, трабектедин, цетуксимаб, панитумумаб, тозитумомаб, алемтузумаб, бевацизумаб, эдреколомаб, гемтузумаб, трастузумаб, пертузумаб, алвоцидиб, селициклиб, аминолевулиновая кислота, метиламинолевулинат, эфапроксирал, порфимер натрия, талапорфин, темопорфин, вертепорфин, алитретиноин, третиноин, анагрелид, триоксид мышьяка, атрасентан, бортезомиб, кармофур, целекоксиб, демеколцин, элескломол, элзамитруцин, этоглюцид, лонидамин, лукантон, масопрокол, митобронитол, митогуазон, митотан, облимерсен, омацетаксин, ситимаген, цераденовец, тегафур, тестолактон, тиазофурин, типифамиб и вориностат.

Также биологические лекарственные препараты, такие как антитела, фрагменты антител, конструкции антител (например, одноцепочечные конструкции) и/или модифицированные антитела (такие как CDR-привитые антитела, гуманизированные антитела, "полностью гуманизированные" антитела и т.д.), направленные против раковых или опухолевых маркеров/факторов/цитокинов, вовлеченных в пролиферативные заболевания, могут быть использованы в подходах комбинированной терапии с фармацевтической композицией, молекулой нуклеиновой кислоты, вектором, мутантным семафорином 3, его функциональным фрагментом и/или гибридным белком/полипептидом согласно данному изобретению. Примерами таких биологических молекул являются анти-HER2-антитела (например, трастузумаб, Herceptin®), анти-CD20-антитела (например, ритуксимаб, Rituxan®, MabThera®, Reditux®), анти-CD19/CD3-конструкции (см., например, ЕР-В1 1071752) и анти-TNF-антитела (см., например, Taylor PC. Antibody therapy for rheumatoid arthritis. Curr Opin Pharmacol. 2003. 3(3):323-328). Другие антитела, фрагменты антител, конструкции антител и/или модифицированные антитела, которые предназначены для использования в подходах комбинированной терапии с фармацевтической композицией, молекулой нуклеиновой кислоты, вектором, мутантным семафорином 3, его функциональным фрагментом и/или полипептидом согласно данному изобретению, можно найти в Taylor PC. Curr Opin Pharmacol. 2003. 3(3):323-328; Roxana A. Maedica. 2006. 1(1):63-65.

Комбинации, упомянутые выше, могут быть удобно представлены для применения в форме фармацевтического состава. Отдельные компоненты таких комбинаций могут вводиться либо последовательно, либо одновременно/сопутствующим образом в раздельных или комбинированных фармацевтических составах любым удобным путем. Когда введение является последовательным, сначала можно вводить либо фармацевтическую композицию, молекулу нуклеиновой кислоты, вектор, мутантный семафорин 3, его функциональный фрагмент и/или гибридный белок/полипептид согласно данному изобретению, либо второй терапевтический агент. Когда введение является одновременным, комбинацию можно вводить либо в одной той же, либо в разных фармацевтических композициях. При объединении в одном составе является понятным, что два соединения должны быть стабильными и совместимыми друг с другом и с другими компонентами состава. При сборе составов по отдельности они могут быть представлены в любом удобном составе.

Фармацевтическая композиция, молекула нуклеиновой кислоты, вектор, мутантный семафорин 3, его функциональный фрагмент и/или гибридный белок/полипептид также могут вводиться в сочетании с физической терапией, такой как лучевая терапия. Лучевая терапия может начинаться до, после или одновременно с введением соединений согласно данному изобретению. Например, лучевая терапия может начинаться через 1-10 минут, 1-10 часов или 24-72 часа после введения соединений. Тем не менее эти временные рамки не должны рассматриваться как ограничивающие. Субъект подвергается воздействию излучения, предпочтительно гамма-излучения, где излучение может быть доставлено в разовой дозе или в нескольких дозах, которые используют в течение нескольких часов, дней и/или недель. Гамма-излучение может быть доставлено в соответствии со стандартными радиотерапевтическими протоколами с использованием стандартных доз и режимов.

Таким образом, данное изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, мутантному семафорину 3, его функциональному фрагменту, гибридному белку или полипептиду и/или его фармацевтически приемлемой соли, сольвату или пролекарству или фармацевтической композиции, содержащей любой из вышеупомянутых веществ в сочетании с фармацевтически приемлемым эксципиентом, для применения в лечении или профилактике рака, в частности, для лечения или профилактики рака поджелудочной железы, где соединение или фармацевтическая композиция предназначена для введения в комбинации с противораковым лекарственным препаратом и/или в комбинации с лучевой терапией.

Другими словами, данное изобретение предусматривает молекулу нуклеиновой кислоты согласно данному изобретению, вектор согласно данному изобретению и/или мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент, гибридный белок согласно данному изобретению или полипептид согласно данному изобретению для применения в качестве лекарственного препарата. Кроме того, данное изобретение предусматривает молекулу нуклеиновой кислоты согласно данному изобретению, вектор согласно данному изобретению и/или мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент согласно данному изобретению или гибридный белок/полипептид согласно данному изобретению для применения в лечении ангиогенного нарушения, рака, опухолевого заболевания, сосудистой ретинопатии, изменений проницаемости гематоэнцефалического барьера, нейровоспалительных заболеваний, остеопороза, ожирения, микобактериальных инфекций и/или гранулем. Кроме того, данное изобретение предусматривает молекулу нуклеиновой кислоты согласно данному изобретению, вектор согласно данному изобретению и/или мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент согласно данному изобретению или гибридный белок/полипептид согласно данному изобретению для применения в лечении опухоли, где опухоль представляет собой солидную опухоль. Кроме того, данное изобретение предусматривает молекулу нуклеиновой кислоты согласно данному изобретению, вектор согласно данному изобретению и/или мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент согласно данному изобретению или гибридный белок/полипептид согласно данному изобретению для применения в лечении опухоли, выбранной из группы, состоящей из опухоли поджелудочной железы, рака шейки матки, рака молочной железы, рака толстой кишки, меланомы, рака предстательной железы, рака мочевого пузыря и рака языка. В частности, данное изобретение предусматривает молекулу нуклеиновой кислоты согласно данному изобретению, вектор согласно данному изобретению и/или мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент согласно данному изобретению или гибридный белок/полипептид согласно данному изобретению для применения в лечении рака поджелудочной железы. Кроме того, данное изобретение предусматривает молекулу нуклеиновой кислоты согласно данному изобретению, вектор согласно данному изобретению и/или мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент согласно данному изобретению или гибридный белок/полипептид согласно данному изобретению, где вовлечены нормализация сосудов, уменьшение роста опухоли, уменьшение метастатирования или увеличение продолжительности жизни.

Термин "ангиогенез" означает, что сосудистые ЕС прорастают из ранее существовавшего сосуда, и таким образом формируется капиллярный сосуд, который проходит в ткань. Формирующий процесс представляет собой расщепление сосудистой базальной мембраны протеазой, миграцию/рост сосудистых ЕС и формирование просвета. "Ангиогенное нарушение" представляет собой сосудистое заболевание, такое как артериальный склероз, гипертония, стенокардия, обструктивный артериосклероз, инфаркт миокарда, инфаркт головного мозга, диабетическая ангиопатия или сосудистая мальформация; воспалительное заболевание, такое как гепатит, пневмония, гломерулярный нефрит, тиреоидит, остеит, артроменингит, остеоклазия, хондролизис, ревматизм, бронхиальная астма, саркоидоз, синдром Кроу-Фуказе, паннус, аллергический отек, язвы, гидроперитонеум, перитонеальный склероз или тканевая конглютинация; энтоптическое неоваскулярное заболевание, такое как диабетическая ретинопатия, окклюзия ретинальной вены или возрастная дегенерация желтого пятна; заболевание репродуктивной системы, такое как дисфункция матки, дисфункция плаценты, гиперфункция яичников или фолликулярная киста; заболевание центральной нервной системы, такое как ретиноз, церебральная апоплексия, сосудистая деменция или болезнь Альцгеймера; рак, такой как солидный рак, ангиоматоз, гемангиоэндотелиома, саркомы, саркома Капоши или гематопоэтическая органическая язва.

"Рак" согласно данному изобретению относится к классу заболеваний или нарушений, характеризующихся неконтролируемым делением клеток и способностью их распространяться либо путем прямого роста в соседнюю ткань за счет инвазии, либо путем имплантации в отдаленные участки посредством метастазов, когда раковые клетки переносятся через кровоток или лимфатическую систему.

Опухолевое заболевание может быть любой формой рака, опухоли или может быть выбрано среди рака поджелудочной железы, рака молочной железы, рака эпителия, гепатоцеллюлярной карциномы, холангиоцеллюлярного рака, рака желудка, рака толстой кишки, рака предстательной железы, рака мочевого пузыря, рака языка, рака головы и шеи, рака кожи (меланомы), рака мочеполового тракта, например, рака яичников, рака эндометрия, рака шейки матки и рака почки; рака легкого, рака желудка, рака тонкого кишечника, рака печени, рака желчного пузыря, рака желчного протока, рака пищевода, рака слюнных желез или рака щитовидной железы.

Ингибитор ангиогенеза может быть использован в качестве профилактического или терапевтического агента при заболевании, состояние которого может стать серьезным из-за ангиогенеза при вышеуказанных заболеваниях. Заболевание, на которое действует ингибитор ангиогенеза, представляет собой сосудистое заболевание, воспалительное заболевание, энтоптическое неоваскулярное заболевание, заболевание репродуктивной системы, заболевание центральной нервной системы, рак и т.п. Форма состава с вектором согласно данному изобретению (агентом генной терапии) может быть одной из множества форм в соответствии с вышеприведенной каждой формой введения. Например, когда это инъекция, содержащая ДНК согласно данному изобретению, которая является активным ингредиентом, инъекцию можно приготовить обычным способом. Ингредиент-основа для агента генной терапии конкретным образом не ограничивается до тех пор, пока он является основным ингредиентом, обычно используемым для инъекций. Он представляет собой, например, дистиллированную воду, хлорид натрия, солевой раствор, такой как смесь хлорида натрия и минеральных солей, раствор, такой как маннит, лактоза, декстран или глюкоза, раствор аминокислот, таких как глицин или аргинин, или смесь раствора органической кислоты или раствора соли и раствора глюкозы. Инъекцию можно приготовить с вспомогательным агентом, таким как агент для коррекции осмотического давления, агент для коррекции pH, растительное масло, такое как кунжутное масло или соевое масло, поверхностно-активный агент, такой как лецитин, или неионный поверхностно-активный агент, и другими в соответствии с обычным способом, такими как раствор, суспензия или дисперсия. Инъекция, как указано выше, может представлять собой препарат, растворенный перед применением путем манипуляций, таких как дезинтеграция или лиофилизация.

Кроме того, данное изобретение предусматривает применение мутантного семафорина 3 или его функционального фрагмента, молекулы нуклеиновой кислоты, гибридного белка, полипептида или хозяина согласно данному изобретению.

Кроме того, данное изобретение относится к способу лечения ангиогенного нарушения и/или опухолевого заболевания и/или рака, включающему этап введения субъекту, нуждающемуся в таком лечении, фармацевтически активного количества молекулы нуклеиновой кислоты согласно данному изобретению или мутантного семафорина 3 или его функционального фрагмента согласно данному изобретению, гибридного белка, полипептида согласно данному изобретению, фармацевтической композиции согласно данному изобретению или полученной способом, описанным в данном документе.

Субъектом или пациентом, подлежащим лечению согласно данному изобретению, может быть животное, позвоночное животное, млекопитающее, грызун (например, морская свинка, хомяк, крыса, мышь), относящееся к мышиным (например, мышь), относящееся к псовым (например, собака), относящееся к кошачьим (например, кошка), относящееся к свиньям (например, свинья), относящееся к лошадиным (например, лошадь), примат, обезьяна (например, мартышка, бабуин или человекообразная обезьяна), человекообразная обезьяна (например, горилла, шимпанзе, орангутан, гиббон) или человек. В контексте данного изобретения особенно предполагается, что нужно лечить животных, которые являются экономически, агрономически или научно важными. Научно-важные организмы включают, но не ограничиваясь ими, мышей, крыс и кроликов. Низшие организмы, такие как, например, плодовые мушки, такие как Drosophila melanogaster, и нематоды, такие как Caenorhabditis elegan, также могут использоваться в научных подходах. Неограничивающими примерами агрономически важных животных являются овцы, крупный рогатый скот и свиньи, в то время как, например, кошки и собаки могут считаться экономически важными животными. Предпочтительно субъектом/пациентом является млекопитающее; более предпочтительно субъектом/пациентом является человек или другое млекопитающее (таким как, например, морская свинка, хомяк, крыса, мышь, кролик, собака, кошка, лошадь, обезьяна, человекообразная обезьяна, мартышка, бабуин, горилла, шимпанзе, орангутан, гиббон, овца, крупный рогатый скот или свинья); наиболее предпочтительно субъектом/пациентом является человек.

Фармацевтически эффективное количество может быть выше 10 мг/кг массы тела. Кроме того, фармацевтическое эффективное количество может быть ниже 0,5 мг/кг массы тела. В конкретных предпочтительных аспектах данное изобретение предусматривает способ лечения согласно данному изобретению, где фармацевтически эффективное количество составляет от 0,5 до 10 мг/кг массы тела.

Предполагается, что содержание ДНК в препарате различается в зависимости от заболевания, на которое нацелена терапия, места введения, числа доз, желаемой продолжительности терапии, возраста или массы тела пациента и т.п. и может быть соответствующим образом скорректировано. Обычно оно составляет примерно 0,01-2000 мг и предпочтительно 0,1-100 мг ДНК, кодирующей белок согласно данному изобретению, для одного пациента (масса тела составляет 60 кг).

Фармацевтическая композиция будет формироваться и дозироваться в соответствии с надлежащей медицинской практикой с учетом клинического состояния отдельного пациента, места доставки фармацевтической композиции, способа введения, планирования введения и других факторов, известных врачам.

Таким образом, "эффективное количество" фармацевтической композиции для целей в данном документе определяется такими соображениями.

Специалист в данной области знает, что эффективное количество фармацевтической композиции, вводимой индивидууму, будет, помимо прочего, зависеть от природы соединения.

Введение композиций, предусмотренных в данном документе, может, помимо прочего, включать введение два раза в день, каждый день, через день, каждый третий день, каждый четвертый день, каждый пятый день, один раз в неделю, один раз в две недели, один раз в три недели, один раз в месяц и т.д.

Например, если указанное соединение представляет собой (поли)пептид или белок, общее фармацевтически эффективное количество фармацевтической композиции, вводимой парентерально на одну дозу, будет находиться в диапазоне от примерно 1 мкг белка/кг/день до 15 мг белка/кг масса тела пациента/день, хотя, как отмечено выше, оно будет подлежать терапевтическому усмотрению. Более предпочтительно эта доза составляет по меньшей мере 0,01 мг белка/кг/день и наиболее предпочтительно для людей в диапазоне примерно 0,01-1 мг белка/кг/день. При непрерывном введении фармацевтическая композиция, как правило, вводится со скоростью дозирования от примерно 1 мг/кг/ч до примерно 50 мкг/кг/ч либо путем 1-4 инъекций в день, либо путем непрерывных подкожных инфузий, например, с использованием мини-насоса. Также можно использовать мешок с раствором для внутривенного введения. Продолжительность введения, необходимая для наблюдения изменений, и интервал после введения для получения ответа, по-видимому, изменяется в зависимости от желаемого эффекта. Конкретные количества можно определить с помощью стандартных анализов, которые хорошо известны специалистам в данной области.

Фармацевтические композиции согласно данному изобретению можно вводить парентерально, перорально, ректально, внутрицистернально, интравагинально, внутрибрюшинно, местно (в виде порошков, мазей, капель или трансдермального пластыря) или буккально. В конкретных предпочтительных воплощениях фармацевтическая композиция вводится парентерально.

Фармацевтические композиции согласно данному изобретению предпочтительно содержат фармацевтически приемлемый носитель. Под "фармацевтически приемлемым носителем" понимают вирус, нетоксичный твердый, полутвердый или жидкий наполнитель, разбавитель, инкапсулирующий материал или вспомогательный препарат любого типа. Используемый в данном документе термин "парентеральный" относится к способам введения, которые включают внутривенную, внутримышечную, внутрибрюшинную, интратрахеальную, интраназальную, внутригрудную, подкожную и внутрисуставную инъекцию и инфузию.

Фармацевтическая композиция также подходит для введения с помощью систем с замедленным высвобождением. Подходящие примеры композиций с замедленным высвобождением включают полупроницаемые полимерные матрицы в форме формованных изделий, например пленок или микрокапсул. Матрицы с замедленным высвобождением включают полилактиды (патент США №3777919, ЕР 58481), сополимеры L-глутаминовой кислоты и гамма-этил-L-глутамата (Sidman, U. et al., Biopolymers 22:547-556 (1983)), поли(2-гидроксизтилметакрилат) (R. Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 (1981) и R. Langer, Chem. Tech. 12:98-105 (1982)), этиленвинилацетат (R. Langer et al., Id.) или поли-D-(-)-3-гидроксимасляную кислоту (ЕР 133988). Фармацевтическая композиция с замедленным высвобождением также включает соединение, помещенное в липосомы. Липосомы, содержащие фармацевтическую композицию, получают известными способами: DE 3,218,121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82:3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77:4030-4034 (1980); EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; заявка на патент Японии 83-118008; патенты США №№4485045 и 4544545; и ЕР 102324. Как правило, липосомы являются небольшими (примерно 200-800 ангстрем) и относятся к однослойному типу, в котором содержание липидов превышает примерно 30 мольных процентов холестерина, при этом выбранная пропорция корректируется для оптимальной терапии.

Для парентерального введения фармацевтическую композицию готовят в основном путем смешивания ее с требуемой степенью чистоты в стандартной инъекционной дозе (раствор, суспензия или эмульсия) с фармацевтически приемлемым носителем, т.е. нетоксичным для реципиента в используемых дозировках и концентрациях и совместимым с другими ингредиентами cjcnfdf.

Как правило, составы получают путем равномерного и тщательного контактирования компонентов фармацевтической композиции с жидкими носителями, тонко измельченными твердыми носителями или и теми, и другими. Затем при необходимости продукт формуют в желаемый состав. Предпочтительно носитель представляет собой носитель для парентерального введения, более предпочтительно раствор, который является изотоническим крови реципиента. Примеры таких носителей включают воду, физиологический раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Для данного изобретения также пригодны неводные носители, такие как фиксированные масла и этилолеат, а также липосомы.

Носитель соответственно содержит незначительные количества добавок, таких как вещества, которые усиливают изотоничность и химическую стабильность. Такие материалы нетоксичны для реципиентов в используемых дозах и концентрациях и включают буферы, такие как фосфат, цитрат, сукцинат, уксусную кислоту и другие органические кислоты или их соли; антиоксиданты, такие как аскорбиновую кислоту; низкомолекулярные (менее десяти остатков) (поли)пептиды, например полиаргинин или трипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота или аргинин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая целлюлозу или ее производные, глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA); сахарные спирты, такие как маннит или сорбит; противоионы, такие как натрий; и/или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как полисорбаты, полоксамеры или ПЭГ (PEG).

Компоненты фармацевтической композиции, предназначенные для терапевтического введения, должны быть стерильными. Стерильность легко достигается путем фильтрации через стерилизующие фильтрующие мембраны (например, мембраны с размером пор 0,2 мкм). Терапевтические компоненты фармацевтической композиции, как правило, помещают в контейнер, имеющий стерильный порт доступа, например, в пакет для раствора для внутривенного введения или флакон с пробкой, прокалываемой иглой для подкожной инъекции.

Компоненты фармацевтической композиции, как правило, хранят в разовых или многодозовых контейнерах, например, в герметичных ампулах или флаконах, в виде водного раствора или в виде лиофилизированного состава для восстановления. В качестве примера лиофилизированного состава флаконы объемом 10 мл заполняют 5 мл 1% (мас./об.) стерильно профильтрованного раствора и полученную смесь лиофилизируют. Раствор для инфузии получают путем восстановления лиофилизированного соединения(й) с использованием бактериостатической воды для инъекций.

Данное изобретение также относится к набору, содержащему мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент, гибридный белок, молекулу нуклеиновой кислоты, антитело и/или фармацевтическую композицию, определенные в данном документе. Такой набор может быть использован, например, для лечения рака, опухоли и/или опухолевого заболевания, где указанный рак, опухоль, опухолевое заболевание представляет собой солидную опухоль, в частности, опухоль/рак поджелудочной железы.

Термин "молекула нуклеиновой кислоты" согласно данному изобретению содержит кодирующие и, где это применимо, некодирующие последовательности (такие как промоторы, энхансеры и т.д.).

Термины "полипептид", "(поли)пептид", "пептид" и "белок" используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся к полимеру из двух или более аминокислот, связанных через амидные связи, которые образуются между аминогруппой одной аминокислоты и карбоксильной группой другой аминокислоты. Аминокислоты, содержащиеся в пептиде или белке, которые также называются аминокислотными остатками, могут быть выбраны из 20 стандартных протеиногенных а-аминокислот (т.е. Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, He, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr и Val), а также из непротеиногенных и/или нестандартных α-аминокислот (таких как, например, орнитин, цитруллин, гомолизин, пирролизин или 4-гидроксипролин), а также β-аминокислот (например, β-аланина), γ-аминокислот и δ-аминокислот. Предпочтительно аминокислотные остатки, содержащиеся в пептиде или белке, выбраны среди α-аминокислот, более предпочтительно из 20 стандартных протеиногенных α-аминокислот (которые могут присутствовать в форме L-изомера или D-изомера и предпочтительно присутствуют в виде L-изомера). Пептид или белок может быть немодифицированным или может быть модифицирован, например, на его N-конце, на его С-конце и/или в функциональной группе боковой цепи любого из ее аминокислотных остатков (особенно в функциональной группе боковой цепи одного или более чем одного из остатков Lys, His, Ser, Thr, Tyr, Cys, Asp, Glu и/или Arg). Такие модификации могут включать, например, присоединение любой из защитных групп, описанных для соответствующих функциональных групп в: Wuts PG & Greene TW, Greene's protective groups inocganic synthesis, John Wiley & Sons, 2006. Такие модификации могут также включать ковалентное присоединение одной или более чем одной цепи полиэтиленгликоля (ПЭГ) (образуя ПЭГилированный пептид или белок), гликозилирование и/или ацилирование одной или более чем одной жирной кислотой (например, одной или более чем одной С_8-30-алкановой или алкеновой кислотами, образуя ацилированный жирной кислотой пептид или белок). Аминокислотные остатки, содержащиеся в пептиде или белке, могут, например, присутствовать в виде линейной молекулярной цепи (образуя линейный пептид или белок) или могут образовывать одно или более чем одно кольцо (соответствующее циклическому пептиду или белку). Пептид или белок также может формировать олигомеры, состоящие из двух или более идентичных или разных молекул. Используемый в данном документе термин "домен" относится к любой области/части аминокислотной последовательности, которая способна автономно принимать конкретную структуру и/или функцию. В контексте данного изобретения, соответственно, "домен" может представлять собой функциональный домен или структурный домен.

Термин "консенсусная последовательность" или "мотив консенсусной последовательности" представляет собой рассчитанный порядок наиболее часто встречающихся остатков, нуклеотидов или аминокислот, найденных в каждой позиции при выравнивании последовательности. Он представляет результаты множества выравниваний последовательностей, в которых родственные последовательности сравниваются друг с другом и рассчитываются подобные мотивы последовательностей.

Используемые в данном документе термины "содержащий" и "включающий" или их грамматические варианты должны приниматься как указывающие на приведенные признаки, целые числа, этапы или компоненты, но не исключающие добавления одного или более чем одного из дополнительных признаков, целых чисел, этапов, компонентов или их групп.Этот термин охватывает термины "состоящий из" и "состоящий в основном из".

Таким образом, термины "содержащий"/"включающий"/"имеющий" означают, что может присутствовать любой другой компонент (или, аналогично, признаки, целые числа, этапы и т.п.).

Термин "состоящий из" означает, что никакой другой компонент (или, аналогично, признак, целое число, этапо и т.п.) не присутствует.

Термин "состоящий в основном из" или его грамматические варианты при использовании в данном документе следует рассматривать как указывающие на приведенные признаки, целые числа, этапы или компоненты, но не исключающие добавления одного или более чем одного из дополнительных признаков, целых чисел, этапов, компонентов или их групп, но только в том случае, если дополнительные признаки, целые числа, этапы, компоненты или их группы существенно не изменяют основные и новые характеристики заявленной композиции, устройства или способа.

Таким образом, термин "состоящий в основном из" означает, что могут присутствовать конкретные дополнительные компоненты (или, аналогично, признаки, целые числа, этапы и т.п.), а именно те, которые не оказывают существенного влияния на основные характеристики композиции, устройства или способа. Другими словами, термин "состоящий в основном из" (который может быть взаимозаменяемо использован в данном документе с термином "содержащий по существу") позволяет присутствовать другим компонентам в композиции, устройстве или способе в дополнение к обязательным компонентам (или, аналогично, признакам, целым числам, этапам и т.п.), при условии, что присутствие других компонентов не оказывает существенного влияния на существенные характеристики устройства или способа.

Термин "способ" относится к способам, средствам, методикам и процедурам для выполнения данной задачи, включая, но не ограничиваясь ими, те способы, средства, методики и процедуры, которые известны или могут быть легко разработаны из известных способов, средств, методик и процедур специалистами в области химии, биологии и биофизики.

Термин "примерно" предпочтительно относится к плюс/минус 10% от указанного численного значения, более предпочтительно до плюс/минус 5% от указанного численного значения и, в частности, к точному указанному численному значению.

Используемый в данном документе термин "примерно" относится к плюс/минус 10% от указанного численного значения и, в частности, к плюс/минус 5% от указанного численного значения. Всякий раз, когда используется термин "примерно", также указывается конкретная ссылка на точное числовое значение. Если термин "примерно" используется в связи с параметром, который количественно определен в целых числах, например, число нуклеотидов в данной нуклеиновой кислоте, то числа, соответствующие плюс/минус 10% или плюс/минус 5% от указанного численного значения, должны быть округлены до ближайшего целого. Например, выражение "примерно 25 нуклеотидов" относится к диапазону от 23 до 28 нуклеотидов, в частности, к диапазону от 24 до 26 нуклеотидов, и предпочтительно относятся к конкретному значению 25 нуклеотидов.

Далее данное изобретение описано со ссылкой на следующие неограничивающие графические материалы и примеры. Если не указано иное, то использовались известные способы рекомбинантной генной технологии, описанные, например, в документе Sambrook, Russell "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001)), который включен в данный документ посредством ссылки во всей его полноте.

Используемый в данном документе термин "выделенный" относится к композиции, которая была извлечена из места ее локализации in vivo. Предпочтительно выделенные композиции или соединения согласно данному изобретению по существу не содержат других веществ (например, других белков или других соединений), которые присутствуют в местах их локализации in vivo (т.е. очищенные или полуочищенные композиции или соединения).

Данные определения и пояснения также применимы к этим пунктам и применяются с необходимыми изменениями. В соответствии с вышесказанным данное изобретение относится к следующим пунктам в некоторых воплощениях.

1. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, содержащий аминокислотную последовательность мутантного семафорина 3 или его функционального фрагмента, который функционирует в качестве ингибитора ангиогенеза, где аланин, соответствующий позиции 106 семафорина дикого типа 3А, показанного в SEQ ID NO 2, или аланин в позиции, которая при сравнении гомологии соответствует в других белках семафоринах 3 позиции 106 семафорина дикого типа 3А, показанного в SEQ ID NO 2, заменен гидрофильной аминокислотой, где указанный семафорин 3 выбран из группы семафорина 3А, семафорина 3В, семафорина 3С и семафорина 3D.

2. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 1, где указанный мутантный семафорин 3 или указанный его функциональный фрагмент функционирует как ингибитор ангиогенеза.

3. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 1 или п. 2, где указанный мутантный семафорин 3 или указанный функциональный его фрагмент содержит аминокислотную последовательность CX₁X₂A₃GKD, где

X₁ представляет собой K или N,

Х₂ представляет собой аминокислоту, выбранную среди W, М и L, и где аланин (А₃) заменен указанной гидрофильной аминокислотой.

4. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-3, которая выбрана из следующей группы:

(а) молекула нуклеиновой кислоты, выбранная среди SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 9 и SEQ ID NO 13,

где нуклеотиды GCT в позиции с 631 по 633 в SEQ ID NO 1 заменены нуклеотидами, кодирующими указанную гидрофильную аминокислоту,

где нуклеотиды GCA в позиции с 559 по 561 в SEQ ID NO 5 заменены нуклеотидами, кодирующими указанную гидрофильную аминокислоту,

где нуклеотиды GCT в позиции с 872 по 874 в SEQ ID NO 9 заменены нуклеотидами, кодирующими указанную гидрофильную аминокислоту, и

где нуклеотиды GCC в позиции с 398 по 400 в SEQ ID NO 13 заменены нуклеотидами, кодирующими указанную гидрофильную аминокислоту;

(b) молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, выбранный среди SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 10 и SEQ ID NO 14, где остаток аланина в позиции 106 в SEQ ID NO 2, в позиции 105 в SEQ ID NO 6, в позиции 104 в SEQ ID NO 10 или в позиции 120 в SEQ ID NO 14 заменен указанной гидрофильной аминокислотой;

(c) молекула нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в жестких условиях с комплементарной нитью молекулы нуклеиновой кислоты, определенной в (а) или (b);

(d) молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, который функционирует в качестве ингибитора ангиогенеза и обладает по меньшей мере 55% идентичностью с одним из полипептидов, определенных в (b); и

(e) молекула нуклеиновой кислоты, которая дегенерирована в результате генетического кода до нуклеотидной последовательности нуклеиновокислотной молекулы, определенной в одном из (a)-(d), где дегенерированная нуклеиновокислотная молекула кодирует полипептид, который функционирует в качестве ингибитора ангиогенеза.

5. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-4, где указанный мутантный семафорин 3 или указанный функциональный его фрагмент содержит указанную гидрофильную аминокислоту в позиции 106 в SEQ ID NO 2, в позиции 105 в SEQ ID NO 6, в позиции 104 в SEQ ID NO 10 или в позиции 120 bSEQ ID NO 14.

6. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-5, где указанный мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент содержит по меньшей мере одну дополнительную мутацию, выбранную из группы, состоящей из аминокислотной замены (замен), добавления(й), делеции(й) и дупликации(й).

7. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-6, где указанная гидрофильная аминокислота выбрана среди K, R, N, Q, S,T, Е, D и Н.

8. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 7, где указанная гидрофильная

аминокислота выбрана среди K, R, Е, D и Н.

9. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 7, где указанный остаток гидрофильной аминокислоты представляет собой K или R.

10. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 7, где указанный остаток гидрофильной аминокислоты представляет собой K.

11. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-10, где K закодирован кодоном AAG или AAA.

12. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-11, где указанный мутантный семафорин 3 или указанный функциональный его фрагмент представляет собой мутантный человеческий или мышиный семафорин 3 или его функциональный фрагмент.

13. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-12, где указанный мутантный семафорин 3 или указанный его функциональный фрагмент содержит одну или более чем одну из следующих последовательностей, определенных в любой из SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 27, SEQ ID NO 29, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 32, SEQ ID NO 33, SEQ ID NO 35, SEQ ID NO 36, SEQ ID NO 45, SEQ ID NO 46, SEQ ID NO 47 и SEQ ID NO 48.

14. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-13, где указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит:

(a) нуклеотиды с 601 по 1206 в SEQ ID NO 1, где нуклеотиды GCT в позиции с 631 по 633 в SEQ ID NO 1 заменены нуклеотидами, кодирующими гидрофильную аминокислоту;

(b) нуклеотиды с 529 по 1137 в SEQ ID NO 5, где нуклеотиды GCA в позиции с 559 по 561 в SEQ ID NO 5 заменены нуклеотидами, кодирующими гидрофильную аминокислоту;

(c) нуклеотиды с 842 по 1444 в SEQ ID NO 9, где нуклеотиды GCT в позиции с 872 по 874 в SEQ ID NO 9 заменены нуклеотидами, кодирующими гидрофильную аминокислоту; или

(d) нуклеотиды с 368 по 982 в SEQ ID NO 13, где нуклеотиды GCC в позиции с 398 по 400 в SEQ ID NO 13 заменены нуклеотидами, кодирующими гидрофильную аминокислоту.

15. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-14, где указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотиды с 601 по 1206 в SEQ ID NO 57; нуклеотиды с 529 по 1137 в SEQ ID NO 61; нуклеотиды с 842 по 1444 в SEQ ID NO 65; или нуклеотиды с 368 по 982 в SEQ ID NO 69.

16. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-15, где указанный мутантный семафорин 3 или указанный его функциональный фрагмент содержит аминокислотную последовательность, показанную в:

(a) SEQ ID NO 21, где остаток аланина, соответствующий позиции 106 в SEQ ID NO 2, заменен гидрофильной аминокислотой;

(b) SEQ ID NO 22, где остаток аланина, соответствующий позиции 105 в SEQ ID NO 6, заменен гидрофильной аминокислотой;

(c) SEQ ID NO 23 где остаток аланина, соответствующий позиции 104 в SEQ ID NO 10, заменен гидрофильной аминокислотой; или

(d) SEQ ID NO 24, где остаток аланина, соответствующий позиции 120 в SEQ ID NO 14, заменен гидрофильной аминокислотой.

17. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-16, где указанный мутантный семафорин 3 или указанный его функциональный фрагмент содержит аминокислотную последовательность, которая выбрана среди SEQ ID NO 49, SEQ ID NO 50, SEQ ID NO 51 и SEQ ID NO 52.

18. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1 по 17, где указанный полипептид представляет собой гибридный белок.

19. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 18, где указанный полипептид содержит указанный мутантный семафорин 3 или указанный его функциональный фрагмент, стабилизирующий домен и/или домен димеризации.

20. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 18 или п. 19, где указанный стабилизирующий домен представляет собой домен плексин-семафорин-интегрин (PSI), где указанный PSI-домен содержит одну или более чем одну из последовательностей: SEQ ID NO 45, SEQ ID NO 46, SEQ ID NO 47 или SEQ ID NO 48.

21. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп. 18-20, где указанный домен димеризации имеет константу диссоциации K_D в диапазоне от 10^-5 М до 10^-6 М с другим таким доменом димеризации.

22. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп. 18-21, где указанный домен димеризации выбран из группы С-концевого константного домена IgG, DARPin и лейциновой застежки.

23. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 22, где константный домен IgG представляет собой IgG1 или IgG3.

24. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-23, где указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит молекулу нуклеиновой кислоты, имеющую:

(a) последовательность нуклеиновой кислоты, которая простирается от нуклеотида 316 до 1959 в SEQ ID NO 1, и последовательность нуклеиновой кислоты, которая простирается от нуклеотида 295 до 990 в SEQ ID NO 37, где нуклеотиды GCT в позиции с 631 по 633 в SEQ ID NO 1 заменены нуклеотидами, кодирующими гидрофильную аминокислоту;

(b) последовательность нуклеиновой кислоты, которая простирается от нуклеотида 247 до 1887 в SEQ ID NO 5, и последовательность нуклеиновой кислоты, которая простирается от нуклеотида 295 до 990 в SEQ ID NO 37, где нуклеотиды GCA в позиции с 559 по 561 в SEQ ID NO 5 заменены нуклеотидами, кодирующими гидрофильную аминокислоту;

(c) последовательность нуклеиновой кислоты, которая простирается от нуклеотида 563 до 2197 в SEQ ID NO 9, и последовательность нуклеиновой кислоты, которая простирается от нуклеотида 295 до 990 в SEQ ID NO 37, где нуклеотиды GCT в позиции с 872 по 874 в SEQ ID NO 9 заменены нуклеотидами, кодирующими гидрофильную аминокислоту; или

(d) последовательность нуклеиновой кислоты, которая простирается от нуклеотида 41 до 1735 в SEQ ID NO 13, и последовательность нуклеиновой кислоты, которая простирается от нуклеотида 295 до 990 в SEQ ID NO 37, где нуклеотиды GCC в позиции с 398 до 400 в SEQ ID NO 13 заменены нуклеотидами, кодирующими гидрофильную аминокислоту.

25. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-24, где указанный полипептид содержит аминокислотную последовательность:

(a) которая простирается от аминокислотного остатка 1 до 548 в SEQ ID NO 2, и аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO 41, где остаток аланина в позиции 106 в SEQ ID NO 2 заменен гидрофильной аминокислотой;

(b) которая простирается от аминокислотного остатка 1 до 547 в SEQ ID NO 6, и аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO 41, где остаток аланина в позиции 105 в SEQ ID NO 6 заменен гидрофильной аминокислотой;

(c) которая простирается от аминокислотного остатка 1 до 565 в SEQ ID NO 10, и аминокислотную последовательность, показанную в

SEQ ID NO 41, где остаток аланина в позиции 104 в SEQ ID NO 10 заменен гидрофильной аминокислотой; или

(d) которая простирается от аминокислотного остатка 1 до 545 в SEQ ID NO 14, и аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO 41, где остаток аланина в позиции 120 в SEQ ID NO 14 заменен указанной гидрофильной аминокислотой.

26. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-25.

27. Вектор по п. 26, где указанный вектор представляет собой вектор, нацеленный на ген, или вектор, переносящий ген.

28. Вектор по п. 26 или п. 27, где указанный вектор представляет собой вектор на основе аденоассоциированного вируса (AAV).

29. Вектор по любому из пп. 26-28, где вектор на основе аденоассоциированного вируса представляет собой вектор AAV8.

30. Хозяин, трансформированный вектором по любому из пп. 26-29 или содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п. 1-22.

31. Хозяин по п. 30, который представляет собой клетку млекопитающего.

32. Хозяин по п. 30 или п. 31, где клетка млекопитающего представляет собой клетку HEK.

33. Хозяин по любому из пп. 30-32, где клетка HEK представляет собой клетку HEK293-EBNA1 или HEK293E.

34. Способ получения указанного полипептида, указанного мутантного семафорина 3 или его указанного функционального фрагмента, закодированного молекулой нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-25, где указанный способ содержит культивирование/выращивание хозяина по любому из пп. 30-33 и, возможно, выделение полученного полипептида.

35. Полипептид, который закодирован молекулой нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-25.

36. Мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент, где указанный мутантный семафорин 3 или указанный его функциональный фрагмент, который функционирует в качестве ингибитора ангиогенеза, содержит аминокислотную последовательность, где аланин, соответствующий позиции 106 семафорина дикого типа 3А, показанного в SEQ ID NO 2, или аланин, в позиции, которая соответствует в других белках семафоринах 3 при сравнении гомологии позиции 106 семафорина дикого типа 3А, показанного в SEQ ID NO 2, заменен гидрофильной аминокислотой, где указанный семафорин 3 выбран из группы семафорина 3А, семафорина 3В, семафорина 3С и семафорина 3D.

37. Мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент по п. 36, где указанный мутантный семафорин 3 или указанный его функциональный фрагмент функционирует в качестве ингибитора ангиогенеза.

38. Мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент по любому из пп. 36-37, где указанный мутантный семафорин 3 или указанный его функциональный фрагмент содержит аминокислотную последовательность CX₁X₂A₃GKD, где

X₁ представляет собой K или N,

Х₂ представляет собой аминокислоту, выбранную среди W, М и L и где аланин (А₃) заменен указанной гидрофильной аминокислотой.

39. Мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент по любому из пп. 36-38, где указанный мутантный семафорин 3 выбран из следующей группы:

(а) полипептид, закодированный молекулой нуклеиновой кислоты, выбранной среди SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 9 и SEQ ID NO 13,

где нуклеотиды GCT в позиции с 631 по 633 в SEQ ID NO 1 заменены нуклеотидами, кодирующими указанную гидрофильную аминокислоту,

где нуклеотиды GCA в позиции с 559 по 561 в SEQ ID NO 5 заменены нуклеотидами, кодирующими указанную гидрофильную аминокислоту,

где нуклеотиды GCT в позиции с 872 по 874 в SEQ ID NO 9 заменены нуклеотидами, кодирующими указанную гидрофильную аминокислоту, и

где нуклеотиды GCC в позиции с 398 по 400 в SEQ ID NO 13 заменены нуклеотидами, кодирующими указанную гидрофильную аминокислоту;

(b)полипептид, выбранный среди SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 10 и SEQ ID NO 14, где остаток аланина, соответствующий позиции 106 в SEQ ID NO 2, соответствующий позиции 105 в SEQ ID NO 6, соответствующий позиции 104 в SEQ ID NO 10 или соответствующий позиции 120 в SEQ ID NO 14, заменен указанной гидрофильной аминокислотой;

(c) полипептид, закодированный молекулой нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в жестких условиях с комплементарной нитью молекулы нуклеиновой кислоты, определенной в (а) или (с);

(d) полипептид, обладающий по меньшей мере 55% идентичностью с полипептидом по любому из (a)-(d) и функционирующий в качестве ингибитора ангиогенеза; и

(e) полипептид, который функционирует в качестве ингибитора ангиогенеза, содержащий аминокислотную последовательность, закодированную молекулой нуклеиновой кислоты, которая дегенерирована в результате генетического кода до нуклеотидной последовательности молекулы нуклеиновой кислоты, определенной в одном из (а), (с) и (d).

40. Мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент по любому из пп. 36-39, где указанный мутантный семафорин 3 или указанный его функциональный фрагмент содержит указанную гидрофильную аминокислоту в позиции 106 в SEQ ID NO 2, в позиции 105 в SEQ ID NO 6, в позиции 104 в SEQ ID NO 10 или в позиции 120 в SEQ ID NO 14.

41. Мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент по любому из пп. 36-40, где мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент содержит по меньшей мере одну дополнительную мутацию, выбранную из группы, состоящей из аминокислотной замены (замен), добавления(й), делеции(й) и дупликации(й).

42. Мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент по любому из пп. 36-41, где указанная гидрофильная аминокислота выбрана среди K, R, N, Q, S, T, Е, D и Н.

43. Мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент по п. 42, где указанная гидрофильная аминокислота выбрана среди K, R, Е, D и Н.

44. Мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент по п. 42, где указанная гидрофильная аминокислота представляет собой K или R.

45. Мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент по п. 42, где указанная гидрофильная аминокислота представляет собой K.

46. Мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент по любому из пп. 36-45, где указанный мутантный семафорин 3 или указанный его функциональный фрагмент представляет собой мутантный человеческий или мышиный семафорин 3 или его функциональный фрагмент.

47. Мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент по любому из пп. 36-46, где указанный мутантный семафорин 3 или указанный его функциональный фрагмент содержит одну или более чем одну из следующих последовательностей, определенных в любой из SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 27, SEQ ID NO 29, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 32, SEQ ID NO 33, SEQ ID NO 35.SEQ ID NO 36, SEQ ID NO 45, SEQ ID NO 46, SEQ ID NO 47 и SEQ ID NO 48.

48. Мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент по любому из пп. 36-47, где указанный мутантный семафорин 3 или указанный его функциональный фрагмент закодирован молекулой нуклеиновой кислоты содержащей:

(a) нуклеотиды с 601 по 1206 в SEQ ID NO 1, где нуклеотиды GCT в позиции с 631 по 633 в SEQ ID NO 1 заменены нуклеотидами, кодирующими гидрофильную аминокислоту;

(b) нуклеотиды с 529 по 1137 в SEQ ID NO 5, где нуклеотиды GCA в позиции от 559 по 561 в SEQ ID NO 5 заменены нуклеотидами, кодирующими гидрофильную аминокислоту;

(с)нуклеотиды с 842 по 1444 в SEQ ID NO 9, где нуклеотиды GCT в позиции от 872 по 874 в SEQ ID NO 9 заменены нуклеотидами, кодирующими гидрофильную аминокислоту; или

(d) нуклеотиды с 368 по 982 в SEQ ID NO 13, где нуклеотиды GCC в позиции с 398 по 400 в SEQ ID NO 13 заменены нуклеотидами, кодирующими гидрофильную аминокислоту.

49. Мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент по любому из пп. 36-48, где указанный мутантный семафорин 3 или указанный его функциональный фрагмент закодирован молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотиды с 601 по 1206 в SEQ ID NO 57; нуклеотиды с 529 по 1137 в SEQ ID NO 61; нуклеотиды с 842 по 1444 в SEQ ID NO 65; или нуклеотиды с 368 по 982 в SEQ ID NO 69.

50. Мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент по любому из пп. 36-49, где указанный мутантный семафорин 3 или указанный его функциональный фрагмент содержит аминокислотную последовательность, показанную в:

(a) SEQ ID NO 21, где остаток аланина, соответствующий позиции 106 в SEQ ID NO 2, заменен гидрофильной аминокислотой;

(b) SEQ ID NO 22, где остаток аланина, соответствующий позиции 105 в SEQ ID NO 6, заменен гидрофильной аминокислотой;

(c) SEQ ID NO 23, где остаток аланина, соответствующий позиции 104 в SEQ ID NO 10, заменен гидрофильной аминокислотой; или

(d) SEQ ID NO 24, где остаток аланина, соответствующий позиции 120 в SEQ ID NO 14, заменен гидрофильной аминокислотой.

51. Мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент по любому из пп. 36-50, где указанный мутантный семафорин 3 или указанный его функциональный фрагмент содержит аминокислотную последовательность, которая выбрана среди SEQ ID NO 49, SEQ ID NO 50, SEQ ID NO 51 и SEQ ID NO 52.

52. Полипептид, который содержит мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент по любому из пп. 36-51.

53. Полипептид по п. 52, который представляет собой гибридный белок.

54. Полипептид по п. 52 или п. 53, который содержит указанный мутантный семафорин 3 или указанный его функциональный фрагмент, стабилизирующий домен и/или домен димеризации.

55. Полипептид по любому из пп. 52-54, где указанный стабилизирующий домен представляет собой домен плексин-семафорин-интегрин (PSI), где указанный PSI-домен содержит одну или более чем одну из последовательностей SEQ ID NO 45, SEQ ID NO 46, SEQ ID NO 47 или SEQ ID NO 48.

56. Полипептид по любому из пп. 52-55, где указанный домен димеризации имеет константу диссоциации K_D в диапазоне от 10^-5 М до 10^-6 М с другим таким доменом димеризации.

57. Полипептид по любому из пп. 52-56, где указанный домен димеризации выбран из группы С-концевого константного домена IgG, DARPin и лейциновой застежки.

58. Полипептид по п. 57, где константный домен IgG представляет собой IgG1 или IgG3.

59. Полипептид по любому из пп. 52-58, где указанный полипептид закодирован молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую:

(а) последовательность нуклеиновой кислоты, которая простирается от нуклеотида 316 до 1959 в SEQ ID NO 1, и

последовательность нуклеиновой кислоты, которая простирается от нуклеотида 295 до 990 в SEQ ID NO 37, где нуклеотиды GCT в позиции с 631 по 633 в SEQ ID NO 1 заменены нуклеотидами, кодирующими гидрофильную аминокислоту;

(b) последовательность нуклеиновой кислоты, которая простирается от нуклеотида 247 до 1887 в SEQ ID NO 5, и последовательность нуклеиновой кислоты, которая простирается от нуклеотида 295 до 990 в SEQ ID NO 37, где нуклеотиды GCA в позиции с 559 по 561 в SEQ ID NO 5 заменены нуклеотидами, кодирующими гидрофильную аминокислоту;

(c) последовательность нуклеиновой кислоты, которая простирается от нуклеотида 563 до 2197 в SEQ ID NO 9, и последовательность нуклеиновой кислоты, которая простирается от нуклеотида 295 до 990 в SEQ ID NO 37, где нуклеотиды GCT в позиции с 872 по 874 в SEQ ID NO 9 заменены нуклеотидами, кодирующими гидрофильную аминокислоту; или

(d) последовательность нуклеиновой кислоты, которая простирается от нуклеотида 41 до 1735 в SEQ ID NO 13, и последовательность нуклеиновой кислоты, которая простирается от нуклеотида 295 до 990 в SEQ ID NO 37, где нуклеотиды GCC в позиции с 398 по 400 в SEQ ID NO 13 заменены нуклеотидами, кодирующими гидрофильную аминокислоту.

60. Полипептид по любому из пп. 52-59, где указанный полипептид содержит аминокислотную последовательность:

(a) которая простирается от аминокислотного остатка 1 до 548 в SEQ ID NO 2, и аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO 41, где остаток аланина в позиции 106 в SEQ ID NO 2 заменен гидрофильной аминокислотой;

(b) которая простирается от аминокислотного остатка 1 до 547 в SEQ ID NO 6, и аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO 41, где остаток аланина в позиции 105 в SEQ ID NO 6 заменен гидрофильной аминокислотой;

(c) которая простирается от аминокислотного остатка 1 до 565 в SEQ ID NO 10, и аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO 41, где остаток аланина в позиции 104 в SEQ ID NO 10 заменен гидрофильной аминокислотой; или

(d) которая простирается от аминокислотного остатка 1 до 545 в SEQ ID NO 14, и аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO 41, где остаток аланина в позиции 120 в SEQ ID NO 14 заменен указанной гидрофильной аминокислотой.

61. Антитело, которое специфически связывается с мутантным семафорином 3 или его функциональным фрагментом по любому из пп. 36-51, где указанное антитело специфически связывается с эпитопом, содержащим гидрофильную аминокислоту, которая заменяет аланин, соответствующий позиции 106 семафорина дикого типа 3А, показанного в SEQ ID NO 2, или аланин в позиции, которая соответствует в других белках семафоринах 3 при сравнении гомологии позиции 106 семафорина дикого типа 3А, показанного в SEQ ID NO 2, заменен гидрофильной аминокислотой, где указанный семафорин 3 выбран из группы семафорина 3А, семафорина 3В, семафорина 3С и емафорина 3D.

62. Фармацевтическая композиция, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-25 или мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент по любому из пп. 36-51 или полипептид по любому из пп. 52-60, возможно, содержащая фармацевтический эксципиент.

63. Фармацевтическая композиция по п. 62, где указанная композиция содержит мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент по любому из пп. 36-51 или полипептид по любому из пп. 52-60, возможно, содержащая фармацевтический эксципиент.

64. Фармацевтическая композиция по п. 62 или п. 63, где фармацевтический эксципиент представляет собой фармацевтический носитель, который является вирусом.

65. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 62-64, где указанный вирус представляет собой аденоассоциированный вирус (AAV).

66. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 62-65, где аденоассоциированный вирус представляет собой AAV8.

67. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-25, вектор по любому из пп. 26 или 29, мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент по любому из пп. 36-51, полипептид по любому из пп. 52-60 или фармацевтическая композиция по любому из пп. 62-66 для применения в качестве лекарственного препарата.

68. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-25, вектор по любому из пп. 26 или 29, мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент по любому из пп. 36-51, полипептид по любому из пп. 52-60 или фармацевтическая композиция по любому из пп. 62-66 для применения в лечении ангиогенного нарушения, рака, опухоли, опухолевого заболевания, сосудистой ретинопатии, изменений проницаемости гематоэнцефалического барьера, нейровоспалительного заболевания, остеопороза, ожирения, микобактериальной инфекции и/или гранулемы.

69. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-25 для применения по п. 68, вектор по любому из пп. 26 или 29 для применения по п. 68, мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент по любому из пп. 36-51 для применения по п. 68, полипептид по любому из пп. 52-60 для применения по п. 68 или фармацевтическая композиция по любому из пп. 62-66 для применения по п. 68, где опухоль представляет собой солидную опухоль.

70. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-25 для применения по п. 68 или п. 69, вектор по любому из пп. 26 или 29 для применения по п. 68 или п. 69, мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент по любому из пп. 36-51 для применения по п. 68 или п. 69, полипептид по любому из пп. 52-60 для применения по п. 68 или п. 69 или фармацевтическая композиция по любому из пп. 62-66 для применения по п. 68 или п. 69, где опухоль представляет собой опухоль поджелудочной железы.

71. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-25 для применения по любому из пп. 68-70, вектор по любому из пп. 26 или 29 для применения по любому из пп. 68-70, мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент по любому из пп. 36-51 для применения по любому из пп. 68-70, полипептид по любому из пп. 52-60 для применения по любому из пп. 68-70 или фармацевтическая композиция по любому из пп. 62-66 для применения по любому из пп. 68-70, где рак выбран из группы, состоящей из рака поджелудочной железы, рака шейки матки, рака молочной железы, рака толстой кишки, меланомы, рака предстательной железы, рака мочевого пузыря и рака языка.

72. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-25 для применения по любому из пп. 68-71, вектор по любому из пп. 26 или 29 для применения по любому из пп. 68-71, мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент по любому из пп. 36-51 для применения по любому из пп. 68-71, полипептид по любому из пп. 52-60 для применения по любому из пп. 68-71 или фармацевтическая композиция по любому из пп. 62-66 для применения по любому из пп. 68-71, где вовлечена нормализация сосудов, уменьшение роста опухоли, уменьшение метастазирования или увеличение продолжительности жизни.

73. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-25 для применения по любому из пп. 68-72, вектор по любому из пп. 26 или 29 для применения по п. 68, мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент по любому из пп. 36-51 для применения по любому из пп. 68-72, полипептид по любому из пп. 52-60 для применения по любому из пп. 68-72 или фармацевтическая композиция по любому из пп. 62-66 для применения по любому из пп. 68-72, где указанная молекула нуклеиновой кислоты, указанный вектор, указанный мутантный семафорин 3, указанный его функциональный фрагмент, указанный полипептид или указанная фармацевтическая композиция предназначена для введения в комбинации с антипролиферативным лекарственным препаратом, противораковым лекарственным препаратом, цитостатическим лекарственным препаратом, цитотоксическим лекарственным препаратом и/или лучевой терапией.

74. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-25 для применения по любому из пп. 68-72, вектор по любому из пп. 26 или 29 для применения по п. 68, мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент по любому из пп. 36-51 для применения по любому из пп. 68-72, полипептид по любому из пп. 52-60 для применения по любому из пп. 68-72 или фармацевтическая композиция по любому из пп. 62-66 для применения по любому из пп. 68-72, где указанная молекула нуклеиновой кислоты, указанный вектор, указанный мутантный семафорин 3, указанный его функциональный фрагмент, указанный полипептид или указанная фармацевтическая композиция предназначены для парентерального введения.

75. Применение мутантного семафорина 3 или его функционального фрагмента, закодированного молекулой нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-25, или мутантного семафорина 3 или его функционального фрагмента по любому из пп. 36-51, или полипептида по любому из пп. 52-60, или хозяина по любому из пп. 30-33.

76. Способ лечения ангиогенного нарушения, опухолевого заболевания и/или рака, содержащий этап введения субъекту, нуждающемуся в таком лечении, фармацевтически эффективного количества молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-23, или мутантного семафорина 3 или его функционального фрагмента по любому из пп. 36-51, полипептида по любому из пп. 52-60, фармацевтической композиции по любому из пп. 62-68 или полученной способом по п. 34.

77. Способ лечения по п. 76, где субъектом является человек.

78. Способ лечения по п. 76 или п. 77, где фармацевтически эффективное количество находится в диапазоне от 0,5 до 10 мг/кг массы тела.

Далее данное изобретение описано со ссылкой на следующие неограничивающие графические материалы и примеры.

Если не указано иное, то использовались стандартные способы рекомбинантной генной технологии, описанные, например, в документе Sambrook, Russell "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001)), который включен в данный документ посредством ссылки во всей его полноте.

Графические материалы показывают:

Фиг. 1. Сигнальный комплекс Sema3A-Nrp1-ruieKCHHA4. Sema3A характеризуется наличием sema-домена на его NH₂-конце, за которым следует домен PSI, lg-подобный домен и дополнительный короткий С-концевой основной участок (b). Внеклеточная группировка Nrp1 содержит два повторяющихся комплементарно-связывающих домена (домены а1-а2), два домена типа коагуляционного фактора (домены b1-b2) и домен гомологии околомембранный меприн/А5/мю-фосфатаза (МАМ; с). Плексин А4 характеризуется внеклеточным sema-доменом, за которым следуют множественные домены PSI и домены IPT (интегрин-плексин-транскрипционный фактор), а внутриклеточно демонстрирует наполовину расщепленный домен GAP. С-концевой основной участок Sema3A связывает с высокой аффинностью (двойная стрелка с черными границами) b1-домен Nrp1, который действует как корецептор, который сохраняет димерный Sema3A близко к плексину А4. Без привязки к конкретной теории предполагается, что Sema3A управляет димеризацией и активацией плексина А4 через очень низкую аффинность взаимодействие "sema-домен - sema-домен" (двойные стрелки с серыми границами), что приводит к ингибированию ГТФ-загрузки R-Ras и Rap1 и к фосфорилированию ERK 1/2.

Фиг. 2. Схематическое представление белковых конструкций Sema3A. Изображены представители мутантов Sema3A: (А) домен Sema3A, содержащий мутацию A106K с дополнительным доменом PSI или без него или с доменом, который может стабилизировать структуру функционального sema-домена (домен-стабилизатор), или без него; (В) Sema3A A106K ΔIg-b; (С) Sema3A ΔIg-b; и (D) полноразмерный SEMA3A WT (R&D Systems).

Фиг. 3. Выравнивание аминокислотных последовательностей мышиных Sema3A, Sema3B, Sema3C, Sema3D, Sema3E, Sema3F и Sema3G. Белковые последовательности мышиных Sema3A, Sema3B, Sema3C, Sema3D, Sema3E, Sema3F и Sema3G и человеческих SEMA3A, SEMA3B, SEMA3C и SEMA3D изображены в однобуквенном аминокислотном коде. (А) Пептидный мотив CX₁X₂A₃GKD выделен (жирным шрифтом). (В) Выделены жирным шрифтом три мотива консенсусной последовательности, которые, как ожидается, позволят обеспечить сильное взаимодействие sema-домена с sema-доменом плексинов. (С) Один мотив консенсусной последовательности выделен жирным шрифтом в домене PSI. Консервативность обозначается символами консенсуса ClustalW: звездочка (*) обозначает позиции, которые имеют единственный, полностью консервативный остаток; двоеточие (:) указывает на консервативность между группами с сильно похожими свойствами - оценка > 0,5 в матрице Gonnet РАМ 250; точка (.) указывает на консервативность между группами со слабо похожими свойствами - оценка = <0,5 в матрице Gonnet РАМ 250.

Фиг. 4. Анализ семафорина 3 и мутантных белков семафоринов 3, связывающих рецепторы плексин типа А и Nrp1. (А) кДНК щелочной фосфатазы (alkaline phosphatase, АР) и полноразмерного Sema3A дикого типа (WT), мутантного Sema3A ΔIg-b или мутантного Sema3A A106K ΔIg-b сливали, получая соответствующие АР-конъюгированные лиганды Sema3A. В анализе связывания in situ клетки COS-7 трансфицировали различными кандидатными рецепторами. Связывание лиганда с клетками, экспрессирующими специфические рецепторы, обнаруживали с помощью фосфатазного субстрата, нитросинего тетразолия. (B-D) Кривые связывания (В, D) и анализ Scatchard (С) связывания плексина А4 (В, С) или Nrp1 (D) при различных концентрациях лигандов (В, С, Sema3A A106K ΔIg-b; D, Sema3A WT) независимо количественно оценивали путем спектрометрии хромогенного превращения субстрата АР пара-нитрофенилфосфата. (Е). Оцененные аффинности Sema3A WT, Sema3A ΔIg-b и Sema3A A106K ΔIg-b для рецептора плексина А4. Кривые связывания лиганда АР-конъюгированного Sema3A WT, мутантного Sema3A ΔIg-b или мутантного Sema3A A106K ΔIg-b с клетками COS-7, экспрессирующими рецептор плексин А4, независимо количественно оценивали путем спектрометрии хромогенного превращения субстрата АР пара-нитрофенилфосфата. Связывание Sema3A WT, мутантного Sema3A ΔIg-b или мутантного Sema3A A106K ΔIg-b с плексином А4, соответственно, отображает рассчитанная константа диссоцияции K_d 7 нМ, 200 нМ и 0,7 нМ. (F). В анализе связывания in situ клетки COS-7 трансфицировали различными рецепторами плексинами типа А или зеленым флуоресцентным белком (пустой контроль) с контрольной целью. Связывание человеческого Fc-меченного SEMA3B ΔIg-b, SEMA3B A105K ΔIg-b и SEMA3A A106K ΔIg-b с клетками, экспрессирующими различные рецепторы плексины типа А, обнаруживали в иммуноцитохимии с помощью конъюгированного с щелочной фосфатазой (АР) козлиного вторичного антитела против человеческого Fc IgG. В качестве субстрата АР использовали комбинацию нитросинего тетразолия хлорида (NBT) и 5-бром-4-хлор-3'-индофосфатной соли пара-толуидина (BCIP) с получением нерастворимого продукта черно-фиолетового цвета в местах, где АР-конъюгированное козлиное вторичное антитело против человеческого IgG Fc связывалось с человеческими Fc-меченными рекомбинантными белками SEMA3.

Фиг. 5. Очистка Fc-меченных Sema3A ΔIg-b и Sema3A A106K ΔIg-b рекомбинантных белков. Белки продуцировали в человеческих клетках HEK 293, очищали от супернатанта на сефарозе с белком А, элюировали и анализировали с помощью 4-12% геля NuPAGE в невосстанавливающих или восстанавливающих условиях. Дорожки: 1) маркеры молекулярных весов; 2) клеточная культуральная среда Fc-меченного Sema3A ΔIg-b; 3) несвязанный белок А; 4) фракция 1 Fc-меченного Sema3A ΔIg-b; 5) фракция 2 Fc-меченного Sema3A ΔIg-b; 6) фракция 3 Fc-меченного Sema3A ΔIg-b; 7) клеточная культуральная среда Fc-меченного Sema3A A106K ΔIg-b; 8) несвязанный белок А; 9) фракция 1 Fc-меченного Sema3A A106K ΔIg-b; 10) фракция 2 Fc-меченного Sema3A A106K ΔIg-b; 11) фракция 3 Fc-меченного Sema3A A106K ΔIg-b; 12) пулы фракций 1, 2 и 3 Fc-меченного Sema3A ΔIg-b; 13) пулы фракций 1, 2 и 3 Fc-меченного Sema3A ΔIg-b (восстанавливающие условия); 14) пулы фракций 1, 2 и 3 Fc-меченного Sema3A A106K ΔIg-b; 15) пулы фракций 1, 2 и 3 Fc-меченного Sema3A A106K ΔIg-b (восстанавливающие условия). В невосстанавливающих условиях как Fc-меченный Sema3A ΔIg-b, так и Fc-меченный Sema3A A106K ΔIg-b появляются в виде димера с молекулярной массой примерно 200 кДа без продуктов деградации.

Фиг. 6. Fc-меченный Sema3A A106K ΔIg-b более эффективен, чем коммерчески доступный Fc-меченный SEMA3A WT, в ингибировании направленной миграции ЕС. Направленную миграцию ЕС в направлении коллагена I типа (1 мкг/мл) анализировали в режиме реального времени. (А-С) Миграцию ЕС отслеживали в течение 4-часового периода в CIM-планшетах 16 платформы системы xCelligence либо в отсутствие (контроль, черная сплошная линия), либо в присутствии 0,2 нМ (А), 0,9 нМ (В) и 3,5 нМ (С) Fc-меченного SEMA3A WT (серая сплошная линия) или Fc-меченного Sema3A ΔIg-b (черная пунктирная линия) или Fc-меченного Sema3A A106K ΔIg-b (черная прерывистая линия). Каждая кривая представляет собой среднее значение четырех технических повторов ±SD. Статистический анализ: результаты анализировали с помощью двухстороннего t-теста Стьюдента случайных величин; * Fc-меченный Sema3A A106K ΔIg-b по сравнению с Fc-меченным SEMA3A WT; # Fc-меченный Sema3A A106K ΔIg-b по сравнению с Fc-меченным Sema3A ΔIg-b; *, # р<0,05, **, ## р<0,01, ***, ### р<0,001. (D, Е). Контрольные молчащие (D) или плексин А4-молчащие (Е) ЕС оставляли мигрировать в течение 2 часов и полупериода либо в отсутствие (контроль, черная сплошная линия), либо в присутствии 1,8 нМ Fc-меченного Sema3A A106K ΔIg-b (черная пунктирная линия); *, р<0,05; **, р<0,01; *** р<0,001.

Фиг. 7. Человеческий Fc-меченный белок SEMA3A A106K ΔIg-b является более эффективным, чем коммерчески доступный Fc-меченный SEMA3A WT, в ингибировании направленной миграции ЕС. Направленную миграцию ЕС в направлении коллагена I типа (1 мкг/мл) анализировали в режиме реального времени. Миграцию ЕС отслеживали в течение 4-часового периода в CIM-планшетах 16 платформы системы xCelligence либо в отсутствие (контроль, черная сплошная линия), либо в присутствии (А) эквимолярных (0,9 нМ) количеств коммерческого Fc-меченного SEMA3A WT (серая сплошная линия) или Fc-меченного человеческого Sema3A A106K ΔIg-b (черная прерывистая линия); (В) 3,5 нМ коммерческого Fc-меченного SEMA3A WT (серая сплошная линия) или 0,2 нМ Fc-меченного человеческого SEMA3A A106K ΔIg-b (черная прерывистая линия). Каждая кривая представляет собой среднее значение четырех технических повторов ±SD. Статистический анализ: результаты анализировали с помощью двухстороннего t-теста Стьюдента случайных величин; * Fc-меченный SEMA3A A106K ΔIg-b по сравнению с Fc-меченным SEMA3A WT; *, р<0,05; **, р<0,01; ***, р<0,001.

Фиг. 8. Fc-меченный белок Sema3A A106K ΔIg-b намного эффективнее коммерчески доступного Fc-меченного SEMA3A WT в выявлении биохимического сигналинга в ЕС. (А) Анализ преципитации (пулдаун) активного Rap1 ГТФ в клетках ЕС, которые обрабатывали или не обрабатывали в течение 1 минуты 0,02 нМ Fc-меченным SEMA3A WT, Sema3A ΔIg-b или Sema3A A106K ΔIg-b. Общее количество Rap1, обнаруженное во входных фракциях, использовали для вычисления нормированной оптической плотности (normalized optical density, N.O.D.) активного Rap1. (В) Анализ вестерн-блот активированной фосфо-ERK1/2 в клетках ЕС, которые обрабатывали или не обрабатывали в течение 15 минут 0,2 нМ Fc-меченным SEMA3A WT или Sema3A ΔIg-b или Sema3A A106K ΔIg-b. Анализ вестерн-блот общей ERK1/2 использовали для расчета N.O.D. активной ERK 1/2. Показаны три репрезентативных независимых анализа с аналогичными результатами. Полосы оценивали количественно и вычисляли N.O.D. относительно контроля (значения представляют собой среднее ±SD, n=3 отдельных анализа). Статистический анализ: результаты анализировали с помощью двухстороннего t-теста Стьюдента случайных величин; * р<0,05, ** р<0,01, *** р<0,001.

Фиг. 9. Sema3A A106K ΔIg-b ухудшает ангиогенез и нормализует сосудистую сеть раковых опухолей у мышей RIP-Tag2. Иммунофлуоресцентный анализ раковых тканей от контрольных мышей и мышей, получавших Sema3A A106K ΔIg-b, проводили так, как было описано. Конфокальные изображения представляют 7 мышей на каждую группу и пять полей на каждую раковую опухоль. (А) Для окрашивания сосудистых ЕС использовали анти-Меса32-антитело (зеленый). Sema3A A106K ΔIg-b значительно уменьшал площадь кровеносных сосудов на 51%. (В) Для обнаружения перицитов (красный) использовали антитело против а-гладкомышечного актина (ASMA) в комбинации с анти-Меса32-антителом (зеленый). Sema3A A106K ΔIg-b значительно увеличивал число перицитов кровеносных сосудов. (С) У контрольных мышей и мышей, получавших Sema3A A106K ΔIg-b, проводили перфузию сердца с FITC-лектином (зеленый), и затем раковые ткани окрашивали анти-Меса32-антителом (красный). В то время как контрольные раковые опухоли демонстрировали слабо перфузированную сосудистую сеть, Sema3A A106K ΔIg-b усиливал перфузию кровеносных сосудов раковых опухолей. (D) Sema3A A106K ΔIg-b эффективно ингибировал гипоксию раковой опухоли, что обнаруживали путем введения мышам пимонидазола перед умерщвлением (Maione et al., 2012).

Фиг. 10. Полноразмерный SEMA3A WT в AAV8 ингибирует рост раковой опухоли и формирование метастазов на мышиной модели PDAC. Полноразмерный SEMA3A WT трансдуцировали в поджелудочные железы мышей PDAC путем AAV-8-опосредованного переноса соматических генов, как было описано ранее (Maione et al., 2009, 2012). AAV8-LacZ трансдуцировали в качестве контроля. Через три недели мышей, которых подвергли генной терапии SEMA3A WT, умерщвляли и анализировали. AAV8-SEMA3A WT уменьшал объем раковой опухоли на 52% (А) и уменьшал частоту метастазов в печень на 59% (В). Число мышей на группу (n=10). Статистический анализ: использовали тест Манна-Уитни, ** р<0,01.

Фиг.11. Sema3A A106K ΔIg-b ингибирует рост раковой опухоли, уменьшает формирование метастазов и увеличивает покрытие кровеносных сосудов перицитами на мышиной модели PDAC. (А, В). Мышам PDAC с раковыми опухолями вводили 3 мг/кг (внутрибрюшинно) Sema3A A106K ΔIg-b в течение трех недель. Sema3A A106K ΔIg-b уменьшает объем раковой опухоли на 64% (А) и ингибирует появление метастазов в печени на 81% (В); число мышей на группу (n=10); статистический анализ: использовали тест Манна-Уитни, ** р<0,01, *** р<0,001. (С) Конфокальные изображения иммунофлуоресцентного анализа тканей раковых опухолей от мышей, получавших Sema3A A106K ΔIg-b и контроль, окрашенных анти-NG2-антителом (красный, для мечения перицитов) и анти-Меса32-антителом (зеленый). Sema3A A106K ΔIg-b значительно увеличивал число сосудистых перицитов по сравнению с контролями. Изображения представляют 7 мышей на каждую группу и пять полей на каждую раковую опухоль.

Фиг. 12. Sema3F A106K не увеличивает ингибирование миграции эндотелиальных клеток. Направленную миграцию ЕС в направлении коллагена I типа (1 мкг/мл) анализировали в режиме реального времени. Миграцию ЕС отслеживали в течение 4-часового периода в CIM-планшетах 16 платформы системы xCelligence либо в отсутствие (контроль, черная сплошная линия), либо в присутствии 3,5 нМ Fc-меченного Sema3F ΔIg-b (черная пунктирная линия) или Fc-меченного Sema3F S107K ΔIg-b (прерывистая линия). Каждая кривая представляет собой среднее значение четырех технических повторов ±SD. Статистический анализ: результаты анализировали с помощью двухстороннего t-теста Стьюдента случайных величин; * Fc-меченный Sema3F ΔIg-b по сравнению с контролем; *, р<0,05; **, р<0,01; *** р<0,001.

Фиг. 13. Fc-меченный Sema3A A106K ΔIg-b более эффективен, чем коммерчески доступные Fc-меченные SEMA3E и SEMA3F, в ингибировании направленной миграции ЕС. Направленную миграцию ЕС в направлении коллагена I типа (1 мкг/мл) анализировали в режиме реального времени. (А-В) Миграцию ЕС отслеживали в течение 4-часового периода в CIM-планшетах 16 платформы системы xCelligence либо в отсутствие (контроль, черная сплошная линия), либо в присутствии эквимолярных количеств Fc-меченного Sema3A A106K ΔIg-b (А-В, черная прерывистая линия) или коммерчески доступного Fc-меченного человеческого SEMA3E WT (черная пунктирная линия) или коммерчески доступного Fc-меченного Sema3F WT (серая сплошная линия). Каждая кривая представляет собой среднее значение четырех технических повторов ±SD. Статистический анализ: результаты анализировали с помощью двухстороннего t-теста Стьюдента случайных величин; * Fc-меченный Sema3A A106K ΔIg-b по сравнению с Fc-меченным SEMA3E WT или Fc-меченным Sema3F WT; *, р<0,05, **, р<0,01, ***, р<0,001.

Следующие примеры без связывания иллюстрируют данное изобретение.

Пример 1 - Sema3A A106K ΔIg-b является специфически связывающей молекулой, мощным активатором плексина А4 и ингибитором гаптотактической миграции ЕС

Материалы и методы

Анализ клеточного связывания и анализ Scatchard

Анализы связывания in situ выполняли с модификацией протокола, описанного ранее (Tamagnone et al 1999). В частности, клетки COS7, трансфицированные конструкциями кДНК, экспрессирующие различные рецепторы семафоринов, высевали в лунки 48-луночных кластерных планшетов. Затем их инкубировали в течение 1 часа при 37°С в полной среде, содержащей молекулы рекомбинантного семафорина, слитого с секретируемой плацентарной щелочной фосфатазой (например, Sema3A-AP). После пяти промываний клетки фиксировали, нагревали в течение 10 минут при 65°С для инактивации эндогенных фосфатаз и инкубировали с субстратом NBT-BCIP (нитросиний тетразолий-5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат) (Promega, кат. № S3771) для окрашивания клеток in situ. Для количественной оценки связывания лиганда клетки, экспрессирующие рецептор, инкубировали с увеличивающимися концентрациями АР-конъюгированных лигандов (с заданной удельной активностью/мкг); связанную с клеткой АР-активность наконец обнаруживали путем инкубации с хромогенным растворимым субстратом пара-нитрофенилфосфатом (Sigma-Aldrich, кат. № Р7998) и измеряли с помощью многолуночного спектрофотометра (поглощение при 405 нм). Анализ графиков Scatchard выполняли с использованием Prism 6 (GraphPad Software Inc.).

Анализы гаптотактической миграции эндотелиальных клеток

Направленную миграцию человеческих ЕС пупочной вены контролировали в режиме реального времени с помощью xCELLigence (Acea Biosciences Inc.), системы на основе электрического импеданса, в которой микроэлектронные сенсорные чипы интегрированы в лунки микропланшета. Основанная на импедансе система xCelligence основана на использовании прибора Real-Time Cell Analyzer (RTCA).

Ядром инструмента является Е-планшет. Е-планшеты 16 являются одноразовыми планшетами, и каждая отдельная лунка на Е-планшете 16 имеет встроенный сенсорный электродный чип, который позволяет постоянно контролировать клетки в лунке. Настройка файла эксперимента происходит с помощью программного обеспечения RTCA 1.2: это программное обеспечение преобразует значения импеданса для получения таких параметров как: клеточный индекс (cell index, CI), средние значения, максимальные и минимальные значения, стандартное отклонение (SD), концентрация половины максимальной эффективности (ЕС₅₀), концентрация половины максимального ингибирования (IC₅₀). Затем данные, выраженные в единицах CI, могут быть экспортированы для любого типа математического и статистического анализа.

В этом анализе мы отслеживали направленную миграцию ЕС в режиме реального времени с использованием CIM-планшета 16 инструмента xCELLigence RTCA DP. Нижнюю сторону верхней камеры (сторона, обращенная к нижней камере) CIM-планшета покрывали 30 мкл коллагена I типа (1 мкг/мл) в течение 30 минут в боксе для культивирования тканей. Каждую лунку нижней камеры сначала заполняли 160 мкл бессывороточной среды М199 (содержащей или не содержащей Sema3A), а затем собирали с верхней камерой. Собранный планшет инкубировали при 37°С в течение одного часа для уравновешивания (в каждую лунку верхней камеры добавляли 30 мкл бессывороточной среды). ЕС отделяли и ресуспендировали до конечной концентрации 30000 клеток/100 мкл. Начинали с этапа BLANCK для измерения фонового импеданса клеточной культуральной среды, который затем использовали в качестве референсного импеданса для вычисления значений CI. Затем в каждую лунку верхней камеры добавляли 100 мкл клеточной суспензии (30000 клеток). CIM-планшет 16 помещали в прибор RTCA DP, уравновешенный в CO₂-инкубаторе. Миграцию ЕС постоянно контролировали с помощью инструмента RTCA DP.

Для статистической оценки результаты анализировали с помощью двухстороннего t-теста Стьюдента случайных величин. На основании данных CI, экспортированных из инструмента RTCA, рассчитывали среднее стандартное отклонение и значение р для технических повторов каждого экспериментального условия за это время. Данные миграции представлены в процентах относительно контрольных образцов 100%.

Анализ преципитации Rap1-ГТФ

ЕС сначала содержали в обедненной среде в течение 3 часов, а затем к ним вносили или не вносили 0,02 нМ SEMA3A на 1 минуту при 37°С. Затем активный Rap1-ГТФ преципитировали на гибридном белке глутатион-S-трансферазы и Rap1-связывающего домена (RBD) человеческого стимулятора диссоциации гуанинового нуклеотида Ra1 (Ra1GDS), выделенного с помощью глутатион-агарозной смолы. Мы провели анализ преципитации активного Rap1 в соответствии с инструкцией производителя и набором для обнаружения (Thermo Scientific, кат. № продукта 16120). Для определения нормированной оптической плотности (normalized optical density, N.O.D.) активного Rap1-ГТФ использовали общий Rap1, обнаруженный во входных фракциях. Показан результат трех независимых анализов преципитации с подобными результатами. Полосы оценивали количественно и вычисляли N.O.D. относительно контроля (значения представляют собой среднее ±SD, n=3 отдельных анализа). Для статистической оценки результаты анализировали с помощью двухстороннего t-теста Стьюдента случайных величин.

Фосфорилирование ERK 1/2

ЕС сначала содержали в обедненной среде в течение 3 часов, а затем к ним вносили или не вносили SEMA3A [0,225 нМ] на 15 минут при 37°С.Мы лизировали клетки и проводили анализ белка путем вестрен-блота с антителами против фосфо-ERK 1/2 [мышиное антитело против фосфо-р44/42 МАРК (ERK1/2; Thr202Tyr204) (клон Е10); разведение 1:1000; Cell Signaling Technology, кат.№продукта 9106], и с антителами против тотальной ERK [кроличье антитело против р44/42 МАРК (ERK1/2) (клон 137F5); разведение 1:1000; Cell Signaling Technology, кат.№продукта 4695]. Общее количество белка определяли с использованием реагента для анализа белка бицинхониновой кислоты (bicinchoninic acid, ВСА) (Thermo Scientific). Эквивалентные количества белка разделяли в SDS-PAGE с помощью готового геля Bolt 4-12% Bis-Tris gel (Invitrogen). Затем белки переносили в Trans-Blot Turbo™ Mini Nitrocellulose Transfer (Biorad), метили либо козлиным вторичным антителом против кроличьего IgG (H+L), конъюгированным с HRP (Invitrogen, кат. №65-6120), либо козлиным вторичным антителом против мышиного IgG (H+L), конъюгированным с HRP (Jackson ImmunoResearch Inc. кат. №11-035-062), и обнаруживали с помощью усовершенствованной методики хемилюминесценции (Western Lightning Plus-ECL, Enhanced Chemiluminescence Substrate; Perkin Elmer, кат. №NEL105001EA). Общую ERK1/2, обнаруженную во входных фракциях, использовали для расчета N.O.D. фосфо-ERK1/2. Показан результат трех независимых анализов преципитации с подобными результатами. Полосы оценивали количественно и вычисляли N.O.D. относительно контроля (значения представляют собой среднее ±SD, n=3 отдельных анализа). Для статистической оценки результаты анализировали с помощью двухстороннего t-теста Стьюдента случайных величин.

Человеческие и мышиные белки семафорины 3 являются консервативными белками. Человеческий семафорин 3А, показанный в SEQ ID NO 1, по меньшей мере на 52% гомологичен/идентичен человеческому семафорину 3В, показанному в SEQ ID NO 5. Кроме того, человеческий семафорин 3А, показанный в SEQ ID NO 1, по меньшей мере на 45% гомологичен/идентичен человеческому семафорину ЗС, показанному в SEQ ID NO 9. Кроме того, человеческий семафорин 3А, показанный в SEQ ID NO 1, по меньшей мере на 53% гомологичен/идентичен человеческому семафорину 3D, показанному в SEQ ID NO 13. Кроме того, мышиный семафорин 3А, показанный в SEQ ID NO 3, по меньшей мере на 53% гомологичен/идентичен человеческому или мышиному семафорину 3А, показанному в SEQ ID NO 13 или SEQ ID NO 15. Кроме того, мышиный семафорин 3А, показанный в SEQ ID NO 3, по меньшей мере на 45% гомологичен/идентичен мышиному семафорину 3С, показанному в SEQ ID NO 11.

Результаты

Мы разработали стратегию создания нового, легко очищаемого и парентерально доставляемого мутантного синтетического белка, полученного из Sema3A WT. Этот мутант должен обладать следующими признаками: i) не способен связываться с Nrp1; ii) не имеет сайта расщепления фуриновой протеазой; iii) является стабильно димерным; и iv) способен связываться с плексинами с высокой аффинностью. Таким образом, был создан новый рекомбинантный мутантный мышиный белок Sema3A. Этот иллюстративный мутант Sema3A был разработан в формате гибридного белка. Этот мутантный семафорин 3А обладает признаками, обобщенными в таблице 2, и обозначается как Sema3A A106K ΔIg-b (таблица 2 и фиг. 2). Иллюстративные аминокислотные последовательности проиллюстрированы в SEQ ID NO 18 или 20. Кроме того, также были получены соответствующие гибридные белки мутантного семафорина 3В, С и D. Эти мутанты в данном документе обозначаются как Sema3B A105K-Fc, Sema3C A104K-Fc и Sema3D A120K-Fc (показаны в SEQ ID NO 76, 78 или 79, соответственно). Мутант семафорина 3А, сохраняющий аланин в позиции 106, но имеющий ту же архитектуру, что и Sema3A A106K ΔIg-b, обозначен как Sema3A ΔIg-b, молекула нуклеиновой кислоты такой молекулы приведена в SEQ ID NO 43 или 44 (человеческий и мышиный Sema3A ΔIg-b, соответственно).

Мутант Sema3A A106K ΔIg-b характеризуется следующими особенностями и преимуществами:

1) связывание Nrp1 и расщепляемая фурином lg-подобная/основная область Sema3A WT (например, аминокислоты 549-772) удалены;

2) оставшаяся область домена Sema-PSI (например, аминокислоты 1-548) мутантного мышиного Sema3A слита на своем С-конце с константным фрагментом IgG1 (например, мышиным) (Fc, образованным шарнирной областью, СН2 и СН3), чтобы индуцировать димеризацию. Fc IgG1 допускает легкую и крупномасштабную очистку мутантного белка Sema3A на сефарозе с белком А;

3) остаток AIa₁₀₆ в Sema3A WT замещен Lys (A106K), что наделяет мутантную форму высокой аффинностью (K_d=0,7 нМ) к плексину типа А плексину А4.

Мутантный и семафорин дикого типа 3А, В, С, D, Е и F получали с использованием стандартной очистки белка. В частности, человеческий и мышиный Fc-меченный Sema3A A106K ΔIg-b (приведенный в SEQ ID NO 18 или 20, соответственно), а также мышиный Fc-меченный Sema3A ΔIg-b получали с использованием стандартной очистки белка на заказ. Полноразмерный SEMA3A WT был приобретен у R&D Systems Inc., Миннеаполис, Миннесота; кат.№1250-S3-025. кДНК, кодирующая Sema3A A106K ΔIg-b, обозначенная как SEQ ID NO 19, была получена путем синтеза гена (GeneArt® Gene Synthesis, Life-Technologies/Thermo Fisher Scientific Inc.).

Затем кДНК, кодирующую Sema3A A106K ΔIg-b (SEQ ID NO 19), субклонировали в экспрессионный вектор pUPE. Затем препаратом трансфекционной маркировки экспрессионного вектора pUPE, несущего кДНК, кодирующую Sema3A A106K ΔIg-b (Sema3A A106K ΔIg-b pUPE), временно трансфицировали суспензионно растущую клеточную линию НЕК293, стабильно экспрессирующую ядерный антиген-1 вируса Эпштейна-Барр (HEK293-EBNA1 или 293Е), т.е. клеточную линию, которая наиболее часто используется для крупномасштабных трансфекций. Через неделю среду суспензионных культур Sema3A A106K ΔIg-b pUPE HEK293E собирали путем центрифугирования. Гибридные белки порциями связывали на сефарозе с белком А. Гранулы собирали и переносили в колонну с гравитационным потоком. Специфически связанные белки удаляли промыванием колонки фосфатным буферным раствором (phosphate buffered saline, PBS). Связанные гибридные белки элюировали с использованием 20 мМ цитрата, 150 мМ NaCl, рН 2,7, и 0,9 мл фракций собирали в пробирки Эппендорф, содержащие 0,1 мл 1 М KH₂PO₄/K₂HPO₄, рН 8,0, для нейтрализации.

Чтобы определить функцию мутации A106K в Sema3A, был получен рекомбинантный белок Sema3A ΔIg-b. Sema3A ΔIg-b не обладал Ig-подобной/основной областью, но сохранял остаток AIa₁₀₆ дикого типа (фиг. 2). Биохимическую и биологическую активность мутантов Sema3A ΔIg-b и Sema3A A106K ΔIg-b сравнивали с биохимической активностью коммерчески доступного полноразмерного SEMA3A WT (от R&D Systems Inc., Миннеаполис, Миннесота; кат. №1250-S3-025).

Анализ связывания "лиганд - рецептор" in situ (Flanagan et al., 2000; Tamagnone et al., 1999) подтвердил, что конъюгированный с щелочной фосфатазой (АР) Sema3A WT взаимодействует с Nrp1 в клетках COS. Тем не менее, мутанты Sema3A ΔIg-b и Sema3A A106K ΔIg-b не взаимодействовали с Nrp1 (фиг. 4А).

Белки семафорины являются лигандами, которые передают сигнал через плексины (Kumanogoh and Kikutani, 2013; Tamagnone et al., 1999). Таким образом, была проверена способность этих конструкций напрямую связываться с членами семейства плексина. Важно отметить, что Sema3A A106K ΔIg-b связывался с плексином А4 с более высокой аффинностью по сравнению с Sema3A WT или мутантом Sema3A ΔIg-b (фиг.4А и В). Аффинность связывания Sema3A A106K ΔIg-b с плексином А4 была увеличена до K_d 0,7 нМ, что оценивали по графику анализа Scatchard (фиг. 4С). Для сравнения K_d связывания Sema3A WT с Nrp1 составляла 1,1 нМ (фиг. 4D), что согласуется с предыдущими данными (Takahashi et al., 1999). Кроме того, ни один другой плексин типа А не обнаруживал связывания с Sema3A A106K ΔIg-b (фиг. 4А). Соответственно, связывание Sema3A A106K ΔIg-b было очень специфичным для плексина А4. Наконец, анализы связывания лигандов позволили оценить диапазон аффинности Sema3A WT, Sema3A ΔIg-b и Sema3A A106K ΔIg-b для рецептора плексина А4 и показать, как связывание Sema3A WT, мутантного Sema3A ΔIg-b или мутантного Sema3A A106K ΔIg-b с плексином А4, соответственно, отображает рассчитанный K_d 7 нМ, 200 нМ и 0,7 нМ (фиг.4Е). Кроме того, анализировали аффинность связывания мутантного семафорина 3В с плексинами (фиг. 4F). Например, иллюстративный Sema3B A105K-Fc продемонстрировал высокоаффинное связывание с плексином А2. Семафорин 3В, который имеет тот же дизайн конструкции, что и Sema3B A105K-Fc, но не имеет мутации аланина с заменой на лизин в позиции 105 (SEMA3B ΔIg-b), не показал увеличения связывания по сравнению с мутантной версией. Как описано выше, сильное взаимодействие белков семафоринов 3 с их рецептором плексином имеет важное значение для активации рецептора и передачи сигнала семафорина 3. Таким образом, эти данные свидетельствуют о том, что мутантные семафорины 3А, В, С и D могут быть использованы в улучшенной терапии против ангиогенеза и/или против васкулогенеза. Дальнейший анализ в in vitro, а также в in vivo системах представлен в данном документе для мутантного семафорина 3А.

Для оценки гаптотактической миграции эндотелиальных клеток пупочной вены человека (human umbilical vein endothelial cells, HUVEC, или EC) в направлении белков ECM мы получали и очищали Fc-меченные белки Sema3A ΔIg-b и Sema3A A106K ΔIg-b (фиг. 2, 3, 5). Эквимолярные количества Fc-меченных белков Sema3A ΔIg-b, Sema3A A106K ΔIg-b и SEMA3A WT сравнивали в отношении ингибирования гаптотактической миграции ЕС в направлении белков ЕСМ, таких как коллаген типа I, в платформе системы xCelligence (Acea Biosciences Inc., Сан-Диего, Калифорния) (фиг. 6). В ингибировании направленной миграции ЕС Fc-меченный Sema3A A106K ΔIg-b всегда был намного эффективнее, чем Fc-меченный Sema3A ΔIg-b или коммерческий Fc-меченный SEMA3A WT в широком диапазоне концентраций (0,2-3,5 нМ) (фиг. 6А-С). Как показано в таблице 3, в то время как мышиный Fc-меченный Sema3A A106K ΔIg-b ингибировал направленную миграцию ЕС на 36-45%, коммерческий Fc-меченный SEMA3A WT и мышиный Fc-меченный Sema3A A106K ΔIg-b нарушали подвижность ЕС только на 23-25% и 19-24%, соответственно. Кроме того, эксперименты с молчанием гена плексина А4 увеличивали миграцию ЕС в ответ на Sema3A A106K ΔIg-b до контрольных уровней. Соответственно, ингибирующая активность Fc-меченного Sema3A A106K ΔIg-b в отношении гаптотаксиса ЕС зависит от плексина А4 (фиг. 6D, Е), что согласуется с его профилем связывания с рецептором плексином типа А (фиг. 4А).

Мы создали и проанализировали человеческий Fc-меченный SEMA3A A106K ΔIg-b, биологическая активность которого по существу накладывалась на биологическую активность его мышиного аналога (фиг. 7). Как было показано в таблице 4, в то время как максимальная (3,5 нМ) доза коммерческого человеческого Fc-меченного SEMA3A WT ингибировала направленную миграцию ЕС на 20%, в 17,5 раз меньшая доза (0,2 нМ) человеческого Fc-меченного SEMA3A A106K ΔIg-b ингибировала подвижность ЕС на 46%. Более того, димеризация SEMA3A A106K, индуцированная Fc-меткой, еще больше увеличивала ингибирование направленной миграции ЕС (данные не показаны).

Sema3F обладает полярной аминокислотой, т.е. серином (Ser₁₀₇), в позиции, которая соответствует при сравнении гомологии позиции 106 Sema3A. Это контрастирует с Sema3A, Sema3B, Sema3C и Sema3D, которые содержат гидрофобный аланин в соответствующей позиции. Поэтому для контрольных целей мы исследовали, приводит ли мутация полярного Ser₁₀₇ с заменой на положительно заряженный Lys (Sema3F S107K) к значительному увеличению аффинности Sema3F в отношении плексина(ов) и к способности ингибировать миграцию ЕС в направлении белков ЕСМ. С помощью анализов связывания "лиганд - рецептор" in situ в клетках COS мы обнаружили, что АР-конъюгированные мутанты Sema3F ΔIg-b и Sema3F S107K ΔIg-b не связываются с высокой аффинностью с каким-либо из членов семейства плексинов типа А, В, С или D. Соответственно, мы наблюдали, как способность эквимолярных (3,5 нМ) количеств Sema3F ΔIg-b и Sema3F S107K ΔIg-b ингибировать миграцию ЕС в направлении белков ЕСМ в значительной степени накладывается (фиг. 12). Аналогично, SEMA3A A106K ΔIg-b демонстрировал повышенное ингибирование направленной миграции ЕС по сравнению с Fc-меченными SEMA 3Е (R&D Systems) или Sema 3F (R&D Systems) (фиг. 13). Анализ миграции ЕС проводили с эквимолярными количествами белка, соответственно. Поэтому без привязки к конкретной теории мы пришли к выводу, что синтетическое введение положительно заряженных аминокислот в белки Sema3 более вероятно увеличивает их аффинность к рецептору(ам) плексину и хеморегуляторную активность, если замещенная аминокислота является гидрофобной, например, как в случае Sema3A А106. Другими словами, описанное в данном документе искусственное введение гидрофильной аминокислоты в контексте Sema 3А, В, С или D увеличивает антиангиогенные и/или антиваскулогенные свойства.

Чтобы проанализировать влияние конструкций Sema3A на дальнейший сигналинг, были выполнены анализы преципитации партнеров, связывающих Sema3A. Fc-меченный Sema3A A106K ΔIg-b был значительно более мощным, чем Fc-меченный Sema3A ΔIg-b и коммерческий Fc-меченный SEMA3A WT, в ингибировании ГТФ-загрузки малой ГТФазы Rap1 (фиг. 8А), а также в инициировании фосфорилирования киназы ERK 1/2 (фиг. 8В). В частности, коммерческий Fc-меченный SEMA3A WT, Fc-меченный Sema3A ΔIg-b и Fc-меченный Sema3A A106K ΔIg-b, соответственно: i) ингибировал ГТФ-загрузку Rap1 на 42%, 44% и 65%; ii) активировал фосфорилирование ERK 1/2 в 1,95 раза, в 2,3 раза и в 3,9 раза.

Таким образом, можно сделать вывод, что новый Fc-меченный мутант Sema3A A106K ΔIg-b) связывался специфически с высокой аффинностью с рецептором плексином А4; ii) был намного более мощным активатором передачи сигналов от плексина; iii) был намного более сильным ингибитором функции ЕС; iv) не взаимодействовал с Nrp1; и v) не мог быть расщеплен.

Это позволяет получить Sema3A A106K ΔIg-b в виде специфической связывающей молекулы, мощного активатора плексина А4 и ингибитора гаптотактической миграции ЕС.

Пример 2 - Sema3A A106K ΔIg-b эффективно ингибирует рост раковой опухоли и метастазирование при раке поджелудочной железы

Учитывая настоящие данные in vitro и доклинический опыт использования мышиной модели спонтанного нейроэндокринного рака поджелудочной железы (RIP-Tag2) (Maione et al., 2012; Maione et al., 2009), способность широкого диапазона [0,5-5 мг/кг/мышь, доставляется либо посредством осмотического мини-насоса, либо внутрибрюшинно (i.p.) в течение 4 недель] Fc-меченного Sema3A ΔIg-b и Sema3A A106K ΔIg-b останавливать прогрессирование рака и увеличивать выживаемость мышей RIP-Tag2 оценивали по меньшей мере до возраста 16 недель, как мы ранее делали посредством переноса гена аденоассоциированным вирусом (AAV)-8 (Maione et al., 2012; Maione et al., 2009)). Мы обнаружили, что никакая доза Sema3A ΔIg-b, доставляемая каким-либо терапевтическим способом, не могла увеличить выживаемость мышей RIP-Tag2, как это делал полноразмерный Sema3A в AAV-8 (Maione et al., 2012; Maione et al., 2009). Напротив, Sema3A A106K ΔIg-b демонстрировал активность в отношении увеличения выживаемости, подобную полноразмерному Sema3A в AAV-8, таким образом показывая, как повышенная активность связывания плексина А4 наделяла Sema3A A106K ΔIg-b мощным Nrp1-независимым противораковым эффектом. В частности, доставка 3 мг/кг Sema3A A106K ΔIg-b в соответствии с данным изобретением путем внутрибрюшинной инъекции три раза в неделю была наиболее эффективным и нетоксичным терапевтическим режимом для снижения прогрессирования рака, нормализации сосудистой сети раковой опухоли и увеличения выживаемости мышей RIP-Tag2. Фактически, по сравнению с контролем, когда мышам вводили физиологический раствор, один месяц введения мышам RIP-Tag2 препарата Sema3A A106K ΔIg-b (3 мг/кг внутрибрюшинно, три раза в неделю): i) вызывал уменьшение объема раковой опухоли на 67%; ii) эффективно уменьшал площадь кровеносных сосудов раковой опухоли на 51%) (фиг. 9А); iii) способствовал нормализации кровеносных сосудов раковой опухоли в плане увеличения охвата перицитами (фиг. 9В); iv) повышал перфузию (фиг. 9С) и снижал тканевую гипоксию (фиг. 9D).

Кроме того, влияние Sema3A A106K ΔIg-b анализировали на мышиной модели значительно более частого и смертельного гистотипа рака поджелудочной железы человека, а именно на сингенной ортотопической мышиной модели K-Ras^G12D; Ink4a/Arf^-/-; p53^R172H протоковой аденокарциномы поджелудочной железы (pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC). Полноразмерный SEMA3A WT доставляли в ортотопическую мышиную модель Ras^G12D; Ink4a/Arf^-/-; p53^R172H PDAC посредством AAV-8-опосредованного переноса гена (Maione et al., 2009). Введение полноразмерного SEMA3A WT приводило к ингибированию как роста раковой опухоли (на 52%), так и метастазов в печени (на 59%) (фиг. 10А, В) через 3 недели. Исходя из предыдущих перспективных данных, затем мы вводили мышам PDAC с раковыми опухолями очищенный мутантный белок Sema3A A106K ΔIg-b (3 мг/кг внутрибрюшинно, три раза в неделю) и оценивали его фармакологическое влияние на формирование раковой опухоли и формирование метастазов. Sema3A A106K ΔIg-b значительно ингибировал рост раковой опухоли (на 64%) (фиг. 11А), уменьшал частоту метастазов в печени на 81% (фиг. 11В) и уменьшал объем метастазов на 78%. Самое главное и удивительное, что Sema3A A106K ΔIg-b оказывал более сильное влияние на снижение прогрессирования рака и распространения метастазов, чем полноразмерный Sema3A, у мышей PDAC. В соответствии с введением RIP-tag2 мышам препарат Sema3A A106K ΔIg-b уменьшал площадь сосудов (данные не показаны) и способствовал нормализации сосудов раковой опухоли также на мышиной модели PDAC за счет усиления охвата перицитами (фиг. 11С), увеличения перфузии кровеносных сосудов и ингибирования гипоксии раковой опухоли.

Все приведенные в данном документе ссылки полностью включены в данный документ посредством ссылки. Имея теперь полностью описанное изобретение, специалист в данной области сможет понять, что данное изобретение может быть осуществлено на практике в широком и эквивалентном диапазоне условий, параметров и т.п. без изменения сущности или объема данного изобретения или любого его воплощения.

Adams et al., (1997) EMBO J. 16:6077-6086.

Bos et al., (2012) Sci Signal. 5:pe6.

Casazza et al., (2013) Cancer Cell. 24:695-709.

Cleaver et al., (2003) Nat Med. 9:661-668.

Conley et al., (2012) Proc Natl Acad Sci USA.

Gherardi et al., (2004) Curr Opin Struct Biol. 14:669-678.

Goel et al., (2011) Physiol Rev. 91:1071-1121.

Hahn et al., (2009) Nat Rev Mol Cell Biol. 10:53-62.

Janssen et al., (2010) Nature. 467:1118-1122.

Kinbara et al., (2003) Nat Rev Mol Cell Biol. 4:767-776.

Koppel et al., (1998) J Biol Chem. 273:15708-15713.

Kruger et al., (2005) Nat Rev Mol Cell Biol. 6:789-800.

Kumanogoh et al., (2013) Nat Rev Immunol. 13:802-814.

Lucitti et al., (2007) Development. 134:3317-3326.

Maione et al., (2012) J Clin Invest. 122:1832-1848.

Maione et al., (2009) J Clin Invest. 119:3356-3372.

Michieli et al., (2009) Cell Cycle. 8:3291-3296.

Nogi etal., (2010) Nature. 467:1123-1127.

Parker et al., (2010) Biochemistry. 49:4068-4075.

Parker et al., (2012) J Biol Chem.

Sennino et al., (2012) Nat Rev Cancer. 12:699-709.

Serini et al., (2013) Journal of Internal Medicine.

Serini et al., (2003) Nature. 424:391-397.

Shattil et al., (2010) Nat Rev Mol Cell Biol. 11:288-300.

Takahashi et al., (1999) Cell. 99:59-69.

Tamagnone et al., (1999) Cell. 99:71-80.

Tran et al., (2007) Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 23:263-292.

Tzima et al., (2001) EMBO J. 20:4639-4647

Van der Veldt et al., (2012) Cancer Cell. 21:82-91.

Wang et al., (2012) Sci Signal. 5:ra6.

Flanagan Methods Enzymol. 2000;327:198-210.

Gherardi et al., (2004) Curr Opin Struct Biol 14:669-678.

Love et al., (2003) Nat Struct Biol 10:843-848.

Xiong J et al., (2004) J Biol Chem 279:40252-40254.

Rein FEBS Letters 513 (2002) 141-144, Oct 2001

Antipenko et al., (2003) Neuron. 39:589-598.

Chen et al., (2011) Trends Biochem Sci. 36:553-561.

Conley et al., (2012) Proc Natl Acad Sci USA.

Desgrosellier et al., (2010) Nat Rev Cancer. 10:9-22..

Flanagan et al., (2000) Methods Enzymol. 327:19-35.

Gherardi et al., (2004) Curr Opin Struct Biol. 14:669-678.

Love et al., (2003) Nat Struct Biol. 10:843-848.

Sennino et al., (2012) Nat Rev Cancer. 12:699-709.

Xiong et al., (2004) J Biol Chem. 279:40252-40254.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к мутантному семафорину 3 или его функциональному фрагменту, к гибридному белку, содержащему вышеуказанный семафорин 3 или его функциональный фрагмент, а также к способу их получения. Также раскрыта молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая вышеуказанный мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая вышеуказанный гибридный белок, а также вектор и клетка-хозяин, содержащие вышеуказанную молекулу нуклеиновой кислоты. Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей вышеуказанный мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент, гибридный белок и/или молекулу нуклеиновой кислоты, а также к применению вышеуказанного мутантного семафорина 3 или его функционального фрагмента, гибридного белка, молекулы нуклеиновой кислоты, вектора, клетки-хозяина, фармацевтической композиции для лечения ангиогенного нарушения и для лечения опухолевого заболевания. Изобретение позволяет эффективно осуществлять лечение ангиогенного нарушения и опухолевого заболевания. 15 н. и 38 з.п. ф-лы, 4 табл., 2 пр., 13 ил.

1. Мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент, где указанный мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент ингибирует ангиогенез и действует как сосудистый нормализующий агент, где указанный мутантный семафорин 3 выбран из группы, состоящей из семафорина 3А, семафорина 3В, семафорина 3С и семафорина 3D, и где указанный мутантный семафорин 3 или указанный его функциональный фрагмент содержит аминокислотную последовательность CX₁X₂A₃GKD, где:

X₁ является аминокислотой, которая представляет собой K или N,

Х₂ представляет собой аминокислоту, выбранную среди W, М и L,

и где аланин (А₃) заменен гидрофильной аминокислотой.

2. Мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент по п. 1, где указанный мутантный семафорин 3 или указанный его функциональный фрагмент содержит:

указанную гидрофильную аминокислоту на месте аланина, соответствующего позиции 106 семафорина дикого типа 3А, показанного в SEQ ID NO 2;

указанную гидрофильную аминокислоту на месте аланина, соответствующего позиции 105 семафорина дикого типа 3В, показанного в SEQ ID NO 6;

указанную гидрофильную аминокислоту на месте аланина, соответствующего позиции 104 семафорина дикого типа 3С, показанного в SEQ ID NO 10; или

указанную гидрофильную аминокислоту на месте аланина, соответствующего позиции 120 семафорина дикого типа 3D, показанного в SEQ ID NO 14.

3. Мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент по п. 1 или 2, где указанный семафорин 3 выбран из группы:

(а) полипептида, который закодирован последовательностью нуклеиновой кислоты, выбранной среди SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 9 и SEQ ID NO 13,

где нуклеотиды GCT в позиции с 631 по 633 в SEQ ID NO 1 заменены нуклеотидами, кодирующими указанную гидрофильную аминокислоту,

где нуклеотиды GCA в позиции с 559 по 561 в SEQ ID NO 5 заменены нуклеотидами, кодирующими указанную гидрофильную аминокислоту,

где нуклеотиды GCT в позиции с 872 по 874 в SEQ ID NO 9 заменены нуклеотидами, кодирующими указанную гидрофильную аминокислоту, и

где нуклеотиды GCC в позиции по 398 по 400 в SEQ ID NO 13 заменены нуклеотидами, кодирующими указанную гидрофильную аминокислоту;

(b) полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, выбранную среди SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 10 и SEQ ID NO 14, где остаток аланина в позиции 106 в SEQ ID NO 2, в позиции 105 в SEQ ID NO 6, в позиции 104 в SEQ ID NO 10 или в позиции 120 в SEQ ID NO 14 заменен указанной гидрофильной аминокислотой;

(c) полипептида, который закодирован последовательностью нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в жестких условиях с комплементарной нитью молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, определенный в (а) или (b);

(d) полипептида, который обладает по меньшей мере 55% идентичностью с одним из полипептидов, определенных в (b).

4. Мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент по любому из пп. 1-3, где указанный семафорин 3 или указанный его функциональный фрагмент содержит гидрофильную аминокислоту

(a) в позиции 106 в SEQ ID NO 2;

(b) в позиции 105 в SEQ ID NO 6;

(c) в позиции 104 в SEQ ID NO 10; или

(d) в позиции 120 в SEQ ID NO 14.

5. Мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент по любому из пп. 1-4, где указанная гидрофильная аминокислота выбрана среди K, R, N, Q, S, Т, Е, D и Н.

6. Мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент по любому из пп. 1-5, где указанная гидрофильная аминокислота представляет собой K или R.

7. Мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент по п. 5, где указанная гидрофильная аминокислота, заменяющая указанный аланин, представляет собой K.

8. Мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент по любому из пп. 1-7, где молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая указанный семафорин 3 или указанный его функциональный фрагмент, содержит:

(a) нуклеотиды с 601 по 1206 в SEQ ID NO 1, и где нуклеотиды GCT в позиции с 631 по 633 в SEQ ID NO 1 заменены нуклеотидами, кодирующими гидрофильную аминокислоту;

(b) нуклеотиды с 529 по 1137 в SEQ ID NO 5, и где нуклеотиды GCA в позиции с 559 по 561 в SEQ ID NO 5 заменены нуклеотидами, кодирующими гидрофильную аминокислоту;

(c) нуклеотиды с 842 по 1444 в SEQ ID NO 9, и где нуклеотиды GCT в позиции с 872 по 874 в SEQ ID NO 9 заменены нуклеотидами, кодирующими гидрофильную аминокислоту; или

(d) нуклеотиды с 368 по 982 в SEQ ID NO 13, и где нуклеотиды GCC в позиции с 398 по 400 в SEQ ID NO 13 заменены нуклеотидами, кодирующими гидрофильную аминокислоту.

9. Мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент по любому из пп. 1-8, где указанный семафорин 3 или указанный его функциональный фрагмент содержит функциональный sema-домен, где указанный sema-домен выбран из аминокислотной последовательности, показанной в:

(a) SEQ ID NO 21, где остаток аланина, соответствующий позиции 106 в SEQ ID NO 2, заменен гидрофильной аминокислотой;

(b) SEQ ID NO 22, где остаток аланина, соответствующий позиции 105 в SEQ ID NO 6, заменен гидрофильной аминокислотой;

(c) SEQ ID NO 23, где остаток аланина, соответствующий позиции 104 в SEQ ID NO 10, заменен гидрофильной аминокислотой; или

(d) SEQ ID NO 24, где остаток аланина, соответствующий позиции 120 в SEQ ID NO 14, заменен гидрофильной аминокислотой.

10. Мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент по любому из пп. 1-9, где мутантный семафорин 3 содержит аминокислотную последовательность, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO 58, SEQ ID NO 60, SEQ ID NO 62, SEQ ID NO 64, SEQ ID NO 66, SEQ ID NO 68, SEQ ID NO 70 и SEQ ID NO 72.

11. Гибридный белок, который действует как ингибитор ангиогенеза и как сосудистый нормализующий агент, содержащий мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент, как определено в любом из пп. 1-10, и (а) стабилизирующий домен и/или (b) домен димеризации.

12. Гибридный белок по п. 11, где:

(a) указанный стабилизирующий домен представляет собой домен плексин-семафорин-интегрин (PSI), где указанный PSI-домен содержит одну или более чем одну из последовательностей SEQ ID NO 45, SEQ ID NO 46, SEQ ID NO 47 или SEQ ID NO 48; и/или

(b) указанный домен димеризации имеет константу диссоциации K_D с другим таким доменом димеризации в диапазоне от 10^-5 М до 10^-6 М, и/или где указанный домен димеризации выбран из группы С-концевого константного домена IgG, сконструированного белка с анкириновым повтором (DARPin) и лейциновой застежки.

13. Гибридный белок по п. 12, где константный домен IgG представляет собой IgG1 или IgG3.

14. Гибридный белок по любому из пп. 11-13, где указанный гибридный белок закодирован молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую:

последовательность нуклеиновой кислоты, которая простирается от нуклеотида 316 до 1959 в SEQ ID NO 1, и последовательность нуклеиновой кислоты, которая простирается от нуклеотида 295 до 990 в SEQ ID NO 37, где нуклеотиды GCT в позиции с 631 по 633 в SEQ ID NO 1 заменены нуклеотидами, кодирующими гидрофильную аминокислоту;

последовательность нуклеиновой кислоты, которая простирается от нуклеотида 247 до 1887 в SEQ ID NO 5, и последовательность нуклеиновой кислоты, которая простирается от нуклеотида 295 до 990 в SEQ ID NO 37, где нуклеотиды GCA в позиции с 559 по 561 в SEQ ID NO 5 заменены нуклеотидами, кодирующими гидрофильную аминокислоту;

последовательность нуклеиновой кислоты, которая простирается от нуклеотида 563 до 2197 в SEQ ID NO 9, и последовательность нуклеиновой кислоты, которая простирается от нуклеотида 295 до 990 в SEQ ID NO 37, где нуклеотиды GCT в позиции с 872 по 874 в SEQ ID NO 9 заменены нуклеотидами, кодирующими гидрофильную аминокислоту; или

последовательность нуклеиновой кислоты, которая простирается от нуклеотида 41 до 1735 в SEQ ID NO 13, и последовательность нуклеиновой кислоты, которая простирается от нуклеотида 295 до 990 в SEQ ID NO 37, где нуклеотиды GCC в позиции с 398 по 400 в SEQ ID NO 13 заменены нуклеотидами, кодирующими гидрофильную аминокислоту.

15. Гибридный белок по любому из пп. 11-14, где указанный гибридный белок содержит аминокислотную последовательность:

которая простирается от аминокислотного остатка 1 до 548 в SEQ ID NO 2, и аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO 41, где остаток аланина в позиции 106 в SEQ ID NO 2 заменен гидрофильной аминокислотой;

которая простирается от аминокислотного остатка 1 до 547 в SEQ ID NO 6, и аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO 41, где остаток аланина в позиции 105 в SEQ ID NO 6 заменен гидрофильной аминокислотой;

которая простирается от аминокислотного остатка 1 до 565 в SEQ ID NO 10, и аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO 41, где остаток аланина в позиции 104 в SEQ ID NO 10 заменен гидрофильной аминокислотой; или

которая простирается от аминокислотного остатка 1 до 545 в SEQ ID NO 14, и аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO 41, где остаток аланина в позиции 120 в SEQ ID NO 14 заменен указанной гидрофильной аминокислотой.

16. Гибридный белок по любому из пп. 11-15, где указанный гибридный белок содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 76, SEQ ID NO 78 и SEQ ID NO 79.

17. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент по любому из пп. 1-10.

18. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая гибридный белок по любому из пп. 11-16.

19. Экспрессионный вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п. 17.

20. Вектор по п. 19, где указанный вектор представляет собой вектор, нацеленный на ген, или вектор, переносящий ген.

21. Вектор по п. 19 или 20, где указанный вектор представляет собой вектор на основе аденоассоциированного вируса (AAV).

22. Вектор по п. 21, где аденоассоциированный вирус представляет собой вектор AAV8.

23. Экспрессионный вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п. 18.

24. Вектор по п. 23, где указанный вектор представляет собой вектор, нацеленный на ген, или вектор, переносящий ген.

25. Вектор по п. 23 или 24, где указанный вектор представляет собой вектор на основе аденоассоциированного вируса (AAV).

26. Вектор по п. 25, где аденоассоциированный вирус представляет собой вектор AAV8.

27. Клетка-хозяин для получения мутантного семафорина 3 или его функционального фрагмента по любому из пп. 1-10, трансформированная вектором по любому из пп. 19-22 или содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п. 17, где указанная клетка не является эмбриональной клеткой человека.

28. Клетка-хозяин по п. 27, которая представляет собой клетку млекопитающего.

29. Клетка-хозяин для получения гибридного белка по любому из пп. 11-16, трансформированная вектором по любому из пп. 23-26 или содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п. 18, где указанная клетка не является эмбриональной клеткой человека.

30. Клетка-хозяин по п. 29, которая представляет собой клетку млекопитающего.

31. Способ получения мутантного семафорина 3 или его функционального фрагмента, закодированного молекулой нуклеиновой кислоты по п. 17, где указанный способ включает культивирование/выращивание клетки-хозяина по любому из пп. 27-28 и, возможно, выделение полученного полипептида.

32. Способ получения гибридного белка, закодированного молекулой нуклеиновой кислоты по п. 18, где указанный способ включает культивирование/выращивание клетки-хозяина по любому из пп. 29-30 и, возможно, выделение полученного полипептида.

33. Фармацевтическая композиция, ингибирующая ангиогенез и действующая как сосудистый нормализующий агент, содержащая эффективное количество:

(a) мутантного семафорина 3 или его функционального фрагмента по любому из пп. 1-10;

(b) гибридного белка по любому из пп. 11-16; и/или

(c) молекулы нуклеиновой кислоты по п. 17 или 18;

и содержащая фармацевтический эксципиент.

34. Фармацевтическая композиция по п. 33, где фармацевтический эксципиент представляет собой фармацевтический носитель.

35. Фармацевтическая композиция по п. 34, где фармацевтический носитель представляет собой вирус.

36. Фармацевтическая композиция по п. 35, где указанный вирус представляет собой аденоассоциированный вирус (AAV).

37. Фармацевтическая композиция по п. 36, где аденоассоциированный вирус представляет собой AAV8.

38. Мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент по любому из пп. 1-10, гибридный белок по любому из пп. 11-16, молекула нуклеиновой кислоты по п. 17 или 18 и/или фармацевтическая композиция по любому из пп. 33-37 для применения в качестве лекарственного препарата для лечения ангиогенного нарушения.

39. Мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент по любому из пп. 1-10, гибридный белок по любому из пп. 11-16, молекула нуклеиновой кислоты по п. 17 или 18 и/или фармацевтическая композиция по любому из пп. 33-37 для применения в качестве лекарственного препарата для лечения опухолевого заболевания.

40. Мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент по любому из пп. 1-10, гибридный белок по любому из пп. 11-16, молекула нуклеиновой кислоты по п. 17 или 18 и/или фармацевтическая композиция по любому из пп. 33-37 для применения по п. 39, где указанное опухолевое заболевание представляет собой солидную опухоль.

41. Мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент по любому из пп. 1-10, гибридный белок по любому из пп. 11-16, молекула нуклеиновой кислоты по п. 17 или 18 и/или фармацевтическая композиция по любому из пп. 33-37 для применения по п. 39 или 40, где указанное опухолевое заболевание представляет собой рак, выбранный из группы, состоящей из рака поджелудочной железы, рака шейки матки, рака молочной железы, рака толстой кишки, меланомы, рака предстательной железы, рака мочевого пузыря и рака языка.

42. Мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент по любому из пп. 1-10, гибридный белок по любому из пп. 11-16, молекула нуклеиновой кислоты по п. 17 или 18 и/или фармацевтическая композиция по любому из пп. 33-37 для применения по любому из пп. 39-41, где указанное опухолевое заболевание представляет собой опухоль/рак поджелудочной железы.

43. Мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент по любому из пп. 1-10, гибридный белок по любому из пп. 11-16, молекула нуклеиновой кислоты по п. 17 или 18 и/или фармацевтическая композиция по любому из пп. 33-37 для применения по любому из пп. 39-42, где вовлечена нормализация сосудов, уменьшение роста опухоли, уменьшение метастазирования или увеличение продолжительности жизни.

44. Мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент по любому из пп. 1-10, гибридный белок по любому из пп. 11-16, молекула нуклеиновой кислоты по п. 17 или 18 и/или фармацевтическая композиция по любому из пп. 33-37 для применения по любому из пп. 39-43, где мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент, гибридный белок, молекула нуклеиновой кислоты и/или фармацевтическая композиция предназначены для введения в комбинации с антипролиферативным лекарственным препаратом, противораковым лекарственным препаратом, цитостатическим лекарственным препаратом, цитотоксическим лекарственным препаратом и/или лучевой терапией.

45. Мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент по любому из пп. 1-10, гибридный белок по любому из пп. 11-16, молекула нуклеиновой кислоты по п. 17 или 18 и/или фармацевтическая композиция по любому из пп. 33-37 для применения по любому из пп. 38-44, где мутантный семафорин 3 или его функциональный фрагмент, гибридный белок, молекула нуклеиновой кислоты и/или фармацевтическая композиция предназначены для парентерального введения.

46. Применение мутантного семафорина 3 или его функционального фрагмента по любому из пп. 1-10, гибридного белка по любому из пп. 11-16, молекулы нуклеиновой кислоты по п. 17 или 18, вектора по любому из пп. 19-26, клетки-хозяина по любому из пп. 27-30 и/или фармацевтической композиции по любому из пп. 33-37 в качестве лекарственного препарата для лечения ангиогенного нарушения.

47. Применение мутантного семафорина 3 или его функционального фрагмента по любому из пп. 1-10, гибридного белка по любому из пп. 11-16, молекулы нуклеиновой кислоты по п. 17 или 18, вектора по любому из пп. 19-26, клетки-хозяина по любому из пп. 27-30 и/или фармацевтической композиции по любому из пп. 33-37 в качестве лекарственного препарата для лечения опухолевого заболевания.

48. Способ лечения ангиогенного нарушения, содержащий этап введения субъекту, нуждающемуся в таком лечении, фармацевтически эффективного количества мутантного семафорина 3 или его функционального фрагмента по любому из пп. 1-10, гибридного белка по любому из пп. 11-16, молекулы нуклеиновой кислоты по п. 17 или 18, вектора по любому из пп. 19-26 и/или фармацевтической композиции по любому из пп. 33-37.

49. Способ лечения по п. 48, где субъектом является человек.

50. Способ лечения по п. 48 или 49, где фармацевтически эффективное количество находится в диапазоне от 0,5 до 10 мг/кг массы тела.

51. Способ лечения опухолевого заболевания, содержащий этап введения субъекту, нуждающемуся в таком лечении, фармацевтически эффективного количества мутантного семафорина 3 или его функционального фрагмента по любому из пп. 1-10, гибридного белка по любому из пп. 11-16, молекулы нуклеиновой кислоты по п. 17 или 18, вектора по любому из пп. 19-26 и/или фармацевтической композиции по любому из пп. 33-37.

52. Способ лечения по п. 51, где субъектом является человек.

53. Способ лечения по п. 51 или 52, где фармацевтически эффективное количество находится в диапазоне от 0,5 до 10 мг/кг массы тела.