БЕЛКИ, СВЯЗЫВАЮЩИЕ СПЕЦИФИЧЕСКИЙ МЕМБРАННЫЙ АНТИГЕН ПРОСТАТЫ, И СООТВЕТСТВУЮЩИЕ КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ Российский патент 2017 года по МПК C07K16/28 C12N15/13 C12N15/85 A61K39/395 A61P35/00 

[001] Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США №61/478449, поданной 22 апреля 2011 г., включенной в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[002] Настоящее изобретение относится к моноспецифическим и мультиспецифическим белковым терапевтическим средствам, специфично нацеленным на клетки, экспрессирующие специфический мембранный антиген простаты (PSMA/ПСМА) и подходящим для лечения расстройств, для которых характерна сверхэкспрессия ПСМА, таких как, например, рак предстательной железы (например, кастрационно-резистентный рак предстательной железы), опухолезависимый ангиогенез или доброкачественная гиперплазия предстательной железы (ВРН / ДГПЖ). Согласно одному из вариантов реализации указанное мультиспецифическое белковое терапевтическое средство связывается и с ПСМА-экспрессирующими клетками, и с Т-клеточным рецепторным комплексом на Т-клетках, индуцируя мишенезависимую Т-клеточную цитотоксичность, активацию и пролиферацию.

ПРИЛАГАЕМЫЙ ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[003] Содержание текстового файла (Название: «Sequence_Listing.txt» / «Перечень последовательностей», размер: 272 014 байт; дата создания: 20 апреля 2012), приложенного к настоящей заявке в электронном виде, полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[004] Специфический мембранный антиген простаты (простат-специфичный мембранный антиген, ПСМА), также известный как глутаматкарбоксипептидаза II и N-ацетилированная альфа-связанная кислая дипептидаза 1, представляет собой димер трансмембранного гликопротеина II типа, принадлежащего к семейству пептидаз М28, кодируемого геном FOLH1 (фолатгидролазы 1). Указанный белок функционирует в качестве глутаматкарбоксипептидазы на различных альтернативных субстратах, включая пищевой фолат и нейропептид N-ацетил-L-аспартил-L-глутамат, и экспрессируется в некоторых тканях, например, в предстательной железе, и, в меньшем количестве, в тонком кишечнике, центральной и периферической нервной системе и почках. Ген, кодирующий ПСМА, подвергается альтернативному сплайсингу с получением по меньшей мере трех вариантов. Мутация этого гена может быть связана с нарушением кишечной абсорбции пищевых фолатов, приводящей к низким уровням фолата в крови и, как следствие, к гипергомоцистеинемии. Экспрессия указанного белка в головном мозге может быть вовлечена в ряд патологических состояний, связанных с эксайтотоксичностью глутамата.

[005] ПСМА представляет собой хорошо изученный строго ограниченный связанный с раком предстательной железы антиген клеточной мембраны. В клетках рака предстательной железы экспрессия ПСМА в 1000 раз превышает экспрессию в эпителии нормальной предстательной железы (Su et al., Cancer Res. 1995 44:1441-1443). Экспрессия ПСМА увеличивается при прогрессировании рака предстательной железы и наиболее высока при метастатическом заболевании, в гормонорезистентных случаях и при низкодифференцированных очагах повреждения (Israeli et al., Cancer Res. 1994, 54:1807-1811; Wright et al., Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations 1995 1:18-28; Wright et al., Urology 1996 48:326-332; Sweat et al., Urology 1998 52:637-640). Кроме того, ПСМА в больших количествах экспрессируется на новообразованных сосудах различных других солидных опухолей, в том числе при раке мочевого пузыря, поджелудочной железы, меланоме, раке легкого и раке почки, но не на нормальных новообразованных сосудах (Chang et al., Urology 2001 57:801-805; Divgi et al., Clin. Cancer Res. 1998 4:2729-3279).

[006] ПСМА, как было показано, является важной мишенью для иммунологических методов, таких как вакцины или направленная терапия моноклональными антителами. В отличие от других ограниченных предстательной железой молекул, представляющих собой секреторные белки (ПСА, простатическая кислая фосфатаза), ПСМА представляет собой интегральный мембранный белок клеточной поверхности, который не секретируется, что делает его идеальной мишенью для терапии антителами. PROSTASCINT® (капромаба пендетид) представляет собой одобренное FDA ¹¹¹In-меченое моноклональное антитело мыши против ПСМА для визуализации и определения стадии заболевания у пациентов с впервые диагностированным и рецидивирующим раком предстательной железы (Hinkle et al., Cancer 1998, 83:739-747). Однако капромаб связывается с внутриклеточным эпитопом ПСМА, что требует интернализации или экспонирования внутреннего домена ПСМА, связывая, соответственно, преимущественно апоптотические или некротические клетки (Troyer et al., Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations 1995 1:29-37; Troyer et al., Prostate 1997 30:232-242). В результате капромаб не может оказывать благоприятное терапевтическое действие (Liu et al., Cancer Res. 1997 57:3629-3634).

[007] Разработаны другие моноклинальные антитела, нацеленные на внешний домен ПСМА (например, J591, J415, J533 и Е99) (Liu et al., Cancer Res. 1997 57:3629-3634). Радиоактивно меченое J591 в настоящее время проходит клинические испытания (Tagawa et al., Cancer 2010 116(S4):1075). Как бы то ни было, существуют данные, свидетельствующие о том, что ПСМА может функционировать в качестве рецептора, опосредующего интернализацию предполагаемого лиганда. ПСМА подвергается конститутивной интернализации, и ПСМА-специфические антитела могут индуцировать интернализацию и/или повышать скорость интернализации, что впоследствии приводит к аккумуляции антител в эндосомах (Liu et al., Cancer Res. 1998 58:4055-4060). Хотя ПСМА-специфические интернализирующиеся антитела могут быть полезны при разработке терапевтических средств для направленной доставки токсинов, лекарственных средств или радиоизотопов внутрь клеток рака предстательной железы (Tagawa et al., Cancer 2010 116(S4):1075), использование ПСМА-специфических антител, задействующих природные или искусственные эффекторные механизмы (например, антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (ADCC), комплементзависимую цитотоксичность (CDC), антителозависимый клеточноопосредованный фагоцитоз (ADCP) или перенаправленную Т-клеточную цитотоксичность (RTCC)) проблематично, так как указанное ПСМА-специфическое антитело может быть интернализировано до распознавания эффекторными клетками.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[008] Согласно одному из вариантов реализации в настоящей заявке предложен связывающий специфический мембранный антиген простаты (ПСМА) полипептид, содержащий, в направлении от амино-конца к карбоксильному концу, (а) ПСМА-связывающий домен, который специфично связывается с ПСМА человека, (b) шарнирную область, и (с) константную область иммуноглобулина. Согласно определенным вариантам реализации подходящие ПСМА-связывающие домены включают связывающие домены, конкурирующие за связывание с ПСМА человека с одноцепочечным Fv (scFv), имеющим последовательность аминокислот, приведенную в SEQ ID NO: 21. Согласно определенным вариантам реализации указанный ПСМА-связывающий полипептид способен образовывать димер с второй, идентичной полипептидной цепью за счет связи между соответствующими константными областями иммуноглобулина и/или шарнирными областями.

[009] Согласно определенным вариантам реализации указанный ПСМА-связывающий домен содержит (i) вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, содержащую CDR LCDR1, LCDR2 и LCDR3, и/или (ii) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую CDR HCDR1, HCDR2 и HCDR3. Согласно некоторым вариантам LCDR3 имеет последовательность аминокислот, приведенную в SEQ ID NO: 17, и/или HCDR3 имеет последовательность аминокислот, приведенную в SEQ ID NO: 11; согласно некоторым вариантам реализации LCDR1 и LCDR2 имеют последовательности аминокислот, приведенные в SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16, соответственно, и/или HCDR1 и HCDR2 имеют последовательности аминокислот, приведенные в SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10, соответственно. Согласно другому варианту (i) указанная вариабельная область легкой цепи содержит последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентичную последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 23; и/или (ii) указанная вариабельная область тяжелой цепи содержит последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентичную последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 25 или SEQ ID NO: 27. Одна или обе из указанных вариабельных областей легкой и тяжелой цепей могут быть гуманизированы.

[0010] Согласно некоторым вариантам ПСМА-связывающий домен представляет собой одноцепочечный Fv (scFv), содержащий раскрытые в настоящей заявке вариабельные области легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина. Согласно определенным вариантам реализации ПСМА-связывающие scFv включают, например, scFv, содержащие последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентичную последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 34 или SEQ ID NO: 35. Согласно определенным вариантам реализации вариабельная область тяжелой цепи указанного scFv расположена со стороны карбоксильного конца относительно вариабельной области легкой цепи (что в настоящей заявке также называется «VL-VH-ориентацией»). Согласно некоторым вариантам реализации scFv, имеющего VL-VH-ориентацию, указанный scFv содержит последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентичную последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 30 или SEQ ID NO: 31. Вариабельная область легкой цепи и вариабельная область тяжелой цепи указанного scFv могут быть соединены пептидным линкером, таким как, например, пептидный линкер, содержащий последовательность аминокислот (Gly₄Ser)_n, где n=1-5 (SEQ ID NO: 165).

[0011] Согласно некоторым вариантам реализации описанного в настоящей заявке ПСМА-связывающего полипептида шарнирную область получают из шарнирной области иммуноглобулина, такой как, например, шарнирная область иммуноглобулина IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 или IgD. Такая шарнирная область иммуноглобулина может представлять собой шарнирную область иммуноглобулина либо дикого типа, либо модифицированную.

[0012] Согласно другим вариантам реализации описанного в настоящей заявке ПСМА-связывающего полипептида константная область иммуноглобулина содержит домены СН2 и СН3 иммуноглобулина, такие как, например, домены СН2 и СН3 иммуноглобулина IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 или IgD. Согласно другому варианту реализации константная область иммуноглобулина содержит домены СН2 и СН3 иммуноглобулина, и указанная константная область не содержит домена СН1 иммуноглобулина.

[0013] Согласно некоторым вариантам ПСМА-связывающий полипептид, описанный в настоящей заявке, обладает по меньшей мере одной эффекторной функцией, выбранной из антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (ADCC) и комплементзависимой цитотоксичности (CDC). Согласно некоторым вариантам реализации шарнирную область получают из шарнирной области иммуноглобулина, и константная область иммуноглобулина содержит домены СН2 и СН3 иммуноглобулина IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. Согласно другому варианту реализации шарнирную область иммуноглобулина получают из шарнирной области IgG1, и константная область иммуноглобулина содержит домены СН2 и СН3 иммуноглобулина IgG1.

[0014] Согласно некоторым вариантам реализации ПСМА-связывающий полипептид, описанный в настоящей заявке, содержит последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентичную последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 70 или SEQ ID NO: 72.

[0015] Согласно дальнейшим вариантам реализации ПСМА-связывающий полипептид, описанный в настоящей заявке, дополнительно включает (d) вторую шарнирную область со стороны карбоксильного конца константной области иммуноглобулина, и (е) второй связывающий домен со стороны карбоксильного конца указанной второй шарнирной области. Согласно некоторым вариантам реализации вторые шарнирные области включают полученные из области «ствола» лектинов типа С (II) или шарнирной области иммуноглобулина. Согласно некоторым вариантам указанная вторая шарнирная область имеет последовательность аминокислот, приведенную в SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65 или SEQ ID NO: 66.

[0016] Согласно другому варианту реализации в настоящей заявке предложен связывающий специфический мембранный антиген простаты (ПСМА) полипептид, который специфично связывается с ПСМА человека и содержит первый связывающий домен, содержащий (i) вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, содержащую CDR LCDR1, LCDR2 и LCDR3, и (ii) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую CDR HCDR1, HCDR2 и HCDR3; где LCDR3 имеет последовательность аминокислот, приведенную в SEQ ID NO: 17 и/или HCDR3 имеет последовательность аминокислот, приведенную в SEQ ID NO: 11. Согласно некоторым вариантам реализации LCDR1 и LCDR2 имеют последовательности аминокислот, приведенные в SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16, соответственно, и/или HCDR1 и HCDR2 имеют последовательности аминокислот, приведенные в SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10, соответственно. Согласно некоторым вариантам LCDR1, LCDR2 и LCDR3 имеют последовательности аминокислот, приведенные в SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, и SEQ ID NO: 17, соответственно; и HCDR1, HCDR2 и HCDR3 имеют последовательности аминокислот, приведенные в SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 11, соответственно. Согласно некоторым вариантам (i) указанная вариабельная область легкой цепи содержит последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентичную последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 23; и/или (ii) указанная вариабельная область тяжелой цепи содержит последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентичную последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 25 или SEQ ID NO: 27. Согласно определенным вариантам реализации вариабельная область легкой цепи кодируется последовательностью нуклеиновых кислот, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентичной последовательности нуклеиновых кислот, приведенной в SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 22; и/или вариабельная область тяжелой цепи кодируется последовательностью нуклеиновых кислот, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентичной последовательности нуклеиновых кислот, приведенной в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 24 или SEQ ID NO: 26. Одна или обе из указанных вариабельных областей легкой и тяжелой цепей могут быть гуманизированы. Согласно некоторым вариантам реализации ПСМА-связывающий полипептид способен образовывать димер с второй идентичной полипептидной цепью.

[0017] Согласно определенным вариантам реализации описанный в настоящей заявке первый связывающий домен представляет собой одноцепочечный Fv (scFv), содержащий вариабельные области легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина. Согласно некоторым вариантам реализации ПСМА-связывающие scFv включают, например, scFv, содержащие последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере 95% по меньшей мере 99%, или 100% идентичную аминокислоте, приведенной в SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 34 или SEQ ID NO: 35. Согласно определенным вариантам реализации вариабельная область тяжелой цепи указанного scFv расположена со стороны карбоксильного конца вариабельной области легкой цепи («VL-VH-ориентация»), Согласно некоторым вариантам реализации scFv, имеющего VL-VH ориентацию, указанный scFv содержит последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентичную последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 30 или., SEQ ID NO: 31. Вариабельная область легкой цепи и вариабельная область тяжелой цепи указанного scFv могут быть соединены пептидным линкером, таким как, например, пептидный линкер, содержащий последовательность аминокислот (Gly₄Ser)_n, где n=1-5 (SEQ ID NO: 165).

[0018] Согласно определенным вариантам реализации ПСМА-связывающий полипептид дополнительно включает константную область иммуноглобулина. Например, согласно некоторым вариантам указанная константная область иммуноглобулина содержит домены СН2 и СН3 иммуноглобулинов IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 или IgD. Согласно некоторым вариантам ПСМА-связывающий полипептид дополнительно включает одну или более шарнирную область. Согласно определенным вариантам реализации указанная шарнирная область может быть получена, например, из области «ствола» пектинов типа С (II) или из шарнирной области иммуноглобулина.

[0019] Согласно другому варианту реализации ПСМА-связывающий полипептид содержит, в направлении от амино-конца к карбоксильному концу, первый связывающий домен, шарнирную область и константную область иммуноглобулина. ПСМА-связывающий полипептид такого формата также может называться ПСМА-специфической SMIP-молекулой. Общие конфигурации SMIP приведены, например, в опубликованных заявках на патент США №№2003/0133939, 2003/0118592 и 2005/0136049, включенных в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылок.

[0020] Согласно другому варианту реализации ориентация указанного полипептида является обратной, так что указанный полипептид содержит, в направлении от амино-конца к карбоксильному концу, константную область иммуноглобулина, шарнирную область и первый связывающий домен. При такой ориентации полипептид также может называться ПСМА-специфической PIMS-молекулой. Общие конфигурации PIMS приведены, например, в опубликованной заявке на патент США №2009/0148447, включенной в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки. Согласно некоторым вариантам реализации ПСМА-связывающий полипептид, содержащий константную область иммуноглобулина и, необязательно, шарнирную область согласно описанию в настоящей заявке, способен образовывать димер с второй, идентичной полипептидной цепью за счет связи между соответствующими константными областями иммуноглобулина и/или шарнирными областями.

[0021] Согласно другому варианту реализации ПСМА-связывающий полипептид включает второй связывающий домен, такой как, например, одноцепочечный Fv (scFv). Например, согласно некоторым вариантам ПСМА-связывающий полипептид содержит, в направлении от амино-конца к карбоксильному концу или в направлении от карбоксильного конца к амино-концу, (а) первый связывающий домен, (b) первую шарнирную область, (с) константную область иммуноглобулина, (d) вторую шарнирную область и (е) второй связывающий домен.

[0022] Согласно еще одному варианту реализации в настоящей заявке предложен ПСМА-связывающий полипептид, соответствующий другим описанным в настоящей заявке вариантам реализации и содержащий дополнительный связывающий домен, например, второй связывающий домен, при этом, указанный второй связывающий домен специфично связывается с Т-клеткой. Согласно определенным вариантам реализации указанный второй связывающий домен специфично связывается с Т-клеточным рецепторным (TCR) комплексом или его компонентом. Согласно некоторым вариантам реализации указанный второй связывающий домен включает такие, которые специфично связываются с CD3, например, CD3ε. Согласно некоторым вариантам указанный второй связывающий домен конкурирует за связывание CD3 с моноклональным антителом CRIS-7 или HuM291. Согласно некоторым из таких вариантов указанный второй связывающий домен содержит вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина и вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, полученные из моноклонального антитела CRIS-7 или HuM291. Например, согласно определенным вариантам реализации вариабельные области легкой и тяжелой цепей указанного второго связывающего домена представляют собой гуманизированные вариабельные области, содержащие, соответственно, CDR легкой и тяжелой цепей моноклонального антитела CRIS-7 или HuM291. Согласно другому варианту реализации вариабельные области легкой и тяжелой цепей указанного второго связывающего домена выбраны из (а) вариабельной области легкой цепи, содержащей последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентичную последовательности аминокислот, представленной остатками 139-245 последовательности SEQ ID NO: 47, и вариабельной области тяжелой цепи, содержащей последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентичную последовательности аминокислот, представленной остатками 1-121 последовательности SEQ ID NO: 47; и (b) вариабельной области легкой цепи, содержащей последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентичную последовательности аминокислот, представленной остатками 634-740 последовательности SEQ ID NO: 78, и вариабельной области тяжелой цепи, содержащей последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентичную последовательности аминокислот, представленной остатками 496-616 последовательности SEQ ID NO: 78.

[0023] Согласно определенным вариантам реализации ПСМА-связывающего полипептида, содержащего второй связывающий домен, указанный второй связывающий домен представляет собой одноцепочечный Fv (scFv). Например, согласно некоторым вариантам реализации второго связывающего домена, содержащего вариабельные области легкой и тяжелой цепей, полученные из моноклонального антитела CRIS-7, указанный второй связывающий домен представляет собой scFv, содержащий последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентичные последовательности аминокислот, выбранной из (i) последовательности аминокислот, представленной остатками 1-245 последовательности SEQ ID NO: 47, и (ii) последовательности аминокислот, представленной остатками 496-742 последовательности SEQ ID NO: 78. Согласно некоторым вариантам реализации ПСМА-связывающий полипептид содержит последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентичную последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 162 или SEQ ID NO: 164.

[0024] Согласно другому варианту реализации в настоящей заявке предложен димерный ПСМА-связывающий белок, содержащий первую и вторую полипептидные цепи, при этом каждая из указанных полипептидных цепей представляет собой ПСМА-связывающий полипептид согласно любому из вариантов реализации, описанных в настоящей заявке.

[0025] Согласно другому варианту реализации в настоящей заявке предложен ПСМА-связывающий полипептид, содержащий, в направлении от амино-конца к карбоксильному концу, (а) связывающий домен, который специфично связывается с ПСМА человека, (b) шарнирную область, (с) константную область иммуноглобулина и (d) домен гетеродимеризации иммуноглобулина. Домен гетеродимеризации может содержать, например, домен СН1 иммуноглобулина или домен CL иммуноглобулина. Согласно определенным вариантам реализации ПСМА-связывающий домен конкурирует за связывание ПСМА человека с одноцепочечным Fv (scFv), имеющим последовательность аминокислот, приведенную в SEQ ID NO: 21. Согласно определенным вариантам реализации указанные ПСМА-связывающие домены включают, например, ПСМА-связывающие домены, описанные выше.

[0026] Согласно некоторым вариантам реализации шарнирную область получают из шарнирной области иммуноглобулина, такой как, например, шарнирная область иммуноглобулина IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 или IgD. Такая шарнирная область иммуноглобулина может представлять собой шарнирную область иммуноглобулина либо дикого типа, либо модифицированную. Согласно дальнейшим вариантам реализации константная область иммуноглобулина содержит домены иммуноглобулина СН2 и СН3, такие как, например, домены СН2 и СН3 иммуноглобулина IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, или любую их комбинацию; домен СН3 иммуноглобулина IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgM или любую их комбинацию; или СН3 и домены СН4 иммуноглобулина IgE, IgM или их комбинацию.

[0027] Согласно определенным вариантам реализации ПСМА-связывающий полипептид включает по меньшей мере одну эффекторную функцию, выбранную из антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (ADCC) и комплементзависимой цитотоксичности (CDC). Согласно некоторым вариантам реализации шарнирную область получают из шарнирной области иммуноглобулина, и константная область иммуноглобулина содержит домены СН2 и СН3 иммуноглобулина IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. Согласно более конкретным вариантам шарнирную область иммуноглобулина получают из шарнирной области IgG1, и константная область иммуноглобулина содержит домены СН2 и СН3 иммуноглобулина IgG1.

[0028] Согласно определенным вариантам реализации ПСМА-связывающий полипептид содержит последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 99%, или 100%% идентичную последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 или SEQ ID NO: 61.

[0029] Согласно другому варианту реализации в настоящей заявке предложен ПСМА-связывающий белок, содержащий две неидентичные полипептидные цепи, которые связываются посредством доменов гетеродимеризации (например, доменов гетеродимеризации иммуноглобулина) с образованием гетеродимера. Согласно некоторым вариантам реализации указанный гетеродимерный ПСМА-связывающий белок содержит первую полипептидную цепь, содержащую, в направлении от амино-конца к карбоксильному концу, (а) первый связывающий домен, который специфично связывается с ПСМА, (b) первую шарнирную область, (с) первую константную область иммуноглобулина, и (d) первый домен гетеродимеризации иммуноглобулина; и второй одноцепочечный полипептид, содержащий, в направлении от амино-конца к карбоксильному концу, (а') вторую шарнирную область, (b') второй участок иммуноглобулина, и (с') второй домен гетеродимеризации иммуноглобулина, отличный от первого домена гетеродимеризации иммуноглобулина первой полипептидной цепи, причем указанные первый и второй домены гетеродимеризации иммуноглобулина связываются друг с другом с образованием гетеродимера. Согласно определенным вариантам реализации указанный ПСМА-связывающий домен конкурирует за связывание с ПСМА человека с одноцепочечным Fv (scFv), имеющим последовательность аминокислот, приведенную в SEQ ID NO: 21. Согласно определенным вариантам реализации ПСМА-связывающие домены включают, например, ПСМА-связывающие домены, описанные выше.

[0030] Согласно определенным вариантам реализации домены гетеродимеризации включают домены, содержащие либо домен СН1 иммуноглобулина, либо домен CL иммуноглобулина. Согласно некоторым вариантам реализации первый домен гетеродимеризации иммуноглобулина содержит первый домен СН1 иммуноглобулина, а второй домен гетеродимеризации иммуноглобулина содержит первый домен CL иммуноглобулина. Как вариант, согласно другим вариантам реализации первый домен гетеродимеризации иммуноглобулина содержит первый домен CL иммуноглобулина, а второй домен гетеродимеризации иммуноглобулина содержит первый домен СН1 иммуноглобулина.

[0031] Согласно некоторым вариантам реализации по меньшей мере одну из указанных первой и второй шарнирных областей получают из шарнирной области иммуноглобулина, такой как, например, шарнирная область иммуноглобулина IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 или IgD. Такая шарнирная область иммуноглобулина может представлять собой шарнирную область иммуноглобулина либо дикого типа, либо модифицированную. Согласно дальнейшим вариантам реализации по меньшей мере одна из указанных первой и второй константных областей иммуноглобулина содержит домены СН2 и СН3 иммуноглобулина, такие как, например, домены СН2 и СН3 иммуноглобулина IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, или любую их комбинацию; домен СН3 иммуноглобулина IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgM или любую их комбинацию; или домены СН3 и СН4 иммуноглобулина IgE, IgM или их комбинацию.

[0032] В определенных версиях гетеродимерного ПСМА-связывающего белка согласно описанию в настоящей заявке одна или обе из указанных первых и вторых полипептидных цепей обладают по меньшей мере одной эффекторной функцией, выбранной из: антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (ADCC) и комплементзависимой цитотоксичности (CDC). Согласно некоторым вариантам реализации каждую из указанных первой и второй шарнирных областей получают из шарнирной области иммуноглобулина, и каждая из указанных первой и второй константных областей иммуноглобулина содержит домены СН2 и СН3 иммуноглобулина IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. Согласно определенным вариантам реализации каждую из указанных первой и второй шарнирных областей получают из шарнирной области IgG1, и каждая из указанных первой и второй константных областей иммуноглобулина содержит домены СН2 и СН3 иммуноглобулина IgG1.

[0033] Согласно некоторым вариантам реализации гетеродимерного ПСМА-связывающего белка согласно описанию в настоящей заявке вторая полипептидная цепь дополнительно включает второй связывающий домен. Например, указанная вторая полипептидная цепь может дополнительно содержать второй связывающий домен со стороны амино-конца второй шарнирной области.

[0034] Согласно некоторым вариантам гетеродимерный ПСМА-связывающий белок согласно описанию в настоящей заявке может быть моноспецифическим (т.е. моноспецифическим в отношении ПСМА). Как вариант, согласно другим вариантам реализации указанный гетеродимерный ПСМА-связывающий белок является мультиспецифическим. Например, каждая полипептидная цепь указанного гетеродимера может содержать разные связывающие домены, например, первая полипептидная цепь может содержать ПСМА-связывающий домен, а вторая полипептидная цепь может содержать второй связывающий домен (например, со стороны амино-конца указанной второй шарнирной области), специфичный в отношении второго целевого антигена, отличного от ПСМА.

[0035] Согласно некоторым вариантам реализации мультиспецифического гетеродимерного ПСМА-связывающего белка указанный второй связывающий домен специфично связывается с Т-клеткой. Согласно определенным вариантам реализации связывающие Т-клетки домены включают, например, дополнительные связывающие домены и вторые связывающие домены, описанные выше. Согласно определенным вариантам реализации гетеродимерного ПСМА-связывающего белка, содержащего второй связывающий домен, который специфично связывается с Т-клеткой, например, (а) первая полипептидная цепь содержит последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентичную последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 46, и вторая полипептидная цепь содержит последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентичную последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 47; (b) первая полипептидная цепь содержит последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентичную последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 58, и вторая полипептидная цепь содержит последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентичную последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 57; (с) первая полипептидная цепь содержит последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентичную последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 59, и вторая полипептидная цепь содержит последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентичную последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 57; (d) первая полипептидная цепь содержит последовательность аминокислот, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 99%, или 100% идентичную последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 60, и вторая полипептидная цепь содержит последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентичную последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 47; или (е) первая полипептидная цепь содержит последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентичную последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 61, и вторая полипептидная цепь содержит последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентичную последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 47.

[0036] Согласно определенным вариантам реализации димерного или гетеродимерного ПСМА-связывающего белка, описанного в настоящей заявке, указанный ПСМА-связывающий белок имеет увеличенное время полужизни в сыворотке, сниженную интернализацию клеткой, экспрессирующей ПСМА, и/или увеличенное время персистенции на поверхности указанной клетки, экспрессирующей ПСМА, по сравнению с моноклональным антителом мыши 107-1А4.

[0037] Согласно другому варианту реализации, в настоящей заявке предложена выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая ПСМА-связывающий полипептид. Например, согласно некоторым вариантам указанная нуклеиновая кислота содержит последовательность нуклеотидов, приведенную в SEQ ID NO NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 53, SEQ ID: NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 161 или SEQ ID NO: 163.

[0038] Согласно другому варианту реализации в настоящей заявке предложен экспрессионный вектор для экспрессии ПСМА-связывающего полипептида или белка согласно описанию в настоящей заявке в рекомбинантной клетке-хозяине. Согласно некоторым вариантам реализации указанный экспрессионный вектор содержит сегмент нуклеиновой кислоты, кодирующий ПСМА-связывающий полипептид, причем указанный сегмент нуклеиновой кислоты функционально связан с регуляторными последовательностями, подходящими для экспрессии указанного сегмента нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине. Согласно некоторым вариантам реализации указанный сегмент нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеотидов, приведенную в SEQ ID NO NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 53, SEQ ID: NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 161 или SEQ ID NO: 163. Согласно другим вариантам реализации указанный экспрессионный вектор содержит первую и вторую экспрессионные единицы, причем указанные первая и вторая экспрессионные единицы содержат, соответственно, первый и второй сегменты нуклеиновой кислоты, кодирующие первую и вторую полипептидные цепи гетеродимерного ПСМА-связывающего белка согласно определенным вариантам реализации, описанным в настоящей заявке, при этом указанные первый и второй сегменты нуклеиновой кислоты функционально связаны с регуляторными последовательностями, подходящими для экспрессии указанных сегментов нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине. Согласно некоторым вариантам (а) первый сегмент нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеотидов, приведенную в SEQ ID NO: 44, а второй сегмент нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеотидов, приведенную в SEQ ID NO: 45; (b) первый сегмент нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеотидов, приведенную в SEQ ID NO: 53, а второй сегмент нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеотидов, приведенную в SEQ ID NO: 52; (с) первый сегмент нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеотидов, приведенную в SEQ ID NO: 54, а второй сегмент нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеотидов, приведенную в SEQ ID NO: 52; (d) первый сегмент нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеотидов, приведенную в SEQ ID NO: 55, а второй сегмент нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеотидов, приведенную в SEQ ID NO: 45; или (е) первый сегмент нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеотидов, приведенную в SEQ ID NO: 56, а второй сегмент нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеотидов, приведенную в SEQ ID NO: 45.

[0039] Согласно другому варианту реализации в настоящей заявке предложена рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая экспрессионный вектор, описанный в настоящей заявке.

[0040] Согласно другому варианту реализации в настоящей заявке предложен способ получения ПСМА-связывающего полипептида или белка. Например, согласно некоторым вариантам реализации указанный способ предназначен для получения ПСМА-связывающего полипептида, описанного в настоящей заявке. Согласно определенным вариантам реализации указанный способ в общем включает культивирование рекомбинантной клетки-хозяина, содержащей экспрессионный вектор, причем указанный экспрессионный вектор содержит сегмент нуклеиновой кислоты, кодирующий указанный ПСМА-связывающий полипептид и функционально связанный с регуляторными последовательностями, подходящими для экспрессии указанного сегмента нуклеиновой кислоты в указанной клетке-хозяине, и при этом указанное культивирование происходит в условиях, при которых экспрессируется указанный сегмент нуклеиновой кислоты, с получением таким образом указанного ПСМА-связывающего полипептида. Согласно некоторым вариантам указанный сегмент нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеотидов, приведенную в SEQ ID NO NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 53, SEQ ID: NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 161 или SEQ ID NO: 163. Согласно определенным вариантам реализации указанный способ дополнительно включает выделение указанного ПСМА-связывающего полипептида.

[0041] Согласно некоторым вариантам реализации указанный способ предназначен для получения димерного ПСМА-связывающего белка, описанного в настоящей заявке. Согласно некоторым вариантам сегмент нуклеиновой кислоты указанного экспрессионного вектора кодирует ПСМА-связывающий полипептид согласно описанию в настоящей заявке, и культивирование происходит в условиях, при которых экспрессируется указанный сегмент нуклеиновой кислоты, и кодируемый ПСМА-связывающий полипептид получают в виде димерного ПСМА-связывающего белка. Указанный способ может дополнительно включать выделение указанного димерного ПСМА-связывающего белка.

[0042] Согласно другим вариантам реализации указанный способ предназначен для получения гетеродимерного ПСМА-связывающего белка, описанного в настоящей заявке. Согласно определенным вариантам реализации указанный способ в общем включает культивирование рекомбинантной клетки-хозяина, содержащей первую и вторую экспрессионные единицы, причем указанные первая и вторая экспрессионные единицы содержат, соответственно, первый и второй сегменты нуклеиновой кислоты, кодирующие первую и вторую полипептидные цепи гетеродимерного ПСМА-связывающего белка в соответствии с описанием в настоящей заявке, при этом указанные первый и второй сегменты нуклеиновой кислоты функционально связаны с регуляторными последовательностями, подходящими для экспрессии указанных сегментов нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине, и при этом указанное культивирование осуществляют в условиях, при которых экспрессируются указанные первый и второй сегменты нуклеиновой кислоты и кодируемые полипептидные цепи получают в виде гетеродимерного ПСМА-связывающего белка. Согласно некоторым вариантам реализации указанный способ дополнительно включает выделение указанного гетеродимерного ПСМА-связывающего белка.

[0043] Согласно другому варианту реализации в настоящей заявке предложена композиция, содержащая любой из ПСМА-связывающих полипептидов или белков, описанных в настоящей заявке и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество.

[0044] Согласно другому варианту реализации в настоящей заявке предложен способ индуцирования антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (ADCC) или комплементзависимой цитотоксичности (CDC) против клетки, экспрессирующей ПСМА. Например, согласно некоторым вариантам реализации способ индуцирования ADCC или CDC против указанной клетки, экспрессирующей ПСМА, включает приведение в контакт указанной ПСМА-экспрессирующей клетки с димерным ПСМА-связывающим белком, содержащим первую и вторую полипептидные цепи, при этом каждая из указанных полипептидных цепей представляет собой ПСМА-связывающий полипептид, описанный в настоящей заявке; при этом указанный контакт осуществляют в условиях, при которых индуцируется ADCC или CDC против указанной ПСМА-экспрессирующей клетки. Согласно другим вариантам реализации способ индуцирования ADCC или CDC против указанной ПСМА-экспрессирующей клетки включает приведение указанной клетки в контакт с гетеродимерным ПСМА-связывающим белком согласно параграфу [0031], причем указанный контакт осуществляют в условиях, при которых индуцируется ADCC или CDC против указанной ПСМА-экспрессирующей клетки.

[0045] Согласно другому варианту реализации в настоящей заявке предложен способ индуцирования перенаправленной Т-клеточной цитотоксичности (RTCC) против клетки, экспрессирующей ПСМА. Согласно некоторым вариантам способ индуцирования RTCC против указанной клетки, экспрессирующей ПСМА, включает приведение в контакт указанной ПСМА-экспрессирующей клетки с димерным ПСМА-связывающим белком, содержащим первую и вторую полипептидные цепи, при этом, каждая из указанных полипептидных цепей представляет собой ПСМА-связывающий полипептид, описанный в настоящей заявке; при этом указанный контакт осуществляют в условиях, при которых индуцируется RTCC против указанной ПСМА-экспрессирующей клетки. Согласно другим вариантам реализации способ индуцирования RTCC против указанной ПСМА-экспрессирующей клетки включает приведение указанной клетки в контакт с гетеродимерным ПСМА-связывающим белком, описанным в настоящей заявке, причем указанный контакт осуществляют в условиях, при которых индуцируется RTCC против указанной ПСМА-экспрессирующей клетки.

[0046] Согласно другому варианту реализации в настоящей заявке предложен способ лечения расстройства у субъекта, отличающийся тем, что указанное расстройство характеризуется сверхэкспрессией ПСМА. Согласно некоторым вариантам реализации указанный способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества описанного выше димерного ПСМА-связывающего белка. Согласно некоторым вариантам реализации первая и вторая полипептидные цепи указанного димерного ПСМА-связывающего белка представляют собой ПСМА-связывающий полипептид, например, согласно приведенному выше описанию, и указанный димерный ПСМА-связывающий белок индуцирует перенаправленную Т-клеточную цитотоксичность (RTCC) у указанного субъекта. Согласно другим вариантам указанный способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества гетеродимерного ПСМА-связывающего белка, например, согласно приведенному выше описанию. Согласно некоторым вариантам гетеродимерный ПСМА-связывающий белок представляет собой белок согласно приведенному выше описанию, и указанный гетеродимерный ПСМА-связывающий белок индуцирует RTCC у указанного субъекта. Согласно определенным вариантам реализации описанных способов указанное расстройство представляет собой раковое заболевание, такое как, например, рак предстательной железы (например, кастрационно-резистентный рак предстательной железы), колоректальный рак, рак желудка, светлоклеточный рак почки, рак мочевого пузыря или рак легких. Согласно некоторым вариантам реализации указанное расстройство представляет собой расстройство предстательной железы, такое как, например, рак предстательной железы или доброкачественная гиперплазия предстательной железы. Согласно другим вариантам указанное расстройство представляет собой неоваскулярное расстройство. Указанное подлежащее лечению неоваскулярное расстройство может представлять собой, например, рак, характеризующийся ростом солидной опухоли, такой как, например, светлоклеточный рак почки, колоректальный рак, рак мочевого пузыря и рак легких.

[0047] Эти и другие варианты реализации и/или другие аспекты настоящего изобретения станут очевидными при ознакомлении со следующим подробным описанием настоящего изобретения и прилагаемыми чертежами.

ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0048] На Фиг. 1 представлен график, иллюстрирующий результаты анализа связывания, проведенного для сравнения родительского антитела мыши 107-1А4 (TSC045) с TSC085, TSC092 и TSC122 в ПСМА(+) (LNCaP) и ПСМА(-) (DU-145) клеточных линиях рака предстательной железы.

[0049] На Фиг. 2А представлен график, иллюстрирующий результаты исследования связывания, проведенного для сравнения гуманизированных TSC188 и TSC189 в ПСМА(+) (С4-2) и ПСМА(-) (DU-145) клеточных линиях рака предстательной железы.

[0050] На Фиг. 2В представлен график, иллюстрирующий результаты исследования связывания, проведенного для сравнения связывания гуманизированных SCORPION молекул TSC194 и TSC199 со связыванием родительских гуманизированных SMIP-молекул TSC188 и TSC189 и гибридной интерцепторной молекулы TSC122 в ПСМА(+) (С4-2) и ПСМА(-) (DU-145) клеточных линиях рака предстательной железы.

[0051] На Фиг. 3 представлен график, иллюстрирующий результаты экспериментов по сравнению интернализации родительского 107-1А4 антитела мыши и ПСМА-связывающих белков, сконструированных на интерцепторных и SMIP-каркасах (скаффолдах).

[0052] На Фиг. 4 представлен график, иллюстрирующий мощную мишенезависимую цитотоксическую активность в течение 24 часов, наблюдаемую для гибридной интерцепторной молекулы TSC122 в при уменьшении концентраций (300, 100, 30, 10 и 0 пМ) в присутствии Т-клеток из крови человека, полученной от двух разных доноров (помечены как AG и VV).

[0053] На Фиг. 5 представлен график, иллюстрирующий цитотоксическую активность TSC200, TSC202, TSC204 наряду с родительской гибридной интерцепторной молекулой TSC122.

[0054] На Фиг. 6 представлен график, иллюстрирующий Т-клеточную цитотоксичность, опосредованную гуманизированными молекулами SCORPION 107-1А4 (TSC194, TSC199, TSC212, TSC213) в сравнении с гибридной интерцепторной молекулой TSC122.

[0055] На Фиг. 7А и 7В представлены графики, иллюстрирующие мишенезависимую пролиферацию CD4+ Т-клеток (Фиг. 7А) и CD8+ Т-клеток (Фиг. 7В), индуцированную анти-ПСМА биспецифическими молекулами (TSC194, TSC199, TSC202 и TSC122), вступающими в реакцию с клетками С4-2.

[0056] На Фиг. 8А-8С представлены графики, иллюстрирующие исследование конкурентного связывания mAb J591 и J415 / mAb 107-1А4 и гибридных и гуманизированных SMIP-молекул 107-1А4, с ПСМА на клетках С4-2. В частности, на Фиг. 8А показаны результаты анализа конкурентного связывания для определения наличия конкуренции гуманизированного J591 антитела (Hu591) с 107-1А4, J591 или J415 антителами мыши за связывание ПСМА на клетках С4-2; на Фиг. 8В показаны результаты анализа конкурентного связывания для определения наличия конкуренции трех антител мыши с гибридной 107-1А4 SMIP-молекулой (TSC085) за связывание ПСМА на клетках С4-2; и Фиг. 8С показаны результаты анализа конкурентного связывания для определения наличия конкуренции трех антител мыши за связывание ПСМА на клетках С4-2 с гуманизированным 107-1А4 SMIP-молекулой (TSC189).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

I. Общее описание

[0057] В настоящем изобретении предложены ПСМА-связывающие полипептиды и белки, которые специфично связываются с простатическим специфическим мембранным антигеном (ПСМА). Введение терапевтически эффективного количества ПСМА-связывающего полипептида или белка согласно настоящему изобретению нуждающемуся в этом пациенту подходит для лечения определенных расстройств, связанных со сверхэкспрессией ПСМА, включая определенные раковые заболевания и расстройства предстательной железы. Согласно одному из вариантов реализации указанный ПСМА-связывающий полипептид или белок одновременно связывает клетка-мишень, избыточно экспрессирующую ПСМА, и Т-клетку, таким образом «перекрестно связывая» указанную клетку-мишень, избыточно экспрессирующую ПСМА, и указанную Т-клетку. Связывание обоих доменов с их мишенями вызывает мощную мишенезависимую перенаправленную Т-клеточную цитотоксичность (RTCC) (например, индуцирует мишенезависимую Т-клеточную цитотоксичность, активацию Т-клеток и пролиферацию Т-клеток).

[0058] Названия разделов в настоящей заявке служат исключительно организационным целям и не должны толковаться как ограничивающие описываемый объект изобретения. Все документы или части документов, цитируемые в настоящей заявке, включая, но не ограничиваясь перечисленными, патенты, заявки на патенты, статьи, книги и учебные руководства, явным образом включены в настоящую заявку посредством ссылки в полном объеме для любых целей. В том случае, если определение термина в одном или более из включенных документов или частей документов противоречит определению указанного термина в настоящей заявке, данное в настоящей заявке определение будет иметь преимущественную силу.

[0059] Следует понимать, что в настоящем описании любой диапазон концентраций, диапазон процентов, диапазон отношений или диапазон целочисленных значений включает значение любого целого числа в указанном диапазоне и, в соответствующих случаях, его части (например, одной десятой и одной сотой целого числа), если не указано иное. В настоящей заявке «приблизительно» означает ± 20% от указанного диапазона, значения или структуры, если не указано иное. Следует понимать, что термины в единственном числе в настоящей заявке означают «один или более» из перечисленных компонентов, если не указано иное. Упоминание альтернативных вариантов (например, «или») подразумевает один из указанных альтернативных вариантов, оба указанных альтернативных варианта или любую их комбинацию. В настоящей заявке термины «включать» и «содержать» являются синонимами. Кроме того, следует понимать, что полипептиды, содержащие различные описанные в настоящей заявке комбинации компонентов (например, доменов или областей) и заместителей, описаны в том же объеме, как если бы каждый полипептид был указан отдельно. Соответственно, выбор конкретных компонентов индивидуальных полипептидов охвачен объемом настоящего описания.

II. Определения

[0060] Используемый в настоящей заявке термин «связывающий домен» или «связывающая область» относится к домену, области, части или участку белка, полипептида, олигопептида или пептида, обладающему(ей) способностью специфично распознавать и связываться с целевой молекулой, такой как антиген, лиганд, рецептор, субстрат или ингибитор (например, CD3, ПСМА). Типовые связывающие домены включают одноцепочечные вариабельные области антител (например, доменные антитела, sFv, scFv, scFab), эктодомены и лиганды рецепторов (например, цитокины, хемокины). Согласно определенным вариантам реализации связывающий домен содержит участок связывания антигена или состоит из участка связывания антигена (например, содержит вариабельную последовательность тяжелой цепи и вариабельную последовательность легкой цепи или три определяющие комплементарность области легких цепей (CDR) и три CDR тяжелых цепей антитела, помещенные в альтернативные каркасные области (FR) (например, FR человека, где необязательно заменена одна или более аминокислота). Известны разнообразные методы анализа для идентификации связывающих доменов согласно настоящему описанию, которые специфично связываются с конкретной мишенью, в том числе вестерн-блоттинг, ELISA, скрининг библиотек фагового дисплея и анализ взаимодействия BIACORE®. В настоящей заявке ПСМА-связывающий полипептид может содержать «первый связывающий домен» и, необязательно, «второй связывающий домен». Согласно определенным вариантам реализации указанный «первый связывающий домен» представляет собой ПСМА-связывающий домен и, в зависимости от конкретного формата полипептида (например, SMIP или PIMS), могут быть расположены либо на амино-конце, либо на карбоксильном конце. Согласно определенным вариантам реализации, подразумевающим наличие и первого и второго связывающего домена, второй связывающий домен представляет собой связывающий Т-клетки домен, такой как scFv, полученный из моноклонального антитела мыши (например, CRIS-7), который связывается с антигеном поверхности Т-клеток (например, CD3). Согласно другим вариантам реализации указанный второй связывающий домен представляет собой второй ПСМА-связывающий домен. Согласно дальнейшим вариантам реализации указанный второй связывающий домен представляет собой связывающий домен, отличный от ПСМА-связывающего домена или связывающего Т-клетки домена.

[0061] Связывающий домен «специфично связывает» мишень, если он связывает указанную мишень со сродством (аффинностью) или K_a (т.е. равновесной константой связывания конкретного связывающего взаимодействия в единицах 1/М), равным или большим, чем 10⁵ М^-1, в то же время не связывая в выраженной степени другие компоненты, присутствующие в тестируемом образце. Связывающие домены могут быть классифицированы на «высокоаффинные» связывающие домены и «низкоаффинные» связывающие домены. «Высокоаффинные» связывающие домены относятся к связывающим доменам с K_a, равной по меньшей мере 10⁷ М^-1, по меньшей мере 10⁸ М^-1, по меньшей мере 10⁹ М^-1, по меньшей мере 10¹⁰ М^-1, по меньшей мере 10¹¹ М^-1, по меньшей мере 10¹² М^-1 или по меньшей мере 10¹³ М^-1. «Низкоаффинные» связывающие домены относятся к связывающим доменам с K_a, значение которой составляет до 10⁷ М^-1, до 10⁶ М^-1, до 10⁵ М^-1. Как вариант, аффинность может быть определена как равновесная константа диссоциации (K_d) конкретного связывающего взаимодействия в единицах М (например, от 10^-5 М до 10^-13 М). Аффинности полипептидов связывающего домена и одноцепочечных полипептидов, соответствующих настоящему описанию, могут быть легко определены с применением обычных методов (см., например, Scatchard et al. (1949) Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660; и патенты США №5283173, №5468614, или эквивалентные).

[0062] «CD3» известен в данной области техники как мультибелковый комплекс из 6 цепей (см., например, Abbas and Lichtman, 2003; Janeway et al., p. 172, 178, 1999), представляющих собой субъединицы Т-клеточного рецепторного комплекса. У млекопитающих субъединицы CD3 Т-клеточного рецепторного комплекса представлены цепью CD3γ, цепью CD3δ, двумя цепями CD3ε и гомодимером цепей CD3ζ. Цепи CD3γ, CD3δ и CD3ε представляют собой белки клеточной поверхности из суперсемейства иммуноглобулинов, содержащие один домен иммуноглобулина. Трансмембранные области цепей CD3γ, CD3δ и CD3ε отрицательно заряжены, что представляет собой характеристику, позволяющую указанным цепям связываться с положительно заряженными цепями Т-клеточного рецептора. Каждый из внутриклеточных сегментов цепей CD3γ, CD3δ, и CD3ε содержит одиночный консервативный мотив, известный как иммунорецепторный тирозиновый активирующий мотив, или ITAM, в то время как каждая цепь CD3ζ содержит три таких мотива. Полагают, что ITAM имеют важное значение для сигнальной способности TCR-комплекса. CD3 в настоящей заявке может относиться к CD3 из различных видов животных, включая человека, обезьян, мышь, крысу или других млекопитающих.

[0063] В настоящей заявке под «консервативной заменой» согласно принятому в данной области техники значению имеется в виду замена одной аминокислоты на другую аминокислоту, обладающую сходными свойствами. Типовые консервативные замены общеизвестны в данной области техники (см., например, WO 97/09433, стр. 10, опубликованную 13 марта 1997 г.; Lehninger, Biochemistry, Second Edition; Worth Publishers, Inc. NY:NY (1975), pp. 71-77; Lewin, Genes IV, Oxford University Press, NY and Cell Press, Cambridge, MA (1990), p. 8). Согласно определенным вариантам реализации консервативная замена включает замену лейцина на серин.

[0064] Используемый в настоящей заявке термин «производное» относится к модификации одного или более аминокислотного остатка пептида химическим или биологическим способом, с применением либо без применения фермента, например, гликозилированием, алкилированием, ацилированием, получением сложного эфира или получением амида.

[0065] В настоящей заявке под полипептидной или аминокислотной последовательностью, «полученной из» определенного полипептида или белка, подразумевается происхождение указанного полипептида. Согласно определенным вариантам реализации полипептидная или аминокислотная последовательность, которая происходит из конкретной последовательности (иногда называемой «начальной» или «родительской» или «исходной» последовательностью) содержит последовательность аминокислот, в существенной степени идентичную начальной последовательности или ее части, при этом, указанная часть состоит по меньшей мере из 10-20 аминокислот, по меньшей мере из 20-30 аминокислот, или по меньшей мере из 30-50 аминокислот, или по меньшей мере из 50-150 аминокислот, либо такой фрагмент, который специалист в данной области техники сможет иначе идентифицировать как происходящий из указанной начальной последовательности.

[0066] Полипептиды, полученные из другого полипептида, могут содержать одну или более мутацию относительно начального полипептида, например, замену одного или более аминокислотного остатка другим аминокислотным остатком, либо вставку или удаление одного или более аминокислотных остатков. Указанный полипептид может содержать последовательность аминокислот, не встречающуюся в природе. Такие версии обязательно обладают менее чем 100% идентичностью, или сходством, с последовательностями изначального полипептида. Согласно одному из вариантов реализации версия имеет последовательность аминокислот, идентичную или сходную с последовательностью аминокислот начального полипептида приблизительно на 60% - менее чем на 100%. Согласно другому варианту реализации версия имеет последовательность аминокислот, идентичную или сходную с последовательностью аминокислот начального полипептида приблизительно на 75% - менее чем на 100%, приблизительно на 80% - менее чем на 100%, приблизительно на 85% - менее чем 100%, приблизительно на 90% - менее чем на 100%, приблизительно на 95% - менее чем на 100%.

[0067] В настоящей заявке, если не указано иное, положения аминокислотных остатков в вариабельной области молекулы иммуноглобулина пронумерованы в соответствии с системой нумерации по Kabat (Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest («Последовательности белков, представляющих иммунологический интерес»), 5^th ed. Bethesda, MD: Public Health Service, National Institutes of Health (1991)), а положения аминокислотных остатков в константной области молекулы иммуноглобулина пронумерованы в соответствии с номенклатурой EU (Ward et al., 1995 Therap. Immunol. 2:77-94).

[0068] Используемый в настоящей заявке термин «димер» относится к биологическому образованию, которое состоит из двух субъединиц, связанных друг с другом за счет одного или более вида внутримолекулярных сил, включая ковалентные связи (например, дисульфидные связи) и других взаимодействий (например, электростатических взаимодействий, солевых мостиков, водородной связи и гидрофобных взаимодействий), и стабилен в подходящих условиях (например, в физиологических условиях, в водном растворе, подходящем для экспрессирования, очищения и/или хранения рекомбинантных белков, или в условиях для неденатурирующего и/или невосстанавливающего электрофореза). Термин «гетеродимер» или «гетеродимерный белок» в настоящей заявке относится к димеру, образованному двумя разными полипептидами. «Гетеродимер» не включает антитело, образованное четырьмя полипептидами (т.е. двумя легкими цепями и двумя тяжелыми цепями). Термин «гомодимер» или «гомодимерный белок» в настоящей заявке относится к димеру, образованному двумя идентичными полипептидами.

[0069] В настоящей заявке «шарнирная область» или «шарнир» относится к полипептиду, полученному из (а) междоменной области трансмембранного белка (например, трансмембранного белка I типа); или (b) области «ствола» С-лектина II типа. Например, шарнирная область может быть получена из междоменной области члена суперсемейства иммуноглобулинов; подходящие шарнирные области этого конкретного класса включают (i) шарнирные области иммуноглобулинов (состоящие из, например, верхней(их) и/или сердцевинной(ых) области(областей)) или их функциональные варианты, включая шарнирные области иммуноглобулина, дикого типа и модифицированные, и (ii) области (или их функциональные варианты), соединяющие V-подобные или С-подобные домены иммуноглобулинов.

[0070] Термин «шарнирная область иммуноглобулина дикого типа» относится к встречающимся в природе верхним и средним шарнирным последовательностям аминокислот, располагающимся между доменами СН1 и СН2 и соединяющим их (в IgG, IgA, и IgD) или располагающимся между доменами СН1 и СН3 и соединяющим их (в IgE и IgM), обнаруживаемым в тяжелой цепи антитела. Согласно определенным вариантам реализации последовательность шарнирной области иммуноглобулина дикого типа представляет собой последовательность человека и может содержать шарнирную область IgG человека.

[0071] Термин «модифицированная шарнирная область иммуноглобулина дикого типа» или «модифицированная шарнирная область иммуноглобулина» относится к (а) шарнирной области иммуноглобулина дикого типа, содержащей до 30% изменений аминокислотного состава (например, до 25%, 20%, 15%, 10%, или 5% аминокислот заменены или удалены), или (b) части шарнирной области дикого типа иммуноглобулина, длина которого составляет от приблизительно 5 аминокислот (например, приблизительно 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 аминокислот) до приблизительно 120 аминокислот (например, длина составляет от приблизительно 10 до приблизительно 40 аминокислот, или от приблизительно 15 до приблизительно 30 аминокислот, или от приблизительно 15 до приблизительно 20 аминокислот, или от приблизительно 20 до приблизительно 25 аминокислот), содержащему приблизительно до 30% изменений аминокислотного состава (например, приблизительно до 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1% аминокислот заменены или удалены, либо присутствует комбинация указанных изменений), и содержит сердцевинную шарнирную область IgG, раскрытую в PCT/US 2010/62436 и PCT/US 2010/62404.

[0072] Используемый в настоящей заявке термин «гуманизированное» относится к процессу получения антитела или иммуноглобулиновых связывающих белков и полипептидов, полученных от не являющихся человеком видов (например, мыши или крысы), менее иммуногенных для человека, но при этом сохраняющих антиген-связывающие свойства исходного антитела, с применением методов генной инженерии. Согласно некоторым вариантам реализации указанный(ые) связывающий(ие) домен(ы) антитела или иммуноглобулин-связывающих белков и полипептидов (например, вариабельные области легкой и тяжелой цепей, Fab, scFv) гуманизированы. Связывающие домены, полученные не от человека, могут быть гуманизированы с применением методики, известной как CDR-прививка (Jones et al., Nature 321:522 (1986)) и ее вариантов, включая «реконструирование» (Verhoeyen, et al., 1988 Science 239:1534-1536; Riechmann, et al., 1988 Nature 332:323-337; Tempest, et al., Bio/Technol 1991 9:266-271), «гиперхимеризация» (Queen, et al., 1989 Proc Natl Acad Sci USA 86:10029-10033; Co, et al., 1991 Proc Natl Acad Sci USA 88:2869-2873; Co, et al., 1992 J Immunol 148:1149-1154), и «виниринг» («реконструирование поверхности») (Mark, et al., "Derivation of therapeutically active humanized and veneered anti-CD18 antibodies («Дериватизация терапевтически активных гуманизированных антител против CD18 с реконструированной поверхностью»). Из: Metcalf BW, Dalton BJ, eds. Cellular adhesion: molecular definition to therapeutic potential. New York: Plenum Press, 1994: 291-312). Полученные из отличного от человека источника другие области антитела или иммуноглобулин-связывающих белков и полипептидов, такие как домены шарнирной области и константной области, могут также быть гуманизированы.

[0073] Термин «домен димеризации иммуноглобулина» или «домен гетеродимеризации иммуноглобулина» в настоящей заявке относится к домену иммуноглобулина полипептидной цепи, который преимущественно взаимодействует или связывается с другим доменом иммуноглобулина второй полипептидной цепи, при этом взаимодействие разных доменов гетеродимеризации иммуноглобулина существенно способствует или эффективно содействует гетеродимеризации указанных первой и второй полипептидных цепей (т.е. образованию димера из двух разных полипептидных цепей, также называемого «гетеродимером»). Взаимодействие между доменами гетеродимеризации иммуноглобулина «существенно способствует или эффективно содействует» гетеродимеризации первой и второй полипептидной цепей, если имеется статистически значимое уменьшение димеризации между указанными первой и второй полипептидными цепями в отсутствие домена гетеродимеризации иммуноглобулина первой полипептидной цепи и/или домена гетеродимеризации иммуноглобулина второй полипептидной цепи. Согласно определенным вариантам реализации, если первая и вторая полипептидные цепи коэкспрессируются, по меньшей мере 60%, по меньшей мере приблизительно 60% - приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 70% - приблизительно 80%, по меньшей мере на 80% - приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% указанных первой и второй полипептидных цепей образуют гетеродимеры друг с другом. Типовые домены гетеродимеризации иммуноглобулина включают домен СН1 иммуноглобулина, домен CL иммуноглобулина (например, Сκ или Сλ изотипы), или их производные, включая домены СН1 и CL иммуноглобулина дикого типа и модифицированные (или мутированные) домены СН1 и CL иммуноглобулина, согласно описанию в настоящей заявке.

[0074] Термин «константная область иммуноглобулина» или «константная область» в настоящей заявке относится к пептидной или полипептидной последовательности, которая представляет собой частично или полностью один или более доменов константной области, или получена из нее. Согласно определенным вариантам реализации константная область иммуноглобулина представляет собой частично или полностью один или более доменов константной области, или получена из нее, но не все домены константной области исходного антитела. Согласно определенным вариантам реализации константная область содержит домены IgG CH2 и СН3, например, домены IgG1 CH2 и СН3. Согласно определенным вариантам реализации константная область не содержит домен СН1. Согласно определенным вариантам реализации домены константной области, составляющие указанную константную область, являются доменами человека. Согласно некоторым вариантам реализации (например, в определенных версиях ПСМА-связывающего полипептида или белка, включающих второй связывающий домен, который специфично связывается с CD3 или другим антигеном поверхности Т-клеток) домены константной области гибридного белка согласно настоящему описанию не обладают или обладают минимальными эффекторными функциями антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (ADCC), активации комплемента и комплементзависимой цитотоксичности (CDC), сохраняя в то же самое время способность связывать некоторые F_c-рецепторы (например, F_cRn, неонатальный Fc-рецептор) и относительно длинный период полужизни in vivo. Согласно другим вариантам гибридный белок согласно настоящему описанию включает константные домены, которые сохраняют такую эффекторную функцию, либо что-то одно, либо и ADCC, и CDC. Согласно определенным вариантам реализации связывающий домен согласно настоящему описанию слит с константной областью IgG1 человека, при этом в указанной константной области IgG1 мутирована одна или более из следующих аминокислот: лейцин в положении 234 (L234), лейцин в положении 235 (L235), глицин в положении 237 (G237), глутамат в положении 318 (Е318), лизин в положении 320 (K320), лизин в положении 322 (K322), или присутствует любая комбинация указанных мутаций (нумерация соответствует EU). Например, любая(ые) одна или более из указанных аминокислот может(гут) быть заменена(ы) на аланин. Согласно еще одному варианту реализации в Fc-домене IgG1 все остатки L234, L235, G237, Е318, K320, и K322 (в соответствии с системой нумерации EU) заменены на аланин (т.е. L234A, L235A, G237A, Е318А, K320A, и K322A соответственно), и необязательно дополнительно присутствует мутация N297A (т.е. гликозилирование домена CH2 в существенной степени подавляется).

[0075] «Fc-область» или «Fc-домен» относится к полипептидной последовательности, соответствующей или полученной из части исходного антитела, отвечающего за связывание с рецепторами антитела на клетках и компонент C1q комплемента. Fc означает «кристаллизующийся фрагмент», фрагмент антитела, легко образующий белковый кристалл. Определенные белковые фрагменты, изначально описанные с помощью протеолитического расщепления, могут полностью определять общую структуру белка-иммуноглобулина. Согласно первоначальному определению в литературе Fc фрагмент состоит из связанных дисульфидной связью шарнирных областей тяжелой цепи, доменов CH2 и СН3. Однако недавно указанный термин был использован для обозначения одиночной цепи, состоящей из СН3, CH2 и по меньшей мере части шарнирной области, достаточной для образования за счет дисульфидной связи димера с второй такой цепью. Для ознакомления с обзором структуры и функций иммуноглобулинов см. Putnam, The Plasma Proteins («Белки плазмы»), Vol. V (Academic Press, Inc., 1987), pp. 49-140; и Padlan, Mol. Immunol. 31:169-217, 1994. Используемый в настоящей заявке термин Fc включает варианты встречающихся в природе последовательностей.

[0076] В настоящей заявке термин «SMIP» означает белковый скаффолд согласно общим описаниям, например, в опубликованных заявках на патент США №2003/0133939, 2003/0118592 и 2005/0136049, включенных в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылок. Под «ПСМА-специфическими SMIP-молекулами» или «SMIP-молекулами», описанными в Примерах и на протяжении всего настоящего описания, подразумеваются ПСМА-связывающие белки, содержащие каркасные структуры SMIP; например, в направлении от амино-конца к карбоксильному концу, первый связывающий домен, шарнирную область и константную область иммуноглобулина.

[0077] В настоящей заявке термин «PIMS» означает белковый скаффолд согласно общим описаниям, например, в опубликованной заявке на патент США №2009/0148447, включенной в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки. Под «ПСМА-специфическими PIMS-молекулами» или «PIMS-молекулами» описанными в Примерах и на протяжении всего настоящего описания, подразумеваются ПСМА-связывающие белки, содержащие каркасные структуры PIMS, например, в направлении от амино-конца к карбоксильному концу, константную область, шарнирную область и первый связывающий домен иммуноглобулина.

[0078] В настоящей заявке термин «интерцептор/интерцепторный» используется для обозначения моноспецифического или мультиспецифического гетеродимерного белкового скаффолда, соответствующего общему описанию в заявках PCT/US 2010/62436 и PCT/US 2010/62404, полностью включенных в настоящую заявку. Под «ПСМА-специфическими интерцепторными молекулами» или «интерцепторными молекулами», описанными в Примерах и на протяжении всего настоящего описания, подразумеваются ПСМА-связывающие белки, содержащие интерцепторные каркасные структуры, например, две неидентичные полипептидные цепи, где каждая полипептидная цепь содержит домен гетеродимеризации иммуноглобулина. Взаимодействующие домены гетеродимеризации иммуноглобулина различаются. Согласно одному из вариантов реализации домен гетеродимеризации иммуноглобулина содержит домен СН1 или его производное. Согласно другому варианту реализации домен гетеродимеризации иммуноглобулина содержит домен CL или его производное. Согласно одному из вариантов реализации указанный домен CL представляет собой Сκ или Сλ изотип или его производное.

[0079] В настоящей заявке «SCORPION» представляет собой термин, используемый для обозначения мультиспецифического связывающего белкового скаффолда. SCORPION™ является торговой маркой Emergent Product Development Seattle, LLC. Мультиспецифические связывающие белки и полипептиды описаны, например, в опубликованной заявке PST № WO 2007/146968, опубликованной заявке на патент США №2006/0051844, опубликованной заявке PST № WO 2010/040105, опубликованной заявке PST № WO 2010/003108 и в патенте США №7166707, включенных в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылок. Полипептид SCORPION содержит два связывающих домена (указанные домены могут быть сконструированы таким образом, чтобы специфично связываться с одной или разными мишенями), два шарнирные области и константную область иммуноглобулина. Белки SCORPION представляют собой гомодимерные белки, содержащие два идентичных, связанных дисульфидной связью полипептида SCORPION. Под «ПСМА-специфические молекулами SCORPION» или «молекулами SCORPION», описанными в Примерах и на протяжении всего настоящего описания, подразумеваются ПСМА-связывающие белки, содержащие каркасную структуру SCORPION, например, два связывающих домена (указанные домены могут быть сконструированы таким образом, чтобы специфично связываться с одной и той же или разными мишенями), две шарнирные области и константную область иммуноглобулина.

[0080] В настоящей заявке термин «область «ствола» С-лектина II типа относится к части внеклеточного домена С-лектина II типа, который расположен между С-типа лектиноподобный домен (CTLD; например, сходный с CTLD рецепторами естественных клеток-киллеров) и трансмембранным доменом. Например, в молекуле CD94 человека (номер доступа GenBank AAC50291.1, PRI, 30 ноября 1995 г.) внеклеточный домен соответствует аминокислотным остаткам 34-179, в то время как CTLD соответствует аминокислотным остаткам 61-176. Соответственно, область «ствола» молекулы CD94 человека включает аминокислотные остатки 34-60, обнаруживаемые между мембраной и CTLD (см. Boyington et al., Immunity 10:75, 1999; для ознакомления с описанием другие областей «ствола», см. также Beavil et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:753, 1992; и Figdor et al., Nature Rev. Immunol. 2:77, 2002). Указанные С-лектины II типа могут также содержать от 6 до 10 соединительных аминокислот между областью «ствола» и трансмембранной областью или CTLD. В другом примере состоящий из 233 аминокислот NKG2A белок человека (номер доступа GenBank P26715.1, PRI, 15 июня 2010 г.) имеет трансмембранный домен, занимающий аминокислоты 71-93, и внеклеточный домен, занимающий аминокислоты 94-233. CTLD состоит из аминокислот 119-231, и область «ствола» содержит аминокислоты 99-116, и фланкирован соединениями из пяти и двух аминокислот. Другие С-лектины II типа, а также их внеклеточные лиганд-связывающие домены, междоменные области или области «ствола», и CTLD известны в данной области техники (см., например, номера доступа GenBank NP_001993.2; AAH07037.1, PRI, 15 июля 2006 г.; NP_001773.1, PRI, 20 июня 2010 г.; AAL65234.1, PRI, 17 января 2002, и САА04925.1, PRI, 14 ноября 2006 г., для ознакомления с последовательностями человека CD23, CD69, CD72, NKG2A и NKG2D и их описаниями, соответственно).

[0081] В настоящей заявке термин «междоменная область» трансмембранного белка (например, трансмембранный белок I типа) относится к части внеклеточного домена указанного трансмембранного белка, который расположен между двумя смежными доменами. Примеры междоменных областей включают области, соединяющие смежные Ig домены у представителей суперсемейства иммуноглобулинов (например, шарнирная область иммуноглобулина IgG, IgA, IgD или IgE; область, соединяющая домены IgV и IgC2 CD2; или область, соединяющая домены IgV и IgC CD80 или CD86). Другим примером междоменной области является область, соединяющая неиммуноглобулиновый домен и IgC2 домен CD22, связывающего сиаловую кислоту Ig-подобного лектина I типа.

[0082] Полипептидный участок, «полученный из» области «ствола» С-лектина II типа или «полученный из» междоменной области трансмембранного белка (например, шарнирной области иммуноглобулина), относится к последовательности, состоящей из приблизительно 5 - приблизительно 150 аминокислот, последовательностям, состоящим из приблизительно 5 - приблизительно 100 аминокислот, последовательностям, состоящим из приблизительно 5 - приблизительно 50 аминокислот, последовательностям, состоящим из приблизительно 5 - приблизительно 40 аминокислот, последовательностям, состоящим из приблизительно 5 - приблизительно 30 аминокислот, последовательностям, состоящим из приблизительно 5 - приблизительно 25 аминокислот, последовательностям, состоящим из приблизительно 5 - приблизительно 20 аминокислот, последовательностям, состоящим из приблизительно 10 - приблизительно 25 аминокислот, последовательностям, состоящим из приблизительно 10 - приблизительно 20 аминокислот, приблизительно 8 - приблизительно 20 аминокислот, приблизительно 9 - приблизительно 20 аминокислот, приблизительно 10 - приблизительно 20 аминокислот, приблизительно 11 - приблизительно 20 аминокислот, приблизительно 12 - приблизительно 20 аминокислот, приблизительно 13 - приблизительно 20 аминокислот, приблизительно 14 - приблизительно 20 аминокислот, приблизительно 15 - приблизительно 20 аминокислот, или к последовательностям, приблизительно 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, или 20 аминокислот, при этом все они или по меньшей мере их часть включает(ют) (i) последовательность дикого типа области «ствола» или междоменной области; (ii) фрагмент последовательности дикого типа области «ствола» или междоменной области; (iii) полипептид, имеющий последовательность аминокислот, по меньшей мере на 80%, 85%, 90% или 95% идентичную либо (i), либо (ii); или (iv): либо (i), либо (ii), в которым одна, две, три, четыре или пять аминокислот удалены, вставлены, заменены или имеется любая комбинация указанного, например, одно или более изменение представляет собой замену, или указанная одна или более мутация включает только одно удаление. Согласно некоторым вариантам реализации производное области «ствола» более устойчиво к протеолитическому расщеплению по сравнению с последовательностью области «ствола» дикого типа, например, полученные приблизительно из 8 - приблизительно 20 аминокислот NKG2A, NKG2D, CD23, CD64, CD72 или CD94.

[0083] Используемый в настоящей заявке термин «соединительные аминокислоты» или «соединительные аминокислотные остатки» относится к одному или более (например, приблизительно 2-10) аминокислотным остаткам между двумя смежными областями или доменами полипептида, например, между шарниром и смежной константной областью иммуноглобулина, или между шарниром и смежным связывающим доменом, или между пептидным линкером, соединяющим два вариабельных домена иммуноглобулина, и смежным вариабельным доменом иммуноглобулина. Соединительные аминокислоты могут быть обусловлены конструктивной схемой полипептида (например, аминокислотные остатки, обусловленные применением сайта расщепления рестриктазой при конструировании молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид).

[0084] В настоящей заявке выражение «линкер между СН3 и СН1 или CL» относится к одному или более (например, приблизительно 2-12, приблизительно 2-10, приблизительно 4-10, приблизительно 5-10, приблизительно 6-10, приблизительно 7-10, приблизительно 8-10, приблизительно 9-10, приблизительно 8-12, приблизительно 9-12, или приблизительно 10-12) аминокислотному остатку между С-концом домена СН3 (например, СН3 дикого типа или мутированного СН3) и амино-концом домена СН1 или домена CL (например, Ck).

[0085] Используемый в настоящей заявке термин «нуждающийся пациент» относится к пациенту, у которого имеется риск возникновения заболевания, расстройства или состояния, поддающегося лечению или облегчаемого ПСМА-связывающим белком или полипептидом или его композицией согласно настоящей заявке, или страдающего от такого заболевания, расстройства или состояния.

[0086] Используемый в настоящей заявке термин «пептидный линкер» относится к последовательности аминокислот, соединяющей вариабельную область тяжелой цепи с вариабельной областью легкой цепи и обеспечивающей спейсерную функцию, совместимую с взаимодействием двух связывающих субдоменов, так что полученный полипептид сохраняет специфическую связывающую способность в отношении той же целевой молекулы, что и антитело, содержащее такие же вариабельные области легкой и тяжелой цепей. Согласно определенным вариантам реализации линкер состоит из 5 - приблизительно 35 аминокислот, например, приблизительно 15 - приблизительно 25 аминокислот.

[0087] Используемый в настоящей заявке термин «фармацевтически приемлемый» относится к молекулярным субстанциям и композициям, не дающим аллергических или других серьезных нежелательных реакций при введении с применением путей, общеизвестных в данной области техники. Молекулярные субстанции и композиции, одобренные регулирующим органом федерального или государственного управления, либо приведенные в Фармакопее США или других общепризнанных фармакопеях для применения у животных, и конкретнее - у людей, считаются «фармацевтически приемлемыми».

[0088] Используемый в настоящей заявке термин «промотор» относится к области ДНК, вовлеченной в связывание РНК-полимеразы для инициации транскрипции.

[0089] В настоящей заявке термины «нуклеиновая кислота», «молекула нуклеиновой кислоты» или «полинуклеотид» относятся к дезоксирибонуклеотидам или рибонуклеотидами и их полимерам в одноцепочечной или двуцепочечной форме. Если отдельно не приведены ограничения, указанные термины охватывают нуклеиновые кислоты, содержащие аналоги природных нуклеотидов со сходными связывающими качествами, что и у исходной нуклеиновой кислоты, и метаболизирующиеся сходным с встречающимися в природе нуклеотидами образом. Если не указано иное, конкретная последовательность нуклеиновой кислоты также потенциально охватывает ее консервативно модифицированные варианты (например, замены вырожденных кодонов) и комплементарные последовательности, а также явным образом указанную последовательность. В частности, замены вырожденных кодонов могут производиться синтезом последовательностей, в которых положение 3 одного или более выбранного (либо всех) кодонов заменяют на остатки смешанных оснований и/или дезоксиинозина (Batzer et al. (1991) Nucleic Acid Res. 19:5081; Ohtsuka et al. (1985) J. Biol. Chem. 260:2605-2608; Cassol et al. (1992); Rossolini et al. (1994) Mol. Cell. Probes 8:91-98). Термин «нуклеиновая кислота» используется взаимозаменяемо с терминами «ген», «кДНК» и «мРНК, кодируемая геном». В настоящей заявке подразумевается, что термины «нуклеиновая кислота», «молекула нуклеиновой кислоты» или «полинуклеотид» включают молекулы ДНК (например, кДНК или геномная ДНК), молекулы РНК (например, мРНК), аналоги указанных ДНК или РНК, полученные с применением аналогов нуклеотидов, и их производные, фрагменты и гомологи.

[0090] Термин «экспрессия» относится к биосинтезу продукта, кодируемого нуклеиновой кислотой. Например, в случае сегмента нуклеиновой кислоты, кодирующего представляющий интерес полипептид, экспрессия включает транскрипцию указанного сегмента нуклеиновой кислоты в мРНК и трансляцию мРНК в один или более полипептид.

[0091] Термины «экспрессионная единица» и «экспрессионная кассета» используются в настоящей заявке взаимозаменяемо и обозначают сегмент нуклеиновой кислоты, кодирующий представляющий интерес полипептид и способный обеспечивать экспрессию указанного сегмента нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине. Экспрессионная единица, как правило, содержит промотор транскрипции, открытую рамку считывания, кодирующую представляющий интерес полипептид, и терминатор транскрипции, все в функциональной конфигурации. Кроме промотора и терминатора транскрипции экспрессионная единица может дополнительно включать другие сегменты нуклеиновой кислоты, такие как, например, энхансер или сигнал полиаденилирования.

[0092] Термин «экспрессионный вектор» в настоящей заявке относится к молекуле нуклеиновой кислоты, линейной или циклической, содержащей одну или более экспрессионную единицу. Кроме одной или более экспрессионной единицы экспрессионный вектор может дополнительно включать дополнительные сегменты нуклеиновой кислоты, такие как, например, одна или более точка начала репликации или один или более селектируемый маркер. Экспрессионные векторы обычно получают из плазмидной или вирусной ДНК, либо они могут содержать элементы и того, и другого.

[0093] Используемый в настоящей заявке термин «идентичность последовательностей» относится к отношению друг к другу двух или более полинуклеотидных последовательностей или двух или более полипептидных последовательностей. Если положение в одной последовательности занято тем же основанием нуклеиновой кислоты или аминокислотным остатком в соответствующем положении сравниваемой последовательности, говорят, что последовательности «идентичны» по указанному положению. Процент «идентичности последовательностей» рассчитывают, определяя число положений, занятых в обеих последовательностях идентичными основаниями нуклеиновых кислот или аминокислотными остатками, с получением числа «идентичных» положений. Число «идентичных» положений затем делят на общее число положений в окне сравнения и умножают на 100 для получения процента «идентичности последовательностей». Процент «идентичности последовательностей» определяют, сравнивая две оптимально выровненных последовательности в окне сравнения. Размер окна сравнения для последовательности нуклеиновых кислот может составлять, например, по меньшей мере 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 или 1000 или более нуклеиновых кислот. Длина окна сравнения для полипептидных последовательностей может составлять, например, по меньшей мере 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300 или более аминокислот. Для оптимального выравнивания последовательностей для их сравнения часть полинуклеотидной или полипептидной последовательности в окне сравнения могут быть включены добавления или удаления, называемые «гэпами» (пропусками), тогда как исходную последовательность оставляют неизменной. Оптимальное выравнивание представляет собой такое выравнивание, которое, даже при наличии пропусков, дает максимальное возможное число «идентичных» положений между исходной и сравниваемой последовательностями. Процент «идентичности последовательностей» между двумя последовательности может быть определен с применением версии программы «BLAST 2 Sequences», предоставляемой Национальным центром биотехнологической информации (National Center for Biotechnology Information) от 01.09.2004 г., включающей программы BLASTN (для сравнения последовательностей нуклеотидов) и BLASTP (для сравнения полипептидных последовательностей), основанных на алгоритме Карлина-Альтшуля (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(12):5873-5877, 1993). При использовании «BLAST 2 Sequences» могут применяться дефолтные по состоянию на 01.09.2004 г. параметры, включающие длину сегмента (word size) (3), штраф за внесение пропуска (open gap penalty) (11), штраф за продолжение пропуска (extension gap penalty) (1), максимальное продление сегментов при выравнивании с пробелами (gap dropoff) (50), величину Е (expect value) (10) и любые другие требуемые параметры, включая, но не ограничиваясь указанным, применение матрицы сравнения. Две последовательности нуклеотидов или аминокислот считаются имеющими «существенную степень сходства последовательностей» или «в существенной степени идентичными последовательностями», если указанные две последовательности по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% идентичны друг другу.

[0094] В настоящей заявке «полипептид» или «полипептидная цепь» представляет собой одиночную линейную непрерывную структуру из ковалентно связанных аминокислот. Он не включает две полипептидные цепи, соединенные нелинейно, например, посредством межцепочечной дисульфидной связи (например, половина молекулы иммуноглобулина, где легкая цепь соединена с тяжелой цепью за счет дисульфидной связи). Полипептиды могут содержать или образовывать одну или более внутрицепочечную дисульфидную связь. Что касается полипептидов, описанных в настоящей заявке, под аминокислотными остатками, соответствующими указанным в SEQ ID NO, подразумеваются и посттрансляционные модификации таких остатков.

[0095] «Белок» представляет собой макромолекулу, содержащую одну или более полипептидную цепь. Белок может также содержать непептидные компоненты, такие как углеводные группы. Углеводы и другие непептидные заместители могут добавляться к белку клеткой, в которой синтезируется указанный белок, и варьируют в зависимости от типа клетки. Белки определены в настоящей заявке через структуру их аминокислотного остова; заместители, такие как углеводные группы, обычно не указываются, но, тем не менее, могут присутствовать.

[0096] В настоящей заявке термин «малые модульные иммунофармацевтические белки» («small modular immunopharmaceutical proteins»), или SMIP, относится к белковому скаффолду, описанному в общих чертах, например, в опубликованных патентах США №2003/0133939, №2003/0118592 и №2005/0136049. SMIP™ представляет собой торговую марку Emergent Product Development Seattle LLC. SMIP-белок может содержать полипептидную цепь, включающую связывающий домен, шарнирную область и константную область иммуноглобулина.

[0097] Термины «амино-концевой» и «карбокси-концевой» в настоящей заявке применяются для обозначения положений в полипептидах. Если позволяет контекст, указанные термины применяют в отношении конкретной последовательности или части полипептида для обозначения близости или относительного расположения. Например, определенная последовательность, расположенная со стороны карбоксильного конца референтной последовательности в составе полипептида, расположена возле карбоксильного конца референтной последовательности, но не обязательно на карбоксильном конце всего полипептида.

[0098] «Т-клеточный рецептор» (TCR) представляет собой молекулу, обнаруживаемую на поверхности Т-клеток, которая, вместе с CD3, в основном отвечает за распознавание антигенов, связанных с молекулами главного комплекса гистосовместимости (МНС). В большинстве Т-клеток он состоит из связанного дисульфидной связью гетеродимера высоковариабельных α и β цепей. В других Т-клетках экспрессируется альтернативный вариант рецептора, состоящий из вариабельных γ и δ цепей. Каждая цепь TCR представляет собой член суперсемейства иммуноглобулинов и содержит один вариабельный домен иммуноглобулина на амино-конце, один константный домен иммуноглобулина, трансмембранный участок и короткий цитоплазматический сегмент на С-конце (см. Abbas and Lichtman, Cellular and Molecular Immunology («Клеточная и молекулярная иммунология») (5th Ed.), Editor: Saunders, Philadelphia, 2003; Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease («Иммунобиология: иммунная система в норме и при заболеваниях»), 4^th Ed., Current Biology Publications, p148, 149, 172, 1999). В настоящем описании под TCR может подразумеваться TCR различных видов животных, включая человека, мышь, крысу или других млекопитающих.

[0099] «TCR-комплекс» в настоящей заявке относится к комплексу, образованному соединением CD3-цепей с другими цепями TCR. Например, TCR-комплекс может состоять из цепи CD3γ, цепи CD3δ, двух цепей CD3ε, гомодимера цепей CD3ζ, цепи TCRα и цепи TCRβ. Как вариант, TCR-комплекс может состоять из цепи CD3γ, цепи CD3δ, двух цепей CD3ε, гомодимера цепей CD3ζ, цепи TCRγ и цепи TCRδ.

[0100] «Компонент TCR-комплекса» в настоящей заявке относится к цепи TCR (т.е. TCRα, TCRβ, TCRγ или TCRδ), цепи CD3 (т.е. CD3γ, CD3δ, CD3ε или CD3ζ, или к комплексу, образованному двумя или более цепями TCR или цепями CD3 (например, комплексу TCRα и TCRβ, комплексу TCRγ и TCRδ, комплексу CD3ε и CD3δ, комплексу CD3γ и CD3ε, или TCR-субкомплексу из TCRα, TCRβ, CD3γ, CD3δ и двух цепей CD3ε).

[0101] «Антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность» и «ADCC» в настоящей заявке относится к клеточно-опосредованному процессу, при котором неспецифические цитотоксические клетки, экспрессирующие FcγRs (например, моноциты, такие как естественные (NK) клетки-киллеры и макрофаги) распознают связанное антитело (или другой белок, способный связывать FcγRs) на клетке-мишени, и в результате вызывают лизис указанной клетки-мишени. В принципе, любая эффекторная клетка с активирующимся FcγR может быть активирована для опосредования ADCC. Первичными клетками, опосредующими ADCC, являются NK-клетки, экспрессирующие только FcγRIII, в то время как моноциты, в зависимости от их статуса активации, локализации или дифференцировки, могут экспрессировать FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Для ознакомления с обзором экспрессии FcγR на гемопоэтических клетках, см., например, Ravetch et at., 1991, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92.

[0102] Термин «обладающий ADCC-активностью» в настоящей заявке в отношении полипептида или белка означает, что указанный полипептид или белок (например, содержащий шарнирную область иммуноглобулина и константную область иммуноглобулина с доменами СН2 и СН3, например, полученными из IgG (например, IgG1)), способен к опосредованию антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (ADCC) за счет связывания цитолитического Fc-рецептора (например, FcγRIII) на цитолитической иммунной эффекторной клетке, экспрессирующей указанный Fc-рецептор (например, NK-клетке).

[0103] Термины «комплементзависимая цитотоксичность» и «CDC» в настоящей заявке относятся к процессу, при котором наблюдается лизис клетки-мишени, экспрессирующей целевой антиген, компонентами нормальной сыворотки («комплемент») вместе с антителом или другим C1q-комплемент-связывающим белком, связанным с целевым антигеном. Комплемент состоит из группы белков сыворотки, которые действуют согласованно и в определенной последовательности для обеспечения эффекта.

[0104] Термины «классический путь комплемента» и «классическая система комплемента» в настоящей заявке являются синонимами и относятся к конкретному пути активации комплемента. Для инициации указанного классического пути необходимы комплексы антиген-антитело, и он включает активацию девяти главных белковых компонентов, обозначаемых С1 - С9, в определенном порядке. Для нескольких этапов процесса активации продукт представляет собой фермент, который катализирует следующий этап. Указанный каскад обеспечивает амплификацию и активацию больших количеств комплемента при относительно слабом стартовом сигнале.

[0105] Термин «обладающий CDC-активностью» в отношении полипептида или белка в настоящей заявке означает, что указанный полипептид или белок (например, содержащий шарнирную область иммуноглобулина и константную область иммуноглобулина с доменами СН2 и СН3, такими как полученные из IgG (например, IgG1)), способен к опосредованию комплементзависимой цитотоксичности (CDC) за счет связывание белка C1q комплемента и активации классической системы комплемента.

[0106] Термины «перенаправленная Т-клеточная цитотоксичность» и «RTCC» в настоящей заявке относятся к опосредованному Т-клетками процессу, при котором цитотоксическая Т-клетка рекрутируется в клетку-мишень с помощью мультиспецифического белка, способного к специфическому связыванию и цитотоксической Т-клетки, и клетки-мишени, и за счет которого стимулируется цитотоксический Т-клеточный мишенезависимый ответ против указанной клетки-мишени.

[0107] Термины «неоваскуляризация» и «ангиогенез» употребляются в настоящей заявке взаимозаменяемо. Неоваскуляризация и ангиогенез относятся к синтезу новых кровеносных сосудов в клетках, тканях или органах. Контроль ангиогенеза, как правило, модифицирован при определенных болезненных состояниях, и, во многих случаях, патологические повреждения, связанные с указанным заболеванием, связаны с модифицированным или нерегулируемым ангиогенезом. Стойкий нерегулируемый ангиогенез происходит при разнообразных болезненных состояниях, включая характеризующееся анормальным ростом эндотелиальных клеток, и способствует патологическим повреждениям, наблюдаемым при указанных состояниях, включая транссудацию и проницаемость кровеносных сосудов.

[0108] Термин «неоваскулярное расстройство» в настоящей заявке относится к любому заболеванию или расстройству, включающему патологию, которая опосредована, по меньшей мере частично, увеличенной или нерегулируемой активностью ангиогенеза. Примеры таких заболеваний или расстройств включают различные раковые заболевания с солидными опухолями. Такие заболевания или расстройства с сосудистой сетью, характеризующейся сверхэкспрессией ПСМА (например, определенные раковые заболевания с солидными опухолями, такие как светлоклеточный рак почки, колоректальный рак, рак мочевого пузыря и рак легких) особенно подходят для лечения определенными способами подавления ангиогенеза, согласно приведенному далее в настоящей заявке описанию.

[0109] Используемый в настоящей заявке термин «лечение», «лечить» или «облегчать» относится либо к терапевтическому лечению, либо к профилактическому/предупредительному лечению. Лечение является терапевтическим, если наступает облегчение по меньшей мере одного симптома заболевания у получающего лечение индивидуума, либо лечение может задерживать ухудшение при прогрессирующем заболевании у индивидуума, или предотвращать начало дополнительных связанных заболеваний.

[0110] Используемый в настоящей заявке термин «терапевтически эффективное количество (или доза)» или «эффективное количество (или доза)» обладающей способностью к специфическому связыванию молекулы или соединения относится к количеству указанного соединения, достаточному для того, чтобы приводить к статистически значимому облегчению одного или более симптома заболевания, лечение которого проводится. Если речь идет об индивидуальном активном ингредиенте, вводимом отдельно, «терапевтически эффективная доза» относится только к указанному ингредиенту. Если речь идет о комбинации, «терапевтически эффективная доза» относится к совокупным количествам активных ингредиентов, которые проводят к терапевтическому эффекту, как при последовательном, так и при одновременном введении (в одном составе либо параллельно в отдельных составах).

[0111] Используемый в настоящей заявке термин «трансформация», «трансфекция» и «трансдукция» относятся к переносу нуклеиновой кислоты (т.е. нуклеотидного полимера) в клетку. Используемый в настоящей заявке термин «генетическая трансформация» относится к переносу и встраиванию ДНК, в частности, рекомбинантной ДНК, в клетку. Переносимая нуклеиновая кислота может быть введена в клетку с помощью экспрессионного вектора.

[0112] Используемый в настоящей заявке термин «вариант» или «варианты» относится к нуклеиновой кислоте или полипептиду, отличающей(его)ся от исходной(ого) нуклеиновой кислоты или полипептида, но сохраняющей(ему) ее(его) важнейшие качества. В целом, варианты очень сильно схожи, и во многих областях идентичны исходной(ого) нуклеиновой кислоте или полипептиду. Например, последовательности варианта могут быть по меньшей мере приблизительно на 70%, по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере приблизительно на 95%, по меньшей мере приблизительно на 96%, по меньшей мере приблизительно на 97%, по меньшей мере приблизительно на 98% или по меньшей мере приблизительно на 99% идентичны последовательностям активной части или полноразмерной(ого) исходной(ого) нуклеиновой кислоте или полипептиду.

[0113] Термины «вариабельная область легкой цепи» (также называемая «вариабельным доменом легкой цепи», или «VL») и «вариабельная область тяжелой цепи» (также называемая «вариабельным доменом тяжелой цепи», или «VH») относятся к вариабельным связывающим областям легкой и тяжелой цепей антитела, соответственно. Вариабельные связывающие области составлены отдельными, четко определенными участками, известными как «определяющие комплементарность области» (CDR) и «каркасные области» (FR). Согласно одному из вариантов реализации FR гуманизированы. Термин «CL» относится к «константной области легкой цепи иммуноглобулина» или «константной области легкой цепи», т.е. к константной области легкой цепи антитела. Термин «СН» относится к «константной области тяжелой цепи иммуноглобулина» или «константной области тяжелой цепи», далее подразделяющейся, в зависимости от изотипа антитела, на домены СН1, СН2 и СН3 (IgA, IgD, IgG), или СН1, СН2, СН3 и СН4 (IgE, IgM). «Fab» (антигенсвязывающий домен) представляет собой часть антитела, которая связывается с антигенами, и включает вариабельную область и домен СН1 тяжелой цепи, соединенные с легкой цепью посредством межцепочечной дисульфидной связи.

III. ПСМА-связывающие полипептиды, белки и их компоненты

[0114] В настоящей заявке предложены полипептиды и белки, содержащие связывающие домены, в частности, первый связывающий домен, который специфично связывается с ПСМА. Полипептиды и белки, содержащие связывающие домены согласно настоящему описанию, могут дополнительно содержать константные области иммуноглобулина, линкерные пептиды, шарнирные области, домены димеризации/гетеродимеризации иммуноглобулина, соединительные аминокислоты, метки и т.д. Указанные компоненты раскрытых полипептидов и белков более подробно описаны ниже.

[0115] Кроме того, ПСМА-связывающие полипептиды и белки, описанные в настоящей заявке, могут находиться в форме антител или гибридного белка любого из множества различных форматов (например, указанный гибридный белок может находиться в форме SMIP-молекулы, PIMS-молекулы, молекулы SCORPION или интерцепторные молекулы).

[0116] ПСМА-связывающий белок в соответствии с настоящим изобретением в общем включает по меньшей мере одну ПСМА-связывающую полипептидную цепь, содержащую (а) ПСМА-связывающий домен в соответствии с описанием в настоящей заявке. Согласно некоторым вариантам указанный ПСМА-связывающий полипептид дополнительно включает (b) шарнирную область со стороны карбоксильного конца ПСМА-связывающего домена и (с) константную область иммуноглобулина (например, SMIP-молекула). Согласно другим вариантам указанный ПСМА-связывающий полипептид дополнительно включает (а) вторую шарнирную область со стороны карбоксильного конца константной области иммуноглобулина и (е) второй связывающий домен со стороны карбоксильного конца второй шарнирной области (например, полипептид SCORPION).

[0117] Согласно дальнейшим вариантам указанный ПСМА-связывающий полипептид содержит (b) шарнирную область со стороны амино-конца ПСМА-связывающего домена и (с) участок иммуноглобулина со стороны амино-конца шарнирной области (например, PIMS-полипептид).

[0118] Обычно ПСМА-связывающие полипептиды вышеперечисленных форматов (SMIP, SCORPION или PIMS) способны к гомодимеризации, как правило, за счет связывания дисульфидной связью константной области и/или шарнирной области иммуноглобулина (например, константной области иммуноглобулина, содержащей IgG домены СН2 и СН3, и шарнирной области IgG). Соответственно, согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения, два идентичных ПСМА-связывающих полипептида гомодимеризуются с образованием димерного ПСМА-связывающего белка.

[0119] Согласно другим вариантам реализации ПСМА-связывающий полипептид дополнительно включает домен гетеродимеризации, способный к гетеродимеризации с другим доменом гетеродимеризации второй неидентичной полипептидной цепи. Согласно некоторым вариантам указанная вторая полипептидная цепь для гетеродимеризации включает второй связывающий домен. Соответственно, согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения, две неидентичных полипептидных цепи, одна из которых содержит ПСМА-связывающий домен, а вторая необязательно содержит второй связывающий домен, димеризуются с образованием гетеродимерного ПСМА-связывающего белка.

[0120] ПСМА-связывающие полипептиды, белки и различные их компоненты описаны ниже в настоящей заявке.

А. Связывающие домены

[0121] Как указано выше, иммуноглобулиновый связывающий полипептид согласно настоящему описанию содержит связывающий домен, который специфично связывается с ПСМА. Согласно некоторым вариантам указанный ПСМА-связывающий домен способен конкурировать за связывание ПСМА с антителом, содержащим V_L и V_H области, имеющие последовательности аминокислот согласно приведенным в SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 2, соответственно (например, mAb 107-1A4), или с одноцепочечным Fv (scFv), имеющим последовательность аминокислот согласно приведенной в SEQ ID NO: 21. Согласно определенным вариантам реализации указанный ПСМА-связывающий домен содержит (i) вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина (V_L), содержащую CDR LCDR1, LCDR2 и LCDR3, и (ii) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина (V_H), содержащую CDR HCDR1, HCDR2 и HCDR3. Подходящие ПСМА-связывающие домены включают содержащие области V_L и V_H, полученные из mAb 107-1A4. Согласно некоторым вариантам реализации LCDR3 имеет последовательность аминокислот, приведенную в SEQ ID NO: 17 и/или HCDR3 имеет последовательность аминокислот, приведенную в SEQ ID NO: 11; и LCDR1 и LCDR2 необязательно имеют последовательности аминокислот, приведенные в SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16, соответственно, и HCDR1 и HCDR2 необязательно имеют последовательности аминокислот, приведенные в SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10, соответственно. Согласно некоторым вариантам реализации LCDR1, LCDR2 и LCDR3, например, имеют последовательности аминокислот приведенные, соответственно, в последовательностях SEQ ID NO:: 15, 16, и 17; и/или HCDR1, HCDR2 и HCDR3 имеют последовательности аминокислот согласно приведенным в последовательностях SEQ ID NO:: 9, 10, и 11.

[0122] Согласно определенным вариантам реализации ПСМА-связывающий белок может содержать один или более дополнительный связывающий домен (например, второй связывающий домен), который связывает мишень, отличную от ПСМА. Указанные другие целевые молекулы могут содержать, например, конкретный цитокин или молекулу, направляющую полипептид связывающего домена в конкретный тип клеток, токсин, дополнительный клеточный рецептор, антитело и т.д.

[0123] Согласно определенным вариантам реализации связывающий домен, например, в виде части интерцепторной молекулы или SCORPION, может содержать TCR-связывающий домен для привлечения (рекрутинга) Т-клеток в клетки-мишени, экспрессирующие ПСМА. Согласно определенным вариантам реализации полипептидный гетеродимер, описанный в настоящей заявке может содержать связывающий домен, который специфично связывается с TCR-комплексом или его компонентом (например, TCRα, TCRβ, CD3γ, CD3δ, и CD3ε) и другой связывающий домен, который специфично связывается с ПСМА.

[0124] Типовые антитела против CD3, из которых может быть получен связывающий домен согласно настоящему описанию, включают моноклональное антитело CRIS-7 (Reinherz, E.L. et al. (eds.), Leukocyte typing II., Springer Verlag, New York, (1986); последовательности аминокислот V_L и V_H, приведенные, соответственно, в SEQ ID NO: 153

моноклональное антитело ВС3 (Anasetti et al. (1990) J. Exp. Med. 172:1691); моноклональное антитело OKT3 (Ortho multicenter Transplant Study Group (1985) N. Engl. J. Med. 313:337) и его производные, например, OKT3 ala-ala (также называемый OKT3 AA-FL, или OKT3 FL), гуманизированный вариант Fc с заменами на аланин в положениях 234 и 235 (Herold et al. (2003) J. Clin. Invest. 11:409); визилизумаб (Carpenter et al. (2002) Blood 99:2712), моноклональное антитело G19-4 (Ledbetter et al., 1986, J. Immunol. 136:3945) и моноклональное антитело 145-2С11 (Hirsch et al. (1988) J. Immunol. 140: 3766). Типовым антителом против TCR является моноклональное антитело ВМА031 (Borst et al. (1990) Human Immunology 29:175-188).

[0125] Согласно некоторым вариантам реализации связывающий домен представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), содержащий области V_H и V_L, специфичные в отношении представляющей интерес мишени. Согласно определенным вариантам реализации указанные V_H и V_L области являются областями человека.

[0126] Согласно определенным вариантам реализации ПСМА-связывающий домен содержит или представляет собой scFv, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере приблизительно на 91%, по меньшей мере приблизительно на 92%, по меньшей мере приблизительно на 93%, по меньшей мере приблизительно на 94%, по меньшей мере приблизительно на 95%, по меньшей мере приблизительно на 96%, по меньшей мере приблизительно на 97%, по меньшей мере приблизительно на 98%, по меньшей мере приблизительно на 99%, по меньшей мере приблизительно на 99,5%, или на 100% идентична аминокислотной последовательности scFv из SEQ ID NO: 19, 21, 30, 31, 34 или 35.

[0127] В родственных вариантах реализации ПСМА-связывающий домен содержит или представляет собой последовательность, по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере приблизительно на 91%, по меньшей мере приблизительно на 92%, по меньшей мере приблизительно на 93%, по меньшей мере приблизительно на 94%, по меньшей мере приблизительно на 95%, по меньшей мере приблизительно на 96%, по меньшей мере приблизительно на 97%, по меньшей мере приблизительно на 98%, по меньшей мере приблизительно на 99%, по меньшей мере приблизительно на 99,5%, или на 100% идентичную аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи (V_L) (например, SEQ ID NO: 23) или вариабельной области тяжелой цепи (V_H) (например, SEQ ID NO: 25 или SEQ ID NO: 27), или обеим.

[0128] Согласно дальнейшим вариантам реализации каждая CDR содержит не более чем одну, две или три замены, вставки или удаления, относительно образующих моноклональное антитело, либо фрагмент или производное такого моноклонального антитела, которое специфично связывается с представляющей интерес мишенью (например, ПСМА).

[0129] Согласно некоторым вариантам реализации ПСМА-связывающего белка, включающим второй связывающий домен, который специфично связывается с CD3ε, указанный второй связывающий домен конкурирует за связывание CD3ε с моноклональным антителом CRIS-7 или HuM291. Согласно некоторым вариантам CD3-связывающий домен содержит вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина (V_L) и вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина (V_H), полученные из моноклонального антитела CRIS-7 или HuM291 (например, V_L и V_H второго связывающего домена могут представлять собой гуманизированные вариабельные области, содержащие, соответственно, CDR легкой цепи и CDR тяжелой цепи указанного моноклонального антитела). Например, области V_L и V_H, полученные из CRIS-7, могут быть выбраны из (а) области V_L, содержащей последовательность аминокислот, идентичную по меньшей мере на 95% или на 100% последовательности аминокислот, представленной остатками 139-245 последовательности SEQ ID NO: 47; и области V_H, содержащей последовательность аминокислот, идентичную по меньшей мере на 95% или на 100% последовательности аминокислот, представленной остатками 1-122 последовательности SEQ ID NO: 47; и (b) области V_L, содержащей последовательность аминокислот, идентичную по меньшей мере на 95% или на 100% последовательности аминокислот, представленной остатками 634-740 последовательности SEQ ID NO: 78; и области V_H, содержащей последовательность аминокислот, по меньшей мере на 95% или на 100% идентичную последовательности аминокислот, представленной остатками 496-616 последовательности SEQ ID NO: 78.

[0130] Согласно определенным вариантам реализации связывающий домен V_L и/или область V_H согласно настоящему описанию получен из V_L и/или V_H известного моноклонального антитела (например, 107-1А4, CRIS-7 или HuM291) и включает приблизительно одну или более (например, приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) вставку, приблизительно одно или более (например, приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) удаление, приблизительно одну или более (например, приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) замену аминокислоты (например, консервативные замены аминокислот или неконсервативные замены аминокислот), или комбинацию вышеуказанных изменений, относительно указанных V_L и/или V_H известного моноклонального антитела. Вставка(и), удаление(ия) или замена(ы) может(гут) располагаться где угодно в области V_L и/или V_H, в том числе на амино-конце или карбоксильном конце, или на обоих концах указанной области, с условием, что каждая область CDR не содержит изменений, либо содержит максимум одно, два или три изменения, и с условием, что связывающий домен, содержащий модифицированную область V_L и/или V_H, сохраняет способность специфично связываться со своей мишенью со сродством, сходным с таковым связывающего домена дикого типа.

[0131] Согласно некоторым вариантам связывающий домен представляет собой одноцепочечный Fv (scFv), содержащий области иммуноглобулина V_L и V_H, соединенные пептидным линкером. Применение пептидных линкеров для соединения областей V_L и V_H общеизвестно в данной области техники, и конкретно этой теме посвящено значительное число публикаций. Широко используемый пептидный линкер представляет собой 15-мер, состоящий из трех повторов последовательности аминокислот Gly-Gly-Gly-Gly-Ser ((Gly₄Ser)₃) (SEQ ID NO: 152). Использовали и другие линкеры; для получения разнообразия и отбора подходящих линкерных последовательностей применяли также технологию фагового дисплея и метод селективного инфицирования фагом (Tang et al., J. Biol. Chem. 271, 15682-15686, 1996; Hennecke et al., Protein Eng. 11, 405-410, 1998). Согласно определенным вариантам реализации области V_L и V_H объединяют пептидным линкером, имеющим последовательность аминокислот, содержащей формулу (Gly₄Ser)_n, где n=1-5 (SEQ ID NO: 165). Другие подходящие линкеры могут быть получены оптимизацией простого линкера (например, (Gly₄Ser)_n) с применением неспецифического мутагенеза.

[0132] Согласно определенным вариантам реализации связывающий домен содержит гуманизированные V_L и/или V_H области иммуноглобулина. Методики гуманизации V_L и V_H областей иммуноглобулина известны в данной области техники и обсуждаются, например, в опубликованной заявке на патент США №2006/0153837.

[0133] «Гуманизация», как ожидается, должна приводить к получению менее иммуногенного антитела при полном сохранении антиген-связывающих свойств исходной молекулы. Чтобы полностью сохранить антиген-связывающие свойства исходного антитела, в «гуманизированной» версии должна воспроизводиться структура его участка связывания антигена. Этого можно добиться встраиванием только не принадлежащих человеку CDR в вариабельные каркасные домены и константные области человека, с сохранением или без сохранения критичных каркасных остатков (Jones et al., Nature 321:522 (1986); Verhoeyen et al., Science 239:1539 (1988)) или рекомбинированием не принадлежащих человеку вариабельных доменов полностью (для сохранения лиганд-связывающих качеств), но с их «маскировкой» поверхностью, напоминающей принадлежащую человеку, с помощью продуманной замены экспонируемых остатков (для снижения антигенности) (Padlan, Molec. Immunol. 28:489 (1991)).

[0134] По существу, гуманизация CDR-прививкой вовлекает рекомбинирование только областей CDR не принадлежащего человеку антитела с каркасной вариабельной областью человека и константной областью человека. Теоретически, это должно существенно снижать или элиминировать иммуногенность (при отсутствии аллотипических или идиотипических различий). Однако, по имеющимся сведениям, некоторые каркасные остатки исходного антитела также, возможно, необходимо сохранять (Reichmann et al., Nature, 332:323 (1988); Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10,029(1989)).

[0135] Остатки каркасной области, которые необходимо сохранять, можно идентифицировать с помощью компьютерного моделирования. Как вариант, важные каркасные остатки могут потенциально быть идентифицированы при сравнении структур известных антиген-связывающих участков (Padlan, Molec. Immunol., 31(3): 169-217 (1994), включен в настоящую заявку посредством ссылки).

[0136] Остатки, потенциально влияющие на связывание антигена, можно разделить на несколько групп. В первую группу входят остатки, которые соприкасаются с поверхностью антигенного участка, следовательно, способные вступать в прямой контакт с антигенами. Указанные остатки включают амино-концевые остатки и смежные с областями CDR. Вторая группа включает остатки, способные изменять структуру или относительное расположение областей CDR, за счет контакта либо с указанными CDR, либо с другой пептидной цепью антитела. Третья группа содержит аминокислоты с погруженными боковыми цепями, способные оказывать влияние на структурную целостность вариабельных доменов. Остатки указанных групп, как правило, обнаруживаются в одних и тех же положениях (Padlan, 1994, выше), хотя их положения могут быть определены по-разному в зависимости от системы нумерации (см. Kabat et al., "Sequences of proteins of immunological interest («Последовательности белков, представляющих иммунологический интерес»), 5th ed., Pub. No. 91-3242, U.S. Dept. Health & Human Services, NIH, Bethesda, Md., 1991).

[0137] Хотя варианты реализации согласно настоящему описанию включают гуманизацию молекул SMIP, SCORPION и интерцепторных молекул, а не антител, знания в области техники гуманизированных антител применимы к полипептидам согласно настоящему изобретению.

В. Шарнирная область

[0138] Согласно определенным вариантам реализации шарнирная область представляет собой шарнирную область иммуноглобулина человека дикого типа. Согласно некоторым другим вариантам реализации на амино- или карбоксильном конце шарнирной области дикого типа иммуноглобулина может быть добавлен один или более аминокислотный остаток как часть конструктивной схемы гибридного белка. Например, дополнительные соединительные аминокислотные остатки на амино-конце шарнирной области могут представлять собой «RT», «RSS», «TG» или «Т», либо на карбоксильном конце шарнирной области может присутствовать «SG», или удаление в шарнире может сочетаться с добавлением, например, ΔР и «SG» на карбоксильном конце.

[0139] Согласно определенным вариантам реализации шарнирная область представляет собой модифицированную шарнирную область иммуноглобулина, в которой один или более остаток цистеина в шарнирной области иммуноглобулина дикого типа заменяют на один или более другой аминокислотный остаток (например, серин или аланин).

[0140] Типовые модифицированные шарнирные области иммуноглобулина включают шарнирную область иммуноглобулина IgG1 человека, в котором один, два или три остатка цистеина, обнаруживаемые в шарнире IgG1 человека дикого типа, заменены одним, двумя или тремя разными аминокислотными остатками (например, серином или аланином). Дополнительно в модифицированном шарнире иммуноглобулина может быть произведена замена пролина другой аминокислотой (например, серином или аланином). Например, в описанном выше модифицированном шарнире IgG1 человека пролин, расположенный в направлении карбоксильного конца от трех цистеинов шарнирной области дикого типа IgG1 человека может быть дополнительно заменен другим аминокислотным остатком (например, серином, аланином). Согласно одному из вариантов реализации пролины сердцевинной шарнирной области не заменены.

[0141] Согласно определенным вариантам реализации шарнирный полипептид содержит или представляет собой последовательность, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 81%, по меньшей мере на 82%, по меньшей мере на 83%, по меньшей мере на 84%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99% идентичную шарнирной области иммуноглобулина дикого типа, такой как шарнирная область дикого типа IgG1 человека, шарнирная область дикого типа IgG2 человека, или шарнирная область дикого типа IgG4 человека.

[0142] Согласно дальнейшим вариантам реализации шарнир, присутствующий в ПСМА-связывающем полипептиде, может представлять собой шарнир, не основанный на шарнире иммуноглобулина или не полученный из шарнирной области иммуноглобулина (т.е. не шарнирная область иммуноглобулина дикого типа или не модифицированная шарнирная область иммуноглобулина). Примеры таких шарниров включают пептиды размером от приблизительно 5 до приблизительно 150 аминокислот, полученные из междоменной области трансмембранного белка или области «ствола» С-лектина II типа, например, пептиды размером от приблизительно 8 до 25 аминокислот и пептиды размером от приблизительно 7 до 18 аминокислот.

[0143] Согласно определенным вариантам реализации шарнирные области междоменной области или области «ствола» содержат от 7 до 18 аминокислот и могут формировать суперспиральную («coiled-coil») структуру из α-спиралей. Согласно определенным вариантам реализации шарнирные области междоменной области или области «ствола» содержат 0, 1, 2, 3, или 4 цистеина. Типовые шарнирные области междоменной области или области «ствола» представлены такими пептидными фрагментами междоменных областей или областей «ствола», как фрагменты длиной ID-150 аминокислот областей «ствола» CD69, CD72, CD94, NKG2A и NKG2D.

[0144] Согласно определенным вариантам реализации шарнирные последовательности содержат приблизительно 5-150 аминокислот, 5-10 аминокислот, 10-20 аминокислот, 20-30 аминокислот, 30-40 аминокислот, 40-50 аминокислот, 50-60 аминокислот, 5-60 аминокислот, 5-40 аминокислот, 8-20 аминокислот или 10-15 аминокислот Шарнирная область может быть в основном гибкой, но может и обеспечивать большую жесткость, или может включать главным образом α-спиральную структуру с минимумом β-листовых структур. Длины или последовательности шарнирных областей могут влиять на связывающую способность связывающих доменов, к которым указанные шарнирные области прямо или опосредовано (с помощью другой области или другого домена, например, домена гетеродимеризации) присоединены, а также на один или более вид активности участков Fc-области, к которой прямо или непрямо присоединены шарнирные области.

[0145] Согласно определенным вариантам реализации шарнирные последовательности стабильны в плазме и сыворотке и устойчивы к протеолитическому расщеплению. Первый лизин в верхней шарнирной области IgG1 может быть мутирован для минимизации протеолитического расщепления, например, указанный лизин может быть заменен на метионин, треонин, аланин или глицин, либо удален.

[0146] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения ПСМА-связывающий полипептид способен образовывать гетеродимер с второй полипептидной цепью и содержит шарнирную область (а) непосредственно у амино-конца константной области иммуноглобулина (например, с амино-концевой стороны домена СН2, при этом указанная константная область иммуноглобулина включает домены СН2 и СН3, или с амино-концевой стороны домена СН3, при этом участки иммуноглобулина включают домены СН3 и СН4), (b) располагающимся между связывающим доменом (например, scFv) и доменом гетеродимеризации иммуноглобулина и соединяющим их (с) располагающимся между доменом гетеродимеризации иммуноглобулина и константной областью иммуноглобулина и соединяющим их (при этом, например, константная область иммуноглобулина включает домены СН2 и СН3 или домены СН3 и СН4), (d) располагающиеся между константной областью иммуноглобулина и связывающим доменом и соединяющие их, (е) на амино-конце полипептидной цепи, или (f) на карбоксильном конце полипептидной цепи. Полипептидная цепь, содержащая шарнирную область согласно описанию в настоящей заявке, способна связываться с другой полипептидной цепью с образованием гетеродимерного белка, предложенного в настоящем изобретении, и образованный гетеродимер содержит связывающий домен, сохраняющий специфичность по отношению к мишени, или способность специфично связывать мишень.

[0147] Согласно определенным вариантам реализации присутствующий в полипептиде шарнир, образующий гетеродимер с другой полипептидной цепью, может представлять собой шарнирную область иммуноглобулина, например, шарнирную область иммуноглобулина дикого типа или модификацию такой шарнирной области иммуноглобулина. Согласно определенным вариантам реализации шарнирная область одной полипептидной цепи гетеродимерного белка идентична соответствующей шарнирной области другой полипептидной цепи указанного гетеродимера. Согласно некоторым другим вариантам реализации шарнирная область одной цепи отличается от шарнирной области другой цепи (длиной либо последовательностью). Разные шарнирные области в разных цепях позволяют по-разному манипулировать связывающей способностью связывающих доменов, к которым присоединены указанные шарнирные области, так что такой гетеродимер способен преимущественно связываться с мишенью одного связывающего домена, а не с мишенью другого связывающего домена. Например, согласно определенным вариантам реализации гетеродимерный белок содержит CD3-или TCR-связывающий домен в одной цепи и ПСМА-связывающий домен в другой цепи. Наличие двух разных шарниров в двух цепях может обеспечить связывание гетеродимера сначала с ПСМА, а затем с CD3 или другим компонентом TCR. Соответственно, указанный гетеродимер может обеспечивать рекрутинг в ПСМА-экспрессирующие клетки (например, ПСМА-экспрессирующие опухолевые клетки) CD3⁺-Т-клеток, которые, в свою очередь, могут разрушать или уничтожать указанные ПСМА-экспрессирующие клетки.

[0148] Типовые шарнирные области, подходящие для применения в соответствии с настоящим изобретением приведены в таблицах 1 и 2 ниже. Дополнительные типовые шарнирные области приведены в последовательностях SEQ ID NO: 241-244, 601, 78, 763-791, 228, 379-434, 618-749 из WO 2011/090762 (указанные последовательности включены в настоящую заявку посредством ссылок).

С. Домены гетеродимеризации иммуноглобулина

[0149] Согласно определенным вариантам реализации ПСМА-связывающий полипептид или белок согласно настоящему изобретению может содержать «домен димеризации иммуноглобулина» или «домен гетеродимеризации иммуноглобулина».

[0150] «Домен димеризации иммуноглобулина» или «домен гетеродимеризации иммуноглобулина» в настоящей заявке относится к иммуноглобулиновому домену полипептидной цепи, который преимущественно взаимодействует или связывается с другим иммуноглобулиновым доменом другой полипептидной цепи, при этом указанное взаимодействие разных доменов гетеродимеризации иммуноглобулина вносит существенный вклад или эффективно содействует гетеродимеризации указанных первой и второй полипептидных цепей (т.е. образованию димера из двух разных полипептидных цепей, также называемого «гетеродимером» или «гетеродимерным белком»). Указанное взаимодействие между доменами гетеродимеризации иммуноглобулина «вносит существенный вклад или эффективно содействует» гетеродимеризации первой и второй полипептидных цепей, если имеется статистически значимое снижение димеризации указанных первой и второй полипептидных цепей в отсутствие указанного домена гетеродимеризации иммуноглобулина первой полипептидной цепи и/или домена гетеродимеризации иммуноглобулина второй полипептидной цепи. Согласно определенным вариантам реализации, в том случае, если первая и вторая полипептидные цепи коэкспрессируются, по меньшей мере 60%, по меньшей мере приблизительно 60% - приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 70% - приблизительно 80%, по меньшей мере 80% - приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% указанных первой и второй полипептидных цепей образуют гетеродимеры друг с другом. Типовые домены гетеродимеризации иммуноглобулина включают домен СН1 иммуноглобулина, домен CL1 иммуноглобулина (например, изотипы Сκ или Сλ), или их производные, в том числе домены СН1 и CL иммуноглобулина дикого типа и модифицированные (или мутированные) домены СН1 и CL иммуноглобулина, такие как описанные в настоящей заявке.

[0151] Домены димеризации/гетеродимеризации могут быть использованы в тех случаях, когда требуется получить гетеродимеры из двух неидентичных полипептидных цепей, из которых одна полипептидная цепь или обе содержит(ат) связывающий домен. Согласно определенным вариантам реализации одна из полипептидных цепей определенных гетеродимеров согласно настоящему описанию не содержит связывающий домен. Как указано выше, гетеродимерный белок согласно настоящему описанию содержит домен гетеродимеризации иммуноглобулина в каждой полипептидной цепи. Домены гетеродимеризации иммуноглобулина в полипептидных цепях гетеродимера отличаются друг от друга и, соответственно, могут быть различным образом модифицированы для облегчения гетеродимеризации обеих цепей и минимизации гомодимеризации какой-либо из цепей. Как продемонстрировано в примерах, домены гетеродимеризации иммуноглобулина, предложенные в настоящей заявке, обеспечивают эффективную гетеродимеризацию различных полипептидов и облегчают очистку полученного гетеродимерного белка.

[0152] Согласно настоящей заявке домены гетеродимеризации иммуноглобулина, подходящие для обеспечения гетеродимеризации двух разных одноцепочечных полипептидов (например, одного короткого и одного длинного) в соответствии с настоящим описанием, включают домены СН1 и CL иммуноглобулина, например, домены СН1 и CL человека. Согласно определенным вариантам реализации домен гетеродимеризации иммуноглобулина представляет собой домен СН1 дикого типа, такой как домен СН1 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, или IgM дикого типа. Согласно дальнейшим вариантам реализации домен гетеродимеризации иммуноглобулина представляет собой домен СН1 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, или IgM человека дикого типа, приведенный в последовательностях SEQ ID NO: 114, 186-192 и 194, соответственно, в публикации РСТ № WO 2011/090762 (указанные последовательности включены в настоящую заявку посредством ссылок). Согласно определенным вариантам реализации домен гетеродимеризации иммуноглобулина представляет собой домен СН1 IgG1 человека дикого типа, приведенный в SEQ ID NO: 114 в WO 2011/090762 (указанная последовательность включена в настоящую заявку посредством ссылки).

[0153] Согласно дальнейшим вариантам реализации домен гетеродимеризации иммуноглобулина представляет собой модифицированный домен СН1 иммуноглобулина, такой как модифицированный домен СН1 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 IgD, IgE, или IgM. Согласно определенным вариантам реализации домен гетеродимеризации иммуноглобулина представляет собой модифицированный домен СН1 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, или IgM человека. Согласно дальнейшим вариантам реализации остаток цистеина домена СН1 дикого типа (например, человека СН1).вовлеченный в образование дисульфидной связи с доменом CL иммуноглобулина дикого типа (например, CL человека), удаляют или заменяют в модифицированном домене СН1 иммуноглобулина таким образом, что дисульфидная связь между указанным модифицированным доменом СН1 и доменом CL дикого типа не образуется.

[0154] Согласно определенным вариантам реализации домен гетеродимеризации иммуноглобулина представляет собой домен CL дикого типа, например, домен Сκ дикого типа или домен Сλ дикого типа. Согласно определенным вариантам реализации домен гетеродимеризации иммуноглобулина представляет собой домен дикого типа Сκ человека или Сλ человека, приведенные в последовательностях SEQ ID NO: 112 и 113, соответственно, из WO 2011/090762 (указанные последовательности включены в настоящую заявку посредством ссылок). Согласно дальнейшим вариантам реализации домен гетеродимеризации иммуноглобулина представляет собой модифицированный домен CL иммуноглобулина, такой как модифицированный домен Сκ или Сλ, например, модифицированный домен Сκ человека или Сλ человека.

[0155] Согласно определенным вариантам реализации остаток цистеина домена CL дикого типа (например, CL человека), вовлеченный в образование дисульфидной связи с доменом СН1 иммуноглобулина дикого типа (например, СН1 человека), в модифицированном домене CL иммуноглобулина удаляют или заменяют. В таких модифицированных доменах CL могут также быть удалены аминокислоты на амино-концах. В SEQ ID NO: 141 из WO 2011/090762 (указанная последовательность включена в настоящую заявку посредством ссылки) приведен типовой домен Сκ, в котором удалены и первый аргинин, и последний цистеин домена дикого типа Сκ человека. Согласно определенным вариантам реализации в модифицированном домене Ck удален только последний цистеин домена дикого типа Ck человека, так как удаление первого аргинина домена дикого типа Ck человека может быть осуществлено только при использовании линкера, содержащего аргинин на карбоксильном конце и связывающего амино-конец указанного модифицированного домена Ck с другим доменом (например, частью молекулы иммуноглобулина, таким как часть, содержащая домены иммуноглобулина СН2 и СН3). В SEQ ID NO: 140 из WO 2011/090762 (указанная последовательность включена в настоящую заявку посредством ссылки) приведен типовой Сλ домен, в котором удален первый аргинин домена Сλ дикого типа человека, а цистеин, вовлеченный в образование дисульфидной связи с цистеином в домене СН1, заменен на серин.

[0156] Согласно дальнейшим вариантам реализации домен гетеродимеризации иммуноглобулина представляет собой модифицированный относительно домена Сκ дикого типа домен Сκ, в котором заменена одна или более аминокислота, в положениях, которые могут быть вовлечены в образование сети межцепочечных водородных связей на поверхности Сκ-Сκ. Например, согласно определенным вариантам реализации домен гетеродимеризации иммуноглобулина представляет собой модифицированный домен Сκ человека, в котором одна или более аминокислота в положениях N29, N30, Q52, V55, Т56, S68 или Т70 заменена на другую аминокислоту. Нумерация аминокислот основана на их положениях в модифицированной последовательности человека Сκ, приведенной в SEQ ID NO: 141 из WO 2011/090762 (указанная последовательность включена в настоящую заявку посредством ссылки). Согласно определенным вариантам реализации домен гетеродимеризации иммуноглобулина представляет собой модифицированный человека домен Сκ, в котором заменена(ы) одна, две, три или четыре аминокислоты в положениях N29, N30, V55 или Т70. Аминокислота, используемая для замены в вышеуказанных положениях, может представлять собой аланин, или аминокислотный остаток с объемным фрагментом боковой цепи, такой как аргинин, триптофан, тирозин, глутамат, глутамин или лизин. Дополнительные аминокислотные остатки, подходящие для замены аминокислотных остатков последовательности дикого типа Сκ человека в перечисленных выше положениях (например, N30) включают аспартат, метионин, серин и фенилаланин. Типовые модифицированные домены Сκ человека приведены в последовательностях SEQ ID NO: 142-178 из WO 2011/090762 (указанные последовательности включены в настоящую заявку посредством ссылок). Модифицированные домены Сκ человека представлены такими доменами, которые облегчают гетеродимеризацию с доменом СН1, при этом минимизируя гомодимеризацию с другим доменом Сκ. Типовые модифицированные домены Сκ человека приведены в последовательностях SEQ ID NO: 160 (N29W V55A Т70А), 161 (N29Y V55A Т70А), 202 (T70E N29A N30A V55A), 167 (N30R V55A Т70А), 168 (N30K V55A Т70А), 170 (N30E V55A Т70А), 172 (V55R N29A N30A), 175 (N29W N30Y V55A T70E), 176 (N29Y N30Y V55A T70E), 177 (N30E V55A T70E), 178 (N30Y V55A T70E), 838 (N30D V55A T70E), 839 (N30M V55A T70E), 840 (N308 V55A T70E) и 841 (N30F V55A T70E) из WO 2011/090762 (указанные последовательности включены в настоящую заявку посредством ссылок).

[0157] Согласно определенным вариантам реализации помимо мутаций в доменах Ck, описанных в настоящей заявке, либо в качестве альтернативного варианта, оба домена гетеродимеризации иммуноглобулина (т.е. домены СН1 и CL иммуноглобулина) полипептидного гетеродимера содержат такие мутации, что полученные домены гетеродимеризации иммуноглобулина образуют солевые мостики (т.е. ионные взаимодействия) между аминокислотными остатками мутированных участков. Например, домены гетеродимеризации иммуноглобулина полипептидного гетеродимера могут представлять собой комбинацию мутированного домена СН1 и мутированного домена Ck. В мутированном домене СН1 валин в положении 68 (V68) домена СН1 дикого типа человека заменен отрицательно заряженным аминокислотным остатком (например, аспартатом или глутаматом), в то время как лейцин в положении 29 (L29) мутированного домена Ck человека, в котором первый аргинин и последний цистеин удалены, заменен положительно заряженным аминокислотным остатком (например, лизин, аргинин или гистидин). Электростатическое взаимодействие несущего отрицательный заряд аминокислотного остатка в полученном мутированном домене СН1 и несущего положительный заряд аминокислотного остатка в полученном мутированном домене Ck приводит к образованию солевого мостика, стабилизирующего гетеродимерную область между мутированными доменами СН1 и Ck. Как вариант, V68 в СН1 дикого типа может быть заменен аминокислотным остатком, несущим положительный заряд, в то время как L29 мутированного домена Ck человека, в котором первый аргинин и последний цистеин были удалены, может быть заменен аминокислотным остатком, несущим отрицательный заряд. Типовые мутированные последовательности СН1, где V68 заменен отрицательно или положительно заряженной аминокислотой, приведены в последовательностях SEQ ID NO: 844 и 845 из WO 2011/090762 (указанные последовательности включены в настоящую заявку посредством ссылок). Типовые мутированные последовательности Ck, где L29 заменен отрицательно или положительно заряженной аминокислотой, приведены в последовательностях SEQ ID NO: 842 и 843 из WO 2011/090762 (указанные последовательности включены в настоящую заявку посредством ссылок).

[0158] Дополнительно, либо в качестве альтернативного варианта, помимо мутаций V68 домена СН1 и L29 домена Ck могут быть произведены замены на аминокислоты с противоположным зарядом в положениях, отличных от V68 домена СН1 человека и L29 домена Ck человека, для обеспечения ионных взаимодействий между аминокислотами. Такие положения могут быть определены с помощью любого подходящего способа, включая неспецифический мутагенез, анализ кристаллической структуры пары CH1-Ck, для идентификации аминокислотных остатков в области взаимодействия CH1-Ck и последующего определения подходящих положений среди аминокислотных остатков области взаимодействия CH1-Ck с применением ряда критериев (например, склонность к вступлению в ионные взаимодействия, близость к потенциальному остатку-партнеру и т.д.).

[0159] Согласно определенным вариантам реализации полипептидные гетеродимеры согласно настоящему описанию содержат только одну пару доменов гетеродимеризации иммуноглобулина. Например, первая цепь полипептидного гетеродимера может содержать домен СН1 в качестве домена гетеродимеризации иммуноглобулина, а вторая цепь при этом может содержать домен CL (например, Сκ или Сλ) в качестве домена гетеродимеризации иммуноглобулина. Как вариант, первая цепь может содержать домен CL (например, Сκ или Сλ) в качестве домена гетеродимеризации иммуноглобулина, а вторая цепь при этом может содержать домен СН1 в качестве домена гетеродимеризации иммуноглобулина. В соответствии с описанием в настоящей заявке домены гетеродимеризации иммуноглобулина указанных первой и второй цепей способны связываться с образованием гетеродимерного белка согласно настоящему описанию.

[0160] Согласно некоторым другим вариантам реализации гетеродимерные белки согласно настоящему описанию могут содержать две пары доменов гетеродимеризации иммуноглобулина. Например, первая цепь гетеродимера может содержать два домена СН1, а вторая цепь при этом может содержать два домена CL, которые связываются с указанными двумя доменами СН1 в первой цепи. Как вариант, первая цепь может содержать два домена CL, а вторая цепь при этом может содержать два домена СН1, которые связываются с указанными двумя доменами CL в первой цепи. Согласно определенным вариантам реализации первая полипептидная цепь содержит домен СН1 и домен CL, при этом вторая полипептидная цепь содержит домен CL и домен СН1, которые связываются с указанными доменом СН1 и доменом CL, соответственно, первой полипептидной цепи.

[0161] Согласно вариантам реализации, в которых гетеродимерный белок содержит только одну гетеродимеризующую пару (т.е. один домен гетеродимеризации иммуноглобулина в каждой цепи), домен гетеродимеризации иммуноглобулина каждой цепи может быть расположен со стороны амино-конца константной области иммуноглобулина указанной цепи. Как вариант, домен гетеродимеризации иммуноглобулина в каждой цепи может быть расположен со стороны карбоксильного конца константной области иммуноглобулина указанной цепи.

[0162] Согласно вариантам реализации, в которых гетеродимерный белок содержит две гетеродимеризующих пары (т.е. по два домена гетеродимеризации иммуноглобулина в каждой цепи), оба домена гетеродимеризации иммуноглобулина в каждой цепи могут быть расположены со стороны амино-конца константной области иммуноглобулина указанной цепи. Как вариант, оба домена гетеродимеризации иммуноглобулина в каждой цепи могут быть расположены со стороны карбоксильного конца константной области иммуноглобулина указанной цепи. Согласно дальнейшим вариантам реализации один домен гетеродимеризации иммуноглобулина в каждой цепи может быть расположен со стороны амино-конца константной области иммуноглобулина указанной цепи, тогда как другой домен гетеродимеризации иммуноглобулина каждой цепи могут быть расположены со стороны карбоксильного конца константной области иммуноглобулина указанной цепи. Другими словами, согласно таким вариантам реализации константная область иммуноглобулина располагается между двумя доменами гетеродимеризации иммуноглобулина каждой цепи.

D. Константные области иммуноглобулина

[0163] Как указано в настоящей заявке, согласно определенным вариантам реализации ПСМА-связывающие полипептиды согласно настоящему описанию (например, молекулы SMIP, PIMS, SCORPION и интерцепторные) содержат константную область иммуноглобулина (также называемую константной областью) в каждой полипептидной цепи. Включение константной области иммуноглобулина замедляет клиренс гомодимерных и гетеродимерных белков, образованных двумя ПСМА-связывающими полипептидными цепями из кровотока после введения субъекту. Применение мутаций или других модификаций константной области иммуноглобулина также позволяет относительно легко модулировать эффекторные функции димерного полипептида (например, ADCC, ADCP, CDC, связывание комплемента и связывание с Fc-рецепторами), которые могут быть либо усилены, либо ослаблены в зависимости от заболевания, лечение которого проводится, согласно известному уровню техники и описанию в настоящей заявке. Согласно определенным вариантам реализации константная область иммуноглобулина одной или обеих полипептидных цепей указанных полипептидных гомодимеров и гетеродимеров согласно настоящему описанию способна к опосредованию одной или более из указанных эффекторных функций. Согласно другим вариантам реализации одна или более из указанных эффекторных функций константной области иммуноглобулина одной или обеих полипептидных цепей полипептидных гомодимеров и гетеродимеров согласно настоящему описанию понижена или отсутствует по сравнению с соответствующей константной областью иммуноглобулина дикого типа. Например, в димерных ПСМА-связывающих полипептидах, разработанных для стимуляции RTCC, такой, например, как за счет включения CD3-связывающего домена, константная область иммуноглобулина предпочтительно обладает сниженной или отсутствующей эффекторной функцией относительно соответствующей константной области иммуноглобулина дикого типа.

[0164] Константная область иммуноглобулина, присутствующая в ПСМА-связывающих полипептидах согласно настоящему описанию, может состоять либо быть получена из части или из полного домена СН2, домена СН3, домена СН4 или любой их комбинации. Например, константная область иммуноглобулина может содержать домен СН2, домен СН3, оба домена СН2 и СН3, оба домена СН3 и СН4, два домена СН3, домен СН4, два домена СН4, домен СН2 и часть домена СН3.

[0165] Домен СН2, способный образовывать константную область иммуноглобулина ПСМА-связывающего полипептида согласно настоящему описанию может представлять собой домен СН2 иммуноглобулина дикого типа или модификацию такого домена СН2 иммуноглобулина из определенных классов или подклассов иммуноглобулинов (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 или IgD) и из различных видов (включая человека, мышь, крысу и другие млекопитающих).

[0166] Согласно определенным вариантам реализации домен СН2 представляет собой домен СН2 иммуноглобулина человека дикого типа, такой как домены СН2 дикого типа IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 или IgD человека, приведенные в последовательностях SEQ ID NO: 115, 199-201 и 195-197, соответственно, в публикации PST WO 2011/090762 (указанные последовательности включены в настоящую заявку посредством ссылок). Согласно определенным вариантам реализации указанный домен СН2 представляет собой домен СН2 IgG1 человека дикого типа, приведенный в SEQ ID NO: 115 из WO 2011/090762 (указанная последовательность включена в настоящую заявку посредством ссылки).

[0167] Согласно определенным вариантам реализации домен СН2 представляет собой модифицированную область СН2 иммуноглобулина (например, модифицированный домен СН2 IgG1 человека), где произведена замена аминокислоты аспарагина в положении 297 (например, аспарагин → аланин). Такая замена аминокислоты уменьшает или устраняет гликозилирование на указанном участке и препятствует эффективному связыванию Fc с FcγR и C1q. Последовательность модифицированного домен СН2 IgG1 человека с заменой Asn на Ala в положении 297 приведена в SEQ ID NO: 324 из WO 2011/090762 (указанная последовательность включена в настоящую заявку посредством ссылки).

[0168] Согласно определенным вариантам реализации домен СН2 представляет собой модифицированную область СН2 иммуноглобулина (например, модифицированный домен СН2 IgG1 человека), где произведена по меньшей мере одна замена или удаление в положениях 234-238. Например, в области СН2 иммуноглобулина может быть произведена замена в положении 234, 235, 236, 237 или 238, положениях 234 и 235, положениях 234 и 236, положениях 234 и 237, положениях 234 и 238, положениях 234-236, положениях 234, 235 и 237, положениях 234, 236 и 238, положениях 234, 235, 237, и 238, положениях 236-238, или любой другой комбинации двух, трех, четырех или пяти аминокислот в положениях 234-238. Дополнительно или как вариант, в модифицированной области СН2 может быть удалена одна или более (например, две, три, четыре или пять) аминокислота в положениях 234-238, например, в одном из положений 236 или 237, и при этом в другом положении произведена замена. Вышеуказанная(ые) мутация(и) снижают или полностью подавляют антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (ADCC) или Fc рецептор-связывающую способность полипептидного гетеродимера, содержащего указанный модифицированный домен СН2. Согласно определенным вариантам реализации аминокислотные остатки в одном или более положении 234-238 заменены на один или более остаток аланина. Согласно дальнейшим вариантам реализации только один из аминокислотных остатков в положениях 234-238 удален, в то же время одна или более из оставшихся аминокислот в положениях 234-238 может быть заменена другой аминокислотой (например, аланином или серином).

[0169] Согласно некоторым другим вариантам реализации домен СН2 представляет собой модифицированную область СН2 иммуноглобулина (например, модифицированный домен СН2 IgG1 человека), где произведена одна или более замена аминокислот в положениях 253, 310, 318, 320, 322 и 331. Например, в области СН2 иммуноглобулина может быть произведена замена в положении 253, 310, 318, 320, 322 или 331, положениях 318 и 320, положениях 318 и 322, положениях 318, 320 и 322, или любой другой комбинации двух, трех, четырех, пяти или шести аминокислот в положениях 253, 310, 318, 320, 322 и 331. Вышеуказанная(ые) мутация(и) снижают или полностью подавляют комплементзависимую цитотоксичность (CDC) полипептидного гетеродимера, содержащего указанный модифицированный домен СН2.

[0170] Согласно некоторым другим вариантам реализации помимо замены аминокислоты в положении 297, в модифицированной СН2-области (например, модифицированном домене СН2 IgG1 человека) может также быть произведена одна или более (например, две, три, четыре или пять) дополнительная замена в положениях 234-238. Например, в области СН2 иммуноглобулина может быть произведена замена в положениях 234 и 297, положениях 234, 235, и 297, положениях 234, 236 и 297, положениях 234-236 и 297, положениях 234, 235, 237 и 297, положениях 234, 236, 238 и 297, положениях 234, 235, 237, 238 и 297, положениях 236-238 и 297, или замену любой комбинации двух, трех, четырех или пяти аминокислот в положениях 234-238, помимо положения 297. Дополнительно или как вариант, в модифицированной СН2-области может быть удалена одна или более (например, две, три, четыре или пять) аминокислота в положениях 234-238, например, в положении 236 или положении 237. Указанная(ые) дополнительная(ые) мутация(и) уменьшает(ют) или полностью устраняет(ют) активность антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (ADCC) или Fc-рецептор-связывающую способность полипептидного гетеродимера, содержащего указанный модифицированный домен СН2. Согласно определенным вариантам реализации аминокислотные остатки в одном или более положении 234-238 заменены одним или более остатком аланина. Согласно дальнейшим вариантам реализации только один из аминокислотных остатков в положениях 234-238 удален, и при этом одна или более из оставшихся аминокислот в положениях 234-238 может быть заменена другой аминокислотой (например, аланином или серином).

[0171] Согласно определенным вариантам реализации помимо одной или более (например, 2, 3, 4 или 5) замены аминокислот в положениях 234-238, в мутированной области СН2 (например, модифицированном домене СН2 IgG1 человека) гибридного белка согласно настоящему описанию может быть произведена одна или более (например, 2, 3, 4, 5, или 6) дополнительная замена аминокислоты (например, замена на аланин) в одном или более положении, вовлеченном в связывание комплемента (например, в положениях I253, Н310, Е318, K320, K322 или Р331). Примеры мутированных областей СН2 иммуноглобулинов включают СН2 области IgG1, IgG2, IgG4 человека и IgG2a мыши с заменами аланином в положениях 234, 235, 237 (при их наличии), 318, 320 и 322. Типовая мутированная область СН2 иммуноглобулина представлена областью СН2 IGHG2c мыши с заменами на аланин в положениях L234, L235, G237, Е318, K320 и K322.

[0172] Согласно дальнейшим вариантам реализации помимо замены аминокислот в положении 297 и дополнительного(ых) удаления(й) или замен(ы) в положениях 234-238, в модифицированной области СН2 (например, в модифицированном домене СН2 IgG1 человека) может также быть произведена одна или более (например, две, три, четыре, пять или шесть) дополнительная замена в положениях 253, 310, 318, 320, 322 и 331. Например, в области СН2 иммуноглобулина может быть произведена (1) замена в положении 297, (2) одна или более замена или удаление, либо их комбинация, в положениях 234-238, и одна или более (например, 2, 3, 4, 5 или 6) замена аминокислот в положениях I253, Н310, Е318, K320, K322 и Р331, например, одна, две, три замены в положениях Е318, K320 и K322. Аминокислоты в вышеуказанных положениях могут быть заменены на аланин или серии.

[0173] Согласно определенным вариантам реализации в полипептиде области СН2 иммуноглобулина произведены: (i) замена аминокислот по аспарагинам в положении 297 и одна замена аминокислоты в положении 234, 235, 236 или 237; (ii) замена аминокислоты по аспарагину в положении 297 и замены аминокислот в двух из положений 234-237; (iii) замена аминокислоты по аспарагину в положении 297 и замены аминокислот в трех из положений 234-237; (iv) замена аминокислоты по аспарагину в положении 297, замены аминокислот в положениях 234, 235 и 237 и удаление аминокислоты в положении 236; (v) замены аминокислот в трех из положений 234-237 и замены аминокислот в положениях 318, 320 и 322; или (vi) замены аминокислот в трех из положений 234-237, удаление аминокислоты в положении 236 и замены аминокислот в положениях 318, 320 и 322.

[0174] Примеры модифицированных СН2 областей иммуноглобулина с заменами аминокислоты по аспарагину в положении 297 включают: область СН2 IgG1 человека с заменами на аланин в L234, L235, G237 и N297 и удалением G236 (SEQ ID NO: 325 из WO 2011/090762, указанная последовательность включена в настоящую заявку посредством ссылки), область СН2 человека IgG2 с заменами на аланин в V234, G236 и N297 (SEQ ID NO: 326 из WO 2011/090762, указанная последовательность включена в настоящую заявку посредством ссылки), область СН2 IgG4 человека с заменами на аланин в F234, L235, G237 и N297 и удалением G236 (SEQ ID NO: 322 из WO 2011/090762, указанная последовательность включена в настоящую заявку посредством ссылки), область СН2 IgG4 человека с заменами на аланин в F234 и N297 (SEQ ID NO: 343 из WO 2011/090762, указанная последовательность включена в настоящую заявку посредством ссылки), область СН2 IgG4 человека с заменами на аланин в L235 и N297 (SEQ ID NO: 344 из WO 2011/090762, указанная последовательность включена в настоящую заявку посредством ссылки), область СН2 IgG4 человека с заменами на аланин в G236 и N297 (SEQ ID NO: 345 из WO 2011/090762, указанная последовательность включена в настоящую заявку посредством ссылки), и область СН2 IgG4 человека с заменами на аланин в G237 и N297 (SEQ ID NO: 346 из WO 2011/090762, указанная последовательность включена в настоящую заявку посредством ссылки).

[0175] Согласно определенным вариантам реализации помимо описанных выше замен аминокислот, модифицированная область СН2 (например, модифицированный домен СН2 IgG1 человека) может содержать одну или более дополнительную замену аминокислот в одном или более положении, отличном от вышеуказанных положений. Такие замены аминокислот могут представлять собой консервативные или неконсервативные замены аминокислот. Например, согласно определенным вариантам реализации Р233 может быть заменен на Е233 в модифицированной области СН2 IgG2 (см., например, SEQ ID NO: 326 из WO 2011/090762; указанная последовательность включена в настоящую заявку посредством ссылки). Дополнительно или как вариант, согласно определенным вариантам реализации в указанной модифицированной области СН2 может присутствовать одна или более вставка аминокислоты, удаление аминокислоты, либо и то, и другое. Вставка(и), удаление(ия) или замена(ы) может(могут) присутствовать где угодно в области СН2 иммуноглобулина, например, на N- или С-конце области СН2 иммуноглобулина дикого типа, в результате соединения области СН2 с другой областью (например, связывающим доменом или доменом гетеродимеризации иммуноглобулина) посредством шарнирной области.

[0176] Согласно определенным вариантам реализации модифицированная область СН2 в полипептиде согласно настоящему описанию содержит или представляет собой последовательность, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% идентичную области СН2 иммуноглобулина дикого типа, такой как область СН2 IgG1, IgG2, или IgG4 человека дикого типа, или IgG2a мыши (например, IGHG2C).

[0177] Модифицированная область СН2 иммуноглобулина в ПСМА-связывающем полипептиде согласно настоящему описанию может быть получена из области СН2 различных изотипов иммуноглобулина, таких как IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 и IgD, различных видов (включая человека, мышь, крысу и других млекопитающих). Согласно определенным вариантам реализации модифицированная область СН2 иммуноглобулина в гибридном белке согласно настоящему описанию может быть получена из области СН2 IgG1, IgG2 или IgG4 человека, либо IgG2a мыши (например, IGHG2c), последовательности которых приведены в последовательностях SEQ ID NO: 115, 199, 201 и 320 из WO 2011/090762 (указанные последовательности включены в настоящую заявку посредством ссылок).

[0178] Согласно определенным вариантам реализации модифицированный домен СН2 представляет собой домен СН2 IgG1 человека с заменами на аланин в положениях 235, 318, 320 и 322 (т.е. домен СН2 IgG1 человека с заменами L235A, Е318А, K320A и K322A) (SEQ ID NO: 595 из WO 2011/090762, указанная последовательность включена в настоящую заявку посредством ссылки) и необязательно мутацией N297 (например, заменой на аланин). Согласно некоторым другим вариантам реализации модифицированный домен СН2 представляет собой домен СН2 IgG1 человека с заменами на аланин в положениях 234, 235, 237, 318, 320 и 322 (т.е. домен СН2 IgG1 человека с заменами L234A, L235A, G237A, Е318А, K320A и K322A) (SEQ ID NO: 596 из WO 2011/090762, указанная последовательность включена в настоящую заявку посредством ссылки) и необязательно мутацией N297 (например, заменой на аланин).

[0179] Согласно определенным вариантам реализации модифицированный домен СН2 представляет собой модифицированный домен СН2 IgG1 человека с известными в данной области техники мутациями, усиливающими иммунологическую активность, например, ADCC, ADCP, CDC, связывание комплемента, связывание Fc-рецептора, или любую их комбинацию.

[0180] Домен СН3, способный образовывать константную область иммуноглобулина ПСМА-связывающего полипептида согласно настоящему описанию, может представлять собой домен СН3 иммуноглобулина дикого типа или модификацию указанного домена СН3 иммуноглобулина из определенных классов или подклассов иммуноглобулинов (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgM) различных видов (включая человека, мышь, крысу и другие млекопитающих). Согласно определенным вариантам реализации домен СН3 представляет собой домен СН3 иммуноглобулина человека дикого типа, например, домены СН3 дикого типа IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, или IgM человека, приведенные в последовательностях SEQ ID NO: 116, 208-210, 204-207 и 212, соответственно, из WO 2011/090762 (указанные последовательности включены в настоящую заявку посредством ссылок). Согласно определенным вариантам реализации указанный домен СН3 представляет собой домен СН3 IgG1 человека дикого типа, приведенный в SEQ ID NO: 116 из WO 2011/090762 (указанная последовательность включена в настоящую заявку посредством ссылки). Согласно определенным вариантам реализации домен СН3 представляет собой модифицированный домен СН3 иммуноглобулина человека, такой как модифицированный домен СН3 на основе домена СН3 дикого типа антител IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE или IgM человека, либо полученный из него. Например, модифицированный домен СН3 может представлять собой домен СН3 IgG1 человека с одной или двумя мутациями в положениях Н433 и N434 (положения пронумерованы в соответствии с системой нумерации EU). Мутации в таких положениях могут быть вовлечены в связывание комплемента. Согласно некоторым другим вариантам реализации модифицированный домен СН3 может представлять собой домен СН3 IgG1 человека, но с одной или двумя заменами аминокислот в положении F405 или Y407. Аминокислоты в таких положениях вовлечены в взаимодействие с другим доменом СН3. Согласно определенным вариантам реализации модифицированный домен СН3 может представлять собой модифицированный домен СН3 IgG1 человека с удаленным последним лизином. Последовательность этого модифицированного домена СН3 приведена в SEQ ID NO: 761 из WO 2011/090762 (указанная последовательность включена в настоящую заявку посредством ссылки).

[0181] Согласно определенным вариантам реализации ПСМА-связывающие полипептиды, образующие полипептидный гетеродимер, содержат пару СН3, содержащую так называемые мутации «выступы-во-впадины» («knobs-into-holes») (см., Marvin and Zhu, Acta Pharmacologica Sinica 26:649-58, 2005; Ridgway et al., Protein Engineering 9:617-21, 1966). Более конкретно, мутации могут быть введены в каждый из двух доменов СН3 каждой полипептидной цепи, так что стерическая комплементарность, необходимая для связывания СН3/СН3, обеспечивает спаривание указанных двух доменов СН3 друг с другом. Например, домен СН3 в одном одноцепочечным полипептиде полипептидного гетеродимера может содержать мутацию T366W («knob»-мутация («выступ»), при которой небольшая аминокислота заменяется большей), а домен СН3 в другом одноцепочечном полипептиде указанного полипептидного гетеродимера может содержать мутацию Y407A («hole»-мутация («впадина»), при которой происходит замена большой аминокислоты на меньшую). Другие примеры мутаций типа «выступы-во-впадины» включают (1) мутацию T366Y в одном домене СН3 и Y407T в другом домене СН3, и (2) мутацию T366W в одном домене СН3 и мутации T366S, L368A и Y407V в другом домене СН3.

[0182] Домен СН4, способный образовывать константную область иммуноглобулина ПСМА-связывающих полипептидов согласно настоящему описанию может представлять собой домен СН4 иммуноглобулина дикого типа либо модификацию такого домена СН4 иммуноглобулина из молекул IgE или IgM. Согласно определенным вариантам реализации указанный домен СН4 представляет собой домен СН4 иммуноглобулина человека дикого типа, такой как домены СН4 дикого типа молекул IgE и IgM человека, приведенные в последовательностях SEQ ID NO: 213 и 214, соответственно, из WO 2011/090762 (указанные последовательности включены в настоящую заявку посредством ссылок). Согласно определенным вариантам реализации домен СН4 представляет собой модифицированный домен СН4 иммуноглобулина человека, такой как модифицированный домен СН4 на основе домена СН4 молекул IgE или IgM человека или полученный из него, содержащий мутации, повышающие или снижающие иммунологическую активность, которая, согласно имеющимся сведениям, связана с Fc-областью IgE или IgM.

[0183] В определенных вариантах реализации константная область ПСМА-связывающих полипептидов иммуноглобулина согласно настоящему описанию содержит комбинацию доменов СН2, СН3 или СН4 (т.е. более чем один домен константной области, выбранный из СН2, СН3 и СН4). Например, указанная константная область иммуноглобулина может содержать домены СН2 и СН3 или домены СН3 и СН4. Согласно некоторым другим вариантам реализации константная область иммуноглобулина может содержать два домена СН3 и не содержать доменов СН2 или доменов СН4 (т.е. только два или более СН3). Несколько доменов константной области, образующие константную область иммуноглобулина, могут быть основаны на одной и той же молекуле иммуноглобулина или получены из одной и той же молекулы иммуноглобулина, либо молекул иммуноглобулина того же класса или подкласса. Согласно определенным вариантам реализации константная область иммуноглобулина представляет собой СН2СН3 IgG (например, СН2СН3 IgG1, CH2CH3 IgG2 и СН2СН3 IgG4) и может представлять собой СН2СН3 человека (например, из IgG1 человека, IgG2 и IgG4). Например, согласно определенным вариантам реализации константная область иммуноглобулина содержит (1) домены СН2 и СН3 IgG1 человека дикого типа, (2) IgG1 человека СН2 с заменой N297A (т.е. CH2(N297A)) и СН3 дикого типа IgG1 человека, или (3) CH2(N297A) IgG1 человека и модифицированный СН3 IgG1 человека с удаленным последним лизином.

[0184] Альтернативно, несколько доменов константной области могут быть основаны на разных молекулах иммуноглобулина, либо на молекулах разных классов или подклассов иммуноглобулина, или получены из них. Например, согласно определенным вариантам реализации константная область иммуноглобулина содержит и домен СН3 IgM человека, и домен СН3 IgG1 человека. Несколько доменов константной области, образующих константную область иммуноглобулина, могут быть связаны друг с другом непосредственно либо могут быть связаны друг с другом посредством одной или более (например, приблизительно 2-10) аминокислот.

[0185] Типовые константные области иммуноглобулина приведены в последовательностях SEQ ID NO: 305-309, 321, 323, 341, 342 и 762 из WO 2011/090762 (указанные последовательности включены в настоящую заявку посредством ссылок).

[0186] Согласно определенным вариантам реализации константные области иммуноглобулина обоих ПСМА-связывающих полипептидов полипептидного гомодимера или гетеродимера идентичны друг другу. Согласно некоторым другим вариантам реализации константная область иммуноглобулина одной полипептидной цепи гетеродимерного белка отличается от константной области иммуноглобулина другой полипептидной цепи указанного гетеродимера. Например, одна константная область иммуноглобулина гетеродимерного белка может содержать домен СН3 с мутацией типа «выступ» (knob-мутацией), в то время как другая константная область иммуноглобулина указанного гетеродимерного белка может содержать домен СН3 с мутацией типа «впадина» («hole»-мутацией).

IV. Нуклеиновые кислоты, клетки-хозяева и способы получения

[0187] Настоящее изобретение также охватывает нуклеиновые кислоты (например, ДНК или РНК) кодирующие ПСМА-связывающий полипептид описанный в настоящей заявке, или одну или более полипептидные цепи димерного или гетеродимерного ПСМА-связывающего белка согласно описанию в настоящей заявке. Нуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению включают нуклеиновые кислоты, содержащие область, в существенной степени идентичную полинуклеотиду из перечисленных в таблице 3, ниже. Согласно определенным вариантам реализации нуклеиновая кислота в соответствии с настоящим изобретением меньшей мере на 80%, как правило, по меньшей мере приблизительно на 90%, и чаще по меньшей мере приблизительно на 95% или по меньшей мере приблизительно на 98% идентична кодирующему полипептид полинуклеотиду из перечисленных в таблице 3. Нуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению также включают комплементарные нуклеиновые кислоты. В некоторых случаях указанные последовательности полностью комплементарны (отсутствуют некомплементарные основания) при выравнивании. В других случаях в последовательностях может присутствовать приблизительно до 20% несовпадений. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложены нуклеиновые кислоты, кодирующие и первую, и вторую полипептидные цепи гетеродимерного ПСМА-связывающего белка согласно настоящему изобретению. Последовательности нуклеиновых кислот, предложенных в настоящей заявке, могут быть доработаны с применением оптимизации кодонов, вырожденных последовательностей, молчащих мутаций и других ДНК-методик для оптимизации экспрессии у конкретного хозяина, и настоящее изобретение охватывает такие модификации последовательностей.

[0188] Полинуклеотидные молекулы, содержащие требуемую полинуклеотидную последовательность, размножают путем помещения указанной молекулы в вектор. Используют вирусные и невирусные векторы, в том числе плазмиды. Выбор плазмиды зависит от типа клеток, в которых необходимо осуществлять размножение, и от цели размножения. Определенные векторы подходят амплификации и получения больших количеств требуемой последовательности ДНК. Другие векторы подходят для экспрессии в клетках в культуре. И другие векторы подходят для переноса и экспрессии в клетках животного или человека как целого. Выбор подходящего вектора находится полностью в пределах существующего уровня техники. Многие такие векторы коммерчески доступны. Часть полинуклеотида или полноразмерный полинуклеотид встраивают в вектор, как правило, путем присоединения с помощью ДНК-лигазы в сайт рестриктазного расщепления в векторе. Как вариант, нужная последовательность нуклеотидов может быть встроена с применением гомологичной рекомбинации in vivo. Как правило, это достигается путем присоединения к вектору областей гомологии с фланкированием нужной нуклеотидной последовательности. Области гомологии добавляют лигированием олигонуклеотидов или с помощью полимеразной цепной реакции с применением праймеров, содержащих, например, и область гомологии, и часть требуемой нуклеотидной последовательности.

[0189] Для экспрессирования может применяться экспрессионная кассета или система. Для экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, описанный в настоящей заявке, молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, функционально связанный с регуляторными последовательностями, контролирующими транскрипционную экспрессию в экспрессионном векторе, вводят в клетку-хозяин. Кроме последовательностей регуляции транскрипции, таких как промоторы и энхансеры, экспрессионные векторы могут включать трансляционные регуляторные последовательности и маркерный ген, подходящий для селекции клеток, несущих указанный экспрессионный вектор. Генный продукт, кодируемый полинуклеотидом согласно настоящему изобретению, экспрессируется в любой удобной системе экспрессии, включая, например, системы на основе бактерий, дрожжей, насекомых, амфибий и млекопитающих. В указанном экспрессионном векторе кодирующий полипептид полинуклеотид связан с регуляторной последовательностью, подходящей для получения нужных характеристик экспрессии. Такие последовательности могут включать промоторы, энхансеры, терминаторы, операторы, репрессоры и индукторы. Промоторы могут быть регулируемыми (например, промотор индуцируемого стероидами вектора pIND (Invitrogen)) или конститутивными (например, промоторы CMV, SV40, фактора элонгации или последовательностей LTR). Указанные промоторы соединены с требуемой последовательностью нуклеотидов с применением описанных выше методик связывания с векторами. Могут применяться любые известные в данной области техники методики. Соответственно, экспрессионный вектор обычно обеспечивает область инициации транскрипции и трансляции, которая может быть индуцируемой или конститутивной, при этом кодирующая область функционально связана с указанной областью инициации транскрипции для транскрипционного контроля, и область терминации транскрипции и трансляции.

[0190] Экспрессионная кассета («экспрессионная единица») может быть введена в разнообразные векторы, например, в плазмиду, ВАС, YAC, бактериофаг, такой как лямбда, Р1, М13, и т.д., вирусные векторы на основе вирусов растений или животных (например, векторы на основе ретровирусов, аденовирусные векторы), и т.п., при этом, указанные векторы, как правило, характеризуются способностью обеспечивать отбор клеток, содержащих указанные экспрессионные векторы. Указанные векторы способны обеспечить экстрахромосомное поддержание, в частности, в виде плазмид или вирусов, либо интеграцию в хромосому хозяина. Если необходимо экстрахромосомное поддержание, обеспечивается последовательность точки начала репликации плазмиды, дающая низкое или высокое число копий. Для селекции доступны разнообразные маркеры, в частности, защищающие от токсинов, более конкретно - от антибиотиков. Выбор конкретного маркера основан на природе хозяина, причем в некоторых случаях для ауксотрофных хозяев может применяться комплементация. Введение ДНК-конструкции может осуществляться с применением любого удобного способа, включая, например, конъюгацию, бактериальную трансформацию, кальций-осажденную ДНК, электропорацию, слияние, транфекцию, инфицирование вирусными векторами, биолистику и т.п.

[0191] Соответственно, белки для применения согласно настоящему изобретению могут синтезироваться в сконструированных генноинженерными методами клетках-хозяевах в соответствии с обычными методами. Подходящие клетки-хозяева представляют собой такие типы клеток, которые могут быть трансформированы или трансфицированы экзогенной ДНК и выращены в культуре, и включают клетки бактерий, грибов и культивируемые клетки высших эукариот (в том числе культивируемые клетки многоклеточных организмов), в частности, культивируемые клетки млекопитающих. Методики для манипулирования клонированными молекулами ДНК и введения экзогенной ДНК в разнообразные клетки-хозяина описаны в Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual («Молекулярное клонирование. Лабораторное руководство») (3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001), и в Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology («Краткие протоколы молекулярной биологии») (4th ed., John Wiley & Sons, 1999).

[0192] Например, экспрессионный вектор для рекомбинантной экспрессии гомодимерного ПСМА-связывающего белка, содержащего два идентичных ПСМА-связывающих полипептида согласно описанию в настоящей заявке, обычно включает сегмент нуклеиновой кислоты, кодирующий указанный ПСМА-связывающий полипептид, функционально связанный с промотором. При рекомбинантной экспрессии гетеродимерного ПСМА-связывающего белка, содержащего разные первую и вторую полипептидные цепи, для экспрессии полного гетеродимерного белка указанные первая и вторая полипептидные цепи могут коэкспрессироваться в указанной клетке-хозяине из отдельных векторов. Как вариант, при экспрессии гетеродимерных ПСМА-связывающих белков первая и вторая полипептидные цепи коэкспрессируются из отдельных экспрессионных единиц одного и того же вектора в указанной клетке-хозяине для экспрессии полного гетеродимерного белка. Указанный(ые) экспрессионный(ые) вектор(ы) переносят в клетку-хозяин обычными методами, и трансфицированные клетки затем культивируют с применением обычных методов для получения кодируемого(ых) полипептида(ов) для получения соответствующего ПСМА-связывающего белка.

[0193] Для направления рекомбинантного белка в секреторный путь клетки-хозяина в экспрессионном векторе присутствует секреторная сигнальная последовательность (также известная как лидерная последовательность). Указанная секреторная сигнальная последовательность может быть представлять собой такую последовательность нативной формы рекомбинантного белка, или может быть получена из другого секретируемого белка, либо синтезирована de novo. Указанная секреторная сигнальная последовательность функционально связана с кодирующей полипептид последовательностью ДНК, т.е. указанные две последовательности объединены в правильной рамке считывания и расположены так, чтобы направлять вновь синтезированный полипептид в секреторный путь клетки-хозяина. Секреторные сигнальные последовательности обычно расположены в 5'направлении относительно последовательности ДНК, кодирующей представляющий интерес полипептид, однако определенные сигнальные последовательности могут быть расположены в других местах представляющей интерес последовательности ДНК. (см., например, Welch et al., патент США №5037743; Holland et al., патент США №5143830). Согласно некоторым вариантам секреторная сигнальная последовательность для применения в соответствии с настоящим изобретением имеет последовательность аминокислот MEAPAQLLFLLLLWLPDTTG (SEQ ID NO: 85).

[0194] Культивируемые клетки млекопитающих подходят в качестве хозяев для синтеза рекомбинантных белков для применения согласно настоящему изобретению. Способы введения экзогенной ДНК в клетку-хозяина млекопитающего включают трансфекцию с применением фосфата кальция (Wigler et al., Cell 14:725, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603, 1981: Graham and Van der Eb, Virology 52:456, 1973), электропорацию (Neumann et al., EMBO J. 1:841-845, 1982), опосредованную ДЭАЭ-декстраном трансфекцию (Ausubel et at., выше), и опосредованную липосомами трансфекцию (Hawley-Nelson et al., Focus 15:73, 1993; Ciccarone et al., Focus 15:80, 1993). Синтез рекомбинантных полипептидов в культурах клеток млекопитающих описан, например, у Levinson et al., в патенте США №4713339; Hagen et al., в патенте США №4784950; у Palmiter et al., в патенте США №4579821; и у Ringold, в патенте США №4656134. Примеры подходящих клеток-хозяев млекопитающих включают клетки почки африканской зеленой мартышки (Vero; ATCC CRL 1587), клетки эмбриональной почки человека (293-HEK; ATCC CRL 1573), клетки почки новорожденного хомяка (BHK-21, BHK-570; ATCC CRL 8544, ATCC CRL 10314), клетки почки собаки (MDCK; ATCC CCL 34), клетки яичника китайского хомячка (СНО-K1; ATCC CCL61; СНО DG44; СНО DXB11 (Hyclone, Logan, UT); см. также, например, Chasin et al., Som. Cell. Molec. Genet. 12:555, 1986)), клетки гипофиза крысы (GH1; ATCC CCL82), клетки HeLa S3 (ATCC CCL2.2), клетки гепатомы крысы (H-4-II-E; ATCC CRL 1548), трансформированные SV40 клетки почки обезьяны (COS-1; ATCC CRL 1650) и эмбриональные клетки мыши (NIH-3T3; ATCC CRL 1658). Дополнительные подходящие клеточные линии известны в данной области техники и могут быть получены из национальных депозитариев, таких как Американская коллекция типовых культур (American Type Culture Collection, Манассас, Вирджиния). Могут применяться сильные транскрипционные промоторы, такие как промоторы SV-40 или цитомегаловируса. См., например, патент США №4956288. Другие подходящие промоторы включают промоторы металлотионеиновых генов (патенты США №4579821 и №4601978) и главный поздний промотор аденовируса.

[0195] Для отбора культивируемых клеток млекопитающих, в которые была встроена чужеродная ДНК, обычно применяют отбор по чувствительности к лекарственному препарату. Такие клетки часто называют «трансфектантами». Клетки, которые культивировали в присутствии селективного агента, и способные передавать представляющий интерес ген потомству, называют «стабильными трансфектантами». Типовые селектируемые маркеры включают ген, кодирующий устойчивость к антибиотику неомицину, позволяющий проводить отбор в присутствии неомицинового лекарственного средства, такого как G-418 или т.п.; ген gpt ксантин-гуанин- фосфорибозилтрансферазы, который позволяет клетке-хозяину расти в присутствии микофеноловой кислоты / ксантина; и маркеры, обеспечивающие устойчивость к зеоцину, блеомицину, бластоцидину и гигромицину (см., например, Gatignol et al., Mol. Gen. Genet. 207:342, 1987; Drocourt et al., Nucl. Acids Res. 18:4009, 1990). Системы селекции могут также применяться для повышения уровня экспрессии представляющего интерес гена, процесса, называемого «амплификацией». Амплификацию осуществляют путем культивирования трансфектантов в присутствии небольшого количества селективного агента и последующего повышения количества селективного агента для отбора клеток, продуцирующих значительные количества продуктов введенных генов. Типовым амплифицируемым селектируемым маркером является дигидрофолатредуктаза, придающая устойчивость к метотрексату. Также можно применять другие гены лекарственной устойчивости (например, устойчивости к гигромицину, множественной лекарственной устойчивости, пуромицин-ацетилтрансферазы).

[0196] Клетки других высших эукариот, в том числе клетки насекомых, клетки растений и клетки птиц, могут также применяться в качестве хозяев. Применение Agrobacterium rhizogenes в качестве вектора для экспрессирования генов в клетках растений описано у Sinkar et al., J. Biosci. (Bangalore) 11:47-58, 1987. Трансформация клеток насекомых и синтез в них чужеродных полипептидов описаны у Guarino et al., патент США №5162222, и в публикации WIPO WO 94/06463.

[0197] Клетки насекомых могут быть инфицированы рекомбинантным бакуловирусом, как правило, получаемым из вируса ядерного полиэдроза Autographa californica (AcNPV). См. King and Possee, The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide («Бакуловирусная экспрессионная система. Лабораторное руководством) (Chapman & Hall, London); O'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual («Бакуловирусные экспрессионные векторы. Лабораторное руководство») (Oxford University Press., New York 1994); и Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology («Протоколы бакуловирусного экспрессирования. Методы молекулярной биологии») (Richardson ed., Humana Press, Totowa, NJ, 1995). Рекомбинантный бакуловирус может также быть получен с применением системы на основе транспозонов, описанной у Luckow et al. (J. Virol. 67:4566-4579, 1993). Указанная система, в которой используется переносящие векторы, коммерчески доступен в виде набора (набор ВАС-ТО-ВАС; Life Technologies, Гейтерсберг, Мэриленд). Переносящий вектор (например, PFASTBAC1; Life Technologies) содержит транспозон Tn7 для переноса ДНК, кодирующей представляющий интерес белок в геном бакуловируса, размещаемый в E. coli в виде большой плазмиды, называемой «бакмидой». См. Hill-Perkins and Possee, J. Gen. Virol. 71:971-976, 1990; Bonning et al., J. Gen. Virol. 75:1551-1556, 1994; и Chazenbalk and Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543-1549, 1995. Кроме того, переносящие векторы могут включать лигированную внутрь рамки ДНК, кодирующую удлиняющую или аффинную метку полипептида согласно приведенному выше описанию. С применением известных в данной области техники методик переносящий вектор, содержащий кодирующую белок последовательность ДНК, трансформируют в клетки-хозяева E. coli, и проводят скрининг указанных клеток на бакмиды, содержащие прерванный ген lacZ, что указывает на наличие рекомбинантного бакуловируса. Бакмидную ДНК, содержащую геном рекомбинантного бакуловируса, выделяют с применением обычных методов и используют для трансфицирования клеток Spodoptera frugiperda, таких как клетки Sf9. В результате синтезируется рекомбинантный вирус, экспрессирующий представляющий интерес белок. Культуры рекомбинантного вируса получают общепринятыми в данной области техники способами.

[0198] Для получения белка клетки-хозяина, как правило - линию клеток, полученных от травяной совки Spodoptera frugiperda (например, клетки Sf9 или Sf21) или Trichoplusia ni (например, клетки HIGH FIVE; Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) инфицируют рекомбинантным вирусом. См. в целом Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles & Applications of Recombinant DNA («Молекулярная биотехнология. Теория и практика рекомбинантной ДНК») (ASM Press, Washington, D.C., 1994). См. также патент США №5300435. Для культивирования и поддержания клеток в культуре применяют бессывороточные среды. Среды подходящего состава известны в данной области Техники и могут быть приобретены у коммерческих поставщиков. После инокуляции с плотностью приблизительно 2-5×10⁵ клеток клетки культивируют до достижения плотности 1-2×10⁶ клеток; в этот момент добавляют культуру рекомбинантного вируса с множественностью инфицирования (MOI) 0,1-10, чаще всего, около 3. Выполняемые процедуры, как правило, описаны в доступных лабораторных руководствах (см., например, King and Possee, выше; O'Reilly et al., выше; Richardson, выше).

[0199] Клетки грибов, включая клетки дрожжей, также подходят для применения в настоящем изобретении. Подходящие для этого виды дрожжей включают, например, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris и Pichia methanolica. Способы трансформации клеток S. cerevisiae экзогенной ДНК и синтеза в них рекомбинантных полипептидов описаны, например, Kawasaki, в патенте США №4599311; Kawasaki et al., в патенте США №4931373; Brake, в патенте США №4870008; Welch et al., в патенте США №5037743; и Murray et al., в патенте США №4845075. Трансформированные клетки отбирают по фенотипу, определенному с помощью селектируемого маркера, как правило, по лекарственной устойчивости или способности расти в отсутствие конкретного компонента питания (например, лейцина). Типовой векторной системой для применения в Saccharomyces cerevisiae является векторная система РОТ1, описанная Kawasaki et al. (патент США №4931373), позволяющая проводить отбор трансформированных клеток по росту в содержащих глюкозу средах. Подходящие промоторы и терминаторы для применения в дрожжах включают происходящие из генов ферментов гликолиза (см., например, Kawasaki, патент США №4599311; Kingsman et al., патент США №4615974; и Bitter, патент США №4977092) и генов алкогольдегидрогеназы. См. также патенты США №4990446, №5063154, №5139936 и №4661454. В данной области техники известны системы трансформации и для других дрожжей, в том числе Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii и Candida maltosa. См., например, Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132:3459-3465, 1986; Cregg, патент США №4882279; и Raymond et al., Yeast 14:11-23, 1998. Могут применяться клетки Aspergillus в соответствии со способами по McKnight et al., патент США №4935349. Способы трансформации Acremonium chrysogenum описаны Sumino et al., в патенте США №5162228. Способы трансформации Neurospora описаны Lambowitz, в патенте США №4486533. Получение рекомбинантных белков in Pichia methanolica описано в патентах США №5716808, №5736383, №5854039 и №5888768.

[0200] Прокариотические клетки-хозяина, включая штаммы бактерий Escherichia coli, Bacillus и других родов, также подходят для применения в качестве клеток-хозяина в настоящем изобретении. Методики трансформации указанных хозяев и экспрессирование чужеродных последовательностей ДНК, клонированных в них, общеизвестны в данной области техники (см., например, Sambrook and Russell, выше). При экспрессировании рекомбинантного белка в бактериях, таких как Е. coli, указанный белок может оставаться в цитоплазме, как правило, в виде нерастворимых гранул, или может быть направлен в периплазматическое пространство бактериальной секреторной последовательностью. В первом случае клетки лизируют, гранулы выделяют и денатурируют с применением, например, гуанидинизотиоцианата или мочевину. Затем может быть проведен рефолдинг и димеризация денатурированного белка разбавлением денатуранта, например, диализом против раствора мочевины и комбинации восстановленного и окисленного глутатиона, с последующим диализом против забуференного солевого раствора. В альтернативном варианте указанный белок может быть извлечен из цитоплазмы в растворимой форме и выделен без применения денатурантов. Белок извлекают из клетки в виде водного экстракта, например, в забуференном фосфатом солевом растворе. Для захвата представляющего интерес белка экстракт помещают непосредственно в хроматографическую среду, такую как колонка с иммобилизованными антителами или гепарин-сефарозой. Секретируемые белки могут быть извлечены из периплазматического пространства в растворимой и функциональной форме при разрушении клеток (например, с помощью ультразвука или осмотического шока) для высвобождения содержимого периплазматического пространства и выделения белка, с устранением, таким образом, необходимости денатурации и рефолдинга Антитела, включая одноцепочечные антитела, могут синтезироваться в бактериальных клетках-хозяевах в соответствии с известными способами. См., например, Bird et al., Science 242:423-426, 1988; Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988; и Pantoliano et al., Biochem. 30:10117-10125, 1991.

[0201] Трансформированные или трансфицированные клетки-хозяина культивируют в соответствии со стандартными процедурами в культуральной среде, содержащей питательные вещества и другие компоненты, необходимые для роста выбранных клеток-хозяев. В данной области техники известны разнообразные подходящие среды, в том числе определенные среды и комплексные среды; как правило, они включают источник углерода, источник азота, незаменимые аминокислоты, витамины и минеральные вещества. Также среды могут при необходимости содержать такие компоненты, как факторы роста или сыворотка. Ростовая среда обычно является селективной, обеспечивая отбор клеток, содержащих экзогенно добавленную ДНК, например, отбор по чувствительности к лекарственному препарату или дефициту незаменимого питательного вещества, компенсируемому селектируемым маркером, который переносится экспрессионным вектором или ко-трансфицируется в клетку-хозяин.

[0202] ПСМА-связывающие белки очищают с применением стандартных способов очистки белка, как правило, используя комбинацию хроматографических методов. См. в целом Affinity Chromatography: Principles & Methods («Аффинная хроматография. Теория и практика») (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice («Выделение белков. Теория и практика») (Springer-Verlag, New York 1994). Белки, содержащие Fc-область иммуноглобулина, могут быть очищены аффинной хроматографией с иммобилизованным белком А или белком G. Дополнительные этапы очистки, такие как гель-фильтрация, могут применяться для получения требуемой степени чистоты или для обеспечения обессоливания, замены буфера и т.п.

V. Способы лечения

[0203] Согласно другому варианту реализации в настоящем изобретении предложен способ лечения расстройства, характеризующегося сверхэкспрессией ПСМА. В общем, такие способы включают введение нуждающемуся в таком лечении субъекту терапевтически эффективного количества ПСМА-связывающего белка согласно описанию в настоящей заявке. Согласно некоторым вариантам реализации указанный ПСМА-связывающий белок обладает по меньшей мере одной эффекторной функцией, выбранной из антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (ADCC) и комплементзависимой цитотоксичности (CDC), так что указанный ПСМА-связывающий белок индуцирует ADCC и/или CDC против ПСМА-экспрессирующих клеток у указанного субъекта. Согласно другим вариантам реализации, в случае, когда ПСМА-связывающий белок содержит второй связывающий домен, который специфично связывается с Т-клеткой (например, с TCR-комплексом или его компонентом, таким как CD3ε), указанный ПСМА-связывающий белок индуцирует перенаправленную Т-клеточную цитотоксичность (RTCC) против ПСМА-экспрессирующих клеток у указанного субъекта.

[0204] Для определенных версий указанного способа расстройство представляет собой рак. Типовые раковые заболевания, поддающиеся лечению в соответствии с настоящим изобретением, включают, например, рак предстательной железы (например, кастрационно-резистентный рак предстательной железы), колоректальный рак, рак желудка, светлоклеточный рак почки, рак мочевого пузыря и рак легких. Согласно другим вариантам указанное расстройство представляет собой расстройство предстательной железы, такое как, например, рак предстательной железы или доброкачественная гиперплазия предстательной железы (ДГПЖ). Согласно дальнейшим вариантам реализации указанное расстройство представляет собой неоваскулярное расстройство, такое как, например, рак, характеризующийся ростом солидной опухоли. Типовые раковые заболевания с опухолевой сосудистой сетью, характеризующиеся сверхэкспрессией ПСМА и поддающиеся лечению в соответствии с настоящим изобретением, включают, например, светлоклеточный рак почки (CCRCC, или СКРП), колоректальный рак, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак легких и рак поджелудочной железы (см., например, Baccala et al., Urology 70:385-390, 2007 (экспрессия ПСМА при СКРП); Liu et al., Cancer Res. 57:3629-3634, 1997 (экспрессия ПСМА при различных раковых заболеваниях, не относящихся к предстательной железе, в том числе при раке почек, уротелиальном раке, раке легких, толстой кишки, молочной железы и аденокарциноме печени); и Milowsky et al., J. Clin. Oncol. 25:540-547, 2007 (экспрессия, например, при раке почек, толстой кишки, мочевого пузыря и поджелудочной железы, и демонстрация специфического таргетинга сосудистой сети опухоли у людей с применением mAb против ПСМА).

[0205] В каждом из описанных в настоящей заявке вариантов реализации способов лечения ПСМА-связывающий белок доставляют в соответствии с общепринятыми методами, связанными с управлением течением заболевания или расстройства, лечение которого необходимо провести. В соответствии с настоящим описанием эффективное количество ПСМА-связывающего белка вводят нуждающемуся в таком лечении субъекту на протяжении времени и в условиях, достаточного(ых) для предотвращения или лечения указанного заболевания или расстройства.

[0206] Субъекты, подходящие для введения ПСМА-связывающих белков согласно описанию в настоящей заявке включают пациентов с высоким риском развития конкретного расстройства, характеризующегося сверхэкспрессией ПСМА, а также пациентов, у которых уже имеется такое расстройство. Как правило, у указанного субъекта было диагностировано расстройство, лечение которого необходимо провести. Далее, может проводиться мониторинг любых изменений состояния расстройства у субъектов на протяжении курса лечения (например, повышения или снижения клинических симптомов указанного расстройства). Также согласно некоторым вариантам субъект не страдает от другого расстройства, требующего лечения, включающего таргетинг ПСМА-экспрессирующих клеток.

[0207] При профилактическом применении фармацевтические композиции или медикаменты вводят пациенту, предрасположенному к конкретному расстройству или с каким-либо иным риском развития указанного расстройства, в количестве, достаточном для полного устранения или снижения указанного риска, или для задержки наступления указанного расстройства. При терапевтическом применении композиции или медикаменты вводят пациенту, у которого предположительно имеется такое расстройство, либо уже страдающего от такого расстройства, в количестве, достаточном для излечения или по меньшей мере частичного устранения симптомов указанного расстройства и его осложнений. Количество, соответствующее выполнению указанной задачи, называют терапевтически эффективной дозой или терапевтически эффективным количеством. И при профилактических, и при терапевтических режимах агенты как правило вводят в нескольких дозировках до достижения надлежащего ответа (например, подавления неадекватного ангиогенеза). Как правило, указанный ответ отслеживают и осуществляют повторное дозирование, если требуемый ответ начинает слабеть.

[0208] Для идентификации пациентов, которым подходит лечение в соответствии со способами, предложенными в настоящем изобретении, могут применяться стандартные способы скрининга для определения факторов риска, связанных с конкретными расстройствами, либо для определения статуса текущего идентифицированного у субъекта расстройства. Такие способы могут включать, например, определения наличия у индивидуума родственников, у которых было диагностировано конкретное расстройство. Способы скрининга могут также включать, например, стандартные исследования для определения наследственного статуса конкретного расстройства, для которого было показано наличие наследуемого компонента. Например, известно, что различные раковые заболевания также имеют определенные наследуемые компоненты. Наследуемые компоненты раковых заболеваний включают, например, мутации трансформирующих полигенов (например, Ras, Raf, EGFR, cMet и др.), присутствие или отсутствие определенных HLA- и киллинг-ингибирующих рецепторных (KIR) молекул, или механизмов, за счет которых раковые клетки способны модулировать иммуносупрессию таких клеток, как NK-клетки и Т-клетки, прямо или опосредованно (см., например, Ljunggren and Malmberg, Nature Rev. Immunol. 7:329-339, 2007; Boyton and Altmann, Clin. Exp. Immunol. 149:1-8, 2007). С этой целью обычно используют нуклеотидные зонды для идентифицирования индивидуумов с генетическими маркерами, связанными с конкретным представляющим интерес расстройством. Кроме того, в данной области техники известны разнообразные иммунологические способы, подходящие для идентификации маркеров конкретного расстройства. Например, в данной области техники доступны и общеизвестны различные способы иммуноанализа типа ELISA, задействующие зонды с моноклональными антителами для обнаружения антигенов, связанных с конкретными опухолями. Скрининг может быть реализован с учетом известной симптоматики у пациента, возрастных факторов, сопутствующих факторов риска и т.д. Указанные способы позволяют клиницисту рутинным образом отбирать пациентов, нуждающихся в лечении способами согласно настоящему описанию. В соответствии с указанными способами таргетинг патологических ПСМА-экспрессирующих клеток может быть реализован в качестве независимого курса лечения или в виде последующего, вспомогательного или согласованного с другим лечением режима лечения.

[0209] ПСМА-связывающий белок для введения получают в виде фармацевтической композиции. Состав с фармацевтической композицией, содержащей ПСМА-связывающий белок, может быть получен в соответствии с известными способами для получения фармацевтически полезных композиций, с помощью которых терапевтическую молекулу комбинируют с фармацевтически приемлемым носителем в смеси с ним. Говорят, что композиция является «фармацевтически приемлемым носителем», если ее введение может переноситься пациентом-реципиентом. Стерильный фосфатно-солевой буфер представляет собой один из примеров фармацевтически приемлемого носителя. Другие подходящие носители общеизвестны специалистам в данной области техники, (см., например, Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, 19th ed. 1995).) Составы могут дополнительно содержать одно или более вспомогательное вещество, консервант, солюбилизатор, буферизующий агент, альбумин для предотвращения потерь белка на поверхности сосудов, и т.д.

[0210] Фармацевтическую композицию, содержащую ПСМА-связывающий белок, вводят субъекту в терапевтически эффективном количестве. В соответствии со способами, предложенными в настоящем изобретении, ПСМА-связывающий белок может вводиться субъектам различными путями, включая, например, внутримышечный, подкожный, внутривенный, внутрипредсердный, внутрисуставной, парентеральный, интраназальный, внутрилегочный, трансдермальный, внутриплевральный, интратекальный и пероральный маршруты введения. Для предотвращения и лечения антагонист может вводиться субъекту в виде однократной болюсной доставки с постоянной подачей (например, постоянной чрескожной доставки) на протяжении продленного периода времени, или согласно протоколу повторного введения (например, каждый час, ежедневно или еженедельно).

[0211] «Терапевтически эффективное количество» композиции представляет собой такое количество, которое дает статистически значимый эффект для облегчения одного или более симптомов расстройства, например, статистически значимое снижение прогрессирования заболевания или статистически значимое улучшение функции органа. Точную дозу определяет клиницист в соответствии с принятыми стандартами, принимая во внимание природу и тяжесть состояния, лечение которого проводится, индивидуальные особенности пациента и т.д. Определение дозы входит в обычную квалификацию специалиста в данной области техники.

[0212] Определение эффективной дозировки в указанном контексте, как правило, основано на исследованиях моделей на животных, за которыми следуют клинические испытания на людях, и опирается на определение эффективных дозировок и протоколы введения, которые значительно уменьшают частоту наступления или тяжесть расстройства у модельных субъектов. Эффективные дозы композиции согласно настоящему изобретению варьируют в зависимости от многих факторов, в том числе способа введения, участка-мишени, физиологического состояния пациента, того, является ли пациент человеком или животным, введения других лекарств, того, является ли лечение профилактическим или терапевтическим, а также специфической активности самой композиции и ее способности вызывать требуемый ответ у индивидуума. Как правило, пациент представляет собой человека, однако в случае некоторых заболеваний пациент может представлять собой млекопитающее, не являющееся человеком. Как правило, режимы дозирования корректируют так, чтобы обеспечить оптимальный терапевтический ответ, т.е. оптимизировать безопасность и эффективность. Соответственно, терапевтически эффективное количество также представляет собой такое количество, при введении которого благоприятные эффекты ПСМА-связывающего белка согласно описанию в настоящей заявке перевешивают нежелательные побочные явления. При введении ПСМА-связывающего белка дозировка, как правило, варьирует от приблизительно 0,1 мкг до 100 мг/кг или от 1 мкг/кг до приблизительно 50 мг/кг, а чаще от 10 мкг до 5 мг/кг от массы тела субъекта. Согласно более конкретными вариантам реализации эффективное количество агента находится в диапазоне от приблизительно 1 мкг/кг и приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 10 мкг/кг и приблизительно 10 мг/кг, или от приблизительно 0,1 мг/кг и приблизительно 5 мг/кг. Дозировки в указанном диапазоне могут обеспечиваться за счет однократного или многократного введения, включая, например, многократное ежедневное введение или введение один раз в день, еженедельно, раз в две недели, или ежемесячно. Например, согласно некоторым вариантам режим включает начальное введение с последующим многократным последовательным введением с еженедельными интервалами или раз в две недели. Другой режим включает начальное введение с последующим многократным последовательным введением с ежемесячными интервалами или раз в два месяца. Как вариант, введение может осуществляться нерегулярно на основе мониторинга клинических симптомов расстройства.

[0213] Дозировка указанной фармацевтической композиции может быть изменена лечащим клиницистом для поддержания требуемой концентрации в целевой области. Например, если выбран внутривенный способ введения, местная концентрация агента в кровотоке в целевой ткани может находиться в диапазоне от приблизительно 1-50 нМоль композиции на литр, иногда - приблизительно от 1,0 нМоль на литр и 10, 15 или 25 нМоль на литр в зависимости от состояния субъекта и прогнозируемого ответа. Более высокие или более низкие концентрации могут быть выбраны в зависимости от способа доставки, например, трансэпидермальной доставки/ доставки на поверхность слизистой оболочки. Дозировка должна также корректироваться в зависимости от скорости высвобождения вводимого состава, например, назального спрея/порошка, вводимые перорально или инъецируемые частицы для пролонгированного высвобождения, трансдермальные составы и т.д. Для достижения одинакового уровня концентрации в сыворотке, например, медленно высвобождающиеся частицы со скоростью высвобождения 5 нМ (в стандартных условиях) необходимо вводить в дозировке, приблизительно двукратно превышающей дозировку частиц со скоростью высвобождения 10 нМ.

[0214] Фармацевтические композиции описанные в настоящей заявке можно также применять в контексте комбинированной терапии. Термин «комбинированная терапия» в настоящей заявке означает, что субъекту вводят по меньшей мере одну терапевтически эффективную дозу ПСМА-связывающего белка и другого терапевтического агента.

[0215] Например, в контексте иммунотерапии раковых заболеваний ПСМА-связывающий белок согласно настоящему изобретению можно применять в комбинации с химиотерапией или радиационной терапией. ПСМА-связывающий белок согласно описанию в настоящей заявке может работать синергически при сочетании с общепринятыми методами химиотерапии или радиационной терапии. Указанный ПСМА-связывающий белок может также снижать опухолевую нагрузку и обеспечивать более эффективную цитотоксичность при применении хемотерапевтиков.

[0216] Композиции согласно настоящему изобретению можно также применять в комбинации с иммуномодулирующими соединениями, в том числе с различными цитокинами и костимулирующими / ингибирующими молекулами. Это может включать, не ограничиваясь указанным, применение цитокинов, стимулирующих противораковый иммунный ответ (например, IL-2, IL-12 или IL-21). Кроме того, ПСМА-связывающие белки могут быть скомбинированы с реагентами, костимулирующими различные молекулы клеточной поверхности, обнаруживаемые на связанных с иммунной системой эффекторных клетках, например, активация CD137 (см. Wilcox et al., J. Clin. Invest. 109:651-9, 2002) или подавление CTLA4 (см. Chambers et al., Ann. Rev. Immunol. 19:565-94, 2001). Как вариант, ПСМА-связывающие белки могут применяться с реагентами, индуцирующими апоптоз опухолевых клеток за счет взаимодействия с рецепторами суперсемейства TNF(ФНО) (например, TRAIL-связанные рецепторы, DR4, DR5, Fas или CD37) (см., например, Takeda et al., J. Exp. Med. 195:161-9, 2002; Srivastava, Neoplasia 3:535-46, 2001.) Такие реагенты включают лиганды рецепторов суперсемейства TNF (ФНО), включая гибриды лиганд-Ig, и антитела, специфичные в отношении рецепторов суперсемейства TNF (например, лиганд TRAIL, гибриды лиганд TRAIL - Ig, антитела против TRAIL и т.п.).

[0217] Что касается конкретно лечения солидных опухолей, в данной области техники общеизвестны протоколы для оценки результатов и противоопухолевой активности. Хотя оценка ответа опухоли может определяться различным образом в каждом протоколе, в настоящее время рекомендованным руководством для оценки ответа опухоли считаются критерии RECIST (Критерии оценки ответа солидных опухолей, «Response evaluation Criteria in solid tumors»,) Национального института раковых заболеваний (National Cancer Institute) (см. Therasse et al., J. Natl. Cancer Inst. 92:205-216, 2000). В соответствии с критериями RECIST ответ опухоли означает снижение или элиминацию всех поддающихся измерению очагов повреждения или метастазов. Заболевание обычно считают поддающимся измерению, если присутствуют очаги повреждения, которые возможно точно измерить по меньшей мере в одном измерении как имеющие размер ≥ 20 мм при обычных методах исследования или ≥ 10 мм при спиральном КТ-сканировании с четким определением границ с помощью медицинских фотографий или рентгена, компьютерной аксиальной томографии (КАТ), магнитно-резонансной визуализации (МРТ) или клинического осмотра (если очаги повреждения являются искусственными). Не поддающееся измерению заболевание означает заболевание с очагами повреждения < 20 мм при применении обычных методов или < 10 мм при применении спирального КТ-сканирования, и принципиально не поддающееся измерению очаги повреждения (слишком маленького для точного измерения размера). К не поддающимся измерению заболеваниям относится плевральный выпот, асцит и заболевание, установленное по косвенным признакам.

[0218] Для протоколов оценки ответа солидных опухолей требуются критерии объективного статуса. Типовые критерии включают следующие: (1) Полный ответ (CR), определенный как полное исчезновение поддающегося измерению заболевания; отсутствие, новых очагов повреждения; отсутствие связанных с заболеванием симптомов; отсутствие признаков не поддающегося измерению заболевания; (2) Частичный ответ (PR), определенный как 30% уменьшение суммы наибольших диаметров целевых очагов повреждения (3) Прогрессирующее заболевание (PD), определенное как 20% увеличение суммы наибольших диаметров целевых очагов повреждения или появление любого нового очага повреждения; (4) Стабильное состояние или отсутствие ответа, определенное как не соответствующее CR, PR или прогрессирующему заболеванию (см. Therasse et al., выше).

[0219] Дополнительные результаты, признаваемые в области техники онкологии, включают общую выживаемость (OS), выживаемость без признаков заболевания (DFS), частоту объективных ответов (ORR), время до прогрессирования (ТТР) и выживаемость без прогрессирования (PFS) (см. Guidance for Industry: Clinical Trial Endpoints for the Approval of Cancer Drugs and Biologies («Промышленное руководство. Критерии эффективности при клинических испытаниях для утверждения лекарственных средств для лечения рака и биопрепаратов»), April 2005, Center for Drug Evaluation and Research, FDA, Rockville, MD).

[0220] Фармацевтические композиции могут предоставляться в виде набора, включающего контейнер, содержащий фармацевтическую композицию согласно описанию в настоящей заявке. Фармацевтическая композиция может находиться, например, в форме раствора для инъекций для однократного или многократного дозирования, или в форме стерильного порошка, подлежащего восстановлению перед инъецированием. Как вариант, такой набор может включать диспенсер сухого порошка, генератор жидкого аэрозоля или небулайзер для введения фармацевтической композиции. Такой набор может дополнительно содержать письменную информацию о показаниях к применению и способе применения фармацевтической композиции.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1: Выделение вариабельных доменов мыши из 107-1А4 и получение гуманизированных вариантов

[0221] Вариабельные домены мыши клонировали из клеток гибридомы, экспрессирующих моноклональное антитело 107-1А4, специфичное в отношении ПСМА человека (см. Brown et al, 1998, Prostate Cancer and Prostatic Diseases. 1: 208-215). Тотальную РНК выделяли из гибридомы с применением набора RNeasy® Protect Mini Kit (QIAGEN Inc., 74124) в соответствии с инструкциями производителя. Набор для амплификации кДНК SMART™ RACE (Clontech Laboratories, Inc., 634914) применяли для синтеза 5'RACE-Ready кДНК с олиго(dT)-праймером в соответствии с инструкциями производителя. V_H и V_L области антитела амплифицировали с помощью ПЦР из кДНК, используя протокол SMART™ RACE с применением пулов собственных вырожденных генноспецифичных праймеров для разных семейств генов VK или VH мыши. Продукты ПЦР-амплификации проверяли с помощью гель-электрофореза, полосы соответствующего размера выделяли и клонировали в плазмидном векторе pCR^®2.1-ТОРО^® с применением набора для клонирования ТОРО^® ТА в соответствии с инструкциями производителя (Invitrogen Corporation). Полученный рекомбинантный вектор трансформировали в ТОР10 E. coli. Секвенирование ДНК из клонов дает многочисленные изоляты области тяжелой цепи с каркасной областью VH1 мыши с высокой степенью гомологии (92,7%) каркасной области зародышевой линии мыши L17134 (Genbank), и области каппа-цепи с каркасной областью Vk16 мыши с очень высокой степенью гомологии (98,6%) каркасной области зародышевой линии мыши AJ235936 (EMBL). Два сайта рестрикции - один сайт HindIII и один сайт EcoRI - удаляли нейтральными мутациями из ДНК, кодирующей родительский вариабельный каппа-домен мыши (легкая цепь) для упрощения клонирования в конечных экспрессионных векторах млекопитающих; от нативных секреторных/лидерных последовательностей мыши также отказались в пользу лидерной последовательности Vk3 человека. Полинуклеотидная последовательность ПСМА-специфичной области VH мыши (107-1А4) приведена в SEQ ID NO: 1, а последовательность аминокислот приведена в SEQ ID NO: 2. Полинуклеотидная последовательность ПСМА-специфической VL-области мыши (107-1А4) с сайтами рестрикции приведена в SEQ ID NO: 3. Полинуклеотидная последовательность ПСМА-специфической VL-области мыши (107-1А4), модифицированная удалением сайтов рестрикции, приведена в SEQ ID NO: 4, а последовательность аминокислот приведена в SEQ ID NO: 5.

[0222] Конструировали последовательности ДНК, кодирующие указанные последовательности scFv мыши и кассетированные для встраивания в подходящие скаффолды (например, SMIP, SCORPION, и моноспецифические или мультиспецифические гетеродимерные полипептиды). Указанные конструкции затем синтезировала компания Blue Heron (Ботуэлл, Вашингтон); для получения последовательностей генов, соответствующих TSC084 (SEQ ID NO: 44; последовательность аминокислот SEQ ID NO: 46), TSC085 (SEQ ID NO: 36; последовательность аминокислот SEQ ID NO: 38) и TSC092 (SEQ ID NO: 37; последовательность аминокислот SEQ ID NO: 39) применяли стандартные методики клонирования на основе рестрикционных фрагментов.

[0223] Гуманизированные последовательности, сконструированные посредством CDR-прививки в каркасные области человека, также были синтезированы компанией Blue Heron и клонированы в сходные векторы с помощью рестрикционных фрагментов для получения следующих генных последовательностей с применением двух подходов: (А) лигирования трех отрезков с применением фрагмента HindIII/BamHI, фрагмента BamHI/XhoI, и расщепления конечного вектора HindIII/XhoI для получения генных последовательностей, соответствующих TSC188 (SEQ ID NO: 40; последовательность аминокислот SEQ ID NO: 42) и TSC189 (SEQ ID NO: 41; последовательность аминокислот SEQ ID NO: 43); и (В) лигирования двух отрезков с применением фрагмента HindIII/XhoI и расщепления конечного вектора HindIII/XhoI для получения генных последовательностей, соответствующих TSC192 (SEQ ID NO: 53; последовательность аминокислот SEQ ID NO: 58), TSC193 (SEQ ID NO: 54; последовательность аминокислот SEQ ID NO: 59), TSC194 (SEQ ID NO: 48; последовательность аминокислот SEQ ID NO: 49), TSC195 (SEQ ID NO: 55; последовательность аминокислот SEQ ID NO: 60), TSC196 (SEQ ID NO: 56; последовательность аминокислот SEQ ID NO: 61), TSC199 (SEQ ID NO: 50; последовательность аминокислот SEQ ID NO: 51), TSC210 (SEQ ID NO: 69; последовательность аминокислот SEQ ID NO: 70), TSC211 (SEQ ID NO: 71; последовательность аминокислот SEQ ID NO: 72), TSC212 (SEQ ID NO: 73; последовательность аминокислот SEQ ID NO: 74), TSC213 (SEQ ID NO: 75; последовательность аминокислот SEQ ID NO: 76); TSC249 (SEQ ID NO: 77; последовательность аминокислот SEQ ID NO: 78), TSC250 (SEQ ID NO: 79; последовательность аминокислот SEQ ID NO: 80), TSC251 (SEQ ID NO: 81; последовательность аминокислот SEQ ID NO: 82), и TSC252 (SEQ ID NO: 83; последовательность аминокислот SEQ ID NO: 84); и (С) лигирования двух отрезков с применением фрагмента BsrGI/EcoRI и расщепления одного из двух конечных векторов BsrGI/EcoRI для получения генных последовательностей, соответствующих TSC295 (SEQ ID NO: 157; последовательность аминокислот SEQ ID NO: 158), TSC296 (SEQ ID NO: 159; последовательность аминокислот SEQ ID NO: 160), TSC301 (SEQ ID NO: 161; последовательность аминокислот SEQ ID NO: 162) и TSC302 (SEQ ID NO: 163; последовательность аминокислот SEQ ID NO: 164). Полинуклеотидная последовательность гуманизированной ПСМА-специфической (107-1А4) VL-области приведена в SEQ ID NO: 22, а последовательность аминокислот приведена в SEQ ID NO: 23. Полинуклеотидная последовательность гуманизированной ПСМА-специфической (107-1А4) VH области #1 приведена в SEQ ID NO: 24, а последовательность аминокислот приведена в SEQ ID NO: 25. Полинуклеотидная последовательность гуманизированной ПСМА-специфической (107-1А4) VH-области #2 приведена в SEQ ID NO: 26, а последовательность аминокислот приведена в SEQ ID NO: 27.

[0224] Последовательности различных клонированных последовательностей и компонентов также представлены в Таблице 3. Приведенные последовательности аминокислот полипептидных конструкций (например, SMIP, SCORPION, моно- или мультиспецифических гетеродимерных белков) не включают лидерную последовательность Vk3 человека.

ПРИМЕР 2: Гетеродимерные молекулы

[0225] ПСМА-специфические интерцепторные молекулы получали с применением каркасной структуры интерцептора в соответствии с общим описанием в международных патентных заявках №№ РСТ/US 2010/62436 и PCT/US 2010/62404. Вкратце, ПСМА-специфические полипептидные гетеродимеры получали посредством совместной экспрессии двух разных полипептидных цепей, одна полипептидная цепь содержала домен СH1гетеродимеризации иммуноглобулина и другая полипептидная цепь содержала домен CL гетеродимеризации иммуноглобулина. За день до трансфекции клетки HEK293 суспендировали в концентрации 0,5×10⁶ клеток/мл в среде для экспрессии GIBCO® FreeStyle™ 293 (Invitrogen). Использовали 250 мл клеток для масштабной трансфекции, и 60 мл клеток применяли для трансфекции небольшого объема. В день трансфекции 320 мкл реагента для трансфекции 293fectin™ (Invitrogen) смешивали с 8 мл среды. Одновременно 250 мкг ДНК каждого из одноцепочечных полипептидов смешивали с 8 мл среды и инкубировали на протяжении 5 минут. После 15 минут инкубирования смесь ДНК-293fectin добавляли в 250 мл клеток 293 и возвращали в шейкер при 37°С и перемешивали на скорости 120 об/мин. Для менее масштабной трансфекции с применением 60 мл клеток использовали одну четвертую часть ДНК, реагента 293fectin и среды.

[0226] Для очищения белков применяли аффинную хроматографию с белком А. 2 мл агарозы с иммобилизованным белком A (Repligen) добавляли в хроматографическую колонку Econo-Column® размером 2,5×10 см (Bio-Rad Laboratories), интенсивно промывали ФСБ (10× объем колонки), загружали супернатанты, повторно промывали ФСБ и элюировали 3-мя объемами колонки элюирующего IgG буфера Pierce. Затем белки интенсивно диализировали против ФСБ. Затем белки концентрировали с применением центрифужных фильтров Amicon® Centricon® (Millipore Corp.) до конечного объема примерно 0,5 мл.

[0227] Очищенные белки анализировали на 10% геле для ДСН-ПААГ с применением системы для электрофореза XCell SureLock™ Mini-Cell (Invitrogen).

[0228] Бивалентный полипептидный гетеродимер TSC122 получали посредством совместной экспрессии одноцепочечных полипептидов TSC084 и TSC093. Одноцепочечный полипептид TSC084 содержит от амино-конца к карбоксильному концу: scFv VL-VH 107-1A4 мыши (анти-ПСМА), шарнирная область SCC-P IgG1 человека, CH2IgG1 человека, СН3 IgG1 человека и СН1 человека. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности TSC084 приведены в последовательностях SEQ ID NO: 44 и 46, соответственно. Одноцепочечный полипептид TSC093 содержит от амино-конца к карбоксильному концу: scFv Cris7 (анти-CD3), шарнирная область SCC-P IgG1 человека, CH2IgG1 человека, CH3IgG1 человека, и Сκ человека (YAE) (т.е. Сκ человека без первого Arg или последнего Cys, но с заменами N30Y, V55A и Т70Е). Нуклеотидные и аминокислотные последовательности TSC093 приведены в последовательностях SEQ ID NO: 45 и 47, соответственно.

[0229] Бивалентный полипептидный гетеродимер TSC200 получали посредством совместной экспрессии полипептидных цепей TSC192 и TSC125. TSC192 содержит от амино-конца к карбоксильному концу: scFv VL-VH#2 гуманизированного 107-1А4 (анти-ПСМА), шарнирная область SCC-P IgG1 человека, CH2IgG1 человека, СН3 IgG1 человека и Сκ человека (YAE). Нуклеотидные и аминокислотные последовательности TSC192 приведены в последовательностях SEQ ID NO: 53 и 58, соответственно. TSC125 содержит от амино-конца к карбоксильному концу: scFv Cris7 (анти-CD3), шарнирная область SCC-Р IgG1 человека, СН2 IgG1 человека, СН3 IgG1 человека и СН1 человека. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности TSC125 приведены в последовательностях SEQ ID NO: 52 и 57, соответственно.

[0230] Бивалентный полипептидный гетеродимер TSC202 получали посредством совместной экспрессии полипептидных цепей TSC193 и TSC125. TSC193 содержит от амино-конца к карбоксильному концу: scFv VL-VH#1 гуманизированного 107-1А4 (анти-ПСМА), шарнирная область SCC-P IgG1 человека, СН2 IgG1 человека, СН3 IgG1 человека и Сκ человека (YAE). Нуклеотидные и аминокислотные последовательности TSC193 приведены в последовательностях SEQ ID NO: 54 и 59, соответственно. TSC125 содержит от амино-конца к карбоксильному концу: scFv Cris7 (анти-CD3), шарнирная область SCC-P IgG1 человека, СН2 IgG1 человека, СН3 IgG1 человека и СН1 человека. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности TSC125 приведены в последовательностях SEQ ID NO: 52 и 57, соответственно.

[0231] Бивалентный полипептидный гетеродимер TSC204 получали посредством совместной экспрессии полипептидных цепей TSC195 и TSC093. TSC195 содержит от амино-конца к карбоксильному концу: scFv VL-VH#2 гуманизированного 107-1А4 (анти-ПСМА), шарнирная область SCC-P IgG1 человека, СН2 IgG1 человека, СН3 IgG1 человека и СН1 человека. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности TSC195 приведены в последовательностях SEQ ID NO: 55 и 60, соответственно. TSC093 содержит от амино-конца к карбоксильному концу: Cris7 (анти-CD3) scFv, шарнирная область SCC-Р IgG1 человека, СН2 IgG1 человека, СН3 IgG1 человека и человека Сκ (YAE). Нуклеотидные и аминокислотные последовательности TSC093 приведены в последовательностях SEQ ID NO: 45 и 47, соответственно.

[0232] Бивалентный полипептидный гетеродимер TSC205 получали посредством совместной экспрессии полипептидных цепей TSC196 и TSC093. TSC196 содержит от амино-конца к карбоксильному концу: scFv VL-VH#1 гуманизированного 107-1А4 (анти-ПСМА), шарнирная область SCC-P IgG1 человека, СН2 IgG1 человека, СН3 IgG1 человека и СН1 человека. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности TSC196 приведены в последовательностях SEQ ID NO: 56 и 61, соответственно. TSC093 содержит от амино-конца к карбоксильному концу: scFv Cris7 (анти-CD3), шарнирная область SCC-Р IgG1 человека, СН2 IgG1 человека, СН3 IgG1 человека, и Сκ человека (YAE). Нуклеотидные и аминокислотные последовательности TSC093 приведены в последовательностях SEQ ID NO: 45 и 47, соответственно.

ПРИМЕР 3: Конструирование молекулы SCORPION

[0233] ПСМА-специфические молекулы SCORPION (TSC194 (SEQ ID NO: 48 (нуклеиновая кислота), SEQ ID NO: 49 (аминокислота); TSC199 (SEQ ID NO: 50 (нуклеиновая кислота), SEQ ID NO: 51 (аминокислота)); TSC 212 (SEQ ID NO: 73 (нуклеиновая кислота), SEQ ID NO: 74 (аминокислота)); TSC213 (SEQ ID NO: 75 (нуклеиновая кислота), SEQ ID NO: 76 (аминокислота)); TSC249 (SEQ ID NO: 77 (нуклеиновая кислота), SEQ ID NO: 78 (аминокислота)); TSC250 (SEQ ID NO: 79 (нуклеиновая кислота), SEQ ID NO: 80 (аминокислота)); TSC251 (SEQ ID NO: 81 (нуклеиновая кислота), SEQ ID NO: 82 (аминокислота)); и TSC252 (SEQ ID NO: 83 (нуклеиновая кислота), SEQ ID NO: 84 (аминокислота))) получали с применением стандартных методов молекулярной биологии на основе существующих каркасных структур SCORPION в качестве шаблонов и с применением способов, в целом описанных, например, в опубликованной заявке PST № WO 2007/146968, опубликованной заявке на патент США №2006/0051844, опубликованной заявке PST № WO 2010/040105, опубликованной заявке PST № WO 2010/003108 и в патенте США №7166707 (см. также Таблицу 3). Встраивание N-концевого связывающего домена scFv осуществляли путем расщепления родительского шаблона и встраивания scFv с помощью рестрикционных ферментов, либо HindIII и XhoI, либо AgeI и XhoI, требуемые фрагменты идентифицировали, выделяли очисткой из агарозного геля и лигировали. Встраивание С-концевого scFv связывающего домена осуществляли путем расщепления родительского шаблона и встраивания scFv с помощью рестрикционных ферментов EcoRI и NotI, требуемые фрагменты идентифицировали, выделяли очисткой из агарозного геля и лигировали.

ПРИМЕР 4: Связывание гибридных и гуманизированных молекул с клетками ПСМА(+) и ПСМА(-) линий

[0234] Моноклональные антитела очищали из гибридомной культуральной среды с помощью стандартных процедур. Описанные в настоящей заявке молекулы SMIP, интерцепторные и SCORPION получали транзиторной трансфекцией клеток человека HEK293, и очищали из культуральных супернатантов аффинной хроматографией с белком А. Если после аффинной хроматографии обнаруживались аггрегаты, проводили также дополнительную эксклюзионную хроматографию для проверки гомогенности белка.

[0235] Анализ связывания на клеточных линиях рака предстательной железы ПСМА+ (С4-2, Wu et al., 1994 Int. J. Cancer 57:406-12) и ПСМА- (DU-145, Stone et al., 1978, Intl. J. Cancer 21:274-81) выполняли с помощью стандартных процедур окрашивания на основе FACS. В типовом эксперименте метят 300000 клеток на лунку в диапазоне от 200 нМ до 0,1 нМ связывающей молекулы в 100 мкл FACS-буфера (ФСБ + 2% нормальной козьей сыворотки + 2% эмбриональной бычьей сыворотки + 0,1% азида натрия) на льду, с последующим отмыванием и инкубированием с флуоресцентно-меченым вторичным антителом, козьим против IgG человека (разведение 1:400 Invitrogen #11013 = 5 мкг/мл). После отмывания клеток от вторичного антитела клетки инкубировали с 7-амино-актиномицином D (7-AAD) окрашивающий раствор (BD Pharmingen™ кат. номер 559925)(6 мкл 7AAD на 100 мкл FACS-буфера) на протяжении 20 минут. Сигнал от связанных молекул регистрировали с применением проточного цитометра FACSCalibur™ (BD Biosciences) и анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo для анализа данных проточной цитометрии. Клетки 7-AAD+ исключали из анализа. Нелинейный регрессионный анализ для определения значений ЕС50 выполняли в программах GraphPad Prism® для визуализации и статистической обработки.

[0236] Анализы связывания (Фиг. 1) применяли для сравнения родительского антитела мыши 107-1А4 (т.е. TSC045) с гибридными SMIP-молекулами (TSC085, TSC092) и биспецифической гибридной интерцепторной молекулой TSC122. Обе гибридные SMIP-молекулы демонстрировали в отношении ПСМА+ клеток аффинность, сопоставимую с родительским антителом мыши, хотя одна из них (TSC085, с VL-VH-ориентацией scFv) демонстрировала более низкий уровень насыщения на поверхности указанной клетки. Биспецифическая гибридная молекула- интерцептор (TSC122), содержащая только один связывающий домен 107-1А4, демонстрировала более низкую связывающую способность в отношении клеток ПСМА+. Все молекулы демонстрировали уровень связывания от незначительного до отсутствующего с клетками (ПСМА-)-линии DU-145. Анализ связывания гуманизированных SMIP-молекул TSC188 и TSC189 (Фиг. 2А) показал сопоставимые уровни аффинности с ранее определенными (данные не показаны) для родительского моноклонального антитела, со сходными высокими уровнями насыщения и селективности в отношении ПСМА+ С4-2 клеток по сравнению с ПСМА- клетками DU-145. Анализ связывания гуманизированных молекул SCORPION TSC194 и TSC199 показал сопоставимые уровни аффинности с родительскими гуманизированными SMIP-молекулами TSC188 и TSC189 (Фиг. 2В), при отсутствии связывания с линией клеток ПСМА- DU-145.

ПРИМЕР 5: Дифференциальная интернализация клетками антитела 107-1А4, SMIP-скаффолдов и интерцепторных скаффолдов

[0237] Связывающие белки для исследования интернализации прямо метили CypHer™5E Mono NHS Ester (GE Healthcare, #PA15401) в соответствии с инструкциями производителя. CypHer5E представляет собой рН-чувствительный возбуждаемый красным спектром краситель который флуоресцирует при низких рН, которые, как правило, характерны для внутреннего пространства эндосом и лизосом; в результате флуоренценция CypHer5E может применяться в качестве косвенного показателя клеточной интернализации. Краситель, растворенный в свежем ДМСО, добавляли в очищенный белок в ФСБ/карбонатно-натриевом буфере с рН 8,3 (9:1), до молярного соотношения краситель : белок, составляющего 20:1. После инкубирования в темноте на протяжении по меньшей мере 1 часа при комнатной температуре меченый белок отделяли от непрореагировавшего красителя диализом при 4°С. Поглощение на 280 нм и 500 нм применяли для подсчета концентрации белка и красителя для меченого материала. Итоговое отношение краситель : белок варьирует от 6 до 14, и это значение использовали для нормализации данных визуализации. Чтобы гарантировать, что присутствие белковых аггрегатов не будет искажать данные интернализации, в тех случаях, когда индивидуальные молекулы давали детектируемые уровни аггрегатов (>5%), проводили дополнительную эксклюзионную хроматографию для очищения молекулы до очень высоких степеней гомогенности (>95%).

[0238] Клетки высевали за 2 дня до эксперимента по 4000 клеток на лунку в покрытые поли-D-лизином 96-луночные планшеты, черные с прозрачным дном (BD Biocoat, 356640) в обычную культуральную среду. В течение эксперимента проводили аккуратную замену среды, чтобы сохранить адгезию клеток к поверхности. Ядра окрашивали Hoechst 33342 (Invitrogen, H3570) в бессывороточной без фенолового красного среде RPMI (Invitrogen, 11835) плюс 20 мМ HEPES (Invitrogen, 15630) (называемой PRF-RPMI) в течение часа. Лунки промывали PRF-RPMI плюс 10% ФСБ и добавляли 100 мкл теплой PRF-RPMI + 10% ФСБ. Планшеты помещали на лед на 5 минут, затем добавляли меченые связывающие белки в различных разведениях из 5× исходных растворов для связывания на протяжении 1 ч на льду. Планшеты перемещали в CO₂-инкубатор с температурой 37°С на 60 минут для обеспечения интернализации. Перед визуализацией среду замещали на PRF-RPMI + 1% ФСБ.

[0239] Лунки сканировали в автоматизированной клеточной и субклеточной системе визуализации IN Cell Analyzer 1000 (GE Heatthcare) для подсчета количества интернализированного белка; данные собирали с 8 площадок для каждой лунки. Протокол регистрации настраивали для сбора данных с использованием наборов фильтров, подходящих для Hoechst и CypHer5E, и получения светлопольных изображений. Данные анализировали с применением программного обеспечения IN Cell Investigator, используя протокол, разработанный для обнаружения флуоресцентных гранул в зоне цитоплазмы, окружающей каждое ядро, и измерения их площади. Зарегистрированную общую площадь гранул нормализовали с поправкой на относительный уровень замещения красителем на единицу меченого белка.

[0240] Эксперименты для изучения интернализации с применением родительского антитела мыши 107-1А4 или гибридных молекул SMIP и интерцепторов, показали отсутствие интернализации в линии клеток ПСМА- DU-145 (данные не показаны), но определенная интернализация обнаруживается на клетках линий ПСМА+ LNCaP (CRL-1740™, American Type Culture Collection) или С4-2 (Фиг. 3). Интернализация родительского антитела была выше, чем интернализация молекул SMIP или интерцепторных при всех протестированных концентраций. Выявляемая интернализация для (моновалентной) интерцепторной молекулы была выше, чем для (бивалентной) SMIP-молекулы, что может быть обусловлено более высокой потенциальной стехиометрией связывания - каждая молекула-интерцептор может вступать в контакт только с одной молекулой ПСМА, в то время как каждая SMIP-молекула может вступать в контакт с двумя молекулами ПСМА, потенциально приводя к аккумуляции в два раза большего количества молекул-интерцепторов на поверхности клеток. В тех случаях, когда уровни интернализации и интерцепторных молекул, и SMIP-молекул сходны, более заметный сигнал дает всегда молекула-интерцептор.

ПРИМЕР 6: Перенаправленная Т-клеточная цитотоксичность против ПСМА(+) клеточных линий

[0241] Периферические мононуклеарные клетки крови (ПМКК) выделяли из крови человека от двух разных доноров (помечены как AG или VV) на стандартных градиентах фиколла. Выделенные клетки промывали в солевом буфере. Т-клетки дополнительно выделяли с применением набора Pan T-cell Isolation Kit II от Miltenyi Biotec (Бергиш-Гладбах, Германия) с применением протокола производителя. Использовали Т-клетки со стимуляцией или без стимуляции, как отмечено на фигурах (см. Фиг. 4-6), и добавляли в соотношении 10:1 (Т-клеткищелевые клетки) если не указано иное.

[0242] Клетки С4-2 кастрационно-резистентного рака предстательной железы (CRPC) метили цитоплазматическим красителем CellTracker™ Green (Invitrogen, C7025), следуя протоколу производителя, для отличения от Т-клеток. Меченые С4-2 клетки высевали в покрытые поли-D-лизином 96-луночные планшеты, согласно Примеру 3, по 8000 клеток на лунку в стандартные ростовые среды, за день до добавления Т-клеток и молекулы-интерцептора. 10 мкл концентрированной биспецифической интерцепторной молекулы (TSC122, TSC200, TSC202 или TSC204) добавляли в 100 мкл среды на лунку, плюс 50 мкл Т-клеток (80000 клеток), в стандартных ростовых средах. Культуры клеток помещали в CO₂ инкубатор при 37°С на ночь. Через 24 ч контактирования с интерцепторной молекулой клетки окрашивали красителями 7-AAD и Hoechst, чтобы обеспечить возможность подсчета погибших клеток. Среду меняли на 100 мкл RPMI + 1% ФСБ + 10 мкг/мл 7-AAD + Hoechst при 1:1000 разведении исходного раствора, и инкубировали на протяжении дополнительных 30 минут.

[0243] Визуализацию и количественное определение выполняли с помощью микроскопа InCell Analyzer (GE), собирая данные 10 площадок на лунку. Протокол регистрации настраивали для сбора данных с использованием наборов фильтров, подходящих для: а) обнаружения ядер за счет окрашивания Hoechst, b) разделение клеток по типам за счет детекции CellTracker™ Green, с) определение живых/погибших клеток за счет окрашивания 7-AAD, и получения светлопольных изображений. Количественное определение выполняли с применением программного обеспечения InCell Workstation, используя приложение с деревом решений. Индивидуальные клетки обнаруживали по окрашиванию ядер красителем Hoechst. Пороговые величины сигнала в зеленом канале (CellTracker™ Green) применяли для разделения клеток на популяции С4-2 (позитивные значения) и Т-клеток (негативные значения). Пороговые величины сигнала в красном канале (7-AAD) применяли для разделения клеток на популяции мертвых (позитивные значения) и живых (негативные значения) клеток.

[0244] Биспецифические интерцепторные молекулы, характеризующиеся наличием либо scFv 107-1A4 мыши, либо scFv гуманизированного 107-1А4, а также scFv антитела против CD3 (Cris7) тестировали на способность связывания с Т-клетками для таргетинга ПСМА+ опухолевых клеток и обеспечения мишенезависимого цитотоксического Т-клеточного ответа (так называемой «перенаправленной Т-клеточной цитотоксичности», или RTCC). Мощная мишенезависимая цитотоксическая активность на протяжении 24 часов наблюдалась при применении гибридной интерцепторной молекулы TSC122 (Фиг. 4) с Т-клетками от двух разных доноров; происходил лизис примерно 60% клеток-мишеней при обработке всего лишь 100 пМ интерцепторной молекулы TSC122. Непосредственной цитотоксичности в отношении ПСМА+ клеток в отсутствие эффекторных Т-клеток не наблюдалось (Фиг. 4); также не наблюдалось цитотоксичности в отношении ПСМА- клеток в присутствии эффекторных Т-клеток (данные не показаны). Наряду с родительской гибридной интерцепторной молекулой (TSC122) проверяли также цитотоксическую активность гуманизированных интерцепторных молекул (TSC200, TSC202 и TSC204) (Фиг. 5). Две гуманизированные интерцепторные молекулы (TSC200, TSC204) демонстрировали более низкую RTCC-активность по сравнению с родительскими; одна гуманизированная молекула-интерцептор (TSC202) демонстрировала RTCC-активность, равную активности родительской гибридной интерцепторной молекулы (TSC122) со сходной эффективностью при малых пМ-концентрациях. Эти результаты показали, что определенные гуманизированные интерцепторные молекулы обладают сходной с родительской гибридной интерцепторной молекулой Т-клеточной цитотоксичностью.

[0245] Также исследовали цитотоксическую активность гуманизированных молекул SCORPION (TSC194, TSC199, TSC212, TSC213) в сравнении с цитотоксической активностью гибридной интерцепторной молекулы TSC122 (Фиг. 6). Указанные гуманизированные молекулы SCORPION с анти-ПСМА scFv в VL-VH ориентации (TSC194, TSC199) обладают цитотоксической активностью, сопоставимой со свойственной биспецифической гибридной интерцепторной молекуле (также содержащей scFv в VL-VH ориентации, и также включающей анти-CD3 scFv (Cris7)). С другой стороны, гуманизированные молекулы SCORPION с анти-ПСМА scFv в VH-VL-ориентации обладали менее выраженной общей цитотоксичностью.

ПРИМЕР 7: Индуцированная мишенезависимая Т-клеточная активация и пролиферация против ПСМА+ клеточных линий, направляемые биспецифическими молекулами, полученными из 107-1А4

[0246] Для сравнения эффективности разных биспецифических полипептидных молекул для индуцирования мишенезависимой Т-клеточной активации и пролиферации сравнивали четыре разных анти-ПСМА и анти-CD3 биспецифических молекулы, включая TSC122 (гибридная молекула-интерцептор), TSC202 (гуманизированная молекула-интерцептор), TSC194 (гуманизированная молекула SCORPION) и TSC199 (гуманизированная молекула SCORPION).

[0247] Клетки С4-2 рака предстательной железы (ПСМА+) получали из Онкологического центра Андерсона (MD Anderson Cancer Center) (Хьюстон, Техас) и культивировали в соответствии с предоставленным протоколом. Периферические мононуклеарные клетки крови (ПМКК) выделяли из крови человека на стандартных градиентах фиколла. Выделенные клетки промывали солевым буфером. Затем выделяли Т-клетки с применением набора Pan T-cell Isolation Kit II от Miltenyi Biotec (Бергиш-Гладбах, Германия) с применением протокола производителя.

[0248] Пролиферацию оценивали с использованием мечения выделенных популяций Т-клеток сукцинимидиловым эфиром диацетата карбоксифлуоресцеина (CFSE). CFSE-меченые Т-клетки высевали в 96-луночные планшеты с U-образным дном в количестве 100000 клеток/лунка, с 30000 С4-2 опухолевых клеток/лунка, соответственно, чтобы получить отношение Т-клеток к опухолевым, составляющее примерно 3:1. Тестируемые молекулы в диапазоне концентраций от 10 нМ до 0,1 пМ добавляли к смесям клеток, всего по 200 мкл/лунка, в среду RPMI 1640 с добавлением 10% сыворотки человека или бычьей, пирувата натрия и заменимых аминокислот. Планшеты инкубировали при 37°С, 5% CO₂ в увлажненных инкубаторах. Через 3 дня клетки метили антителами для анализа с применением проточной цитометрии. Клетки метили и промывали в их исходных планшетах для минимизации потери клеток при переносах, и все метки вносили в солевом буфере с 0,2% бычьего сывороточного альбумина. Сначала клетки пре-инкубировали со 100 мкг/мл IgG человека при комнатной температуре в течение 15 минут. Затем клетки инкубировали со смесью (общий объем 50 мкл) следующих меченых красителем антител: CD5-PE, CD4-APC, CD8-Pacific Blue, CD25-PE-Cy7, а также 7-амино-актиномицина D (далее - 7AAD) в течение 40 мин. Клетки дважды промывали, ресуспендировали в объемах 80-120 мкл, и немедленно проводили измерения в проточном цитометре BD LSRII для регистрации 80% содержимого каждой лунки. Файлы с образцами анализировали с применением программного обеспечения FlowJo для подсчета процента и количества клеток, прошедших по меньшей мере одно клеточное деление, в соответствии с их CFSE-профилем, последовательным гейтированием активированных, живых CD4+ или CD8+ Т-клеток (7AAD-, CD5+ CD25+ CD4+ или 7AAD- CD5+ CD25+ CD8+, соответственно). Средние значения и стандартные отклонения рассчитывали с применением программного обеспечения Microsoft Excel. Графики строили с применением Microsoft Excel или GraphPad Prism.

[0249] Анализ популяций живых CD4+ и CD8+ клеток из лунок с С4-2 клетками, обработанными Т-клетками (Фиг. 7А и Фиг. 7В), показал значительное увеличение как общего числа клеток, так и процента пролиферирующих клеток в присутствии клеток С4-2, несущих целевой ПСМА-антиген. Пролиферация CD4+ Т-клеток была немного выше, чем CD8+ Т-клеток, а при пролиферации, индуцированной интерцепторными молекулами TSC122 и TSC202, насыщение наступало на более высоком уровне, чем при ответе, индуцированном молекулами SCORPION TSC194 и TSC199. Все молекулы продемонстрировали индуцирование Т-клеточной пролиферации при низких концентрациях (100 пМ). Значимых различий относительного индуцирования молекулами пролиферации CD4+ клеток в сравнении с CD8+ клетками не обнаружено.

ПРИМЕР 8: Исследование конкурентного связывания анти-ПСМА-молекул подтверждает связывание 107-1А4 уникального эпитопа ПСМА

[0250] Чтобы показать, что моноклональное анти-ПСМА антитело мыши 107-1А4, гибридная молекула SMIP-107-1A4 (TSC085) и гуманизированная молекула SMIP-107-1A4 (TSC189) связывают уникальный эпитоп ПСМА, не распознаваемый обычными описанными в литературе антителами (J415, J591), и что преобразование моноклонального антитела мыши 107-1А4 в форму SMIP не приводит к изменению указанного связывающего эпитопа, проводили эксперименты для исследования конкурентного связывания. Гибридомы, продуцирующие антитела J591, Hu591 (гуманизированная версия J591) и J415, получали от АТСС. Моноклональные антитела очищали из гибридомной культуральной среды с помощью стандартных процедур. SMIP-молекулы получали транзиторной трансфекцией клеток 293 человека, а очищенные из культуры клеток супернатанты - аффинной хроматографией с белком А. Если после аффинной хроматографии обнаруживались аггрегаты, проводили также дополнительную эксклюзионную хроматографию для обеспечения гомогенности белка.

[0251] Исследование конкурентного связывания на линии ПСМА(+) клеток С4-2 рака предстательной железы выполняли с помощью стандартных процедур окрашивания на основе FACS. Для упрощения измерения связывания применяли молекулы с Fc-доменами человека для конкуренции с молекулами, содержащими Fc-домены мыши; для обнаружения связывания с целевой линией клеток применяли либо антитело против человека, либо против мыши.

[0252] В типовом эксперименте молекулу Х (связывающую) смешивают с молекулой Y (конкурирующей), помещают на лед; затем для мечения 300000 клеток на лунку используют 4 нМ молекулы Х и от 250 нМ до 0,4 нМ молекулы Y в 100 мкл FACS-буфера (ФСБ + 2% нормальной козьей сыворотки + 2% эмбриональной бычьей сыворотки + 0,1% азида натрия) на льду, с последующими отмывками и инкубированием с флуоресцентно меченым вторичным антителом, специфичным в отношении молекулы X, либо козьим против IgG человека (Invitrogen 11013 в разведении 1:400 = 5 мкг/мл), либо козьим против IgG мыши (Invitrogen 11017 в разведении 1:400). После отмывания клеток от вторичного антитела клетки инкубировали с 7AAD (6 мкл BD Pharmingen 7AAD, кат. №559925) на 100 мкл FACS-буфера) на протяжении 20 минут. Сигнал от связанных молекул регистрировали с применением проточного цитометра FACSCalibur и анализировали с помощью FlowJo. 7AAD+ клетки исключали из анализа. Нелинейный регрессионный анализ для определения ЕС50 выполняли в GraphPad Prism.

[0253] Исследование конкурентного связывания (Фиг. 8А) применяли, чтобы проверить, способно ли гуманизированное антитело J591, Hu591, конкурировать за связывание с клетками с антителами мыши 107-1А4, J591 или J415. Для связывания 107-1А4 конкуренции не наблюдалось, что предположительно указывает на связывание им неконкурентного эпитопа; в то же время конкуренция наблюдалась для связывания и J591, и J415 антителами. Далее, проводили дополнительные анализы связывания для проверки способности указанных трех антител мыши конкурировать за связывание с клетками с гибридной 107-1А4 SMIP-молекулой TSC085 (Фиг. 8В). Сильная конкуренция за связывание наблюдалась со стороны родительского антитела 107-1А4, что подтверждает, что указанная SMIP-молекула связывается с тем же эпитопом. Не наблюдалось эффективной конкуренции со стороны антител мыши J591 или J415. Наконец, проводили анализ связывания, чтобы проверить, способны ли указанные три антитела мыши конкурировать за связывание с клетками с гуманизированной 107-1А4 SMIP-молекулой TSC189 (Фиг. 8С). И в этом случае также наблюдали сходную сильную конкуренция за связывание со стороны родительского антитела 107-1А4, но не наблюдали эффективной конкуренции со стороны антител J591 или J415 мыши. Это подтверждает, что 107-1А4 связывает уникальный эпитоп ПСМА. Это также показывает, что какое-либо изменение в поведении молекул SMIP и интерцепторных молекул на основе 107-1А4, отличающее их поведение от поведения родительского антитела 107-1А4, обусловлено не изменением связывающих эпитопов.

ПРИМЕР 9: Подавление роста опухоли in vivo с применением биспецифической анти-ПСМА молекулы

[0254] Для подтверждения эффективности биспецифической анти-ПСМА молекулы согласно настоящему описанию (например, анти-ПСМА и анти-CD3 биспецифических молекул) для подавления роста опухолей in vivo проводят оценку биспецифической анти-ПСМА молекулы следующим образом.

[0255] Профилактическое лечение, или предотвращение приживления подкожных опухолей: Культивируемые ПСМА-экспрессирующие опухолевые клеточные линии (такие как LNCaP, LNCaP C4-2, LNCaP C4-2B, VCaP, CWR22Rv1, LAPC4, MDA-PCa-2b, LuCaP 23.1, LuCaP 58, LuCaP 70, LuCaP 77) смешивают с лимфоцитами человека (либо периферическими мононуклеарными клетками крови человека, либо очищенными Т-клетками) и инъецируют подкожно мышам с иммунодефицитом (таким как SCID, NOD/SCID и т.д.). Биспецифическую анти-ПСМА молекулу инъецируют внутривенно в день инъекции и несколько последующих дней. Дозозависимое подавление роста опухоли, согласно оценке на основании объема опухоли, указывает на то, что соответствующая молекула эффективна против ПСМА-экспрессирующих опухолей in vivo.

[0256] Терапевтическое лечение, или регрессия ранее верифицированных подкожных опухолей: Культивируемые ПСМА-экспрессирующие опухолевые клеточные линии (такие как LNCaP, LNCaP C4-2, LNCaP C4-2B, VCaP, CWR22Rv1, LAPC4, MDA-PCa-2b, LuCaP 23.1AI, LuCaP 58, LuCaP 70, LuCaP 77) инъецируют подкожно мышам с иммунодефицитом (таких как SCID, NOD/SCID и т.д.). Рост опухолей отслеживают, и начинают исследование, когда опухоли демонстрируют признаки установившегося роста (как правило, при объеме ~200 мм³). Лимфоциты человека (либо периферические мононуклеарные клетки крови человека, либо очищенные Т-клетки) инъецируют внутривенно вместе с биспецифической анти-ПСМА молекулой в день инъекции. Указанную биспецифическую анти-ПСМА молекулу инъецируют несколько последующих дней. Дозозависимое подавление роста опухоли, согласно оценке на основании объема опухоли, указывает на то, что соответствующая молекула эффективна против ПСМА-экспрессирующих опухолей in vivo.

[0257] Профилактическое лечение, или предотвращение приживления опухолей большеберцовой кости (внутритибиальных): Культивируемые ПСМА-экспрессирующие опухолевые клеточные линии (такие как LNCaP C4-2, LNCaP C4-2B, VCaP, CWR22Rv1, LAPC4, MDA-PCa-2b, LuCaP 23.1, LuCaP 58, LuCaP 70, LuCaP 77) смешивают с лимфоцитами человека (либо периферическими мононуклеарными клетками крови человека, либо очищенными Т-клетками) и инъецируют в большеберцовую кость мышам с иммунодефицитом (таким как SCID, NOD/SCID и т.д.). Биспецифическую анти-ПСМА молекулу инъецируют внутривенно в день инъекции и несколько последующих дней. Дозозависимое подавление роста опухоли, согласно оценке по биомаркерам сыворотки, с помощью радиографии, флуоресцентной визуализации, по потере массы и других косвенных измерений объема опухоли, указывает на то, что соответствующая молекула эффективна против ПСМА-экспрессирующих опухолей in vivo.

[0258] Терапевтическое лечение, или регрессия ранее верифицированных опухолей большеберцовой кости; Культивируемые ПСМА-экспрессирующие опухолевые клеточные линии (такие как LNCaP C4-2, LNCaP C4-2B, VCaP, CWR22Rv1, LAPC4, MDA-PCa-2b, LuCaP 23.1AI, LuCaP 58, LuCaP 70, LuCaP 77) инъецируют в большеберцовую кость мышам с иммунодефицитом (таким как SCID, NOD/SCID и т.д.). Рост опухолей отслеживают, и начинают исследование, когда опухоли демонстрируют признаки установившегося роста (как правило, при объеме ~200 мм³). Лимфоциты человека (либо периферические мононуклеарные клетки крови человека, либо очищенные Т-клетки) инъецируют внутривенно вместе с биспецифической анти-ПСМА молекулой в день инъекции. Указанную биспецифическую анти-ПСМА молекулу инъецируют в последующие несколько дней. Дозозависимое подавление роста опухоли согласно оценке по биомаркерам сыворотки, с помощью радиографии, флуоресцентной визуализации, по потере массы и с помощью других косвенных измерений объема опухоли, указывает на то, что соответствующая молекула эффективна против ПСМА-экспрессирующих опухолей in vivo.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к биспецифическим связывающим полипептидным терапевтическим средствам, специфично нацеленным на клетки, экспрессирующие специфический мембранный антиген простаты (ПСМА), что может быть использовано в медицине. Полученный полипептид, а также его димер и композиции их содержащие используют в составе фармацевтических композиций для лечения рака предстательной железы и кастрационно-резистентного рака предстательной железы. Изобретение позволяет связываться и с ПСМА-экспрессирующими клетками, и с Т-клеточным рецепторным комплексом на Т-клетках, индуцируя мишенезависимую Т-клеточную цитотоксичность, активацию и пролиферацию, что обеспечивает эффективную противоопухолевую терапию. 9 н. и 17 з.п. ф-лы, 8 ил., 3 табл., 9 пр.

1. Биспецифический связывающий полипептид, содержащий: гуманизированный одноцепочечный иммуноглобулиновый фрагмент, связывающий специфический мембранный антиген простаты (ПСМА), при этом указанный ПСМА-связывающий иммуноглобулиновый фрагмент содержит

(i) вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, содержащую LCDR1, LCDR2 и LCDR3, и

(ii) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую HCDR1, HCDR2 и HCDR3;

при этом LCDR1, LCDR2 и LCDR3 имеют последовательности аминокислот, приведенные в SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 17 соответственно, и HCDR1, HCDR2 и HCDR3 имеют последовательности аминокислот, приведенные в SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 11 соответственно; и

второй связывающий домен, индуцирующий мишенезависимую Т-клеточную цитотоксичность.

2. Биспецифический полипептид по п. 1, отличающийся тем, что указанный биспецифический полипептид содержит в направлении от амино-конца к карбоксильному концу

(a) указанный ПСМА-связывающий фрагмент,

(b) первую шарнирную область,

(c) константную область иммуноглобулина и

(d) указанный второй связывающий домен.

3. Биспецифический полипептид по п. 1, отличающийся тем, что указанный биспецифический полипептид содержит, в направлении от амино-конца к карбоксильному концу или в направлении от карбоксильного конца к амино-концу,

(a) указанный ПСМА-связывающий фрагмент,

(b) первую шарнирную область,

(c) константную область иммуноглобулина,

(d) вторую шарнирную область и

(e) указанный второй связывающий домен.

4. Биспецифический полипептид по п. 3, отличающийся тем, что указанный второй связывающий домен расположен в направлении карбоксильного конца или в направлении амино-конца относительно указанной второй шарнирной области.

5. Биспецифический полипептид по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что указанная вариабельная область легкой цепи иммуноглобулина содержит последовательность аминокислот, по меньшей мере на 95% идентичную последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 23, и указанная вариабельная область тяжелой цепи содержит последовательность аминокислот, по меньшей мере на 95% или на 100% идентичную последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 25 или SEQ ID NO: 27.

6. Биспецифический полипептид по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что указанный ПСМА-связывающий фрагмент конкурирует за связывание с ПСМА человека с одноцепочечным Fv (scFv), который имеет последовательность аминокислот, приведенную в SEQ ID NO: 21.

7. Биспецифический полипептид по любому из пп. 2-4, отличающийся тем, что указанная первая шарнирная область получена из (i) области «ствола» лектинов С-типа (II) или (ii) шарнирной области иммуноглобулина.

8. Биспецифический полипептид по любому из пп. 3-4, отличающийся тем, что указанная вторая шарнирная область получена из (i) области «ствола» лектинов С-типа (II) или (ii) шарнирной области иммуноглобулина.

9. Биспецифический полипептид по любому из пп. 3-4, отличающийся тем, что указанная вторая шарнирная область содержит последовательность аминокислот, приведенную в SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65 или SEQ ID NO: 66.

10. Биспецифический полипептид по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что указанный ПСМА-связывающий фрагмент представляет собой одноцепочечный Fv (scFv).

11. Биспецифический полипептид по п. 10, отличающийся тем, что указанный scFv содержит последовательность аминокислот, по меньшей мере на 95% идентичную последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 34 или SEQ ID NO: 35.

12. Биспецифический полипептид по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что указанный биспецифический полипептид содержит последовательность аминокислот, по меньшей мере на 95% идентичную последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 70 или SEQ ID NO: 72.

13. Биспецифический полипептид по любому из пп. 1-4, 11, отличающийся тем, что указанный второй связывающий домен специфично связывается с Т-клеткой, CD3, CD3ε или комплексом Т-клеточного рецептора (TCR) или его компонентом.

14. Биспецифический полипептид по п. 13, отличающийся тем, что указанный второй связывающий домен конкурирует за связывание с CD3ε с моноклональным антителом, выбранным из группы, состоящей из CRIS-7 и HuM291.

15. Биспецифический полипептид по п. 13, отличающийся тем, что указанный второй связывающий домен содержит вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина и вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, полученные из моноклонального антитела, выбранного из группы, состоящей из CRIS-7 и HuM291.

16. Биспецифический полипептид по п. 13, отличающийся тем, что указанные вариабельные области легкой и тяжелой цепей указанного второго связывающего домена выбраны из группы, состоящей из

(a) вариабельной области легкой цепи, содержащей последовательность аминокислот, по меньшей мере на 95% или на 100% идентичную последовательности аминокислот, представленной остатками 139-245 последовательности SEQ ID NO: 47, и вариабельной области тяжелой цепи, содержащей последовательность аминокислот, по меньшей мере на 95% или на 100% идентичную последовательности аминокислот, представленной остатками 1-121 последовательности SEQ ID NO: 47; и

(b) вариабельной области легкой цепи, содержащей последовательность аминокислот, по меньшей мере на 95% или на 100% идентичную последовательности аминокислот, представленной остатками 634-740 последовательности SEQ ID NO: 78, и вариабельной области тяжелой цепи, содержащей последовательность аминокислот, по меньшей мере на 95% или на 100% идентичную последовательности аминокислот, представленной остатками 496-616 последовательности SEQ ID NO: 78.

17. Биспецифический полипептид по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что указанный биспецифический полипептид содержит последовательность аминокислот, по меньшей мере на 95% или на 100% идентичную последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 162 или SEQ ID NO: 164.

18. Димерный полипептид, содержащий первую и вторую полипептидные цепи, при этом каждая из указанных полипептидных цепей представляет собой биспецифический полипептид по любому из пп. 1-17.

19. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая указанный биспецифический полипептид по любому из пп. 1-17.

20. Экспрессионный вектор для экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей биспецифический полипептид по любому из пп. 1-17, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 19, которая функционально связана с регуляторными последовательностями, подходящими для экспрессии указанной нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине.

21. Рекомбинантная клетка-хозяин для экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей биспецифический полипептид по любому из пп. 1-17, содержащая вектор по п. 20.

22. Композиция для индуцирования перенаправленной Т-клеточной цитотоксичности (RTCC) против клетки, экспрессирующей специфический мембранный антиген простаты (ПСМА), содержащая в терапевтически эффективном количестве биспецифический полипептид по любому из пп. 1-17 и/или димерный полипептид по п. 18; и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество.

23. Способ лечения расстройства у субъекта, при этом указанное расстройство характеризуется сверхэкспрессией специфического мембранного антигена простаты (ПСМА), причем указанный способ включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества биспецифического полипептида по любому из пп. 1-17, или димерного полипептида по п. 18, или композиции по п. 22.

24. Способ по п. 23, отличающийся тем, что указанное расстройство, характеризующееся сверхэкспрессией специфического мембранного антигена простаты (ПСМА), выбрано из: рака предстательной железы, кастрационно-резистентного рака предстательной железы.

25. Применение биспецифического полипептида по любому из пп. 1-17 при лечении расстройства у субъекта, которое характеризуется сверхэкспрессией специфического мембранного антигена простаты (ПСМА), причем предпочтительно указанное расстройство представляет собой рак предстательной железы или кастрационно-резистентный рак предстательной железы.

26. Применение димерного полипептида по п. 18 при лечении расстройства у субъекта, которое характеризуется сверхэкспрессией специфического мембранного антигена простаты (ПСМА), причем предпочтительно указанное расстройство представляет собой рак предстательной железы или кастрационно-резистентный рак предстательной железы.