Нанокапсула для доставки липофильного соединения и способ ее получения Российский патент 2020 года по МПК A61K9/10 A61K9/51 

Область изобретения

Изобретение относится к биосовместимым капсулам на основе полисахаридов, отформованным на жидких сердцевинах диаметром меньше 1 мкм, стабилизированным гидрофобно модифицированными заряженными полисахаридами без применения низкомолекулярных ПАВ, способным эффективно инкапсулировать гидрофобные соединения и обладающим долговременной стабильностью в водных суспензиях, и к способу их получения и стабилизации.

Предпосылки изобретения

Стабильная и биоразлагаемая наноэмульсия типа масло-в-воде (М/В) является одним из наиболее распространенных типов наносостава, используемого в качестве системы доставки различных активных соединений, в частности, лекарств, витаминов, гормонов, красителей, антиоксидантов, пестицидов, контрастных веществ для магнитно-резонансной томографии (МРТ) и позитронной эмиссионной томографии (ПЭТ). Основной целью таких носителей является улучшение эффективности действия инкапсулированных соединений благодаря защите их от разложения, уменьшения токсичности путем снижения побочных действий на ткани организма.

При ультразвуковой или механической гомогенезации двух несмешиваемых фаз образуются эмульсии типа масло-в-воде. Несмотря на то что способ кажется очень простым, основной проблемой является получение устойчивых капелек. Вследствие термодинамической неустойчивости наноэмульсий, для улучшения устойчивости масляных капелек в полярной среде требуется использование стабилизаторов. Поверхностно-активные вещества (ПАВ) хорошо известны своей способностью стабилизировать масляные капельки благодаря адсорбции на поверхности раздела вода/масло, что приводит к снижению поверхностного натяжения. Это вызывает нарушение целостности поверхности капелек, уменьшение их размеров и предотвращает их агрегирование благодаря, например, электростатическим силам отталкивания.

Другой стратегией, направленной на улучшение устойчивости наноэмульсий, является применение послойной методики (layer by layer technique - LbL), результатом которой является образование сверхтонких полимерных пленок, образующихся в процессе попеременной адсорбции противоположно заряженных полиэлектролитов. Получаемые структуры относятся к нанокапсулам, отформованным на жидких сердцевинах. Применение низкомолекулярных ионных ПАВ позволяет покрывать масляные сердцевины полимерными оболочками, однако, динамическая природа взаимодействий внутри мицеллярных систем является серьезным ограничением. Наиболее важной проблемой является то, что избыточное разбавление системы может привести к снижению концентрации ПАВ ниже критической концентрации мицеллообразования (ККМ), что приводит к разрушению структуры, стабилизирующей масляные капельки и, таким образом, к неконтролируемому высвобождению инкапсулированных соединений до достижения ими цели. Другим важным моментом является выбор подходящей пары ПАВ и полиэлектролита, которая является первым слоем оболочки, т.к. формирование устойчивого межфазного комплекса имеет решающее значение для формирования стабильной оболочки капсулы [U. et al., Soft Matter, 2011, 7, 6113-6124; U. et al., Bioelectrochemistry, 2012, 87, 147-153]. Хотя использование блок-сополимеров, по-видимому, является решением проблемы нестабильности мицеллярной системы благодаря более низкому значению ККМ, чем у низкомолекулярных ПАВ, изменения окружающих условий также приводят к дестабилизации наносостава [L.I. Atanase et al., International Journal of Pharmaceutics, 2013, 448, 339-345]. Поэтому продолжаются поиски материалов, устойчивых к изменениям внешних параметров.,,

Амфифильные привитые сополимеры позволяют достичь вышеупомянутые цели, поскольку они способны закреплять свои гидрофобные «ответвления» в масляных капельках, стабилизируя их [F. Liu et al., Polymer Chemistry, 2014, 5, 1381-1392]. Эти полимеры играют двойную роль в наноэмульсиях: с одной стороны они действуют как стабилизаторы капелек, а с другой - они составляют первый слой оболочки. Кроме того, применение привитых полиэлектролитов способствует образованию многослойных капсул повышенной стабильности [J. Szafraniec et al., Nanoscale, 2015, 7, 5525-5536].

Хотя контролируемое или замедленное высвобождение инкапсулированных веществ из наноносителей различного типа представляет значительный интерес для таких применений, как самовосстанавливающиеся материалы, консервирование питательных веществ, морская индустрия или высвобождение душистых веществ, такой подход особенно важен в области, относящейся к липофильным биологически активным соединениям с недостаточным биораспределением и плохими фармакокинетическими профилями, что является результатом гидрофобной природы таких соединений. Учитывая широкое разнообразие молекул с различными структурами, молярными массами и физико-химическими свойствами (например, полярность или вязкость), ясно, что необходимо рассмотреть различные альтернативы для изготовления систем доставки.

Хотя многочисленные публикации и патенты были посвящены наноэмульсиям, используемым в качестве носителей различных соединений в косметике, пищевой промышленности, фармации или сельском хозяйстве, среди прочих, они всегда стабилизируются либо низкомолекулярными поверхностно-активными агентами, либо полимерными ПАВ. См., например:

Патент США №20060063676 описывает наноэмульсии, инкапсулирующие пестициды в масляных сердцевинах, стабилизированных ионными или неионными ПАВ.

Патент США №2007036831 направлен на стабилизацию наноэмульсий, имеющих высокие противовоспалительные свойства, ионными и/или неионными ПАВ.

Для биомедицинских применений нанокапсул, отформованных на жидких сердцевинах, важно, чтобы они были устойчивы к изменениям концентрации, которые могут происходить после внутривенного введения. Неконтролируемое высвобождение инкапсулированного лекарства или контрастного вещества до достижения ими цели очень нежелательно и может вызвать нежелательные побочные явления. Биоразлагаемые полимеры с низкой токсичностью, такие как поли(глутаминовая кислота), полипептиды, такие как поли(L-лизин) и поли(L-аргинин), а также модифицированные полисахариды (например, хитозан или декстран), используются для минимизации такого риска [А. Karabasz et al., Journal of Nanoparticles Research, 2014, 16,1-14; R. Vecchione et al., Nanoscale, 2014, 6, 9300-9307], однако, масляные сердцевины капсул по-прежнему стабилизируют обычными поверхностно-активными агентами.

В публикации заявки №WO 9637232 описана методика стабилизации масляной капельки с использованием межфазного комплекса, образующегося между анионным фосфолипидом и катионным полисахаридом. Такие капсулы направлены на доставку биологически активных веществ, таких как индометацин, метипранолол, диазепам и циклоспорин А.

В патенте № ЕР 2266546 описаны наноэмульсии, отформованные на сердцевинах, состоящих из насыщенных или ненасыщенных жирных кислот, с длиной цепей в 12-24 атома углерода, стабилизированных анионными фосфолипидами и покрытых тонким слоем хитозана. Такие капсулы были описаны в качестве носителей липофильных соединений, используемых в косметике и фармации.

В патенте № ЕР 2266546 раскрыты составы с диаметром, не превышающим 1 мкм, в масляных сердцевинах которых, стабилизированных лецитином и покрытых хитозаном, можно эффективно инкапсулировать циклоспорин А.

В публикации № WO 2013001124 описана методика получения наноэмульсий, отформованных на изопреноидах, стабилизированных анионными или неионными ПАВ и покрытых поли(D-глюкозамином), которые использовались в качестве носителей вакцин.

Многочисленные изобретения, основанные на стабилизации масляных сердцевин блок-полимерами, выполняющими роль ПАВ, также были раскрыты, например, в патентах: В публикации № WO 2015013566 описана методика получения наноэмульсии, стабилизированной блок-сополимерами, такими как полиэтиленгликоль и 1,2 дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин, используемыми при лечении раковых заболеваний в качестве носителей комплекса платины(П).

В российском патенте № RU 2494728 описаны нанокапсулы, отформованные на эвкалиптовом масле, стабилизированные блок-сополимером поли(этиленоксида) и поли(пропиленоксида) (ПЭО-блок-ППО), суспендированные в водном растворе полисахаридов (например, хитозана), которые используются в качестве носителей биологически активных липофильных соединений.

Хотя многочисленные статьи и патенты имели своим предметом получение носителей на основе наноэмульсий, ни в одном из них не описан синтез нанокапсул, стабилизированных без классических поверхностно-активных агентов, состоящих из гидрофобной «головы» и гидрофильного «хвоста». Такие молекулы адсорбированы на поверхности раздела близко расположенных стабилизируемых капелек в полярной среде, однако разбавление заставляет молекулы ПАВ уходить с поверхности капельки, что приводит к их дестабилизации и представляет собой значительную проблему.

Неожиданно, эти проблемы были решены в настоящем изобретении, относящемся к носителям липофильных соединений на основе наноэмульсий, описанным согласно приведенной ниже формуле изобретения.

Подробное описание изобретения:

Изобретение относится к новой биосовместимой системе со структурой типа сердцевина-оболочка и способу ее получения. Нанокапсулы, отформованные на жидких сердцевинах, стабилизируют заряженными гидрофобно модифицированными полисахаридами без применения низкомолекулярных ПАВ. Эмульсия капелек диаметром менее 1 мкм образуется при ультразвуковом эмульгировании водного раствора модифицированного полисахарида (с=1-10 г/л) с соответствующим количеством масла (1-10 об./об. %). Такие капсулы затем покрывают сверхтонкими пленками из полиэлектролитов, что приводит к повышению их стабильности, улучшению биосовместимости и фармакокинетического профиля инкапсулированных соединений. На стабильность таких капсул влияют как тип полисахарида, так и тип производимой модификации полисахарида. Так, необходимо соответственным образом сбалансировать характер гидрофобных боковых цепей с их длиной. Известно, что слишком короткие гидрофобные боковые группы («ответвления») не обеспечивают удовлетворительную стабилизацию масляных капель, в то время как лишком высокая степень гидрофобной модификации приводит к снижению растворимости полисахаридов, что существенно ограничивает их применимость.

В особенно предпочтительных вариантах осуществления данного изобретения заявлены гидрофобно модифицированные ионные олиго- и полисахариды, такие как хитозан, олигосахарид хитозана, декстран, каррагенан, амилоза, крахмал, гидроксипропилцеллюлоза, пуллулан и глюкозаминогликаны (например, гиалуроновая кислота, гепарансульфат, гепаринсульфат, кератансульфат, сульфат хондроитина, дерматансульфат) и их производные. Наиболее пригодными стабилизаторами по мнению заявителей являются производные гиалуроновой кислоты, хитозана и олигосахарида хитозана.

Любые полисахариды можно гидрофобно модифицировать. Предпочтительно, чтобы молярная масса полисахарида, используемого в качестве стабилизатора эмульсии, не превышала 2000 г/моль, однако наиболее пригодны полисахариды с молярной массой выше 5000 г/моль.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления данного изобретения полисахариды, используемые в качестве стабилизаторов эмульсии, должны обладать стабильным электростатическим зарядом, создаваемым ионными группами в полимерных цепях, такими как карбоксильная, сульфоновая, сульфатная, фосфатная, аммонийная, пиридиновая или фосфоновая группы. Предпочтительно, чтобы содержание ионных групп было не менее 10%, более подходящим образом оно не должно превышать 40%, хотя для хорошей стабилизации капелек эмульсии наиболее пригодны полимеры, содержание ионных групп в которых составляет не менее 60%.

В особенно предпочтительных вариантах осуществления данного изобретения стабилизация масляных сердцевин капсул может быть обеспечена полисахаридами, модифицированными гидрофобными группами с либо линейными, либо разветвленными алкильными цепями, состоящими из 3-30 атомов углерода с одинарными и/или многократными связями. Также возможно «использование циклических соединений и/или ароматических соединений в качестве гидрофобных боковых цепей, которые также могут содержать слабо поляризованные группы, такие как простые эфирные или дисульфидные группы или галогены. Предпочтительно, чтобы степень замещения гидрофобными цепями в молекулах полисахарида не превышала 40%. Для получения хорошей растворимости в воде рекомендовано менее чем 10% замещение гидрофобными группами, однако для обеспечения наилучшей стабилизации масляных сердцевин капсул оно не должно превышать 5%. Рекомендуется использовать гидрофобные соединения, состоящие из 6-18 атомов углерода, однако наиболее подходящими для использования являются боковые цепи из 12 атомов углерода.

В особенно предпочтительных вариантах осуществления изобретения для получения наноэмульсий используют способ с применением ультразвука: ультразвуковую обработку следует проводить в течение 15-120 минут при температуре в интервале 4-40°С. Предпочтительно, чтобы она продолжалась 30-60 минут при 20-35°С, однако наиболее подходящие условия, обеспечивающие получение нанокапсул, представляют собой следующее: 30-минутная обработка ультразвуком, осуществляемая при комнатной температуре.

Нанокапсулы на основе полисахаридов производят, используя водный раствор гидрофобно модифицированного полисахарида с рН 2-12, концентрацией в пределах 0,1-30 г/л и ионной силой в интервале от 0,001 М до 3 М. Предпочтительно, чтобы ионная сила раствора полисахаридов варьировалась в интервале 0,015-0,15 М, а концентрация была в пределах 1-10 г/л.

Масляные сердцевины предлагаемых капсул состоят из нетоксичных гидрофобных соединений, как натуральных, так и искусственных, таких как олеиновая кислота, изопропилпальмитат, PROVINOL, жирные кислоты и чистые натуральные масла (как растительного, так и животного происхождения), или их смесей, включая, среди прочего, льняное масло, соевое масло, аргановое масло. Полученные капсулы имеют широкое применение, такое как носители липофильных соединений с низкой биодоступностью или нанореакторы для ферментативных и/или биологических процессов. Липофильные активные соединения и субстраты для ферментативных реакций могут быть либо материалом сердцевины, либо растворенным в нем соединением. Смешивание доставляемых липофильных соединений, с масляной фазой на первой стадии способа получения капсул минимизирует риск повреждения уязвимых молекул и позволяет производить инкапсулирование с высокой эффективностью.

Растворение красителей в масляных сердцевинах приводит к образованию капсул, получение изображения и исследование которых легко осуществлять микроскопическими методами для определения профилей высвобождения заключенных в сердцевинах веществ. Концентрации инкапсулированных красителей изменяются в пределах от прим. 10^-5 М до концентраций, получаемых в насыщенных растворах.

Капсулы, используемые для биоимиджинга, должны заключать в себе красители, длины волн возбуждения и излучения которых лежат в красной части спектра, т.к. это облегчает визуализацию in vivo, поскольку излучение красителя не перекрывается с автофлуоресценцией клеток.

В особенно предпочтительных вариантах осуществления изобретения предлагаемые нанокапсулы должны быть покрыты свехтонкими пленками полиэлектролитов. Особенно предпочтительно использование биосовместимых полиэлектролитов и их производных природного происхождения, включающих производные хитозана, декстран, крахмал, гидроксипропилцеллюлозу, глюкозаминогликаны (например, производные гиалуроновой кислоты, гепаринсульфат, гепарин, кератансульфат, хондроитин и дерматан), каррагенан, альгинат и синтетические полиэлектролиты, такие как поли-L-лизин, полиорнитин, полиф-глутаминовая кислота), производные поли(молочной кислоты), полистиролсульфонат, поли(диаллилдиметиламмония хлорид), полиаллиламина гидрохлорид или полиэтиленимин. Меченные флуоресцентным методом полисахариды рекомендуются для производства многослойных капсул для томографии in vivo.

Нанесение на капсулы многослойных пленок особенно важно, поскольку это позволяет регулировать заряд капсул и тем самым избежать агрегации продукта с клетками крови, что является основным условием для биомедицинских применений. Кроме того, такая стратегия обеспечивает улучшенную стабильность капсул, а также их более высокую биодоступность и биосовместимость. Предпочтительно, чтобы внешний слой капсул был анионно заряжен. Особенно предпочтительно использовать анионные производные хитозана и гликозаминогликаны. Также рекомендуется модифицировать внешний слой капсул полиэтиленгликолем (ПЭГ), поскольку это приводит к улучшению биодоступности капсул и продлению времени циркуляции в кровотоке.

Преимуществом изобретения является возможность приготовления биосовместимой, стабильной наноэмульсии без использования низкомолекулярного ПАВ. Предлагаемые капсулы могут инкапсулировать гидрофобные соединения, которые растворены непосредственно в масляных сердцевинах, что обеспечивает инкапсулирование с высокой эффективностью. Простота в приготовлении, низкие энергопотребление и затраты способа получения, устойчивость к изменениям условий (таким как рН и концентрация) и достаточная простота биосовместимой системы позволяет широко применять ее в качестве носителей липофильных биологически активных соединений.

Краткое описание графических материалов и таблиц

Таблицы 1 и 2 содержат данные о стабильности капсул, описанных в примерах I-IV.

В Таблице 3 показано, как рН влияет на морфологию и стабильность капсул, описанных в примерах VHI-IX.

В Таблицу 4 включены данные о характеристиках капсул, отформованных на масляных сердцевинах различного типа, как описано в примерах Х-ХП.

Таблица 5 содержит данные о стабильности капсул, описанных в примере XVI.

На Фигурах 1-4 показано распределение по размерам капсул, описанных в примерах I-VI.

Фигура 5 представляет собой распределение по размерам капсул, описанных в примере V.

На Фигурах 6 и 7 показаны конфокальные микрофотографии капсул, представленных в примерах VI и VII.

Фигура 8 представляет собой распределение по размерам капсул, описанных в примере VII.

Фигура 9 представляет собой распределение по размерам капсул, описанных в примере VII.

На Фигурах 10 и 11 показано распределение по размерам капсул, описанных в примерах VIII-IX.

На Фигуре 12 показано распределение по размерам капсул, описанных в примерах X-XI.

Фигура 13 представляет собой распределение по размерам капсул, описанных в примере XII.

На Фигуре 14 приведены СЭМ микрофотографии капсул, отформованных на сердцевине из н-додекана, описанных в примере XIII.

На Фигурах 15 и 16 показаны размер и дзета-потенциал капсул, покрытых катионно- и анионно- хитозаном, как представлено в примере XIV.

Фигура 17 представляет собой распределение по размерам капсул, описанных в примере XV.

Фигура 18 представляет собой распределение по размерам капсул, описанных в примере XVI.

Фигура 19 представляет собой крио-ПЭМ микрофотографию капсул, описанных в примере XVI.

Фигура 20 представляет собой распределение по размерам капсул, описанных в примере XVII.

На Фигурах 21 и 22 показаны размер и дзета-потенциал капсул, описанных в примере XVIII.

Фигура 23 представляет собой распределение по размерам капсул, описанных в примере XIX.

На Фигурах 24 и 25 показаны размер и дзета-потенциал капсул, описанных в примере XX.

Фигура 26 представляет собой распределение по размерам капсул, описанных в примере XXI.

Изобретение подробно описано и проиллюстрировано с конкретной ссылкой на определенные предпочтительные варианты его осуществления согласно следующим примерам.

Пример I Получение нанокаспул, отформованных на сердцевинах из олеиновой кислоты, стабилизированных гиалуроновой кислотой, модифицированной гексиламином

Гиалуроновую кислоту, модифицированную гексильными боковыми цепями (Ну-С6), растворяли в 0,1 М NaCl (1 г/л) и смешивали с олеиновой кислотой (100:1 об./об.). Обе фазы взбалтывали в течение 5 минут и эмульгировали в течение 30 минут при комнатной температуре в ультразвуковой ванне (540 Вт, 1-секундный импульс, 2-секундный перерыв). Размер получаемых капсул определяли, используя методику динамического светорассеяния (ДСР или DLS), и он был равен примерно 500 нм. Полученные капсулы были стабильны в течение по меньшей мере двух недель, что подтверждалось измеренными значениями гидродинамического диаметра и электрокинетического потенциала (дзета-потенциала). Через два дня после получения наблюдали снижение размера частиц (до примерно 360 нм), что свидетельствует о дестабилизации скоплений частиц и/или более крупных капсул и образовании эмульсии, содержащей только более мелкие и более стабильные частицы (Фигура 1, Таблица 1).

Пример II Получение нанокаспул, отформованных на сердцевинах из олеиновой кислоты, стабилизированных гиалуроновой кислотой, модифицированной октиламином

Смесь водного раствора гиалуроновой кислоты, модифицированной октальными боковыми цепями (Ну-С8), и олеиновой кислоты приготовляли согласно процедуре, описанной в Примере I. Размер получаемых капсул определяли, используя методику динамического светорассеяния (ДСР или DLS), и он был равен примерно 700 нм. Полученные капсулы были стабильны в течение по меньшей мере двух недель, что подтверждалось измеренными значениями гидродинамического диаметра и электрокинетического потенциала (дзета-потенциала). Через два дня после ультразвуковой обработки наблюдали значительное уменьшение размера частиц (до примерно 300 нм), что свидетельствует о дестабилизации скоплений частиц и/или более крупных капсул и образовании эмульсии, содержащей только более мелкие и более стабильные частицы. (Фигура 2, Таблица 1).

Пример III Получение нанокаспул, отформованных на сердцевинах из олеиновой кислоты, стабилизированных гиалуроновой кислотой, модифицированной додециламином

Гиалуроновую кислоту, модифицированную додецильными боковыми цепями (Ну-С12), растворяли в 0,1 М NaCl (1 г/л) и интенсивно перемешивали в течение 60 минут, используя магнитную мешалку (500 об/мин), с целью обеспечения полного растворения полисахарида. Такой водный раствор затем смешивали с олеиновой кислотой (100:1 об./об.), взбалтывали в течение 5 минут и эмульгировали в течение 30 минут при комнатной температуре в ультразвуковой ванне (540 Вт, 1-секундный импульс, 2-секундный перерыв). Размер получаемых капсул определяли, используя методику динамического светорассеяния (ДСР или DLS), и он был равен примерно 200 нм. Полученные капсулы были стабильны в течение по меньшей мере двух недель, что подтверждалось измеренными значениями гидродинамического диаметра и электрокинетического потенциала (дзета-потенциала). Поскольку размер полученных капсул несколько уменьшился через 3 дня после ультразвуковой обработки, без дальнейших доказательств было принято, что произошла дестабилизация скоплений частиц и/или более крупных капсул и образовалась эмульсия, содержащая только более мелкие и более стабильные частицы. (Фигура 3, Таблица 1).

Пример IV Получение нанокаспул, отформованных на сердцевинах из олеиновой кислоты, стабилизированных гиалуроновой кислотой, модифицированной октадециламином

Смесь водного раствора гиалуроновой кислоты, модифицированной октадецильными боковыми цепями (Ну-С18), и олеиновой кислоты получали согласно процедуре, описанной в Примере III. Размер получаемых капсул определяли, используя методику динамического светорассеяния (ДСР или DLS), и он был равен примерно 320 нм. Полученные капсулы были стабильны в течение по меньшей мере двух недель, что подтверждалось измеренными значениями гидродинамического диаметра и электрокинетического потенциала (дзета-потенциала). Поскольку размер полученных капсул уменьшился до примерно 250 нм через 3 дня после ультразвуковой обработки, без дальнейших доказательств было принято, что произошла дестабилизация скоплений частиц и/или более крупных капсул и образовалась эмульсия, содержащая только более мелкие и более стабильные частицы (Фигура 4, Таблица 1).

Пример V Определение влияния концентрации полисахарида и солевого раствора на размер и стабильность капсул, отформованных на сердцевинах из олеиновой кислоты, стабилизированных Ну-С12

Гиалуроновую кислоту, модифицированную додецильными боковыми цепями, растворяли в 0,15М NaCl (5 г/л) и использовали для получения нанокапсул, отформованных на сердцевинах из олеиновой кислоты, согласно процедуре, описанной в Примере III. Размер получаемых капсул определяли, используя методику динамического светорассеяния (ДСР или DLS), и он был равен примерно 280 нм (Фигура 5).

Пример VI Определение эффективности инкапсулирования гидрофобного красителя капсулами из Ну-С12, отформованными на сердцевинах из олеиновой кислоты.

Смесь водного раствора гиалуроновой кислоты, модифицированной додецильными боковыми цепями (Ну-С12), и олеиновой кислоты приготовляли согласно слегка измененной процедуре, описанной в Примере V, а именно, Нильский красный растворяли в олеиновой кислоте (1 г/л), а затем смешивали с водным раствором Ну-С12. Размер получаемых капсул определяли, используя методику динамического светорассеяния (ДСР или DLS), и он был равен примерно 320 нм. Кроме того, с помощью конфокальной микроскопии было подтверждено, что полученные капсулы могут эффективно инкапсулировать гидрофобные красители (Фигура 6).

Пример VII Определение влияния концентрации инкапсулированного красителя на размер и стабильность капсул

Смесь водного раствора гиалуроновой кислоты, модифицированной додецильными боковыми цепями (Ну-С12), и олеиновой кислоты приготовляли согласно слегка измененной процедуре, описанной в Примере III, а именно, Нильский красный или перилен (0,15 г/л) растворяли в олеиновой кислоте, а затем смешивали с водным раствором Ну-С12. Размер получаемых капсул определяли, используя методику динамического светорассеяния (ДСР или DLS), и он был равен примерно 190 нм и 120 нм для капсул с Нильским красным и периленом, соответственно. Для визуализации капсул использовали конфокальную микроскопию. Полученные результаты подтверждают, что капсулы эффективно инкапсулировали гидрофобные соединения, растворенные в масляной фазе. (Фигура 7, Фигура 8, Фигура 9).

Пример VIII Определение влияния низкого рН на размер и стабильность капсул из Ну-С12, отформованных на сердцевинах из олеиновой кислоты

Смесь водного раствора гиалуроновой кислоты, модифицированной додецильными боковыми цепями (Ну-С12), и олеиновой кислоты получали согласно слегка измененной процедуре, описанной в Примере III, а именно, суспензию подкисляли до рН=1,4, используя 6 М HCl. Размер получаемых капсул определяли, используя методику динамического светорассеяния (ДСР или DLS), и он был равен примерно 280 нм до подкисления и 310 нм после него. С помощью оптической микроскопии было подтверждено, что снижение рН суспензии не влияет на стабильность капсул. (Фигура 10, Таблица 4).

Пример IX Определение влияния низкого рН на размер и стабильность капсул из Ну-С18, отформованных на сердцевинах из олеиновой кислоты

Смесь водного раствора гиалуроновой кислоты, модифицированной октадецильными боковыми цепями (Ну-С18), и олеиновой кислоты получали согласно процедуре, описанной в Примере VIII. Размер получаемых капсул определяли, используя методику динамического светорассеяния (ДСР или DLS), и он был равен примерно 125 нм до подкисления и 130 нм после него. С помощью оптической микроскопии было подтверждено, что снижение рН суспензии не влияет на стабильность капсул (Фигура 11, Таблица 4).

Пример X Получение нанокаспул, отформованных на сердцевинах из льняного масла, стабилизированных гиалуроновой кислотой, модифицированной додециламином Смесь водного раствора гиалуроновой кислоты, модифицированной додецильными боковыми цепями (Ну-С12), и льняного масла получали согласно процедуре, описанной в Примере III. Полученные капсулы охарактеризовывали, используя ДСР: измеренный размер составлял примерно 320 нм и дзета-потенциал составлял примерно -22 мВ. Полученные результаты показали, что нанокапсулы могут образовываться вне зависимости от типа используемого в качестве сердцевины масла (Фигура 12, Таблица 5).

Пример XI Получение нанокаспул, отформованных на сердцевинах из льняного масла, стабилизированных гиалуроновой кислотой, модифицированной октадециламином Смесь водного раствора гиалуроновой кислоты, модифицированной додецильными боковыми цепями (Ну-С18), и льняного масла приготовляли согласно процедуре, описанной в Примере X. Полученные капсулы охарактеризовывали, используя ДСР: измеренный размер составлял примерно 530 нм и дзета-потенциал составлял примерно -21 мВ. Полученные результаты показали, что нанокапсулы могут образовываться вне зависимости от типа используемого в качестве сердцевины масла (Фигура 12, Таблица 5).

Пример XII Получение нанокаспул, отформованных на сердцевинах из арганового масла, стабилизированных гиалуроновой кислотой, модифицированной додециламином

Смесь водного раствора гиалуроновой кислоты, модифицированной додецильными боковыми цепями (Ну-С12), и арганового масла приготовляли согласно процедуре, описанной в Примере X. Полученные капсулы охарактеризовывали, используя ДСР: измеренный размер составлял примерно 710 нм и дзета-потенциал составлял примерно -20 мВ. Полученные результаты показали, что нанокапсулы могут образовываться вне зависимости от типа используемого в качестве сердцевины масла (Фигура 13, Таблица 5).

Пример XIII Получение нанокаспул, отформованных на сердцевинах из отвержденного н-октадекана для сканирующей электронной микроскопии (СЭМ)

1 г/л растворы гиалуронатов (Ну-С6, Ну-С8, Ну-С12 и Ну-С18) в 0,1 М NaCl интенсивно перемешивали в течение 60 минут с целью обеспечения полного растворения полисахаридов. Растворы нагревали до примерно 35°С, смешивали с н-октадеканом (100:1 об./об.) и эмульгировали в течение 30 минут при 32°С в ультразвуковой ванне (540 Вт, 1-секундный импульс, 2-секундный перерыв). После охлаждения суспензии н-октадекана затвердевали, что значительно упрощало получение изображения капсул с использованием сканирующей электронной микроскопии (Фигура 14).

Пример XIV Формирование многослойных Ну-С12 капсул, отформованных на сердцевинах из олеиновой кислоты

Капсулы, стабилизированные гиалуроновой кислотой, модифицированной додецильными боковыми цепями (Ну-С12), и отформованные на сердцевинах из олеиновой кислоты, получали согласно процедуре, описанной в Примере III. Измерения с помощью ДСР указали на формирование капсул диаметром 170 нм, дзета-потенциал которых был равен -19 мВ. Полученные капсулы затем покрывали многослойными оболочками, используя методику послойного насыщения, которая заключалась в добавлении в суспензию малых количеств либо катионно-, либо анионно-модифицированного хитозана (1 г/л в 0,15М NaCl), и после каждой стадии измеряли размер и дзета-потенциал с целью контролирования процесса адсорбции каждого слоя. Полученные четырехслойные капсулы имели диаметр 315 нм и дзета-потенциал, равный -28 мВ. Постепенное увеличение средних диаметров капсул, а также характерная зигзагообразная форма кривой дзета-потенциала подтверждают попеременную адсорбцию полиэлектролитов и сильную электростатическую стабилизацию капсул (Фигура 15 и Фигура 16).

Интересно, что полученные результаты указывают на то, что анионные слои более предпочтительны и обеспечивают лучшую стабилизацию капсул.

Пример XV Определение влияния концентрации полиэлектролита на способ получения многослойных Ну-С12 капсул, отформованных на сердцевинах из олеиновой кислоты

Капсулы, стабилизированные гиалуроновой кислотой, модифицированной додецильными боковыми цепями (Ну-С12), и отформованные на сердцевинах из олеиновой кислоты, получали согласно процедуре, описанной в Примере III. Измерения с помощью ДСР указали на формирование капсул диаметром 210 нм, дзета-потенциал которых был равен -24 мВ. Полученные капсулы затем покрывали многослойными оболочками, используя методику послойного насыщения, которая заключалась в добавлении в суспензию малых количеств либо катионно-, либо анионно-модифицированного хитозана (10 г/л в 0,15М NaCl), и после каждой стадии измеряли размер и дзета-потенциал с целью контролирования процесса адсорбции каждого слоя. Полученные двухслойные капсулы имели диаметр 240 нм и дзета-потенциал, равный -39 мВ, что указывает на высокую стабильность наноэмульсии (Фигура 17). Благодаря использованию концентрированных растворов хитозана разбавление образца было сведено к минимуму, что особенно важно для биомедицинских применений. Важно отметить, что одного двойного слоя хитозана было достаточно, чтобы обеспечить получение системы со стабильностью выше, чем у капсул, описанных в Примере XIV. Кроме того, полученные результаты подтвердили, что анионные слои более предпочтительны и обеспечивают лучшую стабилизацию капсул.

Пример XVI Получение нанокаспул, отформованных на сердцевинах из олеиновой кислоты, стабилизированных катионным производным хитозана, модифицированным додецильными боковыми цепями

Катионное производное хитозана, модифицированное додецильными боковыми цепями (CChit-C12), растворяли в 0,1М NaCl (1 г/л) и интенсивно перемешивали в течение 4 дней с целью обеспечения полного растворения полисахарида. Полученный раствор CChit-C12 смешивали с олеиновой кислотой (100:1 об./об.). Обе фазы взбалтывали в течение 5 минут и эмульгировали в течение 30 минут при комнатной температуре в ультразвуковой ванне (540 Вт, 1-секундный импульс, 2-секундный перерыв). Размер получаемых капсул определяли, используя ДСР, и он был равен примерно 320 нм. Полученные капсулы демонстрировали по меньшей мере двухнедельную стабильность, что подтверждалось измеренными значениями гидродинамического диаметра и электрокинетического потенциала (дзета-потенциала). (Фигура 18, Фигура 19, Таблица 6).

Пример XVII Определение влияния растворителя на способ получения CChit-C12 нанокапсул, отформованных на сердцевинах из олеиновой кислоты

Капсулы, стабилизированные катионным производным хитозана, модифицированного додецильными боковыми цепями (CChit-C12), и отформованные на сердцевинах из олеиновой кислоты, получали согласно измененной процедуре, описанной в Примере XVI, а именно, хитозан растворяли в уксусной кислоте (0,12 М) уксусной кислоте. Это привело к уменьшению времени растворения хитозана до менее чем 30 минут. Полученные капсулы имели диаметр 400 нм нм и дзета-потенциал, равный 25 мВ (измерения с помощью ДСР) (Фигура 20).

Пример XVIII Получение многослойных CChit-C12 капсул, отформованных на сердцевинах из олеиновой кислоты

Капсулы, стабилизированные катионным производным хитозана, модифицированного додецильными боковыми цепями (CCHit-C12), и отформованные на олеиновую кислоту, получали согласно процедуре, описанной в Примере XVI. Полученные капсулы имели диаметр 260 нм и электрокинетический потенциал (дзета-потенциал), равный +25 мВ. Полученные капсулы затем покрывали многослойными оболочками, используя методику послойного насыщения, которая заключалась в добавлении в суспензию малых количеств либо катионно-, либо анионно-модифицированного хитозана (1 г/л в 0,15М NaCl), и после каждой стадии измеряли размер и дзета-потенциал с целью контролирования процесса адсорбции каждого слоя. Полученные двухслойные капсулы имели диаметр 340 нм и дзета-потенциал, равный +21 мВ. Постепенное увеличение средних диаметров капсул, а также характерная зигзагообразная форма кривой дзета-потенциала подтверждают попеременную адсорбцию полиэлектролитов и сильную электростатическую стабилизацию капсул (Фигура 21, Фигура 22). Кроме того, полученные результаты подтвердили, что анионные слои более предпочтительны и обеспечивают лучшую стабилизацию капсул.

Пример XIX Получение капсул, отформованных на сердцевинах из олеиновой кислоты и стабилизированных октадецильным производным анионно-модифицированного олигосахарида хитозана

Капсулы, отформованные на олеиновую кислоту, получали согласно измененной процедуре, описанной в Примере I, а именно, в качестве стабилизатора эмульсии использовали октадецильное производное анионно-модифицированного олигосахарида хитозана (oChit-C18-sulf). Полученные капсулы имели диаметр, равный 150 нм, который измеряли с помощью динамического светорассеяния (ДСР или DLS) (Фигура 23).

Пример XX Получение многослойных капсул, отформованных на сердцевинах из олеиновой кислоты и стабилизированных октадецильным производным анионно-модифицированного олигосахарида хитозана

Капсулы, отформованные на олеиновую кислоту, получали согласно процедуре, описанной в Примере XIX. Полученные капсулы имели диаметр 170 нм и дзета-потенциал, равный -17 мВ. Капсулы покрывали многослойными оболочками согласно процедуре, описанной в Примере XVIII. Полученные восьмислойные капсулы имели диаметр 260 нм и дзета-потенциал, равный -29 мВ. Постепенное увеличение средних диаметров капсул, а также характерная зигзагообразная форма кривой дзета-потенциала согласуются с попеременной адсорбцией полиэлектролитов и сильной электростатической стабилизацией капсул (Фигура 24, Фигура 25). Кроме того, полученные результаты подтверждают, что анионные слои более предпочтительны и обеспечивают лучшую стабилизацию капсул.

Пример XXI Определение влияния степени гидрофобной модификации и концентрации полисахарида на параметры, характеризующие нанокапсулы. отформованные на сердцевинах из олеиновой кислоты, стабилизированных Ну-С18х.

Гиалуронат, модифицированный октадецильными боковыми цепями (4,5% замещения), растворяли в 0,1М NaCl (1 г/л или 5 г/л) и интенсивно перемешивали в течение 60 минут, используя магнитную мешалку (500 об/мин), с целью обеспечения полного растворения полисахарида. Такие водные растворы затем смешивали с олеиновой кислотой (100:1 об./об.), взбалтывали в течение 5 минут и эмульгировали в течение 30 минут при комнатной температуре в ультразвуковой ванне (540 Вт, 1-секундный импульс, 2-секундный перерыв). Размер получаемых капсул определяли по ДСР, и он был равен примерно 780 нм и примерно 710 нм в случае капсул, стабилизированных с использованием Ну-С18х при с=1 г/л или 5 г/л, соответственно, при этом дзета-потенциалы были равны -19 мВ или -16 мВ, соответственно. Полученные результаты в сравнении с результатами, представленными в Примере IV, указывают на то, что в случае длинных гидрофобных цепочек предпочтительно синтезировать материалы с меньшей степенью замещения боковых цепей. Кроме того, была показана плохая стабильность получаемых капсул вне зависимости от концентрации полисахарида (Фигура 26).

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложена проявляющая долговременную стабильность в водных суспензиях нанокапсула диаметром менее 1 мкм, водная суспензия для доставки липофильных соединений, содержащая указанную нанокапсулу, и способ получения нанокапсул. Нанокапсула содержит жидкую масляную сердцевину и изготовленную из гидрофобно модифицированного полисахарида оболочку. Способ включает смешивание водной и масляной фаз, эмульгирование. Изобретения обеспечивают приготовление биосовместимой, стабильной наноэмульсии без использования низкомолекулярного ПАВ, а также инкапсулирование с высокой эффективностью. 3 н. и 12 з.п. ф-лы, 26 ил., 5 табл., 18 пр.

1. Нанокапсула диаметром менее 1 мкм, проявляющая долговременную стабильность в водных суспензиях, используемая для доставки липофильных соединений, причем указанная нанокапсула содержит:

a) жидкую масляную сердцевину для доставки липофильных соединений, где материал сердцевины выбирают из олеиновой кислоты, изопропилпальмитата, жирных кислот, масел и экстрактов природного происхождения, в особенности льняного масла, соевого масла, арганового масла и/или их смесей;

b) оболочку, изготовленную из гидрофобно модифицированного полисахарида, выбранного из хитозана, олигосахарида хитозана, декстрана, каррагенана, амилозы, крахмала, гидроксипропилцеллюлозы, пуллулана и глюкозаминогликанов.

2. Нанокапсула по п. 1, где степень замещения указанного модифицированного полисахарида гидрофобными цепями изменяется в интервале 0,1-40%.

3. Нанокапсула по п. 1, где глюкозаминогликаны выбраны из гиалуроновой кислоты, гепарансульфата, гепаринсульфата, кератансульфата, сульфата хондроитина, дерматансульфата и их производных, причем наиболее предпочтительными стабилизаторами являются гиалуроновая кислота, хитозан и производные олигосахарида хитозана.

4. Нанокапсула по п. 1, где оболочка указанной капсулы выполнена из гидрофобно модифицированного полисахарида, выбранного из Ну-Сх, CChit-C12 или oCh-C18-sulf,

где Ну-Сх (х=6, или 8, или 12, или 18) представляет собой производное гиалуроната со следующей структурой:

где р является целым числом, выбранным из 2, 3, 5 или 8, m является целым числом, равным 10 для НуС6 и НуС8, 22 для НуС12 и НуС18х или 7 для НуС18, в то время как n является целым числом, равным 472 для НуС6 и НуС8, 460 для НуС12 и НуС18х или 475 для НуС18,

CChit-C12 представляет собой додецильное производное катионно-модифицированного хитозана следующей формулы:

где при условии молярной массы, равной 100000 г/моль, величина m является целым числом, равным примерно 200, n является целым числом, равным 6, и р является целым числом, равным 88,

oCh-C18-sulf представляет собой октадецильное производное анионно-модифицированного олигосахарида хитозана, описываемого следующей структурой:

где m является целым числом, равным 9, n является целым числом, равным 1, и р является целым числом, равным 5.

5. Нанокапсула по п. 1, где оболочка указанной капсулы покрыта пленкой полиэлектролита, состоящей из биосовместимого полиэлектролита или его производного природного происхождения, выбранного из производных хитозана, декстрана, крахмала, гидроксипропилцеллюлозы и глюкозаминогликанов, и синтетических полиэлектролитов, выбранных из поли-L-лизина, полиорнитина, поли(D-глутаминовой кислоты), производных поли(молочной кислоты), полистиролсульфоната, поли(диаллилдиметиламмония хлорида), полиаллиламина гидрохлорида или полиэтиленимина.

6. Нанокапсула по п. 5, где глюкозаминогликаны выбраны из гиалуроновой кислоты, гепарансульфата, гепаринсульфата, кератансульфата, сульфата хондроитина, дерматансульфата и их производных, причем наиболее предпочтительными стабилизаторами являются гиалуроновая кислота, хитозан и производные олигосахарида хитозана.

7. Нанокапсула по п. 1, где в инкапсулированном виде в жидкой масляной сердцевине эффективно доставляются флуоресцентный краситель, витамин или активное фармацевтическое начало.

8. Водная суспензия для доставки липофильных соединений, содержащая нанокапсулы по пп. 1-5.

9. Водная суспензия по п. 8, содержащая нанокапсулы, отформованные на жидких масляных сердцевинах, стабилизированные гидрофобно модифицированными полисахаридами.

10. Способ получения нанокапсул для доставки липофильных соединений, включающий в себя следующие стадии:

a) смешивание водной и масляной фаз в соотношении об./об., изменяющемся в интервале от 10:1 до 10000:1, предпочтительно - 100:1;

b) механическое, то есть путем перемешивания или взбалтывания, или ультразвуковое эмульгирование; водная фаза представляет собой раствор гидрофобно модифицированного полисахарида, выбранного из хитозана, олигосахарида хитозана, декстрана, каррагенана, амилозы, крахмала, гидроксипропилцеллюлозы, пуллулана и глюкозаминогликанов, таких как гиалуроновая кислота, гепарансульфат, гепаринсульфат, кератансульфат, сульфат хондроитина, дерматансульфат, и их производных, имеющий значение рН в интервале 2-12, концентрацию 0,1-30 г/л и ионную силу в интервале 0,001-3 М, при этом масляную фазу выбирают из олеиновой кислоты, изопропилпальмитата, жирных кислот, PROVINOL, масел и экстрактов природного происхождения, в особенности льняного масла, соевого масла, арганового масла и/или их смесей, при этом указанный способ осуществляют без применения низкомолекулярных ПАВ.

11. Способ по п. 10, где ультразвуковую обработку проводят от 15 минут до 2 часов при температуре от 4 до 40°С, предпочтительно - от 30 до 60 минут при температуре в интервале 20-35°С, особенно рекомендуется обработка в течение 30 минут при комнатной температуре.

12. Способ по п. 10, где ультразвуковую обработку проводят во включенном режиме и ультразвуковые импульсы в два раза короче паузы между ними.

13. Способ по п. 10, где указанные нанокапсулы покрывают свехтонкими пленками полиэлектролитов, полученными послойной методикой, основанной на последовательной адсорбции противоположно заряженных полиэлектролитов, где используют биосовместимый полисахарид или его производное природного происхождения, выбранное из хитозана, декстрана, крахмала, гидроксипропилцеллюлозы и глюкозаминогликанов, и синтетических полиэлектролитов, выбранных из поли-L-лизина, полиорнитина, поли(D-глутаминовой кислоты), производных поли(молочной кислоты), полистиролсульфоната, поли(диаллилдиметиламмония хлорида), полиаллиламина гидрохлорида или полиэтиленимина, с концентрацией в пределах от 0,1 до 30 г/л и ионной силой в интервале от 0,001 до 3 М.

14. Способ по п. 10, где глюкозаминогликаны выбраны из гиалуроновой кислоты, гепарансульфата, гепаринсульфата, кератансульфата, сульфата хондроитина, дерматансульфата.

15. Способ по п. 10, где инкапсулированное гидрофобное соединение растворяют в масляной фазе.