СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГОМОЛОГА МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ Российский патент 2020 года по МПК A01H1/04 

Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности к генетико-селекционным методам и может использоваться в селекции для создания исходного материала.

Создание гомологов является важной частью селекционной работы. Гомологи характеризуется тем, что их признаки претерпевают глубокие мутационные изменения, которые и приводят к образованию новых видов, родов и более крупных систематических групп растений. Гомологи могут появляться в природе в результате приспособительной эволюции. Наряду с этим предпринимаются попытки ускоренного получения гомологов и другим путем, включая гибридизацию и использование различных видов мутагенеза.

Известен способ создания гомолога мягкой пшеницы по второй филогенетической ветви при помощи гибридизации голозерной Triticum militinae A^bA^bGG х Ae.tauschii DD и получении Triticum miguschovae A^bA^bGGDD, который позиционируется авторами как гомолог мягкой пшеницы. (Пшеницы мира. - Л.: ВО «Агропромиздат». - 1987. - С. 15-16.)

Недостатком данного способа является то, что созданная, как гомолог мягкой пшеницы, Triticum aestivum A^uA^uBBDD по второй филогенетической ветви Triticum miguschovae A^bA^bGGDD, в отличие от мягкой пшеницы, не реализуется вклад одного из трех ее элементарных геномов (Романов Б.В., Лимонов К.И. Феномогеномика продукционных признаков видов пшеницы. п. Персиановский. - 2018. - С. 141-149). К тому же Triticum miguschovae существенно отличается от настоящей Triticum aestivum фенотипически, тогда как полная гомология подразумевает одинаковый или близкий фенотипический эффект (Медников Б.М. Современное состояние вида и видообразования. В кн. Вавиловское наследие в современной биологии. - М.: Наука, 1989. - С. 136). То есть Triticum miguschovae не может считаться в полной мере гомологом мягкой пшеницы.

Известен способ получения из Triticum spelta (гомолог Triticum kiharae) мягкой пшеницы Triticum aestivum после гамма облучения на гамма поле. То есть, в принципе, таким образом можно получить гомолог мягкой пшеницы из Triticum kiharae, проведя его гамма облучение. (Пухальский А.В., Максимов И.Л. О появлении зеленой окраски зерна у озимой пшеницы. - Бюллетень ВИР.- 1980, вып.99. - С. 3-6.).

Недостатком такого способа является то, что для получения «мягкой пшеницы» (гомолога) необходимо сложное и дорогостоящее оборудование -гамма-излучатель для создания гамма поля.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ создания полного гомолога мягкой пшеницы Triticum aestivum L. A^uA^uBBDD по второй филогенетической ветви, включающий обработку, предварительно замоченных набухших семян Triticum kiharae (гомолог Triticum spelta) химическим реагентом - супермутагеном N-HMM (нитрозо-метилмочевина), промывание и высевание семян (Романов Б.В., Пимонов К.И. Феномогеномика продукционных признаков видов пшеницы. Монография. - п. Персиановский, 2018. - С. 148-158) - прототип.

Недостатками прототипа являются высокая агрессивность и стоимость химического супермутагена N-HMM, трудности с его приобретением, транспортировкой, хранением, необходимость обеспечения специальной защиты для работающего персонала и условий утилизации оборудования (колбы, мензурки, растильни и т.д.).

Из анализируемого уровня техники явно следует потребность в разработке способа получения гомолога, альтернативного уже существующим, который бы не имел вышеуказанных недостатков и обеспечивал создание условий для реализации вклада третьего элементарного диплоидного генома у гексаплоидного Triticum kiharae, т.е. получение на базе их генотипов гомологичной мягкой пшенице формы - гомолог.

В селекционной практике привлечение представителей второй филогенетической ветви пшениц с геномами A^bA^bGG и A^bA^bGGDD, которые выделяются высоким иммунным статусом, крайне затруднителен из-за их генетической несовместимости с другими пшеницами.

Попытки использовать в гибридизации Triticum aestivum A^uA^uBBDD тетраплоидной Triticum timopheevii A^bA^bGG, обладающей комплексной устойчивостью к грибковым заболеваниям, малорезультативны, поскольку сопряжены с массой проблем возникающих при скрещивании.

Ценность гомолога мягкой пшеницы в том, что он фенотипически и генотипически, приближен к мягкой пшенице, и, тем не менее, сохраняет свойства представителей второй филогенетической ветви пшеницы, обладающей комплексной устойчивостью к грибковым заболеваниям. Гомолог легче скрещивается с мягкой пшеницей, но, в то же время, имея несколько отличающийся генетический материал, может дать при гибридизации гетерозисный эффект и возможность реализации в таких гибридным формах высоких иммунных показателей, характерных для представителей второй филогенетической ветви.

Задачей изобретения является разработка способа, позволяющего создавать новый селекционный материал в виде гомолога мягкой пшеницы, с высокими иммунными показателями при одновременном снижении себестоимости и безопасности путем применения мутагена растительного происхождения.

Поставленная задача достигается тем, что, что семена Triticum kiharae обрабатывают колхицином концентрации 0,05% в экспозиции 12 часов.

Технический результат заключается в обеспечении возможности получения гомологичной мягкой пшеницы Triticum aestivum L. A^uA^uBBDD формы (гомолог) по второй филогенетической ветви пшениц из Triticum kiharae с сохранением трехфеномного уровня продукционных признаков, фенотипически повторяющего мягкую пшеницу.

Технический результат достигается путем макромутационного преобразования исходного вида в мягкоподобную пшеницу при повышении экономичности и безопасности способа по сравнению с прототипом за счет применения колхицина (мутаген растительного происхождения), который доступнее, дешевле и безопаснее химического супермутагена N-HMM.

Существенным отличительным признаком изобретения в сравнении с прототипом является то, что разработаны новые условия получения гомолога с высокими иммунными показателями путем обработки Triticum kiharae мутагеном растительного происхождения, в качестве которого используют колхицин концентрации 0,05% в экспозиции 12 часов.

Анализ информационных источников, найденных при проведении патентных исследований, показал, что использование колхицина в селекции для различных целей в селекции известно. (Гуляев Г.В. Генетика. М.: Колос. - 1977. - С. 201.; Абрамова З.В., Карлинский О.А. Практикум по генетике. - Л.: Колос. - 1979. - С. 99).

Объекты обработки колхицином: прорастающие и не прорастающие семена, проростки и всходы, распускающиеся цветочные почки, растущие листья и хвоя, точки роста корней и ветвей, нарезанные зеленые и одревесневшие черенки перед укоренением, срезанные ветви при искусственном опылении на срезанных ветвях, сеянцы и саженцы при их контейнерном выращивании в теплицах, свободно растущие деревья и кустарники и т.д. (Найдено в Интернете: https://studopedya.ru/2-8040.html, дата обращения 10.07.2019).

Известен способ использования колхицина для получения полиплоидов, включающий обработку семян путем замачивания в водных растворах, как правило, низких (0,1-0,2%) концентрациях в экспозиции 12-24 (и до 48) часов. Во всех схемах обработки, по ее завершении, рекомендуется семена промыть в дистиллированной воде, подсушить и высеять. (Найдено в Интернете: https://studopedya.ru/2-8040.html, дата обращения 02.07.2019).

Известен способ получения гаплоидов с применением реагентов. (Найдено в Интернете: https://studopedya.ru/2-8040.html, дата обращения 02.07.2019.)

Известно применение колхицина для плодовых и ягодных растений, у которых обрабатывают семена, проростки, молодые сеянцы, точки роста побегов и т.д. В результате таких обработок в большинстве случаев получают химерные растения разных типов, а иногда и гомогенные полиплоидные формы. (Найдено в Интернете: https://vniispk.ru/pages/activities/science-activities/physical-chemical-influence/p-ch-7, дата обращения 02.07.2019).

Характеристика Triticum kiharae. Является гомологом Triticum spelta (A^uBD) и имеет в своем генотипе все гены иммунитета, характерные для Triticum timopheevii (A^bG). Triticum miguschovae (A^bGD), синтезирован как гомолог мягкой пшеницы. (Пшеницы мира. Л.: ВО «Агропромиздат», Ленинградское отделение, 1987. - С. 15). Доказано, что у спельтоидных пшениц, включая искусственно созданный гомолог Triticum kiharae A^bA^bGGDD, в формировании хозяйственно ценных количественных признаков не задействован вклад одного из трех элементарных диплоидных геномов. (Романов Б.В. Лимонов К.И. Феномогеномика продукционных признаков видов пшеницы. - п. Персиановский. - С. 141-149).

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации, содержащим сведения об аналогах заявленного изобретения, позволил установить, что в анализируемых объектах не обнаружены признаки заявляемого изобретения, а из перечня выявленных аналогов подобран прототип, как наиболее близкий по совокупности признаков и достигаемому результату, что позволило определить отличительные признаки заявляемого технического решения. По мнению заявителя, заявленное изобретение соответствует критерию «новизна».

Предлагаемое техническое решение не следует явным образом из известного уровня техники, в известных источниках не выявлены способы применения колхицина для получения гомолога мягкой пшеницы, а также его свойство влиять на задействование вклада одного из трех элементарных диплоидных геномов для формирования хозяйственно ценных количественных признаков, поэтому оно соответствует критерию «изобретательский уровень». Каждый существенный признак заявляемого способа связан с техническим результатом.

Описание сущности способа. Предварительно замоченные и набухшие семена Triticum kiharae обрабатывают колхицином концентрации 0,05% в экспозиции 12 часов. Затем после промывки семена высевают под зиму, для усиления мутагенного эффекта. Полученные растения оценивают и осуществляют отбор визуально по фенотипическим признакам. Оптимальные количественные признаки изобретения определены путем проведения научных экспериментов. Для доказательства получения гомолога использовали сравнительный анализ по двум методикам: видов-гомологов, сделав упор на его фенотипическое сходство с представителями Triticum aestivum, и показатель коэффициента удельной продуктивности (Куп), по которому он четко на уровне показателей мягкой пшеницы. Следует отметить, что коэффициент удельной продуктивности (Куп) у спельтоидных форм, включая Triticum kiharae варьировал от 0,49 до 0,53, а мягкой пшеницы от 0,73 до 0,82. (Б.В. Романов, К.И. Пимонов Феномогеномика продукционных признаков видов пшеницы. - п. Персиановский. - 2018. - С. 143-144). Более того, у некоторых сортообразцов мягкой пшеницы коэффициент удельной продуктивности (Куп) может быть выше 1,0.

Материалы, объясняющие сущность изобретения, представлены на фотографиях, как основной вид поясняющих материалов - фиг. 1-5.

Фиг.1 - показаны колосья растения 3-го поколения (С₃) с «голубой» окраской или сизым восковым налетом; фиг. 2 - представлен главный колос с растения с тремя продуктивными колосьями (С₄); фиг. 3 - колосья гомологичной мягкой пшенице формы (гомолог) из Triticum kiharae после уборки; фиг. 4 - колосья и колоски исходного Triticum kiharae и полученного из него гомолога мягкой пшеницы пятого поколения, под номерами - 1 - Triticum kiharae, 2 -гомолог; фиг. 5 - колосья, под номерами: 1 - Triticum spelta (A^uBD) остистая, 2 - Triticum spelta безостая, 3 - Triticum kiharae (A^bGD), 4 - Triticum aestivum остистая, 5 - Triticum aestivum безостая, 6 - полученный гомолог мягкой пшеницы.

Пример. Способ получения гомолога был осуществлен обработкой семян исходного материала Triticum kiharae A^bA^bGGDD. Набухшие семена Triticum kiharae обрабатывали 0,05% раствором колхицина в экспозиции 12 часов. Затем после промывки семена посеяли под зиму, для усиления мутагенного эффекта. Оценивали полученные растения и отбирали визуально по фенотипическим признакам. В С₃ было обнаружено растение с «голубой» окраской или сизым восковым налетом (фиг. 1). Из дозревших колосьев этого растения получено 5 зерновок, из которых в посеве 2016-2017 гг. в С₄ выжило и дало потомство лишь одно растение с тремя продуктивными колосьями, которые уже больше походили на представителей мягкой пшеницы (фиг. 2). Здесь представлен главный колос растения С₄ в период налива зерна. Видно, что колос растения в большей степени уже походил на мягкую пшеницу, хотя его родство с Triticum kiharae вполне просматривается, в частности, таким же опушением колоса. На фото (фиг. 3) колосья гомологичной мягкой пшенице формы (гомолог) из Triticum kiharae после уборки. Видно, что они по своему внешнему облику уже существенно приближаются к мягкой пшенице. Колосья были полностью фертильными. В колосках у них было не по две зерновки, что характерно для исходного Triticum kiharae, а во многих колосках, особенно в середине колоса, уже по три - четыре, что имеет место и характерно для мягкой пшеницы. На фото (фиг. 4) представлены колосья и колоски исходного Triticum kiharae (1) и полученного из него гомолога мягкой пшеницы пятого поколения (2). Здесь вполне видны различия между исходным Triticum kiharae и полученным гомологом по строению колоса, колоскам и по форме зерновок. Так, колос у гомолога более широкий. Ости у него расходятся, что присуще мягким пшеницам. Колоски намного шире, чем у Triticum kiharae, что связано с большим количеством зерновок в них. Они по форме вполне похожи на зерновки мягкой пшеницы, тогда как у исходной формы они более вытянутые и не такие округлые.

Можно сделать объективный вывод о том, что получен гомолог именно из Triticum kiharae, так как присутствуют характерные для обоих признаки. Ости у гомолога также имеют темный цвет, хотя заметно, что кончики светлее. Достаточно отчетливо выражено опушение колосьев у гомолога, что характерно и для Triticum kiharae. Хорошо просматривается такая же нервация на колосковых чешуйках, как и у Triticum kiharae.

Для объективности доказательств полученного гомолога использовали два метода: 1) сравнение гомолога и исходной формы Triticum kiharae, в соответствующих фенотипических рядах, с видами гомологами Triticum aestivum и Triticum spelta, согласно закону гомологических рядов наследственной изменчивости; 2) сравнительный анализ по коэффициенту удельной продуктивности (Куп), соответствующих гомологичных образцов («Способ отбора растений пшеницы с высокой продуктивностью», патент №2443104, МКИ А01Н 1/04. Опубл. 27.02.2012, Бюл. №6).

Что немаловажно, если расположить Triticum kiharae и полученный из него гомолог мягкой пшеницы в соответствующих фенотипических рядах, согласно закону гомологических рядов (фиг. 5), то визуально очевидно внешнее сходство колосьев. Triticum spelta (A^uBD) остистой (1) и безостой (2), а также гомологичной им Triticum kiharae (A^bGD) (3), составляющих один фенотипический ряд, а полученный гомолог (6) вполне вписывается в ряд с мягкими пшеницами (4, 5). То есть, Triticum kiharae, являющийся гомологом Triticum spelta, фенотипически близок к последним, также, как и полученный гомолог (6), к представителям мягкой пшеницы (Triticum aestivum A^uBD). Кроме того, если обратимся к коэффициенту удельной продуктивности (Куп), то он у гомолога на уровне представителей мягкой пшеницы (таблица). Таким образом коэффициент удельной продуктивности (Куп) также подтверждает факт создания гомолога мягкой пшеницы.

Проблема получения исходного материала всегда являлась приоритетной в селекции сельскохозяйственных растений. На современном этапе все острее ощущается его недостаток при создании новых сортов, отвечающих практическим требованиям. Причем, он касается, прежде всего, дефицитных признаков: источников устойчивости к важнейшим заболеваниям и стрессовым факторам. Ценность полученного гомолога, как исходного материала, в том, что, во-первых, благодаря определенному внешнему сходству с мягкой пшеницей он будет легче скрещиваться с образцами Triticum aestivum, во-вторых, все же отличающийся генетический материал от истинных мягких пшениц, усилит определенные показатели таких гибридных форм.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения гомологичной мягкой пшеницы Triticum aestivum L. A^uA^uBBDD формы - гомолог - по второй филогенетической ветви пшеницы из T.kiharae A^bA^bGGDD. Для этого семена последней обрабатывали колхицином концентрации 0,05% в экспозиции 12 часов, затем растения высевали под зиму. В С₃ обнаружили мутантное растение, отличающееся по цвету от растений исходного T.kiharae, из которого в последующем получен гомолог. Получены растения гомолога (пятое поколение после обработки), которые фенотипически близки образцам мягкой пшеницы. Проявляя фенотипическое сходство с мягкой пшеницей, гомолог сохранил некоторые черты исходной T.kiharae. 5 ил., 1 табл.

Способ получения гомолога мягкой пшеницы, включающий обработку набухших семян раствором мутагена, влияющего на макромутационные преобразования исходного вида, промывание и высевание обработанных семян, отличающийся тем, что семена обрабатывают растительным алколоидом, в качестве которого используют колхицин концентрации 0,05% в экспозиции 12 часов.