Способ получения дигаплоидных растений озимой пшеницы Российский патент 2024 года по МПК A01H1/00 

Изобретение относится к области сельскохозяйственной биотехнологии, в частности прикладным исследованиям, связанным с созданием новых сортов и гибридов. Способ может быть востребован образовательными и научными учреждениями биотехнологического и сельскохозяйственного профиля, семеноводческими компаниями и селекционными станциями.

Существуют публикации и патенты на изобретения, в которых предлагается использовать удаленную гибридизацию (Патент WO 2005084420 (2005-09-15), Kasha K.J. and Као K.N., 1970, Mujeeb-Kazi A. and Riera-Lizarazu О., 1996), женский гаметофит (Патент JPH 0698648 (1994-04-12), Keller Е. and Korzun L. 1996)), культуру пыльников (Патенты US 5770788 А (1995-06-06), US 6362393 В1 (1999-08-26)) и культуру микроспор (Патенты KR 100952103 (2009-07-01), WO 2002052926 A3 (2002-01-02), SUS 6764854 В2 (2004-07-20). Из-за сложности получения дигаплоидных растений все работы описывают решение какой-либо отдельной проблемы, применимой для конкретного сорта или вида растения, как правило овощных и некоторых зерновых. Способа, адаптированного конкретно под озимую пшеницу не разработано.

В настоящее время существует несколько патентов по способу получения дигаплоидных растений. Однако предлагаемые в них методы разработаны и подходят только для таких культур как перец (Capsicum annuum L.) (Патент KR 100952103 (2009-07-01)) и кукуруза (Zea mays L.) (WO 2002052926 A3 (2002-01-02)), рис (SUS 6764854 B2 (2004-07-20)).

Предлагаемый нами способ позволяет получать гаплоидные растения озимой мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.) с повышенным выходом дигаплоидных растений на 10-12%, по сравнению с общепринятыми методами.

Задача изобретения - улучшение технологии получения дигаплоидных растений, адаптированной для озимой мягкой пшеницы. Технический результат достигается благодаря оптимальному для озимой мягкой пшеницы сочетанию физических факторов и концентраций фитогормонов и витаминов, позволяющих увеличить выход дигаплоидных растений.

Пшеница является одной из важнейших сельскохозяйственных культур, в селекции которой использование технологии удвоенных гаплоидов может быть весьма эффективно. Использование удвоенных дигаплоидов позволяет существенно сократить время селекционного процесса и повысить его эффективность за счет получения гомозиготных, нерасщепляющихся форм уже на ранних его этапах (Maluszynski М. et al. 2003).

Способ включает следующие этапы:

I. Получение эмбриоидов.

1. Колосья донорных растений, соответствующие фенотипическим критериям, срезают в поле в фазу начала колошения, когда пыльники в цветках еще зеленые, несозревшие. Срезание колосьев растений-доноров проводят в одно и тоже время суток для всех партий. Срезанные колосья без флагового листа размещают в охладительную камеру (контейнер + аккумулятор холода) для поддержания постоянной пониженной температуры при транспортировке с поля в лабораторию, что будет способствовать лучшей сохранности пыльников (на 8-10%) для последующей инокуляции их на питательную среду.

2. Транспортированные с поля колосья вначале помещают в воду и выдерживают сутки в холодильнике при +4±1°С для поддержания высокого тургора. Затем выдержанные колосья упаковывают в полиэтиленовый пакеты и оставляют на 7 суток для индукции андроклинии. Данный способ позволяет снизить загнивание растений и повысить выход пригодных к гаплоиндукции пыльников.

3. Перед извлечением пыльников из обработанных холодом колосьев донорных растений проводят их поверхностную стерилизацию мыльным раствором не менее 5 минут. Затем колосья трехкратно промывают автоклавированной дистиллированной водой.

4. Для основной стерилизации колосья пшеницы помещают в 30%-ный раствор гипохлорита натрия и выдерживают 3-4 мин. Затем раствор сливают, а колосья промывают трехкратно в стерильной дистиллированной воде и переносят в чашки Петри на фильтровальную бумагу.

5. От каждого донорного растения инокулируют на индукционную питательную среду только 3 пыльника каждого нижнего цветка 5-ти колосков средней трети колоса, находящиеся в одном периоде развития (всего 15 пыльников от каждого донорного растения).

6. Под бинокулярной лупой, придерживая пинцетом колос, отгибают колосковые чешуи и извлекают пыльники (поврежденные удаляют), которые быстро переносят в чашки Петри с модифицированной агаризованной средой МС, слегка вдавливая для лучшего контакта со средой. Культуры инкубируют при повышенной температуре 27°С без доступа света в течение 21-24 суток.

Повышенная температура способствует образованию напрямую эмбриоидных структур, и более высокому выходу из них гаплоидных растений (на 2%) по сравнению со стандартным температурным режимом (23-25°С).

II. Получение растений-регенерантов.

1. Для индукции формирования растения-регенеранта полученные эмбриоиды в течение 1 суток с момента появления на поверхности пыльника в стерильных условиях ламинарного бокса переносят на модифицированную питательную среду для регенерации, содержащую по 1,0 мг/л БАП и 0,2 мг/л индолил-3-уксусной кислоты (ИУК).

2. Пробирки размещают в условия: температура +9 … +11°С, 16-часовой фотопериод, освещенность 20 тыс. люкс. В таких условиях образуется андроклинные растения-регенеранты. Полученные растения выращивают в пробирках до образования 3-4 боковых побегов.

3. Андроклинные растения-регенеранты пшеницы, в фазе образования 3-4 боковых побегов извлекают из пробирок и подвергают цитогенетическому контролю, состоящему в подсчете количества хромосом (n) в метафазных пластинках клеток кончика одного из корней. Такой контроль принципиально необходим, поскольку в условиях культуры in vitro неизбежно возникает определенный процент растений-регенерантов с диплоидным количеством хромосом из-за образования эмбриоидных структур из диплоидных клеток тканей пыльника. Отбирают только гаплоидные (n=21) особи.

4. Извлеченные из пробирок гаплоидные растения отмывают вначале водопроводной водой для удаления остатков питательной среды, а затем кончики корней промывают аккуратно, не повреждая, в автоклавированной дистиллированной воде. Это позволит удалить максимально остатки питательной среды, которая может снизить эффективность действия колхицина при дигаплоидизации.

5. Для дигаплоидизации кончики корней погружают в 0,2% раствор колхицина на 5 часов. После выдержки кончики корней опускают в дистиллированную воду для снятия токсического действия колхицина и повышения приживаемости растений (на 5-7%). Растения-регенеранты вновь подвергают цитогенетическому контролю.

III. Адаптация.

1. 1-й этап адаптации (мягкая).

Отобранные дигаплоидизированные (n+n=42) растения переносят в условия ex vitro в кассеты для рассады со специально подобранным субстратом, состоящим из торфа (5 части), речного песка (2 часть), вермикулита (1 часть) и размещают в теплице при +17-180С, 16-часовом фотопериоде и освещенности 20 тыс.лк. в течении 20-22 суток.

2. 2-й этап адаптации (закалка).

Перенос укоренившихся растений в кассетах в условия ex vivo, на открытый воздух для адаптации растений к полевым условиям. Выращивание в течение 7-10 дней.

3. Высадка отобранных адаптированных растений в поле и размещение в питомнике дигаплоидов.

Данный способ был использован на трех сортах озимой мягкой пшеницы отечественной селекции. Эффективность сохранности пыльников при предлагаемой холодовой обработке составила 8-10% для всех исследуемых сортов, независимо от генотипа. Выход гаплоидных растений при использовании модифицированных питательных сред и физических условий был выше на 2%. Приживаемость растений-регенерантов повышалась на 5-7%. Таким образом общая эффективность технологии составила от 18-20 дигаплоидных растений на один использованный колос. Это указывает на достаточно высокую эффективность предлагаемого способа.

Изобретение относится к области сельскохозяйственной биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения дигаплоидных растений озимой пшеницы из культивируемых пыльников in vitro, отличающийся тем, что проводят стрессовую обработку колосьев холодом в полевых условиях, в лабораторных условиях размещают их в холодильнике при +4±1°С вначале в воде на 1 день, а затем в полиэтиленовом пакете в течение 7 суток, извлекают пыльники из обработанных холодом колосьев, культивируют выделенные пыльники на модифицированной среде МС для индукции эмбриогенеза, включающей дополнительно 6% крахмала, 0,05 мг/л биотина, 2,0 2,4-Д, при повышенной температуре +27°С, проводят регенерацию растений из эмбриоидов путем культивирования на модифицированной питательной среде, содержащей по 1,0 мг/л БАП и 0,2 мг/л индолил-3-уксусной кислоты, тщательно промывают корни гаплоидных растений пшеницы дистиллированной водой перед обработкой их колхицином для удвоения хромосом и получения дигаплоидных растений, проводят мягкую адаптацию ex vitro в специально подобранном субстрате, состоящем из торфа - 5 частей, речного песка - 2 части, вермикулита - 1 часть, и закалку полученных дигаплоидных растений ex vivo. Эффективность сохранности пыльников при предлагаемой холодовой обработке составила 8-10% для всех исследуемых сортов, независимо от генотипа. Выход гаплоидных растений при использовании модифицированных питательных сред и физических условий был выше на 2%. Приживаемость растений-регенерантов повышалась на 5-7%. Таким образом, общая эффективность технологии составила от 18-20 дигаплоидных растений на один использованный колос. Это указывает на достаточно высокую эффективность предлагаемого способа.

Способ получения дигаплоидных растений озимой пшеницы из культивируемых пыльников in vitro, отличающийся тем, что проводят стрессовую обработку колосьев холодом в полевых условиях, в лабораторных условиях размещают их в холодильнике при +4±1°С вначале в воде на 1 день, а затем в полиэтиленовом пакете в течение 7 суток, извлекают пыльники из обработанных холодом колосьев, культивируют выделенные пыльники на модифицированной среде МС для индукции эмбриогенеза, включающей дополнительно 6% крахмала, 0,05 мг/л биотина, 2,0 2,4-Д, при повышенной температуре +27°С, проводят регенерацию растений из эмбриоидов путем культивирования на модифицированной питательной среде, содержащей по 1,0 мг/л БАП и 0,2 мг/л индолил-3-уксусной кислоты, тщательно промывают корни гаплоидных растений пшеницы дистиллированной водой перед обработкой их колхицином для удвоения хромосом и получения дигаплоидных растений, проводят мягкую адаптацию ex vitro в специально подобранном субстрате, состоящем из торфа - 5 частей, речного песка - 2 части, вермикулита - 1 часть, и закалку полученных дигаплоидных растений ex vivo.