СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ BLV-ИНФЕКЦИИ У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ Российский патент 2021 года по МПК A61B10/00 G09B23/28 C12Q1/70 C12Q1/686 

Изобретение относится к области экспериментальной медицины и может быть использовано для моделирования BLV-инфекции на лабораторных животных с целью изучения механизмов развития инфекционного процесса и возможности управления им.

Bovine leukemia virus (BLV) относится к онкогенным представителям семейства Retroviridae и является возбудителем энзоотического лейкоза крупного рогатого скота (ЭЛ КРС) - широко распространенного во всем мире инфекционного лимфопролиферативного заболевания, которое по данным М. Polat et al. (2017) в ряде стран охватывает более 80% восприимчивого поголовья [7].

Установлено, что заражение ЭЛ КРС происходит чаще всего не вирусом, а инфицированным лимфоцитом, геном которого, содержит интегрированную в хромосому провирусную ДНК [1].

В последние годы появляется все больше сообщений об увеличивающимся генетическом разнообразии BLV, его способности расширять спектр своего тропизма in vivo. В частности, в работах G.C. Buehring et al. (2014, 2015, 2017) представлены доказательства того, что BLV может быть связан с развитием рака молочной железы у женщин [3-5]. По этой причине актуальной является задача изучения патогенеза при BLV-инфекции в гетерологичных восприимчивых к вирусу организмах.

По некоторым данным инфекцию BLV можно воспроизвести на нескольких видах домашних и лабораторных животных [2]. К Boris-Lawrie et al. (1997) было показано, что вирус-продуцирующие клетки и провирусная ДНК являются инфекционными и иммуногенными для лабораторных крыс [6].

Крысы являются приемлемой лабораторной моделью для проведения многих исследований, так как позволяют в кратчайшие сроки с минимальными затратами выполнить многопараметрический анализ на нескольких генерациях животных.

Известен способ заражения экспериментальных животных бластоцистами, отличающийся тем, что лабораторным мышам и крысам через рот однократно вводят взвесь вакуолярных форм бластоцист человека в объеме 0,5-1,0 мл соответственно в концентрации 10⁶-10⁷ мл, полученную из фекалий путем обогащения и последующего фильтрования полученной взвеси через мембрану (заявка №2002114890/13, опубликовано 10.02.2004).

Данный способ не может быть использован для воспроизведения BLV-инфекции путем однократного перорального заражения крыс, так как алиментарный способ заражения возбудителем ЭЛ КРС является эффективным при выпаивании экспериментальным животным вируссодержащего материала 2 раза в день в течение 30 дней [2].

Известен способ моделирования дисбактериоза кишечника у лабораторных животных, заключающийся в том, что воздействуют антибактериальным препаратом гентамицином на кишечную микрофлору, и определяют количество жизнеспособных микроорганизмов кишечной микрофлоры в начале и конце опыта, и сравнивают их численные значения, при этом создают селективное давление антибактериальным препаратом гентамицином при пероральном его введении лабораторным животным 1 раз в сутки в течение 5 дней в дозах, превышающих его суточную терапевтическую дозу при парентеральном введении в 4,8 раза у мышей и в 4 раза - у морских свинок (заявка №2011149501/14, опубликовано 20.03.2013 Бюл. №8).

Данный способ не может быть использован для моделирования BLV-инфекции у лабораторных животных, так как возбудитель ЭЛ КРС не является представителем резидентной микрофлоры организма животных и воспроизведение заболевания не возможно путем управления гомеостазом по средствам лекарственных препаратов, воздействующих на микробиоценоз.

Известен способ моделирования перитонита, включающий введение в брюшную полость животного микробной взвеси Е. coli и В. fragilis, отличающийся тем, что в качестве экспериментальных животных используют самцов крыс линии Wistar в возрасте 6-9 месяцев, которым выполняют лапаротомию, в рану выводят слепую кишку и в бессосудистой зоне области купола слепой кишки проводят разрез серозно-мышечной оболочки длиной до 1 см, затем рану кишки ушивают непрерывным обвивным швом, после чего в брюшную полость вводят взвесь Е. coli и В. fragilis, содержащую по 0,5 мл 10⁹ микробных тел каждого, и лапаротомную рану ушивают (заявка №2019109595, опубликовано 11.03.2020 Бюл. №8).

Недостатками данного способа являются: его трудоемкость и сложность исполнения; необходимость наличия специальных условий и навыков для воспроизведения; большая вероятность развития осложнений и длительный реабилитационный период у экспериментальных животных.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ моделирования кишечного иерсиниоза у экспериментальных животных, включающий следующие стадии:

a) штамм Yersinia enterocolitica выращивают при температуре 24-26°С на агаре Хоттингера;

b) готовят 3 млрд взвесь полученной культуры в хлориде натрия, которую соединяют в соотношении 1:1 с 0,2% раствором агара Нобля;

c) вводят морским свинкам внутрибрюшинно взвесь в объеме 0,5 мл, которая содержит 3×10⁸ микробных клеток Y. enterocolitica в агаризованном растворе хлорида натрия;

d) животных забивают через пять дней, вскрывают, делают мазки-отпечатки из брызжеечных лимфоузлов и выделяют из них пассированную культуру;

e) перед заражением экспериментальных животных проводят снижение кислотности их желудочного сока путем перорального введения 7,5% раствора пищевой соды, белым мышам - 0,1 мл, морским свинкам - 0,5 мл;

f) заражают опытных животных пассированной культурой Y. enterocolitica перорально, причем белым мышам вводят 3×10⁹ микробных клеток, разведенных в 0,2 мл физиологического раствора, а морским свинкам - 3×10⁹ микробных клеток, разведенных в 0,5 мл физиологического раствора;

g) подтверждают кишечный иерсиниоз методом ПЦР после высева из внутренних органов животных на агар Хоттингера с рН 7,2 (заявка №2014132726/14, опубликовано 20.10.2015 Бюл. №29).

Недостатками данного способа являются:

- затраты на культивирование возбудителя в лабораторных условиях для обогащения заразного материала;

- использование перорального способа инфицирования животных с предварительным снижением кислотности их желудочного сока;

- необходимость выводить животных из эксперимента с целью контроля факта их заражения;

- потребность во вскрытии лабораторных животных для подтверждения диагноза;

- применение культурального метода контроля факта заражения лабораторных животных.

Технической задачей является создание доступного по материально-техническому обеспечению, малоинвазивного, быстро воспроизводимого, высокоэффективного, легко контролируемого способа моделирования BLV-инфекции у экспериментальных животных с целью изучения механизмов развития инфекционного процесса и возможности управления им.

Технический результат предлагаемого изобретения заключается в разработке способа получения биологически чистого концентрата, содержащего инфекционную форму возбудителя ЭЛ КРС и применения его для моделирования BLV-инфекции у лабораторных животных с последующим контролем заражения.

Техническая задача решается, а технический результат достигается тем, что свежеполученную стерильную стабилизированную К3 ЭДТА цельную кровь BLV-инфицированного крупного рогатого скота центрифугируют на 1000 об/мин при 25°С в течение 10 минут, образовавшееся между плазмой и эритроцитами кольцо мононуклеаров отбирают стерильным шприцем, 5-6 месячным крысам линии Wistar двукратно с интервалом в 1 неделю внутрибрюшинно вводят extempore полученную фракцию мононуклеаров, разведенную стерильным физиологическим раствором по стандарту мутности МакФарланда (R092B стандарт 1 ед.) в объеме 0,5 мл, контроль заражения осуществляют методом ПЦР с кровью экспериментальных животных.

Предлагаемый способ моделирования BLV-инфекции у экспериментальных животных обеспечивает возможность высокоэффективно воспроизводить и достаточно просто контролировать заражение крыс линии Wistar возбудителем ЭЛ КРС и отличается тем, что является:

- низко затратным, так как не требует специального оборудования и дорогостоящих реактивов для накопления биомассы возбудителя инфекции;

- мало инвазивным, так как отсутствует необходимость выполнения полостных операций для заражения животных;

- быстро воспроизводимым, так как предполагает парентеральный путь инфицирования животных без специальной предварительной подготовки их к заражению;

- обеспечивающим высокую сохранность поголовья экспериментальных животных, так как нет необходимости выводить животных из эксперимента с целью контроля факта их заражения;

- легко контролируемым, так как эффективность заражения подтверждается методом ПЦР с кровью лабораторных животных.

Пример 1. Апробация эффективности разрабатываемого способа моделирования BLV-инфекции у экспериментальных животных.

Исследования проводились в 2019/20 гг. Объектом исследования послужили 5-6 месячные крысы линии Wistar (n=20), которым двукратно с интервалом в 1 неделю внутрибрюшинно вводили стерильную фракцию лимфоцитов BLV-инфицированного крупного рогатого скота, разведенную стерильным физиологическим раствором по стандарту мутности МакФарланда (R092B стандарт 1 ед.) в объеме 0,5 мл. Контрольной группе животных (n=10) вводили аналогичное количество физиологического раствора.

Кровь у экспериментальных крыс отбирали из латеральной хвостовой вены двукратно: через 3 и через 6 месяцев после введения лимфоцитов. Наличие BLV-инфекции у крыс опытной группы устанавливали методом ПЦР на оборудовании Bio-Rad (USA) с использованием набора Лейкоз (ИЛС, Россия). По результатам ПЦР исследований 100% животных экспериментальной группы были инфицированы BLV. В то время как все животные контрольной группы были BLV-негативны.

Пример 2. Апробация эффективности разрабатываемого способа моделирования BLV-инфекции у экспериментальных животных с целью изучения механизмов развития инфекционного процесса.

Исследование общего анализа крови экспериментальных животных (см. пример 1) выполняли на гематологическом анализаторе автоматического типа PCE-90VET (USA). Осуществление биохимического анализа крови выполняли на биохимическом анализаторе полуавтоматического типа BioChemSA (USA) с использованием реагентов линии Диакон-ДС (АО «ДИАКОН-ДС», Россия).

При сравнительной оценке данных гематологических исследований ориентировались на референсные значения для крыс линии Wistar, эталонными считали результаты исследований контрольных групп.

Общий анализ крови крыс выявил выраженный в той или иной степени лимфолейкоз у 75% животных опытной группы и лейкоцитоз со сдвигом нейтрофильного ядра влево. Количество лимфоцитов крови крыс опытной группы было на 17-36% больше, чем у животных контрольной группы, лейкоцитов - в среднем на 30%, при этом количество сегментоядерных нейтрофилов возрастало в среднем на 39%. У животных опытной группы присутствовали признаки эритроцитарной аплазии, гемолитической или апластической анемии. У отдельных животных отмечали маркеры аллергии.

При биохимическом исследовании крови крыс опытной группы было выявлено снижение общего белка у животных в среднем на 9%, при этом уровень альбуминовой фракции снижался наиболее значительно - на 24-25%) по сравнению с контрольной группой. Кроме того, у некоторых крыс опытной группы несколько возрастали содержание креатинина и активность аминотрансфераз в сыворотке крови. Через 6 месяцев после заражения было выявлено повышение содержания билирубина в крови крыс опытной группы в 2,7-3,2 раз по сравнением с контролем. А также значительное увеличение содержания не только креатинина, но и мочевины крови. На фоне роста активности печеночных ферментов было отмечено увеличение коэффициента де Ритиса (в 3-5 раз).

Таким образом, заявленное изобретение является не дорогостоящим и доступным в материально-техническом отношении, отличающимся низкой травматичностью для экспериментальных объектов, легко воспроизводимым и высокоэффективным способом моделирования BLV-инфекции на лабораторных животных в короткие сроки. При этом контроль заражения показывает, что инфекция воспроизводится у 100% экспериментального поголовья и сопровождается характерными для BLV изменениями в крови животных, что позволяет рекомендовать разрабатываемый способ для изучения механизмов развития инфекционного процесса и возможности управления им.

Предложенный способ апробирован с положительными результатами и регулярной воспроизводимостью этих результатов в 2019/20 гг.на крысах линии Wistar.

Список литературы

1. Иммуноморфологические изменения, сопровождающие развитие гемобластозов человека и животных / П.Н. Смирнов, В.В. Храмцов, С.Н. Магер [и др.] // Инновации и продовольственная безопасность. - 2017. - №4 (18).-С. 39-50.

2. Межвидовая передача вируса лейкоза крупного рогатого скота в эксперименте / М.И. Гулюкин, Н.Г. Козырева, Л.А. Иванова [и др.] // Вопросы вирусологии. - 2015. - Т. 60. - №5. - С. 32-37.

3. Bovine leukemia virus DNA in human breast tissue / G.C. Buehring, H.M. Shen, H.M. Jensen [et al.] // Emerging Infectious Diseases. -2014. -N. 20. -P. 772-782.

4. Bovine leukemia virus linked to breast cancer in Australian women and identified before breast cancer development / G.C. Buehring, H. Shen, D.A. Schwartz [et al.] // PLoS One. - 2017. - N. 12(6). - P. e0179367.

5. Exposure to bovine leukemia virus is associated with breast cancer: A case-control study / G.C. Buehring, H.M. Shen, H.M. Jensen [et al.] // PLOS One. - 2015. - N. 10(9). - P. e0134304.

6. In vivo study of genetically simplified bovine leukemia virus derivatives that lack tax and rex / K Boris-Lawrie, V Altanerova, С Altaner [et al.] // J Virol. - 1997 - No 71(2).-P. 1514-1520.

7. The molecular epidemiological study of bovine leukemia virus infection in Myanmar cattle / M. Polat, H.H. Мое, Т. Shimogiri [et al.] // Arch Virol. - 2017. - V. 162. - P. 425-437.

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной медицине, и может быть использовано для моделирования BLV-инфекции у экспериментальных животных. Осуществляют внутрибрюшинное введение 5-6-месячным крысам линии Wistar свежеприготовленной фракции мононуклеаров крови BLV-инфицированного крупного рогатого скота. Свежеполученную стерильную стабилизированную К3 ЭДТА цельную кровь BLV-инфицированного крупного рогатого скота центрифугируют на 1000 об/мин при 25°С в течение 10 минут. Образовавшееся между плазмой и эритроцитами кольцо мононуклеаров отбирают стерильным шприцем, разводят стерильным физиологическим раствором по стандарту мутности МакФарланда (R092B стандарт 1 ед) и вводят крысам двукратно с интервалом 1 неделя в объеме 0,5 мл. Контроль заражения осуществляют методом ПЦР с кровью экспериментальных животных. Способ обеспечивает возможность малоинвазивного, быстро воспроизводимого, высокоэффективного, легко контролируемого моделирования BLV-инфекции у крыс за счет получения биологически чистого концентрата, содержащего инфекционную форму возбудителя энзоотического лейкоза крупного рогатого скота, и применения его для моделирования BLV-инфекции у лабораторных животных с последующим контролем заражения. 2 пр.

Способ моделирования BLV-инфекции у экспериментальных животных, включающий внутрибрюшинное введение 5-6-месячным крысам линии Wistar свежеприготовленной фракции мононуклеаров крови BLV-инфицированного крупного рогатого скота, отличающийся тем, что свежеполученную стерильную стабилизированную К3 ЭДТА цельную кровь BLV-инфицированного крупного рогатого скота центрифугируют на 1000 об/мин при 25°С в течение 10 минут, образовавшееся между плазмой и эритроцитами кольцо мононуклеаров отбирают стерильным шприцем, разводят стерильным физиологическим раствором по стандарту мутности МакФарланда (R092B стандарт 1 ед) и вводят крысам двукратно с интервалом 1 неделя в объеме 0,5 мл, а контроль заражения осуществляют методом ПЦР с кровью экспериментальных животных.