ЭФФЕКТИВНОСТЬ КОНЪЮГАТОВ АНТИТЕЛА ПРОТИВ TROP-2 С ЛЕКАРСТВЕННЫМ СРЕДСТВОМ SN-38 ДЛЯ ТЕРАПИИ РЕЦИДИВИРУЮЩИХ/РЕФРАКТЕРНЫХ К ИНГИБИТОРАМ КОНТРОЛЬНОЙ ТОЧКИ ОПУХОЛЕЙ Российский патент 2020 года по МПК A61K31/337 A61P35/00 

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[01] Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно §119(е) Раздела 35 Свода законов США по предварительной заявке на патент США 62/328289, поданной 4 апреля 2016 г., содержание которой полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[02] Настоящая заявка включает перечень последовательностей, поданный в формате ASCII через EFS-Web и включенный в настоящий документ полностью посредством ссылки. Указанная копия в формате ASCII, созданная 5 апреля 2017 г., имеет название IMM366WO2_SL.txt. и размер 13 002 байта.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[03] Настоящее изобретение относится к терапевтическому применению конъюгатов антитела с лекарственным средством (ADC), содержащих антитела против Trop-2 или их антигенсвязывающие фрагменты, и камптотецины, такие как SN-38, с улучшенной способностью к нацеливанию на различные раковые клетки у субъектов-людей. Согласно предпочтительным вариантам реализации указанные антитела и терапевтические фрагменты соединены расщепляемой внутриклеточной связью, что увеличивает терапевтическую эффективность. Согласно более предпочтительным вариантам реализации указанные ADC вводят в определенных дозировках и/или согласно определенным схемам введения, которые оптимизируют терапевтический эффект. Неожиданным образом, оптимизированные дозировки и схемы введения конъюгированных с SN-38 антител, таких как сацитузумаб говитекан, демонстрируют неожиданную более высокую эффективность, которая не могла быть предсказана на основании исследований в моделях на животных, позволяющую проводить эффективное лечение раковых заболеваний, устойчивых к антителам - ингибиторам контрольной точки, таким как атезолизумаб, пембролизумаб, ниволумаб, пидилизумаб, дурвалумаб, атезолизумаб, ипилимумаб или тремелимумаб. Согласно конкретным вариантам реализации указанный ADC можно вводить субъекту-человеку с Trop-2-положительным раком в дозировке от 3 до 18 мг/кг, более предпочтительно от 4 до 12 мг/кг, наиболее предпочтительно от 8 до 10 мг/кг. Неожиданным образом, указанные конъюгаты антитела с лекарственным средством (ADC) анти-Trop-2-SN38 эффективны для лечения Trop-2-положительных раковых заболеваний у пациентов, у которых произошел рецидив после терапии ингибитором контрольной точки или продемонстрировавших устойчивость к терапии ингибитором контрольной точки, таких как рак поджелудочной железы, рак молочной железы с тройным негативным фенотипом, мелкоклеточный рак легкого, рак эндометрия, уротелиальный рак и немелкоклеточный рак легкого.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[04] На протяжении многих лет ученые в области специфической направленной (таргетной) лекарственной терапии работали над применением моноклональных антител (MAb) для специфической доставки токсических агентов в раковые образования человека. Были разработаны конъюгаты опухолеассоциированных MAb и подходящих токсических агентов, однако они имели переменный успех при терапии рака у человека, и практически не находили применения при других заболеваниях, таких как инфекционные и аутоиммунные заболевания. Токсический агент чаще всего представляет собой химиотерапевтическое лекарственное средство, хотя испускающие частицы радионуклиды, или бактериальные или растительные токсины, также конъюгировали с MAb, в частности, для терапии рака (Sharkey, Goldenberg, CA Cancer J Clin. 2006 Jul-Aug; 56(4):226-243) и, недавно, с радиоиммуноконьюгатами для доклинической терапии определенных инфекционных заболеваний (Dadachova, Casadevall, Q J Nucl Med Mol Imaging 2006; 50(3):193-204).

[05] Преимущества применения конъюгатов MAb с химиотерапевтическим лекарственным средством заключаются в том, что (а) структура самого указанного химиотерапевтического лекарственного средства хорошо определена; (b) указанное химиотерапевтическое лекарственное средство соединено с белком MAb с применением очень хорошо определенных химических средств образования конъюгатов, часто в определенных сайтах, отдаленных от антигенсвязывающих областей указанных MAb; (с) конъюгаты MAb с химиотерапевтическим лекарственным средством можно получать с большей воспроизводимостью и они обычно обладают меньшей иммуногенностью, чем химические конъюгаты, содержащие MAb и бактериальные или растительные токсины, и, таким образом, являются более подходящими для коммерческой разработки и одобрения контролирующих органов; и (d) конъюгаты MAb с химиотерапевтическим лекарственным средством обладают на порядки меньшей системной токсичностью по сравнению с конъюгатами радионуклидов с MAb, в частности, в отношении радиационно-чувствительного костного мозга.

[06] Камптотецин (СРТ) и его производные представляют собой класс мощных противоопухолевых агентов. Иринотекан (также называемый СРТ-11) и топотекан представляют собой аналоги СРТ, одобренные в качестве терапевтических средств против рака (Iyer, Ratain, Cancer Chemother. Phamacol. 42: S31-S43 (1998)). СРТ действуют путем ингибирования фермента топоизомеразы I, стабилизируя комплекс топоизомеразы I с ДНК (Liu, et al., в источнике: The Camptothecins: Unfolding Their Anticancer Potential, Liehr J.G., Giovanella, B.C., Verschraegen (eds), NY Acad Sci., NY 922:1-10 (2000)). При получении конъюгатов с СРТ возникают специфические проблемы. Одной из проблем является нерастворимость большинства производных СРТ в водных буферах. Во-вторых, при структурной модификации СРТ для конъюгации (т.е. образования конъюгатов) с макромолекулами возникают специфические трудности. Например, собственно СРТ содержит только третичную гидроксильную группу в кольце Е. Указанная гидроксильная функциональная группа в случае СРТ должна быть связана с линкером, подходящим для последующей конъюгации с белком; и в мощных производных СРТ, таких как SN-38, активный метаболит химиотерапевтического средства СРТ-11, и других содержащих С-10-гидроксил производных, таких как топотекан и 10-гидрокси-СРТ, присутствие фенольного гидроксила в положении С-10 усложняет необходимую дериватизацию С-20-гидроксила. В-третьих, лабильность в физиологических условиях фрагмента 5-лактона кольца Е камптотецинов приводит к значительному снижению противоопухолевой мощности. Соответственно, протокол конъюгации осуществляют таким образом, чтобы значение рН при этом составляло 7 или менее, чтобы избежать раскрытия лактонного кольца. Однако для конъюгации бифункционального СРТ, содержащего аминореактивную группу, такую как активный сложный эфир, как правило, требуется значение рН 8 или более. В-четвертых, предпочтительно включение расщепляемого внутриклеточно фрагмента в линкер/спейсер, соединяющий СРТ с антителами, или в другие связывающие фрагменты.

[07] Существует потребность в более эффективных способах получения и введения конъюгатов антител с СРТ, таких как конъюгаты анти-Trop-2-SN-38 (например, сацитузумаб говитекан). В предпочтительном варианте такие способы включают оптимизированные схемы дозирования и введения, максимизирующие эффективность и минимизирующие токсичность, для применения у пациентов с Trop-2-положительным раком, рецидивирующим после лечения антителами - ингибиторами контрольной точки, или устойчивым к антителам - ингибиторам контрольной точки.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[08] В настоящем документе сокращение «СРТ» может относиться к камптотецину или любому из его производных, такому как SN-38, если явным образом не указано другое. Настоящее изобретение удовлетворяет существующую потребность в данной области техники, обеспечивая улучшенные способы и композиции для получения и введения ADC СРТ-антитело. В предпочтительном варианте камптотецин представляет собой SN-38, а антитело представляет собой антитело против Trop-2 (например, сацитузумаб говитекан). Раскрытые способы и композиции подходят для лечения заболеваний, рефрактерных или хуже реагирующих на другие формы терапии, такие как виды Trop-2+ рака, устойчивые к лечению антителами - ингибиторами контрольной точки, или рецидивирующие после лечения антителами - ингибиторами контрольной точки.

[09] В предпочтительном варианте фрагмент антитела в ADC представляет собой моноклональное антитело, фрагмент антитела, биспецифическое или другое мультивалентное антитело, или другую молекулу или соединение на основе антитела. Указанное антитело может относиться к различным изотипам, предпочтительно -IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека, более предпочтительно - содержать последовательности шарнирных и константных областей IgG1 человека. Указанное антитело или его фрагмент может представлять собой химерное антитело человека-мыши, химерное антитело человека-примата, гуманизированное антитело (каркас человека и гипервариабельные участки (CDR) мыши), или полностью человеческое антитело, а также варианты перечисленного, такие как полуантитела IgG4 (называемые «унителами»), как описано в источнике: Van der Neut Kolfschoten et al., Science 2007; 317:1554-1557. В более предпочтительном варианте указанное антитело или его фрагмент может быть сконструирован(о) или выбран(о) таким образом, чтобы содержать последовательности константной области человека, принадлежащие к специфическим аллотипам, что может приводить к пониженной иммуногенности при введении указанного ADC субъекту-человеку. Предпочтительные аллотипы для введения включают аллотип, не являющийся аллотипом G1m1 (nG1m1), такой как G1m3, G1m3,1, G1m3,2 или G1m3,1,2. В более предпочтительном варианте аллотип выбран из группы, состоящей из аллотипов nG1m1, G1m3, nG1m1,2 и Km3.

[010] Примером антитела против Trop-2 является гуманизированное антитело RS7 (hRS7), содержащее последовательности CDR легкой цепи CDR1 (KASQDVSIAVA, SEQ ID NO: 1); CDR2 (SASYRYT, SEQ ID NO: 2); и CDR3 (QQHYITPLT, SEQ ID NO: 3), и последовательности CDR тяжелой цепи CDR1 (NYGMN, SEQ ID NO: 4); CDR2 (WINTYTGEPTYTDDFKG, SEQ ID NO: 5) и CDR3 (GGFGSSYWYFDV, SEQ ID NO: 6).

[011] Согласно предпочтительному варианту реализации химиотерапевтический фрагмент выбирают из камптотецина (СРТ) и его аналогов и производных; в более предпочтительном варианте он представляет собой SN-38. Однако могут быть использованы и другие химиотерапевтические фрагменты, которые включают таксаны (например, баккатин III, таксол), эпотилоны, антрациклины (например, доксорубицин (DOX), эпирубицин, морфолинодоксорубицин (морфолино-DOX), цианоморфолино-доксорубицин (цианоморфолино-DOX), 2-пирролинодоксорубицин (2-PDOX) или 2-PDOX в форме пролекарства (про-2-PDOX); см., например, источники: Priebe W (ed.), ACS Symposium Series 574, опубл. Американским химическим обществом (American Chemical Society, Washington D.C., 1995 (332pp)) и Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:2464-2469, 1996), бензохиноидные ансамицины, примером которых является гелданамицин (DeBoer et al., Journal of Antibiotics 23:442-447, 1970; Neckers et al., Invest. New Drugs 17:361-373, 1999); и т.п. В предпочтительном варианте указанное антитело или его фрагмент соединен(о) по меньшей мере с одним химиотерапевтическим фрагментом; предпочтительно, с химиотерапевтическими фрагментами в количестве от 1 до приблизительно 5; в более предпочтительном варианте с 6 или более химиотерапевтическими фрагментами, наив более предпочтительном варианте приблизительно с 6 - приблизительно с 12 химиотерапевтические фрагменты.

[012] Различные варианты реализации могут предусматривать применение заявленных способов и композиций для лечения рака, экспрессирующего Trop-2 человека, в том числе, но не ограничиваясь перечисленными, карцином, таких как карциномы пищевода, поджелудочной железы, легких, желудка, ободочной кишки и прямой кишки, мочевого пузыря, молочной железы, яичников, матки, почки, уротелия и предстательной железы.

[013] Согласно некоторым вариантам реализации, включающим лечение ракового заболевания, конъюгаты лекарственных средств могут применяться в комбинации с хирургическим вмешательством, лучевой терапией, химиотерапией, иммунотерапией «голыми» антителами, радиоиммунотерапией, иммуномодуляторами, вакцинами и т.п. Указанные виды комбинированной терапии могут позволять введение более низких доз каждого из терапевтических средств в таких комбинациях, с уменьшением таким образом определенных тяжелых побочных эффектов, и потенциальным уменьшением требуемой продолжительности курсов терапии. В случае отсутствия перекрывающейся токсичности или при минимальной перекрывающейся токсичности могут также вводиться полные дозы каждого из терапевтических средств. Согласно альтернативным вариантам реализации указанные ADC могут вводиться в комбинации с интерфероном, антителом-ингибитором контрольной точки, ингибитором тирозинкиназы Брутона, ингибитором PI3K, ингибитором PARP или ингибитором микротрубочек, согласно обсуждению ниже.

[014] Предпочтительные оптимальное дозирование ADC может включать в/в дозировку от 3 мг/кг до 18 мг/кг, предпочтительно вводимых либо еженедельно, либо два раза в неделю, либо один раз в две недели. Оптимальная схема дозирования может включать циклы лечения, включающие две последовательные недели терапии с последующей одной, двумя, тремя или четырьмя неделями отдыха, или чередующиеся недели терапии и отдыха, или одну неделю терапии с последующими двумя, тремя или четырьмя неделями отдыха, или три недели терапии с последующими одной, двумя, тремя или четырьмя неделями отдыха, или четыре недели терапии с последующими одной, двумя, тремя или четырьмя неделями отдыха, или пять недель терапии с последующими одной, двумя, тремя, четырьмя или пятью неделями отдыха, или введение один раз в две недели, один раз в три недели или один раз в месяц. Лечение может быть продлено на любое число циклов, предпочтительно, по меньшей мере 2, по меньшей мере 4, по меньшей мере 6, по меньшей мере 8, по меньшей мере 10, по меньшей мере 12, по меньшей мере 14 или по меньшей мере 16 циклов. Примеры подходящих дозировок могут включать 4 мг/кг, 5 мг/кг, 6 мг/кг, 7 мг/кг, 8 мг/кг, 9 мг/кг, 10 мг/кг, 11 мг/кг, 12 мг/кг, 13 мг/кг, 14 мг/кг, 15 мг/кг, 16 мг/кг, 17 мг/кг и 18 мг/кг. Предпочтительными являются дозировки 4, 6, 8, 9, 10, или 12 мг/кг.

[015] Согласно некоторым альтернативным вариантам реализации при подкожном введении ADC дозировки ADC, например, сацитузумаба говитекана (IMMU-132) могут быть ограничены возможностью концентрации ADC без осаждения или агрегации, а также объемом введения, который может вводиться подкожно (предпочтительно, 1, 2 или 3 мл, или менее). Следовательно, при подкожном введении может вводиться от 1,5 до 4 мг/кг ADC, ежедневно в течение 1 недели, или 3 раза в неделю в течение 2 недель, или два раза в неделю в течение двух недель, с последующим отдыхом. При использовании нескольких сайтов п/к инъекций могут применяться дозировки до 8 мг/кг. Поддерживающие дозы ADC могут вводиться в/в или п/к каждые две - три недели или ежемесячно после индукции. Как вариант, индукция может проводиться в виде двух-четырех циклов в/в введения в дозе 8-10 мг/кг (каждый цикл включает введение ADC на 1 и 8 день двух 21-дневных циклов, разделенных 1-недельным периодом отдыха), с последующим п/к введением в качестве активного дозирования один или более раз еженедельно, или в качестве поддерживающей терапии. Дозирование (введение) может быть скорректировано на основании промежуточного сканирования опухоли и/или анализа циркулирующих Trop-2-положительных опухолевых клеток.

[016] Среднему специалисту в данной области техники будет понятно, что при выборе оптимальной дозировки ADC можно учитывать различные факторы, такие как возраст, общее состояние здоровья, функционирование специфического органа или масса тела, а также эффекты предшествующей терапии на специфические системы органов (например, костный мозг), и что дозировка и/или частота введения может быть увеличена или уменьшена в ходе курса терапии. При необходимости дозирование может быть повторено, причем сокращение размеров опухоли наблюдается уже после 4-8 доз. Оптимизированные дозировки и схемы введения, описанные в настоящем документе, неожиданно демонстрируют превосходную эффективность и пониженную токсичность у субъектов-людей, что не могло быть предсказано на основании исследований в моделях на животных. Неожиданным образом, указанная превосходная эффективность позволяет проводить лечение опухолей, которые ранее считались устойчивыми к одному или более стандартным видам противораковой терапии, в том числе к терапии ингибитором контрольной точки.

[017] Заявленные способы могут включать применение КТ и/или ПЭТ-КТ, или МРТ, для измерения ответа опухолей через регулярные интервалы времени. Также может проводиться мониторинг уровней опухолевых маркеров, таких как КЭА (карциноэмбриональный антиген), СА19-9, АФП, СА 15.3 или ПСА, в крови. Дозировки и/или схемы введения могут быть при необходимости скорректированы в соответствии с результатами визуализации и/или уровнями маркера в крови.

[018] Неожиданным для заявленных композиций и способов результатом является непредвиденная переносимость высоких доз конъюгата антитела с лекарственным средством, даже при многократных инфузиях, сопровождаемых наблюдаемой токсичностью лишь относительно низких степеней в виде тошноты и рвоты, или управляемой нейтропении. Дополнительным неожиданным результатом является отсутствие накопления конъюгата антитела с лекарственным средством, в отличие от других продуктов, содержащих SN-38, конъюгированный с альбумином, ПЭГ или другими носителями. Отсутствие накопления ассоциировано с улучшенной переносимостью и отсутствием серьезной токсичности даже после многократного введения или повышения дозы. Указанные неожиданные результаты позволяют оптимизировать схемы дозирования и доставки, обеспечивая неожиданно высокую эффективность и низкую токсичность. Заявленные способы обеспечивают сокращение размеров солидных опухолей у индивидуумов с ранее демонстрировавшим устойчивость раком на 15% или более, предпочтительно, на 20% или более, предпочтительно, на 30% или более, более предпочтительно - на 40% или более (по оценке на основании максимального диаметра). Среднему специалисту в данной области техники будет понятно, что размер опухоли может быть измерен с применением разнообразных методик, например, путем измерения общего объема опухолей, максимального размера опухолей в любом измерении или комбинации размеров в нескольких измерениях. Это может осуществляться путем проведения стандартных радиологических процедур, таких как компьютерная томография, ультрасонография и/или позитронно-эмиссионная томография. Способы измерения размеров менее важны, чем наблюдаемый тренд уменьшения размера опухолей при лечении ADC, предпочтительно, приводящего к элиминации опухоли.

[019] Хотя ADC может вводиться в виде периодической болюсной инъекции, согласно альтернативным вариантам реализации указанный ADC может вводиться путем непрерывной инфузии конъюгатов антитела с лекарственным средством. Для увеличения Cmax и продления ФК ADC в крови может проводиться непрерывная инфузия, например, через постоянный катетер. Такие устройства известны в данной области техники, такие как катетеры HICKMAN®, BROVIAC® или PORT-A-CATH® (см., например, Skolnik et al., Ther Drug Monit 32:741-48, 2010), и может быть использован любой такой известный постоянный катетер. Также в данной области техники известны различные наносы для непрерывной инфузии, и может быть использован любой такой известный инфузионный насос. Диапазон дозировок для непрерывной инфузии может составлять от 0,1 до 3,0 мг/кг в сутки. В более предпочтительном варианте указанные ADC могут вводиться путем внутривенных инфузии на протяжении относительно коротких периодов продолжительностью 2-5 часов, более предпочтительно - 2-3 часа.

[020] Согласно конкретным предпочтительным вариантам реализации ADC и схемы дозирования могут быть эффективны у пациентов, резистентных (устойчивых) к стандартным видам терапии. Например, антитело против Trop-2 сацитузумаб говитекан может вводиться пациенту, не отвечавшему на предшествующую терапию иринотеканом, агентом, из которого происходит SN-38. Неожиданным образом, у устойчивого к иринотекану пациента может наблюдаться частичный или даже полный ответ на сацитузумаб говитекан. Способность ADC к специфическому нацеливанию на опухолевую ткань может обеспечивать преодоление устойчивости опухоли за счет улучшенного нацеливания и улучшенной доставки терапевтического агента. ADC могут демонстрировать аналогичную улучшенную эффективность и/или уменьшенную токсичность по сравнению с альтернативными стандартными видами терапевтического лечения, например, лечения антителами - ингибиторами контрольной точки.

[021] Специфический предпочтительный субъект может представлять собой пациента с метастатическим раком ободочной и прямой кишки, пациента с метастатическим раком поджелудочной железы, пациента с раком молочной железы с тройным негативным фенотипом, пациента с HER-положительным (HER+), эстроген-положительным (ER+), прогестерон-положительным раком молочной железы, пациента с метастатическим немелкоклеточным раком легкого (НМРЛ), пациента с метастатическим мелкоклеточным раком легкого, пациента с метастатическим раком желудка, пациента с метастатическим раком почек, пациента с метастатическим уротелиальным раком, пациента с метастатическим раком мочевого пузыря, пациента с метастатическим раком яичников или пациента с метастатическим раком матки.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[022] Фиг. 1. Обзор результатов КТ-сканирования для пациента с устойчивым к ингибиторам контрольной точки метастатическим ТНРМЖ, получавшего лечение 10 мг/кг сацитузумаба говитекана.

[023] Фиг. 2. Базовые КТ-снимки для пациента с устойчивым к ингибиторам контрольной точки метастатическим ТНРМЖ, приведены осевые снимки (верхний ряд) и снимки в сагиттальной проекции (нижний ряд). Опухоли отмечены стрелками.

[024] Фиг. 3. Сравнение результатов КТ-сканирования для целевых очагов поражения 1 и 2, до и после лечения 10 мг/кг сацитузумаба говитекана (IMMU-132). Исходный снимок приведен наверху, вторая оценка ответа после терапии сацитузумабом говитеканом представлена снизу. Наблюдалось явно выраженное сокращение размеров опухолей, индуцированное IMMU-132.

[025] Фиг. 4. Сравнение результатов КТ-сканирования для целевого очага поражения 3, до и после лечения 10 мг/кг сацитузумаба говитекана (IMMU-132). Исходный снимок приведен сверху, а вторая оценка ответа после терапии сацитузумабом говитеканом показана снизу. Наблюдалось явно выраженное сокращение размеров опухоли, индуцированное IMMU-132.

[026] Фиг. 5. Обобщенные результаты для пациентов с устойчивыми к лечению ингибитором контрольной точки опухолями, получавших лечение IMMU-132.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определения

[027] В описании ниже используется ряд терминов, и для облегчения понимания заявленного объекта изобретения приведены их определения. Термины, явным образом не определенные в настоящем документе, используют в соответствии с их обычным принятым значением.

[028] Если не указано иное, термины в единственном числе означают «один или более».

[029] Термин приблизительно в настоящем документе означает плюс или минус десять процентов (10%) от значения. Например, «приблизительно 100» относится к любому числу от 90 до 110.

[030] Антитело в настоящем документе относится к полноразмерной (т.е. встречающейся в природе или образованной в ходе нормальных процессов рекомбинации фрагментов генов иммуноглобулинов) молекуле иммуноглобулина (например, антителу IgG) или антигенсвязывающей части молекулы иммуноглобулина, такой как фрагмент антитела. Антитело или фрагмент антитела могут быть конъюгированы или иным образом дериватизированы, что входит в объем заявленного предмета изобретения. Такие антитела включают, не ограничиваясь перечисленными, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 (и подформы IgG4), а также изотипы IgA. Ниже в настоящем документе сокращение «MAb» может применяться взаимозаменяемо с терминами антитело, фрагмент антитела, моноклональное антитело или мультиспецифическое антитело.

[031] Фрагмент антитела представляет собой часть антитела, такую как Р(ab')₂, F(ab)₂, Fab', Fab, Fv, scFv (одноцепочечный Fv), однодоменные антитела (DAB или VHH) и т.п., в том числе полумолекулы IgG4, упомянутого выше (van der Neut Kolfschoten et al. (Science 2007; 317(14 Sept): 1554-1557). Независимо от структуры, подходящий для применения фрагмент антитела связывается с тем же антигеном, который распознает интактное антитело. Термин «фрагмент антитела» также включает синтетические или генетически сконструированные белки, которые действуют как антитело за счет связывания со специфическим антигеном с образованием комплекса. Например, фрагменты антитела включают выделенные фрагменты, состоящие из вариабельных областей, такие как фрагменты «Fv», состоящие из вариабельных областей тяжелых и легких цепей, и рекомбинантные одноцепочечные полипептидные молекулы, в которых легкие и тяжелые вариабельные области соединены пептидным линкером («белки scFv»). Указанные фрагменты могут быть сконструированы разными способами с получением мультивалентных и/или мультиспецифических связывающих форм.

[032] Голое антитело обычно представляет собой целое антитело, не конъюгированное с терапевтическим агентом. Голое антитело может проявлять терапевтические и/или цитотоксические эффекты, например, за счет Fe-зависимых функций, таких как фиксация комплемента (КЗЦ) и АЗКЦ (антителозависимая клеточная цитотоксичность). Однако терапевтический эффект могут также обеспечивать другие механизмы, такие как апоптоз, антиангиогенез, антиметастатическая активность, антиадгезионная активность, ингибирование гетеротипической или гомотипической адгезии, и интерференция сигнальных путей. Голые антитела включают поликлональные и моноклональные антитела, встречающиеся в природе или рекомбинантные антитела, такие как химерные антитела, гуманизированные антитела или антитела человека, а также их фрагменты. В некоторых случаях «голое антитело» может также относиться к «голому» фрагменту антитела. Согласно определению в настоящем документе «голое» является синонимом «неконъюгированного» и означает не соединенное или не конъюгированное с терапевтическим агентом.

[033] Химерное антитело представляет собой рекомбинантный белок, который содержит вариабельные домены как тяжелых, так и легких цепей антител, в том числе определяющие комплементарность области (CDR) антитела, происходящие от одного вида, предпочтительно, из антитела грызуна, более предпочтительно - из антитела мыши, тогда как константные домены указанной молекулы антитела происходят из константных доменов антитела человека. Для применения в ветеринарии константные домены химерного антитела могут происходить из константных доменов других видов, например, примата, кошки или собаки.

[034] Гуманизированное антитело представляет собой рекомбинантный белок, в котором области CDR из антитела одного вида; например, антитела мыши, переносят из вариабельных тяжелых и легких цепей указанного антитела мыши в вариабельные домены (каркасные области) тяжелых и легких цепей человека. Константные домены указанной молекулы антитело происходят из константных доменов антитела человека. В некоторых случаях специфические остатки каркасной области гуманизированного антитела, в частности, соприкасающиеся с последовательностями CDR или расположенные близко к ним, могут быть модифицированы, например, путем замен остатков на соответствующие остатки из оригинального антитела мыши, грызуна, человекообразного примата или т.д.

[035] Антитело человека представляет собой антитело, полученное, например, из трансгенных мышей, которые были «сконструированы» для получения антител человека в ответ на антигенную стимуляцию. В указанной методике элементы локусов тяжелых и легких цепей человека вводят мышам линий, происходящих из линий эмбриональных стволовых клеток, в которых были направленным образом разрушены эндогенные локусы тяжелых цепей и легких цепей. Указанные трансгенные мыши могут синтезировать антитела человека, специфические в отношении различных антигенов, и могут применяться для получения секретирующих антитела человека гибридом. Способы получения антител человека с использованием трансгенных мышей описаны в источниках: Green et al., Nature Genet. 7:13 (1994), Lonberg et al., Nature 368:856 (1994) и Taylor et al., Int. Immun. 6:579 (1994). Полностью человеческое антитело также может быть сконструировано с применением способов генетической или хромосомной трансфекции, а также технологии фагового дисплея, все из которых известны в данной области техники. См. например, описание получения антител человека и их фрагментов in vitro из репертуаров генов вариабельных доменов иммуноглобулинов иммунизированных доноров McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990). В указанной методике гены вариабельных доменов антител человека клонируют внутрь рамки в ген либо основного, либо малого белка оболочки нитевидного бактериофага, с дисплеем в виде функциональных фрагментов антитела на поверхности фаговой частицы. Поскольку указанная нитевидная частица содержит копию одноцепочечной ДНК фагового генома, отбор, основанный на функциональных свойствах антитела, также приводит к отбору гена, кодирующего антитело, проявляющее указанные свойства. Таким образом, фаг имитирует некоторые свойства В-клетки. Фаговый дисплей может быть осуществлен в различных форматах, обзор которых приведен, например, в источнике: Johnson, Chiswell, Current Opinion in Structural Biology 3:5564-571 (1993). Антитела человека могут также быть продуцированы in vitro активированными В-клетками. См. патенты США №5567610 и №5229275, разделы примеров каждого из которых включены в настоящий документ посредством ссылок.

[036] Терапевтический агент представляет собой атом, молекулу или соединение, подходящие для лечения заболевания. Примеры терапевтических агентов включают, не ограничиваясь перечисленными, антитела, фрагменты антител, иммуноконъюгаты, лекарственные средства, цитотоксические агенты, проапоптозные агенты, токсины, нуклеазы (в том числе ДНКазы и РНКазы), гормоны, иммуномодуляторы, хелаторы, соединения бора, фотоактивные агенты или красители, радионуклиды, олигонуклеотиды, интерференционную РНК, миРНК, РНК-интерференцию, антиангиогенные агенты, химиотерапевтические агенты, цитокины, хемокины, пролекарства, ферменты, связывающие белки или пептиды, или их комбинации.

[037] Иммуноконъюгат представляет собой антитело, антигенсвязывающий фрагмент антитела, комплекс антитела или слитый с антителом белок, конъюгированный с терапевтическим агентом. Конъюгация может быть ковалентной или нековалентной. В предпочтительном варианте конъюгация является ковалентной. В тех случаях, когда указанный терапевтический агент представляет собой лекарственное средство, итоговый иммуноконъюгат представляет собой конъюгат антитела с лекарственным средством, или ADC.

[038] В настоящем документе термин слитый с антителом белок означает полученную рекомбинантным способом антигенсвязывающую молекулу, в составе которой одно или более естественных антител, одноцепочечных антител или фрагментов антитела соединены с другим фрагментом, таким как белок или пептид, токсин, цитокин, гормон и т.п. Согласно некоторым предпочтительным вариантам реализации указанный слитый белок может содержать два или более одинаковых или разных антител, фрагментов антител или одноцепочечных антител, слитых друг с другом, которые могут связываться с одним и тем же эпитопом, разными эпитопами на одном и том же антигене, или с разными антигенами.

[039] Иммуномодулятор представляет собой терапевтический агент, присутствие которого изменяет, подавляет или стимулирует иммунную систему организма. Как правило, подходящий для применения иммуномодулятор стимулирует пролиферацию или активацию иммунных клеток в каскаде иммунного ответа, таких как макрофаги, дендритные клетки, В-клетки и/или Т-клетки. Однако в некоторых случаях иммуномодулятор может подавлять пролиферацию или активацию иммунных клеток. Примером иммуномодулятора, описанного в настоящем документе, является цитокин, который представляет собой растворимый малый белок массой приблизительно 5-20 кДа, который высвобождается одной популяцией клеток (например, примированными Т-лимфоцитами) при контакте со специфическими антигенами, и действует в качестве межклеточного посредника для клеток. Как будет понятно специалисту, примеры цитокинов включают лимфокины, монокины, интерлейкины и ряд родственных сигнальных молекул, таких как фактор некроза опухоли (ФИО) и интерфероны. Хемокины представляют собой подгруппу цитокинов. Определенные интерлейкины и интерфероны являются примерами цитокинов, которые стимулируют пролиферацию Т-клеток или других иммунных клеток. Примеры интерферонов включают интерферон-α, интерферон-β, интерферон-γ и интерферон-λ.

[040] СРТ представляет собой сокращенное обозначение камптотецина, и в настоящем документе СРТ означает как собственно камптотецин, так и аналог или производное камптотецина, например, SN-38. Структуры камптотецина и некоторых его аналогов, с нумерацией и кольцами, обозначенными символами А-Е, приведены в формуле 1 на схеме 1 ниже.

[041] Схема 1

Антитела против Trop-2

[042] Различные варианты реализации предусматривают применение антител или их фрагментов, которые связываются с Trop-2. Согласно специфическому предпочтительному варианту реализации антитело против Trop-2 может представлять собой гуманизированное антитело RS7 (см., например, патент США №7238785, включенный в настоящий документ полностью посредством ссылки), содержащее последовательности CDR легкой цепи CDR1 (KASQDVSIAVA, SEQ ID NO: 1); CDR2 (SASYRYT, SEQ ID NO: 2); и CDR3 (QQHYITPLT, SEQ ID NO: 3), и последовательности CDR тяжелой цепи CDR1 (NYGMN, SEQ ID NO: 4); CDR2 (WINTYTGEPTYTDDFKG, SEQ ID NO: 5) и CDR3 (GGFGSSYWYFDV, SEQ ID NO: 6).

[043] Антитело RS7 представляло собой IgG₁ мыши против состава с неочищенными мембранами первичной плоскоклеточной карциномы легких человека. (Stein et al., Cancer Res. 50: 1330, 1990) Антитело RS7 распознает гликопротеин массой 46-48 кДа, охарактеризованный как принадлежащий к кластеру 13. (Stein et al., Int. J. Cancer Supp. 8:98-102, 1994). Антиген обозначали как EGP-1 (эпителиальный гликопротеин-1), однако его также называют Trop-2.

[044] Trop-2 представляет собой трансмембранный белок I типа, который был клонирован как из клеток человека (Fornaro et al., Int J Cancer 1995; 62:610-8), так и из клеток мыши (Sewedy et al., Int J Cancer 1998; 75:324-30). Последовательность аминокислот Trop-2 человека общеизвестна (см., например, № доступа в NCBI P09758.3). Помимо роли в качестве опухолеассоциированного переносчика кальциевого сигнала (Ripani et al., Int J Cancer 1998; 76:671-6) экспрессия Trop-2 человека, как было показано, необходима для туморогенеза и обеспечения инвазивности раковых клеток ободочной кишки, которые могут быть эффективно понижены при применении поликлонального антитела к внеклеточному домену Trop-2 (Wang et al., Mol Cancer Ther 2008; 7:280-5).

[045] Растущий интерес к Trop-2 в качестве терапевтической мишени при лечении солидного рака (Cubas et al., Biochim Biophys Acta 2009; 1796:309-14) поддерживают дополнительными сообщениями, документально подтверждающими клиническое значение сверхэкспрессируемого Trop-2 в карциномах молочной железы (Huang et al., Clin Cancer Res 2005; 11:4357-64), ободочной и прямой кишки (Ohmachi et al., Clin Cancer Res 2006; 12:3057-63; Fang et al., Int J Colorectal Dis 2009; 24:875-84) и плоскоклеточной карциноме полости рта (Fong et al., Modem Pathol 2008; 21:186-91). В частности, следует упомянуть новейшие данные о повышенных уровнях in vitro и in vivo активности, сходной с активностью стволовых клеток, базальных клеток предстательной железы, экспрессирующих высокие уровни Trop-2 (Goldstein et al., Proc Natl Acad Sci USA 2008; 105:20882-7).

[046] Исследования с использованием проточной цитометрии и иммуногистохимического окрашивания показали, что MAb RS7 детектирует антиген на различных типах опухолей, при ограниченном связывании с нормальными тканями человека (Stein et al., 1990). Trop-2 экспрессируется в основном карциномами, такими как карциномы легкого, желудка, мочевого пузыря, молочной железы, яичников, матки и предстательной железы. Исследования локализации и терапии с применением меченого радиоактивной меткой MAb RS7 мыши в моделях на животных продемонстрировали нацеливание на опухоль и терапевтическую эффективность (Stein et al., 1990; Stein et al., 1991).

[047] Выраженное окрашивание RS7 было продемонстрировано в опухолях из легких, молочной железы, мочевого пузыря, яичников, матки, желудка и предстательной железы. (Stein et al., Int. J. Cancer 55:938, 1993). Случаи рака легкого включают и плоскоклеточные карциномы, и аденокарциномы. (Stein et al., Int. J. Cancer 55:938, 1993). Выраженное окрашивание наблюдалось в обоих типах клеток, указывая на то, что для антитела RS7 различия гистологических классов немелкоклеточных карцином легкого не имеют значения.

[048] MAb RS7 быстро интернализуется целевыми клетками (Stein et al., 1993). Константа скорости интернализации MAb RS7 занимает промежуточное значение между константами скорости интернализации двух других быстро интернализующихся MAb, которые, как было показано, подходят для получения ADC (выше). Хорошо известно, что интернализация ADC представляет собой необходимое для противоопухолевой активности условие (Pastan et al., Cell 47:641, 1986). Интернализация ADC с лекарственными средствами была описана как основной фактор противоопухолевой эффективности (Yang et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85: 1189, 1988). Соответственно, антитело RS7 проявляет ряд качеств, важных для терапевтического применения.

[049] Хотя антитело hRS7 является предпочтительным, также известна и/или находится в открытом доступе информация о других антителах против Trop-2, и такие антитела могут быть использованы в заявленных ADC согласно альтернативным вариантам реализации. Хотя предпочтительными являются гуманизированные антитела или антитела человека ввиду пониженной иммуногенности, согласно альтернативным вариантам реализации может подходить для применения химерное антитело. Как обсуждается ниже, способы гуманизации антител хорошо известны в данной области техники и могут быть использованы для преобразования доступного антитела мыши или химерного антитела в гуманизированную форму.

[050] Антитела против Trop-2 коммерчески доступны в ряде источников и включают LS-C126418, LS-C178765, LS-C126416, LS-C126417 (LifeSpan BioSciences, Inc., Сиэтл, Вашингтон); 10428-ММ01, 10428-ММ02, 10428-R001, 10428-R030 (Sino Biological Inc., Пекин, Китай); MR54 (eBioscience, Сан-Диего, Калифорния); sc-376181, sc-376746, Santa Cruz Biotechnology (Санта-Круз, Калифорния); MM0588-49D6, (Novus Biologicals, Литтлтон, Колорадо); ab79976 и ab89928 (ABCAM®, Кембридж, Массачусетс).

[051] Другие антитела против Trop-2 были описаны в патентной литературе. Например, в публикации США №2013/0089872 описаны антитела против Trop-2 K5-70 (№ доступа FERM ВР-11251), K5-107 (№ доступа FERM ВР-11252), K5-116-2-1 (№ доступа FERM ВР-11253), Т6-16 (№ доступа FERM ВР-11346) и Т5-86 (№ доступа FERM ВР-11254), депонированные в Международном депозитарии запатентованных организмов (International Patent Organism Depositary), Цукуба, Япония. В патенте США №5840854 описано моноклональное антитело против Trop-2 BR110 (АТСС № НВ11698). В патенте США №7420040 описано антитело против Trop-2, продуцируемое гибридомной линией клеток AR47A6.4.2, депонированное в Международном депозитарием органе Канады, IDAC (International Depository Authority of Canada, Виннипег, Канада) под номером доступа 141205-05. В патенте США №7420041 описано антитело против Trop-2, продуцируемое гибридомной линией клеток AR52A301.5, депонированное в IDAC под номером доступа 141205-03. В публикации США №2013/0122020 описаны антитела против Trop-2 3Е9, 6G11, 7Е6, 15Е2, 18В1. Гибридомы, кодирующие репрезентативное антитело, были депонированы в Американской коллекции типовых культур (АТСС) под номерами доступа РТА-12871 и РТА-12872. ADC PF 06263507, содержащий антитело против 5Т4 (против Trop-2), присоединенное к ингибитору тубулина монометилауристатину F (MMAF), доступно от Pfizer, Inc. (Гротон, Коннектикут) (см., например, Sapra et al., 2013, Mol Cancer Ther 12:38-47). В патенте США №8715662 описаны антитела против Trop-2, продуцируемые гибридомами, депонированными в AID-ICLC (Генуя, Италия) под номерами PD 08019, PD 08020 и PD 08021. В опубликованной заявке на патент США №20120237518 описаны антитела против Trop-2 77220, KM4097 и KM4590. В патенте США №8309094 (Wyeth) описаны антитела A1 и A3, идентифицированные посредством перечня последовательностей. Разделы примеров каждого из патентов или каждой из патентных заявок, цитируемых выше в настоящем параграфе, включены в настоящий документ посредством ссылок. В непатентной публикации Lipinski с соавторами (Lipinski et al., 1981, Proc Natl. Acad Sci USA, 78:5147-50) описаны антитела против Trop-2 162-25.3 и 162-46.2.

[052] Многочисленные антитела против Trop-2 известны в данной области техники и/или информация о них находится в открытом доступе. Согласно обсуждению ниже, способы получения антител против известных антигенов являются рутинными в данной области техники. Способы получения гуманизированных антител, антител человека или химерных антител также были известны. Средний специалист в данной области техники после прочтения настоящего описания, руководствуясь общеизвестными в данной области техники Сведениями, сможет получить и использовать род антител против Trop-2 для заявленных ADC.

[053] Применение антител против мишеней, родственных Trop-2, было описано в контексте иммунотерапевтических средств, отличных от ADC. Антитело мыши IgG2a против Trop-1, эдреколомаб (PANOREX®), применяли для лечения рака ободочной и прямой кишки, хотя антитело мыши не очень хорошо подходит для клинического применения у человека (Baeuerle & Gires, 2007, Br. J Cancer 96:417-423). Сообщалось, что подкожное введение низких доз эдреколомаба индуцирует гуморальный иммунный ответ против антигена вакцины (Baeuerle & Gires, 2007). Адекатумумаб (МТ201), полностью человеческое антитело против Trop-1, применяли при метастатическом раке молочной железы и на ранних стадиях рака предстательной железы, и, как сообщалось, оно действует за счет АЗКЦ- и КЗЦ-активности (Baeuerle & Gires, 2007). Сообщалось, что МТ110, конструкция с одно цепочечным биспецифическим антителом против Trop-1/против CD3, обладает эффективностью, направленной против рака яичников (Baeuerle & Gires, 2007). Проксиниум, иммунотоксин, содержащий одноцепочечное антитело против Trop-1, слитый с экзотоксином Pseudomonas, тестировали при раке головы и шеи, а также раке мочевого пузыря (Baeuerle & Gires, 2007). Ни в одном из указанных исследований не содержится какого-либо описания применения ADC против Trop-2, в частности, у пациентов с устойчивостью к лечению антителами - ингибиторами контрольной точки.

Конъюгаты с камптотецином

[054] Неограничивающие способы и композиции для получения ADC, содержащих терапевтический агент камптотецин, присоединенный к антителу или антигенсвязывающему фрагменту антитела, описаны ниже. Согласно предпочтительным вариантам реализации растворимость лекарственного средства улучшают путем введения фрагмента определенного полиэтиленгликоля (ПЭГ) (т.е. ПЭГ, содержащего определенное число мономерных единиц) между лекарственным средством и антителом, при этом указанный определенный ПЭГ представляет собой ПЭГ с низкой молекулярной массой, предпочтительно содержащий 1-30 мономерных единиц, в более предпочтительном варианте содержащий 1-12 мономерных единиц.

[055] В предпочтительном варианте первый линкер соединен с лекарственным средством на одном конце и может оканчиваться ацетиленовой или азидной группы на другом конце. Указанный первый линкер может содержать фрагмент определенного ПЭГ с азидной или ацетиленовой группой на одном конце и другой реакционноспособной группой, такой как карбоновая кислота или гидроксильная группа, на другом конце. Указанный бифункциональный определенный ПЭГ может быть присоединен к аминогруппе аминоспирта, а гидроксильная группа последнего может быть присоединена к гидроксильной группе на лекарственном средстве в форме карбоната. Как вариант, неазидный (или ацетиленовый) фрагмент указанного определенного бифункционального ПЭГ необязательно присоединен к N-концу L-аминокислоты или полипептида, при этом С-конец присоединен к аминогруппе аминоспирта, а гидроксильная группа последнего присоединена к гидроксильной группе лекарственного средства в форме карбоната или карбамата, соответственно.

[056] Второй линкер, содержащий группу для соединения с антителом и реакционноспособную группу, комплементарную азидной (или ацетиленовой) группе первого линкера, а именно, ацетиленовую (или азидную), может вступать в реакцию с конъюгатом лекарственного средства и первого линкера за счет реакции циклоприсоединения между ацетиленом и азидом, с получением итогового бифункционального лекарственного продукта, который подходит для конъюгации с нацеленными на заболевание антителами. Группа для соединения с антителом представляет собой предпочтительно либо тиол, либо реакционноспособную в отношении тиола группу.

[057] Способы селективной регенерации 10-гидроксильной группы в присутствии С-20-карбоната в составах с предшественником, содержащим лекарственное средство и линкер, включая аналоги СРТ, такие как SN-38, представлены ниже. Могут также применяться другие защитные группы для реакционноспособных гидроксильных групп в лекарственных средствах, таких как фенольный гидроксил в SN-38, например, трет-бутилдиметилсилил или трет-бутилдифенилсилил; снятие защиты осуществляют с применением фторида тетрабутиламмония перед соединением дериватизированного лекарственного средства с фрагментом для соединения с антителом. 10-гидроксильная группа аналогов СРТ, как вариант, защищена как сложный эфир или карбонат, отличным от «ВОС» способом, таким образом, что бифункциональный СРТ конъюгирован с антителом без предварительного снятия защиты указанной защитной группой. Снятие защитной группы легко происходит в условиях физиологических значений рН после введения биоконъюгата.

[058] При ацетилен-азидном соединении, называемом «клик-химией», азидная часть может находиться на L2, а ацетиленовая часть - на L3. Как вариант, L2 может содержать ацетилен, а L3 - азид. «Клик-химия» относится к катализируемой медью (+1) реакции циклоприсоединения между ацетиленовым фрагментом и азидным фрагментом (Kolb НС, Sharpless KB, Drug Discov Today 2003; 8: 1128-37), хотя известны и могут применяться альтернативные формы клик-химии. Клик-химия происходит в водном растворе в условиях значений рН, приближенных к нейтральным, и, соответственно, подходит для конъюгации лекарственных средств. Преимущество клик-химии заключается в ее хемоселективности и дополнении других хорошо известных реакций конъюгационной химии, таких как тиол-малеимидная реакция.

[059] Хотя в настоящем документе внимание сфокусировано на применении антител или фрагментов антител в качестве нацеливающих фрагментов, специалисту будет понятно, что в тех случаях, когда конъюгат содержит антитело или фрагмент антитела, может быть использован другой тип нацеливающего фрагмента, например, аптамер, авимер, аффитело или пептидный лиганд.

[060] Пример предпочтительного варианта реализации относится к конъюгату производного лекарственного средства и антитела общей формулы 2,

MAb-[b2]-[L1]-[АК]_m-[А'] - Лекарственное средство (2)

где MAb представляет собой нацеленное на заболевание антитело; L2 представляет собой компонент кросс-линкера, содержащий фрагмент для соединения с антителом и одну или более ацетиленовых (или азидных) групп; L1 содержит заданный ПЭГ с азидом (или ацетиленом) на одном конце, комплементарный ацетиленовому (или азидному) фрагменту в L2, и реакционноспособную группу, такую как карбоновая кислота или гидроксильная группа, на другом конце; АК представляет собой L-аминокислоту; m представляет собой целое число, принимающее значения 0, 1, 2, 3 или 4; и А' представляет собой дополнительный спейсер, выбранный из группы, включающей этаноламин, 4-гидроксибензиловый спирт, 4-аминобензиловый спирт, или замещенный или незамещенный этилендиамин. L-аминокислоты «АК» выбирают из аланина, аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, цистеина, глутамина, глутаминовой кислоты, глицина, гистидина, изолейцина, лейцина, лизина, метионина, фенилаланина, пролина, серина, треонина, триптофана, тирозина и валина. Если группа А' содержит гидроксил, она соединена с гидроксильной группой или аминогруппой лекарственного средства в форме карбоната или карбамата, соответственно.

[061] Согласно предпочтительному варианту реализации формулы 2 А' представляет собой замещенный этаноламин, происходящий из L-аминокислоты, при этом карбоксикислотная группа аминокислоты заменена на гидроксиметильный фрагмент. А' может происходить из любой из следующих L-аминокислот: аланин, аргинин, аспарагин, аспарагиновая кислота, цистеин, глутамин, глутаминовая кислота, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, пролин, серии, треонин, триптофан, тирозин и валин.

[062] В примере конъюгата согласно предпочтительному варианту реализации формулы 2 m равен 0, А' представляет собой L-валинол, а лекарственное средство представляет собой, например, SN-38. Полученная структура представлена формулой 3.

[063] В другом примере конъюгата согласно предпочтительному варианту реализации формулы 2, m равен 1 и представлен дериватизированным L-лизином, А' представляет собой L-валинол, а лекарственное средство представляет собой, например, SN-38. Указанная структура представлена формулой 4.

[064] Согласно указанному варианту реализации амидная связь сначала образуется между карбоновой кислотой аминокислоты, такой как лизин, и аминогруппой валинола, с применением ортогональных защитных групп для аминогрупп лизина. Защитную группу на N-конце лизина удаляют, сохраняя интактную защитную группу на боковой цепи лизина, а N-конец сопрягают с карбоксильной группой на определенном ПЭГ с азидом (или ацетиленом) на другом конце. Затем гидроксильную группу валинола присоединяют к 20-хлорформатному производному 10-гидрокси-защищенного SN-38, и указанный промежуточный продукт сопрягают с компонентом L2, несущим связывающий антитело фрагмент, а также комплементарную ацетиленовую (или азидную) группу, вовлеченную в циклоприсоединение клик-химии. Наконец, удаление защитных групп как с боковой цепи лизина, так и с SN-38 обеспечивает получение продукта согласно указанному примеру, представленного формулой 3.

[065] Безотносительно какой-либо теории, продукт SN-38 с малой молекулярной массой (MW), а именно, карбонат валинол-SN-38, образующийся после внутриклеточного протеолиза, обеспечивает дополнительный путь выделения интактного SN-38 за счет внутримолекулярной циклизации, задействующей аминогруппу валинола и карбонил карбоната.

[066] Согласно другому предпочтительному варианту реализации А' общей формулы 2 представляет собой А-ОН, где А-ОН представляет собой деформируемый фрагмент, такой как 4-аминобензиловый спирт или замещенный 4-аминобензиловый спирт, замещенный C₁-С₁₀ алкильной группой в положении бензила, и последний, посредством аминогруппы, присоединен к L-аминокислоте или полипептиду, содержащему до четырех фрагментов L-аминокислоты; при этом N-конец присоединен к кросс-линкеру, оканчивающемуся в связывающей антитело группе.

[067] Пример предпочтительного варианта реализации приведен ниже, при этом в указанном варианте реализации А-ОН, соответствующий А' общей формулы (2), происходит из замещенного 4-аминобензилового спирта, а «АК» состоит из одиночной L-аминокислоты с m равным 1 в общей формуле (2); лекарственное средство представляет собой, например, SN-38. Указанная структура представлена ниже (формула 5, называемая MAb-CLX-SN-38). Одиночную аминокислоту «АК» выбирают из любой из следующих L-аминокислот: аланин, аргинин, аспарагин, аспарагиновая кислота, цистеин, глутамин, глутаминовая кислота, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, пролин, серии, треонин, триптофан, тирозин и валин. Заместитель R на фрагменте 4-аминобензилового спирта (вариант реализации А' «А-ОН») представлен водородом или алкильной группой, выбранной из C1-С10 алкильных групп.

[068] Частным предпочтительным вариантом реализации является MAb-CLX-SN-38 формулы 5, где одиночная аминокислота АК представляет собой L-лизин, R=Н, а лекарственное средство представляет собой, например, SN-38 (формула 6; называемое MAb-CL2A-SN-38). Указанная структура отличается от линкера MAb-CL2-SN-38 заменой одиночного остатка лизина на дипептид Phe-Lys, обнаруживаемый в линкере CL2. Дипептид Phe-Lys был спроектирован в качестве сайта расщепления катепсином В, лизосомным ферментом, что считали важным для внутриклеточного высвобождения связанного лекарственного средства. Неожиданным образом, несмотря на элиминацию сайта расщепления катепсином, ADC, содержащие линкер CL2A, по меньшей мере в той же степени эффективны, и могут быть более эффективны in vivo, чем содержащие линкер CL2.

[069] Другие варианты реализации возможны в контексте 10-гидрокси-содержащих камптотецинов, таких как SN-38. В примере с SN-38 в качестве лекарственного средства более реакционноспособная 10-гидроксильную группу указанного лекарственного средства дериватизируют, не задействуя 20-гидроксильную группу. В общей формуле 2 А' представляет собой замещенный этилендиамин. Пример указанного варианта реализации представлен формулой «7» ниже, где фенольная гидроксильная группа SN-38 дериватизирована как карбамат замещенным этилендиамином, тогда как другой амин диамина дериватизирован как карбамат 4-аминобензиловым спиртом, а аминогруппа последнего присоединена к дипептиду Phe-Lys. В указанной структуре (формула 7) R и R' представляют собой независимо водород или метил. Она имеет название MAb-CL17-SN-38 или MAb-CL2E-SN-38, где R=R'=метил.

[070] Согласно некоторым вариантам реализации АК содержит полипептидный фрагмент, предпочтительно, ди-, три- или тетрапептид, расщепляемый внутриклеточной пептидазой. Примерами являются: Ala-Leu, Leu-Ala-Leu и Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 20) (Trouet et al., 1982). Другой пример представлен фрагментом Phe-Lys, расщепляемым лизосомным катепсином.

[071] Согласно предпочтительному варианту реализации компонент L1 конъюгата содержит определенный полиэтиленгликолевый (ПЭГ) спейсер с 1-30 повторяющимися мономерными единицами. Согласно дополнительному предпочтительному варианту реализации ПЭГ представляет собой определенный ПЭГ с 1-12 повторяющимися мономерными единицами. Введение ПЭГ может включать применение гетеробифункционализированных производных ПЭГ, которые коммерчески доступны. Указанные гетеробифункциональные ПЭГ может содержать азидную или ацетиленовую группу. Пример гетеробифункционального определенного ПЭГ, содержащего 8 повторяющихся мономерных единиц, где «NHS» представляет собой сукцинимидил, представлен ниже в формуле 8:

[072] Согласно предпочтительному варианту реализации L2 содержит совокупность ацетиленовых (или азидных) групп, в диапазоне от 2 до 40, однако предпочтительно - от 2 до 20, и более предпочтительно - от 2 до 5, и одиночный связывающий антитело фрагмент.

[073] Репрезентативный конъюгат SN-38 с антителом, содержащим несколько молекул лекарственного средства и одиночный связывающий антитело фрагмент, показан ниже. Компонент «L2» указанной структуры присоединяют к 2 ацетиленовым группам, что приводит к прикреплению двух присоединенных к азиду молекул SN-38. Связь с MAb представлена в виде сукцинимида.

Где остаток R представляет собой:

[074] Согласно предпочтительным вариантам реализации в тех случаях, когда бифункциональное лекарственное средство содержит реакционноспособный в отношении тиола фрагмент в качестве связывающей антитело группы, тиолы на указанном антителе получают на лизиновых группах указанного антитела с применением тиолирующего реагента. Способы введения тиольных групп в антитела путем модификаций лизиновых групп MAb хорошо известны в данной области техники (Wong, в источнике: Chemistry of protein conjugation and cross-linking, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL (1991), pp 20-22). Как вариант, мягкое восстановление межцепочечных дисульфидных связей на антителе (Willner et al., Bioconjugate Chem. 4:521-527 (1993)) с применением восстанавливающих агентов, таких как дитиотреитол (DTT), может давать 7-10 тиолов на антителе; что обеспечивает преимущество, заключающееся во включении нескольких лекарственных фрагментов в межцепочечную область MAb в отдалении от антигенсвязывающей области. Согласно более предпочтительному варианту реализации прикрепление SN-38 к восстановленным дисульфидным-сульфгидрильным группам приводит к образованию ADC антитела/SN-38 с 6 фрагментами SN-38, ковалентно присоединенными к молекуле антитела. Известны другие способы обеспечения остатков цистеина для прикрепления лекарственных средств или других терапевтических агентов, такие как применение сконструированных антител с цистеином (см. патент США №7521541, раздел примеров которого включен в настоящий документ посредством ссылки).

[075] Согласно альтернативным предпочтительным вариантам реализации химиотерапевтический фрагмент выбран из группы, состоящей из доксорубицина (DOX), эпирубицина, морфолинодоксорубицина (морфолино-DOX), цианоморфолинодоксорубицина (цианоморфолино-DOX), 2-пирролинодоксорубицина (2-PDOX), про-2PDOX, СРТ, 10-гидроксикамптотецина, SN-38, топотекана, луртотекана, 9-аминокамптотецина, 9-нитрокамптотецина, таксанов, гелданамицина, ансамицинов и эпотилонов. Согласно более предпочтительному варианту реализации указанный химиотерапевтический фрагмент представляет собой SN-38. В предпочтительном варианте в конъюгатах в предпочтительных вариантах реализации антитело соединено по меньшей мере с одним химиотерапевтическим фрагментом; предпочтительно, с химиотерапевтическими фрагментами в количестве от 1 до приблизительно 12; наиболее предпочтительно приблизительно с 6 - приблизительно с 12 химиотерапевтическими фрагментами.

[076] Кроме того, согласно предпочтительному варианту реализации указанный линкерный компонент «L2» содержит тиольную группу, которая вступает в реакцию с реакционноспособным в отношении тиола остатком, введенным в одну или более аминогрупп боковой цепи лизина указанного антитела. В таких случаях антитело предварительно дериватизируют реакционноспособной в отношении тиола группой, такой как малеимидная, винилсульфоновая, бромацетамидная или иодацетамидная, посредством процедур, хорошо описанных в данной области техники.

[077] В контексте указанного исследования неожиданным образом был открыт способ, с помощью которого могут быть получены лекарственные СРТ с линкерами, в которых СРТ дополнительно содержит 10-гидроксильную группу. Указанный способ включает, не ограничиваясь указанным, защиту 10-гидроксильной группы как трет-бутилоксикарбонильного (ВОС) производного с последующим получением предпоследнего промежуточного продукта конъюгата лекарственного средства с линкером. Обычно для удаления ВОС-группы требуется обработка сильной кислотой, такой как трифторуксусная кислота (ТФК). В указанных условиях карбонат СРТ 20-0-линкера, содержащий защитные группы, которые требуется удалить, также подвержен расщеплению с образованием таким образом немодифицированного СРТ. Фактически, обоснование для применения умеренно легко удаляемой метокситритильной (ММТ) защитной группы боковой цепи лизина молекулы линкера, как известно в данной области техники, заключалось именно в устранении указанной возможности (Walker et al., 2002). Было обнаружено, что селективное удаление фенольной защитной ВОС-группы возможно осуществить путем проведения реакций короткой продолжительности, оптимально - от 3 до 5 минут. В указанных условиях преобладал продукт, в котором «ВОС» в 10-гидрокси-положении был удален, тогда как карбонат в положении «20» оставался интактным.

[078] Альтернативный подход включает защиту 10-гидрокси-положения аналога СРТ группой, отличной от «ВОС», таким образом, чтобы конечный продукт был готов для конъюгации с антителами без необходимости снятия защиты 10-ОН-защитной группы. 10-гидрокси-защитная группа, которая преобразует 10-ОН в фенольный карбонат или сложный фенольный эфир, легко снимается под действием физиологических значений рН или под действие эстераз после введения конъюгата in vivo. Более быстрое удаление фенольного карбоната в положении 10 относительно третичного карбоната в положении 20 10-гидроксикамптотецина в физиологических условиях было описано Не с соавторами (Не et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry 12: 4003-4008 (2004)). 10-гидрокси-защитная группа на SN-38 может представлять собой «COR», где R может представлять собой замещенный алкил, такой как «N(CH₃)₂-(CH₂)_n-», где n представляет собой 1-10, а концевая аминогруппа необязательно находится в форме четвертичной соли для улучшения водорастворимости, или простой остаток алкила, такой как «СН₃-(СН₂)_n-», где n представляет собой 0-10, или он может представлять собой фрагмент алкоксигруппы, такой как «СН₃-(СН₂)n-O-», где n представляет собой 0-10, или «N(CH₃)₂-(CH₂)_n-O-», где n представляет собой 2-10, или «R₁O-(CH₂-CH₂-O)_n-CH₂-CH₂-O-», где R₁ представляет собой этил или метил, и n представляет собой целое число, принимающее значения 0-10. Указанные 10-гидроксипроизводные легко получить путем обработки хлорформатом выбранного реагента, если итоговое производное должно представлять собой карбонат. Как правило, 10-гидрокси-содержащий камптотецин, такой как SN-38, обрабатывают молярным эквивалентом хлорформата в диметилформамиде с применением триэтиламина в качестве основания. В указанных условиях положение 20-ОН не затрагивается. Для получения сложных 10-O-эфиров используют хлорангидрид выбранного реагента.

[079] Согласно предпочтительному способу получения конъюгата производного лекарственного средства и антитела общей формулы 2, где обозначения L2, L1, АК и А-Х соответствуют описанию в разделах выше, сначала получают бифункциональный лекарственный фрагмент, [L2]-[L1]-[AК]_m-[А-Х] - Лекарственное средство, а затем конъюгируют бифункциональный фрагмент лекарственного средства с антителом (обозначаемым в настоящем документе «MAb»).

[080] Согласно предпочтительному способу получения конъюгата производного лекарственного средства и антитела общей формулы 2, где обозначения L2, L1, АК и А-ОН соответствуют описанию в разделах выше, бифункциональный лекарственный фрагмент получают сначала путем соединения А-ОН с С-концом АК посредством амидной связи, с последующим соединением аминоконца АК с карбоксикислотной группой L1. Если АК отсутствует (т.е. m=0), А-ОН прямо присоединяют к L1 посредством амидной связи. Кросс-линкер, [L1]-[AК]_m-[A-OH], присоединяют к гидроксильной группе или аминогруппе лекарственного средства, с последующим прикреплением к фрагменту L1, прибегая к реакции между азидной (или ацетиленовой) и ацетиленовой (или азидной) группами L и L2 с помощью клик-химии.

[081] Согласно одному варианту реализации указанное антитело представляет собой моноклональное антитело (MAb). Согласно другим вариантам реализации указанное антитело может представлять собой мультивалентное и/или мультиспецифическое MAb. Указанное антитело может представлять собой моноклональное антитело мыши, химерное антитело, гуманизированное антитело или антитело человека; указанное антитело может быть в форме интактного антитела, фрагмента (Fab, Fab», F(ab)₂, Р(ab')₂), или субфрагмента (одноцепочечные конструкции), или антитела изотипа IgG1, IgG2a, IgG3, IgG4, IgA, или соответствующих им субмолекул.

[082] Согласно предпочтительному варианту реализации указанное антитело связывается с антигеном или эпитопом антигена, экспрессируемого на раковой или злокачественной клетке, наиболее предпочтительно - с Trop-2. Указанная раковая клетка предпочтительно представляет собой клетку гематопоэтической опухоли, карциномы, саркомы, меланомы или глиальной опухоли. Предпочтительное злокачественное заболевание, подлежащее лечению в соответствии с настоящим изобретением, представляет собой злокачественную солидную опухоль или гематопоэтическое новообразование.

[083] Согласно предпочтительному варианту реализации расщепляемый внутриклеточно фрагмент может быть расщеплен после интернализации клеткой при связывании конъюгата MAb с лекарственным средством с его рецептором.

Антитела - ингибиторы контрольных точек

[084] Исследования с антителами - ингибиторами контрольных точек для терапии рака обеспечили беспрецедентные показатели ответа при видах рака, которые ранее считались устойчивыми к противораковому лечению (см., например, Ott & Bhardwaj, 2013, Frontiers in Immunology 4:346; Menzies & Long, 2013, Ther Adv Med Oncol 5:278-85; Pardoll, 2012, Nature Reviews 12:252-264; Mavilio & Lugli,). Терапия антагонистическими блокирующими контрольные точки антител против CTLA-4, PD-1 и PD-L1 представляет собой один из наиболее многообещающих новых путей иммунотерапии рака и других заболеваний. В отличие от большинства противораковых агентов, ингибитор контрольной точки не нацелен прямо на опухолевые клетки, а нацелен на рецепторы лимфоцитов или их лиганды, усиливая эндогенную противоопухолевую активность иммунной системы (Pardoll, 2012, Nature Reviews 12:252-264). Поскольку такие антитела действуют в основном путем регуляции иммунного ответа на пораженные заболеванием клетки, ткани или патогены, они могут применяться в комбинации с другими терапевтическими методами, например, конъюгатами антитела с лекарственным средством (ADC), для усиления противоопухолевого эффекта указанных ADC.

[085] Белок запрограммированной смерти клеток 1 (PD-1, также известный как CD279) кодирует мембранный белок поверхности клеток из суперсемейства иммуноглобулинов, который экспрессируется в В-клетках и NK-клетках (Shinohara et al., 1995, Genomics 23:704-6; Blank et al., 2007, Cancer Immunol Immunother 56:739-45; Finger et al., 1997, Gene 197:177-87; Pardoll, 2012, Nature Reviews 12:252-264). Антитела против PD1 применялись для лечения меланомы, немелкоклеточного рака легкого, рака мочевого пузыря, рака предстательной железы, рака ободочной и прямой кишки, рака головы и шеи, рака молочной железы с тройным негативным фенотипом, лейкоза, лимфомы и почечно-клеточного рака (Topalian et al., 2012, N Engi J Med 366:2443-54; Lipson et al., 2013, Clin Cancer Res 19:462-8; Berger et al., 2008, Clin Cancer Res 14:3044-51; Gildener-Leapman et al., 2013, Oral Oncol 49:1089-96; Menzies & Long, 2013, Ther Adv Med Oncol 5:278-85).

[086] Примеры антител против PD1 включают пембролизумаб (МК-3475, MERCK), ниволумаб (BMS-936558, BRISTOL-MYERS SQUIBB) и пидилизумаб (СТ-011, CURETECH LTD.). Антитела против PD 1 коммерчески доступны, например, от АВСАМ® (АВ137132), BIOLEGEND® (EH12.2H7, RMP1-14) и AFFYMETRIX EBIOSCIENCE (J105, J116, MIH4).

[087] Лиганд 1 запрограммированной гибели клеток 1 (PD-L1, также известный как CD274) представляет собой лиганд PD-1, обнаруживаемый на активированных Т-клетках, В-клетки, миелоидных клетках и макрофагах. Комплекс PD-1 и PD-L1 ингибирует пролиферацию CD8+ Т-клеток и уменьшает иммунный ответ (Topalian et al., 2012, N Engi J Med 366:2443-54; Brahmer et al., 2012, N Eng J Med 366:2455-65). Антитела против PDL1 применялись для лечения немелкоклеточного рака легкого, меланомы, рака ободочной и прямой кишки, почечно-клеточного рака, рака поджелудочной железы, рака желудка, рака яичников, рака молочной железы и гематологических злокачественных новообразований (Brahmer et al., N Eng J Med 366:2455-65; Ott et al., 2013, Clin Cancer Res 19:5300-9; Radvanyi et al., 2013, Clin Cancer Res 19:5541; Menzies & Long, 2013, Ther Adv Med Oncol 5:278-85; Berger et al., 2008, Clin Cancer Res 14:13044-51).

[088] Примеры антител против PDL1 включают MDX-1105 (MEDAREX), дурвалумаб (MEDI4736, MEDIMMUNE), атезолизумаб (TECENTRIQ®, MPDL3280A, GENENTECH) и BMS-936559 (BRISTOL-MYERS SQUIBB). Антитела против PDL1 также коммерчески доступны, например, от AFFYMETRIX EBIOSCIENCE (MIH1).

[089] Антиген 4 цитотоксических Т-лимфоцитов (CTLA-4, также известный как CD152) также является представителем суперсемейства иммуноглобулинов, экспрессируемых исключительно на Т-клетках. Действие CTLA-4 заключается в ингибировании активации Т-клеток и, согласно сообщениям, он ингибирует активность хелперных Т-клеток и усиливает иммуносупрессивную активность регуляторных Т-клеток (Pardoll, 2012, Nature Reviews 12:252-264). Антитела против CTL4A применялись в клинических испытаниях для лечения меланомы, рака предстательной железы, мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого (Robert & Ghiringhelli, 2009, Oncologist 14:848-61; Ott et al., 2013, Clin Cancer Res 19:5300; Weber, 2007, Oncologist 12:864-72; Wada et al., 2013, J Transl Med 11:89).

[090] Примеры антител против CTLA4 включают ипилимумаб (Bristol-Myers Squibb) и тремелимумаб (PFIZER). Антитела против PD1 коммерчески доступны, например, от АВСАМ® (АВ134090), SINO BIOLOGICAL INC. (11159-Н03Н, 11159-Н08Н) и THERMO SCIENTIFIC PIERCE (PA5-29572, PA5-23967, PA5-26465, MA1-12205, MA1-35914). Ипилимумаб недавно получил одобрение FDA для лечения метастатической меланомы (Wada et al., 2013, J Transl Med 11:89).

[091] Указанные и другие известные антитела - ингибиторы контрольных точек могут применяться в комбинации с IMMU-132. Согласно предпочтительным вариантам реализации IMMU-132, по отдельности или в комбинации, эффективен для лечения пациентов с раковыми заболеваниями, рефракторными к антителам - ингибиторам контрольной точки при их отдельном применении.

Общие методики работы с антителами

[092] Техники получения моноклональных антител практически против любого целевого антигена хорошо известны в данной области техники. См., например, источники: Milstein, Nature 256: 495 (1975), и Coligan et al. (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, VOL. 1, pages 2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991). Вкратце, моноклональные антитела могут быть получены путем инъецирования мышам композиции, содержащих антиген, извлечения селезенки для получения В-лимфоцитов, слияния В-лимфоцитов с клетками миеломы с получением гибридом, клонирования указанных гибридом, выбора положительных клонов, которые продуцируют антитела к указанному антигену, культивирования клонов, которые продуцируют антитела к указанному антигену, и выделения указанных антител из культур гибридом. Среднему специалисту в данной области техники будет ясно, что в тех случаях, когда антитела предназначены для введения субъектам-людям, указанные антитела связываются с антигенами человека.

[093] MAb могут быть выделены и очищены из культур гибридом с применением различных хорошо разработанных методик. Такие методики выделения включают аффинную хроматографию на сефарозе с белком А или белком G, эксклюзионную хроматографию и ионообменную хроматографию. См., например, Coligan, стр. 2.7.1-2.7.12 и стр. 2.9.1-2.9.3. Также см. источник: Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)", в руководстве «Методы молекулярной биологии» (METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY), том 10, стр. 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992)).

[094] После начального получения антител к иммуногену указанные антитела могут быть секвенированы, а затем обработаны с применением рекомбинантных технологий. Гуманизация и химеризация антител и фрагментов антитела мыши хорошо известны специалистам в данной области техники, согласно обсуждению ниже.

[095] Специалисту будет понятно, что в заявленных способах и композициях могут быть задействованы любые из широкого спектра антител, известных в данной области техники. Антитела, подходящие для применения, могут быть получены коммерческим путем из широкого ряда известных источников. Например, секретирующие различные антитела линии гибридом доступны в Американской коллекции типовых культур (АТСС, Манассас, Виргиния). Значительное число антител против различных связанных с заболеваниями мишеней, в том числе, но не ограничиваясь указанным, опухолеассоциированных антигенов, было депонировано в АТСС, и/или были опубликованы последовательности их вариабельных областей, и они доступны для применения в заявленных способах и композициях. См., например, патенты США №7312318, №7282567, №7151164, №7074403, №7060802, №7056509, №7049060, №7045132, №7041803, №7041802, №7041293, №7038018, №7037498, №7012133, №7001598, №6998468, №6994976, №6994852, №6989241, №6974863, №6965018, №6964854, №6962981, №6962813, №6956107, №6951924, №6949244, №6946129, №6943020, №6939547, №6921645, №6921645, №6921533, №6919433, №6919078, №6916475, №6905681, №6899879, №6893625, №6887468, №6887466, №6884594, №6881405, №6878812, №6875580, №6872568, №6867006, №6864062, №6861511, №6861227, №6861226, №6838282, №6835549, №6835370, №6824780, №6824778, №6812206, №6793924, №6783758, №6770450, №6767711, №6764688, №6764681, №6764679, №6743898, №6733981, №6730307, №6720155, №6716966, №6709653, №6693176, №6692908, №6689607, №6689362, №6689355, №6682737, №6682736, №6682734, №6673344, №6653104, №6652852, №6635482, №6630144, №6610833, №6610294, №6605441, №6605279, №6596852, №6592868, №6576745, №6572,856, №6566076, №6562618, №6545130, №6544749, №6534058, №6528625, №6528269, №6521227, №6518404, №6511665, №6491915, №6488930, №6482598, №6482408, №6479247, №6468531, №6468529, №6465173, №6461823, №6458356, №6455044, №6455040 6451310, №6444206, №6441143, №6432404, №6432402, №6419928, №6413726, №6406694, №6403770, №6403091, №6395276, №6395274, №6387350, №6383759, №6383484, №6376654, №6372215, №6359126, №6355481, №6355444, №6355245, №6355244, №6346246, №6344198, №6340571, №6340459, №6331175, №6306393, №6254868, №6187287, №6183744, №6129914, №6120767, №6096289, №6077499, №5922302, №5874540, №5814440, №5798229, №5789554, №5776456, №5736119, №5716595, №5677136, №5587459, №5443953, №5525338, раздел примеров каждой из которых включен в настоящий документ посредством ссылки. Указанные антитела являются исключительно примерами, и в данной области техники известен широкий спектр других антител и их гибридом. Специалисту будет понятно, что последовательности антител или секретирующих антитела гибридом практически против любого ассоциированного с заболеванием антигена могут быть получены путем простого поиска в базах данных АТСС, NCBI и/или USPTO антител против выбранной представляющей интерес ассоциированной с заболеванием мишени. Антигенсвязывающие домены клонированных антител могут быть амплифицированы, вырезаны, дотированы в экспрессионный вектор, трансфицировали адаптированную клетку-хозяина и использовали для получения белка, с применением стандартных методик, хорошо известных в данной области техники. Выделенные антитела могут быть конъюгированы с терапевтическими агентами, такими как камптотецины, с применением методик, описанных в настоящем документе.

Химерные и гуманизированные антитела

[096] Химерное антитело представляет собой рекомбинантный белок, в котором вариабельные области антитела человека были заменены на вариабельные области, например, антитела мыши, включая определяющие комплементарность области (CDR) антитела мыши. Химерные антитела демонстрируют пониженную иммуногенность и повышенную стабильность при введении субъекту. Способы конструирования химерных антител хорошо известны в данной области техники (например, Leung et al., 1994, Hybridoma 13:469).

[097] Химерное моноклональное антитело может быть гуманизировано путем переноса областей CDR мыши из вариабельных тяжелых и легких цепей иммуноглобулина мыши в соответствующие вариабельные домены антитела человека. Каркасные области (FR) мыши в химерном моноклональном антителе также заменяют последовательностями FR человека. Для сохранения стабильности и антигенной специфичности гуманизированного моноклонального антитела один или более остатков FR человека могут быть заменены на соответствующие остатки мыши. Гуманизированные моноклональные антитела могут применяться для терапевтического лечения субъектов. Техники получения гуманизированных моноклональных антител хорошо известны в данной области техники. (См., например, Jones et al., 1986, Nature, 321:522; Riechmann et al., Nature, 1988, 332:323; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534; Carter et al., 1992, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 89:4285; Sandhu, Crit. Rev. Biotech., 1992, 12:437; Tempest et al., 1991, Biotechnology 9:266; Singer et al., J. Immun., 1993, 150:2844.)

[098] Другие варианты реализации могут предусматривать антитела не являющихся человеком приматов. Общие методики получения терапевтически полезных антител у павианов описаны, например, в источниках: Goldenberg et al., WO 91/11465 (1991) и Losman et al., Int. J. Cancer 46: 310 (1990). Согласно другому варианту реализации антитело может представлять собой моноклональное антитело человека. Такие антитела могут быть получены от трансгенных мышей, которые сконструированы для продуцирования специфических антител человека в ответ на антигенную стимуляцию, согласно обсуждению ниже.

Антитела человека

[099] Способы получения полностью человеческих антител с применением либо комбинаторных подходов, либо трансгенных животных, трансформированных локусами иммуноглобулинов человека, известны в данной области техники (см., например, источники: Mancini et а1„ 2004, New Microbiol. 27:315-28; Conrad, Scheller, 2005, Comb. Chem. High Throughput Screen. 8:117-26; Brekke, Loset, 2003, Curr. Opin. Phamacol. 3:544-50; каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки). Такие полностью человеческие антитела, согласно ожиданиям, должны демонстрировать еще меньше побочных эффектов, чем химерные или гуманизированные антитела, и функционировать in vivo по существу так же, как и эндогенные антитела человека. Согласно некоторым вариантам реализации заявленные способы и процедура могут задействовать антитела человека, полученные с применением таких методик.

[0100] Согласно одному альтернативному варианту для получения антител человека может применяться методика фагового дисплея (см., например, источник: Dantas-Barbosa et al., 2005, Genet. Mol. Res. 4:126-40, включенный в настоящий документ посредством ссылки). Антитела человека могут быть получены от здоровых людей, или от людей, у которых наблюдается конкретное болезненное состояние, например, рак (Dantas-Barbosa et al., 2005). Преимущество конструирования антител человека на основе антител пораженного заболеванием индивидуума заключается в том, что репертуар циркулирующих антител может быть смещен в сторону антител против ассоциированных с заболеванием антигенов.

[0101] Согласно одному неограничивающему примеру указанной методологии Dantas-Barbosa с соавторами (2005) конструировали библиотеку фагового дисплея Fab-фрагментов антител человека от пациентов с остеосаркомой. Как правило, тотальную РНК получали из циркулирующих в кровотоке лимфоцитов (выше). Рекомбинантпый Fab клонировали из репертуаров μ, γ и κ-цепей антител и встраивали в библиотеку фагового дисплея (выше). РНК преобразовывали в кДНК и использовали для получения библиотек кДНК Fab с применением специфических праймеров против тяжелых и легких цепей последовательностей иммуноглобулинов (см. источник: Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581-97, включенный в настоящий документ посредством ссылки). Конструирование библиотеки выполняли в соответствии с источником: Andris-Widhopf et al., 2000, в руководстве Phage Display Laboratory Manual, Barbas et al. (eds), 1^st edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp. 9.1-9.22, включенным в настоящий документ посредством ссылки). Итоговые Fab-фрагменты расщепляли рестрикционными эндонуклеазами и встраивали в геном бактериофага с получением библиотеки фагового дисплея. Скрининг таких библиотек может быть проведен с применением стандартных способов фагового дисплея. Специалисту будет понятно, что указанная методика является исключительно примером, и может быть использован любой известный способ получения и скрининга антител или фрагментов антител человека посредством фагового дисплея.

[0102] Согласно другому альтернативному варианту могут быть использованы трансгенные животные, которые были генетически сконструированы для получения антител человека, для получения антител по существу против любой иммуногенной мишени с применением стандартных протоколов иммунизации согласно обсуждению выше. Способы получения антител человека у трансгенных мышей описаны в источниках: Green et al., Nature Genet. 7:13 (1994), Lonberg et al., Nature 368:856 (1994) и Taylor et al., Int. Immun. 6:579 (1994). Неограничивающим примером такой системы является XENOMOUSE® (см., например, источник: Green et al., 1999, J. Immunol. Methods 231:11-23, включенный в настоящий документ посредством ссылки) от Abgenix (Фремонт, Калифорния), где гены антител мыши инактивированы и заменены на функциональные гены антител человека, тогда как остальная иммунной системы мышей остается интактной.

[0103] Трансгенных мышей трансформировали YAC (искусственными дрожжевыми хромосомами) в конфигурации зародышевой линии, содержавшими фрагменты локусов IgH и каппа-цепей Ig человека, в том числе большинство последовательностей вариабельных областей, а также вспомогательные гены и регуляторные последовательности. Репертуар вариабельных областей человека может применяться для получения продуцирующих антитела В-клеток, которые могут быть преобразованы в гибридомы путем применения известных методик. Мыши XENOMOUSE®, иммунизированные целевым антигеном, в результате нормального иммунного ответа продуцируют антитела человека, которые могут быть собраны и/или получены с применением стандартных методик, согласно обсуждению выше. Доступны различные линии генетически сконструированных мышей, каждая из которых способна продуцировать отдельный класс антител. Было показано, что полученные трансгенным способом антитела человека обладают терапевтическим потенциалом при сохранении фармакокинетических свойств нормальных антител человека (Green et al., 1999). Специалисту будет понятно, что заявленные композиции и способы не ограничены применением системы XENOMOUSE®, и могут задействовать использование любых трансгенных животных, которые были генетически сконструированы для получения антител человека.

Получение фрагментов антитела

[0104] Некоторые варианты реализации заявленных способов и/или композиций могут предусматривать фрагменты антитела. Такие фрагменты антитела могут быть получены, например, путем расщепления пепсином или папаином целых антител с применением стандартных способов. Например, фрагменты антитела могут быть получены путем ферментативного расщепления антител пепсином для обеспечения 5S-фрагмента, обозначаемого F(ab')₂. Указанный фрагмент может быть дополнительно расщеплен с применением тиол-восстанавливающего агента и, необязательно, блокирующей группы для сульфгидрильных групп, образующихся при расщеплении дисульфидных связей, с получением моновалентных 3,5S Fab'-фрагментов. Как вариант, ферментативное расщепление с применением пепсина дает два моновалентных Fab-фрагмента и Fc-фрагмент. Примеры способов получения фрагментов антител описаны в патенте США №4036945; патенте США №4331647; в источниках: Nisonoff et al., 1960, Arch. Biochem. Biophys., 89:230; Porter, 1959, Biochem. J., 73:119; Edelman et al., 1967, METHODS IN ENZYMOLOGY, page 422 (Academic Press); и Coligan et al. (eds.), 1991, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, (John Wiley & Sons).

[0105] Также могут применяться другие способы расщепления антител, такие как отделение тяжелых цепей с образованием моновалентных фрагментов легких/тяжелых цепей, дополнительное расщепление фрагментов или другие ферментативные, химические или генетические методики, при условии, что указанные фрагменты связываются с антигеном, распознаваемым интактным антителом. Например, Fv-фрагменты включают связь между цепями V_H и V_L. Указанная связь может быть нековалентной, как описано в источнике: Inbar et al., 1972, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 69:2659. Как вариант, вариабельные цепи могут быть соединены межмолекулярной дисульфидной связью или перекрестно-сшиты химическими веществами, такими как глутаральдегид. См. Sandhu, 1992, Crit. Rev. Biotech., 12:437.

[0106] В предпочтительном варианте Fv-фрагменты содержат цепи V_H и V_L, соединенные пептидным линкером. Указанные одноцепочечные антигенсвязывающие белки (scFv) получают путем конструирования структурного гена, содержащего последовательности ДНК, кодирующие домены V_H и V_L, соединенные последовательностью олигонуклеотидного линкера. Структурный ген встраивают в экспрессионный вектор, который затем вводят в клетку-хозяина, например, Е. coli. Рекомбинантные клетки-хозяева синтезируют одиночную полипептидную цепь с линкерным пептидом, образующим мостик между двумя V-доменами. Способы получения scFv хорошо известны в данной области техники. См. источники: Whitlow et al., 1991, Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:97; Bird et al., 1988, Science, 242:423; патент США №4946778; Pack et al., 1993, Bio/Technology, 11:1271; и Sandhu, 1992, Crit. Rev. Biotech., 12:437.

[0107] Другой формой фрагмента антитела является однодоменное антитело (dAb), иногда называемое одноцепочечным антителом. Техники получения однодоменных антител хорошо известны в данной области техники (см., например, Cossins et al., Protein Expression and Purification, 2007, 51:253-59; Shuntao et al., Molec Immunol 2006, 43:1912-19; Tanha et al., J. Biol. Chem. 2001, 276:24774-780). Другие типы фрагментов антитела могут содержать одну или более определяющих комплементарность областей (CDR). CDR-пептиды («минимальные единицы распознавания») могут быть получены путем конструирования генов, кодирующих CDR представляющего интерес антитела. Такие гены получают, например, с применением полимеразной цепной реакции для синтеза вариабельной области с РНК продуцирующих антитело клеток. См. источники: Larrick et al., 1991, Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106; Ritter et al. (eds.), 1995, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRODUCTION, ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION, pages 166-179 (Cambridge University Press); Birch et al., (eds.), 1995, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND APPLICATIONS, pages 137-185 (Wiley-Liss, Inc.)

Варианты антител

[0108] Согласно некоторым вариантам реализации последовательности антител, такие как Fc-части антител, могут варьировать для оптимизации физиологических характеристик конъюгатов, таких как время полужизни в сыворотке. В данной области техники широко известны способы замены последовательностей аминокислот в белках, такие как сайт-специфический мутагенез (см., например, Sambrook et al., Molecular Cloning, A laboratory manual, 2^nd Ed, 1989). Согласно предпочтительным вариантам реализации вариант может предусматривать добавление или удаление одного или более сайтов гликозилирования в последовательности Fc (см., например, патент США №6254868, раздел примеров которого включен в настоящий документ посредством ссылки). Согласно другим предпочтительным вариантам реализации могут быть осуществлены специфические замены аминокислот в последовательности Fc (см., например, источники: Hornick et al., 2000, J Nucl Med 41:355-62; Hinton et al., 2006, J Immunol 176:346-56; Petkova et al. 2006, Int Immunol 18:1759-69; патент США №7217797; каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки).

Целевые антигены и примеры антител

[0109] Согласно предпочтительному варианту реализации используют антитела, которые распознают антигены и/или связываются с антигенами, которые экспрессируются на высоких уровнях на целевых клетках, и в основном или исключительно экспрессируются на пораженных заболеванием клетках, а не в нормальных тканях. В более предпочтительном варианте указанные антитела быстро интернализуются после связывания. Примером быстро интернализующегося антитела является антитело LL1 (против CD74), показатель интернализации которого составляет приблизительно 8×10⁶ молекул антитела на клетку в сутки (см., например, Hansen et al., 1996, Biochem J. 320:293-300). Соответственно, «быстро интернализующееся» антитело может быть представлено антителом, показатель интернализации которого составляет от приблизительно 1×10⁶ до приблизительно 1×10⁷ молекул антитела на клетку в сутки. Антитела, подходящие для применения в заявленных композициях и способах может включать MAb, обладающие свойствами, описанными выше. Примеры антител, подходящих для применения в терапии, например, рака, включают, не ограничиваясь перечисленными, антитела LL1 (против CD74), LL2 или RFB4 (против CD22), велтузумаб (hA20, против CD20), ритуксимаб (против CD20), обинутузумаб (GA101, против CD20), ламбролизумаб (против рецептора PD-1), ниволумаб (против рецептора PD-1), ипилимумаб (против CTLA-4), RS7 (против эпителиального гликопротеина-1 (EGP-1, также известного как TROP-2)), PAM4 или КС4 (оба против муцина), MN-14 (против карциноэмбрионального антигена (КЭА, также известного как CD66e, или СЕАСАМ5), MN-15 или MN-3 (против СЕАСАМ6), Ми-9 (против специфического для ободочной кишки антигена-р), Immu 31 (против альфа-фетопротеина), R1 (против ИФР-IR), А 19 (против CD 19), TAG-72 (например, СС49), Tn, J591 или HuJ591 (против ПСМА (специфического мембранного антигена предстательной железы)), AB-PG1-XG1-026 (против димера ПСМА), D2/B (против ПСМА), G250 (MAb против карбоангидразы IX), L243 (против HLA-DR), алемтузумаб (против CD52), бевацизумаб (против ФРЭС), цетуксимаб (против EGFR), гемтузумаб (против CD33), ибритутомаб тиуксетан (против CD20); панитумумаб (против EGFR); тозитумомаб (против CD20); PAM4 (или кливатузумаб, против муцина) и трастузумаб (против ErbB2). Такие антитела известны в данной области техники (см., например, источники: патенты США №5686072; №5874540; 6107090; 6183744; 6306393; 6653104; 6730.300; 6899864; 6926893; 6962702; 7074403; 7230084; 7238785; 7238786; 7256004; 7282567; 7300655; 7312318; 7585491; 7612180; 7642239; и опубликованные заявки на патент США №20050271671; №20060193865; №20060210475; №20070087001; разделы примеров каждого из которых включены в настоящий документ посредством ссылок.) Специфические известные антитела, подходящие для применения, включают hPAM4 (патент США №7282567), hA20 (патент США №7251164), hA19 (патент США №7109304), hIMMU-31 (патент США №7300655), hLL1 (патент США №7312318), hLL2 (патент США №7074403), hMu-9 (патент США №7387773), hL243 (патент США №7612180), hMN-14 (патент США №6676924), hMN-15 (патент США №7541440), hR1 (заявка на патент США 12/772645), hRS7 (патент США №7238785), hMN-3 (патент США №7541440), AB-PG1-XG1-026 (заявка на патент США 11/983372, депонировано в АТСС под номерами РТА-4405 и РТА-4406) и D2/B (WO 2009/130575); текст каждого из упомянутых патентов и каждой из упомянутых заявок включен в настоящий документ посредством ссылок, применительно к разделам чертежей и примеров. Согласно конкретному предпочтительному варианту реализации указанное антитело представляет собой hRS7. Специалисту в данной области техники будет понятно, что, согласно некоторым вариантам реализации, в комбинации с антителом против Trop-2 могут применяться антитела против других ТАА, помимо Trop-2.

[0110] Другие подходящие антигены, которые могут быть целевыми, включают карбоангидразу IX, В7, CCL19, CCL21, CSAp, HER-2/neu, BrE3, CD1, CD1a, CD2, CD3, CD4, CD5. CD8, CD11A, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20 (например. С2 В8, MAb hA20, 1F5), CD21, CD22, CD23, CD25, CD29, CD30, CD32b, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD52, CD54, CD55, CD59, CD64, CD67, CD70, CD74, CD79a, CD80, CD83, CD95, CD126, CD133, CD138, CD147, CD154, CEACAM5, CEACAM6, CTLA-4, альфа-фетопротеин (АФП), ФРЭС (например, бевацизумаб, вариант сплайсинга фибронектина), фибронектин ED-B (например, L19), EGP-1 (TROP-2), EGP-2 (например, 17-1А), рецептор EGF (ErbB1) (например, цетуксимаб), ErbB2, ErbB3, фактор Н, FHL-1, Flt-3, фолатный рецептор, Ga733, GRO-β, HMGB-1, индуцируемый гипоксией фактор (HIF), HM1.24, HER-2/neu, инсулиноподобный фактор роста (ИФР), ИФН-γ, ИФН-α, ИФН-β, ИФН-λ, ИЛ-2R, ИЛ-4R, ИЛ-6R, ИЛ-13R, ИЛ-15R, ИЛ-17R, ИЛ-18R, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12, ИЛ-15, ИЛ-17, ИЛ-18, ИЛ-25, IP-10, ИФР-1R, Ia, HM1.24, ганглиозиды, HCG, антиген HLA-DR, с которым связывается L243, антигены CD66, т.е. CD66a-d или их комбинация, MAGE, mCRP, MCP-1, MIP-1A, MIP-1B, фактор ингибирования миграции макрофагов (MIF), MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5ac, плацентарный фактор роста (ПФР), ПСА (простатический специфический антиген), ПСМА, антиген РАМ4, рецептор PD-1, NCA-95, NCA-90, A3, А22, Ер-САМ, KS-1, Le(y), мезотелин, S100, тенасцин, ТАС, антиген Tn, антигены Томсона-Фриденрайха, антигены некроза опухоли, антигены ангиогенеза опухоли, ФНО-α, рецептор TRAIL (R1 и R2), TROP-2, рФРЭС, RANTES, Т101, а также антигены раковых стволовых клеток, факторы комплемента С3, С3а, C3b, С5а, С5 и продукт онкогена.

[0111] Комплексный анализ подходящих антигенных (Cluster Designation, или CD) мишеней на гематопоэтических злокачественных клетках, как показано с помощью проточной цитометрии, который может служить руководством для выбора подходящих антител для иммунотерапии конъюгированными лекарственными средствами, описан в источнике: Craig, Foon, Blood, предварительная публикация в сети 15 января 2008 г.; DOL 10.1182/blood-2007-11-120535.

[0112] Антигены CD66 состоят из пяти разных гликопротеинов с аналогичной структурой, CD66a-e, кодируемых представителями семейства генов карциноэмбриональных антигенов (КЭА), BCG, CGM6, NCA, CGM1 и КЭА, соответственно. Указанные антигены CD66 (например, СЕАСАМ6) экспрессируются в основном в гранулоцитах, нормальных эпителиальных клетках пищеварительного тракта и опухолевых клетках различных тканей. Также в качестве подходящих раковых мишеней предусмотрены антигены рака семенников, такие как NY-ESO-1 (Theurillat et al., Int. J. Cancer 2007; 120(11):2411-7), и CD79a при миелоидном лейкозе (Kozlov et al., Cancer Genet. Cytogenet. 2005; 163(1):62-7), а также В-клеточных заболеваний, и CD79b при неходжкинской лимфоме (Poison et al., Blood 110(2):616-623). Ряд вышеупомянутых антигенов описан в предварительной заявке на патент США сер. №60/426379, имеющей название «Use of Multi-specific, Non-covalent Complexes for Targeted Delivery of Therapeutics» («Применение мультиспецифических нековалентных комплексов для нацеленной доставки терапевтических средств»), поданной 15 ноября 2002 г.. Раковые стволовые клетки, которые считаются более устойчивыми к терапии популяциями злокачественных клеток-предшественников (Hill, Perris, J. Natl. Cancer Inst. 2007; 99:1435-40), содержат антигены, которые могут быть мишенями при определенных типах рака, такие как CD 133 при раке предстательной железы (Maitland et al., Ernst Schering Found. Sympos. Proc. 2006; 5:155-79), немелкоклеточном раке легкого (Donnenberg et al., J. Control Release 2007; 122(3):385-91) и глиобластоме (Beier et al., Cancer Res. 2007; 67(9):4010-5), и CD44 при раке ободочной и прямой кишки (Dalerba et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2007; 104(24)10158-63), раке поджелудочной железы (Li et al., Cancer Res. 2007; 67(3):1030-7) и при плоскоклеточной карциноме головы и шеи (Prince et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2007; 104(3)973-8). Другой подходящей мишенью для терапии рака молочной железы является антиген LIV-1, описанный Taylor с соавторами (Taylor et al., Biochem. J. 2003; 375:51-9). Антиген CD47 представляет собой дополнительную подходящую мишень для раковых стволовых клеток (см., например, Naujokat et al., 2014, Immunotherapy 6:290-308; Goto et al., 2014, Eur J Cancer 50:1836-46; Unanue, 2013, Proc Natl Acad Sci USA 110:10886-7).

[0113] Для терапии множественной миеломы были описаны подходящие нацеливающие антитела против, например, CD38 и CD 138 (Stevenson, Mol Med 2006; 12(11-12):345-346; Tassone et al., Blood 2004; 104(12):3688-96), CD74 (Stein et al., там же), CS1 (Tai et al., Blood 2008; 112(4):1329-37) и CD40 (Tai et al., 2005; Cancer Res. 65(13):5898-5906).

[0114] Фактор ингибирования миграции макрофагов (MIF) представляет собой важный регулятор врожденного и адаптивного иммунитета и апоптоза. CD74 был описан как эндогенный рецептор MIF (Leng et al., 2003, J Exp Med 197:1467-76). Терапевтический эффект антагонистических антител против CD74 на опосредованные MIF внутриклеточные пути может подходить для применения при лечении широкого спектра болезненных состояний, таких как рак мочевого пузыря, предстательной железы, молочной железы, легкого, ободочной кишки и хронический лимфоцитарный лейкоз (например, Meyer-Siegler et al., 2004, ВМС Cancer 12:34; Shachar & Haran, 2011, Leuk Lymphoma 52:1446-54); аутоиммунные заболевания, такие как ревматоидный артрит и системная красная волчанка (Morand & Leech, 2005, Front Biosci 10:12-22; Shachar & Haran, 2011, Leuk Lymphoma 52:1446-54); заболевания почек, такие как отторжение аллотрансплантата почки (Lan, 2008, Nephron Exp Nephrol. 109:e79-83); и многочисленные воспалительные заболевания (Meyer-Siegler et al., 2009, Mediators Inflamm epub March 22, 2009; Takahashi et al., 2009, Respir Res 10:33. Милатузумаб (hLL1) представляет собой пример антитела против CD74, подходящего для терапевтического применения при лечении опосредованных MIF заболеваний.

[0115] Антитела против ФНО-α известны в данной области техники и могут подходить для применения при лечении иммунных заболеваний, таких как аутоиммунное заболевание, иммунная дисфункция (например, болезнь «трансплантат против хозяина», отторжение трансплантата органа) или диабет. Известные антитела против ФНО-α включают антитело человека CDP571 (Ofei et al., 2011, Diabetes 45:881-85); антитела мыши MTNFAI, M2TNFAI, M3TNFAI, M3TNFABI, М302 В и М3О3 (Thermo Scientific, Рокфорд, Иллинойс); инфликсимаб (Centocor, Малверн, Пенсильвания); цертолизумаб пегол (UCB, Брюссель, Бельгия); и адалимумаб (Abbott, Эбботт-Парк, Иллинойс). Указанные и многие другие известные антитела против ФНО-α могут применяться в заявленных способах и композициях. Другие антитела, подходящие для применения в терапии иммунной дисрегуляции или аутоиммунных заболеваний, включают, не ограничиваясь перечисленными, антитела против В-клеток, такие как велтузумаб, эпратузумаб, милатузумаб или hL243; тоцилизумаб (против рецептора ИЛ-6); базиликсимаб (против CD25); даклизумаб (против CD25); эфализумаб (против CD 11а); муромонаб-CD3 (против рецептора CD3); антитело против CD40L (UCB, Брюссель, Бельгия); натализумаб (против интегрина α4) и омализумаб (против IgE).

[0116] Согласно другому предпочтительному варианту реализации используют антитела, которые быстро интернализуются и затем реэкспрессируются, процессируются и презентируются на поверхности клеток, обеспечивая непрерывное поглощение и накопление циркулирующего конъюгата клеткой. Примером наиболее предпочтительной пары антитело/антиген является LL1, MAb против CD74 (инвариантная цепь, специфический для класса II шаперон. Ii) (см., например, патенты США №6653104; №7312318; разделы примеров каждого из которых включены в настоящий документ посредством ссылок). Антиген CD74 экспрессируется на высоком уровне при В-клеточных лимфомах (в том числе множественной миеломе) и лейкозах, определенных Т-клеточных лимфомах, меланомах, раке ободочной кишки, легкого и почек, глиобластомах и некоторых других раковых заболеваниях (Ong et al., Immunology 98:296-302 (1999)). Обзор применения антител CD74 при раке приведен в источнике: Stein et al., Clin Cancer Res. 2007 Sep 15; 13(18 Pt 2):5556s-5563s, включенном в настоящий документ посредством ссылки.

[0117] Заболевания, лечение которых предпочтительно проводить антителами против CD74, включают, не ограничиваясь перечисленными, неходжкинскую лимфому, болезнь Ходжкина, меланому, рак легкого, почки, толстого кишечника, мультиформную глиобластому, гистиоцитомы, миелоидные лейкозы и множественную миелому. Постоянно возобновляющаяся экспрессия антигена CD74 через короткие периоды времени на поверхности целевых клеток с последующей интернализацией указанного антигена и реэкспрессией антигена обеспечивает интернализацию нацеливающего антитела LL1 вместе с любым химиотерапевтическим фрагментом, который он несет. Это обеспечивает высокую, являющуюся также терапевтической, концентрацию конъюгата LL1 с химиотерапевтическим лекарственным средством, накапливающегося внутри таких клеток. Интернализованные конъюгаты LL1 с химиотерапевтическим лекарственным средством циклически проходят через лизосомы и эндосомы, и химиотерапевтический фрагмент высвобождается в активной форме в целевых клетках.

Биспецифические и мультиспецифические антитела

[0118] Биспецифические антитела подходят для некоторых вариантов биомедицинского применения. Например, биспецифическое антитело с сайтами связывания опухолевого антигена клеточной поверхности и Т-рецептора клеточной поверхности может направлять лизис специфических опухолевых клеток Т-клетками. Биспецифические антитела, распознающие глиомы и эпитоп CD3 на Т-клетках, успешно применялись для лечения опухолей головного мозга у пациентов-людей (Nitta, et al. Lancet. 1990; 355:368-371). Предпочтительное биспецифическое антитело представляет собой антитело против CD3 × против CD 19. Согласно альтернативным вариантам реализации антитело против CD3 или его фрагмент может быть присоединено к антителу или фрагменту антитела против другого ассоциированного с В-клетками антигена, с получением, например, антитела против CD3 × против Trop-2, против CD3 × против CD20, против CD3 × против CD22, против CD3 × против HLA-DR; или против CD3 × против CD74. Согласно некоторым вариантам реализации методики и композиции для ADC-терапии, описанной в настоящем документе, могут применяться в комбинации с биспецифическими или мультиспецифическими антителами. Например, биспецифическое антитело (bsAb) против Trop-2 × против CD3 может вводиться до, одновременно или после ADC против Trop-2.

[0119] Известны многочисленные способы получения биспецифических или мультиспецифических антител, например, как описано в патенте США №7405320, раздел примеров которого включен в настоящий документ посредством ссылки. Биспецифические антитела могут быть получены квадромным способом, задействующим слияние двух разных гибридом, каждая из которых продуцирует моноклональное антитело, распознающее отличный антигенный сайт (Milstein, Cuello, Nature, 1983; 305:537-540).

[0120] В другом способе получения биспецифических антител используют гетеробифункциональные кросс-линкеры для химического связывания двух разных моноклональных антител (Staerz, et al. Nature, 1985; 314:628-631; Perez, et al. Nature, 1985; 316:354-356). Биспецифические антитела могут также быть получены путем редуцирования каждого из двух исходных моноклональных антител до соответствующих полумолекул, которые затем смешивают и оставляют для повторного окисления с получением гибридной структуры (Staerz, Bevan. Proc Natl Acad Sci USA. 1986; 83:1453-1457). Другой альтернативный вариант задействует химическое перекрестное связывание двух или трех по отдельности очищенных Fab'-фрагментов с применением подходящих линкеров. (См., например, заявку на европейский патент 0453082).

[0121] Другие способы включают повышение эффективности получения гибридных гибридом путем переноса генов отличающихся селектируемых маркеров посредством происходящих из ретровирусов челночных векторов в соответствующие исходные гибридомы, которые затем сливают (DeMonte, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1990, 87:2941-2945); или путем трансфекции линии клеток гибридомы экспрессионными плазмидами, содержащими гены тяжелых и легких цепей другого антитела.

[0122] Когнатные домены V_H и V_L могут быть соединены с пептидным линкером подходящего состава и длины (обычно состоящим из более чем 12 остатков аминокислот) с образованием одноцепочечного Fv (scFv) со связывающей активностью. Способы получения scFv описаны в патенте США №4946778 и патенте США №5132405, разделы примеров каждого из которых включены в настоящий документ посредством ссылок. Уменьшение длины пептидного линкера менее чем до 12 остатков аминокислот предотвращает спаривание доменов V_H и V_L на одной цепи и стимулирует спаривание доменов V_H и V_L с комплементарными доменами на других цепях, что приводит к образованию функциональных мультимеров. Полипептидные цепи доменов V_H и V_L, соединенные с линкерами длиной 3-12 остатков аминокислот, образуют в основном димеры (называемые диателами). В случае линкеров длиной 0-2 остатка аминокислот, преимущественно образуются тримеры (называемые триателами) и тетрамеры (называемые тетрателами), однако точные паттерны олигомеризации, по-видимому, зависят от состава, а также ориентации V-доменов (V_H-линкер-V_L, или V_L-линкер-V_H), помимо длины линкера.

[0123] Указанные методики получения мультиспецифических или биспецифических антител сопряжены с различными затруднениями, а именно, низким выходом, необходимостью очищения, низкой стабильностью или трудоемкостью методики. Недавно методика, известная как «dock and lock» (DNL), была использована для получения комбинаций практически любых требуемых антител, фрагментов антител и других эффекторных молекул (см., например, патенты США №7521056; №7527787; №7534866; №7550143; №7666400; №7858070; №7871622; №7906121; №7906118; №8163291; №7901680; №7981398; №8003111 и №8034352, разделы примеров каждого из которых включены в настоящий документ посредством ссылок). Указанная методика задействует комплементарные связывающие белки домены, называемые якорными доменами («anchoring domains», AD), и домены димеризации и докинга («dimerization and docking domains», DDD), которые связываются друг с другом и обеспечивают сборку сложных структур, в диапазоне, включающем димеры, тримеры, тетрамеры, пентамеры и гексамеры. Они образуют стабильные комплексы с высоким выходом, без необходимости значительного очищения. Техника DNL позволяет осуществлять сборку моноспецифических, биспецифических или мультиспецифических антител. Для практической реализации заявленных в настоящем документе способов могут быть использованы любые из известных в данной области техники методик получения биспецифических или мультиспецифических антител.

[0124] Согласно различным вариантам реализации конъюгат, описанный в настоящем документе, может представлять собой часть составного мультиспецифического антитела. Такие антитела могут содержать два или более разных сайтов связывания антигена, с различающейся специфичностью. Указанное мультиспецифическое составное антитело может связываться с разными эпитопами одного антигена или, как вариант, может связываться с двумя разными антигенами.

DOCK-AND-LOCK™ (DNL™)

[0125] Согласно предпочтительным вариантам реализации бивалентное или мультивалентное антитело образуется как комплекс DOCK-AND-LOCK™ (DNL™) (см., например, патенты США №7521056; №7527787; №7534866; №7550143; №7666400; №7858070; №7871622; №7906121; №7906118; №8163291; №7901680; №7981398; №8003111 и №8034352, разделы примеров каждого из которых включены в настоящий документ посредством ссылок.) Обычно указанная методика использует преимущество специфических и высокоаффинных связывающих взаимодействий, происходящих между последовательностью домена димеризации и докинга (DDD) регуляторных (R) субъединиц цАМФ-зависимой протеинкиназы (ПКА) и последовательностью якорного домена (AD), происходящего из любого из ряда белков АКАР (Baillie et al., FEBS Letters. 2005; 579: 3264. Wong, Scott, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2004; 5:959). Пептиды DDD и AD могут быть присоединены к любому белку, пептиду или другой молекуле. Поскольку последовательности DDD спонтанно димеризуются и связываются с последовательностью AD, указанная методика позволяет получать комплексы любых выбранных молекул, которые могут быть присоединены к последовательностям DDD или AD.

[0126] Хотя стандартный комплекс DNL™ содержит тример с двумя DDD-связанными молекулами, присоединенными к одной AD-связанной молекулой, варианты структуры комплекса позволяют образование димеров, тримеров, тетрамеров, пентамеров, гексамеров и других мультимеров. Согласно некоторым вариантам реализации комплекс DNL™ может содержать два или более антител, фрагментов антител или слитых белков, которые связываются с одной и той же антигенной детерминантой либо с двумя или более разными антигенами. Комплекс DNL™ может также содержать один или более других эффекторов, таких как белки, пептиды, иммуномодуляторы, цитокины, интерлейкины, интерфероны, связывающие белки, пептидные лиганды, белки-носители, токсины, рибонуклеазы, такие как онконаза, ингибиторные олигонуклеотиды, такие как миРНК, антигены или ксеноантигены, полимеры, такие как ПЭГ, ферменты, терапевтические агенты, гормоны, цитотоксические агенты, антиангиогенные агенты, проапоптозные агенты или любая другая молекула или агрегат.

[0127] ПКА, которая играет центральную роль в одном из наиболее хорошо изученных путей передачи сигналов, запускаемом связыванием вторичного мессенджера, цАМФ, с субъединицами R, была впервые выделена из скелетных мышц кролика в 1968 году (Walsh et al., J. Biol. Chem. 1968;243:3763). Структура голофермента состоит из двух каталитических субъединиц, удерживаемых в неактивной форме субъединицами R (Taylor, J. Biol. Chem. 1989; 264:8443). В изоферментах ПКА обнаруживаются два типа субъединиц R (RI и RII), и каждый тип имеет изоформы и (Scott, Pharmacol. Ther. 1991; 50:123). Соответственно, четыре изоформы регуляторных субъединиц ПКА представлены RI, RI, RII и RII. Субъединицы R были выделены только в виде стабильных димеров, и домен димеризации, как было показано, состоит из первых 44 аминоконцевых остатков RIIα (Newlon et al., Nat. Struct. Biol. 1999; 6:222). Согласно обсуждению ниже, в димеризацию и докинг вовлечены аналогичные части последовательностей аминокислот других регуляторных субъединиц, каждая из которых локализована возле N-конца регуляторной субъединицы. Связывание цАМФ с субъединицами R приводит к высвобождению активных каталитических субъединиц для широкого спектра серин/треонинкиназной активности, ориентированных на выбранные субстраты за счет компартментализации ПКА посредством докинга белками AKAP (Scott et al., J. Biol. Chem. 1990; 265; 21561)

[0128] С тех пор как в 1984 году был охарактеризован первый АКАР, ассоциированный с микротрубочками белок-2 (Lohmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1984; 81:6723), было идентифицировано более 50 AKAP с локализацией в различных субклеточных сайтах, в том числе плазматической мембране, актиновом цитоскелете, ядре, митохондриях и эндоплазматическом ретикулуме, с разнообразной структурой, принадлежащие видам в диапазоне от дрожжей до человека (Wong, Scott, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2004; 5:959). AD белков AKAP для ПКА представляет собой амфипатическую спираль длиной 14-18 остатков (Carr et al., J. Biol. Chem. 1991; 266:14188). Последовательности аминокислот AD индивидуальных AKAP достаточно сильно варьируют, и аффинность связывания, зарегистрированная для димеров RII, находится в диапазоне от 2 до 90 нМ (Alto et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003; 100:4445). AKAP связываются только с димерными субъединицами R. В случае RII человека AD связывается с гидрофобной поверхностью, образуемой 23 аминоконцевыми остатками (Colledge, Scott, Trends Cell Biol. 1999; 6:216). Соответственно, и домен димеризации, и связывающий AKAP домен RII человека локализованы в пределах одной N-концевой последовательности из 44 аминокислот (Newlon et al., Nat. Struct. Biol. 1999; 6:222; Newlon et al., EMBO J. 2001; 20:1651), в настоящем документе называемой DDD.

[0129] Авторы изобретения разработали платформенную технологию использования DDD регуляторных субъединиц ПКА человека и AD белка AKAP в качестве превосходной пары линкерных модулей для докинга двух любых объектов, называемых здесь и далее А и В, с получением нековалентного комплекса, который может быть в дальнейшем «заперт» в комплексе DNL™ посредством введения остатков цистеина как в DDD, так и в AD в стратегических положениях для облегчения образования дисульфидных связей. Общая методология указанного подхода заключается в следующем. Объект А конструируют путем присоединения последовательности DDD к предшественнику А, что в результате дает первый компонент, здесь и далее называемый а. Поскольку последовательность DDD обеспечивает спонтанное образование димера, А будет, соответственно, состоять из а₂. Объект В конструируют путем присоединения последовательности AD к предшественнику В, что в результате дает второй компонент, здесь и далее называемый b. Димерный мотив DDD, содержащийся в а₂, создает сайт докинга для связывания с последовательностью AD, содержащейся в b, облегчая таким образом беспрепятственное образование связи а₂ и b с получением бинарного тримерного комплекса, состоящего из a₂b. Указанное связывание делают необратимым с помощью последующей реакции для ковалентного закрепления указанных двух объектов

посредством дисульфидных мостиков, которое происходит очень эффективно на основании принципа эффективной местной концентрации, поскольку изначальные связывающие взаимодействия сближают реакционноспособные тиольные группы, размещенные как на DDD, так и на AD (Chmura et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001; 98:8480), для сайт-специфического лигирования. С применением различных комбинаций линкеров, адаптерных модулей и предшественников может быть получен и использован широкий спектр конструкций DNL™ с разным стехиометрическим составом (см., например, патенты США №7550143; №7521056; №7534866; №7527787 и №7666400).

[0130] Путем прикрепления DDD и AD в отдалении от функциональных групп двух предшественников, такое сайт-специфическое лигирование, предположительно, позволит сохранить оригинальную активность указанных двух предшественников. Указанный подход имеет модулярную природу и потенциально может применяться для соединения, сайт-специфического и ковалентного, широкого диапазона веществ, в том числе пептидов, белков, антител, фрагментов антител и других эффекторных фрагментов с широким спектром активности. Использование задействующего слитые белки способа конструирования конъюгированных с AD и DDD эффекторов, описанного в разделе примеров ниже, позволяет включить практически любой белок или пептид в конструкцию DNL™. Однако указанная методика не является ограничивающей, и могут быть использованы другие способы конъюгации.

[0131] Известны различные способы получения слитых белков, в том числе синтез, гибридизация и/или амплификация нуклеиновых кислот для получения синтетической двухцепочечной нуклеиновой кислоты, кодирующей представляющий интерес слитый белок. Такие двухцепочечные нуклеиновые кислоты могут быть встроены в экспрессионные векторы для получения слитого белка с применением стандартных методик молекулярной биологии (см., например, Sambrook et al., Molecular Cloning, A laboratory manual, 2^nd Ed, 1989). Согласно таким предпочтительным вариантам реализации фрагмент AD и/или DDD может быть присоединен либо к N-концу, либо к С-концу эффекторного белка или пептида. Однако специалисту будет понятно, что сайт прикрепления фрагмента AD или DDD к эффекторному фрагменту может варьировать в зависимости от химической природы указанного эффекторного фрагмента и части (или частей) указанного эффекторного фрагмента, вовлеченных в его физиологическую активность. Сайт-специфическое прикрепление различных эффекторных фрагментов может быть выполнено с применением методик, известных в данной области техники, таких как применение бивалентных перекрестно-связывающих реагентов и/или других методик химической конъюгации.

[0132] Согласно различным вариантам реализации антитело или фрагмент антитела может быть включен в комплекс DNL™ путем, например, присоединения фрагмента DDD или AD к С-концу тяжелой цепи антитела, согласно подробному описанию ниже. Согласно более предпочтительным вариантам реализации фрагмент DDD или AD, более предпочтительно - фрагмент AD, может быть присоединен к С-концу легкой цепи антитела (см., например, заявку на патент США сер. №13/901737, поданную 24 мая 2013 г., раздел примеров которой включен в настоящий документ посредством ссылки.) Структурно-функциональные взаимосвязи фрагментов AD и DDD

[0133] Для конструкций DNL™ разных типов могут быть использованы разные последовательности AD или DDD. Примеры последовательностей DDD и AD приведены ниже.

[0134] Специалисту будет понятно, что DDD1 и DDD2 основаны на последовательности DDD изоформы RIID протеинкиназы А человека. Однако согласно альтернативным вариантам реализации указанные фрагменты DDD и AD могут быть основаны на последовательности DDD формы RID протеинкиназы А человека и соответствующей последовательности AKAP, согласно иллюстративным примерам DDD3, DDD3C и AD3, приведенным ниже.

[0135] Согласно другим альтернативным вариантам реализации могут быть использованы другие варианты последовательностей фрагментов AD и/или DDD при конструировании комплексов DNL™. Например, существует всего четыре варианта последовательностей DDD ПКА человека, соответствующих фрагментам DDD ПКА RIα, RIIα, RIβ и RIIβ. На последовательности DDD RIIα основаны DDD1 и DDD2, приведенные выше. Указанные четыре последовательности DDD ПКА человека приведены ниже. Последовательность DDD представляет собой остатки 1-44 RIIα, 1-44 RIIβ, 12-61 RIα и 13-66 RIβ. (Отметим, что последовательность DDD1 незначительно модифицирована относительно фрагмента DDD RIIα ПКА человека.)

[0136] Структурно-функциональные взаимосвязи доменов AD и DDD становились предметом изучения. (См., например, источники: Burns-Hamuro et al., 2005, Protein Sci 14:2982-92; Carr et al., 2001, J Biol Chem 276:17332-38; Alto et al., 2003, Proc Natl Acad Sci USA 100:4445-50; Hundsrucker et al., 2006, Biochem J 396:297-306; Stokka et al., 2006, Biochem J 400:493-99; Gold et al., 2006, Mol Cell 24:383-95; Kinderman et al., 2006, Mol Cell 24:397-408, текст каждого из которых включен в настоящий документ посредством ссылки.)

Аллотипы антител

[0137] Иммуногенность терапевтических антител ассоциирована с повышенным риском инфузионных реакций и уменьшением продолжительности терапевтического ответа (Baert et al., 2003, N Engl J Med 348:602-08). Степень индукции терапевтическими антителами иммунного ответа хозяина может определяться отчасти аллотипом антитела (Stickler et al., 2011, Genes and Immunity 12:213-21). Аллотип антитела связан с вариациями последовательностей аминокислот в специфических местах последовательностей константных областей антитела. Аллотипы IgG-антител, содержащие константную область тяжелых цепей γ-типа называются Gm-аллотипами (1976, J Immunol 117:1056-59).

[0138] Среди обычных IgG1-антител человека наиболее распространенным аллотипом является G1m1 (Stickler et al., 2011, Genes and Immunity 12:213-21). Однако аллотип G1m3 также часто встречается у представителей европеоидной расы (выше). G1m1-антитела, как было описано, содержат аллотипические последовательности, демонстрирующие тенденцию к индукции иммунного ответа при введении реципиентам отличного от G1m1 аллотипа (nG1m1), таким как G1m3-пациенты (выше). Антитела, имеющие отличный от G1m1 аллотип, не настолько иммуногенны при введении G1m1-пациентам (выше).

[0139] Аллотип G1m1 человека содержит аминокислоты аспарагиновую кислоту в положении по Kabat 356 и лейцин в положении по Kabat 358 в последовательности СН3 тяжелой цепи IgG1. Аллотип nG1m1 содержит аминокислоты глутаминовую кислоту в положении по Kabat 356 и метионин в положении по Kabat 358. Оба аллотипа, G1m1 и nG1m1, содержат остаток глутаминовой кислоты в положении по Kabat 357; указанные аллотипы иногда называют аллотипами DEL и ЕЕМ. Неограничивающий пример последовательностей константной области тяжелой цепи для антител аллотипов G1m1 и nG1m1 показан для иллюстративных антител ритуксимаба (SEQ ID NO: 18) и велтузумаба (SEQ ID NO:19).

Последовательность вариабельной области тяжелой цепи ритуксимаба (SEQ ID NO: 18)

Вариабельная область тяжелой цепи велтузумаба (SEQ ID NO: 19)

[0140] Jefferis и Lefranc (2009, mAb 1:1-7) приводят обзор вариантов

последовательностей, характерных для аллотипов IgG и их эффекта на иммуногенность. Они сообщают, что аллотип G1m3 характеризуется остатком аргинина в положении по Kabat 214, тогда как при аллотипе G1m17 в положении по Kabat 214 расположен остаток лизина. Для аллотипа nG1m1,2 характерны глутаминовая кислота в положении по Kabat 356, метионин в положении по Kabat 358 и аланин в положении по Kabat 431. Для аллотипа G1m1,2 характерны аспарагиновая кислота в положении по Kabat 356, лейцин в положении по Kabat 358 и глицин в положении по Kabat 431. Помимо вариантов последовательностей константной области тяжелой цепи, Jefferis и Lefranc (2009) описали аллотипические варианты константной области легкой цепи каппа, при этом аллотип Kml характеризуется вал ином в положении по Kabat 153 и лейцином в положении по Kabat 191, аллотип Kml, 2 характеризуется аланином в положении по Kabat 153 и лейцином в положении по Kabat 191, а аллотип Km3 характеризуется аланином в положении по Kabat 153 и валином в положении по Kabat 191.

[0141] Что касается терапевтических антител, велтузумаб и ритуксимаб представляют собой, соответственно, гуманизированное и химерное IgG1-антитела против CD20, подходящие для применения в терапии широкого спектра гематологических злокачественных новообразований. В таблице 1 приведено сравнение последовательностей аллотипов ритуксимаба и велтузумаба. Как показано в таблице 1, ритуксимаб (G1m17,1) представляет собой аллотип DEL IgG1, с дополнительным вариантом последовательности, с лизином в ритуксимабе и аргинином в велтузумабе в положении по Kabat 214 (CH1 тяжелой цепи). Как было описано, велтузумаб является менее иммуногенным у субъектов, чем ритуксимаб (см., например, Morchhauser et al., 2009, J Clin Oncol 27:3346-53; Goldenberg et al., 2009, Blood 113:1062-70; Robak & Robak, 2011, BioDrugs 25:13-25); указанный эффект объясняли различием гуманизированных и химерных антител. Однако различие аллотипов ЕЕМ и DEL, вероятно, также вносит вклад в меньшую иммуногенность велтузумаба.

[0142] Для снижения иммуногенности терапевтических антител у индивидуумов с генотипом nG1m1, желательно выбирать антитело аллотипа, соответствующего аллотипу G1m3, характеризующемуся аргинином в положении по Kabat 214, и нулевым аллотипом nG1m1,2, характеризующимся глутаминовой кислотой в положении по Kabat 356, метионином в положении по Kabat 358 и аланином в положении по Kabat 431. Неожиданным образом, было обнаружено, что многократное подкожное введение C1m3-антител на протяжении длительного периода времени не приводило к значимому иммунному ответу. Согласно альтернативным вариантам реализации тяжелая цепь IgG4 человека, так же, как и аллотип G1m3, содержит аргинин в положении по Kabat 214, глутаминовую кислоту в положении по Kabat 356, метионин в положении по Kabat 359 и аланин в положении по Kabat 431. Поскольку иммуногенность, по-видимому, связана по меньшей мере отчасти с остатками в указанных положениях, использование последовательности константных областей тяжелых цепей IgG4 человека для терапевтических антител также представляет собой предпочтительный вариант реализации. Комбинации антител G1m3-IgG1 с антителами IgG4 могут также подходить для терапевтического введения.

Авимеры

[0143] Согласно некоторым вариантам реализации связывающие фрагменты, описанные в настоящем документе, могут содержать одну или более последовательностей авимеров. Авимеры представляют собой класс связывающих белков, до некоторой степени аналогичным антителам в смысле аффинности и специфичности в отношении различных целевых молекул. Они были разработаны на основе внеклеточных рецепторных доменов человека с применением перестановки экзонов in vitro и фагового дисплея (Silverman et al., 2005, Nat. Biotechnol. 23:1493-94; Silverman et al., 2006, Nat. Biotechnol. 24:220). Итоговые мультидоменные белки могут содержать несколько независимых связывающих доменов, которые могут демонстрировать улучшенную аффинность (в некоторых случаях - субнаномолярную) и специфичность по сравнению со связывающими единственный эпитоп белками (выше). Согласно различным вариантам реализации авимеры могут быть прикреплены, например, к последовательностям DDD и/или AD для применения в заявленных способах и композициях. Дополнительные подробности, касающиеся способов конструирования и применения авимеров описаны, например, в опубликованных заявках на патент США №20040175756, №20050048512, №20050053973, №20050089932 и №20050221384, разделы примеров каждого из которых включены в настоящий документ посредством ссылок.

Фаговый дисплей

[0144] Определенные варианты реализации заявленных композиций и/или способов могут предусматривать связывающие пептиды и/или пептидомиметики различных целевых молекул, клеток или тканей. Связывающие пептиды могут быть идентифицированы с применением любого способа, известного в данной области техники, в том числе, но не ограничиваясь указанным, методики фагового дисплея. Различные способы фагового дисплея и методик получения разнообразных популяций пептидов хорошо известны в данной области техники. Например, в патентах США №5223409; №5622699 и №6068829 описаны способы получения фаговой библиотеки. Техника фагового дисплея задействует генетические манипуляции с бактериофагами, позволяющие экспрессировать на их поверхности пептиды малого размера (Smith, Scott, 1985, Science 228:1315-1317; Smith и Scott, 1993, Meth. Enzymol. 21:228-257). Помимо пептидов, на поверхности фаговых частиц может также быть осуществлен дисплей белковых доменов большего размера, таких как одноцепочечные антитела (Arap et al., 1998, Science 279:377-380).

[0145] Нацеливающие последовательности аминокислот, селективные в отношении определенного органа, ткани, типа клеток или целевой молекулы могут быть выделены путем пэннинга (Pasqualini, Ruoslahti, 1996, Nature 380:364-366; Pasqualini, 1999, The Quart. J. Nucl. Med. 43:159-162). Вкратце, библиотеку фага, содержащую предполагаемые нацеливающие пептиды вводят в интактный организм или в выделенные органы, ткани, типы клеток или целевые молекулы, и собирают образцы, содержащие связанный фаг. Фаг, который связывается с мишенью, может быть элюирован из целевого органа, ткани, типа клеток или целевой молекулы, а затем амплифицирован путем культивирования в бактериях-хозяевах.

[0146] Согласно некоторым вариантам реализации указанный фаг может быть размножен в бактериях-хозяевах между раундами пэннинга. Указанные бактерии, вместо лизиса фагом, могут секретировать несколько копий фага с дисплеем конкретной вставки. При необходимости может быть проведено повторное воздействие амплифицированным фагом на целевые органы, ткани, типы клеток или целевую молекулу и сбор фага для дополнительных раундов пэннинга. До получения популяции селективных или специфических связывающих веществ может быть проведено несколько раундов пэннинга. Последовательность аминокислот указанных пептидов может быть определено путем секвенирования ДНК, соответствующей вставке целевого пептида в геноме фага. Идентифицированный нацеливающий пептид может затем быть получен в виде синтетического пептида с применением стандартных методик химии белков (Arap et al., 1998, Smith et al., 1985).

[0147] Согласно некоторым вариантам реализации протокол вычитания могут применяться для дополнительного уменьшения фонового связывания фага. Целью вычитания является удаление из библиотеки фагов, которые связываются с мишенями, отличными от мишени, представляющей интерес. Согласно альтернативным вариантам реализации может быть проведен предварительный скрининг библиотеки фагов с контрольными клеткой, тканью или органом. Например, связывающиеся с опухолью пептиды могут быть идентифицированы после проведения предварительного скрининга библиотеки с контрольной линией нормальных клеток. После вычитания может быть проведен скрининг указанной библиотеки с представляющей интерес молекулой, клеткой, тканью или органом. Известны и могут применяться при практической реализации заявленных способов и другие способы использования протоколов вычитания, например, как описано в патентах США №5840841, №5705610, №5670312 и №5492807.

Аптамеры

[0148] Согласно некоторым вариантам реализации нацеливающий фрагмент, подходящий для применения, может представлять собой аптамер. Способы конструирования и определения связывающих характеристик аптамеров хорошо известны в данной области техники. Например, такие методики описаны в патентах США №5582981, №5595877 и №5637459, разделы примеров каждого из которых включены в настоящий документ посредством ссылок. Способы приготовления и скрининга аптамеров, которые связываются с конкретными представляющими интерес мишенями, хорошо известны, см., например, патент США №5475096 и патент США №5270163, разделы примеров каждого из которых включены в настоящий документ посредством ссылок.

[0149] Аптамеры могут быть получены любым известным способом, в том числе с применением синтетических способов, рекомбинантных способов и способов очищения, и могут применяться по отдельности или в комбинации с другими лигандами, специфическими в отношении тоже же мишени. В целом, для осуществления специфического связывания необходимо минимум приблизительно 3 нуклеотида, предпочтительно - по меньшей мере 5 нуклеотидов. Аптамеры с последовательностями длиной менее 10 оснований могут быть пригодны, хотя могут быть предпочтительны аптамеры длиной 10, 20, 30 или 40 нуклеотидов.

[0150] Аптамеры могут быть выделены, секвенированы и/или амплифицированы, или синтезированы в виде стандартных молекул ДНК или РНК. Как вариант, представляющие интерес аптамеры могут содержать модифицированные олигомеры. Любые из гидроксильных групп, обычно присутствующих в аптамерах, могут быть заменены на фосфонатные группы, фосфатные группы, защищены стандартной защитной группой, или активированы для получения дополнительных связей с другими нуклеотидами, или могут быть конъюгированы с твердыми подложками. Одна или более фосфодиэфирных связей могут быть заменены на альтернативные соединяющие группы, например, Р(O)O заменяют на P(O)S, P(O)NR₂, P(O)R, P(O)OR', CO или CNR₂, при этом R представляет собой Н или алкил (1-20С), a R' представляет собой алкил (1-20С); кроме того, указанная группа может быть присоединена к смежным нуклеотидам через О или S. Не все связи в олигомере обязательно должны быть идентичными.

Аффитела и финомеры

[0151] Определенные альтернативные варианты реализации могут задействовать аффитела вместо антител. Аффитела коммерчески доступны от Affibody АВ (Сольна, Швеция). Аффитела представляют собой белки небольшого размера, функционирующие как миметики антител, и они подходят для связывания целевых молекул. Аффитела были разработаны путем комбинаторного конструирования на альфа-спиральном белковом скаффолде (Nord et al., 1995, Protein Eng 8:601-8; Nord et al., 1997, Nat Biotechnol 15:772-77). Дизайн аффител основан на трехспиральной пучковой структуре, содержащей связывающий IgG домен белка A (Nord et al., 1995; 1997). Аффитела с широким диапазоном аффинности связывания могут быть получены путем рандомизации 13 аминокислот, вовлеченных в Fc-связывающую активность бактериального белка A (Nord et al., 1995; 1997). После рандомизации ПЦР-амплифицированную библиотеку клонировали в фагмидный вектор для скрининга мутантных белков с применением фагового дисплея. Скрининг библиотеки фагового дисплея может быть проведен с любым известным антигеном, с применением стандартных методик скрининга фагового дисплея (например, Pasqualini, Ruoslahti, 1996, Nature 380:364-366; Pasqualini, 1999, Quart. J. Nucl. Med. 43:159-162), для идентификации одного или более аффител против целевого антигена.

[0152] Было продемонстрировано нацеливание ¹⁷⁷Lu-меченого аффитела, специфического в отношении HER2/neu, на НЕК2-экспрессирующие ксенотрансплантаты in vivo (Tolmachev et al., 2007, Cancer Res 67:2773-82). Хотя почечная токсичность, обусловленная накоплением низкомолекулярного меченого радиоактивной меткой соединения, изначально представляла собой проблему, обратимое связывание с альбумином снижало накопление в почках, позволяя проводить терапию меченым аффителом на основе радионуклидов (выше).

[0153] Недавно была продемонстрирована осуществимость применения меченых радиоактивной меткой аффител для визуализации опухолей in vivo (Tolmachev et al., 2011, Bioconjugate Chem 22:894-902). Дериватизированную малеимидом NOTA конъюгировали с аффителом против HER2 и метили радиоактивной меткой ¹¹¹In (выше). Введение мышам, несущим HER2-экспрессирующий ксенотрансплантат DU-145, с последующей регистрацией изображений в гамма-камере, позволяло визуализировать ксенотрансплантат (выше).

[0154] Финомеры могут также связываться с целевыми антигенами с аналогичной антителам аффинностью и специфичностью. Финомеры основаны на домене SH3 Fyn человека, который используют в качестве скаффолда для сборки связывающих молекул. Домен SH3 Fyn представляет собой полностью человеческий белок длиной 63 аминокислоты, который может быть продуцирован бактериями с высоким выходом. Финомеры могут быть соединены между собой с образованием мультиспецифического связывающего белка с аффинностью в отношении двух или более разных антигенных мишеней. Финомеры коммерчески доступны от COVAGEN AG (Цюрих, Швейцария).

[0155] Специалисту будет понятно, что аффитела или финомеры могут применяться в качестве нацеливающих молекул при практической реализации заявленных способов и композиций.

Иммуноконъюгаты

[0156] Согласно некоторым вариантам реализации цитотоксическое лекарственное средство или другой терапевтические или диагностический агент может быть ковалентно присоединен к антителу или фрагменту антитела с образованием иммуноконъюгата. Согласно некоторым вариантам реализации лекарственное средство или другой агент может быть присоединен к антителу или его фрагменту фрагментом-носителем. Фрагменты-носители могут быть прикреплены, например, к восстановленным SH-группам и/или к углеводным боковым цепям. Фрагмент-носитель может быть прикреплен в шарнирной области восстановленного компонента антитела за счет образования дисульфидной связи. Как вариант, такие агенты могут быть прикреплены с применением гетеробифункционального кросс-линкера, такого как М-сукцинил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP). Yu et al., Int. J. Cancer 56: 244 (1994). Общие методики такой конъюгации хорошо известны в данной области техники. См., например, Wong, CHEMISTRY OF CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING (CRC Press 1991); Upeslacis et al., "Modification of Antibodies by Chemical Methods», в источнике: MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND APPLICATIONS, Birch et al. (eds.), pp. 187-230 (Wiley-Liss, Inc. 1995); Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies», в источнике: MONOCLONAL ANTIBODIES: PRODUCTION, ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION, Ritter et al. (eds.), pp. 60-84 (Cambridge University Press 1995). Как вариант, фрагмент-носитель может быть конъюгирован посредством фрагмента углевода в Fc-области антитела.

[0157] Способы конъюгации функциональных групп с антителами посредством углеводного фрагмента антитела хорошо известны специалистам в данной области техники. См., например, Shih et al., Int. J. Cancer 41: 832 (1988); Shih et al., Int. J. Cancer 46: 1101 (1990); и Shih et al., патент США №5057313, раздел примеров которого включен в настоящий документ посредством ссылки. Общий способ включает проведение реакции антитела, содержащего окисленную углеводную часть, с полимером-носителем, содержащим по меньшей мере одну свободную аминную функциональную группу.

Указанная реакция приводит к образованию сначала основания Шиффа (иминной связи), которое может быть стабилизировано путем восстановления до вторичного амина с образованием итогового конъюгата.

[0158] Fc-область может отсутствовать, если компонент антитела в ADC представляет собой фрагмент антитела. Однако введение фрагмента углевода возможно в вариабельную область легкой цепи как полноразмерного антитела, так и фрагмента антитела. См., например, Leung et al., J. Immunol. 154: 5919 (1995); патенты США №5443953 и №6254868, разделы примеров которых включены в настоящий документ посредством ссылок. Сконструированный фрагмент углевода применяют для прикрепления терапевтического или диагностического агента.

[0159] Альтернативный способ прикрепления фрагментов-носителей к нацеливающей молекуле включает применение реакций клик-химии. Подход клик-химии изначально был предложен как способ быстрого получения сложных веществ путем объединения субъединиц малого размера модульным образом. (См., например, Kolb et al., 2004, Angew Chem Int Ed 40:3004-31; Evans, 2007, Aust J Chem 60:384-95.). В данной области техники известны различные формы реакций клик-химии, такие как 1,3-диполярная катализируемая медью реакция циклоприсоединения Хьюсгена (Tornoe et al., 2002, J Organic Chem 67:3057-64), которую часто называют «клик-реакцией». Другие альтернативы включают реакции циклоприсоединения, такие как реакция Дильса-Альдера, реакции нуклеофильного замещения (в частности, в малых напряженных циклах, таких как эпокси- и азиридиновые соединения), получение соединений мочевины с применением карбонильной химии; и реакции, задействующие углерод-углеродные двойные связи, например, алкины в тиол-иновых реакциях.

[0160] В реакции азид-алкинового циклоприсоединения Хьюсгена используется медный катализатор в присутствии восстанавливающего агента для катализа реакции концевой алкиновой группы, присоединенной к первой молекуле. В присутствии второй молекулы, содержащей азидный фрагмент, указанный азид вступает в реакцию с активированным алкином с образованием 1,4-двузамещенного 1,2,3-триазола. Катализируемая медью реакция происходит при комнатной температуре и достаточно специфична, так что в очищении продукта реакции часто нет необходимости. (Rostovstev et al., 2002, Angew Chem Int Ed 41:2596; Tornoe et al., 2002, J Org Chem 67:3057.) Азидные и алкиновые функциональные группы в значительной степени инертны по отношению к биомолекулам в водной среде, что позволяет проводить реакцию в сложных растворах. Образующийся триазол химически стабилен и не подвергается ферментативному расщеплению, что обеспечивает высокую стабильность продукта клик-химии в биологических системах. Хотя медный катализатор токсичен для живых клеток, основанная на меди реакция клик-химии может применяться in vitro для получения ADC.

[0161] Для ковалентной модификации биомолекул была предложена клик-реакция без использования меди. (См., например, Agard et al., 2004, J Am Chem Soc 126:15046-47.) В реакции без использования меди используется напряжение кольца вместо медного катализатора, стимулирующее [3+2] реакции азид-алкинового циклоприсоединения (выше). Например, циклооктин представляет собой 8-углеродную кольцевую структуру с внутренней алкиновой связью. Указанная циклическая структура индуцирует существенную деформацию угла связи ацетилена, который обладает высокой реакционной способностью в отношении азидных групп, образуя триазол. Соответственно, производные циклооктина могут применяться для клик-реакций без использования меди (выше).

[0162] Ning с соавторами (Ning et al., 2010, Angew Chem Int Ed 49:3065-68) описали другой тип клик-реакции без использования меди, задействующий стимулируемое напряжением циклоприсоединение алкинов и нитронов. Для преодоления медленной скорости реакции с исходным циклооктином рядом с тройной связью присоединяют электроноакцепторные группы (выше). Примеры таких замещенных циклооктинов включают дифторированные циклооктины, 4-дибензоциклооктинол и азациклооктин (выше). Альтернативная реакция без использования меди задействовала стимулируемое напряжением циклоприсоединение алкинов и нитронов с получением N-алкилированных изоксазолинов (выше). Сообщалось, что реакция имела исключительно быструю реакционную кинетику и была использована в протоколе трехэтапной реакции в одном реакционном сосуде для сайт-специфической модификации пептидов и белков (выше). Нитроны получали путем конденсации подходящих альдегидов с N-метилгидроксиламином, и указанная реакция циклоприсоединения протекала в смеси ацетонитрила и воды (выше). Указанные и другие известные реакции клик-химии могут применяться для присоединения фрагментов-носителей к антителам in vitro.

[0163] Agard с соавторами (Agard et al., 2004, J Am Chem Soc 126:15046-47) продемонстрировали, что экспрессия рекомбинантного гликопротеина в клетках СНО в присутствии перацетилированного N-азидоацетилманнозамина приводила к биовключению соответствующей N-азидоацетилсиаловой кислоты в углеводы указанного гликопротеина. Азидо-дериватизированный гликопротеин вступал в специфическую реакцию с биотинилированным циклооктином с образованием биотинилированного гликопротеина, тогда как контрольный гликопротеин без азидного фрагмента оставался немеченым (выше). Laughlin с соавторами (Laughlin et al., 2008, Science 320:664-667) использовали аналогичную методику для метаболического мечения гликанов клеточной поверхности в эмбрионах данио-рерио, инкубированных с перацетилированным N-азидоацетилгалактозамином. Азидо-дериватизированные гликаны вступали в реакцию с дифторированными циклооктиновыми (DIFO) реагентами, позволяя визуализировать гликаны in vivo.

[0164] Реакцию Дильса-Альдера также использовали для мечения молекул in vivo. Rossin с соавторами (Rossin et al., 2010, Angew Chem Int Ed 49:3375-78) сообщили о 52% выходе in vivo реакции между локализованным в опухоли антителом против TAG72 (СС49), несущим транс-циклооктеновый (ТСО) реакционноспособный фрагмент, и ¹¹¹In-меченым тетразиновым производным DOTA. ТСО-меченое антитело СС49 вводили мышам, несущим ксенотрансплантаты рака ободочной кишки, после чего через 1 день инъецировали ¹¹¹In-меченый тетразиновый зонд (выше). Реакция между меченым радиоактивной меткой зондом и локализованным в опухоли антителом приводила к выраженной локализации радиоактивности в опухоли, что продемонстрировано путем ОФЭКТ-визуализации живых мышей через три часа после инъекции меченого радиоактивной меткой зонда, с отношением опухоль:мышцы, равным 13:1 (выше). Указанные результаты подтвердили химическую реакцию ТСО и меченых тетразином молекул in vivo.

[0165] Техники мечения антител с применением биологического включения фрагментов для мечения дополнительно описаны в патенте США №6953675 (раздел примеров которого включен в настоящий документ посредством ссылки). Получали такие «размеченные» антитела, содержащие реакционноспособные кетоновые группы на гликозилированных сайтах. Указанный способ включал экспрессию клеток, трансфицированных экспрессионным вектором, кодирующим антитело с одним или более сайтами N-гликозилирования в домене CHl или Vκ, в культуральной среде, содержащей кетоновое производное сахарида или предшественника сахарида. Дериватизированные кетонами сахариды или предшественники включали N-левулиноилманнозамин и N-левулиноилфукозу. «Размеченные» антитела затем вступали в реакцию с агентами, содержащими реакционноспособный в отношении кетонов фрагмент, такой как гидразид, гидразин, гидроксиламиногруппы или тиосемикарбазидные группы, с образованием меченой нацеливающей молекулы. Примеры агентов, присоединенных к «размеченным» антителам, включали хелатирующие агенты, такие как DTPA, большие молекулы лекарственных средств, такие как доксорубицин-декстран, и содержащие ацил-гидразид пептиды. Указанная методика «разметки» не ограничена получением антител, содержащих кетоновые фрагменты, и может применяться также для введения реакционноспособной группы клик-химии, такой как нитрон, азид или циклооктин, на антитело или другую биологическую молекулу.

[0166] Модифицированные реакции клик-химии подходят для применения in vitro или in vivo. Реакционноспособная нацеливающая молекула может быть образована либо путем химической конъюгации, либо путем биологического включения. Нацеливающая молекула, такая как антитело или фрагмент антитела, может быть активирована азидным фрагментом, замещенной циклооктиновой или алкиновой группой, или фрагментом нитрона. Если нацеливающая молекула содержит азидную или нитронную группу, соответствующая нацеливаемая конструкция содержит замещенную циклооктиновую или алкиновую группу, и наоборот. Такие активированные молекулы могут быть получены путем метаболического включения в живые клетки, согласно обсуждению выше.

[0167] Как вариант, в данной области техники хорошо известны способы химической конъюгации таких фрагментов с биомолекулами, и может быть использован любой такой известный способ. Общие способы получения ADC описаны, например, в патентах США №4699784; №4824659; №5525338; №5677427; №5697902; №5716595; №6071490; №6187284; №6306393; №6548275; №6653104; №6962702; №7033572; №7147856; и №7259240, разделы примеров каждого из которых включены в настоящий документ посредством ссылок.

[0168] Предпочтительный протокол конъюгации основан на тиол-малеимидной, тиол-винилсульфоновой, тиол-бромацетамидной или тиол-иодацетамидной реакции, легко протекающей при нейтральных или кислотных значениях рН. Это исключает необходимость условий с более высокими значениями рН для конъюгации, что, например, необходимо при применении активных сложных эфиров. Дополнительная информация, касающаяся примеров протоколов конъюгации, приведена ниже в разделе примеров.

Терапевтическое лечение

[0169] Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу лечения субъекта, включающему введение субъекту терапевтически эффективного количества конъюгата антитела с лекарственным средством (ADC), таким как IMMU-132, описанного в настоящем документе. В предпочтительном варианте субъект страдает Trop-2-положительным раком, устойчивым к терапии антителами - ингибиторами контрольных точек. ADC могут вводиться однократно или многократно, в зависимости от болезненного состояния и переносимости конъюгата, и могут также, необязательно, применяться в комбинации с другими видами терапии, такими как хирургическое вмешательство, внешнее облучение, радиоиммунотерапия, иммунотерапия, химиотерапия, антисмысловая терапия, терапия с применением РНК-интерференции, генная терапия и т.п. Каждую комбинацию адаптируют в соответствии с типом опухоли, стадией, состоянием пациента и предшествующей терапией, и другими факторами, учитываемыми управляющим врачом.

[0170] В настоящем документе термин «субъект» относится к любому животному (т.е. позвоночных и беспозвоночным), в том числе, но не ограничиваясь указанным, к млекопитающим, в том числе к человеку. Указанный термин не предполагает конкретных ограничений по возрасту или полу. Соответственно, указанным термином охвачены взрослые и новорожденные субъекты, а также плоды, как мужского, так и женского пола. Дозы, указанные в настоящем документе, предназначены для человека, однако могут быть скорректированы с учетом размеров других млекопитающие, а также детей, в соответствии с массой тела или площадью поверхности тела в кв.м.

[0171] Согласно предпочтительному варианту реализации терапевтические конъюгаты, содержащие антитело против Trop-2, такое как MAb hRS7, могут применяться для лечения карцином, таких как карциномы пищевода, поджелудочной железы, легкого, желудка, ободочной кишки и прямой кишки, мочевого пузыря, молочной железы, яичников, матки, почки и предстательной железы, как описано в патентах США №7238785; №7517964 и №8084583, разделы примеров которых включены в настоящий документ посредством ссылок. Антитело hRS7 представляет собой гуманизированное антитело, которое содержит последовательности определяющих комплементарность областей (CDR) легких цепей CDR1 (KASQDVSIAVA, SEQ ID NO: 1); CDR2 (SASYRYT, SEQ ID NO: 2); и CDR3 (QQHYITPLT, SEQ ID NO: 3); и последовательности CDR тяжелых цепей CDR1 (NYGMN, SEQ ID NO: 4); CDR2 (WINTYTGEPTYTDDFKG, SEQ ID NO: 5) и CDR3 (GGFGSSYWYFDV, SEQ ID NO: 6).

[0172] Согласно предпочтительному варианту реализации антитела, которые используют в лечении заболеваний человека, являются антителами человека или гуманизированными (с привитыми CDR) вариантами антител; хотя могут применяться антитела мыши и химерные варианты антител. Некоторые виды молекул IgG в качестве агентов для доставки наиболее предпочтительны для минимизации иммунного ответа. Это, в частности, важно при планируемом повторении лечения. При применении у человека IgG-антитело человека или гуманизированное IgG-антитело с меньшей вероятностью вызывает иммунный ответ против IgG у пациентов. Такие антитела, как hLL1 и hLL2, быстро интернализуются после связывания с интернализующим антигеном на целевых клетках, что означает, что переносимое ими химиотерапевтическое лекарственное средство также быстро интернализуется клетками. Однако для осуществления селективной терапии могут также применяться антитела, отличающиеся меньшей скоростью интернализации.

[0173] Согласно предпочтительному варианту реализации более эффективное включение в клетки может осуществляться с применением мультивалентных мультиспецифических или мультивалентных моноспецифических антител. Примеры таких бивалентных и биспецифических антител можно найти в патентах США №7387772; №7300655; №7238785; и №7282567, разделы примеров каждого из которых включены в настоящий документ посредством ссылок. Указанные мультивалентные или мультиспецифические антитела, в частности, являются предпочтительными для нацеливания на раковые заболевания и инфекционные организмы (патогены), которые экспрессируют несколько антигенных мишеней и даже несколько эпитопов одной антигенной мишени, однако часто избегают таргетинга антителами и достаточного связывания для иммунотерапии, из-за недостаточной экспрессии или доступности единственной антигенной мишени на клетке или патогене. За счет нацеливания на несколько антигенов или эпитопов указанные антитела демонстрируют более высокие уровни связывания и время удерживания на мишени, обеспечивая таким образом более высокое насыщение лекарственным средством, нацеливаемым согласно настоящему изобретению.

[0174] Согласно другому предпочтительному варианту реализации терапевтический агент, применяемый в комбинации с конъюгатом камптотецина согласно настоящему изобретению, может содержать один или более изотопов. Радиоактивные изотопы, подходящие для лечения пораженной заболеванием ткани, включают ¹¹¹In, ¹⁷⁷Lu, ²¹²Bi, ²¹³Bi, ²¹¹At, ⁶²Cu, ⁶⁷Cu, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³¹I, ³²P, ³³P, ⁴⁷Sc, ¹¹¹Ag, ⁶⁷Ga, ¹⁴²Pr, ¹⁵³Sm, ¹⁶¹Tb, ¹⁶⁶Dy, ¹⁶⁶Ho, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁸⁹Re, ²¹²Pb, ²²³Ra, ²²⁵Ac, ⁵⁹Fe, ⁷⁵Se, ⁷⁷As, ⁸⁹Sr, ⁹⁹Mo, ¹⁰⁵Rh, ¹⁰⁹Pd, ¹⁴³Pr, ¹⁴⁹Pm, ¹⁶⁹Er, ¹⁹⁴Ir, ¹⁹⁸Au, ¹⁹⁹Au, ²²⁷Th и ²¹¹Pb, однако не ограничиваются перечисленными. Энергия распада терапевтического радионуклида предпочтительно находится в диапазоне от 20 до 6000 кэВ, предпочтительно в диапазонах от 60 до 200 кэВ для Оже-излучателя, 100-2500 кэВ для бета-излучателя и 4000-6000 кэВ для альфа-излучателя. Максимальная энергия распада подходящих для применения испускающих бета-частиц нуклидов составляет предпочтительно 20-5,000 кэВ, более предпочтительно - 100-4000 кэВ, и наиболее предпочтительно - 500-2500 кэВ. Также предпочтительными являются радионуклиды, при распаде по существу испускающие частицы Оже. Например, Со-58, Ga-67, Br-80m, Tc-99m, Rh-103m, Pt-109, In-111, Sb-119, I-125, Ho-161, Os-189m и Ir-192. Энергия распада подходящих для применения испускающих бета-частиц нуклидов составляет предпочтительно меньше 1,000 кэВ, более предпочтительно - меньше 100 кэВ, и наиболее предпочтительно - меньше 70 кэВ. Также предпочтительными являются радионуклиды, которые распадаются по существу с получением альфа-частиц. Такие радионуклиды включают, однако не ограничиваются Dy-152, At-211, Bi-212, Ra-223, Rn-219, Po-215, Bi-211, Ac-225, Fr-221, At-217, Bi-213, Th-227 и Fm-255. Энергия распада подходящих для применения испускающих альфа-частицы радионуклидов составляет предпочтительно 2000-10000 кэВ, более предпочтительно - 3000-8000 кэВ, и наиболее предпочтительно - 4000-7000 кэВ. Дополнительные потенциально подходящие для применения радиоизотопы включают ¹¹C, ¹³N, ¹⁵O, ⁷⁵Br, ¹⁹⁸Au, ²²⁴Ас, ¹²⁶I, ¹³³I, ⁷⁷Br, ^113mIn, ⁹⁵Ru, ⁹⁷Ru, ¹⁰³Ru, ¹⁰⁵Ru, ¹⁰⁷Hg, ²⁰³Hg, ^121mTe, ^122mTe, ^125mTe, ¹⁶⁵Tm, ¹⁶⁷Tm, ¹⁶⁸Tm, ¹⁹⁷Pt, ¹⁰⁹Pd, ¹⁰⁵Rh, ¹⁴²Pr, ¹⁴³Pr, ¹⁶¹Tb, ¹⁶⁶Ho, ¹⁹⁹Au, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵¹Cr, ⁵⁹Fe, ⁷⁵Se, ²⁰¹Tl, ²²⁵Ac, ⁷⁶Br, ¹⁶⁹Yb и т.п.

[0175] Радионуклиды и другие металлы могут быть доставлены, например, с применением хелатирующих групп, присоединенных к антителу или конъюгату. Макроциклические хелаты, такие как NOTA, DOTA и ТЕТА подходят для применения с различными металлами и радиометаллами, в частности, с радионуклидами галлия, иттрия и меди, соответственно. Таким хелатным комплексам с металлами может быть придана высокая стабильность путем адаптации размера кольца под представляющий интерес металл. Могут применяться и другие хелаты циклического типа, такие как макроциклические простые полиэфиры, для получения комплексов ²²³Ra.

[0176] Терапевтические агенты, подходящие для применения в комбинации с конъюгатами камптотецина, описанными в настоящем документе, также включают, например, химиотерапевтические лекарственные средства, такие как алкалоиды барвинка, антрациклины, эпидофиллотоксины, таксаны, антиметаболиты, ингибиторы тирозинкиназы, алкилирующие агенты, антибиотики, ингибиторы Сох-2, антимитотики, антиангиогенные и проапоптозные агенты, в частности, доксорубицин, метотрексат, таксол, другие камптотецины, а также другие агенты из указанных и других классов противораковых агентов, и т.п. Другие противораковые химиотерапевтические лекарственные средства включают мустаргены, алкилсульфонаты, нитрозомочевины, триазены, аналоги фолиевой кислоты, аналоги пиримидинов, аналоги пурина, координационные комплексы платины, гормоны и т.п.Подходящие химиотерапевтические агенты описаны в публикациях: REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 19th Ed. (Mack Publishing Co. 1995) и GOODMAN AND THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, 7th Ed. (MacMillan Publishing Co. 1985), а также их переработанные и исправленные издания. Другие подходящие химиотерапевтические агенты, такие как экспериментальные лекарственные средства, известны специалистам в данной области техники.

[0177] Примеры подходящих для применения лекарственных средств включают, не ограничиваясь перечисленными, 5-фторурацил, афатиниб, аплидин, азарибин, анастрозол, антрациклины, акситиниб, AVL-101, AVL-291, бендамустин, блеомицин, бортезомиб, бозутиниб, бриостатин-1, бусульфан, калихеамицин, камптотецин, карбоплатин, 10-гидроксикамптотецин, кармустин, целекоксиб, хлорамбуцил, цисплатин (CDDP), ингибиторы Сох-2, иринотекан (СРТ-11), SN-38, карбоплатин, кладрибин, камптотеканы, кризотиниб, циклофосфамид, цитарабин, дакарбазин, дазатиниб, динациклиб, доцетаксел, дактиномицин, даунорубицин, доксорубицин, 2-пирролинодоксорубицин (2P-DOX), циано-морфолинодоксорубицин, доксорубицина глюкуронид, эпирубицина глюкуронид, эрлотиниб, эстрамустин, эпидофиллотоксин, эрлотиниб, энтиностат, связывающие рецептор эстрогена агенты, этопозид (VP16), этопозида глюкуронид, этопозида фосфат, эксеместан, финголимод, флоксуридин (FUdR), 3',5'-O-диолеоил-FudR. (FUdR-dO), флударабин, флутамид, ингибиторы фарнезил-протеинтрансферазы, флавопиридол, фостаматиниб, ганетеспиб, GDC-0834, GS-1101, гефинитиб, гемцитабин, гидроксимочевину, ибрутиниб, идарубицин, иделалисиб, ифосфамид, иматиниб, L-аспарагиназу, лапатиниб, леналидомид, лейковорин, LFM-A13, ломустин, мехлорэтамин, мелфалан, меркаптопурин, 6-меркаптопурин, метотрексат, митоксантрон, митрамицин, митомицин, митотан, навельбин, нератиниб, нилотиниб, нитрозомочевину, олапариб, пликамицин, прокарбазин, паклитаксел, PCI-32765, пентостатин, PSI-341, ралоксифен, семустин, сорафениб, стрептозоцин, SU11248, сунитиниб, тамоксифен, темозоломид, трансплатину, талидомид, тиогуанин, тиотепа, тенипозид, топотекан, урамустин, ваталаниб, винорелбин, винбластин, винкристин, алкалоиды барвинка и ZD 1839. Такие агенты могут быть частью конъюгатов, описанных в настоящем документе, или могут, как вариант, вводиться в комбинации с описанными конъюгатами, до введения, одновременно с введением или после введения конъюгата.

[0178] Терапевтические агенты, которые могут применяться в сочетании с конъюгатами камптотецина, также могут содержать токсины, конъюгированные с нацеливающими фрагментами. Токсины, которые могут применяться указанным образом, включают рицин, абрин, рибонуклеазу (РНКазу), ДНКазу I, стафилококковый энтеротоксин А, противовирусный белок лаконоса, гелонин, дифтерийный токсин, экзотоксин Pseudomonas и эндотоксин Pseudomonas. (См., например, Pastan. et al., Cell (1986), 47:641, и Sharkey, Goldenberg, CA Cancer J Clin. 2006 Jul-Aug; 56(4):226-43.) Дополнительные токсины, подходящие для применения в настоящем документе, известны специалистам в данной области техники и описаны в патенте США №6077499.

[0179] Еще один класс терапевтических агентов может содержать один или более иммуномодуляторов. Иммуномодуляторы, подходящие для применения, могут быть выбраны из цитокина, фактора роста стволовых клеток, лимфотоксина, гематопоэтического фактора, колониестимулирующего фактора (КСФ), интерферона (ИФН), эритропоэтина, тромбопоэтина и их комбинации. В частности, подходят для применения лимфотоксины, такие как фактор некроза опухоли (ФНО), гематопоэтические факторы, такие как интерлейкин (ИЛ), колониестимулирующий фактор, такой как гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ) или гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ), интерферон, такие как интерфероны α, β, γ или λ, и фактор роста стволовых клеток, такой как обозначаемый «фактор S1». К цитокинам относятся гормоны роста, такие как гормон роста человека, N-метионильный гормон роста человека, и бычий гормон роста; паратиреоидный гормон; тироксин; инсулин; проинсулин; релаксин; прорелаксин; гликопротеиновые гормоны, такие как фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), тиреотропный гормон (ТТГ) и лютеинизирующий гормон (ЛГ); фактор роста печени; простагландин, фактор роста фибробластов; пролактин; плацентарный лактоген, белок ОВ; фактор некроза опухоли-α и - β; мюллерова ингибирующая субстанция; гонадотропин-ассоциированный пептид мыши; ингибин; активин; фактор роста эндотелия сосудов; интегрин; тромбопоэтин (ТРО); факторы роста нервов, такие как ФРН-β; фактор роста тромбоцитов; трансформирующие факторы роста (ТФР) такие как ТФР-α и ТФР-β; инсулиноподобные факторы роста I и II; эритропоэтин (ЕРО); остеиндуктивные факторы; интерфероны, такие как интерферон α, β и γ; колониестимулирующие факторы (КСФ), такие как макрофагальный КСФ (М-КСФ); интерлейкины (ИЛ), такие как ИЛ-1, ИЛ-1α, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-8, ИЛ-9, ИЛ-10, ИЛ-11, ИЛ-12; ИЛ-13, ИЛ-14, ИЛ-15, ИЛ-16, ИЛ-17, ИЛ-18, ИЛ-21, ИЛ-25, лейкоз-ингибирующий фактор (ЛИФ), Kit-лиганд или FLT-3, ангиостатин, тромбоспондин, эндостатин, фактор некроза опухоли и лимфотоксин (LT). В настоящем документе термин цитокин включает белки из природных источников или культуры рекомбинантных клеток, и биологически активные эквиваленты природных последовательностей цитокинов.

[0180] Хемокины, подходящие для применения, включают RANTES, MCAF, MIP1-альфа, MIP1 -бета и IP-10.

[0181] Согласно некоторым вариантам реализации Терапевтический агент для применения в комбинации с ADC против Trop-2 представляет собой ингибитор микротрубочек, такой как алкалоид барвинка, таксаны, мейтансиноид или ауристатин. Примеры известных ингибиторов микротрубочек включают паклитаксел, винкристин, винбластин, мертанзин, эпотилон, доцетаксел, дискодермолид, комбрестатин, подофиллотоксин, CI-980, фенилагистины, стеганацины, курацины, 2-метоксиэстрадиол, Е7010, метоксибензенсульфонамиды, винорелбин, винфлунин, виндезин, доластатины, спонгистатин, ризоксин, тасидотин, галихондрины, гемиастерелины, криптофицин 52, ММАЕ и эрибулина мезилат.

[0182] Согласно альтернативному варианту реализации терапевтический агент для применения в комбинации с ADC представляет собой ингибитор PARP, такой как олапариб, талазопариб (BMN-673), рукапариб, велипариб, СЕР 9722, МК 4827, BGB-290, АВТ-888, AG014699, BSI-201, СЕР-8983 или 3-аминобензамид.

[0183] Согласно другому альтернативному варианту терапевтический агент, применяемый в комбинации с ADC, представляет собой ингибитор тирозинкиназы Брутона, такой как ибрутиниб (PCI-32765), PCI-45292, СС-292 (AVL-292), ONO-4059, GDC-0834, LFM-A13 или RN486.

[0184] Согласно еще одному альтернативному варианту терапевтический агент, применяемый в комбинации с ADC, представляет собой ингибитор PI3K, такой как иделалисиб, вортманнин, деметоксивиридин, перифосин, РХ-866, IPI-145 (дувелисиб), BAY 80-6946, BEZ235, RP6530, TGR1202, SF1126, INK1117, GDC-0941, ВКМ120, XL147, XL765, паломид 529, GSK1059615, ZSTK474, PWT33597, IC87114, TG100-115, CAL263, PI-103, GNE477, CUDC-907, AEZS-136 или LY294002.

[0185] Среднему специалисту в данной области техники будет понятно, что заявленные ADC, содержащие камптотецин, конъюгированный с антителом или фрагментом антитела, могут применяться по отдельности или в комбинации с одним или более другими терапевтическими агентами, такими как второе антитело, второй фрагмент антитела, второй иммуноконъюгат, радионуклид, токсин, лекарственное средство, химиотерапевтический агент, лучевая терапия, хемокин, цитокин, иммуномодулятор, фермент, гормон, олигонуклеотид, РНК-интерференция или миРНК. Такие дополнительные терапевтические агенты могут вводиться по отдельности, в комбинации с заявленными ADC, или быть присоединены к заявленным ADC антитела с лекарственным средством.

Состав и введение

[0186] Подходящие маршруты введения конъюгатов включают, без ограничения, пероральное, парентеральное, подкожное, ректальное, трансмукозальное, кишечное введение, внутримышечные, интрамедуллярные, интратекальные, прямые интравентрикулярные, внутривенные, интравитреальные, внутрибрюшинные, интраназальные или интраокулярные инъекции. Предпочтительные маршруты введения являются парентеральными. Как вариант, соединение может быть введено местно, а не системно, например, путем инъекции соединения прямо в солидную опухоль.

[0187] Составы с ADC могут быть получены в соответствии с известными способами получения подходящих для фармацевтического применения композиций, в которых ADC смешивают с подходящим для фармацевтического применения вспомогательным веществом. Стерильный забуференный фосфатом солевой раствор представляет собой один из примеров подходящего для фармацевтического применения вспомогательного вещества. Другие подходящие вспомогательные вещества хорошо известны специалистам в данной области техники. См., например, источники: Ansel et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, 5th Edition (Lea & Febiger 1990), и Gennaro (ed.), REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Edition (Mack Publishing Company 1990), и их переработанные и исправленные издания.

[0188] Согласно предпочтительному варианту реализации ADC вводят в состав биологического буфера Гуда (рН 6-7) с применением буфера, выбранного из группы, состоящей из N(2-ацетамидо)-2-аминоэтансульфоновой кислоты (ACES); N-(2-ацетамидо)иминодиуксусной кислоты (ADA); N,N-бис(2-гидроксиэтил)-2-аминоэтансульфоновой кислоты (BES); 4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфоновой кислоты (HEPES); 2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты (MES); 3-(N-морфолино)пропансульфоновой кислоты (MOPS); 3-(N-морфолинил)-2-гидроксипропансульфоновой кислоты (MOPSO); и пиперазин-N,N'-бис(2-этансульфоновой кислоты) [Pipes]. Более предпочтительными буферами являются MES или MOPS, предпочтительно, в диапазоне концентраций от 20 до 100 мМ, более предпочтительно - приблизительно 25 мМ. Наиболее предпочтительна 25 мМ MES, рН 6,5. Указанный состав может дополнительно содержать 25 мМ трегалозу и 0,01% по объему полисорбата 80 в качестве вспомогательных веществ, при этом конечная концентрация буфера модифицирована до 22,25 мМ в результате добавления вспомогательных веществ. Предпочтительный способ хранения представлен лиофилизированным составом с конъюгатами, хранящимся при температурах в диапазоне от -20°С до 2°С, наиболее предпочтительно - при 2-8°С.

[0189] ADC может быть введен в состав для внутривенного введения путем, например, болюсной инъекции, медленной инфузии или непрерывной инфузии. В предпочтительном варианте антитело согласно настоящему изобретению инфузируют на протяжении периода продолжительностью менее чем приблизительно 4 часа, более предпочтительно - на протяжении периода продолжительностью менее чем приблизительно 3 часа. Например, первые 25-50 мг могут быть инфузированы в пределах периода продолжительностью 30 минут, предпочтительно даже 15 мин, а оставшаяся часть инфузирована на протяжении следующих 2-3 часов. Если требуется подкожное введение, указанное антитело может быть сконцентрировано, например, как описано в патенте США №9180205, раздел примеров которого включен в настоящий документ посредством ссылки. Подкожные инъекции могут быть представлены инъекциями объемом 1, 2 или 3 мл, которые могут вводиться в одном сайте или в двух или более сайтах. Каждая инъекция, как правило, содержит от 1,5 до 4 мг/кг концентрированного ADC.

[0190] Составы для инъекций могут быть представлены единичной лекарственной формой, например, в ампулах или многодозовых контейнерах, с добавлением консерванта. Указанные композиции могут принимать форму, например, суспензий, растворов или эмульсий в масляных или водных основах, и могут содержать рецептурные агенты, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты. Как вариант, активный ингредиент может находиться в порошковой форме, требующей восстановления подходящей основой, например, стерильной апирогенной водой, перед применением.

[0191] Дополнительные фармацевтические способы могут применяться для контроля продолжительности действия терапевтического конъюгата. Составы для контролируемого высвобождения могут быть получены путем применения полимеров для образования комплексов с указанным ADC или его адсорбции. Например, биосовместимые полимеры включают матрицы из поли(этилен-ко-винилацетата) и матрицы из полиангидридного сополимера димера стеариновой кислоты и себациновой кислоты. Sherwood et al., Bio/Technology 10: 1446 (1992). Скорость высвобождения ADC из такой матрицы зависит от молекулярной массы ADC, количества ADC в составе матрицы и размера диспергированных частиц. Saltzman et al., Biophys. J. 55: 163 (1989); Sherwood et al., выше. Другие твердые лекарственные формы описан в источниках: Ansel et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, 5th Edition (Lea & Febiger 1990), и Gennaro (ed.), PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Edition (Mack Publishing Company 1990), а также их переработанных и исправленных изданиях.

[0192] Обычно дозировка ADC для введения человеку варьирует в зависимости от таких факторов, как возраст, масса тела, рост, пол, общее медицинское состояние и предшествующий анамнез пациента. Может быть желательно обеспечить получение реципиентом ADC в дозировке, которая находится в диапазоне от приблизительно 1 мг/кг до 24 мг/кг в виде однократной внутривенной инфузии, однако, в зависимости от обстоятельств, также может быть использована более низкая или более высокая дозировка. Дозировка 1-20 мг/кг для пациента с массой тела 70 кг, например, составляет 70-1400 мг, или 41-824 мг/м² для пациента ростом 1,7 м. Дозирование может быть при необходимости повторено, например, один раз в неделю в течение 4-10 недель, один раз в неделю в течение 8 недель, или один раз в неделю в течение 4 недель. Введение может также осуществляться с меньшей частотой, например, один раз в две недели в течение нескольких месяцев, или ежемесячно или ежеквартально в течение многих месяцев, при необходимости для поддерживающей терапии. Предпочтительные дозировки могут включать, не ограничиваясь перечисленными, 1 мг/кг, 2 мг/кг, 3 мг/кг, 4 мг/кг, 5 мг/кг, 6 мг/кг, 7 мг/кг, 8 мг/кг, 9 мг/кг, 10 мг/кг, 11 мг/кг, 12 мг/кг, 13 мг/кг, 14 мг/кг, 15 мг/кг, 16 мг/кг, 17 мг/кг, 18 мг/кг, 19 мг/кг, 20 мг/кг, 22 мг/кг и 24 мг/кг. Может применяться любое количество в диапазоне от 1 до 24 мг/кг. Дозирование предпочтительно проводят несколько раз, один или два раза в неделю. Может применяться минимальная схема дозирования продолжительностью 4 недель, более предпочтительно - 8 недель, более предпочтительно - 16 недель или более. Схема введения может включать введение один или два раза в неделю, на протяжении цикла, выбранного из группы, состоящей из: (i) еженедельного введения; (ii) введения один раз в две недели; (iii) одной недели терапии с последующим двумя, тремя или четырьмя неделями отдыха; (iv) двух недель терапии с последующим одной, двумя, тремя или четырьмя неделями отдыха; (v) трех недель терапии с последующим одной, двумя, тремя, четырьмя или пятью неделями отдыха; (vi) четырех недель терапии с последующим одной, двумя, тремя, четырьмя или пятью неделями отдыха; (vii) пяти недель терапии с последующим одной, двумя, тремя, четырьмя или пятью неделями отдыха; и (viii) ежемесячного введения. Указанный цикл может быть повторен 4, 6, 8, 10, 12, 16 или 20 раз или более.

[0193] Как вариант, ADC может вводиться в виде одной дозы каждые 2 или 3 недели, в общей сложности по меньшей мере 3 раза, или два раза в неделю в течение 4-6 недель. При понижении дозировки до приблизительно 200-300 мг/м² (340 мг на дозу для пациента ростом 1,7 м или 4,9 мг/кг для пациента с массой тела 70 кг) дозирование может осуществляться один или даже два раза в неделю в течение 4-10 недель. Как вариант, схема дозирования может быть сокращена, а именно, дозирование может осуществляться каждые 2 или 3 недели в течение 2-3 месяцев. Было определено, однако, что даже более высокие дозы, такие как 12 мг/кг один раз в неделю или один раз каждые 2-3 недели, могут вводиться путем медленной в/в инфузии, в рамках многократных циклов дозирования. Схема дозирования может необязательно быть повторена с другими интервалами; дозирование может осуществляться с использованием различных парентеральных маршрутов, с подходящими коррекциями доз и схем дозирования.

[0194] Согласно предпочтительным вариантам реализации указанные ADC подходят для терапии рака. Примеры видов рака включают, не ограничиваясь перечисленными, карциному, лимфому, глиобластому, меланому, саркому и лейкоз, миелому, или лимфоидные злокачественные образования. Более конкретные примеры таких видов рака перечислены ниже и включают: плоскоклеточный рак (например, эпителиальный плоскоклеточный рак), саркому Юинга, опухоль Вильмса, астроцитомы, рак легкого, в том числе мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого и плоскоклеточную карциному легкого, рак брюшины, рак желудочного тракта или рак желудка, в том числе рак ЖКТ, рак поджелудочной железы, мультиформную глиобластому, рак шейки матки, рак яичников, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, гепатоцеллюлярную карциному, нейроэндокринные опухоли, медуллярный рак щитовидной железы, дифференцированную карциному щитовидной железы, рак молочной железы, рак яичников, рак ободочной кишки, рак прямой кишки, рак эндометрия или карциному матки, карциному слюнных желез, рак почки или ренальный рак, рак предстательной железы, рак вульвы, карциному анального канала, карциному полового члена, а также рак головы и шеи. Термин «рак» включает первичные злокачественные клетки или опухоли (например, опухоли, клетки которых не мигрировали в сайты организма субъекта, отличные от сайта исходного злокачественного образования или опухоли), и вторичные злокачественные клетки или опухоли (например, возникшие в результате метастазирования, миграции злокачественных клеток или опухолевых клеток во вторичные сайты, отличные от сайта исходной опухоли).

[0195] Другие примеры рака или злокачественных образований включают, однако не ограничиваясь перечисленными: острый лимфобластный лейкоз детского возраста, острый лимфобластный лейкоз, острый лимфоцитарный лейкоз, острый миелоидный лейкоз, адренокортикальную карциному, (первичный) гепатоцеллюлярный рак взрослого возраста, (первичный) рак печени взрослого возраста, острый лимфоцитарный лейкоз взрослого возраста, острый миелоидный лейкоз взрослого возраста, лимфому Ходжкина взрослого возраста, лимфоцитарный лейкоз взрослого возраста, неходжкинскую лимфому взрослого возраста, первичный рак печени взрослого возраста, саркому мягких тканей взрослого возраста, СПИД-ассоциированную лимфому, СПИД-ассоциированные злокачественные образования, рак анального канала, астроцитому, рак желчных протоков, рак мочевого пузыря, рак кости, глиому ствола головного мозга, опухоли головного мозга, рак молочной железы, рак почечной лоханки и мочеточника, (первичную) лимфому центральной нервной системы, лимфому центральной нервной системы, астроцитому мозжечка, церебральную астроцитому, рак шейки матки, (первичный) гепатоцеллюлярный рак детского возраста, (первичный) рак печени детского возраста, острый лимфобластный лейкоз детского возраста, острый миелоидный лейкоз детского возраста, глиому ствола головного мозга детского возраста, астроцитому мозжечка детского возраста, церебральную астроцитому детского возраста, экстракраниальные опухоли клеток зародышевой линии детского возраста, болезнь Ходжкина детского возраста, лимфому Ходжкина детского возраста, глиому гипоталамуса и зрительного пути детского возраста, лимфобластный лейкоз детского возраста, медуллобластому детского возраста, неходжкинскую лимфому детского возраста, опухоли шишковидного тела и супратенториальные примитивные нейроэктодермальные опухоли детского возраста, первичный рак печени детского возраста, рабдомиосаркому детского возраста, саркому мягких тканей детского возраста, глиому гипоталамуса и зрительного пути детского возраста, хронический лимфоцитарный лейкоз, хронический миелогенный лейкоз, рак ободочной кишки, кожную Т-клеточную лимфому, эндокринную карциному островковых клеток поджелудочной железы, рак эндометрия, эпендимому, эпителиальный рак, рак пищевода, саркому Юинга и ассоциированные опухоли, экзокринный рак поджелудочной железы, экстракраниальную опухоль зародышевых клеток, экстрагонадную опухоль зародышевых клеток, экстрагепатический рак желчных протоков, рак глаза, рак молочной железы женщин, болезнь Гоше, рак желчного пузыря, рак желудка, карциноидную опухоль ЖКТ, опухоли ЖКТ, опухоли клеток зародышевой линии, гестационную трофобластическую опухоль, лейкоз ворсистых клеток, рак головы и шеи, гепатоцеллюлярный рак, лимфому Ходжкина, гипергаммаглобулинемию, гипофарингиальный рак, раковые заболевания ЖКТ, интраокулярную меланому, карциному островковых клеток, рак островковых клеток поджелудочной железы, саркому Капоши, рак почки, рак гортани, рак губы и ротовой полости, рак печени, рак легкого, лимфопролиферативные расстройства, макроглобулинемию, рак молочной железы мужчин, злокачественную мезотелиому, злокачественную тимому, медуллобластому, меланому, мезотелиому, метастатический оккультный первичный плоскоклеточный рак шеи, метастатический первичный плоскоклеточный рак шеи, метастатический плоскоклеточный рак шеи, множественную миелому, множественную миелому/плазмаклеточное новообразование, миелодиспластический синдром, миелогенный лейкоз, миелоидный лейкоз, миелопролиферативные расстройства, рак носовой полости и околоносовых пазух, рак носоглотки, нейробластому, неходжкинскую лимфому, немеланомный рак кожи, немелкоклеточный рак легкого, оккультный первичный метастатический плоскоклеточный рак шеи, рак ротоглотки, остео-/ злокачественную фиброзную саркому, остеосаркому/злокачественную фиброзную гистиоцитому, остеосаркому/злокачественную фиброзную гистиоцитому кости, эпителиальный рак яичников, опухоль зародышевых клеток яичника, опухоль яичника с низким потенциалом злокачественности, рак поджелудочной железы, парапротеинемии, истинную полицитемию, рак паращитовидной железы, рак полового члена, феохромоцитому, опухоль гипофиза, первичную лимфому центральной нервной системы, первичный рак печени, рак предстательной железы, рак прямой кишки, почечно-клеточный рак, рак почечной лоханки и мочеточника, ретинобластому, рабдомиосаркому, рак слюнной железы, саркоидозные саркомы, синдром Сезари, рак кожи, мелкоклеточный рак легкого, рак тонкого кишечника, саркому мягких тканей, плоскоклеточный рак шеи, рак желудка, супратенториальные примитивные нейроэктодермальные опухоли и опухоли шишковидного тела, Т-клеточную лимфому, рак яичка, тимому, рак щитовидной железы, переходно-клеточный рак почечной лоханки и мочеточника, переходно-клеточный рак почечной лоханки и мочеточника, трофобластные опухоли, рак клеток мочеточника и почечной лоханки, рак мочеточника, рак матки, саркому матки, рак влагалища, глиому зрительного пути и гипоталамуса, рак вульвы, макроглобулинемию Вальденстрема, опухоль Вильмса и любое другое гиперпролиферативное заболевание, помимо новообразования, локализованного в системах органов, перечисленных выше.

[0196] Способы и композиции, описанные и заявленные в настоящем документе, могут применяться для лечения злокачественных или предзлокачественных состояний, и для предотвращения прогрессирования в неопластический или злокачественный статус, в том числе, но не ограничиваясь перечисленными, расстройств, описанных выше. Такие варианты применения показаны при состояниях, предшествующих, по имеющимся данным или предположительно, прогрессированию в новообразование или рак, в частности, при появлении роста не являющихся неопластическими клеток, выбранного из гиперплазии, метаплазии или, в частности, дисплазии (см. обзор таких связанных с аномальным ростом состояний в источнике: Robbins, Angell, Basic Pathology, 2d Ed., W. B. Saunders Co., Philadelphia, pp. 68-79 (1976)).

[0197] Дисплазия часто является предвестником рака, и в основном обнаруживается в эпителии. Она представляет собой наиболее неупорядоченную форму роста не являющихся неопластическими клеток, включающую утрату индивидуальными клетками однородности и конструкционной ориентации клеток. Характерно возникновение дисплазии в участках хронического раздражения или воспаления. Диспластические расстройства, лечение которых может быть проведено, включают, не ограничиваясь перечисленными, ангидротическую эктодермальную дисплазию, передне-фациальную дисплазию, асфиксическую торакальную дисплазию, предсердно-пальцевую дисплазию, бронхолегочную дисплазию, церебральную дисплазию, цервикальную дисплазию, хондроэктодермальную дисплазию, ключично-черепную дисплазию, врожденную эктодермальную дисплазию, черепно-диафизарную дисплазию, черепно-карпотарзальную дисплазию, черепно-метафизарную дисплазию, дисплазию дентина, диафизарную дисплазию, эктодермальную дисплазию, дисплазию эмали, энцефалоофтальмическую дисплазию, гемимелическую эпифизарную дисплазию, множественную эпифизарную дисплазию, точечную эпифизарную дисплазию, эпителиальную дисплазию, лице-пальце-генитальную дисплазию, семейную фиброзную дисплазию челюстей, семейную белую складчатую дисплазию, фиброзно-мышечную дисплазию, фиброзную дисплазию костей, флоридную костную дисплазию, наследственную дисплазию почек и сетчатки, гидротическую эктодермальную дисплазию, гипогидротическую эктодермальную дисплазию, лимфоцитопеническую дисплазию тимуса, дисплазию молочной железы, мандибуло-фациальную дисплазию, метафизарную дисплазию, дисплазию Мондини, моностотическую фиброзную дисплазию, мукоэпителиальную дисплазию, множественную эпифизарную дисплазию, окуло-аурикуло-вертебральную дисплазию, окулодентодигитальную дисплазию, окуловертебральную дисплазию, одонтогенную дисплазию, офтальмомандибуломелическую дисплазию, периапикальную цементную дисплазию, полиоссальную фиброзную дисплазию, псевдоахондропластическую спондилоэпифизарную дисплазию, дисплазию сетчатки, септооптическую дисплазию, спондилоэпифизарную дисплазию и предсердно-пальцевую дисплазию.

[0198] Дополнительные преднеопластические расстройства, лечение которых может быть проведено, включают, не ограничиваясь перечисленными, доброкачественный диспролиферативные расстройства (например, доброкачественные опухоли, фиброзно-кистозные состояния, гипертрофию тканей, полипы или аденомы кишечника, и дисплазию пищевода), лейкоплакию, кератозы, болезнь Боуэна, «кожу фермера», солнечный хейлит, и солнечный кератоз.

[0199] Согласно предпочтительным вариантам реализации способ согласно настоящему изобретению применяют для ингибирования роста, прогрессирования и/или метастазирования рака, в частности, перечисленных выше видов рака.

[0200] Дополнительные гиперпролиферативные заболевания, расстройства и/или состояния включают, не ограничиваясь перечисленными, прогрессирование и/или метастазы злокачественных образований и ассоциированные расстройства, такие как лейкоз (в том числе острые лейкозы; например, острый лимфоцитарный лейкоз, острый миелоцитарный лейкоз [в том числе миелобластный, промиелоцитарный, миеломоноцитарный, моноцитарный лейкоз и эритролейкоз]) и хронические лейкозы (например, хронический миелоцитарный [гранулоцитарный] лейкоз и хронический лимфоцитарный лейкоз), истинную полицитемию, лимфомы (например, болезнь Ходжкина и неходжкинскую лимфому), множественную миелому, макроглобулинемию Вальденстрема, болезнь тяжелых цепей и солидные опухоли, в том числе, но не ограничиваясь перечисленными, саркомы и карциномы, такие как фибросаркома, миксосаркома, липосаркома, хондросаркома, остеогенная саркома, хордома, ангиосаркома, эндотелиосаркома, лимфангиосаркома, лимфангиоэндотелиосаркома, синовиома, мезотелиома, опухоль Юинга, лейомиосаркома, рабдомиосаркома, карцинома ободочной кишки, рак поджелудочной железы, рак молочной железы, рак яичников, рак предстательной железы, плоскоклеточную карциному, базально-клеточную карциному, аденокарциному, карциному потовых желез, карциному сальных желез, папиллярную карциному, папиллярные аденокарциномы, цистаденокарциному, медуллярную карциному, бронхогенную карциному, почечноклеточный рак, гепатому, карциному желчных протоков, хориокарциному, семиному, эмбриональную карциному, опухоль Вильмса, рак шейки матки, опухоль яичка, карциному легкого, мелкоклеточную карциному легких, карциному мочевого пузыря, эпителиальную карциному, глиому, астроцитому, медуллобластому, краниофарингиому, эпендимому, пинеалому, гемангиобластому, акустическую невриному, олигодендроглиому, менингиому, меланому, нейробластому и ретинобластому.

[0201] Аутоиммунные заболевания, лечение которых может быть проведено с применением ADC, могут включать острые и хронические иммунные тромбоцитопении, дерматомиозит, хорею Сиденгама, тяжелую миастению, системную красную волчанку, волчаночный нефрит, ревматическую лихорадку, полигландулярные синдромы, буллезный пемфигоид, сахарный диабет, пурпуру Шенлейна-Геноха, постстрептококковый нефрит, узелковую эритему, артериит Такаясу, ANCA-ассоциированный васкулит, болезнь Аддисона, ревматоидный артрит, рассеянный склероз, саркоидоз, язвенный колит, мультиформную эритему, IgA-нефропатию, узелковый полиартериит, анкилозирующий спондилит, синдром Гудпасчера, облитерирующий тромбоангиит, синдром Шегрена, первичный билиарный цирроз, тиреоидит Хашимото, тиреотоксикоз, склеродермию, хронический активный гепатит, полимиозит/дерматомиозит, полихондрит, буллезный пемфигоид, обыкновенную пузырчатку, гранулематоз Вегенера, мембранозную нефропатию, амиотрофический боковой склероз, сухотку спинного мозга, гигантоклеточный артериит/полимиалгию, пернициозную анемию, быстро прогрессирующий гломерулонефрит, псориаз или фиброзирующий альвеолит.

Наборы

[0202] Различные варианты реализации могут предусматривать наборы, содержащие компоненты, подходящие для лечения пораженной заболеванием ткани пациента. Примеры наборов могут содержать по меньшей мере один ADC или другой нацеливающий фрагмент описанные в настоящем документе. Если композиция, содержащая компоненты, для введения, не введена в состав для доставки через пищеварительный тракт, например, пероральной доставки, может быть включено устройство, позволяющее доставлять компоненты набора каким-либо другим путем. Один из типов устройства для вариантов применения, предусматривающих, например, парентеральную доставку, представляет собой шприц, который используют для инъецирования композиции в организм субъекта. Могут также использоваться устройства для ингаляции.

[0203] Компоненты набора могут быть упакованы вместе или разделены на два или более контейнеров. Согласно некоторым вариантам реализации указанные контейнеры могут представлять собой флаконы со стерильными лиофилизированными составами с композицией, которые подходят для восстановления. Набор может также содержать один или более буферов, подходящих для восстановления и/или разведения других реагентов. Другие контейнеры, которые могут применяться, включают, не ограничиваясь перечисленными, пакет, лоток, коробку, пробирку или т.п.Компоненты набора могут быть упакованы и сохранены в стерильном состоянии внутри указанных контейнеров. Другой компонент, который может быть включен, представлен инструкциями для пользователя по применению набора.

ПРИМЕРЫ

[0204] Различные варианты реализации настоящего изобретения проиллюстрированы приведенными ниже примерами, не ограничивающими объем настоящего изобретения.

Пример 1. Получение и применение конъюгата антитела с лекарственным средством анти-Trop-2-SN-38

[0205] Гуманизированное антитело RS7 (hRS7) против Trop-2 получали как описано в патенте США №7238785, разделы чертежей и примеров которого включены в настоящий документ посредством ссылки. Получали SN-38, присоединенный к линкеру CL2A, и конъюгировали с антителами hRS7 (против Trop-2), hPAM4 (против MUC5ac), hA20 (против CD20) или hMN-14 (против СЕАСАМ5) в соответствии с патентом США №7999083 (примеры 10 и 12 из которого включены в настоящий документ посредством ссылки). Протокол конъюгации обеспечивал прикрепление приблизительно 6 молекул SN-38 на молекулу антитела.

[0206] Бестимусные мыши Nude (самки) с иммунной недостаточностью, несущие подкожные ксенотрансплантаты опухолей поджелудочной железы или ободочной кишки человека, получали лечение либо специфическим конъюгатом CL2A-SN-38, либо контрольным конъюгатом, либо не получали никакого лечения. Наблюдалась терапевтическая эффективность специфических конъюгатов. В модели опухоли поджелудочной железы Capan 1 специфические конъюгаты CL2A-SN-38 антител hRS7 (антитело против Trop-2), hPAM4 (антитело против MUC-5ac) и hMN-14 (антитело против СЕАСАМ5) демонстрировали лучшую эффективность по сравнению с контрольным конъюгатом hA20-CL2A-SN-38 (антитело против CD20) и контролем без лечения (не показано). Аналогичным образом, в модели рака поджелудочной железы человека ВХРС3 специфический hRS7-CL2A-SN-38 продемонстрировал лучшую терапевтическую эффективность по сравнению с контрольным лечением (не показано).

Пример 2. Терапевтическое применение ADC против Trop-2 (сацитузумаб говитекан) у пациентов, рефрактерных к терапии ингибиторами контрольной точки

Краткое описание

[0207] IMMU-132 (сацитузумаб говитекан, или hRS7-CL2A-SN-38) продемонстрировал многообещающие терапевтические результаты в испытаниях II фазы у пациентов с метастатическим раком молочной железы с тройным негативным фенотипом и другими раковыми заболеваниями, предварительно проходивших серьезное лечение (ClinicalTrials.gov, NCT01631552), у которых экспрессируются высокие уровни Trop-2. Указанное новое нацеленное на Trop-2 гуманизированное антитело конъюгировано с 7,6 молей SN-38, активной формы иринотекана, линкером CL2A, описанным выше, и подвергается меньшей глюкуронидации in vivo по сравнению с иринотеканом, что является причиной значимо меньшей частоты встречаемости диареи у пациентов, получавших лечение указанным агентом.

[0208] Неожиданным образом, IMMU-132 показал высокую эффективность у пациентов, у которых ранее наблюдался рецидив после применения или устойчивость ко многим стандартным видам противораковой терапии, в том числе к исходному соединению иринотекану. Новый класс противораковых агентов, известных как ингибиторы контрольной точки, включают антитела или другие ингибиторные агенты против антигена 4 цитотоксических Т-лимфоцитов (CTLA-4), белка запрограммированной смерти клеток (PD-1) и лиганда 1 запрограммированной смерти клеток (PD-L1). Согласно описанию в настоящем документе, IMMU-132 демонстрирует неожиданную и непредвиденную эффективность, направленную против опухолей, рецидивирующих/рефрактерных к ингибиторам контрольной точки, а также другим противораковым агентам.

[0209] Приведенные ниже данные обобщают результаты для практического примера применения у пациента (255-029), отвечавшего на терапию IMMU-132 после продемонстрированной устойчивости к ингибитору PD-L1.

Рак: ТНРМЖ (пациент прогрессировал после терапии PD-L1)

Лучший ответ: Частичный ответ, подтвержден (сокращение размеров на 54%)

Стартовая доза IMMU-132: 10 мг/кг

Число лечебных процедур с IMMU-132: 40+

Время до прогрессирования: 12,4 + месяцев (не достигнуто)

Окончание исследования: Продолжение лечения

[0210] Анамнез - Пациент: женщина возрастом 47 лет, в октябре 2007 г. впервые диагностировано новообразование размером 1,8 см в правой молочной железе. Пациентка перенесла правостороннюю мастэктомию с биопсией сигнального лимфоузла (малигнизация в узлах отсутствовала). Было определено, что опухоль является отрицательной по ER, PR и Her-2 (т.е. представляет собой ТНРМЖ). Затем пациентка прошла 4 цикла терапии АС (доксорубицин и циклофосфамид), с последующим еженедельным введением низких доз паклитаксела (×12). В октябре 2008 г. при КТ-исследовании обнаружен не замеченный ранее легочный узелок и увеличенный узел в молочной железе; указанный узел был раковым. Пациентка перенесла местное хирургическое вмешательство для удаления узла, после чего получала XRT (лучевая терапия) в течение марта 2009 г. В июне 2010 г. при КТ зарегистрировано рецидивирующее поражение легких и костей. Пациентка была включена в клиническое испытание с применением Авастина® (бевацизумаб), Метмаба® (онартузумаб, антитело против фактора роста гепатоцитов) и Таксола® (паклитаксел), в котором участвовала до марта 2013 г., продемонстрировав полный ответ, однако в конечном итоге наблюдалось прогрессирование периферического легочного узелка и узла в АП (аортопульмональном) окне. В сентябре 2014 г. пациентка начала 6 циклов лечения антителом к PD-L1 (MPDL3280A), однако в январе 2015 г. началось прогрессирование. После этого пациентка была переведена для участия в испытании IMMU-132.

[0211] Лечение в IMMU-132 - Лечение пациента было начато 6 февраля 2015 г. с дозы 10 мг/кг, введение указанной дозы продолжалось без снижения или задержек согласно запланированной схеме, уже было введено 40 + доз.

Результаты

[0212] Изначально у пациентки имелось 3 целевых очага поражения (1 в легком, 2 в лимфатических узлах грудной клетки) с суммарным диаметром 60 мм, и дополнительный нецелевой очаг поражения (другой лимфатический узел грудной клетки) (фиг. 2). При первой оценке (7 апреля 2015 г.) суммарный диаметр целевых очагов поражения у пациентки уменьшился на 33%, что соответствует частичному ответу согласно критериям RECIST 1.1. При последующем подтверждающем КТ-исследовании, проведенном приблизительно через 5 недель (18 мая 2015 г.) обнаружено улучшение ответа, с общим снижением на 48% (фиг. 3, фиг. 4). 19 июля 2015 г. КТ-исследование показало продолжение частичного ответа у пациентки, с 50% сокращением размеров. 13 сентября 2015 г. КТ-исследование показало продолжение ЧО с 52% сокращением размеров, а КТ-исследование 15 ноября 15 г. показало 54% сокращение размеров. Последнее КТ-исследование, проведенное 25 февраля 2016 г., показало продолжение ЧО с 46% сокращением размеров.

[0213] Обобщенные результаты КТ приведены на фиг. 1. Результаты базовых КТ-сканирований представлены на фиг. 2, осевые снимки приведены в верхнем ряду, а снимки в сагиттальной проекции в нижнем ряду (опухоли отмечены стрелками). Прямое сравнение целевых очагов поражения представлено на фиг. 3 и фиг. 4. На фиг. 3 показаны оба целевых очагов поражения, 1 и 2, в одной плоскости. Базовый снимок (29 января 2015 г.) приведен сверху. Значимое сокращение размеров как L1, так и L2 было очевидным при второй оценке ответа (19 мая 2015 г.), снимки приведены снизу. На фиг. 4 приведены эквивалентные снимки для целевого очага поражения 3, с базовым снимком сверху и второй оценкой ответа снизу. Пациент продолжает лечение, и у него продолжает наблюдаться частичный ответ на IMMU-132 после предшествующей неуспешной терапии ингибитором контрольной точки.

[0214] Иммуногистохимический анализ экспрессии Trop-2 в опухолях пациента подтверждает экспрессию с уровнем окрашивания 2 + (данные не показаны).

[0215] Токсичность - К моменту написания настоящего отчета наиболее серьезное нежелательное явление было представлено гипофосфатемией 3 класса (G3) (не связанной с лечением), при этом предположительно связанная с лечением токсичность была представлена нейтропенией класса 2 (G2) (2 апреля 2015 г.; доза 6), утомляемостью (G1), тошнотой (G1), макулопапулезной сыпью (G1), алопецией (G2) и ринореей (G1).

[0216] Указанные результаты демонстрируют, что IMMU-132 обладает высокой эффективностью у пациентов, у которых ранее наблюдался рецидив после терапии ингибитором контрольной точки или устойчивость к указанной терапии. При применении терапевтической дозировки IMMU-132 у пациента наблюдалось только управляемая токсичность. Указанные результаты демонстрируют полезность IMMU-132 для применения при Trop-2-положительных раковых заболеваний, таких как рак молочной железы с тройным негативным фенотипом (ТНРМЖ).

Пример 3. АЗКЦ-активность ADC против Trop-2

[0217] Определяли сравнительную АЗКЦ-активность различных ADC - конъюгатов с hRS7 и IgG hRS7 (не показано). МКПК, очищенные из крови, приобретали в Центре крови Нью-Джерси. Линию Trop-2-положительных клеток аденокарциномы поджелудочной железы человека (ВхРС-3) использовали в качестве целевой линии клеток, при отношении эффекторных к целевым клеткам 100:1. АЗКЦ, опосредованный IgG hRS7 сравнивали с АЗКЦ, опосредованным hRS7-Pro-2-PDox, hRS7-CL2A-SN-38 и восстановленным и кэпированным hRS7-NEM. Все антитела использовали в концентрации 33,3 нМ.

[0218] Общая активность была низкой, однако значимой (не показано). Наблюдался 8,5% специфический лизис для IgG hRS7, что значимо не отличалось от результатов для hRS7-Pro-2-PDox. Оба результаты были значимо лучше, чем результаты для контрольных hLL2 и hRS7-NEM и сацитузумаба говитекана (Р меньше 0,02, двусторонний t-тест). Различия между hRS7-NEM и сацитузумабом говитеканом отсутствовали.

Пример 4. Эффективность ADC анти-Trop-2-SN-38 против разнообразных видов эпителиального рака in vivo

Краткий обзор

[0219] Целью указанного исследования была оценка эффективности ADC SN-38 и антитела против Trop-2 (hRS7), направленного против нескольких типов солидных опухолей человека, и оценка его переносимости у мышей и обезьян, причем у последних оценивали тканевую перекрестную реактивность в отношении hRS7, аналогичную наблюдаемой у человека. Два производных SN-38, CL2-SN-38 и CL2A-SN-38, конъюгировали с гуманизированным антителом против Trop-2, hRS7. Указанные ADC характеризовали in vitro в отношении стабильности, связывания и цитотоксичности. Эффективность тестировали в пяти разных моделях с ксенотрансплантатами солидных опухолей человека, которые экспрессируют антиген Ткор-2. Токсичность оценивали у мышей и у яванских макаков.

[0220] Конъюгаты hRS7 с двумя производными SN-38 были эквивалентны в отношении коэффициента замещения лекарственного средства (~6), связывания клеток (K_d ~ 1,2 нмоль/л), цитотоксичности (IC₅₀ ~ 2,2 нмоль/л) и стабильности в сыворотке in vitro (t/ ~ 20 часов). При воздействии ADC на клетки наблюдались сигнальные пути, приводящие к расщеплению PARP, однако были отмечены различия положительной регуляции р53 и р21 относительно свободного SN-38. Сацитузумаб говитекан обеспечивал значимые противоопухолевые эффекты при нетоксических дозах у мышей, несущих опухоли Calu-3 (Р меньше или равно 0,05), Capan-1 (Р меньше 0,018), ВхРС-3 (Р меньше 0,005) и COLO 205 (Р меньше 0,033) по сравнению с ненацеливающими контрольными ADC. Мыши переносили дозу 2×12 мг/кг (эквивалентов SN-38) только с кратковременным подъемом уровней ферментов печени АЛТ и ACT. У яванских макаков, которым инфузировали 2×0,96 мг/кг, наблюдалось только транзиентное уменьшение числа элементов крови, при этом, что важно, значения не опускались ниже нормальных диапазонов.

[0221] Обобщая вышесказанное, ADC против Trop-2 hRS7-CL2A-SN-38 обеспечивал значимые специфические противоопухолевые эффекты против ряда типов солидных опухолей человека. Он хорошо переносился у обезьян, экспрессия Trop-2 в тканях у которых аналогична экспрессии у человека, в клинически релевантных дозах.

Введение

[0222] Успешное лечение иринотеканом пациентов с солидными опухолями было ограничено по большей части ввиду низкой скорости конверсии пролекарства СРТ-11 в активный метаболит SN-38. Другие исследователи изучали ненацеливающие формы SN-38 в качестве способа избежать необходимости указанной конверсии и для пассивной доставки SN-38 в опухоли. Авторы настоящего изобретения ковалентно конъюгировали SN-38 с гуманизированным антителом против Trop-2, hRS7. Указанный конъюгат антитела с лекарственном средством оказывает специфические противоопухолевые эффекты в ряде моделей с п/к ксенотрансплантатами рака человека, в том числе немелкоклеточной карциномы легких, рака поджелудочной железы, ободочной и прямой кишки, и плоскоклеточных карцином легких, во всех случаях в нетоксических дозах (например, при кумулятивной дозе эквивалента SN-38 меньше или равно 3,2 мг/кг). Trop-2 широко экспрессируется во многих видах эпителиального рака, однако также и в некоторых нормальных тканях; поэтому для оценки клинической безопасности указанного конъюгата проводили исследование с эскалацией дозы на яванских макаках. Обезьяны переносили 24 мг эквивалентов SN-38/кг с наблюдаемой всего лишь незначительной и обратимой токсичностью. Учитывая способность к нацеливанию на опухоли и профиль безопасности сацитузумаба говитекана, он обеспечивает значимое усовершенствование управления реагирующими на иринотекан солидными опухолями.

Материалы и способы

[0223] Линии клеток, антитела и химиотерапевтические средства - Все линии клеток рака человека, используемые в указанном исследовании, приобретали в Американской коллекции типовых культур. Указанные линии включают Calu-3 (немелкоклеточная карцинома легких), SK-MES-1 (плоскоклеточная карцинома легких), COLO 205 (аденокарцинома ободочной кишки), Сарап-1 и ВхРС-3 (аденокарциномы поджелудочной железы), и РС-3 (аденокарциномы предстательной железы). Гуманизированные IgG-антитела RS7 и контрольные гуманизированные антитела против CD20 (IgG hA20, велтузумаб) и против CD22 (hLL2 IgG, эпратузумаб) получали от Immunomedics, Inc. Иринотекан (20 мг/мл) получали от Hospira, Inc.

[0224] ADC с SN-38 и аспекты in vitro - Синтез CL2-SN-38 был описан ранее (Moon et al., 2008, J Med Chem 51:6916-26). Его конъюгацию с IgG hRS7 и исследование стабильности в сыворотке выполняли как описано (Moon et al., 2008, J Med Chem 51:6916-26; Govindan et al., 2009, Clin Chem Res 15:6052-61). Получение составов с CL2A-SN-38 (молекулярная масса - 1480) и его конъюгата с hRS7, и исследования стабильности, связывания и цитотоксичности проводили как описано в разделе примеров выше.

[0225] Терапевтические исследования in vivo - Для всех исследований на животных дозы ADC с SN-38 и иринотекана приведены в эквивалентах SN-38. При среднем коэффициенте замещения SN-38/IgG, равном 6, доза 500 мкг ADC для мыши с массой тела 20 г (25 мг/кг) содержит 0,4 мг/кг SN-38. Дозы иринотекана также приведены в эквивалентах SN-38 (т.е. 40 мг иринотекаиа/кг эквивалентны 24 мг/кг SN-38).

[0226] Самок бестимусных мышей NCr Nude (nu/nu) возрастом 4-8 недель и самцов мышей Swiss-Webster возрастом 10 недель приобретали у Taconic Farms. Исследования переносимости выполняли на яванских макаков (Масаса fascicularis; самцы и самки с массой тела 2,5-4 кг) в SNBL USA, Ltd. Животным имплантировали подкожно клетки разных линий рака человека. Объем опухоли (ОО) определяли, проводя замеры с помощью калипера в 2 измерениях, следующим образом: L × w ²/2, где L представляет собой наибольший линейный размер опухоли, a w представляет собой наименьший линейный размер. Размер опухолей варьировал в диапазоне от 0,10 до 0,47 см³ в начале терапии. Схемы лечения, дозировки и число животных в каждом эксперименте описаны в разделе результатов. Лиофилизированный сацитузумаб говитекан и контрольный ADC восстанавливали и разводили в соответствии с указаниями в стерильном солевом растворе. Все реагенты вводили внутрибрюшинно (0,1 мл), за исключением иринотекана, который вводили внутривенно. На режим дозирования оказали влияние предшествующие исследования авторов настоящего изобретения, в ходе которых ADC вводили каждые 4 дня или два раза в неделю на протяжении периодов времени варьирующей длительности (Moon et al., 2008, J Med Chem 51:6916-26; Govindan et al., 2009, Clin Chem Res 15:6052-61). Указанная частота дозирования была выбрана с учетом времени полужизни конъюгата в сыворотке in vitro, для лучшего обеспечения непрерывного воздействия ADC.

[0227] Статистика - Кривые роста отражают процентное изменение начального ОО с течением времени. Статистический анализ роста опухоли был основан на площади под кривой (AUC). Профили роста индивидуальных опухолей получали путем моделирования линейных кривых. Для определения равенства дисперсии между группами перед статистическим анализом кривых роста использовали f-тест. Для оценки статистической значимости между различными группами лечения и контролями использовали двусторонний t-тест, за исключением контрольного солевого раствора, для которого использовали односторонний t-тест (значимость при Р меньше или равно 0,05). Статистические сравнения AUC выполняли только до момента времени, когда первое животное из группы умерщвляли ввиду прогрессирования.

[0228] Фармакокинетика и биораспределение - меченый радиоактивной меткой ¹¹¹In сацитузумаб говитекан и IgG hRS7 инъецировали мышам Nude, несущим п/к опухоли SK-MES-1 (~0,3 см³). Одной группе инъецировали внутривенно 20 мкКи (250 мкг белка) ¹¹¹In-сацитузумаба говитекана, тогда как другая группа получала 20 мкКи (250 мкг белка) ¹¹¹In-IgG hRS7. В различные точки времени мышей (5 на точку времени) анестезировали, забирали кровь путем внутрисердечной пункции, и затем умерщвляли. Опухоли и различные ткани извлекали, взвешивали и регистрировали γ-сцинтилляцию для определения процента инъецированной дозы на грамм ткани (% ИД/г). Третьей группе инъецировали 250 мкг немеченого сацитузумаба говитекана за 3 дня до введения ¹¹¹In-сацитузумаба говитекана и проводили некропсию аналогичным образом. 2-сторонний t-критерий использовали для сравнения поглощения сацитузумаба говитекана и IgG hRS7 после определения равенства дисперсии с применением f-теста. Фармакокинетический анализ выведения из крови выполняли с применением программного обеспечения WinNonLin (Parsight Corp.).

[0229] Переносимость у мышей Swiss-Webster и яванских макаков - Вкратце, мышей разделяли на 4 группы, каждая получала 2 мл в/б инъекции либо контрольного натрий-ацетатного буфера, либо 3 разных доз сацитузумаба говитекана (4, 8 или 12 мг/кг SN-38) на 0 и 3 дни с последующим взятием образцов крови и сыворотки, как описано в разделе результатов. Яванским макакам (3 самца и 3 самки; 2,5-4,0 кг) вводили 2 разные дозы сацитузумаба говитекана. Дозировки, моменты времени и число обезьян, у которых брали кровь для оценки возможной гематологической токсичности, и биохимический анализ сыворотки описан в разделе результатов. Результаты

[0230] Стабильность и мощность hRS7-SN-38 - Две разных связи использовали для конъюгирования SN-38 с IgG hRS7 (не показано). Первая называется CL2-SN-38 и была описана ранее (Moon et al., 2008, J Med Chem 51:6916-26; Govindan et al., 2009, Clin Chem Res 15:6052-61). Для получения линкера CL2A использовали изменения для удаления фрагмента фенилаланина в составе линкера при синтезе CL2. Указанное изменение упрощало синтез, однако не влияло на исход конъюгации (например, и CL2-SN-38, и CL2A-SN-38 присоединяли ~6 SN-38 на молекулу IgG). Параллельное сравнение не показало значимых различий стабильности в сыворотке, связывания антигена или цитотоксичности in vitro. Указанный результат был неожиданным, поскольку остаток фенилаланина в CL2 входит в состав спроектированного сайта расщепления катепсином В, лизосомной протеазой.

[0231] Для подтверждения того, что изменение линкера SN-38 с заменой CL2 на CL2A не влияло на мощность in vivo, сравнивали сацитузумаб говитекан и hRS7-CL2-SN-38 у мышей, несущих опухоли COLO 205 (не показано) или Сарап-1 (не показано), с применением 0,4 мг или 0,2 мг/кг SN-38 два раза в неделю х 4 недель, соответственно, при стартовом размере опухолей 0,25 см³ в обоих исследованиях. И сацитузумаб говитекан, и конъюгаты CL2-SN-38 значимо ингибировали рост опухоли по сравнению с отсутствием лечения (AUC_{14 дней} Р меньше 0,002 или солевой раствор в модели COLO 205; AUC_{21 день} Р меньше 0,001 или солевой раствор в модели Capan-1), и ненацеливающим контрольным ADC против CD20, hA20-CL2A-SN-38 (AUC_{14 дней} Р меньше 0,003 в модели COLO-205; AUC_{35 дней}: Р меньше 0,002 в модели Capan-1). В конце исследования (140 день) в модели Capan-1 у 50% мышей, получавших лечение сацитузумабом говитеканом, и 40% мышей, получавших hRS7-CL2-SN-38, наблюдалось отсутствие опухолей, тогда как из получавших лечение hA20-ADC животных только у 20% отсутствовали видимые признаки заболевания. Линкер CL2A приводил к большей эффективности по сравнению с CL2 (не показано).

[0232] Механизм действия - Исследования цитотоксичности in vitro продемонстрировали, что сацитузумаб говитекан отличался значениями IC₅₀ в наномолярном диапазоне (нмоль/л) с отношении нескольких разных линий солидных опухолей (Таблица 2). IC₅₀ у свободного SN-38 была ниже, чем у конъюгата, во всех линиях клеток. Хотя очевидная корреляция между экспрессией Тгор-2 и чувствительностью к сацитузумабу говитекану отсутствовала, отношение IC₅₀ ADC и свободного SN-38 было ниже в клетках с высокой экспрессией Trop-2, что, вероятнее всего, отражает повышенную способность к интернализации лекарственного средства при более высоких уровнях антигена.

[0233] Известно, что SN-38 активирует несколько сигнальных путей в клетках, что приводит к апоптозу (см., например, Cusack et al., 2001, Cancer Res 61:3535-40; Liu et al. 2009, Cancer Lett 274:47-53; Lagadec et al., 2008, Br J Cancer 98:335-44). В начальных исследованиях авторы настоящего изобретения изучали экспрессию 2 белков, вовлеченных в ранние сигнальные события (p21^Wafl/Cip1 и р53) и 1 позднее апоптотическое событие [расщепление поли(АДФ-рибоза)-полимеразы (PARP)] in vitro (не показано). В клетках ВхРС-3 SN-38 обуславливал 20-кратное увеличение экспрессии p21^Wafl/Cip1 (не показано), тогда как сацитузумаб говитекан обуславливал только 10-кратное увеличение (не показано); указанный результат согласуется с более высокой активностью свободного SN-38 в указанной линии клеток (таблица 2). Тем не менее, в Calu-3 увеличение экспрессии p21^Wafl/Cip1 сацитузумабом говитеканом более чем в 2 раза превышало результаты для свободного SN-38 (не показано).

[0234] Еще большие расхождения между опосредованными сацитузумабом говитеканом и свободным SN-38 сигнальными событиями наблюдались в отношении экспрессии р53 (не показано). Ив ВхРС-3, ив Calu-3 положительная регуляция р53 свободным SN-38 не проявлялась до истечения 48 часов, тогда как сацитузумаб говитекан стимулировал р53 в пределах 24 часов (не показано). Кроме того, экспрессия р53 в клетках, на которые воздействовали ADC, в обеих линиях клеток была выше по сравнению с клетками, на которые воздействовали SN-38 (не показано). Интересно, что хотя IgG hRS7 оказывал не поддающийся оценке эффект на экспрессию p21^Wafl/Cip1 он, тем не менее, индуцировал положительную регуляцию р53 и в ВхРС-3, и в Calu-3, однако только через 48 часов воздействия (не показано). Что касается поздних апоптотических событий, расщепление PARP проявлялось в обеих линиях клеток при инкубации либо с SN-38, либо с конъюгатом (не показано). Через 24 часа расщепленная PARP в большем количестве присутствовала в клетках ВхРС-3 (не показано), что коррелирует с высокой экспрессией р21 и его более низкой IC₅₀. Более высокая степень расщепления при применении свободного SN-38, а не ADC, согласуется с результатами исследования цитотоксичности.

[0235] Эффективность hRS7-SN-38 - Поскольку Trop-2 широко экспрессируется в ряде карцином человека, исследования проводили на нескольких разных моделях рака человека, начиная с использования связи hRS7-CL2-SN-38, но затем переходя к использованию конъюгатов с CL2A-связью. У несущих Calu-3 мышей Nude, которые получали 0,04 мг SN-38/кг hRS7-CL2-SN-38 каждые 4 дня × 4, наблюдались значимо улучшенные ответы по сравнению с животными, которым вводили эквивалентное количество ненацеливающего hLL2-CL2-SN-38 (OO=0,14±0,22 см³ против 0,80±0,91 см³, соответственно; AUC_{42 дня} Р меньше 0,026; не показано). Зависимость ответа от дозы наблюдалась при увеличении дозы до 0,4 мг/кг SN-38 (не показано). При указанном более высоком уровне дозы у всех мышей, получавших специфический конъюгат hRS7, наблюдалось «излечение» в пределах 28 дней, и опухоли отсутствовали до окончания исследования на 147 день, тогда как у животных, получавших лечение нерелевантным ADC, наблюдался повторный рост опухолей (специфический ADC или нерелевантный ADC-AUC_{98 дней}: Р=0,05). У мышей, получавших смесь hRS7 IgG и SN-38, опухоли прогрессировали больше 4,5-кратно к 56 дню (ОО=1,10±0,88 см³; AUC_{56 дней} Р меньше 0,006 для различия с hRS7-CL2-SN-38) (не показано).

[0236] Эффективность также исследовали на ксенотрансплантатах опухоли ободочной кишки (COLO 205) и поджелудочной железы (Capan-1) человека. У несущих опухоли COLO 205 животных (не показано) hRS7-CL2-SN-38 (0,4 мг/кг, каждые 4 дня × 8) предотвращал рост опухолей на протяжении 28-дневного периода лечения, обеспечивая значимо меньшие размеры опухолей по сравнению с контрольным ADC против CD20 (hA20-CL2-SN-38) или IgG hRS7 (ОО=0,16±0,09 см³, 1,19±0,59 см³, и 1,77±0,93 см³, соответственно; AUC_{28 дней} Р меньше 0,016).

[0237] МПД иринотекана (24 мг/кг SN-38, каждые 2 дня × 5) была настолько же эффективной, как и hRS7-CL2-SN-38 в клетках COLO 205, поскольку сыворотка мыши обладает способностью к более эффективной конверсии иринотекана в SN-38 (Morton et al., 2000, Cancer Res 60:4206-10) по сравнению с сывороткой человека, однако доза SN-38 в иринотекане (кумулятивная доза 2,400 мкг) была в 37,5 раз выше, чем в конъюгате (в общей сложности 64 мкг).

[0238] У животных, несущих Сарап-1 (не показано), не наблюдалось значимого ответа на иринотекан по отдельности при введении дозы, эквивалентной SN-38 в конъюгате hRS7-CL2-SN-38 (например, на 35 день средний размер опухоли составлял 0,04±0,05 см³ у животных, получавших 0,4 мг/кг SN-38 в hRS7-SN-38 против 1,78±0,62 см³ у получавших лечение иринотеканом животных, которым вводили 0,4 мг/кг SN-38; AUC _{день 35} Р меньше 0,001; не показано). При 10-кратном повышении дозы иринотекана до 4 мг/кг SN-38 ответ улучшался, однако все же не был настолько значимым, как при введении конъюгата с уровнем дозы SN-38 0,4 мг/кг (ОО=0,17±0,18 см³ против 1,69±0,47 см³, AUC_{дней 49} Р меньше 0,001) (не показано). Равная доза ненацеливающего hA20-CL2-SN-38 также оказывала значимый противоопухолевый эффект по сравнению с результатами у получавших лечение иринотеканом животных, однако специфический конъюгат hRS7 показывал значимо лучшие результаты, чем нерелевантный ADC (OO=0,17±0,18 см³ против 0,80±0,68 см³, AUC_{день 49} P меньше 0,018) (не показано).

[0239] Исследования с содержащим сацитузумаб говитекан ADC затем были расширены на 2 другие модели эпителиального рака человека. У мышей, несущих опухоли поджелудочной железы человека ВхРС-3 (не показано), сацитузумаб говитекан также значимо ингибировал рост опухолей по сравнению с контрольными мышами, получавшими лечение солевым раствором или эквивалентным количеством ненацеливающего hA20-CL2A-SN-38 (ОО=0,24±0,11 см³ против 1,17±0,45 см³ и 1,05±0,73 см³, соответственно; AUQ_{день 21} Р меньше 0,001); или иринотеканом с введением 10-кратной эквивалентной дозы SN-38 (ОО=0,27±0,18 см³ против 0,90±0,62 см³, соответственно; AUC_day25P меньше 0,004) (не показано). Интересно, что у мышей, несущих плоско клеточные опухоли легкого человека SK-MES-1, получавших лечение 0,4 мг/кг ADC (не показано), ингибирование роста опухолей превосходило результаты для солевого раствора или неконъюгированного IgG hRS7 (ОО=0,36±0,25 см³ против 1,02±0,70 см³ и 1,30±1,08 см³, соответственно; AUC_{28 дней}, Р меньше 0,043), однако ненацеливающий hA20-CL2A-SN-38 или МПД иринотекана обеспечивали такие же противоопухолевые эффекты, что и специфический конъюгат hRS7-SN-38 (не показано). Во всех исследованиях на мышах ADC hRS7-SN-38 хорошо переносился, исходя из результатов оценок уменьшения массы тела (не показано).

[0240] Биораспределение сацитузумаба говитекана - биораспределение сацитузумаба говитекана или неконъюгированного IgG hRS7 сравнивали у мышей, несущих ксенотрансплантаты плоскоклеточной карциномы легких человека SK-MES-1 (не показано), с применением соответствующих ¹¹¹In-меченых субстратов. Для сравнительного исследования выведения сацитузумаба говитекана и неконъюгированного hRS7 проводили фармакокинетический анализ (не показано). ADC выводился быстрее эквивалентного количества неконъюгированного hRS7, при этом ADC демонстрировал сокращение времени полужизни и среднего времени удержания приблизительно на 40%. Тем не менее, это оказывало минимальное влияние на поглощение опухолью (не показано). Несмотря на наличие значимых различий в точках времени через 24 часа и 48 часов, к 72 часам (пиковое поглощение) количества обоих агентов в опухоли были аналогичными. В нормальных тканях наиболее выраженными были различия для тканей печени и селезенки (не показано). Через 24 часа после инъекций количество сацитузумаба говитекана в печени более чем в 2 раза превышало количество IgG hRS7 (не показано). И напротив, в селезенке количество исходного IgG hRS7 при пиковом поглощении (точка времени через 48 часов) в 3 раза превышало количество сацитузумаба говитекана (не показано). Поглощение и выведение в остальных тканях, как правило, отражали различия концентрации в крови (не показано).

[0241] Поскольку терапия предусматривала введение доз два раза в неделю, исследовали поглощение опухолью в группе животных, сначала получивших предварительную дозу 0,2 мг/кг (250 мкг белка) ADC с hRS7 за 3 дня до инъекции ¹¹¹In-меченого антитела. Поглощение опухолью ¹¹¹In-сацитузумаба говитекана у получавших предварительную дозу мышей было по существу снижено в каждой точке времени по сравнению с животными, не получавшими предварительной дозы (например, через 72 часа поглощение опухолью в группе предварительного дозирования составляло 12,5%±3,8% ИД/г против 25,4%±8,1% ИД/г у животных, не получавших предварительную дозу; Р=0,0123; не показано http://clincancerres.aaciioumals.org/contenty/I 7/10/3157.long - F4). Предварительное дозирование не оказывало поддающегося оценке влияния на выведение из крови или поглощение тканями (не показано). Указанные исследования предполагают, что в некоторых моделях опухолей, накопление в опухоли специфического антитела может снижаться за счет предшествующих(ей) доз(ы), что, вероятно, объясняет, почему специфичность терапевтического ответа может уменьшаться при увеличении доз ADC и почему дальнейшая эскалация дозы не показана.

[0242] Переносимость сацитузумаба говитекана у мышей Swiss-Webster и яванских макаков

Мыши Swiss-Webster переносили введение 2 доз на протяжении 3 дней, каждая из которых содержала по 4, 8, и 12 мг SN-38/кг сацитузумаба говитекана, с минимальным временным уменьшением массы тела (не показано). Гематопоэтическая токсичность отсутствовала и биохимический анализ сыворотки показал только повышенный уровень аспартаттрансаминазы (ACT, не показано) и аланинтрансаминазы (АЛТ, не показано). Через семь дней после лечения уровень ACT поднимался выше нормальных уровней (больше 298 Ед/л) во всех 3 группах лечения (не показано), при этом максимальная доля мышей относилась к получавшей 2×8 мг/кг группе. Однако к 15 дню после лечения значения у большинства животных были в пределах нормального диапазона. Уровни АЛТ также были выше значений нормального диапазона (больше 77 Ед/л) в течение 7 дней лечения (не показано) и демонстрировали признаки нормализации к 15 дню. В печени у всех указанных мышей не наблюдалось гистологических признаков повреждения тканей (не показано). Что касается функции почек, в группах лечения были несколько повышены только уровни глюкозы и хлорида. В получавшей 2×8 мг/кг группе у 5 из 7 мышей были незначительно повышены уровни глюкозы (диапазон 273-320 мг/дл, верхняя граница нормы - 263 мг/дл), возвращавшиеся к нормальным к 15 дню после инъекций. Аналогичным образом, уровни хлорида были незначительно повышены, в диапазоне от 116 до 127 ммоль/л (верхняя граница нормального диапазона - 115 ммоль/л) в 2 получавших максимальные дозировки группах (у 57% мышей в группе 2×8 мг/кг и у 100% мышей в группе 2×12 мг/кг), и оставались повышенными до 15 дней после инъекций. Это также может указывать на токсичность для ЖКТ, поскольку большая часть хлорида образуется в результате абсорбции кишечником; однако к моменту прекращения исследования гистологические признаки повреждения тканей в какой-либо исследованной системе органов отсутствовали (не показано).

[0243] Поскольку Trop-2, целевой антиген hRS7, не экспрессируется в нормальных тканях у мышей, требовалась более подходящая модель для определения потенциала конъюгата hRS7 для клинического применения. При иммуногистологических исследованиях было обнаружено связывание в нескольких тканях как у человека, так и у яванских макаков (молочная железа, глаза, желудочно-кишечный тракт, почки, легкие, яичники, фаллопиевы трубы, поджелудочная железа, паращитовидная железа, предстательная железа, слюнная железа, кожа, вилочковая железа, щитовидная железа, миндалины, мочеточник, мочевой пузырь и матка; не показано). На основании указанной перекрестной реактивности проводили исследование переносимости на обезьянах.

[0244] В группе, получавшей 2×0,96 мг /кг SN-38 в виде сацитузумаба говитекана не наблюдалось значимых клинических явлений после инфузии и до прекращения исследования. Уменьшение массы тела не превышало 7,3%, значения возвращались к акклиматизационным к 15 дню. Было отмечено временное снижение показателей для большинства форменных элементов крови (не показано), однако значения не опускались ниже границ нормальных диапазонов. Не было обнаружено аномальных значений при биохимическом анализе сыворотки. При гистопатологическом исследовании животных после некропсии на 11 день (через 8 дней после последней инъекции) наблюдались микроскопические изменения в гематопоэтических органах (вилочковая железа, нижнечелюстной и брыжеечный лимфатические узлы, селезенка и костный мозг), органах желудочно-кишечного тракта (желудок, двенадцатиперстная кишка, тощая кишка, подвздошная кишка, слепая кишка, ободочная кишка и прямая кишка), женских репродуктивных органах (яичник, матка и влагалище), и в месте инъекции. Указанные изменения варьировали от минимальных до умеренных, и демонстрировали полную обратимость в конце периода восстановления (32 день) во всех тканях, за исключением вилочковой железы и желудочно-кишечного тракта, для которых в указанной поздней точке времени наблюдался тренд к полному восстановлению (не показано).

[0245] При уровне дозы конъюгата 2х1,92 мг /кг SN-38 наблюдалась 1 смерть, обусловленная осложнениями со стороны ЖКТ и подавлением функции костного мозга, а у других животных в указанной группе наблюдались аналогичные, однако более серьезные нежелательные явления по сравнению с получавшей 2×0,96 мг/кг группой (не показано). Эти данные показывают, что показатели дозолимитирующей токсичности были идентичны показателям для иринотекана, а именно, кишечные и гематологические показатели. Соответственно, МПД для сацитузумаба говитекана находится в диапазоне от 2×0,96 до 1,92 мг/кг SN-38, что соответствует эквивалентной дозе для человека 2×0,3 - 0,6 мг/кг SN-38.

Обсуждение

[0246] Trop-2 представляет собой белок, экспрессируемый на многих эпителиальных опухолях, в том числе при раке легкого, молочной железы, ободочной и прямой кишки, поджелудочной железы, предстательной железы и яичников, что делает его потенциально важной мишенью для доставки цитотоксических агентов (Ohmachi et al., 2006, Clin Cancer Res 12:3057-63; Fong et al., 2008, Br J Cancer 99:1290-95; Cubas et al., 2009, Biochim Biophys Acta 1796:309-14). Антитело RS7 интернализуется при связывании с Trop-2 (Shih et al., 1995, Cancer Res 55:5857s-63s), что позволяет осуществлять прямую внутриклеточную доставку цитотоксических средств.

[0247] SN-38 представляет собой мощный ингибитор топоизомеразы-I, со значениями IC₅₀ в наномолярном диапазоне для несколько линий клеток. Он представляет собой активную форму пролекарства, иринотекана, которое применяют для лечения рака ободочной и прямой кишки, также активного в отношении рака легкого, молочной железы и головного мозга. Авторы настоящего изобретения рассудили, что непосредственно нацеленный SN-38 в форме ADC будет представлять собой значимо улучшенное по сравнению с СРТ-11 терапевтическое средство, за счет преодоления характерной для СРТ-11 проблемы низкой и варьирующей от пациента к пациенту биоконверсии в активный SN-38 (Mathijssen et al., 2001, Clin Cancer Res 7:2182-94).

[0248] Пептид Phe-Lys, встроенный в производное оригинального CL2, обеспечивал возможность расщепления катепсином В. Для упрощения процесса синтеза фенилаланин в CL2A был элиминирован, и, соответственно, был удален сайт расщепления катепсином В. Интересно, что указанный продукт обладал более отчетливым хроматографическим профилем по сравнению с широким профилем, полученным для CL2 (не показано), однако, что более важно, указанное изменение не влияло на связывание или стабильность конъюгата, а также, неожиданным образом, обеспечивало незначительное увеличение мощности при параллельном тестировании.

[0249] Цитотоксичность ADC с hRS7 in vitro против диапазона линий клеток солидных опухолей отличалась стабильными значениями IC₅₀ в наномолярном диапазоне (нмоль/л). Однако при воздействии на клетки свободным SN-38 значение IC₅₀ было ниже, чем для ADC. Указанное расхождение между свободным и конъюгированным SN-38 было также зарегистрировано для ENZ-2208 (Sapra et al., 2008, Clin Cancer Res 14:1888-96, Zhao et al., 2008, Bioconjug Chem 19:849-59) и NK012 (Koizumi et al., 2006, Cancer Res 66:10048-56). В ENZ-2208 используется разветвленный ПЭГ, с присоединением к каждой молекуле ПЭГ приблизительно 3,5-4 молекул SN-38, тогда как NK012 представляет собой мицеллярную наночастицу, содержащую 20% SN-38 по массе. При применении предложенного авторами настоящего изобретения ADC указанное расхождение (т.е. отношение мощности свободного и конъюгированного SN-38) уменьшалось по мере увеличения уровней экспрессии Trop-2 в опухолевых клетках, что указывает на преимущество для нацеленной доставки лекарственного средства. Что касается стабильности в сыворотке in vitro, и CL2-, и CL2A-SN-38 формы hRS7-SN-38 демонстрировали время полужизни ~20 часов, что отличается от непродолжительного времени полужизни , равного 12,3 минутам, зарегистрированного для ENZ-2208 (Zhao et al., 2008, Bioconjug Chem 19:849-59), однако аналогично 57% высвобождению SN-38 из NK012 в физиологических условиях через 24 часа (Koizumi et al., 2006, Cancer Res 66:10048-56). Лечение несущих опухоль мышей hRS7-SN-38 (либо CL2-SN-38, либо CL2A-SN-38) значимо ингибировало рост опухолей в 5 разных моделях опухолей. У 4 из них наблюдался регресс опухолей, а при применении Calu-3 у всех получавших максимальную дозу hRS7-SN-38 мышей наблюдалось отсутствие опухолей по завершении исследования. В отличие от человека, эстераза плазмы мышей обеспечивает очень эффективную конверсию иринотекана в SN-38 с показателем конверсии, превышающим 50%, обеспечивая более высокую эффективность у мышей по сравнению с человеком (Morton et al., 2000, Cancer Res 60:4206-10; Furman et al., 1999, J Clin Oncol 17:1815-24). Введение hRS7-SN-38 обеспечивало значимо лучший контроль роста опухолей по сравнению с введением иринотекана в 10-кратно превышающих или эквивалентных уровням SN-38 дозах. Только при введении МПД иринотекана, 24 мг/кг, каждые 2 дня × 5 (в 37,5 раз больше SN-38) его эффективность достигала эффективности hRS7-SN-38. Согласно ожиданиям авторов настоящего изобретения, у пациентов указанное преимущество сацитузумаба говитекана должно было быть еще более выраженным из-за существенно более низкого показателя биоконверсии.

[0250] Авторы настоящего изобретения также показали на некоторых экспрессирующих антиген линиях клеток, таких как SK-MES-1, что применение антигенсвязывающего ADC не гарантирует достижения лучших терапевтических ответов по сравнению с несвязывающим нерелевантным конъюгатом. Указанный результат не является необычным или неожиданным. Так, несвязывающие конъюгаты SN-38, упомянутые ранее, усиливают терапевтическую активность по сравнению с иринотеканом, таким образом, нерелевантный конъюгат IgG-SN-38 предположительно будет обладать некоторой активностью. Это связано с тем фактом, что опухоли содержат незрелые, отличающиеся повышенной проницаемостью сосуды, что позволяет макромолекулам проникать в них легче, чем в нормальные ткани (Jain, 1994, Sci Am 271:58-61). При применении предложенного авторами настоящего изобретения конъюгата 50% SN-38 высвобождается за ~13 часов, если значения рН опускаются до уровня, напоминающего лизосомные уровни (например, рН 5,3 при 37°С; данные не показаны), тогда как при нейтральных значениях рН сыворотки скорость высвобождения снижается почти в 2 раза. Ожидается, что при попадании нерелевантного конъюгата в кислотное микроокружение опухоли он будет локально высвобождать некоторое количество SN-38. Другие факторы, такие как физиология опухоли и внутренне присущая опухоли чувствительность к лекарственному средству, также играют роль в определении указанной «базовой» активности. Однако специфический конъюгат с более продолжительным временем удержания должен обладать повышенной мощностью относительно указанного базового ответа, при условии наличия достаточного количества антигена для захвата специфического антитела. Исследования биораспределения в модели SK-MES-1 также показали, что при насыщении опухолевого антигена вследствие успешного дозирования поглощение опухолью специфического конъюгата снижалось, что давало терапевтические результаты, аналогичные наблюдаемым для нерелевантного конъюгата.

[0251] Несмотря на сложность проведения прямых сравнений предложенного авторами настоящего изобретения ADC и других описанных в опубликованных отчетах агентов для доставки SN-38, могут быть представлены некоторые общие наблюдения. В проведенных авторами настоящего изобретения терапевтических исследованиях максимальная индивидуальная доза составляла 0,4 мг/кг SN-38. В модели Calu-3 было введено только 4 инъекции с общей кумулятивной дозой 1,6 мг/кг SN-38, или 32 мкг SN-38 на мышь с массой тела 20 г. Было проведено несколько исследований с ENZ-2208, с применением МПД, составляющей 10 мг/кг × 5 (Sapra et al., 2008, Clin Cancer Res 14:1888-96; Pastorini et al., 2010, Clin Cancer Res 16:4809-21); доклинические исследования с NK012 включали применение МПД NK012, составляющей 30 мг/кг × 3 (Koizumi et al., 2006, Cancer Res 66:10048-56). Таким образом, при введении hRS7-SN-38 значимые противоопухолевые эффекты были получены для 30-кратно и 55-кратно меньшего количества эквивалентов SN-38 по сравнению с зарегистрированными дозами ENZ-2208 и NK012, соответственно. Значимые противоопухолевые эффекты наблюдались даже при применении 10-кратно меньших количеств ADC с hRS7 (0,04 мг/кг), тогда как меньшие дозы ENZ-2208 не были представлены, а при 4-кратном понижении дозы NK012 до 7,5 мг/кг эффективность отсутствовала (Koizumi et al., 2006, Cancer Res 66:10048-56). У здоровых мышей не наблюдалось острой токсичности при 1-недельной кумулятивной дозе 24 мг/кг SN-38 (1,500 мг/кг конъюгата), что указывает на более высокую МПД. Соответственно, лечение несущих опухоль животных было эффективным при применении 7,5-15-кратно меньшего количества эквивалентов SN-38.

[0252] При исследованиях биораспределения было обнаружено, что поглощение опухолью сацитузумаба говитекана было аналогичным поглощению исходного IgG hRS7, однако выведение происходило по существу быстрее, при 2-кратно более высоком поглощении печенью, что может быть обусловлено гидрофобностью SN-38. Поскольку ADC выводится через печень, ожидается, что токсичность в отношении печени и ЖКТ будет дозолимитирующей. Хотя у мышей наблюдались признаки повышенных уровней трансаминаз печени, наблюдалась только легкая токсичность в отношении ЖКТ, при исключительно временном снижении массы тела и отсутствии аномалий, заметных при гистопатологическом исследовании. Интересно, что не было отмечено гематологической токсичности. Однако у обезьян наблюдался профиль токсичности, идентичный ожидаемому для иринотекана, с дозолимитирующими ЖКТ- и гематологической токсичностью.

[0253] Поскольку Trop-2, распознаваемый hRS7, не экспрессируется у мышей, важно было провести исследования токсичности на обезьянах, отличающихся аналогичной человеку тканевой экспрессией Trop-2. Обезьяны переносили, с возникновением легкой и обратимой токсичности, введение 0,96 мг/кг/дозу (~12 мг/м²), что можно экстраполировать на количество ~0,3 мг/кг/дозу для человека (~11 мг/м²). В клиническом испытании NK012 I фазы пациенты с солидными опухолями переносили введение 28 мг/м² SN-38 каждые 3 недели с возникновением дозолимитирующей токсичности в виде нейтропении 4 класса (ДЛТ; Hamaguchi et al., 2010, Clin Cancer Res 16:5058-66). Аналогичным образом, при клинических испытаниях I фазы с ENZ-2208 выявлена дозолимитирующая фебрильная нейтропения и рекомендовано введение 10 мг/м² каждые 3 недели, или 16 мг/м² при введении пациентам Г-КСФ (Kurzrock et al., AACR-NCI-EORTC International Conference on Molecular Targets and Cancer Therapeutics; 2009 Nov 15-19; Boston, MA; Poster No C216; Patnaik et al., AACR-NCI-EORTC International Conference on Molecular Targets and Cancer Therapeutics; 2009 Nov 15-19; Boston, MA; Poster No C221). Так как обезьяны переносили кумулятивную дозу, эквивалентную дозе 22 мг/м² для человека, предположительно, даже несмотря на то, что hRS7 связывается с некоторыми нормальными тканями, МПД для однократного введения ADC с hRS7 может быть аналогичной МПД других ненацеливающих SN-38-агентов. Действительно, специфичность антитела против Trop-2, по-видимому, не играла роли в определении ДЛТ, поскольку профиль токсичности был аналогичен профилю иринотекана. Что более важно, в том случае, если у человека может быть достигнута противоопухолевая активность при тех же условиях, что и у мышей, которые отвечали на дозу, эквивалентную дозе для человека, составляющей всего 0,03 мг/кг/дозу эквивалентов SN-38, возможна клиническая реализация с достижением значимых противоопухолевых ответов.

[0254] Подводя итоги, следует отметить, что токсикологические исследования на обезьянах, в комбинации с исследованиями в моделях ксенотрансплантатов рака человека у мышей in vivo, показали, что указанный нацеленный на Trop-2 ADC представляет собой эффективное терапевтическое средство для лечения ряда опухолей различного эпителиального происхождения.

Пример 5. Анализ связывания клеток с антителами против Trop-2

[0255] Для конъюгации с ADC получали два разных моноклональных антитела мыши против Trop-2 человека. Первое антитело, 162-46.2, очищали из гибридомы (АТСС, НВ-187), культивированной в роллерных флаконах. Второе антитело, МАВ650, приобретали у R&D Systems (Миннеаполис, Миннесота). Для сравнения связывания в качестве мишени использовали Trop-2-положительные клетки карциномы желудка человека NCI-N87. Клетки (1,5×10⁵/лунку) высевали в 96-луночные планшеты накануне анализа связывания. На следующее утро строили кривую зависимости ответа от дозы для 162-46.2, МАВ650, и RS7 мыши (0,03-66 нМ). Указанные первичные антитела инкубировали с клетками в течение 1,5 ч при 4°С. Лунки промывали и в течение 1 часа при 4°С добавляли во все лунки вторичное конъюгированное с пероксидазой хрена (HRP) антитело против антител мыши. Лунки повторно промывали, после чего добавляли люминесцентный субстрат. Планшеты считывали с применением планшет-ридера Envision и регистрировали значения, выраженные в относительных единицах люминесценции.

[0256] Все три антитела имели аналогичные значения K_D, 0,57 нМ для RS7, 0,52 нМ для 162-46.2 и 0,49 нМ для МАВ650. Однако при сравнении значений максимального связывания (B_max) 162-46.2 и МАВ650 с RS7 они были ниже на 25% и 50%, соответственно (B_Max=11,250 для RS7, 8,471 для 162-46.2; и 6,018 для МАВ650), что указывает на отличающиеся от RS7 связывающие свойства.

Пример 6. Цитотоксичность ADC против Trop-2 (MAB650-SN-38)

[0257] Получали новый ADC против Trop-2 с SN-38 и МАВ650, со средним коэффициентом замещения, составляющим 6,89 молекул лекарственного средства на антитело. Анализы цитотоксичности для сравнения ADC MAB650-SN-38 и ADC сацитузумаба говитекана проводили с использованием двух разных линий клеток аденокарциномы поджелудочной железы человека (ВхРС-3 и Capan-1) и линии клеток карциномы молочной железы человека с тройным негативным фенотипом (MDA-MB-468) в качестве мишеней.

[0258] За день до добавления указанных ADC клетки собирали из тканевой культуры и высевали в 96-луночные планшеты. На следующий день на клетки воздействовали сацитузумабом говитеканом, MAB650-SN-38 и свободным SN-38 в диапазоне концентраций лекарственного средства от 3,84×10^-12 до 2,5×10^-7 М. Неконъюгированное МАВ650 использовали в качестве контроля в дозе, соответствующей белковому эквиваленту MAB650-SN-38. Планшеты инкубировали при 37°С в течение 96 ч. По истечении указанного периода инкубации во все планшеты добавляли субстрат MTS и считывали, регистрируя развитие цвета с получасовыми интервалами до достижения OD_492нм приблизительно 1,0 для необработанных контрольных клеток. Ингибирование роста измеряли как процент роста относительно необработанных клеток, используя программное обеспечение Microsoft Excel и Prism (нелинейная регрессия с получением сигмоидальных кривых зависимости ответа от дозы для определения значений IC₅₀).

[0259] Сацитузумаб говитекан и MAB650-SN-38 оказывали аналогичные ингибирующие рост эффекты со значениями IC₅₀ в нижней области наномолярного диапазона, что типично для SN-38-ADC в указанных линиях клеток (не показано). В линии клеток аденокарциномы поджелудочной железы человека Capan-1 (не показано) IC₅₀ ADC сацитузумаба говитекана составляла 3,5 нМ, тогда как IC₅₀ ADC MAB650-SN-38 составляла 4,1 нМ, а IC₅₀ свободного SN-38 составляла 1,0 нМ. В линии клеток аденокарциномы поджелудочной железы человека ВхРС-3 (не показано) IC₅₀ ADC сацитузумаба говитекана составляла 2,6 нМ, тогда как IC₅₀ ADC MAB650-SN-38 составляла 3,0 нМ, a IC₅₀ свободного SN-38 составляла 1,0 нМ. В линии клеток аденокарцинома желудка человека NCI-N87 (не показано) IC₅₀ ADC сацитузумаба говитекана составляла 3,6 нМ, тогда как IC₅₀ ADC MAB650-SN-38 составляла 4,1 нМ, а IC₅₀ свободного SN-38 составляла 4,3 нМ.

[0260] Обобщая вышесказанное, в указанных анализах in vitro конъюгаты SN-38 с двумя антителами против Trop-2, hRS7 и МАВ650, демонстрируют одинаковую эффективность против нескольких линий опухолевых клеток, аналогичную эффективности свободного SN-38. Учитывая, что нацеливающая функция антител против Trop-2 должна представлять собой in vivo значительно более важный фактор, чем in vitro, указанные данные подтверждают, что ADC против Trop-2 с SN-38 должны представлять собой высокоэффективный при применении in vivo класс ADC, что продемонстрировано в приведенных выше примерах для сацитузумаба говитекана.

Пример 7. Цитотоксичность ADC против Trop-2 (162-46.2-SN-38)

[0261] Получали новый ADC против Trop-2 с SN-38 и 162-46.2, с коэффициентом замещения, составляющим 6,14 молекулы лекарственного средства на антитело. Анализы цитотоксичности для сравнения ADC 162-46.2-SN-38 и ADC hRS7-SN-38 проводили с использованием двух разных Trop-2-положительных линий клеток в качестве мишеней, аденокарциномы поджелудочной железы человека ВхРС-3 и карциномы молочной железы человека с тройным негативным фенотипом MDA-MB-468.

[0262] За день до добавления ADC клетки собирали из тканевой культуры и высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 2000 клеток на лунку. На следующий день на клетки воздействовали сацитузумабом говитеканом, 162-46.2-SN-38 или свободным SN-38 в диапазоне концентраций лекарственного средства от 3,84×10^-12 до 2,5×10^-7 М. Неконъюгированные 162-46.2 и hRS7 использовали в качестве контроля в дозах, соответствующих белковым эквивалентам 162-46.2-SN-38 и сацитузумаба говитекана, соответственно. Планшеты инкубировали при 37°С в течение 96 ч. По истечении указанного периода инкубации во все планшеты добавляли субстрат MTS и считывали, регистрируя развитие цвета с получасовыми интервалами до достижения OD_492нм приблизительно 1,0 для необработанных контрольных лунок. Ингибирование роста измеряли как процент роста относительно необработанных клеток используя программное обеспечение Microsoft Excel и Prism (нелинейная регрессия с получением сигмоидальных кривых зависимости ответа от дозы для определения значений IC₅₀).

[0263] Значения IC₅₀ ADC 162-46.2-SN-38 были аналогичны значениям IC₅₀ сацитузумаба говитекана (не показано). При тестировании на линии клеток аденокарциномы поджелудочной железы человека ВхРС-3 (не показано) IC₅₀ сацитузумаба говитекана составляла 5,8 нМ, тогда как IC₅₀ 162-46.2-SN-38 составляла 10,6 нМ, а IC₅₀ свободного SN-38 составляла 1,6 нМ. При тестировании на линии клеток аденокарциномы молочной железы человека MDA-MB-468 (не показано) IC₅₀ сацитузумаба говитекана составляла сацитузумаб говитекан 3,9 нМ, тогда как IC₅₀ 162-46.2-SN-38 составляла 6,1 нМ, а IC₅₀ свободного SN-38 составляла 0,8 нМ. При отдельном применении свободные антитела в отношении всех линий клеток Trop-2-положительного рака демонстрировали незначительную цитотоксичность.

[0264] Обобщая вышесказанное, при сравнении эффективности in vitro трех разных антител против Trop-2, конъюгированных с одним и тем же цитотоксическим лекарственным средством, все три ADC демонстрировали эквивалентные цитотоксические эффекты, направленные против различных линий клеток Trop-2-положительного рака. Указанные данные подтверждают, что класс антител против Trop-2, включенных в ADC-конъюгаты с лекарственным средством, представляет собой эффективные противораковые терапевтические агенты для лечения экспрессирующих Trop-2 солидных опухолей.

Пример 8. Клинические испытания ADC с IMMU-132 (сацитузумаб говитекан), содержащего антитело против Trop-2 hRS7, конъюгированное с SN-38

Краткое описание

[0265] В настоящем примере представлены результаты клинического испытания фазы I и продолжающегося расширенного испытания фазы II IMMU-132, ADC с интернализующимся гуманизированным антителом hRS7 против Trop-2, конъюгированным рН-чувствительным линкером с SN-38 (среднее отношение количества лекарственного средства к количеству антитела = 7,6). Trop-2 представляет собой трансмембранный белок I типа, переносчик кальциевого сигнала, экспрессируемый с высокой плотностью (~1×10⁵), частотой и специфичностью многими карциномами человека, при ограниченной экспрессии в нормальных тканях. Доклинические исследования на мышах Nude, несущих ксенотрансплантаты опухоли Capan-1 поджелудочной железы человека, показали, что IMMU-132 способен доставлять в опухоль до 120 раз больше SN-38, чем при максимальной переносимой терапии иринотеканом.

[0266] В настоящем примере описано начальное испытание фазы I с 25 пациентами, несколько раз прошедшими неудачную предшествующую терапию (иногда включавшую ингибирующие топоизомеразу-I/II лекарственные средства), и продолжающееся расширенное испытание фазы II, в настоящее время с регистрацией результатов для 69 пациентов, в том числе с раком ободочной и прямой кишки (РОПК), мелкоклеточным и немелкоклеточным раком легких (МРЛ, НМРЛ, соответственно), раком молочной железы с тройным негативным фенотипом (ТНРМЖ), раком поджелудочной железы (РПЖ), пищевода и другими видами рака.

[0267] Согласно подробному обсуждению ниже, Trop-2 не был детектирован в сыворотке, однако выражение экспрессировался (больше или равно 2⁺ при иммуногистохимическом окрашивании) в большинстве архивированных опухолей. В испытании с дизайном 3+3 IMMU-132 вводили на 1 и 8 дни в течение многократных 21-дневных циклов, начиная с дозы 8 мг/кг, затем следовали дозы 12 и 18 мг/кг до возникновения дозолимитирующей нейтропении. Для оптимизации кумулятивного лечения с минимальными задержками в фазе II фокус был сделан на дозировках 8 и 10 мг/кг (n = 30 и 14, соответственно). Из 49 пациентов с зарегистрированными связанными НЯ в указанный момент времени нейтропения больше или равно 3 класса возникала у 28% (4 класса у 4%). В основном общая негематологическая токсичность у указанных пациентов изначально была представлена утомляемостью (55%; больше или равно G3=9%), тошнотой (53%; больше или равно G3=0%), диареей (47%; больше или равно G3=9%), алопецией (40%) и рвотой (32%; больше или равно G3=2%); также часто алопеция возникала. Гомозиготный UGT1A1 *28/*28 был обнаружен у 6 пациентов, у 2 из которых наблюдалась более тяжелая гематологическая токсичность и токсичность для ЖКТ.

[0268] В фазе I и фазе расширения в настоящий момент принимают участие 48 пациентов (за исключением РПЖ), поддающихся оценке по шкале RECIST/c помощью КТ на наилучший ответ. У семи (15%) из пациентов наблюдался частичный ответ (ЧО), в том числе у пациентов с РОПК (N равно 1), ТНРМЖ (N равно 2), МРЛ (N равно 2), НМРЛ (N равно 1) и раком пищевода (N равно 1), а у других 27 пациентов (56%) наблюдалось стабильное заболевание (СЗ); таким образом, в общей сложности у 38 пациентов (79%) наблюдался ответ со стороны заболевания; у 8 из 13 поддающихся оценке с помощью КТ пациентов с РПЖ (62%) наблюдалось СЗ, с медианой времени до прогрессирования (ВДП) 12,7 недель по сравнению с 8,0 недель для последней предшествующей терапии. ВДП для остальных 48 пациентов составляет 12,6+ недель (диапазон 6,0-51,4 недель). Уровни КЭА и СА19-9 в плазме коррелировали с ответами у пациентов с повышенными титрами указанных антигенов в крови. Несмотря на дозирование на протяжении месяцев, антитела против hRS7 или против SN-38 детектированы не были.

[0269] Конъюгат выводился из сыворотки в пределах периода 3 дней, что согласуется с исследованиями на животных in vivo, в ходе которых ежедневно высвобождалось 50% SN-38, причем больше 95% SN-38 в сыворотке было связано с IgG в неглюкоронидированной форме, при концентрациях, превышающих концентрации SN-38, зарегистрированные у пациентов, получавших иринотекан, до 100 раз. Указанные результаты показывают, что сацитузумаб говитекан терапевтически активен при метастатическом солидном раке, при этом диарея и нейтропения поддаются управлению.

Фармакокинетика

[0270] Два способа ИФА ELISA применяли для измерения выведения IgG (захват антителом против идиотипа hRS7) и интактного конъюгата (захват IgG против SN-38 /зондом с антителом против идиотипа hRS7). SN-38 измеряли с применением ВЭЖХ. Общая доля IMMU-132 (интактный конъюгат) выводился быстрее IgG (не показано), отражая известные данные о постепенном высвобождении SN-38 из конъюгата. Определение SN-38 с помощью ВЭЖХ (несвязанного и общего) показало, что больше 95% SN-38 в сыворотке было связано с указанным IgG. Низкие концентрации SN-38G предполагают, что SN-38, связанный с IgG, защищен от глюкуронидации. Сравнение результатов ИФА ELISA для конъюгата и ВЭЖХ для SN-38 показало, что они перекрываются, предполагая, что ИФА ELISA может использоваться в качестве суррогатного анализа для мониторинга выведения SN-38.

[0271] Обобщенная информация о режиме дозирования и пулах пациентов приведена в таблице 3.

Статус клинического испытания

[0272] Было зарегистрировано всего 69 пациентов (в том числе 25 пациентов в фазе I) с разнообразными видами метастатического рака, в среднем 3 раза проходивших предшествующую терапию (медианное значение). У восьми пациентов наблюдалось клиническое прогрессирование, и они были отстранены до оценки с помощью КТ. Индивидуально зарегистрировано 13 поддающихся оценке с помощью КТ пациентов с раком поджелудочной железы. Медианное ВДП (время до прогрессирования) у пациентов с РПЖ составляло 11,9 недель (диапазон от 2 до 21,4 недель) по сравнению с медианным ВДП 8 недель для последней предшествующей терапии.

[0273] Всего 48 пациентов с разнообразными видами рака проходили по меньшей мере 1 оценку с помощью КТ, на основании которой определяли наилучший ответ (не показано) и время до прогрессирования (ВДП; не показано). Обобщенные данные о наилучших ответах у 8 поддающихся оценке пациентов с ТНРМЖ (раком молочной железы с тройным негативным фенотипом): 2 ЧО (частичный ответ), 4 СЗ (стабильное заболевание) и 2 ПЗ (прогрессирующее заболевание), с общим ответом [ЧО + СЗ]=6/8 (75%). В случае МРЛ (мелкоклеточный рак легкого) у 4 поддающихся оценке пациентов наблюдались 2 ЧО, 0 СЗ и 2 ПЗ, с общим ответом 2/4 (50%). В случае РОПК (рак ободочной и прямой кишки) у 18 поддающихся оценке пациентов наблюдались 1 ЧО, 11 СЗ и 6 ПЗ, с общим ответом 12/18 (67%). В случае рака пищевода у 4 поддающихся оценке пациентов наблюдались 1 ЧО, 2 СЗ и 1 ПЗ, с общим ответом 3/4 (75%). В случае НМРЛ (немелкоклеточный рак легкого) у 5 поддающихся оценке пациентов наблюдались 1 ЧО, 3 СЗ и 1 ПЗ, с общим ответом 4/5 (80%). Из всех получавших лечение пациентов у 48 поддающихся оценке пациентов наблюдались 7 ЧО, 27 СЗ и 14 ПЗ, с общим ответом 34/48 (71%). Эти результаты показывают, что ADC против TROP-2 (hRS7-SN-38) демонстрировал значимую клиническую эффективность против широкого диапазона солидных опухолей у пациентов-людей.

[0274] Зарегистрированные побочные эффекты терапии (нежелательные явления) обобщены в таблице 4. Как очевидно из данных, приведенных в таблице 4, терапевтическая эффективность сацитузумаба говитекана достигалась при дозировках ADC, демонстрирующих приемлемо низкий уровень нежелательных побочных эффектов.

[0275] Представленное в таблице 4 исследование было продолжено, с включением к настоящему времени 261 пациентов. Результаты (не показано), как правило, соответствуют описанию в таблице 4, и только для нейтропении частота встречаемости нежелательных явлений 3 класса или выше составляла более 10% от участвующих в тестировании пациентов. Для всех других нежелательных явлений частота встречаемости ответов 3 класса или выше составляла менее 10%. Это отличает предложенные согласно настоящему изобретению ADC от подавляющего большинства ADC; согласно некоторым вариантам реализации заявленные способы и композиции относятся к ADC против Trop-2, демонстрирующим эффективность при разнообразных солидных опухолях, с частотой встречаемости нежелательных явлений 3 класса или выше, составляющей менее 10% пациентов для всех нежелательных явлений, кроме нейтропении. В рамках проспективного исследования (последующего наблюдения) в общей сложности в 421 образцах от 121 пациентов, включающих базовые и по меньшей мере один полученный после проведения лечения образец, не было детектировано ответа в виде антител против hRS7 или против SN-38, несмотря на проведение многократных циклов лечения.

[0276] Примеры частичных ответов на ADC против Trop-2 подтверждали на основании данных КТ (не показано). В примере ЧО при РОПК женщина возрастом 62 года с впервые диагностированным РОПК прошла первичную гемиколэктомию. Через четыре месяца пациентка прошла резекцию печени по поводу метастазов в печень, и в течение 7 месяцев получала лечение согласно режиму FOLFOX, и в течение 1 месяца получала 5FU. У пациентки было выявлено несколько очагов поражения, в основном в печени (иммуногистологическая оценка - 3+ Trop-2), и она была включена в испытание с сацитузумабом говитеканом при стартовой дозе 8 мг/кг приблизительно через 1 год после установления первоначального диагноза. При первом КТ-обследовании установлено достижение ЧО, с 37% уменьшением целевых очагов поражения (не показано). Лечение пациентки было продолжено с достижением максимального уменьшения на 65% через 10 месяцев лечения (не показано) и снижением уровней КЭА с 781 нг/мл до 26,5 нг/мл), до прогрессирования 3 месяца спустя.

[0277] В примере ЧО при НМРЛ у мужчины возрастом 65 лет была диагностирован НМРЛ на стадии IIIB (плоскоклеточный). Начальное лечение карбоплатином/этопозидом (3 месяцев) в сочетании с наружной лучевой терапией (XRT) в дозе 7000 сГр обеспечило ответ продолжительностью 10 месяцев. Затем пациент начал проходить поддерживающую терапию с препаратом Тарцева, которая продолжалась до рассмотрения вопроса о его включении в испытание IMMU-132, помимо проведения поясничной ламинэктомии. Пациент получил первую дозу IMMU-132 через 5 месяцев применения Тарцева, к этому моменту у него присутствовал очаг поражения размером 5,6 см в правом легком с обильным плевральным выпотом. Два месяца спустя, сразу после получения пациентом 6 дозы, при первом КТ было обнаружено уменьшение первичного целевого очага поражения до 3,2 см (не показано).

[0278] В примере ЧО при МРЛ у женщины возрастом 65 лет был диагностирован низкодифференцированный МРЛ. После введения карбоплатина/этопозида (ингибитор топоизомеразы-II), законченного через 2 месяца в отсутствие ответа, с последующим введением топотекана (ингибитор топоизомеразы-I), законченным через 2 месяца, также в отсутствие ответа, пациентка получала местную наружную лучевую терапию (XRT, 3000 сГр), законченную через 1 месяц. Однако в следующем месяце прогрессирование продолжилось. Введение IMMU-132 пациентке начали в следующем месяце (доза 12 мг/кг; снижена до 6,8 мг/кг; экспрессия Trop-2 = 3+), и после двух месяцев введения IMMU-132 происходило 38% уменьшение целевых очагов поражения, в том числе существенное уменьшение основного очаг поражения в легком (не показано). Прогрессирование у пациентки началось через 3 месяца после получения 12 доз.

[0279] Указанные результаты являются значимыми, поскольку демонстрируют, что ADC против Trop-2 был эффективен даже у пациентов, которые прошли неуспешную терапию или у которых наблюдалось прогрессирование после неоднократного предшествующего прохождения терапии. В заключение отметим, что при всех использованных дозировках первичная токсичность была представлена управляемой нейтропенией, только с немногочисленными случаями токсичности 3 класса. Наблюдались признаки активности IMMU-132 (ЧО и стойкая СЗ) у рецидивирующих/рефрактерных пациентов с раком молочной железы с тройным негативным фенотипом, мелкоклеточным раком легкого, немелкоклеточным раком легкого, раком ободочной и прямой кишки; и раком пищевода, в том числе у пациентов с предшествующей историей рецидивов после терапии ингибиторами топоизомеразы-I. Указанные результаты демонстрируют эффективность ADC против Trop-2 в широком диапазоне видов рака, устойчивых к существующим видам терапии.

Пример 9. Сравнительная эффективность разных ADC против Trop-2

[0280] Сравнивали терапевтическую эффективность моноклонального антитела мыши против Trop-2 (162-46.2), конъюгированного с SN-38, и конъюгата антитела с лекарственным средством (ADC) сацитузумабом говитеканом, у мышей, несущих ксенотрансплантаты карциномы желудка человека (NCI-N87). Клетки NCI-N87 размножали в тканевой культуре и собирали с применением трипсина/ЭДТК. Самкам бестимусных мышей Nude инъецировали п/к 200 мкл суспензии клеток NCI-N87, смешанной с матригелем в отношении 1:1, таким образом, чтобы каждая мышь получила 1×10⁷ клеток. После того как опухоли достигали размеров приблизительно 0,25 см³ (через 6 дней), животных разделяли на семь разных групп лечения, по девять мышей в каждой. При применении ADC с SN-38 мыши получали в/в инъекции по 500 мкг один раз в неделю в течение двух недель. Контрольные мыши получали не нацеленный на опухоль ADC hA20-SN-38 в той же дозе/по той же схеме. Последняя группа мышей получала только солевой раствор и служила в качестве не получавшего лечения контроля. Опухоли измеряли и мышей взвешивали два раза в неделю. Мышей умерщвляли ввиду прогрессирования заболевания, если объем опухолей превышал 1,0 см³.

[0281] У получавших лечение SN-38-ADC мышей определяли средний объем опухолей (не показано). По оценке на основании площади под кривой (AUC) как сацитузумаб говитекан, так и 162-46.2-SN-38 значимо ингибировали рост опухоли по сравнению с результатами у контрольных мышей, получавших солевой раствор и hA20-SN-38 (Р меньше 0,001). При лечении сацитузумабом говитеканом стабильное заболевание достигалось у 7 из 9 мышей со средним временем до прогрессирования опухолей (ВДП) 18,4±3,3 дней. Среди мышей, получавших лечение 162-46.2-SN-38, положительный ответ достигался у 6 из 9 мышей, а у 3 остальных достигалось стабильное заболевание. Среднее ВДП составляло 24,2±6,0 дней, что значимо больше, чем у получавших лечение сацитузумабом говитеканом животных (Р=0,0382).

Указанные результаты подтверждают эффективность in vivo различных ADC против Trop-2 для лечения карциномы желудка человека.

Пример 10. Лечение пациентов с распространенным метастатическим раком поджелудочной железы ADC против Trop-2

Краткое описание

[0282] IMMU-132 (сацитузумаб говитекан) представляет собой ADC против Trop-2, содержащий интернализуемое раковыми клетками гуманизированное антитело hRS7 против Trop-2, конъюгированное рН-чувствительным линкером с SN-38, активным метаболитом иринотекана, со средним отношением молекул лекарственного средства к молекулам антитела, равным 7,6. Trop-2 представляет собой переносчик кальциевого сигнала, трансмембранный белок I типа, экспрессируемый с высокой плотностью, частотой и специфичностью при многих видах эпителиального рака, в том числе аденокарциноме протоков поджелудочной железы, при ограниченной экспрессии в нормальных тканях. Все 29 протестированных образцов микромассивов опухолей поджелудочной железы были Trop-2-положительными по результатам иммуногистохимического исследования, а на мембране клеток линии рака поджелудочной железы человека, как было обнаружено, экспрессируется 115-891 тыс. копий Trop-2.

[0283] Авторы настоящего изобретения описали выше результаты исследования IMMU-132 I фазы с дизайном 3+3, в которое были включены пациенты с 13 разными типами опухолей. В I фазе дозолимитирующая токсичность была представлена нейтропенией. Более чем у 80% из 24 поддающихся оценке пациентов в указанном исследовании наблюдалось долгосрочное стабильное заболевание, с частичными ответами (согласно RECIST) у пациентов с раком ободочной и прямой кишки (РОПК), молочной железы с тройным негативным фенотипом (ТНРМЖ), мелкоклеточным и немелкоклеточным раком легкого (МРЛ, НМРЛ), и раком пищевода (АКП). В настоящем примере описаны результаты исследования IMMU-132 I/II фазы в когорте пациентов с метастатическим РПЖ. Пациенты с РПЖ, прошедшие неуспешную предшествующую терапию в среднем 2 раза (медианное значение; диапазон: 1-5 раз), получали IMMU-132 на 1 и 8 дни в ходе многократных 21-дневных циклов.

[0284] В подгруппе пациентов с РПЖ (N равно 15) 14 пациентов получали предварительную терапию в рамках включающих гемцитабин режимов. На основании начальных данных о токсичности у 9 пациентов обнаружена нейтропения [у 3 из 9 больше или равно G3, 33%; 1 случай фебрильной нейтропении класса G4), что приводило к задержкам введения доз или снижению доз. У двух пациентов наблюдалась диарея 3 класса; ни у одного из пациентов не наблюдалась тошнота или рвота 3-4 классов. Алопеция (1-2 классов) возникала у 5 из 9 пациентов. Наилучший ответ поддавался оценке у 13 из 14 пациентов, с 8 случаями стабильного заболевания длительностью 8-21,4 недель (медиана - 12,7 недели; 11,9 недель для всех 14 пациентов). Один пациент, лечение которого продолжается, еще не прошел первое КТ-обследования. У пяти пациентов наблюдалось прогрессирующее заболевание согласно критериям RECIST; 1 пациент был отстранен после введения всего 1 дозы ввиду клинического прогрессирования и не подлежал оценке. Титры СА19-9 в сыворотке снижались у 3 пациентов со стабильным заболеванием с 23 до 72%. Несмотря на многократное введение, ни у одного из пациентов не развивался ответ в виде антител к IMMU-132 или к SN-38. Анализ образцов сыворотки с пиковой и с минимальной концентрацией показал, что IMMU-132 выводился быстрее IgG - ожидаемый результат, с учетом известных данных о локальном высвобождении SN-38 внутри опухолевой клетки. Наблюдаемые уровни концентраций связанного с IgG SN-38 в образцах с пиковой концентрацией от одного пациента, получавшего 12 мг/кг IMMU-132, составляли ~4000 нг/мл, что в 40 раз выше титров SN-38, зарегистрированных у пациентов, получавших терапию иринотеканом.

[0285] Авторы настоящего изобретения заключают, что IMMU-132 активен (долгосрочное стабильное заболевание) у 62% (8/13) пациентов с РПЖ, несколько раз прошедших неуспешную предшествующую терапию, при управляемой нейтропении и незначительной токсичности в отношении ЖКТ. У пациентов с распространенным РПЖ могут проводиться многократные циклы лечения (больше 6) с введением 8-10 мг/кг IMMU-132 на 1 и 8 дни 21-дневного цикла, с определенными корректировками дозы или вспомогательным введением факторов роста при нейтропении в последующих циклах лечения. Указанные результаты согласуются с данными, полученными для пациентов с распространенным РОПК, ТНРМЖ, МРЛ, НМРЛ, АКП, продемонстрировавших частичные ответы и долгосрочное стабильное заболевание при введении IMMU-132. Обобщая вышесказанное, монотерапия IMMU-132 представляет собой новую эффективную схему лечения пациентов с РПЖ, в том числе пациентов с опухолями, ранее продемонстрировавшими устойчивость к другими терапевтическим режимам при РПЖ.

Способы и результаты

[0286] Экспрессия Trop-2 - Экспрессию Trop-2 на поверхности раковых клеток различных линий клеток рака определяли с помощью проточной цитометрии с применением ФЭ-конъюгированных гранул QUANTBRITE®. При подсчете числа детектированных молекул Trop-2 в разных линиях клеток были получены следующие результаты: рак поджелудочной железы ВхРС-3 (891 000); рак желудка NCI-N87 (383 000); рак молочной железы MDA-MB-468 (341 000); плоскоклеточный рак легкого SK-MES-1 (27000); рак поджелудочной железы Capan-1 (115000); рак желудка AGS (78 000) рак ободочной кишки COLO 205 (52 000). Экспрессия Trop-2 также наблюдалась в 29 из 29 (100%) микромассивов ткани аденокарциномы поджелудочной железы (не показано).

[0287] Накопление SN-38- Накопление SN-38 определяли у мышей Nude, несущих Capan-1 ксенотрансплантаты рака поджелудочной железы человека (~0,06-0,27 г). Мышам инъецировали в/в 40 мг/кг иринотекана (773 мкг; в общей сложности 448 мкг эквивалентов SN-38). Указанная доза представляет собой МПД для мышей. Эквивалент дозы для человека = 3,25 мг/кг или ~126 мг/м². Как вариант, мышам инъецировали в/в 1,0 мг IMMU-132 (отношение SN-38:антитело = 7,6; 20 мкг эквивалентов SN-38). Указанная доза значительно ниже МПД для мышей. Эквивалент дозы для человека ~4 мг/кг IMMU-132 (~80 мкг/кг эквивалентов SN-38). В каждом интервале проводили некропсию 3 животных, из группы получавших инъекции иринотекана мышей через 5 мин, 1, 2, 6 и 24 часа, или из группы получавших инъекции IMMU-132 мышей через 1, 6, 24, 48 и 72 ч. Ткани экстрагировали и анализировали с помощью анализа ВЭЖХ с обращенной фазой на SN-38, SN-38G и иринотекан. Экстракты тканей получавших лечение IMMU-132 животных также гидролизовали кислотой для высвобождения SN-38 из конъюгата (т.е. оценки [общего] SN-38). Результаты демонстрируют, что ADC IMMU-132 потенциально способен доставлять в опухоль в 120 раз больше SN-38 по сравнению с иринотеканом даже при введении в 22 раза меньшего количества эквивалентов SN-38 с указанным ADC (не показано).

[0288] Клинический протокол IMMU-132 - Протокол, применявшийся в исследовании фазы I/II соответствовал представленному ниже в таблице 5.

[0289] Пациентам вводили IMMU-132 в соответствии с протоколом, обобщенным выше. Ниже приведен практический пример клинического случая. У мужчины белой расы возрастом 34 года, с изначально диагностированным метастатическим раком поджелудочной железы (печени) наблюдалось прогрессирование в ходе применения нескольких режимов химиотерапии, в том числе гемцитабина/эрлотиниба/FG-3019, режимов FOLFIRINOX и GTX, до введения IMMU-132 (доза 8 мг/кг, введение на 1 и 8 дни 21-дневного цикла). Пациент получал указанное лекарственное средство в течение 4 месяцев, с хорошей симптоматической переносимостью, облегчением болей, 72% максимальным спадом СА 19-9 (с 15885 U/мл до 4418 U/мл) и стабильным заболеванием по оценке с применением КТ/ критериев RECIST наряду с признаками некроза опухоли. Терапия была вынужденно приостановлена в связи с абсцессом печени; пациент скончался ~6 недель спустя, через 6 месяцев после начала терапии.

Выводы

[0290] Доклинические исследования показали, что IMMU-132 обеспечивает доставку 120-кратно большего количества SN-38 в ксенотрансплантат опухоли поджелудочной железы человека, чем при введении иринотекана. При включении в более масштабное исследование пациентов с разнообразными видами метастатического солидного рака дозу IMMU-132 для фазы 2 определяли на уровне от 8 до 10 мг/кг, на основании управляемых нейтропении и диареи как основных побочных эффектов. К настоящему моменту не было детектировано антител против антител или против SN-38, даже при многократных терапевтических циклах.

[0291] Исследование на 14 пациентах с распространенным РПЖ, рецидивировавшим в среднем после двукратной предшествующей терапии (медианное значение) продемонстрировало подтвержденную КТ противоопухолевую активность, соответствующую 8/13 пациентов (62%) со стабильным заболеванием. Медианная продолжительность ВДП у 13 поддающихся оценке с помощью КТ пациентов составила 12,7 недель по сравнению с рассчитанными 8,0 неделями для последней предшествующей терапии. Указанный ADC с известным лекарственным средством, обладающим токсичностью в наномолярном диапазоне, которое конъюгировано с антителом, нацеленным на Trop-2, широко распространенный во многих эпителиальных раковых образованиях, при помощи линкера, обеспечивающего расщепление в сайте опухоли, представляет собой новую эффективную стратегию терапии рака поджелудочной железы с применением ADC. Увеличение периода времени до прогрессирования у пациентов с раком поджелудочной железы, в частности, у пациентов, устойчивых к несколько раз проведенной предшествующей терапии, по сравнению с существующими стандартами лечения пациентов с раком поджелудочной железы, было неожиданным и не могло быть предсказано.

Пример 11. Комбинация нацеливаемого антителом облучения (радиоиммунотерапии) с анти-Trop-2-SN-38 ADC улучшает терапию рака поджелудочной железы

[0292] Авторы изобретения ранее сообщали об эффективной противоопухолевой активности у мышей Nude, несущих опухоли поджелудочной железы человека, ⁹⁰Y-гуманизированного IgG PAM4 (hPAM4; ⁹⁰Y-кливатузумаб тетраксетан), которая усиливалась в комбинации с гемцитабином (GEM) (Gold et al., Int J. Cancer 109:618-26, 2004; Clin Cancer Res 9:3929S-37S, 2003). Указанные исследования привели к клиническому тестированию фракционного ⁹⁰Y-hPAM4 IgG в комбинации с GEM, демонстрирующему обнадеживающие объективные ответы. Хотя известно, что GEM обладает радиосенсибилизирующей способностью, при индивидуальном применении он представляет собой не очень эффективный терапевтический агент для лечения рака поджелудочной железы, и его дозировка ограничена гематологической токсичностью, которая также является лимитирующей для ⁹⁰Y-hPAM4 IgG.

[0293] Согласно описанию в разделе примеров выше, ADC против Trop-2, состоящий из IgG hRS7, соединенного с SN-38, демонстрирует противоопухолевую активность в различных солидных опухолях. Указанный ADC очень хорошо переносился у мышей (например, больше или равно 60 мг), причем уже доза 4,0 мг (0,5 мг, два раза в неделю × 4) обладает значимым терапевтическим значением. Trop-2 также экспрессируется при большинстве видов рака поджелудочной железы.

[0294] В настоящем исследовании изучали комбинации ⁹⁰Y-hPAM4 IgG с сацитузумабом говитеканом у мышей Nude, несущих подкожные ксенотрансплантаты размером 0,35 см³ клеток линии рака поджелудочной железы человека, Capan-1. Мыши (N равно 10) получали лечение в виде одной дозы ⁹⁰Y-hPAM4 IgG по отдельности (130 мкКи, т.е. максимальная переносимая доза (МПД), или 75 мкКи), сацитузумаба говитекана по отдельности (как описано выше), или комбинацией указанных 2 агентов при двух уровнях дозы ⁹⁰Y-hPAM4, при этом первую инъекцию ADC проводили в тот же день, что и ⁹⁰Y-hPAM4. Все варианты лечения были переносимыми, со снижением массы тела меньше или равно 15%. Объективные ответы возникали у большинства животных, однако они были более устойчивыми в обеих получавших комбинацию группах по сравнению с группами, получавшими любой агент по отдельности. У всех животных в группе, получавшей 0,13 мКи ⁹⁰Y-hPAM4 IgG + сацитузумаб говитекан, отсутствие опухолей достигалось в пределах периода 4 недель, тогда как у других животных продолжали наблюдаться признаки персистирующего заболевания. Указанные исследования обеспечивают первичные доказательства того, что комбинация радиоиммунотерапии и ADC усиливает эффективность при применении безопасных доз.

[0295] В рамках продолжающихся клинических испытаний РАМ4 проводят четырехнедельный цикл клинического лечения. На 1 неделе субъектам вводят дозу ¹¹¹In-hPAM4, после чего по меньшей мере через 2 дня вводят дозу гемцитабина. На 2, 3 и 4 неделе субъектам вводят дозу ⁹⁰Y-hPAM4, после чего по меньшей мере через 2 дня вводят гемцитабин (200 мг/м²). Эскалацию начинали с 3×6,5 мКи/м². Максимальная переносимая доза у получавших терапию первой линии пациентов с раком поджелудочной железы составляла 3×15 мКи/м² (гематологическая токсичность является дозолимитирующей). У 22 поддающихся оценке с помощью КТ пациентов частота контроля заболевания (ПО+ЧО+СЗ) составляла 68%, с частичными ответами у 5 пациентов (23%) и стабилизацией у 10 пациентов (45%) в качестве наилучшего ответа согласно критериям RECIST.

Получение конъюгата антитела с лекарственным средством (ADC)

[0296] SN-38, конъюгированный с антителом hRS7, получали как описано выше и в соответствии с представленными ранее протоколами (Moon et al. J Med Chem 2008, 51:6916-6926; Govindan et al., Clin Cancer Res 2009. 15:6052-6061). Получали реакционноспособное бифункциональное производное SN-38 (CL2A-SN-38). Формула CL2A-SN-38 - (малеимидо-[х]-Lys-РАВОСО-20-O-SN-38, где РАВ представляет собой п-аминобензил, а «х» содержит короткий ПЭГ). После восстановления дисульфидных связей в антителе трис(2-карбоксиэтил)фосфином (ТСЕР) проводили реакцию CL2A-SN-38 с восстановленным антителом для получения SN-38, конъюгированного с RS7.

[0297] ⁹⁰Y-hPAM4 получают согласно существующему описанию (Gold et al., Clin Cancer Res 2003, 9:3929S-37S; Gold et al., Int J Cancer 2004, 109:618-26).

Комбинация RAIT + ADC

[0298] Антиген Trop-2 экспрессируется в большинстве видов эпителиального рака (легкого, молочной железы, предстательной железы, яичников, ободочной и прямой кишки, поджелудочной железы), и конъюгаты сацитузумаба говитекана исследуют в различных моделях с ксенотрансплантатами рака человека на мышах. Начальные клинические испытания ⁹⁰Y-hPAM4 IgG с добавлением радиосенсибилизирующих количеств GEM дают обнадеживающие результаты, демонстрируя признаки сокращения размеров опухолей или стабилизацию заболевания. Однако терапия рака поджелудочной железы сопряжена со значительными трудностями. Поэтому исследовали комбинированную терапию, чтобы определить, будет ли она индуцировать лучший ответ. В частности, введение сацитузумаба говитекана в эффективных, но нетоксичных дозах комбинировали с радиоиммунотерапией (RAIT) ⁹⁰Y-hPAM4 IgG.

[0299] Результаты продемонстрировали, что комбинация сацитузумаба говитекана с ⁹⁰Y-hPAM4 была более эффективной, чем любое лечение по отдельности, или сумма индивидуальных вариантов лечения (не показано). При дозировке 75 мкКи ⁹⁰Y-hPAM4 только у 1 из 10 мышей наблюдалось отсутствие опухолей после 20 недель терапии (не показано): такой же результат, что и наблюдаемый для сацитузумаба говитекана по отдельности (не показано). Однако комбинация сацитузумаба говитекана с ⁹⁰Y-hPAM4 обеспечивала отсутствие опухолей у 4 из 10 мышей через 20 недель (не показано), а у остальных наблюдалось существенное уменьшение объема опухолей по сравнению с любым лечением по отдельности (не показано). При дозе 130 мкКи ⁹⁰Y-hPAM4 различие было еще более резко выраженным: опухоли отсутствовали у 9 из 10 животных в группе комбинированной терапии и у 5 из 10 животных в получавшей только RAIT группе (не показано). Указанные данные демонстрируют синергический эффект комбинации сацитузумаба говитекана с ⁹⁰Y-hPAM4. Комбинация RAIT + ADC значимо улучшала показатель времени до прогрессирования и увеличивала частоту достижения отсутствия опухолей при лечении. Комбинация ADC сацитузумаба говитекана и МПД RAIT ⁹⁰Y-hPAM4 проявляла минимальную дополнительную токсичность, на что указывает % уменьшения массы тела животных в ответ на лечение (не показано).

[0300] Анализ эффектов разной последовательности проведения лечения на выживание опухолей показал, что оптимальный эффект достигается при проведении сначала RAIT с последующим введением ADC (не показано). И напротив, при введении сначала ADC с последующим проведением RAIT наблюдается снижение частоты встречаемости животных, у которых отсутствуют опухоли (не показано). Ни одно из неконъюгированных антител hPAM4 и hRS7 не обладало противоопухолевой активностью при введении по отдельности (не показано).

Пример 12. Применение сацитузумаба говитекана (IMMU-132) для лечения рефракторного к терапии метастатического рака молочной железы

[0301] Пациентка - женщина возрастом 57 лет с IV стадией рака молочной железы с тройным негативным фенотипом (ER/PR-негативный, HER-neu-негативный), впервые диагностированным в 2005 году. Пациентка прошла лампэктомию левой молочной железы в 2005 году с последующим проведением уплотненной терапии по схеме ACT в качестве адъювантной терапии в сентябре 2005 года. Затем пациентка прошла лучевую терапию, завершившуюся в ноябре. Локальный рецидив заболевания был идентифицирован после обнаружения пациенткой при пальпации уплотнения в контралатеральной (правой) молочной железе в начале 2012 г., после чего пациентка прошла химиотерапевтическое лечение ЦМФ (циклофосфамид, метотрексат, 5-фторурацил). Заболевание рецидивировало в течение того же года, с появлением метастатических очагов в коже стенки грудной клетки. После этого пациентка получала карбоплатин + ТАКСОЛ® в рамках химиотерапевтического режима, применение которого привело к развитию тромбоцитопении. Заболевание прогрессировало и пациентка начала еженедельно принимать доксорубицин, введение которого продолжали до получения 6 доз. Заболевание кожи также прогрессировало. ФДГ-ПЭТ-сканирование 09/26/12 показало прогрессирование заболевания в стенке грудной клетки и увеличенные твердые подмышечные узлы. Пациентка получала оксикодон для обезболивания.

[0302] Пациентка получала препарат ИКСЕМПРА® с октября 2012 года по февраль 2013 года (один раз в 2 недели в течение 4 месяцев), когда произошло вскрытие из очага поражения в стенке грудной клетке и возникло кровотечение. Пациентке назначили препарат КСЕЛОДА®, прием которого переносился плохо, сопровождаясь нейропатией ладоней и ступней, а также запором. Очаги поражения в коже прогрессировали, и пациентку включили в испытание IMMU-132 после получения информированного согласия. В анамнезе у пациентки также присутствовали гипертиреоз и расстройства зрения, с высоким риском заболевания ЦНС (однако МРТ головного мозга показало отсутствие заболевания ЦНС). В момент включения в указанное испытание кожные очаги поражения (целевые) в правой молочной железе пациентки достигали максимального диаметра 4,4 см и 2,0 см. Также в правой молочной железе пациентки присутствовал еще один нецелевой очаг поражения, и имелось по одному увеличенному подмышечному лимфатическому узлу с правой и с левой стороны тела.

[0303] Первую инфузию IMMU-132 (12 мг/кг), хорошо перенесенную пациенткой, провели 12 марта 2013 года. Проведение второй инфузии было задержано из-за снижения абсолютного количества нейтрофилов (АКН) до значений 3 класса (0,9) в день проведения инфузии согласно схеме, через 1 неделю. После задержки в 1 неделю и введения препарата НЕУЛАСТА® пациентке второй раз вводили IMMU-132 в сниженной на 25% дозе, 9 мг/кг. После этого она получала IMMU-132 по схеме согласно протоколу, один раз в неделю в течение 2 недель, с последующей одной неделей отдыха. При первой оценке ответа 17 мая 2013 года, после 3 циклов терапии, наблюдалось уменьшение суммы максимальных диаметров целевых очагов поражения на 43%, что является частичным ответом согласно критериям RECIST. Пациентка продолжает лечение при уровне дозы 9 мг/кг. Общее состояние ее здоровья и клинические симптомы значимо улучшились с момента начала лечения IMMU-132.

Пример 13. Применение сацитузумаба говитекана (IMMU-132) для лечения рефракторного метастатического мелкоклеточного рак легкого

[0304] Пациент - женщина возрастом 65 лет с диагностированным мелкоклеточным раком легкого, затронувшим левое легкое и медиастинальные лимфатические узлы, с выявленными с помощью МРТ признаками метастазирования в левую теменную долю головного мозга. Предшествующая химиотерапия включала карбоплатин, этопозид и топотекан, однако без отмеченных ответов. Лучевая терапия для контроля заболевания также оказалась неуспешной. Соответственно, пациентка начала получать IMMU-132 в дозе 18 мг/кг один раз в три недели; в общей сложности было проведено 5 инфузий. После введения второй дозы у пациентки развились гипотония и нейтропения 2 класса, улучшение наступило до следующей инфузий. После 5 инфузий КТ-исследование показало 13% сокращение размеров целевой опухолевой массы в левом легком. МРТ головного мозга также показало 10% уменьшение указанного метастаза. Пациентка продолжает получать дозы IMMU-132 раз в 3 недели на протяжении еще 3 месяцев; продолжает наблюдаться объективное и субъективное улучшение состояния, с 25% уменьшением опухолевой массы в левом легком и 21% уменьшением метастаза в головной мозг.

Пример 14. Терапия сацитузумабом говитеканом (IMMU-132) у пациента с раком желудка на IV стадии метастатического заболевания

[0305] Указанный пациент - мужчина возрастом 60 лет с курением и периодами злоупотребления алкоголем в анамнезе на протяжении 40 лет. У него наблюдались снижение массы тела, дискомфорт при употреблении пищи и боль, не снимаемая приемом антацидов, частые боли в животе и пояснице, и недавно обнаруженные пальпируемые подмышечные узлы с обеих сторон тела. Пациент обратился за медицинской помощью, и после обследования у него была обнаружена аденокарцинома гастроэзофагеального соединения с некоторыми признаками плоскоклеточного рака, на основании биопсии, проведенной при помощи гастроскопа. При радиологических исследованиях (КТ и ФДГ-ПЭТ) обнаружено также метастатическое заболевание в правой и левой подмышечной области, медиастинальной области, поясничном отделе позвоночника и печени (2 опухоли в правой доле и 1 в левой доле, все опухоли диаметром от 2 до 4 см). Опухоль желудка была удалена, после чего пациенту назначили курс химиотерапии эпирубицином, цисплатином и 5-фторурацилом. Через 4 месяца, после периода отдыха 6 недель, пациента перевели на химиотерапию доцетакселом, которая также оказалась неуспешной для контроля заболевания, судя по прогрессированию, подтвержденному на основании измерения метастатических опухолей при КТ и некоторого общего ухудшения состояния.

[0306] Соответственно, пациент получил терапию IMMU-132 (hRS7-SN-38) при дозе 10 мг/кг, путем инфузий в общей сложности 6 доз один раз в две недели, после чего проводили КТ-обследования для оценки статуса заболевания. Указанные инфузий переносились хорошо, с некоторой легкой тошнотой и диареей, контролируемыми с помощью симптоматических медикаментов. При КТ-обследованиях обнаружено, что сумма индексных метастатических очагов поражения уменьшилась на 28%, поэтому указанная терапия у пациента была продолжена с проведением 5 дополнительных курсов. КТ-обследования в рамках проспективного исследования указывают на продолжающееся облегчение заболевания приблизительно на 35% согласно критериям RECIST относительно базовых измерений до терапии IMMU-132; общее состояние пациента также, по-видимому, улучшилось, и к пациенту возвращается оптимистический настрой в отношении заболевания, находящегося под контролем.

Пример 15. Клинические испытания IMMU-132 при разнообразных видах Trop-2-положительного рака

Резюме

[0307] Сацитузумаб говитекан (IMMU-132, также известный как hRS7-CL2A-SN-38) представляет собой конъюгат антитела с лекарственным средством (ADC), нацеленный на Trop-2, поверхностный гликопротеин, экспрессируемый на многих эпителиальных опухолях, для доставки SN-38, активного метаболита иринотекана. В отличие от большинства ADC, задействующих ультратоксичные лекарственные средства и стабильные линкеры, в IMMU-132 задействованы умеренно токсичное лекарственное средство и умеренно стабильная карбонатная связь между SN-38 и линкером. С помощью проточной цитометрии и иммуногистохимических исследований обнаружено, что Trop-2 экспрессируется в широком диапазоне типов опухолей, в том числе при раке желудка, поджелудочной железы, раке молочной железы с тройным негативным фенотипом (ТНРМЖ), раке ободочной кишки, предстательной железы и легкого. Хотя в экспериментах со связыванием клеток не обнаружено значимых различий между IMMU-132 и исходным антителом hRS7, анализ методом поверхностного плазменного резонанса с применением СМ5-чипа с Trop-2 демонстрирует значимое преимущество IMMU-132 по сравнению hRS7 при связывании. Указанный конъюгат сохранял способность к связыванию с неонатальным рецептором, однако утрачивал более 60% активности антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности по сравнению с hRS7.

[0308] При воздействии на опухолевые клетки либо свободным SN-38, либо IMMU-132 продемонстрировано участие одних и тех же сигнальных путей, с положительной регуляцией pJNK1/2 и p21WAF1/Cip1 и последующим расщеплением каспаз 9, 7 и 3, что в конечном итоге приводит к расщеплению поли(АДФ-рибоза)-полимеразы и разрывам двухцепочечной ДНК. Фармакокинетика интактного ADC у мышей указывает на среднее время удержания (MRT) 15,4 ч, тогда как антитело-носитель hRS7 выводилось со скоростью, аналогичной неконъюгированному антителу (MRT = ~300 ч). Лечение мышей, несущих ксенотрансплантаты рака желудка человека, с применением IMMU-132 (17,5 мг/кг; два раза в неделю × 4 недели) обеспечивало значимые противоопухолевые эффекты по сравнению с мышами, получавшими лечение неспецифическим контролем. Клинически релевантные схемы дозирования IMMU-132 включали введение один раз в две недели, еженедельно или два раза в неделю у мышей-носителей рака поджелудочной железы или желудка человека.

[0309] В настоящем испытании фазы I проводилась оценка указанного ADC как потенциального терапевтического средства для применения у проходивших предшествующее лечение пациентов с различными видами метастатического солидного рака. Согласно конкретным вариантам реализации указанная терапия подходит для применения при лечении пациентов, ранее обнаруживших устойчивость к стандартным видам противоракового лечения, включая, но не ограничиваясь указанным, лечение иринотеканом, исходным для SN-38 соединением, или рецидивировавших после применения указанных видов лечения. Указанные результаты были неожиданными и непредвиденными, и не могли быть предсказаны.

[0310] Сацитузумаб говитекан вводили на 1 и 8 дни 21-дневных циклов, с повторением циклов до возникновения дозолимитирующей токсичности или прогрессирования. Эскалацию дозы проводили по стандартной схеме 3+3 с 4 запланированными уровнями дозы при разрешенных задержках введения или снижениях доз. 25 пациентов (возрастом 52-60 лет, в среднем 3 предшествующих химиотерапевтических режима (медиана)) получали лечение при уровнях дозы 8 (N равно 7), 10 (N равно 6), 12 (N равно 9) и 18 (N равно 3) мг/кг. Дозолимитирующая токсичность была представлена нейтропенией, при этом максимальная переносимая доза для цикла 1 составляла 12 мг/кг, однако при многократных циклах указанная доза была слишком токсичной. Более низкие дозы были приемлемыми при продленном лечении, без возникновения связанной с лечением токсичности 4 класса, и с токсичностью 3 класса, ограниченной утомляемостью (N равно 3), нейтропенией (N равно 2), диареей (N равно 1) и лейкопенией (N равно 1). Согласно основанным на результатах КТ критериям RECIST 1.1 у 3 пациентов достигался частичный ответ (рак молочной железы с тройным негативным фенотипом, мелкоклеточный рак легкого, рак ободочной кишки), и еще у 15 наблюдалось стабильное заболевание в качестве наилучшего ответа; у 12 из указанные пациентов сохранялся контроль над заболеванием при продолжении лечения в течение 16-36 недель. Предварительного отбора пациентов на основании экспрессии Trop-2 в опухолях не проводили.

[0311] Было сделано заключение, что сацитузумаб говитекан представляет собой многообещающий конъюгат ADC с приемлемой токсичностью и обнадеживающей терапевтической активностью у пациентов с трудноизлечимыми видами рака. Дозы 8 и 10 мг/кг были выбраны для проведения исследований II фазы.

Введение

[0312] Было одобрено два новых конъюгата антитела с лекарственным средством (ADC), включающие разные ультратоксичные (активность в пикомолярном диапазоне) лекарственные средства, что привело к дальнейшим разработкам других ADC на основании аналогичных принципов, в том числе с применением ультратоксичных лекарственных средств (Younes et al., 2011, Nat Rev Drug Discov 11:19-20; Sievers & Senter, 2013, Ann Rev Med 64:15-29; Krop & Winer, 2014, Clin Cancer Res 20:15-20). Однако Moon с соавторами (Moon et al., 2008, J Med Chem 51:6916-26) и Govindan с соавторами (Govindan et al., 2009, Clin Cancer Res 15:6052-61), напротив, выбрали SN-38, ингибитор топоизомеразы I, представляющий собой активный метаболит иринотекана, одобренное лекарственное средство с хорошо известными, но сложными фармакологическими характеристиками (Mathijssen et al., 2001, Clin Cancer Res 7:2182-94). Была проведена оценка нескольких линкеров для конъюгации с SN-38, обеспечивающих его высвобождение при отсоединении от IgG с различной скоростью, от нескольких часов до дней (Moon et al., 2008, J Med Chem 51:6916-26; Govindan et al., 2009, Clin Cancer Res 15:6052-61; Cardillo et al., 2011, Clin Cancer Res 17:3157-69). Выбранный оптимальный линкер, обозначаемый CL2A, обеспечивающий промежуточную стабильность конъюгата в сыворотке, присоединяли к гидроксильной группе на лактонном кольце SN-38; таким образом указанное кольцо при сохранении связи с линкером было защищено от раскрытия с образованием менее токсичной карбоксилатной формы; указанный линкер также содержал короткий фрагмент полиэтиленгликоля, улучшающий растворимость (Cardillo et al., 2011, Clin Cancer Res 17:3157-69). Активная форма SN-38 высвобождалась при расщеплении карбонатной связи между линкером и SN-38, либо при низких значениях рН, как, например, в лизосомах, а также в микроокружении опухоли, либо, как вариант, за счет ферментативного разложения.

[0313] Антитело, выбранное для применения в указанном ADC, нацелено на опухолеассоциированный антиген Trop-2 (поверхностный антиген трофобластных клеток) (Cardillo et al., 2011, Clin Cancer Res 17:3157-69) и представляет собой интернализующееся, как было ранее показано, гуманизированное моноклональное антитело RS7 (Stein et al., 1993, Int J Cancer 55:938-46). Trop-2 является важной опухолевой мишенью ADC, поскольку он сверхэкспрессируется на многих эпителиальных опухолях, в частности, более агрессивного типа (Ambrogi et al., 2014, PLoS One 9:e96993; Cubas et al., 2009, Biochim Biophys Act 1796:309-14; Trerotola et al., 2013, Oncogene 32:222-33). Trop-2 также присутствует в некоторых нормальных тканях, однако в доклинических исследованиях на обезьянах, у которых экспрессируется указанный антиген, при применении указанного нового ADC наблюдались только дозолимитирующая нейтропения и диарея, без признаков поддающейся оценке токсичности для экспрессирующих Trop-2 нормальных тканей (Cardillo et al., 2011, Clin Cancer Res 17:3157-69). Соответственно, на основании доклинических данных, продемонстрировавших активность в нескольких моделях с ксенотрансплантатами опухоли человека и широкое терапевтическое окно (Cardillo et al., 2011, Clin Cancer Res 17:3157-69), было начато клиническое испытание I фазы для определения максимальной переносимой и оптимальной дозы указанного нового ADC у предварительно проходивших серьезное лечение пациентов с разнообразными видами рецидивирующих/рефрактерных метастатических эпителиальных опухолей. Указанное испытание зарегистрировано на веб-сайте ClinicalTrials.gov (под номером NCT01631552).

Материалы и способы

[0314] Критерии отбора - Первичная цель заключалась в определении безопасности и переносимости сацитузумаба говитекана (IMMU-132) как отдельного агента. Дизайн испытания представлял собой стандартный дизайн 3+3 фазы I, со стартовой дозой 8 мг/кг на инъекцию, с еженедельным дозированием в течение 2 недель в 3-недельном цикле лечения.

[0315] Для включения подходили мужчины и небеременные, не кормящие грудью женщины возрастом больше или равно 18 лет при наличии диагностированной эпителиальной опухоли одного из 13 различных типов. Хотя предварительный отбор на основании экспрессии Trop-2 не требовался, ожидается, что экспрессия Trop-2 в указанных опухолях присутствует более чем в 75% случаев на основании результатов иммуногистологических исследований архивных образцов. Требовалось, чтобы у пациентов имелось измеряемое метастатическое заболевание (без одиночных очагов поражения больше или равно 5 см), с рецидивом или рефрактерностью после применения по меньшей мере одного одобренного стандартного химиотерапевтического режима в связи с указанным заболеванием. Другие ключевые критерии включали адекватные (меньше или равно 1 класса) гематологические показатели, показатели функции печени и почек, и отсутствие в анамнезе известных анафилактических реакций на иринотекан или токсичности больше или равно 3 класса в отношении ЖКТ при предшествующем лечении иринотеканом или другими ингибиторами топоизомеразы-1. Ввиду допуска пациентов с такими разнообразными заболеваниями предшествующая терапия иринотеканом не была необходимым условием. Пациентов с болезнью Жильбера, непереносимостью иринотекана при предшествующем введении или с известным метастатическим заболеванием ЦНС исключали.

[0316] Дизайн исследования - Оценку базовых показателей проводили в пределах 4 недель после начала лечения, регулярно проводя мониторинг количества элементов крови, биохимических показателей сыворотки, основных показателей жизнедеятельности и любых нежелательных явлений. Ответ в виде антител к антителам и к SN-38 измеряли с применением ИФА ELISA, взятие образцов осуществляли в базовый момент и затем перед началом каждого четного цикла лечения. Первое КТ-обследование проводили через 6-8 недель после начала лечения, а затем повторяли с 8-12-недельными интервалами до прогрессирования. Дополнительное последующее наблюдение требовалось только для мониторинга какой-либо продолжающейся связанной с лечением токсичности. Класс токсичности определяли с применением критериев CTCAE NCI версии 4.0; эффективность оценивали с использованием критериев RECIST 1.1.

[0317] Был разработан ИФА ELISA для детекции Trop-2 в сыворотке с чувствительностью 2 нг/мл, однако после тестирования 12 пациентов и обнаружения отсутствия признаков циркулирующего Trop-2 дальнейший скрининг не проводили. Образцы ранее архивированных опухолей запрашивали для иммуногистологической оценки Trop-2 с применением поликлонального антитела козы против Trop-2 человека, хотя это не являлось критерием включения (R&D Systems, Миннеаполис, Миннесота), поскольку эпитоп, распознаваемый антителом ADC, hRS7, не сохраняется в фиксированных формалином и залитых в парафин срезах (Stein et al., 1993, Int J Cancer 55:938-46). Окрашивание выполняли согласно приведенному ниже описанию.

[0318] Терапевтический режим - Лиофилизированный сацитузумаб говитекан восстанавливали в солевом растворе и инфузировали на протяжении 2-3 ч (в 100 мг антитела содержалось ~1,6 мг SN-38, при среднем отношении лекарственное средство : антитело [DAR] = 7,6:1). До начала каждой инфузии большинство пациентов получали ацетаминофен, антигистаминные средства (блокаторы H1 и Н2) и дексаметазон. Профилактическое применение противорвотных или противодиарейных медикаментов было запрещено. Терапия включала введение 2 последовательных доз на 1 и 8 дни 3-недельного цикла лечения, с предполагаемым продолжением лечения пациентов с проведением до 8 циклов (т.е. 16 лечебных процедур), при условии отсутствия неприемлемой токсичности или прогрессирования. Пациенты, у которых наблюдается стабилизация заболевания или ответ после 8 циклов, могли продолжить лечение.

[0319] Показателями дозолимитирующей токсичности (ДЛТ) считали фебрильную нейтропению любой продолжительности больше или равно 3 класса, тромбоцитопению 3 класса со значимым кровотечением или тромбоцитопению класса 4 больше или равно 5 дней, что-либо из тошноты, рвоты или диареи 3 класса, персистирующих на протяжении более 48 часов, несмотря на оптимальное медицинское управление, или тошнота, рвота или диарея класса 4 (жизнеугрожающие) любой продолжительности, или любая другая негематологическая токсичность больше или равно 3 класса, по меньшей мере вероятно обусловленная исследуемым лекарственным средством, а также возникновение какой-либо связанной с инфузией реакции 3 класса.

[0320] Максимальную переносимую дозу (МПД) определяли на основании переносимости пациентом первого цикла лечения. В день планового лечения лечение любого пациента с наблюдаемой связанной с лечением токсичностью больше или равно 2 класса, за исключением алопеции, задерживали с недельными интервалами до 2 недель. Лечение возобновляли после снижения токсичности до уровня меньше или равно 1 класса. Протокол исходно также требовал снижения всех последующих доз лечения (25% при восстановлении в пределах 1 недели, 50% при восстановлении в пределах 2 недель), однако это требование смягчали позже в ходе испытания, когда протокол изменяли для обеспечения поддерживающего лечения после первого цикла. Однако в том случае, если токсичность не снижалась в пределах периода 3 недель или повышалась, лечение прекращали. Что важно, задержка введения со снижением дозы не приравнивалась к ДЛТ; соответственно, лечение могло быть продолжено, однако с применением более низкой дозы. Соответственно, считалось, что у пациента, которому требовалась задержка введения/снижение дозы и который мог продолжать лечение, ДЛТ не подлежала оценке, поэтому его заменяли.

[0321] Поскольку возникновение ДЛТ приводило к прекращению любого дальнейшего лечения, вторичная цель заключалась в оценке уровня дозы, который мог бы переноситься на протяжении нескольких циклов лечения, с минимальными задержками введения или снижением доз. Указанный уровень дозы обозначали как максимальную приемлемую дозу; требовалось, чтобы пациенты переносили заданный уровень дозы в первом цикле без задержки или снижения во время указанного цикла, что обеспечило бы переход к началу второго цикла.

[0322] Фармакокинетика и иммуногенность - Взятие образцов крови осуществляли в пределах периода ~30 мин от окончания инфузии (например, взятие образцов с пиковой концентрацией) и затем перед каждой последующей инъекцией (например, взятие образцов с минимальной концентрацией). Образцы разделяли и сыворотку замораживали для определения общих концентраций IgG и сацитузумаба говитекана с применением ИФА ELISA. Также анализировали содержание SN-38 в образцах сыворотки от семи пациентов, как общее (соответствующее SN-38, связанному с IgG, и свободному), так и содержание свободного SN-38 (т.е. несвязанного SN-38).

Результаты

[0323] Характеристики пациентов - В исследование включали двадцать пять пациентов (таблица 6). Медианный возраст варьировал от 52 до 60 лет, при этом 76% пациентов имели статус по шкале ECOG, равный 1, остальные - ECOG 0. Большинство пациентов страдали метастатическим раком поджелудочной железы (РПЖ) (N равно 7), следующими по встречаемости были рак молочной железы с тройным негативным фенотипом (ТНРМЖ) (N равно 4), рак ободочной и прямой кишки (РОПК) (N равно 3), мелкоклеточный рак легкого (МРЛ) (N равно 2) и рак желудка (РЖ) (N равно 2), с одиночными случаями аденокарциномы пищевода (АКП), гормонально-рефрактерного рака предстательной железы (ГРРПЖ), немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ), эпителиального рака яичников (ЭРЯ), рака почек, миндалин и мочевого пузыря (РМП).

[0324] Проводили иммуногистологический анализ архивных тканей от 17 пациентов, при этом в 13 (76,4%) образцах наблюдалось мембранное и цитоплазматическое окрашивание от 2+ до 3+ уровня более чем в 10% опухолевых клеток; 3 образца (17,6%) дали отрицательный результат. Ряд репрезентативных случаев описан ниже.

[0325] Все зачисленные в испытание пациенты страдали метастатическим заболеванием с метастазами в сайтах, типичных для соответствующего вида первичного рака. С применением КТ было определено, что медиана суммы максимальных диаметров опухоли для всех пациентов составляла 9,7 см (диапазон = 2,9-29,8 см), при этом у 14 пациентов имелось 3 или более целевых очагов поражения (медиана для всех пациентов = 4, диапазон = 1-10 очагов поражения), и в среднем 2 нецелевых очага поражения (диапазон = 0-7 очагов поражения), идентифицированных при базовых исследованиях. Предшествующую системную терапию в среднем проводили 3 раза, при этом 7 пациентов (2 РПЖ и РЖ, по 1 пациенту с РОПК, ТНРМЖ, раком миндалин) проходили предшествующую терапию один раз, а 7 пациентов - пять или более раз; 11 пациенты проходили предшествующую лучевую терапию. Предшествующая терапия ингибитором топоизомеразы I проводилась у девяти пациентов, при этом 2 из 3 пациентов с РОПК, 4 из 7 пациентов с РПЖ и 1 пациент с АКП получали иринотекан, и 2 из 2 пациентов с МРЛ получали топотекан; у троих из них (у 2 пациентов с МРЛ и одного пациента с РОПК) ответ на терапию ингибитором топоизомеразы 1 отсутствовал. Далее, семь из 23 пациентов (для 2 пациентов данные не определены) отвечали на последнюю предшествующую терапию с медианной продолжительностью ответа, составляющей 3 месяца (диапазон: 1-11 месяцев).

[0326] Почти все пациенты несколько раз получили лечение сацитузумабом говитеканом (медиана = 10 доз) до окончательного подтверждения прогрессирования заболевания с помощью КТ-обследования по критериям RECIST 1.1; один пациент был отстранен ввиду систематического ухудшения, и у 1 пациента не был измерен целевой очаг поражения при первом визите в рамках последующего наблюдения при обнаружении нового очага поражения.

[0327] Оценка дозы - Отсутствовали задержки введения или снижения дозы, а также явления ДЛТ у 3 пациентов (1 РОПК, 2 РПЖ), включенных с начальным уровнем дозы 8,0 мг/кг. В исследование со следующим уровнем дозы, 12 мг/кг, было включено девять пациентов ввиду возникновения обусловленного протоколом требования задержки введения второй дозы. Для пяти пациентов требование задержки возникло в первом цикле (у 4 пациентов задержка составила 1 неделю, при этом 2 пациентов получали вспомогательный миелоидный фактор роста, и у 1 пациента задержка перед введением второй дозы составила 2 недели). Все указанные пациенты, кроме одного получили 12 мг/кг в качестве второй дозы. У четырех из девяти пациентов с уровнем дозы 12 мг/кг третья доза, введенная в начале третьего цикла, была снижена до 9 мг/кг, и второй цикл был задержан на 1 дополнительную неделю у 3 пациентов. Несмотря на указанные обусловленные протоколом задержки/снижения, ни у одного из указанных 9 пациентов не наблюдалось дозолимитирующих явлений в течение первого цикла (например, у 1 пациента наблюдались связанные с заболеванием показатели уровня гемоглобина 3 класса после введения первой дозы; 2 пациента, у которых наблюдалась нейтропения 3 класса после введения первой дозы, получали миелоидные факторы роста, у 1 пациента наблюдалась нейтропения 3 класса после введения первой дозы, разрешившаяся без вспомогательных средств, у 2 наблюдалась нейтропения 3 класса после введения второй дозы, у 2 пациентов наблюдалась нейтропения 2 класса после введения первой или второй дозы, и у 1 пациента не наблюдалось нежелательных явлений); соответственно, было разрешено увеличение уровня дозы до 18 мг/кг. На этом этапе у всех трех пациентов введение доз было задержано после введения первой лечебной дозы, и только 1 пациент получил вторую лечебную дозу 18 мг/кг. У двух пациентов наблюдалась дозолимитирующая нейтропения 4 класса, у одного после введения первой дозы, у другого после введения второй дозы 18 мг/кг, причем у указанного последнего пациента после введения указанной дозы также наблюдалась диарея 2 класса. Соответственно, в первом цикле с уровнем дозы 12 мг/кг указанный уровень был указан как МПД у 0/9 пациентов с ДЛТ.

[0328] Дополнительные исследования с подбором дозы были продолжены для уточнения уровня дозы, который позволил бы проводить несколько циклов с минимальными задержками между лечебными процедурами/циклами. Соответственно, в исследование были включены еще 4 пациента при уровне дозы 8 мг/кг, и был установлен новый промежуточный уровень 10 мг/кг. Из трех пациентов, включенных при дозе 8 мг/кг, у двух пациентов с РОПК лечение продолжили при дозе 8 мг/кг, с проведением в общей сложности 31 и 11 лечебных процедур, тогда как пациент с РПЖ получил три дозы 8 мг/кг до снижения дозы до 6 мг/кг ввиду возникновения нейтропении 2 класса при введении четвертой дозы, а затем прошел еще 3 лечебных процедуры при указанном уровне дозы, после чего был отстранен ввиду прогрессирования заболевания. Еще 4 пациента получили от 3 до 9 доз 8 мг/кг до отстранения при прогрессировании заболевания. Двое из указанных пациентов получили только 1 дозу до требуемого протоколом снижения до 6 мг/кг ввиду возникновения сыпи 2 класса и нейтропении 2 класса.

[0329] Пятеро из шести пациентов, включенных при дозе 10 мг/кг, получили от 6 до 30 доз без снижения до отстранения ввиду прогрессирования заболевания. У одного пациента с РЖ (#9) развилась фебрильная нейтропения 3 класса, а также показатели уровня гемоглобин 4 класса после получения 1 дозы. Фебрильная нейтропения была сочтена предположительно связанной с лечением, поскольку возникла вскоре после введения первой дозы, тогда как перфорацию выстилки желудка сочли предположительно частично обуславливающей уровни гемоглобина 4 класса и не связанной с лечением. В конечном итоге, состояние пациента быстро ухудшилось, и он скончался через 4 недели после получения первой дозы.

[0330] Соответственно, хотя совокупные результаты свидетельствуют в пользу того, что 12 мг/кг представляет собой МПД, поскольку дозы 8-10 мг/кг лучше переносились в первом цикле и позволяли повторять циклы с минимальной токсичностью, клинические исследования II фазы для оценки указанных 2 уровней дозы продолжаются.

[0331] Нежелательные явления - 297 инфузий сацитузумаба говитекана вводили за 2-3 ч, при этом большинство исследователей предпочитали использовать медикаментозную подготовку перед каждой инфузией. Связанные с инфузией нежелательные явления отсутствовали. Хотя более чем у половины пациентов наблюдались утомляемость, тошнота, алопеция, диарея и нейтропения, которые были сочтены по меньшей мере предположительно связанными с лечением сацитузумабом говитеканом; в основном указанные явления относились к 1 и 2 классам (не показано). В основном зарегистрированная токсичность 3 или 4 класса была представлена нейтропенией (N равно 8), но при этом шестеро из указанных пациентов получали начальное лечение дозами 12 и 18 мг/кг. Фебрильная нейтропения возникла у 2 пациентов, у одного уже упомянутого пациента с РЖ #9, который получил только одну дозу 10 мг/кг, и у второго пациента с РПЖ (#19), который получил 4 дозы 12 мг/кг. Диарея у большинства пациентов была легкой: только у трех (12%) пациентов наблюдалась диарея 3 класса. Два случая наблюдались для уровня дозы 12 мг/кг, один - после получения 4 доз, и другой после получения первой дозы, однако указанный пациент получил еще 6 доз 12 мг/кг, при этом была зарегистрирована только диарея 2 класса. После этого обоим пациентам был прописан безрецептурный противодиарейный препарат, и лечение продолжили. Другие виды значимой токсичности, ассоциированной с сацитузумабом говитеканом, отсутствовали, однако у двух пациентов была зарегистрирована сыпь 2 класса, и у 3 пациентов наблюдался прурит 1 класса.

[0332] Эффективность - Наилучший ответ устанавливали на основании данных об изменениях в целевых очагах поражения и времени до прогрессирования у пациентов, прошедших по меньшей мере одно КТ-обследование после лечения для измерения целевых очагов поражения (не показано). Четыре пациента, у которых заболевания прогрессировали, не представлены на графике, поскольку не проходили КТ-обследование в рамках последующего наблюдения (N = 1), или ввиду появления у них новых очагов и, соответственно, прогрессирования независимо от статуса целевых очагов поражения (N равно 3). В целом, у 3 пациентов наблюдалось более чем 30% уменьшение целевых очагов поражения (частичный ответ, ЧО). Двое из указанных пациентов (#3 и #15) прошли подтверждающие КТ-обследования в рамках последующего наблюдения, тогда как у третьего пациента (# 22) наблюдалось прогрессирование при следующем КТ-обследовании, проведенном 12 недель спустя. У 15 пациентов наилучший ответ был представлен стабильным заболеванием (СЗ), у 7 пациентов - прогрессированием (ПЗ), согласно критериям шкалы RECIST 1.1. Медианное время до прогрессирования с начала лечения для 24 пациентов (за исключением 1 пациента, который прошел только одну 1 лечебную процедуру и был отстранен) составляло 3,6 месяцев [диапазон: 1-12,8 месяца]; 4,1 месяца (диапазон: 2,6-12,8 месяца) для всех пациентов с СЗ или ЧО (N равно 18). Из девяти пациентов, которые прошли предшествующую терапию, включающую ингибитор топоизомеразы-I, у двоих наблюдалось значимое уменьшение целевых очагов поражения (28% и 38%), у 5 наблюдалось стабильное заболевание, в том числе у 2 из них - в течение продолжительных периодов (4,1 и 6,9 месяца, соответственно), тогда как у 2 пациентов наблюдалось прогрессирование при первой оценке.

[0333] Сравнение ВДП и выживаемости у указанных пациентов показывает, что для 16 пациентов выживаемость составила 15-20 месяцев с момента начала терапии, в том числе у двоих пациентов с 40 (пациенты 15 (ТНРМЖ) и 3 (РОПК), и четырех других с СЗ (2 с РОПК, 1 с ГРРПЖ, 1 с ТНРМЖ) (не показано). Радиологические ответы наблюдались у 2 пациентов, с более 30% уменьшением целевых очагов поражения (ЧО) (не показано).

[0334] Помимо 3 пациентов с наилучшим ответом, представленным 40, был отмечен ряд примечательных случаев продленного стабильного заболевания. У пациента возрастом 50 лет с ТНРМЖ (пациент 18; иммуногистологическая оценка экспрессии Trop-2 = 3+) наблюдалось 13% уменьшение после получения всего 3 доз, с достижением максимального уменьшения четырех целевых очагов поражения на 19% после получения 16 доз (сумма наибольших диаметров (SLD) снизилась с 7,5 до 6,1 см), до прогрессирования через 45 недель после начала лечения и получения 26 доз. У пациентки возрастом 63 года с РОПК (пациент 10; иммуногистологическая оценка 2+), 7 раз проходившей предшествующее лечение, в том числе прошедшей 3 отдельных курса со схемами, включавшими иринотекан, наблюдалось совокупное 23% уменьшение 5 целевых очагов поражения после получения 5 доз 10 мг/кг сацитузумаба говитекана, с достижением максимального 28% уменьшения после получения 18 доз. Уровни КЭА в плазме пациентки снизились до 1,6 нг/мл при базовом уровне 38,5 нг/мл. После получения 25 доз (27 недель) у пациентки произошло ПЗ с 20% увеличением SLD относительно минимальных значений. Интересно отметить, что уровень КЭА в плазме к моменту окончания лечения составлял всего 4,5 нг/мл. У пациента возрастом 68 лет с ГРРПЖ (пациент 20; иммуногистологическую оценку не проводили) присутствовало 5 целевых очагов поражения (13,3 см) и 5 нецелевых очагов поражения (3 метастаза в кости). Он получил 34 лечебные процедуры на протяжении периода 12,7 месяцев до прогрессирования, при этом уровни ПСА постепенно возрастали на протяжении указанного периода времени. В другом примечательном случае пациент - мужчина возрастом 52 лет с раком пищевода (пациент 25; иммуногистологическая оценка 3+) 6 раз проходил предшествующую терапию, в том числе прошел 6-месячную терапию согласно режиму FOLFIRI в качестве 3 курса лечения. Лечение начинали с дозы сацитузумаба говитекана 18 мг/кг, которая была снижена до 13,5 мг/кг из-за нейтропении. У пациента наблюдалось СЗ на протяжении периода продолжительностью 30 недель, до прогрессирования он получил 15 доз. Пациентка возрастом 60 лет с РПЖ (#11), с метастазами в печень, получала лечение дозами 10 мг/кг. Базовый титр СА19-9 в сыворотке у пациентки снизился с 5880 до 2840 единиц/мл после получения 8 доз, и наблюдалась стабилизация заболевания (наилучший ответ: 12% сокращение размеров) на протяжении периода продолжительностью 15 недель (11 доз) до обнаружения нового очага поражения. Тем не менее, поскольку уровни СА19-9 оставались пониженными (2814 единиц/мл), пациентка получила еще 8 лечебных процедур (в течение 3 месяцев) при дозе 10 мг/кг до выхода из исследования при прогрессировании целевых очагов поражения.

[0335] К настоящему моменту потенциальная полезность тестирования экспрессии Trop-2 в архивных образцах указанной небольшой выборки из 16 пациентов с разнообразными видами рака недостаточна для вынесения окончательных оценок, что связано в основном с повышенными уровнями экспрессии в большинстве из них.

[0336] ФК и иммуногенность - Концентрации сацитузумаба говитекана и IgG в образце 30-минутной сыворотки приведены в таблице 7, демонстрирующей общий тренд увеличения значений по мере увеличения дозы. В репрезентативном случае пациентка с ТНРМЖ (#15) получила несколько доз, начиная с дозы 12 мг/кг, с последующим снижением несколько раз на протяжении курса лечения. Концентрации IgG и сацитузумаба говитекана в 30-минутной сыворотке при введении нескольких доз, определенные с применением ИФА ELISA, были аналогичными на протяжении периода времени (не показано), опускаясь при снижении дозы. Остаточные концентрации IgG могли быть обнаружены в сыворотке, взятой непосредственно перед введением следующей дозы (с минимальной концентрацией образцы), однако сацитузумаб говитекан не детектировался (не показано).

[0337] Общая концентрация SN-38 в образце 30-минутной сыворотки пациента 15 составляла 3,930 нг/мл после введения первой дозы в цикле 1 (C1D1), однако после снижения лечебных доз сацитузумаба говитекана до 9,0 мг/кг для второй дозы первого цикла (C1D2) указанный уровень снижался до 2,947 нг/мл (не показано). Дальнейшее снижение до 2,381 нг/мл наблюдалась в 6 цикле, после дополнительного снижения дозы до 6,0 мг/кг. Количество свободного SN-38 в указанных образцах варьировало от 88 до 102 нг/мл (от 2,4% до 3,6% от общего SN-38), иллюстрируя тот факт, что больше 96% SN-38 в указанных образцах сыворотки с пиковой концентрацией был связан с IgG. Было проанализировано 28 образцов 30-минутной сыворотки от 7 пациентов с применением ВЭЖХ, при этом концентрации свободного SN-38 в указанных образцах в среднем составили 2,91±0,91% от общего SN-38. Концентрации свободного SN-38G, измеренные у 4 пациентов, ни разу не превысили уровней SN-38, и, как правило, были в несколько раз ниже. Например, у пациента #25 оценивали результаты определения в 30-минутном образце для 12 инъекций на протяжении 8 циклов лечения. При стартовой дозе 18 мг/кг в гидролизованном кислотой образце от указанного пациента содержалось 5,089 нг/мл SN-38 (общий SN-38); в негидролизованном образце содержалось всего 155,2 нг/мл (свободный SN-38; 3,0%). Содержание свободного SN-38G (глюкуронидированная форма) в указанном образце составляло 26,2 нг/мл, или всего 14,4% от общего содержания несвязанного SN-38 + SN-38G в указанном образце. Лечение пациента продолжали с дозой 13,5 мг/кг, при этом содержание SN-38 составляло в среднем 3309,8±601,8 нг/мл в 11 остальных гидролизованных кислотой образцах с пиковой концентрацией, причем содержание свободного SN-38 составляло в среднем 105,4±47,7 нг/мл (т.е. 96,8% было связано с IgG), а содержание свободного SN-38G составляло в среднем 13,9±4,1 нг/мл (11,6% от общего содержания SN-38 + SN-38G). Важно отметить, что почти у всех пациентов концентрации SN-38G в гидролизованных кислотой и негидролизованных образцах были аналогичными, что показывает, что SN-38, связанный с конъюгатом, был полностью неглюкуронидирован.

[0338] Ни у одного из указанных пациентов не наблюдался положительный базовый уровень (т.е. больше 50 нг/мл) или положительный ответ в виде антител против IgG или против SN-38 на протяжении курса лечения.

Обсуждение

[0339] Trop-2 в большом количестве экспрессируется во многих эпителиальных опухолях, являясь по этой причине представляющим интерес антигеном для таргетной терапии (Cubas et al., 2009, Biochim Biophys Acta 1796:309-14), поскольку, в частности, он считается прогностическим маркером и онкогеном при некоторых видах рака (Cardillo et al., 2011, Clin Cancer Res 17:3157-69; Ambrogi et al., 2014, PLoS One 9:e96993; Cubas et al., 2009, Biochim Biophys Acta 1796:309-14; Trerotola et al., 2013, Oncogene 32:222-33). Несмотря на то, что его экспрессия в нормальных тканях и взаимосвязь с другим хорошо изученным опухолеассоциированным антигеном, EpCam, стала причиной высказывания определенных опасений, касающихся безопасности разработки иммунотерапевтических средств, нацеленных на Trop-2 (Trerotola et al., 2009, Biochim Biophys Acta 1805:119-20), проведенные авторами настоящего изобретения исследования на яванских макаках, у которых экспрессия Trop-2 в тканях аналогична экспрессии у человека, показали, что сацитузумаб говитекан очень хорошо переносился при введении эквивалента дозы для человека, ~40 мг/кг (Cardillo et al., 2011, Clin Cancer Res 17:3157-69). При более высоких дозах у животных наблюдались нейтропения и диарея, известные побочные эффекты, ассоциированные с SN-38 при терапии иринотеканом, однако признаки значимых гистопатологических изменений в экспрессирующих Trop-2 нормальных тканях отсутствовали (Cardillo et al., 2011, Clin Cancer Res 17:3157-69). Соответственно, на основании результатов этих и других доклинических исследований, показывающих, что сацитузумаб говитекан обладал активностью при концентрациях в нижней области наномолярного диапазона и эффективностью в отношении ксенотрансплантатов различных эпителиальных опухолей человека в нетоксических дозах, было начато испытание фазы I на пациентах, один или более раз прошедших неуспешную стандартную терапию разнообразных метастатических эпителиальных опухолей.

[0340] Главное открытие, сделанное в ходе указанного исследования, заключалось в том, что, несмотря на использование более стандартного лекарственного средства, не рассматриваемого как ультратоксичное (лекарственные средства, активные в пикомолярном диапазоне; тогда как SN-38 активен при концентрациях в нижней области наномолярного диапазона), для конъюгата сацитузумаба говитекана анти-Trop-2-SN-38 клинически подтверждена терапевтическая активность в отношении широкого диапазона видов солидного рака в дозах, приводящих к умеренной и управляемой токсичности, демонстрируя, таким образом, высокий терапевтический индекс. В общем сложности было введено 297 доз сацитузумаба говитекана 25 пациентам без происшествий; 4 пациента получили больше 25 инъекций. Важно отметить, что ответ в виде антител против IgG hRS7 или SN-38 не был детектирован, даже у пациентов, проходивших несколько циклов лечения продолжительностью до 12 месяцев. Хотя Trop-2 экспрессируется в небольших количествах в различных нормальных тканях (Cardillo et al., 2011, Clin Cancer Res 17:3157-69), нейтропения была единственным видом дозолимитирующей токсичности, при этом 2 пациентам, получавшим больше или равно 12 мг/кг сацитузумаба говитекана, вводили вспомогательный миелоидный фактор роста, чтобы ускорить восстановление и позволить продолжение лечения пациентов, когда все остальные терапевтические опции были исчерпаны. При установленном МПД 12 мг/кг для дальнейшего расширения были выбраны уровни дозы 8,0 и 10,0 мг/кг, ввиду более вероятной переносимости дополнительных циклов у пациентов при использовании указанных уровней с минимальной поддерживающей терапией, и при указанных уровнях наблюдались ответы. Только у 2 из 13 пациентов (15,4%) при указанных уровнях дозы наблюдалась нейтропения 3 класса. Частота встречаемости нейтропении 3 и 4 класса при монотерапии иринотеканом, проводимой еженедельно или один раз в 3 недели в качестве терапии первой линии или второй линии, составляла 14-26% (камптосар - иринотекана гидрохлорид для инъекций, раствор (информация по применению, вкладыш в упаковку), Pfizer, 2012). При введении сацитузумаба говитекана только у 1 пациента при уровне дозы 10 мг/кг наблюдалась диарея 3 класса. Указанная частота встречаемости ниже, чем частота 31% у пациентов, получавших еженедельно ×4 дозы иринотекана, у которых наблюдалась поздняя диарея 3 и 4 классов (Камптосар - иринотекана гидрохлорид для инъекций, раствор (информация по применению, вкладыш в упаковку), Pfizer, 2012). Другие распространенные виды токсичности, приписываемые применению сацитузумаба говитекана, включали утомляемость, тошноту и рвоту, в большинстве случаев -1 и 2 классов, а также алопецию. При уровнях дозы 10 и 12 мг/кг также наблюдались два случая фебрильной нейтропении и один случай тромбоза глубоких вен 3 класса. Мониторинг UGT1A1 не начинали до завершения разведочного анализа доз, и, соответственно, оценка ее вклада в токсичность в настоящее время не может быть указана.

[0341] Пациентов, включенных в указанное испытание, не выбирали предварительно на основании экспрессии Trop-2, в основном постольку, поскольку иммуногистологические оценки микромассивов ткани разнообразных видов рака (таких как рак предстательной железы, молочной железы, поджелудочной железы, ободочной и прямой кишки, и рак легких) показали, что указанный антиген присутствовал в больше 90% образцов (не показано). Кроме того, Trop-2 не был обнаружен в сыворотке 12 пациентов с разнообразными видами метастатического рака, что, в свою очередь, предполагает, что анализ сыворотки может быть неподходящим для выбора пациентов. Хотя авторы изобретения предприняли усилия, направленные на получение архивных образцов опухолей пациентов, включенных в настоящее испытание, в настоящее время недостаточно данных, позволяющих предположить наличие корреляции выбора пациентов, основанного на иммуногистологическом окрашивании, с противоопухолевой активностью, поэтому обогащение выборки пациентов на основании экспрессии Trop-2 не проводилось.

[0342] При применении в качестве монотерапии сацитузумаб говитекан обладает хорошей противоопухолевой активностью у пациентов с разнообразными метастатическими, рецидивирующими/рефрактерными, эпителиальными опухолями, демонстрируя поддающееся оценке уменьшение целевых очагов поражения по результатам КТ и применения критериев RECIST1.1, в том числе обеспечивая продолжительную стабилизацию заболевания. У троих (12%) из 25 пациентов (по 1 пациенту с МРЛ [после прогрессирования при применении топотекана], ТНРМЖ и раком ободочной кишки) наблюдалось более 30% уменьшение целевых очагов поражения до прогрессирования через 2,9, 4,3 и 7,1 месяца, соответственно, после начала терапии. У 15 пациентов (60%) наблюдалось СЗ, при этом у 9 их них началось прогрессирование через более 4 месяцев после начала лечения. Ответы или стабилизация заболевания имели место у 7 из 9 пациентов, прошедших предшествующую терапию с включающим ингибитор топоизомеразы I лекарственным средством или режимом. У троих из них отсутствовал ответ на предшествующую терапию ингибитором топоизомеразы I (иринотеканом или топотеканом), при этом оказалось, что сацитузумаб говитекан был способен индуцировать сокращение размеров опухоли у двоих из них: на 13% у пациента с раком ободочной кишки и на 38% у другого пациента, с МРЛ. Соответственно, сацитузумаб говитекан может быть терапевтически активен у пациентов, прошедших неуспешную терапию или рецидивировавших после предшествующего применения режима с ингибитором топоизомеразы I, что будет исследовано позже в II фазе исследования с расширением.

[0343] Хотя среди включенных в указанное испытание пациентов было больше всего пациентов с распространенным раком протоков поджелудочной железы (N равно 7; медианное время до прогрессирования 2,9 месяцев]; диапазон: 1,0-4,0 месяцев), даже при указанном трудноизлечимом заболевании наблюдалось обнадеживающее уменьшение целевых очагов поражения и концентрации СА19-9 в сыворотке, предполагающие активность (Picozzi et al., 2014, данные представлены на специальной конференции AACR «Pancreatic Cancer: Innovations in Research and Treatment» («Рак поджелудочной железы: новые подходы в исследованиях и терапии»), Новый Орлеан, Лос-Анжелес, США, с. В99). Однако ответы у пациентов с ТНРМЖ и МРЛ представляют особенный интерес, учитывая потребность в показанной в этих случаях нацеленной терапии. Так, дополнительные частичные ответы у пациентов с ТНРМЖ (Goldenberg et al., 2014, данные представлены на Симпозиуме по раку молочной железы AACR, Сан-Антонио, Техас) и МРЛ (Goldenberg et al., 2014, Sci Transl Med), наблюдаемые в продолжающейся фазе расширения указанного испытания, предполагают, что указанным раковым заболеваниям стоит уделить дополнительное внимание, хотя также проводятся наблюдения за обнадеживающими ответами при НМРЛ, АКП, РМП и РОПК. Так, согласно недавно поступившим новым сведениям, в продолжающемся испытании сацитузумаба говитекана у 17 пациентов с ТНРМЖ, исследованных к настоящему времени, наблюдался общий показатель ответа (ЧО) 29%, при уровне клинических преимуществ 46% (ЧО + СЗ больше или равно 6 месяцев). Долгосрочное выживание (15-20 месяцев) наблюдалась почти у 25% (6/25) исследованных пациентов, и включало 2 пациентов с 40 и 4 пациентов с СЗ, в том числе пациентов с ТНРМЖ (N равно 2), РОПК (N равно 3) и ГРРПЖ (N равно 1).

[0344] Анализ образцов сыворотки через 30 мин после окончания инфузии показал, что больше 96% SN-38 было связано с IgG. Более подробные данные фармакокинетики станут доступны после завершения II фазы испытания. В анализе ВЭЖХ в сыворотке также детектированы только следовые количества свободного SN-38G, тогда как при терапии иринотеканом AUC для менее активного SN-38G более 4,5 раз выше, чем для SN-38 (Xie et al., 2002, J Clin Oncol 20:3293-301). Сравнение доставки SN-38 у несущих опухоли животных, которые получали сацитузумаб говитекан и иринотекан, показало, что связанный с IgG SN-38 неглюкуронидирован, тогда как у животных, которые получали иринотекан, больше 50% общего SN-38 в сыворотке глюкуронидировано (Goldenberg et al., 2014, J Clin Oncol 32: Abstract 3107). Что более важно, анализ показал, что при введении сацитузумаба говитекана концентрации SN-38 в ксенотрансплантатах рака поджелудочной железы человека Capan-1 были примерно в 135 раз выше, чем при введении иринотекана (Goldenberg et al., 2014, Sci Transl Med). Соответственно, сацитузумаб говитекан отличается несколькими явными преимуществами по сравнению с ненацеливающими формами ингибиторов топоизомеразы-I: (i) механизм селективного удерживания конъюгата в опухоли (связывание Trop-2) и (ii) предположительно, полная защита нацеленного SN-38 (т.е. неглюкуронидированная лактонная форма), таким образом, весь SN-38, накопленный опухолевыми клетками либо за счет прямой интернализации конъюгата, либо путем высвобождения в микроокружение опухоли из конъюгата, связанного с опухолью, находится в наиболее активной форме. Эти результаты показывают, что умеренно токсичный и при этом хорошо изученный цитотоксический агент, SN-38, может быть эффективен при применении в составе нацеленного на опухоль ADC, такого как сацитузумаб говитекан. При этом за счет введения ADC, содержащего умеренно токсичное лекарственное средство, конъюгированное с высоким отношением лекарственное средство : антитело (7,6:1), SN-38 может быть доставлен в целевые раковые образования в более высоких концентрациях, на что указывает концентрация SN-38 при применении сацитузумаба говитекана, повышенная по сравнению с концентрацией SN-38, высвобождаемого из иринотекана.

[0345] Подводя итоги, указанные результаты I фазы показали, что сацитузумаб говитекан переносился при умеренной и управляемой токсичности, полностью связанной с активностью SN-38, без признаков повреждения нормальных тканей, которые, по имеющимся данным, содержат Trop-2. Важно отметить, что сацитузумаб говитекан был активен у пациентов с разнообразными видами метастатических солидных опухолей, даже после неуспешной предшествующей терапии ингибиторами топоизомеразы-I. Соответственно, указанные начальные результаты свидетельствуют, что сацитузумаб говитекан обладает высоким терапевтическим индексом даже для пациентов с опухолями, для которых отсутствуют данные об ответах на ингибиторы топоизомеразы I, например, МРЛ и ТНРМЖ. Указанное клиническое испытание продолжается с фокусом на стартовых дозах 8 и 10 мг/кг у пациентов с ТНРМЖ, МРЛ и другими видами Trop-2⁺ рака.

Пример 16. Применение IMMU-132 при раке молочной железы с тройным негативным фенотипом (ТНРМЖ)

[0346] Ген Trop-2/TACSTD2 был клонирован (Fornaro et al., 1995, Int J Cancer 62:610-18), и было обнаружено, что он кодирует трансмембранный переносчик Са⁺⁺-сигнала (Basu et al., 1995, Int J Cancer 62:472-72; Ripani et al., 1998, Int J Cancer 76:671-76), функционально связанный с миграцией клеток и независимым от подложки ростом, с более высокими по сравнению с нормальными тканями уровнями экспрессии в различных видах эпителиального рака человека, в том числе карциномах молочной железы, легкого, желудка, ободочной и прямой кишки, поджелудочной железы, предстательной железы, шейки матки, головы и шеи, и яичников (Cardillo et al., 2011, Clin Cancer Res 17:3157-69; Stein et al., 1994; Int J Cancer Suppl 8:98-102; Cubas et al., 2009, Biochim Biophys Acta 196:309-14; Trerotola et al., 2013, Oncogene 32:222-33). Повышенная экспрессия Trop-2, как было описано, необходима и достаточна для стимуляции ракового роста (Trerotola et al., 2013, Oncogene 32:222-33), а бицистронная химерная мРНК циклина D1-Trop-2 является онкогеном (Guerra et al., 2008, Cancer Res 68:8113-21). Важно отметить, что повышенная экспрессия была ассоциирована с более агрессивным заболеванием и неудовлетворительным прогнозом для нескольких типов рака (Cubas et al., 2009, Biochim Biophys Acta 196:309-14; Guerra et al., 2008, Cancer Res 68:8113-21; Bignotti et al., 2010, Eur J Cancer 46:944-53; Fang et al., 2009, Int J Colorectal Dis 24:875-84; Muhlmann et al., 2009, J Clin Pathol 62:152-58), в том числе рака молочной железы (Ambrogi et al., 2014, PLoS One 9:e96993; Lin et al., 2013, Exp Mol Pathol 94:73-8). Повышенный уровень мРНК Trop-2 представляет собой сильный прогностический фактор неудовлетворительной выживаемости и метастазирования в лимфоузлы у пациентов с инвазивным раком протоков молочной железы; кривые выживания Каплана-Майера показывают, что продолжительность выживаемости пациентов с раком молочной железы при высокой экспрессии Trop-2 была значимо меньше (Lin et al., 2013, Exp Mol Pathol 94:73-8).

Способы

[0347] Определение DAR с применением HIC - Клинические партии IMMU-132 анализировали с применением хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC) на ВЭЖХ-колонке с бутил-NPR (Tosoh Bioscience, Кинг-оф-Пруссия, Пенсильвания). Введенный IMMU-132 (100 мкг) разрешали в линейном градиенте концентрации 2,25-1,5 М NaCl в 25 мМ фосфате натрия, рН 7,4, в течение 15 минут при скорости 1 мл/мин и комнатной температуре.

[0348] Определение DAR с применением ЖХ-МС - Поскольку межцепочечные дисульфиды восстанавливают и полученные сульфгидрильные группы используют для конъюгации лекарственного средства (или блокируют), тяжелые и легкие цепи разрешали во время ЖХ-МС анализа без добавления восстанавливающих агентов, и анализировали независимо. IMMU-132 из разных партий вводили в систему ВЭЖХ серии Agilent 1200 с колонкой для ВЭЖХ Aeris Widepore С4 с обращенной фазой (3,6 мкМ, 50×2,1 мм) и разрешали с применением ВЭЖХ с обращенной фазой в линейном градиенте концентрации 30-80% ацетонитрила в 0,1% муравьиной кислоты в течение 14 минут. Проводили времяпролетный масс-спектрометрический анализ с ионизацией в электроспрее (ESI-TOF) на встроенном масс-спектрометре Agilent 6210 ESI-TOF с установленным на капилляре, фрагменторе и скиммере напряжением 5000В, 300В и 80В, соответственно. Полный пик ОФ-ВЭЖХ, соответствующий всем продуктам каппа-цепей или тяжелых цепей, использовали для деконволюции масс-спектров.

[0349] Линии клеток - Все линии клеток рака человека, используемые в указанном исследовании, приобретали в Американской коллекции типовых культур (Манассас, Виргиния), если не указано иное; все они были аутентифицированы с применением анализа коротких тандемных повторов (STR) от АТСС.

[0350] Поверхностная экспрессия Trop-2 на различных линиях клеток карциномы молочной железы человека - Анализ экспрессии Trop-2 на поверхности клеток на основе проточной цитометрии. Вкратце, клетки собирали с применением раствора аккутазы для отсоединения клеток (Becton Dickinson (BD); Франклин Лейке, Нью-Джерси; Кат. №561527) и анализировали экспрессию Trop-2 с применением ФЭ-конъюгированных гранул QuantiBRITE (BD Кат. №340495) и ФЭ-конъюгированного антитела против Trop-2 (eBiosciences, Кат. №12-6024), следуя инструкциям производителя. Данные регистрировали на проточном цитометре FACSCalibur (BD) в программном обеспечении CellQuest Pro, проводя анализ с применением программного обеспечения Flowjo (Tree Star; Эшленд, Орегон).

[0351] Тестирование цитотоксичности in vitro - Чувствительность к SN-38 определяли с применением анализа восстановления красителя 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2Н-тетразолия (анализ восстановления красителя MTS; Promega, Мэдисон, Висконсин). Вкратце, клетки высевали в 96-луночные прозрачные плоскодонные планшеты как описано выше. SN-38, растворенный в ДМСО, разводили средой до конечной концентрации от 0,004 до 250 нМ. Планшеты инкубировали в увлажненной камере в течение 96 ч при 37°С/5% СО₂, после чего добавляли краситель MTS и возвращали в инкубатор до момента превышения показателем поглощения необработанных контрольных клеток значения 1,0. Ингибирование роста измеряли как процент роста относительно необработанных клеток. Кривые зависимости ответа от дозы получали с использованием значений среднего для результатов трех измерений, и вычисляли значения IC₅₀ с применением ПО Prism GraphPad.

[0352] Тестирование специфичности in vitro с помощью проточной цитометрии на окрашенных rH2AX клетках - Для тестирования активности лекарственного средства, клетки линий ТНРМЖ НСС1806 и НСС1395 высевали в 6-луночные планшеты с плотностью 5×10⁵ клеток/лунку и выдерживали при 37°С в течение ночи. После охлаждения в течение 10 мин на льду клетки инкубировали либо с IMMU-132, либо с hA20 против CD20-SN38 в концентрации ~20 мкг/мл (равное количество SN38 на лунку для обоих агентов) в течение 30 минут на льду, троекратно промывали свежей средой, и возвращали в условия 37°С на ночь. Клетки подвергали непродолжительной трипсинизации, осаждали центрифугированием, фиксировали в 4% формалине в течение 15 минут, затем промывали и пермеабилизовали в 0,15% Triton-Х100 в ФСБ на протяжении еще 15 минут. После двукратного промывания 1% бычьим сывороточным альбумином/ФСБ клетки инкубировали с антителом мыши против rH2AX AF488 (EMD Millipore Corporation, Темекула, Калифорния) в течение 45 минут при 4°С. Интенсивность сигнала rH2AX измеряли с помощью проточной цитометрии на BD FACSCalibur (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния).

[0353] Иммуногистохимический анализ Trop-2 в микромассивах опухолей и образцах от пациентов - Анализ включал применение стандартных методов иммуногистохимического исследования срезов тканей и микромассивов. Оценка уровня окрашивания была основана на интенсивности окрашивания больше 10% опухолевых клеток в составе образцов, и включали отрицательный результат, 1+ (слабое окрашивание), 2+ (умеренное окрашивание), и 3+ (интенсивное окрашивание).

[0354] Терапевтические исследования in vivo в моделях с ксенотрансплантатами - В дозе 250 мкг ADC для мыши с массой тела 20 граммов (12,5 мг/кг) содержится количество эквивалентов SN-38, равное 0,2 мг/кг SN-38. В случае иринотекана (иринотекан-HCl для инъекций; AREVA Pharmaceuticals, Inc., Элизабеттаун, Кентукки), 10 мг/кг иринотекана соответствуют 5,8 мг/кг SN-38 из расчета по массе.

[0355] Иммуноблоттинг - Клетки (2×10⁶) высевали в 6-луночные планшеты и оставляли на ночь. На следующий день их обрабатывали либо SN-38, либо IMMU-132 при концентрации эквивалентов SN-38 0,4 мкг/мл (1 мкМ) в течение 24 и 48 ч. Исходные hRS7 применяли в качестве контроля для ADC.

[0356] Количественное определение SN-38 у мышей с ксенотрансплантатами опухоли человека - В двух группах, каждая из которых включала 15 животных, несущих подкожные имплантаты клеток линии карциномы поджелудочной железы человека, вводили либо иринотекан, либо IMMU-132. В каждой группе с 5 разными интервалами умерщвляли по 3 животных. Опухоли Capan-1 (0,131 ± 0,054 г; N равно 30) извлекали и гомогенизировали в деионизированной воде (ДИ) (1 часть ткани + 10 частей ДИ-воды); сыворотку разводили равным количеством ДИ-воды. Гомогенаты сыворотки и тканей экстрагировали и анализировали с применением ВЭЖХ с обращенной фазой (ОФ-ВЭЖХ). Для детекции продуктов в образцах от получавших лечение иринотеканом животных достаточно было экстрагировать образцы, тогда как образцы от животных, получавших IMMU-132, разделяли на 2 части, одну из которых подвергали гидролизу кислотой для высвобождения всего связанного с IgG SN-38, который иначе не мог бы быть детектирован в экстрагированных образцах.

[0357] Статистика - Статистический анализ выполняли с применением GraphPad Prism версии 5.00 для Windows, GraphPad Software, Ла-Хойя, Калифорния, США. Для каждого исследования определяют специфические параметры проведения тестирования.

Результаты

[0358] Структура и свойства SN-18 - В IMMU-132 задействован ингибитор топоизомеразы I, SN-38, водорастворимый метаболит противоракового камптотецинового агента иринотекана (7-этил-10-[4-(1-пиперидино)-1-пиперидино]карбонилоксикамптотецина), терапевтически активного при раке ободочной и прямой кишки, легкого, шейки матки и яичников (Garcia-Carbonero et al., 2002, Clin Cancer Res 8:641061). Важное преимущество при выборе SN-38 заключается в том, что фармакологические характеристики указанного лекарственного средства in vivo хорошо известны. Иринотекан должен быть расщеплен эстеразами для образования SN-38, который на 2-3 порядка мощнее иринотекана, с активностью в нижней области наномолярного диапазона (Kawato et al., 1991, Cancer Res 51:4187-91). При физиологических значениях рН камптотецины существуют в равновесном состоянии, включающем более активную лактонную форму и менее активную (10% мощности) открытую карбокислотную форму (Burke & Mi, 1994, J Med Chem 37:40-46).

[0359] Дизайн производного SN-38, задействованного в IMMU-132, CL2A-SN-38, позволял решить ряд проблем, возникающих при применении указанного лекарственного средства в формате ADC, и включал следующие признаки: (i) в кросс-линкер помещали короткий фрагмент полиэтиленгликоля (ПЭГ) для придания водорастворимости указанному крайне плохо растворимому лекарственному средству; (ii) вводили малеимидную группу для быстрой тиол-малеимидной конъюгации с мягко восстановленным антителом, при специально разработанной процедуре синтеза, обеспечивающей высокоэффективное включение малеимида в контексте формирования карбонатной связи; (iii) бензилкарбонатный сайт обеспечивал сайт рН-опосредованного расщепления для отсоединения от линкера и высвобождения лекарственного средства; и (iv) что важно, кросс-линкер был присоединен к SN-38 в 20-гидрокси-положении, предохраняя лактонное кольцо лекарственного средства от раскрытия с образованием менее активной карбоксикислотной формы в физиологических условиях (Giovanella et al., 2000, Ann NY Acad Sci 922:27-35). Синтез производных SN-38 и конъюгация CL2A-SN-38 с мягко восстановленным IgG hRS7 были описаны выше. При процедуре ограниченного восстановления происходят разрывы только межцепочечных дисульфидных мостиков между тяжелыми и между тяжелыми/легкими цепями, однако не дисульфидов внутри доменов, с получением 8 сайт-специфических тиолов на молекулу антитела. Затем его конъюгируют с CL2A-SN-38, очищенным диафильтрацией, и лиофилизируют для хранения. В процессе получения условия корректируют таким образом, чтобы минимизировать любые потери SN-38 из IMMU-132, так что итоговый лиофилизированный продукт стабильно содержит меньше 1% свободного SN-38 после восстановления. Однако при добавлении в сыворотку и выдерживании при 37°С SN-38 высвобождается из конъюгата со временем полужизни ~1 день (не показано).

[0360] Высвобождение SN-38, по-видимому, представляет собой важный признак IMMU-132, при этом указанный тип линкера был выбран на основании исследований эффективности, в ходе которых тестировали SN-38, конъюгированный с различными линкерами, обеспечивающими разную скорость высвобождения SN-38, от высвобождающих SN-38 с временем полужизни ~10 ч до высокостабильных (Moon et al., 2008(30, 31). Оптимальная терапевтическая активность была обнаружена у конъюгата с промежуточной скоростью высвобождения в сыворотке, составляющей ~2 дня. Затем авторы настоящего изобретения усовершенствовали способ изготовления указанного типа линкера, обозначаемого CL2A, путем удаления остатка фенилаланина (Cardillo et al., 2011, Clin Cancer Res 17:3157-64), а затем повторно сравнили эффективность с эффективностью другого стабильно-связанного конъюгата против Trop-2 (CL2), который был разработан для высвобождения SN-38 исключительно в условиях лизосом (т.е. в присутствии катепсина В при рН 5,0). В моделях на животных конъюгат против Trop-2 с линкером CL2A давал лучшие терапевтические ответы по сравнению со стабильно связанным SN-38, что показывает, что даже быстро интернализующиеся антитела приобретают преимущество, если обеспечить высвобождение SN-38 в сыворотке со временем полужизни ~1 день (Govidan et al. 2013, Mol Cancer Ther 12:968-78). Так как в клинических исследованиях с мечеными радиоактивной меткой антителами было обнаружено, что антитела локализуются в опухолях в течение нескольких часов, достигая пиковых концентраций в течение 1 дня (Sharkey et al., 1995, Cancer Res 55:5935s-45s), избирательная локальная доставка SN-38 в повышенных концентрациях в опухоли происходит за счет интернализации интактного конъюгата, внеклеточного высвобождения свободного лекарственного средства, или обоих механизмов в совокупности.

[0361] Определение отношения количества лекарственного средства к количеству антитела (DAR). Пять клинических партий IMMU-132 оценивали с применением ВЭЖХ гидрофобных взаимодействий (HIC-ВЭЖХ), дававшей три пика, соответствующие продуктам с DAR 6, 7 и 8, при этом самая большая фракция содержала продукт с DAR = 8 (не показано). Указанный способ изготовления обеспечивал стабильное получение IMMU-132 с общим DAR (DAR_AVE) 7,60±0,03 для пяти клинических партий (не показано). HIC-ВЭЖХ результаты подтверждали с применением жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией (ЖХ-МС) (не показано). Указанный анализ показал, что больше 99% из 8 доступных сульфгидрильных групп были соединены линкером CL2A, с SN-38 или без него. Незамещенные (или кэпированные N-этилмалеимидом) тяжелые или легкие цепи детектированы не были. Соответственно, различие DAR среди продуктов является результатом отсоединения SN-38 от линкера в процессе получения, а не более низкого начального коэффициента замещения. После получения и лиофилизации IMMU-132 сохранял стабильность на протяжении нескольких лет.

[0362] Эффект DAR на фармакокинетику и противоопухолевую эффективность у мышей. Мышам, несущие Trop-2⁺ ксенотрансплантаты карциномы желудка человека (NCI-N87), 2 раза с интервалом 7 дней вводили равные дозы белковых эквивалентов (0,5 мг) IMMU-132 с DAR, составляющим 6,89, 3,28 или 1,64 (не показано). У животных, получавших лечение ADC с DAR 6,89, наблюдалось значимое увеличение медианного времени выживания (MST) по сравнению с мышами, которые получали ADC с DAR 3,38 или DAR 1,64 (MST = 39 дней против 25 и 21 дней, соответственно; Р меньше 0,0014). Между группами, получавшими лечение конъюгатами с DAR 3,28 или DAR 1,64, и контрольной группой, получавшей солевой раствор, различия отсутствовали.

[0363] Для дополнительного изучения важности более высокого DAR, мышам, несущим опухоли желудка NCI-N87, вводили 0,5 мг IMMU-132 с DAR 6,89 два раза в неделю на протяжении двух недель (не показано). Другая группа дважды получала дозу белка (1 мг) конъюгата IMMU-132 с DAR 3,28. Хотя обе группы получили одно и то же общее количество SN-38 (36 мкг) в каждой схеме дозирования, у получавших лечение конъюгатом с DAR 6,89 животных наблюдалось значимо более выраженное ингибирование роста опухоли, чем у несущих опухоли животных, получавших лечение конъюгатом с DAR 3,28 (Р = 0,0227; AUC). Кроме того, лечение конъюгатом с более низким DAR значимо не отличалось от контрольного отсутствия лечения. В совокупности, указанные исследования показывают, что более низкое значение DAR приводит к уменьшению эффективности.

[0364] Изучение фармакокинетического поведения полученных конъюгатов с указанными разными значениями отношения проводили на не несущих опухолей мышах, получавших по 0,2 мг каждого конъюгата, неконъюгированного IgG hRS7 или IgG hRS7, восстановленного и затем кэпированного N-этилмалеимидом. Взятие сыворотки осуществляли с 5-минутными интервалами, с 0,5 до 168 часов, и анализировали с применением ИФА ELISA на IgG hRS7. Значимые различия выведения указанных конъюгатов и неконъюгированного IgG отсутствовали (не показано). Соответственно, уровень замещения не влиял на фармакокинетику конъюгатов, и, что не менее важно, восстановление межцепочечных дисульфидных связей, по-видимому, не дестабилизировало антитело.

[0365] Экспрессия Trop-2 при ТНРМЖ и чувствительность к SN-38. Экспрессию Trop-2 определяли путем иммуногистохимического исследования (IHC) в нескольких микромассивах ткани из образцов опухолей человека. В одном микромассиве, содержащем 31 образец ТНРМЖ, а также 15 образцов гормон-рецептор-положительного или HER-2-положительного рака молочной железы, окрашивание проявлялось более чем в 95% опухолей, с уровнем окрашивания 3+ в 65% случаев.

[0366] В таблице 8 перечислены 6 линий клеток рака молочной железы человека, в том числе четыре ТНРМЖ, с описанием поверхностной экспрессии Trop-2 и чувствительности к SN-38. Поверхностная экспрессия Trop-2 в 5 из указанных 6 линий клеток превышала 90000 копий на клетку. Мощность SN-38 варьировала от 2 до 6 нМ в 5 из указанных 6 линий клеток, а клетки MCF-7 имели самую низкую чувствительность, 33 нМ. Мощность IMMU-132 in vitro не указана, поскольку почти весь SN-38, ассоциированный с IMMU-132, высвобождается в среду во время 4-дневного периода инкубации, и, соответственно, мощность аналогична показателям для SN-38. Соответственно, для иллюстрации важности нацеливания антитела как механизма доставки SN-38 требовалось другая стратегия.

[0367] Клетки антиген-положительных (НСС1806) или антиген-отрицательных (НСС1395) линий клеток ТНРМЖ инкубировали при 4°С в течение 30 минут либо с IMMU-132, либо с несвязывающим конъюгатом против CD20 SN-38. Затем клетки промывали для удаления несвязанного конъюгата, после чего инкубировали в течение ночи при 37°С. Клетки фиксировали и пермеабилизовали, а затем окрашивали флуоресцентным антителом против фосфорилированных гистонов Н2А.Х для детекции разрывов дцДНК с помощью проточной цитометрии (Bonner et al., 2008, Nat Rev Cancer 8:957-67) (таблица 9). Медианная интенсивность флуоресценции (MFI) клеток Trop-2⁺ линии рака молочной железы, НСС1806, при инкубации с IMMU-132 увеличивалась с 168 (базовый показатель без обработки) до 546, что указывает на присутствие большего числа разрывов дцДНК, тогда как MFI для клеток, инкубированных с несвязывающим конъюгатом, оставалась на базовых уровнях. И напротив, MFI для отрицательной по антигену Trop-2 линии клеток, НСС1395, оставалась на базовых уровнях после обработки как IMMU-132, так и несвязывающим контрольным конъюгатом. Соответственно, на специфичность IMMU-132 по сравнению с нерелевантным ADC убедительно указывают данные о разрывах дцДНК только в Trop-2-экспрессирующих клетках, инкубированных со связывающим конъюгатом против Trop-2.

[0368] Эффективность сацитузумаба говитекана in vivo в ксенотрансплантатах ТНРМЖ. Оценивали эффективность IMMU-132 у мышей Nude, несущих опухоли ТНРМЖ MDA-MB-468 (не показано). IMMU-132 в дозе 0,12 или 0,20 мг/кг эквивалентов SN-38 (0,15 и 0,25 мг IMMU-132/дозу) индуцировал значимый регресс опухоли по сравнению с солевым раствором, иринотеканом (10 мг/кг; ~5,8 мг/кг эквивалентов SN-38 по массе) или контрольным ADC против CD20, hA20-CL2A-SN-38, при введении при тех же 2 уровнях дозы (Р меньше 0,0017, площадь под кривой, AUC). Поскольку у мышей конверсия иринотекана в SN-38 происходит более эффективно, чем у человека (38) (в исследованиях авторов настоящего изобретения она в среднем составляла ~25%, см. ниже), при указанной дозе иринотекана образуется ~145-174 мкг SN-38, тогда как введенная доза IMMU-132 содержала только 9,6 мкг. Тем не менее, поскольку IMMU-132 селективно нацеливал SN-38 на опухоли, он был более эффективен. Указанные результаты подтверждают данные для других моделей солидных опухолей (Cardillo et al., 2011, Clin Cancer Res 17:3157-69), показывая, что специфическое нацеливание незначительного количества SN-38 в опухоль с помощью IMMU-132 гораздо более эффективно, чем значительно более высокая доза иринотекана или даже смесь IgG hRS7 с равным количеством свободного SN-38 (Cardillo et al., 2011, Clin Cancer Res 17:3157-69). Неконъюгированное антитело RS7, даже при многократном введении доз 1 мг на животное, не проявляло каких-либо противоопухолевых эффектов (Cardillo et al., 2011, Clin Cancer Res 17:3157-69). Однако в исследованиях in vitro гинекологического рака, экспрессирующего Trop-2, продемонстрирован киллинг клеток mAb RS7 за счет антителозависимой клеточной цитотоксичности (Bignotti et al., 2010, Eur J Cancer 46:944-53; Raji et al., 2011, J Exp Clin Cancer Res 30:106; Varughese et al., 2011, Gynecol Oncol 122:171-7; Varughese et al., 2011, Am J Obstet Gyneol 205:567). Также был описан моновалентный Fab-фрагмент другого антитела против Trop-2, терапевтически активный in vitro и в исследованиях на животных.

[0369] На 56 день терапии четыре из семи опухолей у мышей, получавших 0,12 мг/кг контрольного ADC hA20-CL2A-SN-38, уже прогрессировали до конечной точки 1,0 см³ (не показано). В этот момент проводили лечение указанных животных IMMU-132, с выбором более высокой дозы 0,2 мг/кг, чтобы попытаться повлиять на прогрессирование указанных значительно увеличенных опухолей. Несмотря на существенный размер опухолей у нескольких животных, все мыши демонстрировали терапевтический ответ, со значительным уменьшением размеров опухолей спустя пять недель (общий объем [ОО] = 0,14±0,14 см³ против 0,74±0,41 см³, соответственно; Р=0,0031, двусторонний t-тест). Аналогичным образом, авторы настоящего изобретения выбрали двоих животных из получавшей лечение иринотеканом группы с опухолями, прогрессировавшими до ~0,7 см³, и провели повторное лечение одной мыши иринотеканом, а другой - IMMU-132 (не показано). В течение 2 недель после окончания лечения опухоль у получавшего лечение иринотеканом животного уменьшалась на 23%, а затем начала прогрессировать, тогда как опухоль у получавшего лечение IMMU-132 животного стабилизировалась при 60% уменьшении размера. Указанные результаты демонстрируют, что даже для опухолей, рост которых продолжался после воздействия SN-38 из неспецифического ADC, мог быть достигнут значимо улучшенный терапевтический ответ при проведении лечения Trop-2-специфическим IMMU-132. Однако специфические терапевтические эффекты IMMU-132 не были достигнуты в случае MDA-MB-231 (не показано). Указанная линия клеток отличается не только самыми низкими уровнями Trop-2, но и самой низкой чувствительностью к SN-38.

[0370] Механизм действия IMMU-132 при ТНРМЖ - Апоптотический путь, который задействует IMMU-132, исследовали в линии клеток ТНРМЖ, MDA-MB-468, и в линии HER2⁺-клеток SK-BR-3, для подтверждения того, что функция ADC основана на входящем в его состав SN-38 (не показано). SN-38 по отдельности и IMMU-132 опосредовали более чем 2-кратную положительную регуляцию p21^WAF1/Cip1 в пределах периода 24 ч в MDA-MB-468, а через 48 ч количество p21^WAF1/Cip1 в указанных клетках начинало уменьшаться (31% и 43% для SN-38 или IMMU-132, соответственно). Интересно, что в опухолевой HER2⁺-линии SK-BR-3 ни SN-38, ни IMMU-132 не опосредовали положительную регуляцию p21^WAF1/Cip1, превышающую конститутивные уровни, в первые 24 часа, однако, как и в клетках MDA-MB-468, через 48 часов воздействия SN-38 или IMMU-132 количество p21^WAF1/Cip1 уменьшалось более чем на 57%. И SN-38, и IMMU-132 обеспечивали расщепление прокаспазы-3 на активные фрагменты в пределах периода 24 ч, однако больший уровень активных фрагментов наблюдался после воздействия в течение 48 ч. Примечательно, что в обеих линиях клеток IMMU-132 опосредовал большую степень расщепления прокаспазы-3, с максимальным наблюдаемым уровнем через 48 ч, по сравнению с клетками, на которые воздействовали SN-38. Наконец, и SN-38, и IMMU-132 опосредовали расщепление поли(АДФ-рибоза)-полимеразы (PARP), начинающееся через 24 ч, с практически полным расщеплением через 48 ч. В совокупности указанные результаты подтверждают, что механизм действия IMMU-132 аналогичен механизму действия свободного SN-38 при введении in vitro.

[0371] Доставка SN-38 с помощью IMMU-132 или иринотекана в модели ксенотрансплантат опухоли человека - Составляющие продукты, происходящие из иринотекана или IMMU-132, определяли в сыворотке и опухолях мышей с имплантированным и/к ксенотрансплантатом рака поджелудочной железы человека (Capan-1), которым вводили иринотекан (773 мкг; 448 мкг эквивалентов SN-38) и IMMU-132 (1,0 мг; 16 мкг эквивалентов SN-38).

[0372] Иринотекан очень быстро выводился из сыворотки, с наблюдаемой в пределах 5 минут конверсией в SN-38 и SN-38G. Через 24 часа не детектировался ни один из указанных продуктов. Значения AUC на протяжении 6 часового периода составляли 21,0, 2,5 и 2,8 мкг/мл⋅ч для иринотекана, SN-38 и SN-38G, соответственно (показатель конверсии SN-38 у мышей = [2,5+2,8)/21=25,2%]). У животных, получавших IMMU-132, наблюдались значительно более низкие концентрации свободного SN-38 в сыворотке, однако они детектировались в течение 48 ч (не показано). Свободный SN-38G был детектирован только через 1 и 6 ч, и его концентрация была в 3-7 раз ниже концентрации свободного SN-38.

[0373] В опухолях Capan-1, извлеченных из организма получавших лечение иринотеканом животных, уровни иринотекана оставались высокими на протяжении 6 ч, однако становились недетектируемыми через 24 ч (AUC_{5 мин - 6 ч} = 48,4 мкг/г⋅ч). Уровень SN-38 был значительно ниже и детектировался только через 2 ч (т.е. AUC_{5 мин - 2 ч} = 0,4 мкг/г⋅ч), при этом значения для SN-38G были почти в 3 раза выше (AUC = 1,1 мкг/г⋅ч) (не показано). Опухоли животных, получавших IMMU-132, не содержат каких-либо детектируемых уровней свободного SN-38 или SN-38G, при этом весь SN-38 в опухоли, напротив, связан с IMMU-132. Важно отметить, что отсутствие в указанных опухолях детектируемого SN-38G предполагает, что SN-38, связанный с IMMU-132, не был глюкуронидирован. AUC для связанного с IMMU-132SN-38 в указанных опухолях соответствовала 54,3 мкг/г⋅ч, что в 135 раз больше количества SN-38 в опухолях животных, получавших лечение иринотеканом, на протяжении 2-часового периода, когда SN-38 мог быть детектирован, несмотря на то, что мыши, которым вводили иринотекан, получали в 28 раз больше эквивалентов SN-38, чем мыши, которым вводили IMMU-132 (т.е. 448 или 16 мкг эквивалентов SN-38, соответственно)

Обсуждение

[0374] Авторы настоящего изобретения описали новый ADC, нацеленный на Trop-2, и ранние клинические результаты предполагают, что оно хорошо переносится и является эффективным у пациентов с ТНРМЖ, а также другими Trop-2⁺ видами рака (Bardia et al., 2014, San Antonio Breast Cancer Symposium, P5-19-27). Благодаря присущим IMMU-132 особенностям он представляет собой ADC второго поколения. Как правило, требуется оптимальная эффективность 4 обобщенных атрибутов ADC: (i) селективности нацеливания/активности; (ii) связывания, аффинности, интернализации и иммуногенности антитела, задействованного в ADC; (iii) лекарственного средства, его мощности, метаболизма и фармакологического распределения, и (iv) характера связывания лекарственного средства с антителом. Селективность в отношении мишени является наиболее общим требованием для всех ADC, поскольку она играет основную роль в определении терапевтического индекса (отношение токсичности для опухоли к токсичности для нормальных клеток). Trop-2, по-видимому, широко распространен в некоторых видах эпителиального рака, однако также экспрессируется в некоторых нормальных тканях (Cubas et al., 2009, Biochim Biophys Acta 1796:309-14; Trerotola et al., 2013, Oncogene 32:222-33; Stepan et al., 2011, 59:701-10), что могло бы влиять на специфичность. Однако экспрессия в нормальных тканях, по-видимому, ниже, чем при раке (Bignotti et al., 2010, Eur J Cancer 46:944-53), и Trop-2, предположительно, экранирован архитектурой нормальной ткани, которая ограничивает доступность для антитела, тогда как при раке указанные тканевые барьеры ослаблены в результате внедрения опухоли. Подтверждающие это данные обнаружены в ходе начальных токсикологических исследований на обезьянах, когда, несмотря на эскалацию доз IMMU-132 до уровней, приводящих к нейтропении и диарее, подобным обусловленным иринотеканом, гистопатологическое повреждение экспрессирующих Trop-2 нормальных тканей отсутствовало (Cardillo et al., 2011, Clin Cancer Res 17:3157-69). Указанные результаты подтверждаются клинически, отсутствием специфической токсичности для органов у пациентов к настоящему моменту, за исключением токсичности, известной для исходного соединения, иринотекана (Bardia et al., 2014, San Antonio Breast Cancer Symposium, P5-19-27), которая при применении IMMU-132 лучше поддается управлению.

[0375] Общепринятым важным критерием для терапии ADC является интернализация антитела, обеспечивающая доставку химиотерапевтического средства внутрь клетки, где оно обычно метаболизируется в лизосомах. Хотя IMMU-132 интернализуется, авторы настоящего изобретения считают, что линкер в указанном ADC, позволяющий локально высвобождать SN-38, что, предположительно, может индуцировать «эффект свидетеля» в отношении раковых клеток, представляет собой еще один признак, отличающий указанную платформу от задействующих ультратоксичные лекарственные средства. Так, для соединений указанного типа стабильное связывание ультратоксичного агента с IgG представляет собой единственную конфигурацию, которая способна обеспечить подходящее терапевтическое окно. Однако и применение более умеренно-токсичного лекарственного средства не позволяет использовать линкер, который высвобождал бы лекарственное средство в кровоток слишком рано. В нашей группе были исследованы линкеры, высвобождавшие SN-38 из конъюгата с разными периодами полужизни в сыворотке, в диапазоне от ~10 ч до высокостабильного линкера, однако наилучший терапевтический ответ в моделях с ксенотрансплантатами опухоли человека у мышей обеспечивал линкер с промежуточной стабильностью (Moon et al., 2008, J Med Chem 51:6916-26; Govindan et al., 2009, Clin Chem Res 15:6052-61). После указанного начального исследования авторы настоящего изобретения показали, что высокостабильная связь SN-38 была значимо менее эффективной, чем линкер CL2A, обладающий более промежуточной стабильностью в сыворотке (Govindan et al., 2013, Mol Cancer Ther 12:968-78).

[0376] Другой современный догмат в дизайне ADC заключается в использовании ультратоксичного лекарственного средства для компенсации низких уровней накопления антитела в опухолях, как правило, от 0,003 до 0,08% от инъецированной дозы на грамм (Sharkey et al., 1995, Cancer Res 55:5935s-45s). Для современного поколения конъюгатов с ультратоксичными лекарственными средствами установлен, что оптимальный коэффициент замещения для молекул лекарственного средства в антителе составляет меньше или равно 4:1, поскольку более высокие отношения нежелательным образом влияли на их фармакокинетику и уменьшали терапевтический индекс за счет сопутствующей токсичности (Hamblett et al., 2004, Clin Cancer Res 10:7063-70). Для указанной ADC-платформы второго поколения авторы настоящего изобретения выбрали способ соединения с IgG, предусматривающий сайт-специфическое связывание лекарственного средства с межцепочечными дисульфидами за счет мягкого восстановления IgG, что приводит к экспонированию 8 сайтов связывания. Используя линкер CL2A-SN-38, авторы настоящего изобретения получали DAR, достигающий 7,6:1, при этом данные ЖХ-МС показывают, что каждый из 8 сайтов соединения несет линкер CL2A, однако, по-видимому, некоторое количество SN-38 утрачивается в ходе процедуры получения. Тем не менее, 95% линкера CL2A содержит 7-8 молекул SN-38. Впоследствии авторы настоящего изобретения обнаружили, что (а) соединение с указанными сайтами не дестабилизировало антитело, и (b) получение конъюгатов с высокими уровнями замещения в указанных сайтах не нарушало связывание с антителом, и не влияло на фармакокинетические свойства. Так, авторы настоящего изобретения продемонстрировали, что полученные конъюгаты с максимальным уровнем замещения обеспечивали наилучший терапевтический ответ в моделях с ксенотрансплантатами опухолей человека у мышей.

[0377] Одним из наиболее примечательных признаков IMMU-132 с точки зрения переносимости является то, что SN-38, связанный с IgG, не глюкуронидирован, что представляет собой критически важный для детоксификации иринотекана этап. При терапии иринотеканом большая часть образующегося SN-38 легко преобразуется в печени в неактивную форму SN-38G. Расчетные AUC для SN-38G показывают, что его уровни часто в 4,5-32 раз выше, чем уровни SN-38 (Gupta et al., 1994, Cancer Res 54:3723-25; Xie et al., 2002, J Clin Oncol 20:3293-301). Секреция SN-38G в желчь с последующей деконъюгацией бета-глюкуронидазой, продуцируемой кишечной флорой, тесно связана с кишечно-печеночной рециркуляцией SN-38 и отсроченной тяжелой диареей, наблюдаемой при применении иринотекана (Stein et al., 2010, Ther Adv Med Oncol 2:51-63). После введения IMMU-132 концентрации SN-38G были очень низкими в проведенных авторами настоящего изобретения исследованиях на животных и клинических исследованиях (например, в сыворотке пациентов, получавших IMMU-132, только 20-40% свободного SN-38 находятся в форме SN-38G), что является убедительным доказательством того, что SN-38, связанный с IgG, в значительной степени защищен от глюкуронизации, даже несмотря на доступность 10-гидрокси-положения SN-38. Авторы настоящего изобретения предполагают, что низкие уровни SN-38G, генерируемые IMMU-132, вносят вклад в более низкие частоту встречаемости и интенсивность диареи у пациентов, получающих указанный ADC, по сравнению с терапией иринотеканом.

[0378] Предотвращение глюкуронизации SN-38, связанного с антителом, может также вносить вклад в улучшенные терапевтические эффекты SN-38, доставляемого в опухоль. В экстрактах опухолей от животных, получавших иринотекан, обнаружены высокие уровни иринотекана, и в 10 раз более низкие концентрации SN-38 и SN-38G. И напротив, единственным SN-38, обнаруживаемым в опухолях животных, получавших IMMU-132, был SN-38, связанный с IgG. Авторы настоящего изобретения предполагают, что конъюгат, удерживаемый в опухоли, в результате будет интернализован, с высвобождением таким образом SN-38, которым он нагружен, или SN-38 может высвобождаться вне опухолевой клетки; однако он будет высвобождаться в полностью активной форме, с более низкой вероятностью конверсии в SN-38G, происходящей в основном в печени. Также важно подчеркнуть, что за счет соединения линкера с 20-гидрокси-положением SN-38, SN-38 остается в активной лактонной форме (Zhao et al., 2000, J Org Chem 65:4601-6). В совокупности, указанные результаты показывают, что IMMU-132 способен доставлять и концентрировать SN-38 в Trop-2⁺-опухолях селективным образом, в отличие от SN-38, происходящего из ненацеливающего иринотекана, причем вероятно, что SN-38, доставленный IMMU-132, высвобождается в опухоли в полностью активной неглюкуронидированной лактонной форме.

[0379] Иринотекан не является стандартным средством для лечения пациентов с раком молочной железы. Однако описанные в настоящем документе эксперименты на линиях клеток ТНРМЖ показывают, что при концентрации больших количеств SN-38 в опухоли его активность повышается. В обеих линиях опухолевых клеток, MDA-MB-468 ТНРМЖ и HER2⁺ SK-BR-3, IMMU-132 опосредовал активацию внутреннего апоптотического пути, с расщеплением прокаспаз на соответствующие активные фрагменты, и расщеплением PARP. Продемонстрированные разрывы двухцепочечной ДНК раковых клеток, обработанных IMMU-132 (Bardia et al., 2014, San Antonio Breast Cancer Symposium, P5-19-27), по сравнению с результатами для нерелевантного ADC с SN-38 являются подтверждением селективной доставки SN-38 в целевые клетки. Что наиболее важно, указанные данные лабораторных исследований подтверждаются при терапии пациентов с метастатическим ТНРМЖ, предварительно проходивших серьезное лечение, у которых наблюдались стойкие объективные ответы (Bardia et al., 2014, San Antonio Breast Cancer Symposium, P5-19-27). Также оказалось, что IMMU-132 активен у пациентов с другими видами рака, у которых предшествующее применение терапевтического режима, включающего ингибитор топоизомеразы I, было неуспешным (Starodub et al., 2015, Clin Cancer Res 21:3870-78).

[0380] В заключение, применение SN-38, конъюгированного с очень высоким отношением молекул лекарственного средства к молекулам антитела с использованием умеренно стабильного линкера, эффективно в моделях на животных, а также при клиническом применении, представляя собой платформу ADC второго поколения. Полученные авторами настоящего изобретения результаты показывают, что Trop-2 является клинически релевантной новой мишенью в солидных опухолях Trop-2+, в частности, при ТНРМЖ.

Пример 17. Исследования механизма действия IMMU-132

[0381] Сацитузумаб говитекан (IMMU-132, также известный как hRS7-CL2A-SN-38) представляет собой конъюгат антитела с лекарственным средством (ADC), нацеленный на Trop-2, поверхностный гликопротеин, экспрессируемый на многих эпителиальных опухолях, для доставки SN-38, активного метаболита иринотекана. В отличие от большинства ADC, в которых задействованы ультратоксичные лекарственные средства и стабильные линкеры, в IMMU-132 задействовано умеренно токсичное лекарственное средство с умеренно стабильной карбонатной связью между SN-38 и линкером. При проточно-цитометрических и иммуногистохимических исследованиях обнаружено, что Trop-2 экспрессируется в широком диапазоне типов опухолей, в том числе при раке желудка, поджелудочной железы, молочной железы с тройным негативным фенотипом (ТНРМЖ), ободочной кишки, предстательной железы и легкого. Хотя в экспериментах со связыванием клеток не выявлено значимых различий между IMMU-132 и исходным антителом hRS7, анализ методом поверхностного плазмонного резонанса с применением СМ5-чипа с Trop-2 демонстрирует значимое преимущество IMMU-132 по сравнению hRS7 при связывании. Указанный конъюгат сохранял способность к связыванию с неонатальным рецептором, однако утрачивал более 60% активности антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности по сравнению с hRS7.

[0382] При воздействии на опухолевые клетки либо свободным SN-38, либо IMMU-132 продемонстрировано участие одних и тех же сигнальных путей с положительной регуляцией pJNK1/2 и p21WAF1/Cip1 и последующим расщеплением каспаз 9, 7 и 3, что в конечном итоге приводит к расщеплению поли(АДФ-рибоза)-полимеразы и разрывам двухцепочечной ДНК.

[0383] Фармакокинетика интактного ADC у мышей указывает на среднее время удержания (MRT) 15,4 ч, тогда как антитело-носитель hRS7 выводилось со скоростью, аналогичной неконъюгированному антителу (MRT=~300 ч). Лечение мышей, несущих ксенотрансплантаты рака желудка человека, с применением IMMU-132 (17,5 мг/кг; два раза в неделю × 4 недели) обеспечивало значимые противоопухолевые эффекты по сравнению с мышами, получавшими лечение неспецифическим контролем. Для клинически релевантных схем дозирования IMMU-132, включающих введение один раз в две недели, еженедельно или два раза в неделю у мышей, несущих ксенотрансплантаты рака поджелудочной железы или желудка человека, продемонстрированы аналогичные значимые противоопухолевые эффекты в обеих моделях. Текущие клинические испытания I/II фазы (ClinlcalTrials.gov, NCT01631552) подтверждают противораковую активность IMMU-132 при раке, экспрессирующем Trop-2, в том числе у пациентов с раком желудка и поджелудочной железы.

Введение

[0384] Согласно расчетам, в настоящем году в Соединенных Штатах будет диагностировано 22220 новых случаев рака желудка, с последующими 10990 случаями смерти, обусловленной указанным заболеванием (Siegel et al., 2014, СА Cancer J Clin 64:9-29). Несмотря на возникновение тренда к повышению уровней 5-летней выживаемости (в настоящее время составляющей 29%), указанные уровни до сих пор остаются достаточно низкими по сравнению с большинством остальных видов рака, в том числе раком ободочной кишки, молочной железы и предстательной железы (65%, 90% и 100%, соответственно). Фактически, показатели уровни 5-летней выживаемости из всех видов рака хуже только для рака пищевода, печени, легкого и поджелудочной железы. Рак поджелудочной железы остается четвертой лидирующей причиной всех смертей от рака в США, при уровне 5-летней выживаемости, составляющем всего 6% (Siegel et al., 2014, СА Cancer J Clin 64:9-29). Такая мрачная статистика для рака желудка и поджелудочной железы ясно говорит о наличии потребности в новых терапевтических подходах.

[0385] Trop-2 представляет собой гликопротеин размером 45 кДа, который принадлежит к семейству генов TACSTD, в частности, TACSTD22. Избыточная экспрессия указанного трансмембранного белка при разнообразных видах эпителиального рака была связана с общим неудовлетворительным прогнозом. Trop-2 имеет существенное значение для независимого от подложки роста клеток и туморогенеза (Wang et al., 2008, Mol Cancer Ther 7:280-85; Trerotola et al., 2013, Oncogene 32:222-33). Он функционирует в качестве переносчика кальциевого сигнала, что требует наличия интактного цитоплазматического фрагмента, который фосфорилирует протеинкиназа С12-14. Проростовые сигнальные факторы, ассоциированные с Trop-2, включают NF-κВ, циклин D1 и ERK (Guerra et al., 2013, Oncogene 32:1594-1600; Cubas et al., 2010, Mol Cancer 9:253).

[0386] При раке поджелудочной железы избыточная экспрессия Trop-2 наблюдалась у 55% исследованных пациентов, при положительной корреляции с метастазированием, степенью злокачественности опухоли и неудовлетворительной выживаемостью без прогрессирования у пациентов, подвергшихся хирургическому вмешательству с целью излечения (Fong et al., 2008, Br J Cancer 99:1290-95). Аналогичным образом, при раке желудка у 56% пациентов наблюдалась избыточная экспрессия Trop-2 на опухолях, опять-таки, коррелирующая с менее продолжительной выживаемостью без заболевания и менее удовлетворительным прогнозом у пациентов с содержащими Trop-2-положительные опухолевыми клетками лимфатическими узлами (Muhlmann et al., 2009, J Clin Pathol 63:152-58). С учетом указанных характеристик и того факта, что Trop-2 связан со многими трудноизлечимыми видами рака, он представляет собой привлекательную мишень для терапевтического вмешательства с применением конъюгата антитела с лекарственным средством (ADC).

[0387] Общая парадигма применения антитела для нацеливания лекарственного средства на опухоль включает несколько ключевых признаков, в том числе, следующие: (а) целевой антиген преимущественно экспрессируется на опухоли, но не в нормальной ткани, (b) антитело имеет хорошую аффинность и интернализуется опухолевой клеткой; и (с) ультратоксичное лекарственное средство стабильно соединено с антителом (Panowski et al., 2014, mAbs 6:34-45). Руководствуясь указанными принципами, авторы настоящего изобретения разработали антитело, обозначаемое RS7-3G11 (RS7), которое связывается с Trop-2 в ряде солидных опухолей (Stein et al., 1993, Int J Cancer 55:938-46; Basu et al., 1995, Int J Cancer 62:472-79) с наномолярной аффинностью (Cardillo et al., 2011k, Clin Cancer Res 17:3157-69), и после связывания с Trop-2 интернализуется клеткой (Shih et al., 1995, Cancer Res 55:5857s-63s).

[0388] Согласно результатам иммуногистохимического исследования Trop-2 экспрессируется в некоторых нормальных тканях, хотя, как правило, со значительно меньшей интенсивностью по сравнению с неопластической тканью, и часто присутствует в областях тканей с ограниченным сосудистым доступом (Trerotola et al., 2013, Oncogene 32:222-33). На основании указанных характеристик RS7 было гуманизировано и конъюгировано с активным метаболитом иринотекана, 7-этил-10-гидроксикамптотецином (SN-38). Цитотоксичность in vitro в многочисленных линиях клеток, как было обнаружено, характеризуется значениями IC₅₀ в одноразрядном наномолярном диапазоне для SN-38, в отличие от пикомолярного диапазона для многих ультратоксичных лекарственных средств, в настоящее время используемых в ADC (Cardillo et al., 2011, Clin Cancer Res 17:3157-69). Хотя преобладает идея использования ультратоксичных агентов, таких как ауристатины или майтансины, для получения ADC, содержащих всего 2-4 лекарственных средства на антитело, стабильно с ним соединенных, такие агенты отличаются узким терапевтическим окном, что обуславливает все новые попытки реконструирования ADC с расширенным терапевтическим индексом (Junutula et al., 2010, Clin Cancer Res 16:4769-78).

[0389] В качестве одного из способов ухода от этой практики авторы изобретения конъюгировали по 7-8 SN-38 молекул на антитело с применением линкера, который высвобождает SN-38 со временем полужизни в сыворотке человека ~1 сутки. Было выдвинуто предположение, что применение менее стабильного линкера позволит SN-38 высвобождаться в сайте опухоли после нацеливания ADC на клетки, обеспечивая доступность лекарственного средства для окружающих опухолевых клеток, а не только клеток, на которые прямо нацелен указанный ADC. Итоговый ADC, hRS7-CL2A-SN-38 (сацитузумаб говитекан, или IMMU-132), продемонстрировал противоопухолевую активность в отношении широкого диапазона типов опухолей (Cardillo et al., 2011, Clin Cancer Res 17:3157-69). Недавно была продемонстрирована значимая противоопухолевая активность IMMU-132 в отношении доклинической модели рака молочной железы с тройным негативным фенотипом (ТНРМЖ) (Goldenberg et al., 2014, постерный доклад на Симпозиуме по раку молочной железы в Сан-Антонио, 9-13 декабря 2014 г., тезисы №Р5-19-08). Наиболее важно отметить, что в текущем клиническом испытании I/II фазы IMMU-132 показал активность у пациентов ТНРМЖ (Bardia et al., 2014, постерный доклад на Симпозиуме по раку молочной железы в Сан-Антонио, 9-13 декабря 2014 г., тезисы №Р5-19-2), соответственно, подтверждая действенность указанного сдвига парадигмы в химии ADC, предусматривающего применение менее токсичного лекарственного средства и линкера, высвобождающего SN-38 с течением времени, вместо полной зависимости от интернализации ADC для обеспечения активности.

[0390] SN-38 представляет собой известный ингибитор топоизомеразы-I, который индуцирует значимое повреждение ДНК клетки. Он опосредует положительную регуляцию ранних проапоптотических белков, р53 и p21WAF1/Cip1, которая приводит к активации каспаз и расщеплению поли(АДФ-рибоза)-полимеразы (PARP). Экспрессия p21WAF1/Cip1 ассоциирована с остановкой клеточного цикла в фазе G1 и, соответственно, представляет собой отличительный признак внутреннего апоптотического пути. Авторы настоящего изобретения ранее продемонстрировали, что IMMU-132 сходным образом способен опосредовать положительную регуляцию ранних проапоптотических сигнальных событий (р53 и p21WAF1/Cip1), что приводит к расщеплению PARP в линиях клеток НМРЛ (Calu-3) и поджелудочной железы (ВхРС-3), что соответствует внутреннему проапоптозному сигнальному пути (Cardillo et al., 2011, Clin Cancer Res 17:3157-69).

[0391] В настоящем документе авторы настоящего изобретения дополнительно охарактеризовали IMMU-132, уделяя особое внимание лечению солидного рака, в частности, опухолей желудка и поджелудочной железы человека. Была исследована поверхностная экспрессия Trop-2 в диапазоне типов солидных опухолей и сопоставлена с экспрессией in vivo в ксенотрансплантатах опухолей. Механистические исследования обеспечивают дополнительные сведения о внутренних проапоптотических сигнальных событиях, опосредованных IMMU-132, в том числе данные об увеличении уровней разрывов двухцепочечной ДНК (дцРНК) и последующей активации каспаз. Наконец, клинически релевантные и нетоксические схемы дозирования сравнивают в моделях заболеваний карциномой желудка и карциномой поджелудочной железы, тестируя схемы введения два раза в неделю, еженедельно и один раз в две недели, чтобы определить, какой цикл лечения лучше всего подходит для применения в клинических условиях без потери эффективности.

Экспериментальные процедуры

[0392] Линии клеток и химиотерапевтические средства - Все использованные линии клеток рака человека приобретали в Американской коллекции типовых культур (АТСС) (Манассас, Виргиния). Все линии поддерживали в соответствии с рекомендациями АТСС и проводили рутинное тестирование на микоплазму; все линии аутентифицировали с помощью анализа коротких тандемных повторов (STR) от АТСС. IMMU-132 (hRS7-SN-38) и контрольные ADC (hA20-SN-38 против CD20 и hLL2-SN-38 против CD22) получали согласно приведенному ранее описанию и хранили при -20°С (Cardillo et al., 2011, Clin Cancer Res 17:3157-69). SN-38 приобретали (Biddle Sawyer Pharma, LLC, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк) и хранили в аликвотах по 1 мМ в ДМСО при -20°С.

[0393] ИФА ELISA на Trop-2 - Рекомбинантный Trop-2 человека с His-меткой (Sino Biological, Inc., Пекин, Китай; кат. №10428-Н09Н) и рекомбинантный Trop-2 мыши с His-меткой (Sino Biological, Inc., кат. №50922-М08Н) наносили на полоски Ni-NTA HisSorb (Qiagen GmbH, кат. №35023) в количестве 1 мкг в течение 1 часа при комнатной температуре. Планшет 4-кратно промывали промывочным буфером ФСБ-Tween (0,05%). Получали серийные разведения hRS7 в буфере для разведения 1% БСА-ФСБ в диапазоне тестируемых концентраций от 0,1 нг/мл до 10 мкг/мл. Затем планшеты инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре с последующим 4-кратным промыванием и добавлением конъюгированного с пероксидазой вторичного антитела (антитело козы против антител человека, специфическое в отношении Fc-фрагмента; Jackson Immunoresearch, кат. №109-036-098). После 45 минут инкубации планшет промывали и добавляли во все лунки раствор субстрата (о-фенилендиаминдигидрохлорид (OPD); Sigma, кат. №Р828). Планшеты инкубировали в темноте в течение 15 минут, после чего реакцию останавливали 4Н серной кислотой. Планшеты считывали при 450 нм на планшет-ридере Biotek ELX808. Данные анализировали и строили графики с применением ПО Prism GraphPad Software (v4.03) (Advanced Graphics Software, Inc.; Энсинитас, Калифорния).

[0394] Связывание клеток in vitro - Для детекции связывания антител с клетками использовали хемилюминесцентную субстратную систему LumiGLO (KPL, Гайтерсберг, Мэриленд). Вкратце, клетки высевали в черный 96-луночный планшет с плоским прозрачным дном и оставляли на ночь. Антитела серийно разводили 1:2 и добавляли в трех повторностях, получая диапазон концентраций от 0,03 до 66,7 нМ. После инкубации в течение 1 часа при 4°С среду удаляли и клетки промывали свежей холодной средой с последующим добавлением конъюгированного с пероксидазой хрена вторичного антитела козы против человека (Jackson Immunoresearch, Уэст-Гроув, Пенсильвания) в разведении 1:20000 в течение 1 часа при 4°С. Планшеты повторно промывали перед добавлением реагента LumiGLO. Люминесценцию планшетов считывали с использованием планшет-ридера Envision (Perkin Elmer, Бостон, Массачусетс). Данные анализировали методом нелинейной регрессии для определения равновесной константы диссоциации (KD). Статистические сравнения значений KD проводили с использованием ПО Prism GraphPad Software (v4.03) (Advanced Graphics Software, Inc.; Энсинитас, Калифорния) с применением F-теста для кривых наилучшей аппроксимации для данных. За значимый уровень принимали значение Р меньше 0,05.

[0395] Антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность (АЗКЦ) -Проводили 4-часовой анализ высвобождения ЛДГ для оценки АЗКЦ-активности, вызываемой IMMU-132, IgG hRS7, hLL2-SN-38 и IgG hLL2 (hLL2 представляют собой несвязывающие конъюгаты против CD22 для линий клеток солидных опухолей). Вкратце, целевые клетки (MDA-MB-468, NIH:OVCAR-3, или ВхРС-3) высевали с плотностью 1×10⁴ клеток/лунку в 96-луночный черный плоскодонный планшет и инкубировали в течение ночи. На следующий день мононуклеарные эффекторные клетки периферической крови (МКПК), свежевыделенные от донора, добавляют в заданные лунки реакционного планшета с отношением Е:Т=50:1. Взятие МКПК человека выполняли с одобрения институционального наблюдательного совета Новой Англии (Ньютон, Массачусетс). Реагенты для тестирования добавляли в заданные лунки в конечной концентрации 33,3 нМ. В одну группу лунок добавляли отдельно среду для анализа АЗКЦ для контроля фона, а в другую группу лунок добавляли отдельно клетки и TritonX100 для определения контрольного максимального лизиса клеток. Планшет инкубировали в течение 4 ч при 37°С. Через 4 часа лизис целевых клеток оценивали с применением гомогенного флуорометрического анализа высвобождения ЛДГ (Cyto Tox-One Homogenous Membrane Integrity Assay; Promega, Кат. №G7891).

[0396] Планшеты считывали (544 нм - 590 нм) с использованием планшет-ридера Envision (PerkinElmer LAS, Inc.; Шелтон, Коннектикут). Данные анализировали с использованием Microsoft Excel. Процент специфического лизиса рассчитывали следующим образом:

где:

[0397] Анализ связывания методом поверхностного плазменного резонанса (BIACORE) - Вкратце, rhTrop-2/TACSTD2 (Sino Biological, Inc.) или рекомбинантный неонатальный рецептор человека (FcRn), полученный как описано (Wang et al., 2011, Drug Metab Dispos 39:1469-77), иммобилизовали с применением набора для соединения с аминогруппами (GE Healthcare; кат. №BR-1000-50) на сенсорном СМ5-чипе (GE Healthcare; кат. №BR-1000-12), следуя инструкциям изготовителя для чипа низкой плотности. Готовили три отдельных серии разведений IgG hRS7 и IMMU-132 в подвижном буфере (400 нМ, 200 нМ, 100 нМ, 50 нМ и 25 нМ). Каждую серию использовали для отдельного анализа в системе BIACORE (BIACORE-X; Biacore Inc., Пискатауэй, Нью-Джерси) и анализировали данные с применением программного обеспечения BIAevaluation (Biacore Inc., v4.1). Анализ выполняли с использованием модели связывания 1:1 (модель Ленгмюра) и аппроксимации, с применением всех пяти точек концентрации для каждого анализа образца, для определения наилучшей аппроксимации (минимальное значение χ²). Значение KD рассчитывали по формуле KD=kd1/ka1, где kd1 представляет собой константу скорости диссоциации, a ka1 представляет собой константу скорости связывания.

[0398] Иммуногистологическая оценка распределения Trop-2 в фиксированных формалинов залитых в парафин тканях - Ксенотрансплантаты опухоли у мышей извлекали, фиксировали в 10% забуференном формалине и заливали в парафин. После депарафинизации среды толщиной 5 мкм инкубировали с буфером Tris/ЭДТК (DaKo Target Retrieval Solution, pH 9,0; Дако, Дания) при 95°С в течение 30 минут в аппарате NxGen Decloaking Chamber (Biocare Medical, Конкорд, Калифорния). Trop-2 детектировали поликлональным антителом козы против Trop-2 человека в концентрации 10 мкг/мл (R&D Systems, Миннеаполис, Миннесота) и окрашивали с применением набора для окрашивания с комплексом авидин-биотин от Vector VECTASTAINR ABC Kit (Vector Laboratories, Inc., Берлингейм, Калифорния). Нормальное антитело козы использовали в качестве отрицательного контроля (R&D Systems, Миннеаполис, Миннесота). Ткани контрастировали гематоксилином в течение 6 секунд.

[0399] Поверхностная экспрессия Trop-2 на клетках линий карциномы человека -Анализ экспрессии Trop-2 на поверхности клеток на основе проточной цитометрии. Вкратце, клетки собирали с применением раствора аккутазы для отсоединения клеток (Becton Dickinson (BD), Франклин Лейке, Нью-Джерси; кат. №561527) и анализировали экспрессию Trop-2 с применением ФЭ-гранул QuantiBRITE (BD Кат. №340495) и ФЭ-конъюгированного антитела против Trop-2 (eBiosciences, кат. №12-6024), следуя инструкциям производителя. Данные регистрировали на проточном цитометре FACSCalibur (BD) с использованием программного обеспечения CellQuest Pro. Окрашивание анализировали с использованием программного обеспечения Flowjo (Tree Star, Эшленд, Орегон).

[0400] Фармакокинетика - Нестимулированных самок мышей NCr Nude (nu/nu) возрастом 8-10 недель приобретали у Taconic Farms (Джермантаун, Нью-Йорк). Мышам (N равно 5) инъецировали в/в 200 мкг IMMU-132, исходного hRS7 или модифицированного hRS7-NEM (hRS7, обработанное ТСЕР и конъюгированное с N-этилмалеимидом). У животных собирали кровь через ретроорбитальное сплетение через 30 минут, 4, 24, 72 и 168 часа после инъекции. Для определения концентраций в сыворотке общего IgG hRS7 использовали ИФА ELISA, анализируя конкуренцию за связывание идиотипического антитела против IgG hRS7 с конъюгатом hRS7 с пероксидазой хрена. Концентрации в сыворотке интактного IMMU-132 определяли с применением антитела против SN-38 для захвата и конъюгированное с пероксидазой хрена антитело против IgG hRS7 для детекции. Фармакокинетические (ФК) показатели вычисляли с использованием некомпартментного метода анализа с помощью программного обеспечения Phoenix WinNonlin (версия 6.3; Pharsight Corp., Маунтин-Вью, Калифорния).

[0401] Оценка разрывов двухцепочечной ДНК In vitro - Для тестирования активности лекарственного средства клетки ВхРС-3 высевали в 6-луночные планшеты с плотностью 5×105 клеток/лунку и выдерживали при 37°С в течение ночи. После охлаждения на льду в течение 10 мин клетки инкубировали с IMMU-132, hA20-SN-38 или hRS7-IgG в конечной концентрации 20 мкг/мл в течение 30 минут на льду, троекратно промывали свежей средой, а затем возвращали в условия 37°С для продолжения культивирования в течение ночи. На следующее утро клетки подвергали непродолжительной трипсинизации, центрифугировали, окрашивали фиксируемым красителем для оценки жизнеспособности (Fixable Viability Stain 450, BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния), промывали 1% БСА-ФСБ, а затем фиксировали в 4% формалине в течение 15 минут, повторно промывали пермеабилизовали 0,15% Triton-Х100 в ФСБ на протяжении еще 15 минут. После двукратного промывания 1% БСА-ФСБ клетки инкубировали с антителом мыши против γH2AX-AF488 (EMD Millipore Corporation, Темекула, Калифорния) в течение 45 минут при 4°С. Интенсивность сигнала γН2АХ измеряли с помощью проточной цитометрии на BD FACSCanto (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния).

[0402] Терапевтические исследования in vivo - самок бестимусных мышей NCr Nude (nu/nu) возрастом 4-8 недель приобретали у Taconic Farms (Джермантаун, Нью-Йорк). Ксенотрансплантаты опухоли желудка NCI-N87 получали путем сбора клеток из тканевой культуры, приготовления итоговой суспензии клеток в отношении 1:1 в матригеле (BD Bioscience; Сан-Хосе, Калифорния) и введения каждой мыши в общей сложности 1×10⁷ клеток п/к в правый бок. В случае ВхРС-3 собирали ксенотрансплантаты массой 1 г и получали суспензию опухоли в сбалансированном солевом растворе Хенкса (HBSS) с концентрацией 40% (масса/объем). Указанную суспензию смешивали в отношении 1:1 с матригелем с получением итоговой суспензии опухоли с концентрацией 20% (масса/объем). Затем мышам инъецировали 300 мкл суспензии п/к. Объем опухоли (ОО) определяли, проводя замеры с помощью калипера в 2 измерениях, следующим образом: L×w²/2, где L представляет собой наибольший линейный размер опухоли, a w представляет собой наименьший линейный размер. Для проведения иммуногистохимического анализа опухолям позволяли дорасти до размера приблизительно 0,5 см³, после чего мышей умерщвляли, опухоли извлекали, фиксировали в формалине и заливали в парафин. Для проведения терапевтических исследований мышей рандомизировали в группы лечения и начинали терапию, когда объем опухолей составлял приблизительно 0,25 см³. Схемы лечения, дозировки и число животных в каждом эксперименте приведены в разделе результатов и на подписях к чертежам. Лиофилизированные IMMU-132 и контрольный ADC (hA20-SN-38) восстанавливали и разводили, в соответствии с указаниями, в стерильном солевом растворе.

[0403] При превышении опухолями размера 1,0 см³ мышей умерщвляли, считая, что они поддались заболеванию. Наилучший ответ на терапию был определен как: частичный ответ - сокращение размеров более чем на 30% по сравнению с начальным размером; стабильное заболевание - сокращение объемов опухолей вплоть до сокращения на 29% или увеличение не более чем на 20% по сравнению с начальным размером; прогрессирование - увеличение опухолей больше или равно 20% по сравнению либо с начальным размером, либо с минимальным размером. Время до прогрессирования (ВДП) определяли как период времени после начала терапии до увеличения опухоли более чем на 20% по сравнению с минимальным размером.

[0404] Статистический анализ роста опухоли был основан на площади под кривой (AUC). Профили роста индивидуальных опухолей получали путем моделирования линейных кривых. Для определения равенства дисперсии между группами перед статистическим анализом кривых роста использовали f-тест. Для оценки статистической значимости между различными группами лечения и контролями использовали двусторонний t-тест, за исключением контрольного солевого раствора, для которого использовали односторонний t-тест (значимость при Р меньше или равно 0,05). Результаты исследования выживаемости анализировали с применением графиков Каплана-Майера (логарифмический ранговый анализ), используя пакет программного обеспечения Prism GraphPad Software (v4.03) (Advanced Graphics Software, Inc., Энсинитас, Калифорния).

[0405] Иммуноблоттинг - Клетки (2×10⁶) высевали в 6-луночные планшеты и оставляли на ночь. На следующий день их обрабатывали либо свободным SN-38 (растворенным в ДМСО), либо IMMU-132 с концентрацией, эквивалентной 0,4 мкг/мл SN-38 (1 мкМ). Исходное hRS7 применяли в качестве контроля для ADC. Клетки лизировали в буфере, содержащем 10 мМ Tris, рН 7,4; 150 мМ NaCl, ингибиторы протеазы и ингибиторы фосфатазы (2 мМ Na2PO4, 10 мМ NaF). В общей сложности 20 мкг белка проводили через 4-20% ДСН-полиакриламидный гель, переносили на нитроцеллюлозную мембрану и блокировали 5% обезжиренным молоком в 1× TBS-T (забуференный Tris солевой раствор, 0,1% Tween-20) в течение 1 часа при комнатной температуре. Мембраны зондировали в течение ночи при 4°С первичными антителами, с последующей инкубацией в течение 1 часа с вторичным антителом против антител кролика (1:2500) при комнатной температуре. Сигнал детектировали, используя набор для хемилюминесценции (Supersignal West Dura, Thermo Scientific; Рокфорд, Иллинойс), с визуализацией мембран на Kodak Image Station 40000R. Первичные антитела p21Waf1/Cip1 (кат. №2947), каспазу-3 (кат. №9665), каспазу-7 (кат. №9492), каспазу-9 (кат. №9502), PARP (кат. №9542), β-актин (кат. №4967), pJNK1/2 (кат. №4668), JNK (кат. №9258) и вторичное конъюгированное с HRP антитело козы против антител кролика (кат. №7074) получали от Cell Signal Technology (Дэнверс, Массачусетс).

Результаты

[0406] Уровни экспрессии Trop-2 в нескольких линиях клеток солидных опухолей - Поверхностная экспрессия Trop-2 проявляется в различных линиях солидных опухолей человека, в том числе опухолях желудка, поджелудочной железы, молочной железы, ободочной кишки и легкого (таблица 10). Не существует типа опухоли, где экспрессия была бы выше, чем в остальных типах; в пределах одного отдельно взятого типа опухолевых клеток наблюдается вариабельность. Например, в аденокарциномах желудка уровни Trop-2 варьировали от очень низких значений, 494±19 (Hs 746Т) до высоких значений, 246 857±64 651 (NCI-N87) поверхностных молекул на клетку.

[0407] При окрашивании ксенотрансплантатов опухолей ЖКТ на экспрессию Trop-2 наблюдалось как цитоплазматическое, так и мембранное окрашивание (не показано). Интенсивность окрашивания хорошо коррелировала с результатами для поверхностной экспрессии Trop-2, определенными с применением FACS-анализа. Для всех трех аденокарцином поджелудочной железы наблюдалось гомогенное окрашивание, где уровень окрашивания ВхРС-3 составлял от 2+ до 3+. Паттерн окрашивания аденокарциномы желудка NCI-N87 был более гетерогенным, с окрашиванием уровня 3+ апикальной выстилки желез и менее выраженным окрашиванием окружающих опухолевых клеток. В COLO 205 встречались только отдельные очаги окрашивания уровня от 1+ до 2+, тогда как в НТ-29 крайне редко, для нескольких клеток, встречалось окрашивание уровня 1+.

а Проводили три отдельных анализа, рассчитывая значения среднего и стандартное отклонение.

[0408] Связывающие характеристики IMMU-132 - Чтобы дополнительно продемонстрировать, что hRS7 не вступает в перекрестные реакции с Trop-2 мыши, проводили ИФА ELISA на планшетах, покрытых либо рекомбинантным Trop-2 мыши, либо Trop-2 человека (не показано). Гуманизированное RS7 специфически связывалось только с Trop-2 человека (KD=0,3 нМ); перекрестная реактивность с Trop-2 мыши отсутствовала. Контрольные поликлональные антитела кролика против Trop-2 мыши и против Trop-2 человека не вступали в перекрестные реакции и не связывались с обеими формами Trop-2 (данные не показаны).

[0409] Изучали связывание IMMU-132 с несколькими линиями клеток, проводя сравнение с исходным hRS7, а также с модифицированным hRS7, hRS7-NEM (hRS7, обработанный ТСЕР и конъюгированный с N-этилмалеимидом) (не показано). Во всех случаях рассчитанные значения KD попадали в субнаномолярный диапазон, без значимых различий между hRS7, IMMU-132 и hRS7-NEM в заданной линии клеток.

[0410] Сравнительное связывание IMMU-132 и hRS7 дополнительно исследовали с применением анализа методом поверхностного плазмонного резонанса (BIACORE) (не показано). Использовали биосенсорный Trop-2-чип с низкой плотностью (плотность = 1110 отн. ед.) с рекомбинантным Trop-2 человека. Результаты трех независимых анализов связывания не только свидетельствуют, что процесс конъюгации с SN-38 не влиял на IMMU-132 нежелательным образом, однако также демонстрируют более высокую аффинность связывания с Trop-2, чем с hRS7 (0,26±0,14 нМ против 0,51±0,04 нМ, соответственно; Р=0,0398).

[0411] Механизм действия: АЗКЦ и внутренние сигнальные пути апоптоза - Сравнивали АЗКЦ-активность IMMU-132 и hRS7 в трех разных линиях клеток, ТНРМЖ (MDAMB-468), яичников (NIH:OVCAR-3) и поджелудочной железы (ВхРС-3) (не показано). Во всех трех линиях клеток hRS7 опосредовал значимый лизис клеток, в отличие от всех других вариантов обработки, в том числе IMMU-132 (Р меньше 0,0054). При применении IMMU-132 для нацеливания на клетки АЗКЦ уменьшался более чем на 60% по сравнению с hRS7. Например, в клетках MDA-MB-468, специфический лизис, опосредованный hRS7, составлял 29,8±2,6% против 8,6±2,6% для IMMU-132 (не показано; Р меньше 0,0001). Аналогичное снижение АЗКЦ-активности также наблюдалось в клетках NIH:OVCAR-3 и ВхРС-3 (не показано; Р меньше 0,0001 и Р меньше 0,0054; соответственно). Указанная ослабленная АЗКЦ-активность предположительно является результатом изменений антитела, происходящих в процессе конъюгации, поскольку точно такое же снижение специфического лизиса клеток проявлялось для hRS7-NEM, в котором отсутствует линкер CL2A-SN-38, и вместо этого цистеины блокированы N-этилмалеимидом (не показано). КЗЦ-активность, ассоциированная с hRS7 или IMMU-132, отсутствует (данные не показаны).

[0412] Ранее было показано, что IMMU-132 опосредует положительную регуляцию ранних проапоптотических сигнальных событий (р53 и p21WAF1/Cip1), в конечном итоге приводящих к расщеплению PARP20. Для лучшего понимания апоптотического пути, задействуемого IMMU-132, на линии клеток карциномы желудка человека NCI-N87 и аденокарциномы поджелудочной железы человека ВхРС-3 воздействовали 1 мкМ свободным SN-38 или эквивалентным количеством IMMU-132 (не показано). И свободный SN-38, и IMMU-132 опосредуют положительную регуляцию p21WAF1/Cip1, хотя одинаковая положительная регуляция в клетках NCI-N87, на которые воздействовали свободным SN-38 или IMMU-132 наблюдается только через 48 часов (не показано), тогда как максимальная положительная регуляция для ВхРС-3 проявляется в пределах 24 часов (не показано). Как свободный SN-38, так и IMMU-132 демонстрируют расщепление про каспазы-9 и -7 в пределах 48 ч от воздействия. Прокаспаза-3 расщепляется в обеих линиях клеток с максимальной наблюдаемой степенью расщепления через 48 ч. Наконец, и свободный SN-38, и IMMU-132 опосредовали расщепление PARP. Указанное расщепление впервые проявляется через 24 часа, с увеличением через 48 часа. В совокупности указанные данные подтверждают, что SN-38, входящий в состав IMMU-132, обладает такой же активностью, что и свободный SN-38.

[0413] Помимо указанных более поздних сигнальных событий апоптоза, в клетках ВхРС-3, на которые непродолжительно воздействовали либо свободным SN-38, либо IMMU-132, однако не голым hRS7 (не показано), также проявляется более раннее событие, ассоциированное с указанным путем, а именно, фосфорилирование JNK (pJNK). Увеличение количества pJNK проявляется спустя 4 ч, при не поддающихся оценке изменениях через 6 ч. В клетках, на которые воздействовали свободным SN-38, наблюдается более высокая интенсивность фосфорилирования по сравнению с клетками, на которые воздействовали IMMU-132, однако оба значения по существу выше контрольных. В качестве конечной точки для оценки механизма действия IMMU-132 измеряли разрывы дцДНК в клетках ВхРС-3. Воздействие IMMU-132 на ВхРС-3 в течение всего 30 мин приводило более чем к двукратному увеличению индукции γН2АХ по сравнению с ненацеливающим контрольным ADC (Таблица 11). Приблизительно 70% клеток были положительными по окрашиванию на γН2АХ относительно меньше 20% для голого hRS7, нерелевантного ADC, hA20-SN-38 и контроля без обработки (Р меньше 0,0002).

а Сравнение IMMU-132 и всех 3 вариантов контрольной обработки, Р меньше 0,0002 (односторонний t-тест; N равно 3).

[0414] Фармакокинетика IMMU-132 - Связывание с неонатальным рецептором человека (FcRn) определяли с применением анализа BIACORE (не показано). С применением биосенсорного FcRn-чипа низкой плотности (плотность = 1302 отн. ед.) проводили три независимых анализа связывания с пятью разными концентрациями (400-25 нМ) для каждого агента. В целом, и hRS7, и IMMU-132 демонстрируют значения KD в наномолярном диапазоне (92,4±5,7 нМ и 191,9±47,6 нМ, соответственно), без значимых различий. Мышам инъецировали IMMU-132, и сравнивали выведение IMMU-132 или IgG hRS7 по сравнению с исходным hRS7, с применением двух ИФА ELISA (не показано). У мышей, которым инъецировали hRS7, наблюдался двухфазный паттерн выведения (не показано), аналогичный наблюдаемому для нацеливающей hRS7 части IMMU-132 (не показано), с альфа- и бета-периодами полужизни приблизительно 3 и 200 ч, соответственно. И напротив, наблюдалось быстрое выведение интактного IMMU-132 со временем полужизни 11 ч и среднее время удержания (MRT) 15,4 ч (не показано).

[0415] Для дополнительного подтверждения того, что разрушение межцепочечных дисульфидных связей не изменяет ФК нацеливающего антитела, ФК исходного hRS7 сравнивали с ФК модифицированного hRS7 (hRS7-NEM). Значимых различий между какими-либо агентами в отношении времени полужизни, Cmax, AUC, выведения или MRT отмечено не были (не показано).

[0416] Эффективность IMMU-132 в отношении ксенотрансплантатов карциномы желудка человека - Эффективность IMMU-132 была продемонстрирована ранее в моделях с ксенотрансплантатами немелкоклеточного рака легкого, рака ободочной кишки, ТНРМЖ и карциномы поджелудочной железы (Cardillo et al., 2011, Clin Cancer Res 17:3157-69; Goldenberg et al., постерный доклад, представленный на Симпозиуме по раку молочной железы в Сан-Антонио, 9-13 декабря, тезисы №Р5-19-08). Для дополнительного расширения указанного открытия на другие виды рака ЖКТ IMMU-132 тестировали у мышей, несущих ксенотрансплантат карциномы желудка человека, NCI-N87 (не показано). При лечении IMMU-132 достигалась значимая регрессия опухолей по сравнению с наблюдаемой при введении контролей, солевого раствора и ненацеливающих ADC (против CD20) hA20-SN-38 (не показано; Р меньше 0,001). Частичный ответ, продолжавшийся в течение более чем 18 дней после введения животным последней терапевтической дозы, наблюдался у 6 из 7 мышей в группе IMMU-132. Указанный ответ обеспечивал среднее время до прогрессирования (ВДП), составляющее 41,7±4,2 дня, что отличается от отсутствия ответа в группе контрольного ADC, где ВДП составляло 4,1±2,0 дня (Р меньше 0,0001). В целом, медианное время выживания (MST) у получавших лечение IMMU-132 мышей составляло 66 дней против 24 дней у получавших контрольный ADC и 14 дней у получавших солевой раствор контрольных животных (не показано; Р меньше 0,0001).

[0417] Клинически релевантные схемы дозирования - Максимальные переносимые дозы IMMU-132 при многократном введении, клинически протестированные к настоящему времени, составляют 8 и 10 мг/кг при введении на 1 и 8 дни 21-дневных циклов. Дозу 8 мг/кг для человека переводят в дозу для мыши 98,4 мг/кг, или приблизительно 2 мг на мышь с массой тела 20 г. Три разных схемы дозирования разделенных на части 2 мг IMMU-132 исследовали в модели с ксенотрансплантатом аденокарциномы поджелудочной железы человека (ВхРС-3). Указанную общую дозу разделяли на части согласно одной из трех разных схем дозирования: одна группа получала две дозы IMMU-132 по 1 мг (терапия на 1 и 15 дни), одна получала четыре дозы по 0,5 мг (терапия на 1, 8, 22 и 29 дни) и последняя группа получала восемь доз по 0,25 мг (терапия на 1, 4, 8, 11, 22, 25, 29 и 32 дни). Все три схемы дозирования обеспечивали значимый противоопухолевый эффект по сравнению с контрольными не получавшими лечения животными, как в отношении ингибирования роста опухоли, так и общей выживаемости (не показано; Р меньше 0,0009 и Р меньше 0,0001, соответственно). Значимые различия ВДП между какими-либо из трех разных групп лечения отсутствуют, ВДП варьировало от 22,4±10,1 дней для группы дозирования 1 мг до 31,7±14,5 дней для группы дозирования 0,25 мг (ВДП в не получавшей лечения контрольной группе = 5,0±2,3 дней).

[0418] Аналогичный эксперимент со схемами дозирования проводили на мышах, несущих ксенотрансплантаты опухоли желудка человека NCI-N87 (не показано). Все три схемы дозирования обеспечивали значимый противоопухолевый эффект по сравнению контрольными не получавшими лечения мышами, однако не отличались между собой (AUC; Р меньше 0,0001). Что касается общей выживаемости, аналогичным образом, при том, что все три схемы дозирования обеспечивали значимое преимущество в отношении выживаемости по сравнению с контролем без лечения (Р меньше 0,0001), различия между какими-либо из трех разных групп лечения отсутствуют.

[0419] Для дополнительного разграничения возможных схем дозирования мышей, несущих опухоли NCI-N87, подвергали хроническому дозированию IMMU-132, при котором мыши получали инъекции по 0,5 мг IMMU-132 один раз в неделю на протяжении двух недель с последующей одной неделей отдыха до начала следующего цикла (не показано), согласно текущей схеме клинических испытаний. В общей сложности у животных проводили 4 цикла лечения.

[0420] Указанная схема дозирования замедляла рост опухоли с ВДП 15,7±11,1 дней против 4,7±2,2 дней у получавших лечение контрольным ADC мышей (Р равно 0,0122). В целом, хроническое дозирование увеличивало 19-месячную медианную выживаемость в 3 раза, с 21 дня для получавших лечение контрольным ADC мышей до 63 дней для животных, которым вводили IMMU-132 (Р равно 0,0001). Важно отметить, что при оценке всех указанных различающихся схем дозирования у мышей не наблюдалось связанной с лечением токсичности, что продемонстрировано отсутствием значимого снижения массы тела (данные не показаны).

Обсуждение

[0421] В текущем клиническом испытании I/II фазы (ClinicalTrials.gov, NCT01631552), при применении IMMU-132 (сацитузумаб говитекан) наблюдаются объективные ответы у пациентов с широким диапазоном солидных опухолей (Starodub et al., 2015, Clin Cancer Res 21:3870-78). По мере продолжения указанного клинического испытания I/II фазы должна быть дополнительно исследована эффективность IMMU-132 для лечения расширенного списка Trop-2-положительных видов рака. Кроме того, по мере продвижения клинической разработки необходимы дополнительные исследования для выяснения механизмов уникальности IMMU-132, отличающих его от других клинически релевантных ADC, в которых используются ультратоксичные лекарственные средства.

[0422] В представленной в настоящем документе работе IMMU-132 дополнительно охарактеризован, и продемонстрирована его эффективность против аденокарциномы желудка и поджелудочной железы при использовании клинически релевантных схем дозирования. Преобладает мнение, что эффективный ADC должен включать антитело, распознающее антиген, отличающийся высокими уровнями экспрессии в опухоли по сравнению с нормальными тканями, и предпочтительно интернализующееся при связывании с опухолевыми клетками (Panowski et al., 2014, mAbs 6:34-45). Все одобренные к настоящему времени ADC включают ультратоксичное лекарственное средство (IC50 в пикомолярном диапазоне), соединенное с антителом высокостабильным линкером, с низкими коэффициентами замещения (2-4 молекулы лекарственного средства на антитело). IMMU-132 расходится с указанной парадигмой в трех основных аспектах: (i) в качестве химиотерапевтического агента применяют SN-38, умеренно цитотоксичное лекарственное средство (нМ IC₅₀); (ii) SN-38 сайт-специфическим образом конъюгирован с 8 межцепочечными тиолами антитела, что дает коэффициент замещения = 7,6 молекул лекарственного средства на антитело; и (iii) применяют карбонатный линкер, расщепляемый при низких значениях рН, однако также высвобождающий лекарственное средство со временем полужизни в сыворотке ~24 ч (Cardillo et al., 2011, Clin Cancer Res 17:3157-69). IMMU-132 состоит из антитела, которое интернализуется после связывания с эпитопом, как было показано авторами изобретения, специфическим для Trop-2 человека, который экспрессируется на высоких уровнях в эпителиальных опухолях разнообразных типов, а также, в более низких концентрациях, в соответствующих им нормальных тканях (Shih et al., 1995, Cancer Res 55:5857s-63s). Предшествующие исследования на обезьянах, у которых также экспрессируется Trop-2 в аналогичных тканях, показали, что, несмотря на присутствие Trop-2 в нормальных тканях, гистопатологические изменения были относительно мягкими и обратимыми даже при очень высоких дозах, при которых возникали дозолимитирующие нейтропения и диарея, что предполагает, что указанный антиген в нормальных тканях каким-то образом секвестрирован, или что применение менее токсичного лекарственного средства предотвращало серьезное повреждение указанных нормальных тканей (Cardillo et al., 2011, Clin Cancer Res 17:3157-69).

[0423] В настоящем документе авторы изобретения представили расширенную оценку экспрессии Trop-2 в нескольких линиях солидных опухолей человека, исследовав экспрессию in vitro с большим акцентом на количественном подходе, чем в более ранних сообщениях, однако также, что важно, оценку в ксенотрансплантатах с иллюстративной экспрессией Trop-2 в диапазоне от гомогенной (например, NCIN87) до выраженно фокальной (например, COLO 205). В целом, уровни поверхностной экспрессии Trop-2, определенные in vitro, коррелировали с интенсивностью окрашивания в ИГХ-анализе ксенотрансплантатов. В частности, интересно отметить, что даже в такой опухоли, как COLO 205, где при иммуногистологическом анализе обнаруживались исключительно фокальные скопления экспрессирующих Trop-2 клеток, IMMU-132 все же был способен вызывать специфический регресс опухоли, что указывает на возможное возникновение «эффекта свидетеля» в результате высвобождения SN-38 из конъюгата, связанного с антигенпрезентирующими клетками (Cardillo et al., 2011, Clin Cancer Res 17:3157-69). Так, SN-38 легко проникает через мембраны клеток, и, соответственно, локальное высвобождение в пределах микроокружения опухоли обеспечивает другой механизм его входа в клетки, не требующий интернализации интактного конъюгата. Важно отметить, что SN-38, связанный с конъюгатом, остается полностью активным; то есть он не глюкуронидирован и находится в форме лактонного кольца в момент высвобождения (Sharkey et al., 2015, Clin Cancer Res, 21:5131-8). Указанное свойство является уникальным, обеспечивая отличающую IMMU-132 способность к более селективной локализации полностью активной формы SN-38 по сравнению с любыми другими SN-38 или иринотекановыми агентами для медленного высвобождения, исследованными к настоящему времени.

[0424] В клиническом испытании I фазы идентифицированы дозировки IMMU-132 от 8 до 10 мг/кг, вводимые еженедельно на протяжении двух недель 21-дневного цикла, для дополнительного исследования во II фазе (Starodub et al., 2015, Clin Cancer Res 21:3870-78). У пациентов с широким диапазоном метастатических солидных опухолей, в том числе раком поджелудочной железы и желудка, наблюдались продленные периоды стабилизации заболевания, после рецидивов, возникавших после пройденной несколько раз предшествующей терапии (Starodub et al., 2015, Clin Cancer Res 21:3870-78; Starodub et al., 2014, J Clin Oncol 32:5s (Suppl Abstr 3032)). Были проведены дополнительные исследования в моделях с ксенотрансплантатами для определения возможной большей эффективности других схем дозирования. С этой целью дозу, эквивалентную дозе 8 мг/кг у человека (доза для мыши 98,4 мг/кг) разделяли на части согласно трем разным схемам дозирования, включающим введение один раз в две недели; еженедельно; или два раза в неделю в ходе 21-дневного цикла. В моделях опухолей поджелудочной железы и желудка между какими-либо из трех схем не наблюдалось значимого различия терапевтических ответов; при этом опухоли прогрессировали только после прекращения терапии. Соответственно, указанные данные свидетельствуют в пользу продолжения применения режима дозирования с еженедельным однократным введением, в настоящее время используемого в клиническом испытании.

[0425] С учетом рекомендованной на основании клинических испытаний разовой лечебной дозы IMMU-132 от 8 до 10 мг/кг (Starodub et al., 2015, Clin Cancer Res 21:3870-78), важно было исследовать, может ли антитело по отдельности вносить вклад в активность IMMU-132. Предыдущие исследования в моделях с ксенотрансплантатами опухолей человека на мышах Nude включали неконъюгированный IgG hRS7 по отдельности (например, многократное введение доз от 25 до 50 мг/кг), который не проявил терапевтической активности (Cardillo et al., 2011, Clin Cancer Res 17:3157-69); однако исследования на мышах не всегда позволяют предсказать иммунологическую функциональность. АЗКЦ-активность hRS7 in vitro была описана при Trop-2-положительных карциномах яичников и матки (Raji et al., 2011, J Exp Clin Cancer Res 30:106; Bignotti et al., 2011, Int J Gynecol Cnacer 21:1613-21; Varughese et al., 2011, Am J Obstet Gynecol 205:567; Varughese et al., 2011, Cancer 117:3163-72). Авторы настоящего изобретения подтвердили АЗКЦ-активность неконъюгированного hRS7 в трех разных линиях клеток, однако обнаружили, что IMMU-132 терял 60-70% эффекторной функции. Поскольку восстановленный/NEM-блокированный IgG отличался аналогичным снижением АЗКЦ-активности, прикрепление компонента CL2A-SN-38 само по себе, предположительно, не имело к этому отношения.

[0426] Антитела также могут вызывать смерть клеток, действуя на различные апоптотические сигнальные пути. Однако авторы настоящего изобретения не наблюдали каких-либо эффектов неконъюгированного антитела на ряд апоптотических сигнальных путей, зато при этом было отмечено, что IMMU-132 стимулировал внутренние апоптотические явления аналогичным SN-38 образом. Ранние события включают фосфорилирование JNK1/2, а также положительную регуляцию p21WAF1/Cip1, ведущую к активации каспазы-9, -7 и -3, конечным результатом которой является расщепление PARP и значимые уровни разрывов дцДНК, по оценке на основании увеличения количества фосфорилированного гистона Н2АХ (γН2АХ)41. Указанные данные предполагают, что первичный механизм действия IMMU-132 связан с SN-38.

[0427] При анализе методом поверхностного плазмонного резонанса (BIACORE) значимого различия связывания IMMU-132 с неонатальным рецептором человека (FcRn) не было детектировано, несмотря на то, что средние уровни связывания для IMMU-132 приблизительно в 2 раза ниже. Связывание с FcRn было ассоциировано с продлением времени полужизни IgG в сыворотке (Junghans & Anderson, 1996, Proc Natl Acad Sci USA 93:5512-16), однако, поскольку аффинность антитела к FcRn in vitro необязательно коррелирует со скоростью выведения in vivo (Datta-Mannan et al., 2007, J Biol Chem 282:1709-17), итоговая важность указанного связывания неизвестна. В предыдущих экспериментах на несущих опухоль мышах с применением ¹¹¹In-DTPA-IMMU-132 обнаружено, что скорость выведения указанного конъюгата из сыворотки была несколько выше, чем у ¹¹¹In-DTPA-hRS7, хотя оба демонстрировали аналогичное поглощение опухолью (Cardillo et al., 2011, Clin Cancer Res 17:3157-69). В ходе текущих исследований при ИФА ELISA, также измеряющем выведение IgG-компонента, было обнаружено, что скорости выведения IMMU-132 и восстановленного и NEM-блокированного IgG были аналогичными скоростям для неконъюгированного hRS7, что предполагает, что соединение с межцепочечными дисульфидами не дестабилизирует антитело. Как и ожидалось, при применении ИФА ELISA для мониторинга выведения интактного конъюгата (захват с применением антитела против SN-38 и зонда с антителом против идиотипического антитела), скорость выведения была выше, чем при мониторинге только IgG-компонента. Указанное различие всего лишь отражает высвобождение SN-38 из конъюгата со временем полужизни ~1 день. Авторы изобретения также исследовали скорости выведения конъюгатов сацитузумаба говитекана с разными уровнями замещения, с применением ИФА ELISA, и также не обнаружили значимых различий скоростей выведения (Goldenberg et al., 2015, Oncotarget 8:22496-512). В целом, указанные данные предполагают, что мягкое восстановление антитела с последующей сайт-специфической модификацией некоторых или всех межцепочечных дисульфидов оказывает минимальное воздействие или вообще не оказывает воздействия на выведение IgG из сыворотки, при этом общая скорость выведения IMMU-132 определяется в значительной степени скоростью высвобождения SN-38 линкером.

[0428] Кроме того, обширные эксперименты по связыванию с клетками продемонстрировали отсутствие значимых различий связывания IMMU-132, неконъюгированного антитела или NEM-модифицированного антитела, что предполагает, что сайт-специфическое присоединение к межцепочечным дисульфидам сохраняет антигенсвязывающие свойства антитела. Интересно, что в анализе BIACORE, который позволяет точнее измерить скорости связывания и диссоциации, помимо общей аффинности, IMMU-132 показал значимое 2-кратное увеличение расчетных значений KD для связывания Trop-2 по сравнению с голым hRS7.

[0429] Авторы настоящего изобретения предполагают, что указанное увеличение может быть результатом повышения гидрофобности при конъюгации SN-38 с антителом. Гидрофобные остатки, а также гидрофобность закрытых областей сайтов связывания белка, как было показано, усиливают аффинность в отношении эпитопа (Park et al., 2000, Nat Biotechnol 18:194-98; Berezov et al., 2001, J Med Chem 44:2565-74; Young et al., 2007, Proc Natl Acad Sci USA 104:808013). Указанные области необязательно должны находиться на интерфейсе белок-белкового взаимодействия, и могут располагаться на окружающих остатках, обеспечивающих энергетически менее выгодные контакты (Li et al., 2005, Structure 13:297-307). Хотя ни один из сайтов конъюгации SN-38 не располагается в определяющих комплементарность областях (CDR) hRS7, нельзя исключать возможность того, что SN-38 на антителе может замещать некоторое количество молекул воды вокруг эпитопа, что приводит к наблюдаемому повышению аффинности связывания IMMU-132 относительно голого hRS7.

[0430] При разработке ADC усилия были направлены в основном на применение стабильного линкера и ультратоксичного лекарственного средства; доклинические исследования свидетельствовали о специфических оптимальных требованиях для указанных конъюгатов (Panowski et al., 2014, mAbs 6:34-45; Phillips et al., 2008, Cancer Res 68:9280-90). Например, при сравнении T-DM1 с другим, менее стабильным производным, T-SSPDM1, обнаружено, что интактный T-SSP-DM1 выводился приблизительно в 2 раза быстрее, чем T-DM-1, у не несущих опухолей мышей (Phillips et al., 2008, Cancer Res 68:9280-90; Erickson et al., 2012, Mol Cancer Ther 11:1133-42), при 1,5-кратно более высоких уровнях T-DM1 по сравнению с T-SSPDM1 в опухолях. Неожиданное и крайне интересное открытие заключалось в том, что количество свободных активных метаболитов мейтансиноида в целевых опухолях было в значительной степени сходным для двух ADC (Erickson et al., 2012, Mol Cancer Ther 11:1133-42).

[0431] Другими словами, T-SSP-DM1 был способен компенсировать недостаток стабильности линкера за счет того, что более низкая стабильность приводила к более эффективному высвобождению лекарственного средства в опухоли по сравнению с высвобождением более стабильным T-DM1. Закономерным образом, указанная эквивалентность активных катаболитов лекарственного средства из двух ADC в опухолях приводила к аналогичным противоопухолевым эффектам у несущих опухоли животных. В конечном итоге был выбран T-DM1 с учетом проблем токсичности, возникающих при применении ультратоксичного лекарственного средства и менее стабильных линкеров (Phillips et al., 2008, Cancer Res 68:9280-90). Поскольку SN-38 по меньшей мере на один порядок по log-шкале менее токсичен, чем указанные майтансины, ожидается, что его высвобождение из ADC будет приводить к меньшей токсичности. Однако даже при высвобождении в сыворотке количество SN-38, локализованного в ксенотрансплантатах опухоли желудка или поджелудочной железы человека, до 136 раз превышало количество у несущих опухоли мышей, которым инъецировали дозы иринотекана, содержащие более чем в 20 раз больше эквивалентов SN-38 (Sharkey et al., 2015, Clin Cancer Res, 21:5131-8). При тестировании авторами настоящего изобретения более стабильных линкеров при разработке IMMU-132 они были значимо менее эффективны в моделях с ксенотрансплантатами опухолей по сравнению с IMMU-132 (Govindan et al., 2013, Mol Cancer Ther 12:968-78).

[0432] Аналогичным образом, линкеры, высвобождавшие SN-38 быстрее (например, со временем полужизни в сыворотке ~10 ч) также были менее эффективны в моделях с ксенотрансплантатами (Moon et al., 2008, J Med Chem 51:6916-26; Govindan et al., 2009, Clin Chem Res 15:6052-61), предполагая наличие оптимального окна высвобождения SN-38, обеспечивающего улучшенную эффективность. Соответственно, имеющиеся к настоящему времени данные демонстрируют, что IMMU-132 представляет собой более эффективный способ нацеливания и высвобождения лекарственного средства в опухоли, чем иринотекан.

[0433] Ранние клинические исследования показали обнадеживающие объективные ответы в различных солидных опухолях, и, что важно отметить, лучший профиль безопасности, с меньшей частотой встречаемости диареи по сравнению с терапией иринотеканом (Starodub et al., 2015, Clin Cancer Res 21:3870-78).

[0434] Обобщая вышесказанное, IMMU-132 (сацитузумаб говитекан) представляет собой смену парадигмы при разработке ADC. В нем используется умеренно-стабильный линкер для конъюгации 7-8 молекул лучше переносимого активного метаболита иринотекана, SN-38, с антителом против Trop-2. Несмотря на указанные кажущиеся противоречивыми характеристики по сравнению с ультратоксичными ADC, неклинические исследования продемонстрировали, что IMMU-132 обеспечивает очень эффективное нацеливание на Trop-2-экспрессирующие опухоли со значимой эффективностью в отсутствие поддающейся оценке токсичности. В ранних клинических испытаниях I/II фазы против широкого диапазона солидных опухолей, в том числе поджелудочной железы, желудка, ТНРМЖ, мелкоклеточных и немелкоклеточных карцином легких, IMMU-132 сходным образом демонстрирует противоопухолевые эффекты при управляемой токсичности у указанных пациентов, в отсутствие детектированного иммунного ответа как на IgG, так и на SN-38, даже после многих месяцев дозирования (Starodub et al., 2015, Clin Cancer Res 21:3870-78). Ввиду повышенной экспрессии Trop-2 на таком широком спектре солидных опухолей, продолжаются клинические исследования IMMU-132, в частности, при распространенном раке, рефрактерном к большинству современных стратегий терапии.

Пример 18. Дополнительные результаты клинических исследований I/II фазы

Рак молочной железы с тройным негативным фенотипом (ТНРМЖ)

[0435] Клиническое испытание I/II фазы (NCT01631552), описанное в разделе примеров выше, было продолжено, с привлечением 56 пациентов с ТНРМЖ, которые получали лечение 10 мг/кг. Популяция пациентов ранее, до начала терапии IMMU-132, получала обширное лечение, задействовавшее по меньшей мере 2 предшествующих линии терапии, включая лечение таксанами. Предыдущее лечение включало циклофосфамид, доксорубицин, карбоплатин, гемцитабин, капецитабин, эрибулин, цисплатину, анастрозол, винорелбин, бевацизумаб и тамоксифен. Несмотря на указанную историю обширного лечения пациенты с ТНРМЖ хорошо отвечали на IMMU-132, при этом у 2 пациентов наблюдался полный ответ (ПО), у 13 - частичный ответ (ЧО), и у 25 - стабильное заболевание (СЗ), с показателем объективного ответа, равным 29% (15/52) (не показано). На основании сложения частоты ПО+ЧО+СЗ, лечение при ТНРМЖ приводило к 71% показателю благоприятного ответа у получавших лечение IMMU-132 пациентов (не показано). Медианное время до прогрессирования в указанной ранее проходившей серьезное лечение популяции пациентов с ТНРМЖ составляло 9,4 месяца, с диапазоном от 2,9 до 14,2 месяцев к настоящему времени. Однако 72% пациентов в исследовании продолжали получать лечение.

Метастатический НМРЛ

[0436] Клиническое испытание также продолжается для пациентов с метастатическим немелкоклеточным раком легкого (НМРЛ), при этом к настоящему времени привлечено 29 поддающихся оценке пациентов, которые получали лечение 8 или 10 мг/кг IMMU-132. Определяли наилучшие ответы по критериям шкалы RESIST 1.1 (не показано). Из 29 пациентов у 8 наблюдалось 40 и у 13 - СЗ. Время до прогрессирования для пациентов с НМРЛ показало, что у 21/33 (64%) пациентов с НМРЛ наблюдались 40 или СЗ (не показано). Медианное время до прогрессирования составляло 9/4 месяцев, с диапазоном от 1,8 до 15,5+ месяцев, при этом 47% пациентов продолжают получать лечение. Определяли выживаемость без прогрессирования у пациентов с НМРЛ, получавших лечение 8 или 10 мг/кг IMMU-132 (не показано). Медианная ВБП составляла 3,4 месяца при дозе 8 мг/кг и 3,8 месяцев при дозе 10 мг/кг. Однако исследования еще продолжаются, и показатели медианной выживаемости без прогрессирования, вероятно, будут улучшаться.

Метастатический МРЛ

[0437] Сопоставимые результаты наблюдались у пациентов с метастатическим МРЛ (не показано). Наблюдаемое медианное время до прогрессирования (не показано) составляло 4,9 месяцев, с диапазоном от 1,8 до 15,7+ месяцев, при этом 7 пациентов продолжают получать лечение IMMU-132. Наблюдаемая медианная ВБП (выживаемость без прогрессирования) (не показано) составляла 2,0 месяцев при дозе 8 мг/кг и 3,6 месяцев при дозе 10 мг/кг. Медианная ОВ (общая выживаемость) составляла 8,1 месяцев при дозе 8 мг/кг, и пока не может быть определена для 10 мг/кг.

Уротелиальный рак

[0438] Аналогичные результаты получали для пациентов с уротелиальным раком, получавших лечение 8 или 10 мг/кг IMMU-132. Наилучший наблюдаемый ответ для 11 поддающихся оценке пациентов соответствовал 6 ЧО и 2 СЗ (не показано). Наблюдаемая медианное время до прогрессирования (не показано) составляло 8,1 месяцев, с диапазоном от 3,6 до 9,7+ месяцев.

[0439] Обобщая вышесказанное, продолжающееся клиническое испытание I/II фазы продемонстрировало превосходящую эффективность IMMU-132 при введении ADC в указанных дозировках, по меньшей мере при ТНРМЖ, НМРЛ, МРЛ и уротелиальном раке. Превосходящий терапевтический эффект у указанных предварительно подвергавшихся серьезному лечению и устойчивых метастатических раковых заболеваний не сопровождался серьезной токсичностью, которая может препятствовать клиническому применению. IMMU-132 показал приемлемый профиль безопасности у предварительно проходивших серьезное лечение пациентов с различными видами солидного рака, в среднем подвергавшихся предшествующей терапии 2-5 раз (медианное значение). Только в случае нейтропении частота встречаемости нежелательных реакций 3 класса или выше превышала 20% популяции пациентов. Указанное исследование также демонстрирует, что дозы IMMU-132 могут многократно вводиться пациентам-людям, при терапевтических дозировках, не вызывая взаимодействия с антителами хозяина против IMMU-132. Указанные результаты демонстрируют безопасность и полезность IMMU-132 для лечения разнообразных Trop-2-положительных раковых заболеваний у пациентов-людей.

* * *

[0440] На основе приведенного выше описания специалист в данной области техники сможет легко установить существенные характеристики настоящего изобретения и, без отступления от существа и объема настоящего изобретения, сможет вносить различные изменения и модификации согласно настоящему изобретению для адаптации к различным вариантам применения и условиям, не прибегая к излишнему экспериментированию. Все патенты, патентные заявки и публикации, цитируемые в настоящем документе, включены в него посредством ссылок.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для лечения Trop-2-положительного рака у пациента. Для этого пациенту-человеку с Trop-2-положительным раком вводят конъюгат антитело-лекарственное средство (ADC). При этом у пациента произошел рецидив после лечения ингибитором контрольной точки или наблюдается рефрактерность к лечению ингибитором контрольной точки. Указанный ADC содержит SN-38, конъюгированный с линкерным фрагментом, присоединенным к антителу против Trop-2 или его антигенсвязывающему фрагменту. При этом антитело представляет собой антитело hRS7. Указанный линкер представляет собой CL2A. ADC имеет структуру MAb-CL2A-SN-38. Изобретение обеспечивает лечение пациентов с Trop-2-положительным раком, устойчивым к лечению ингибиторами контрольной точки. 20 з.п. ф-лы, 11 табл., 5 ил., 18 пр.

1. Способ лечения Trop-2-положительного рака, включающий введение пациенту-человеку с Trop-2-положительным раком конъюгата антитело-лекарственное средство (ADC), содержащего SN-38, конъюгированный с линкерным фрагментом, присоединенным к антителу против Trop-2 или его антигенсвязывающему фрагменту, характеризующийся тем, что у указанного пациента произошел рецидив после лечения ингибитором контрольной точки или наблюдается рефрактерность к лечению ингибитором контрольной точки,

причем указанное антитело против Trop-2 представляет собой антитело hRS7, содержащее последовательности CDR легкой цепи CDR1 (KASQDVSIAVA, SEQ ID NO:1); CDR2 (SASYRYT, SEQ ID NO:2); и CDR3 (QQHYITPLT, SEQ ID NO:3), и последовательности CDR тяжелой цепи CDR1 (NYGMN, SEQ ID NO:4); CDR2 (WINTYTGEPTYTDDFKG, SEQ ID NO:5) и CDR3 (GGFGSSYWYFDV, SEQ ID NO:6);

указанный линкер представляет собой CL2A, а ADC имеет структуру MAb-CL2A-SN-38

MAb-CL2A-SN-38.

2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что указанный ингибитор контрольной точки представляет собой ингибитор PD-1, PD-L1 или CTLA-4.

3. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что указанный ингибитор контрольной точки выбран из группы, состоящей из MPDL3280A, пембролизумаба, ниволумаба, ипилимумаба, пидилизумаба, MDX-1105, дурвалумаба, BMS-936559 и тремелимумаба.

4. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что указанный ингибитор контрольной точки представляет собой MPDL3280A.

5. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что указанный рак выбран из группы, состоящей из рака ободочной и прямой кишки, легкого, желудка, мочевого пузыря, почки, поджелудочной железы, молочной железы, яичника, матки, пищевода и предстательной железы.

6. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что указанный рак представляет собой рак молочной железы с тройным негативным фенотипом.

7. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что указанный рак выбран из группы, состоящей из рака молочной железы с тройным негативным фенотипом, HER+, ER+, прогестерон-положительного рака молочной железы, метастатического немелкоклеточного рака легкого, метастатического мелкоклеточного рака легкого, метастатического рака эндометрия, метастатического уротелиального рака и метастатического рака поджелудочной железы.

8. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что указанный ADC вводят в дозировке от 3 мг/кг до 18 мг/кг.

9. Способ по п. 8, характеризующийся тем, что указанная дозировка выбрана из группы, состоящей из 3 мг/кг, 4 мг/кг, 6 мг/кг, 7 мг/кг, 8 мг/кг, 9 мг/кг, 10 мг/кг, 11 мг/кг, 12 мг/кг, 16 мг/кг и 18 мг/кг.

10. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что указанный ADC вводят в дозировке от 8 мг/кг до 12 мг/кг.

11. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что указанный ADC вводят в дозировке от 8 мг/кг до 10 мг/кг.

12. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что указанный ADC вводят в дозировке 10 мг/кг.

13. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что лечение приводит к снижению размера опухоли, составляющему по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30% или по меньшей мере 40%.

14. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что указанный рак является метастатическим.

15. Способ по п. 14, дополнительно включающий уменьшение размеров или элиминацию метастазов.

16. Способ по п. 1, дополнительно включающий применение у указанного пациента по меньшей мере одного другого вида противораковой терапии, выбранного из группы, состоящей из хирургического вмешательства, внешнего облучения, радиоиммунотерапии, иммунотерапии, химиотерапии, антисмысловой терапии, терапии с применением РНК-интерференции, лечения терапевтическим агентом и генной терапии.

17. Способ по п. 16, характеризующийся тем, что указанный терапевтический агент представляет собой лекарственное средство, токсин, иммуномодулятор, второе антитело, антигенсвязывающий фрагмент второго антитела, проапоптотический агент, токсин, РНКазу, гормон, радионуклид, антиангиогенный агент, миРНК, РНК-интерференцию, химиотерапевтический агент, цитокин, хемокин, пролекарство или фермент.

18. Способ по п. 17, характеризующийся тем, что указанное лекарственное средство выбрано из группы, состоящей из 5-фторурацила, афатиниба, аплидина, азарибина, анастрозола, антрациклинов, акситиниба, AVL-101, AVL-291, бендамустина, блеомицина, бортезомиба, бозутиниба, бриостатина-1, бусульфана, калихеамицина, камптотецина, карбоплатина, 10-гидроксикамптотецина, кармустина, целебрекса, хлорамбуцила, цисплатины, ингибиторов Cox-2, иринотекана (CPT-11), SN-38, карбоплатина, кладрибина, камптотеканов, кризотиниба, циклофосфамида, цитарабина, дакарбазина, дазатиниба, динациклиба, доцетаксела, дактиномицина, даунорубицина, доксорубицина, 2-пирролинодоксорубицина (2P-DOX), циано-морфолинодоксорубицина, глюкуронида доксорубицина, глюкуронида эпирубицина, эрлотиниба, эстрамустина, эпидофиллотоксина, эрлотиниба, энтиностата, связывающих рецепторы эстрогена агентов, этопозида (VP16), глюкуронида этопозида, фосфата этопозида, эксеместана, финголимода, флоксуридина (FUdR), 3',5'-O-диолеоил-FudR (FUdR-dO), флударабина, флутамида, ингибиторов фарнезил-протеинтрансферазы, флавопиридола, фостаматиниба, ганетеспиба, GDC-0834, GS-1101, гефитиниба, гемцитабина, гидроксимочевины, ибрутиниба, идарубицина, иделалисиба, ифосфамида, иматиниба, L-аспарагиназы, лапатиниба, леналидомида, лейковорина, LFM-A13, ломустина, мехлорэтамина, мелфалана, меркаптопурина, 6-меркаптопурина, метотрексата, митоксантрона, митрамицина, митомицина, митотана, навельбина, нератиниба, нилотиниба, нитрозомочевины, олапариба, пликамицина, прокарбазина, паклитаксела, PCI-32765, пентостатина, PSI-341, ралоксифена, семустина, сорафениба, стрептозоцина, SU11248, сунитиниба, тамоксифена, темозоломида (водная форма дакарбазина (DTIC)), трансплатины, талидомида, тиогуанина, тиотепы, тенипозида, топотекана, урамустина, ваталаниба, винорелбина, винбластина, винкристина, алкалоидов барвинка и ZD1839.

19. Способ по п. 17, характеризующийся тем, что указанный иммуномодулятор выбран из группы, состоящей из цитокинов, лимфокинов, монокинов, факторов роста стволовых клеток, лимфотоксинов, гематопоэтических факторов, колониестимулирующих факторов (КСФ), интерферонов (ИФН), паратиреоидного гормона, тироксина, инсулина, проинсулина, релаксина, прорелаксина, фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), тиреотропного гормона (ТТГ), лютеинизирующего гормона (ЛГ), фактора роста печени, простагландина, фактора роста фибробластов, пролактина, плацентарного лактогена, белка OB, трансформирующего фактора роста (ТФР), ТФР-α, ТФР-β, инсулиноподобного фактора роста (ИФР), эритропоэтина, тромбопоэтина, фактора некроза опухоли (ФНО), ФНО-α, ФНО-β, мюллеровой ингибирующей субстанции, гонадотропин-ассоциированного пептида мышей, ингибина, активина, фактора роста эндотелия сосудов, интегрина, интерлейкина (ИЛ), гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ), гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ), интерферона-α, интерферона-β, интерферона-γ, фактора S1, ИЛ-1, ИЛ-1-cc, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-8, ИЛ-9, ИЛ-10, ИЛ-11, ИЛ-12, ИЛ-13, ИЛ-14, ИЛ-15, ИЛ-16, ИЛ-17, ИЛ-18 ИЛ-21, ИЛ-23, ИЛ-25, лейкоз-ингибирующего фактора (ЛИФ), Kit-лиганда, FLT-3, ангиостатина, тромбоспондина и эндостатина.

20. Способ по п. 17, характеризующийся тем, что указанный радионуклид выбран из группы, состоящей из ¹¹C, ¹³N, ¹⁵O, ³²P, ³³P, ⁴⁷Sc, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁶²Cu, ⁶⁷Cu, ⁶⁷Ga, ⁶⁷Ga, ⁷⁵Br, ⁷⁵Se, ⁷⁵Se, ⁷⁶Br, ⁷⁷As, ⁷⁷Br, ^80mBr, ⁸⁹Sr, ⁹⁰Y, ⁹⁵Ru, ⁹⁷Ru, ⁹⁹Mo, ^99mTc, ^103mRh, ¹⁰³Ru, ¹⁰⁵Rh, ¹⁰⁵Ru, ¹⁰⁷Hg, ¹⁰⁹Pd, ¹⁰⁹Pt, ¹¹¹Ag, ¹¹¹In, ^113mIn, ¹¹⁹Sb, ^121mTe, ^122mTe, ¹²⁵I, ^125mTe, ¹²⁶I, ¹³¹I, ¹³³I, ¹⁴²Pr, ¹⁴³Pr, ¹⁴⁹Pm, ¹⁵²Dy, ¹⁵³Sm, ¹⁶¹Ho, ¹⁶¹Tb, ¹⁶⁵Tm, ¹⁶⁶Dy, ¹⁶⁶Ho, ¹⁶⁷Tm, ¹⁶⁸Tm, ¹⁶⁹Er, ¹⁶⁹Yb, ¹⁷⁷Lu, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ^189mOs, ¹⁸⁹Re, ¹⁹²Ir, ¹⁹⁴Ir, ¹⁹⁷Pt, ¹⁹⁸Au, ¹⁹⁹Au, ¹⁹⁹Au, ²⁰¹Tl, ²⁰³Hg, ²¹¹At, ²¹¹Bi, ²¹¹Pb, ²¹²Bi, ²¹²Pb, ²¹³Bi, ²¹⁵Po, ²¹⁷At, ²¹⁹Rn, ²²¹Fr, ²²³Ra, ²²⁵Ac, ²²⁷Th и ²⁵⁵Fm.

21. Способ по п. 17, характеризующийся тем, что указанный токсин выбран из группы, состоящей из рицина, абрина, рибонуклеазы (РНКазы), ДНКазы I, стафилококкового энтеротоксина А, противовирусного белка лаконоса, гелонина, дифтерийного токсина, экзотоксина Pseudomonas и эндотоксина Pseudomonas.