ЛЕЧЕНИЕ ТРИЖДЫ НЕГАТИВНОГО РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ, ХАРАКТЕРИЗУЮЩЕГОСЯ ЭКСПРЕССИЕЙ Trop-2, С ПОМОЩЬЮ САЦИТУЗУМАБА ГОВИТЕКАНА И ИНГИБИТОРА Rad51 Российский патент 2021 года по МПК A61K39/395 A61K31/33 A61K31/337 A61K31/4015 A61K31/52 A61P35/00 

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[01] В настоящей заявке испрашивается приоритет, в соответствии с параграфом 119(e) раздела 35 Кодекса законов США, по предварительной заявке США 62/477,216, поданной 27 марта 2017 г., текст которой включен в данный документ в полном объеме посредством ссылки.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[02] Настоящая заявка содержит Перечень Последовательностей, который был подан в формате ASCII через EFS-Web и включен посредством ссылки в полном его объеме. Указанная копия ASCII, созданная 14 марта 2018 года, названа IMM372WO1_SL и имеет размер 7916 байт.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[03] Настоящее изобретение относится к комбинированной терапии конъюгатами анти-Trop-2 антитело-лекарственное средство (КАС - ADC - antibody-drug conjugate) и ингибиторами Rad51 для лечения рака, характеризующегося экспрессией Trop-2. Лекарственные средства, конъюгированные с анти-Trop-2 антителом, могут представлять собой такие, которые индуцируют разрывы цепей ДНК, такие как ауристатины, калихеамицины, камптотецины (например, SN-38) или антрациклины. Примеры лекарственных средств, индуцирующих разрывы цепи ДНК, включают, но не ограничиваются ими, SN-38, топотекан, доксорубицин, этопозид, цисплатин, оксалиплатин или карбоплатин. Предпочтительно, рак представляет собой трижды негативный рак молочной железы (ТНРМЖ - TNBC - triple-negative breast cancer), мелкоклеточный рак легкого (МКРЛ - SCLC - small cell lung cancer), немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ - NSCLC - non-small cell lung cancer), уротелиальный рак, рак желудка, рак поджелудочной железы, колоректальный рак, рак предстательной железы, рак яичников, рак почки или рак мочевого пузыря, хотя любой тип рака, характеризующегося экспрессией Trop-2, может подвергаться лечению. Более предпочтительно указанный КАС представляет собой конъюгат анти-Trop-2-SN-38, такой как сацитузумаб говитекан. В некоторых вариантах осуществления изобретения линкер, такой как CL2A, может быть использован для присоединения лекарственного средства к антителу или фрагменту антитела. Однако могут быть использованы другие линкеры, другие известные цитотоксические лекарственные средства и другие известные способы конъюгирования лекарственных средств с антителами. Антитело или его фрагмент могут быть присоединены к 1-12, 1-6, 1-5, 6-8 или 7-8 копиям фрагмента лекарственного средства или фрагмента лекарственное средство-линкер на антитело или фрагмент. КАС применяются для лечения пациентов, которые либо устойчивы к, либо страдают от рецидивов при традиционных противораковых способах лечения, таких как химиотерапия. Однако в других вариантах осуществления КАС могут быть использованы для первой линии лечения рака Trop-2+, такого как ТНРМЖ. Удивительно, что КАС используются для лечения онкологических пациентов, которые либо страдают от рецидивов, либо не реагируют на терапию иринотеканом или топетеканом, несмотря на то, что они также являются ингибиторами топоизомеразы I. Комбинированную терапию можно применять отдельно или вместе с одним или более другими терапевтическими средствами, выбранными из группы, состоящей из хирургии, лучевой терапии, химиотерапии, иммуномодуляторов, цитокинов, химиотерапевтических агентов, проапоптотических агентов, антиангиогенных агентов, цитотоксических агентов, лекарственных средств, токсинов, радионуклидов, РНКи, миРНК, второго антитела или фрагмента антитела и иммуноконъюгата. Может быть использован любой ингибитор Rad51, известный в данной области техники, такой как B02 ((E)-3-бензил-2(2-(пиридин-3-ил)винил)хиназолин-4(3H)-он) (Huang & Mazin, 2014, PLoS ONE 9(6):e100993); RI-1 (3-хлор-1-(3,4-дихлорфенил)-4-(4-морфолинил)-1H-пиррол-2,5-дион) (Budke et al., 2012, Nucl Acids Res 40:7347-57); DIDS (4,4'-диизотиоцианостильбен-2,2'-дисульфоновая кислота) (Ishida et al., 2009, Nucl Acids Res 37:3367-76); галенахинон (Takaku et al., 2011, Genes Cells 16:427-36); или иматиниб (Choudhury et al., 2009, Mol Cancer Ther 8:203-13).

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[04] Конъюгаты антитело-лекарственное средство (КАС), содержащие антитела, связанные с активными терапевтическими агентами, для селективной доставки токсической полезной нагрузки к раковым клеткам, одобрены для лимфомы Ходжкина, системной анапластической крупноклеточной лимфомы и для HER2-положительного метастатического рака молочной железы, c несколькими новыми КАС в стадии разработки, которые нацелены на множество антигенов, ассоциированных с опухолями кроветворной ткани и солидными опухолями (de Goeij & Lambert, 2016, Curr Opin Immunol 40:14-231-4; Gravanis et al., 2016, Oncologist 21:102-9; Jerjian et al., 2016, Pharmacotherapy 36:99-116; Govindan et al., 2016, Expert Opin Biol Ther 16:883-93). Почти все КАС используют лекарственные средства с пикомолярной токсичностью, такие как калихеамицин, который расщепляет ДНК, или ауристатин, или майтанзин в качестве ингибиторов микротрубочек. Их не применяют в качестве самостоятельных агентов из-за высокой токсичности. Однако, при соответствующем связывании с антителами, их терапевтическое окно является приемлемым, при этом тщательный выбор подходящего антитела и методики линкера имеет решающее значение для успешного клинического применения.

[05] Авторами изобретения разработаны КАС на основе хорошо известного противоракового лекарственного средства SN-38, камптотецина, который является активным компонентом иринотекана (CPT-11), ингибитора топоизомеразы I (Garcia-Carbonero & Supko, 2002, Clin Cancer Res 8:641-615; Mathijssen et al., 2001, Clin Cancer Res 7:2182-94). В то время как SN-38 обладает более умеренным уровнем активности по сравнению с лекарственными средствами, применяемыми в других КАС, доклинические испытания на ксенотрансплантатных моделях опухоли у мышей показали, что в оптимизированных условиях (то есть выборе антитела и линкера), КАС, полученные с SN-38, были эффективными и имели крайне благоприятное терапевтическое окно (Cardillo et al., 2011, Clin Cancer Res 17:3157-69; Govindan et al., 2009, Clin Cancer Res 15:6052-61; Moon et al., 2008, J Med Chem 51:6916-267-9). Один из этих SN-38 конъюгатов (наименование компании IMMU-132; наименование препарата по Справочнику национальных непатентованных названий США сацитузумаб говитекан) нацелен на Trop-2 (трофобластический антиген клеточной поверхности; также обозначают как эпителиальный гликопротеин-1 или EGP-1), гликопротеин, который сильно экспрессируется при многих типах эпителиального рака (Cubas et al., 2009, Biochim Biophys Acta 1796:309-14, Trerotola et al., 2013, Oncogene 32:222-33). Trop-2 также присутствует во многих соответствующих здоровых тканях (Trerotola et al., 2013, Oncogene 32:222-33; Stepan et al., 2011, J Histochem Cytochem 59:701-10), но исследования на яванских макаках, экспрессирующих перекрестно-реагирующий Trop-2 в схожих тканях, указывают только на дозолимитирующую нейтропению и желудочно-кишечную токсичность (Cardillo et al., 2011, Clin Cancer Res 17:3157-69). Поскольку эти события обычно связаны с терапией иринотеканом и поскольку не было заметного повреждения здоровых тканей, экспрессирующих Trop-2, даже при относительно высоких эквивалентных дозах для человека, авторы изобретения предположили что, либо антиген защищен каким-либо образом в здоровых тканях, либо здоровые ткани менее подвержены влиянию более среднетоксичного SN-38.

[06] Недавно авторы сообщали о результатах исследования с повышением дозы фазы I сацитузумаба говитекана (IMMU-132), который давали пациентам с различными типами метастатического эпителиального рака в течение 2 недель в 3-недельных курсах лечения (Starodub et al., 2015, Clin Cancer Res 21:3870-8). Протестировали дозы 8, 10, 12 и 18 мг/кг, и определили максимально переносимую дозу (МПД), оцененную по переносимости одного курса терапии, как равную 12 мг/кг. Однако при этой дозе присутствовали частые задержки в течение или между курсами, а также требовалось снижение дозы. Следовательно, для пациентов, чтобы получить несколько курсов терапии с минимальными задержками или уменьшением доз, поступление продолжали при 2 низких уровнях дозы, 8 и 10 мг/кг.

[07] Несмотря на многообещающие результаты с IMMU-132 (сацитузумаб говитекан) в качестве монотерапии, существует потребность в улучшенных способах и композициях для комбинированной терапии с применением IMMU-132 и других противораковых терапевтических препаратов.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[08] В различных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям и способам лечения рака с помощью конъюгатов антитело-лекарственное средство (КАС), применяемых в комбинированных терапиях с одним или более другими терапевтическими средствами, такими как хирургия, лучевая терапия, химиотерапия, иммуномодуляторы, цитокины, химиотерапевтические агенты, проапоптотические агенты, антиангиогенные агенты, цитотоксические агенты, лекарственные средства, токсины, радионуклиды, РНКи, миРНК, второе антитело или фрагмент антитела или иммуноконъюгат. В предпочтительных вариантах осуществления КАС применяют в сочетании с одним или более ингибиторами Rad51. КАС можно применять для лечения раковых заболеваний, для которых стандартные способы лечения неэффективны, таких как метастатический рак поджелудочной железы, метастатический колоректальный рак или трижды негативный рак молочной железы. Более предпочтительно, сочетание КАС и другого терапевтического средства является более эффективным, по сравнению с отдельным или суммарным эффектом инвидуального лечения.

[09] В конкретном варианте осуществления анти-Trop-2 антитело может представлять собой гуманизированное антитело RS7 (см., например, патент США №7238785, раздел графических материалов и примеров которого включен в настоящую заявку посредством ссылки), содержащее последовательности CDR легкой цепи CDR1 (KASQDVSIAVA, SEQ ID NO: 1); CDR2 (SASYRYT, SEQ ID NO: 2); и CDR3 (QQHYITPLT, SEQ ID NO: 3) и последовательности CDR тяжелой цепи CDR1 (NYGMN, SEQ ID NO: 4); CDR2 (WINTYTGEPTYTDDFKG, SEQ ID NO: 5) и CDR3 (GGFGSSYWYFDV, SEQ ID NO: 6). Однако, как обсуждается ниже, другие анти-Trop-2 антитела известны и могут быть использованы в рассматриваемых КАС. Предпочтительно лекарственное средство, конъюгированный с анти-Trop-2 антителом, представляет собой лекарственное средство, которое индуцирует разрывы цепи ДНК, такой как ауристатины, калихеамицины, камптотецины (например, SN-38) или антрациклины. Примеры лекарственных средств, индуцирующих разрывы цепи ДНК, включают, но не ограничиваются ими, SN-38, доксорубицин, топотекан, доксорубицин, этопозид, цисплатин, оксалиплатин или карбоплатин. В более предпочтительном варианте осуществления лекарственное средство, конъюгированное с антителом, представляет собой камптотецин или антрациклин, наиболее предпочтительно SN-38 или доксорубицин (см., например, патент США №9028833, раздел графических материалов и примеров которого включен в настоящую заявку посредством ссылки).

[010] Фрагмент антитела может представлять собой моноклональное антитело, фрагмент антигенсвязывающего антитела, биспецифическое или другое поливалентное антитело или другую молекулу на основе антитела. Антитело может принадлежать к различным изотипам, предпочтительно человеческим IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, более предпочтительно, содержащим последовательности шарнирной и константной области человеческого IgG1. Антитело или его фрагмент может быть химерным, гуманизированным или человеческим антителом, а также его вариантами, такими как полу-IgG4 антитела (называемые "унителами"), как описано van der Neut Kolfschoten et al. (Science 2007; 317:1554-1557). Более предпочтительно, антитело или его фрагмент могут быть сконструированы или выбраны так, чтобы они содержали последовательности константной области человека, которые принадлежат к конкретным аллотипам, что может приводить к снижению иммуногенности при введении указанного КАС человеку. Предпочтительные аллотипы для введения включают аллотип не-G1m1 (nG1m1), такие как G1m3, G1m3,1, G1m3,2 или G1m3,1,2. Более предпочтительно, аллотип выбирают из группы, состоящей из аллотипов nG1m1, G1m3, nG1m1,2 и Km3 (Jefferies and Lefranc, 2009, mAbs 1(4):1-7).

[011] Лекарственное средство, которое должно быть конъюгирован с антителом или фрагментом антитела, может быть выбран из группы, состоящей из антрациклина, камптотецина, ингибитора тубулина, майтанзиноида, калихеамицина, ауристатина, азотистого иприта, производного этиленимина, алкилсульфоната, нитрозомочевины, триазена, аналога фолиевой кислоты, таксана, ингибитора СОХ-2, аналога пиримидина, аналога пурина, антибиотика, ингибитора фермента, эпиподофиллотоксина, координационного комплекса платины, алкалоида барвинка, замещенной мочевины, производного метилгидразина, адренокортикального супрессанта, антагониста гормонов, антиметаболита, алкилирующего агента, антимитотика, антиангиогенного агента, ингибитора тирозинкиназы, ингибитора mTOR, ингибитора белка теплового шока (HSP90), ингибитора протеосом, ингибитора HDAC, проапоптотического агента и их комбинации.

[012] Конкретные лекарственные средства могут быть выбраны из группы, состоящей из 5-фторурацила, афатиниба, аплидина, азарибина, анастрозола, антрациклинов, акситиниба, AVL-101, AVL-291, бендамустина, блеомицина, бортезомиба, бозутиниба, бриостатина-1, бусульфана, калихеамицина, камптотецина, карбоплатина, 10-гидроксикамптотецина, кармустина, целекоксиба, хлорамбуцила, цисплатина, ингибиторов COX-2, иринотекана (СРТ-11), SN-38, карбоплатина, кладрибина, кампототеканов, кризотиниба, циклофосфамида, цитарабина, дакарбазина, дазатиниба, динациклиба, доцетаксела, дактиномицина, даунорубицина, DM1, DM3, DM4, доксорубицина, циано-морфолино доксорубицина, доксорубицин глюкуронида, эндостатина, эпирубицин глюкуронида, эрлотиниба, эстрамустина, эпидофилотоксина, эрлотиниба, энтиностата, агентов, связывающих рецептор эстрогена, этопозида (VP16), этопозид глюкуронида, этопозид фосфата, экземестана, финголимода, флоксуридина (FUdR), 3',5'-О-диолеоил-FudR (FUdR-dO), флударабина, флутамида, ингибиторов фарнезил-протеинтрансферазы, флавопиридола, фостаматиниба, ганетеспиба, GDC-0834, GS-1101, гефитиниба, гемцитабина, гидроксимочевины, ибрутиниба, идарубицина, иделалисиба, ифосфамида, иматиниба, лапатиниба, ленолидамида, лейковорина, LFM-А13, ломустина, мехлоретамина, мелфалана, меркаптопурина, 6-меркаптопурина, метотрексата, митоксантрона, митрамицина, митомицина, митотана, монометилауристатина F (MMAF), монометилауристатина D (MMAD), монометилауристатина Е (ММАЕ), навелбина, нератиниба, нилотиниба, нитрозомочевины, олапариба, пликомицина, прокарбазина, паклитаксела, PCI-32765, пентостатина, PSI-341, ралоксифена, семустина, SN-38, сорафениба, стрептозоцина, SU11248, сунитиниба, тамоксифена, темазоломида, трансплатина, талидомида, тиогуанина, тиотепы, тенипозида, топотекана, урацилового иприта, ваталаниба, винорелбина, винбластина, алкалоидов барвинка и ZD1839. Предпочтительно лекарственное средство представляет собой SN-38.

[013] Предпочтительно оптимальная дозировка рассматриваемых КАС может включать дозировку от 4 мг/кг до 18 мг/кг, предпочтительно ее вводят либо раз в неделю, два раза в неделю или каждые две недели. Оптимальная схема дозирования может включать курсы лечения, состоящие из двух последовательных недель терапии, за которыми следуют одна, две, три или четыре недели отдыха, или чередующихся недель терапии и отдыха, или одной недели терапии, за которой следуют две, три или четыре недели отдыха, или трех недель терапии, за которыми следуют одна, две, три или четыре недели отдыха, или четырех недель терапии, за которыми следуют одна, две, три или четыре недели отдыха, или пяти недель терапии, за которыми следуют одна, две, три, четыре или пять недель отдыха, или введение один раз каждые две недели, один раз каждые три недели или один раз в месяц. Лечение может быть продлено на любое количество курсов, предпочтительно на по меньшей мере 2, по меньшей мере 4, по меньшей мере 6, по меньшей мере 8, по меньшей мере 10, по меньшей мере 12, по меньшей мере 14 или по меньшей мере 16 курсов. Примерные дозировки применения могут включать 1 мг/кг, 2 мг/кг, 3 мг/кг, 4 мг/кг, 5 мг/кг, 6 мг/кг, 7 мг/кг, 8 мг/кг, 9 мг/кг, 10 мг/кг, 11 мг/кг, 12 мг/кг, 13 мг/кг, 14 мг/кг, 15 мг/кг, 16 мг/кг, 17 мг/кг, 18 мг/кг, 19 мг/кг, 20 мг/кг, 22 мг/кг и 24 мг/кг. Предпочтительные дозировки составляют 4, 6, 8, 9, 10, 12, 14, 16 или 18 мг/кг. Более предпочтительные дозировки составляют от 6 до 12, от 6 до 8, от 7 до 8, от 8 до 10, от 10 до 12 или от 8 до 12 мг/мл. Специалисту в данной области будет понятно, что различные факторы, такие как возраст, общее состояние здоровья, конкретная функция органа или вес, а также влияние предшествующей терапии на определенные системы органов (например, костный мозг), могут быть учтены при выборе оптимальной дозировки КАС, и что дозировка и/или частота введения могут быть увеличены или уменьшены в течение курса терапии. Дозировка может быть повторена по мере необходимости, при признаках уменьшения размеров опухоли, наблюдаемых после применения всего лишь от 4 до 8 доз. Раскрытые в настоящем документе оптимизированные дозировки и схемы введения показывают неожиданную превосходную эффективность и сниженную токсичность для людей, что нельзя было предсказать из исследований на животных моделях. Неожиданно, но высокая эффективность позволяет лечить опухоли, которые ранее были признаны устойчивыми к одному или более стандартный противораковым способам лечения. Еще более неожиданно, что лечение оказалось эффективным в отношении опухолей, которые ранее были устойчивы к камптотецинам, таким как иринотекан, исходное соединение для SN-38.

[014] Ингибитор Rad51, применяемый в комбинированной терапии, может представлять собой любой ингибитор Rad51, известный в данной области техники, включая, но не ограничиваясь ими, B02 (доступный, например, от Calbiochem, Ла-Хойя, шт. Калифорния, CAS 1290541-46-6); RI-1 (доступный, например, от Calbiochem, Ла-Хойя, шт. Калифорния, CAS 415713-60-9); DIDS (доступный, например, от Tocris Bioscience, Бристоль, Великобритания, CAS 67483-13-0); галенахинон (доступный, например, от Angene International Ltd., Гонконг, Китай, CAS 86690-14-4); или иматиниб (GLEEVAC®, Novartis, Восточный Гановер, шт. Нью-Джерси).

[015] Комбинированную терапию анти-Trop-2 КАС применяют для лечения раковых заболеваний, таких как ТНРМЖ, МКРЛ, НМРЛ, уротелиальный рак, рак мочевого пузыря, рак желудка или рак яичника. Такое применение может быть первой линии, второй линии или на более поздних стадиях развития рака. Композиции и способы применения эффективны при устойчивых к камптотецину, а также чувствительных к камптотецину, типах рака. Как правило, анти-Trop-2 КАС применяют для лечения любого рака, характеризующегося экспрессией антигена Trop-2.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[016] Фиг. 1. Доклиническая терапия in vivo бестимусных голых мышей, несущих рак поджелудочной железы человека Capan 1, с помощью конъюгатов SN-38 с hRS7 (анти-Trop-2), hPAM4 (анти-MUC5ac), hMN-14 (анти-CEACAM5) или неспецифического контроля hA20 (анти-CD20).

[017] Фиг. 2. Доклиническая терапия in vivo бестимусных голых мышей, несущих рак поджелудочной железы человека BxPC3, с помощью конъюгатов анти-TROP2-CL2A-SN-38 по сравнению с контролем.

[018] Фиг. 3A. Структуры CL2-SN-38 и CL2A-SN-38.

[019] Фиг. 3B. Сравнительная эффективность КАС анти-Trop-2, связанного с линкерами CL2 в сравнении с CL2A, по сравнению с КАС hA20 и контрольным солевым раствором с применением аденокарциномы толстой кишки COLO 205. Животных обрабатывали два раза в неделю в течение 4 недель, как показано стрелками. Мышей COLO 205 (N равно 6) обрабатывали 0,4 мг/кг КАС и измеряли опухоли два раза в неделю.

[020] Фиг. 3C. Сравнительная эффективность КАС анти-Trop-2, связанного с линкерами CL2 в сравнении с CL2A, по сравнению с КАС hA20 и контрольным солевым раствором с применением аденокарциномы поджелудочной железы Capan-1. Животных обрабатывали два раза в неделю в течение 4 недель, как показано стрелками. Мышей Capan-1 (N равно 10) обрабатывали 0,2 мг/кг КАС и измеряли опухоли один раз в неделю.

[021] Фиг. 4A. Терапевтическая эффективность hRS7-SN-38 КАС на нескольких моделях солидных опухолей и ксенотрансплантатов. Эффективность лечения КАС hRS7-CL2-SN-38 и hRS7-CL2A-SN-38 изучали на мышах, несущих ксенотрансплантаты опухолей немелкоклеточного рака легких, колоректального рака, рака поджелудочной железы или плоскоклеточного рака легких человека. Все КАС и контроли вводили в указанных количествах (выраженных как количество SN-38 на дозу; длинные стрелки обозначают инъекции конъюгата, короткие стрелки обозначают инъекции иринотекана). Мышам, несущим опухоли Calu-3 (N равно от 5 до 7), вводили hRS7-CL2-SN-38 каждые 4 дня, всего 4 инъекции (q4dx4).

[022] Фиг. 4В. Терапевтическая эффективность hRS7-SN-38 КАС на нескольких моделях солидных опухолей и ксенотрансплантатов. Эффективность лечения КАС hRS7-CL2-SN-38 и hRS7-CL2A-SN-38 изучали на мышах, несущих ксенотрансплантаты опухолей немелкоклеточного рака легких, колоректального рака, рака поджелудочной железы или плоскоклеточного рака легких человека. Все КАС и контроли вводили в указанных количествах (выраженных как количество SN-38 на дозу; длинные стрелки обозначают инъекции конъюгата, короткие стрелки обозначают инъекции иринотекана). Мышам, несущим опухоли COLO 205 (N равно 5), вводили КАС 8 раз (q4dx8) или МПД иринотекана каждые 2 дня, всего 5 инъекций (q2dx5).

[023] Фиг. 4C. Терапевтическая эффективность hRS7-SN-38 КАС на нескольких моделях солидных опухолей и ксенотрансплантатов. Эффективность лечения КАС hRS7-CL2-SN-38 и hRS7-CL2A-SN-38 изучали на мышах, несущих ксенотрансплантаты опухолей немелкоклеточного рака легких, колоректального рака, рака поджелудочной железы или плоскоклеточного рака легких человека. Все КАС и контроли вводили в указанных количествах (выраженных как количество SN-38 на дозу; длинные стрелки обозначают инъекции конъюгата, короткие стрелки обозначают инъекции иринотекана). Мышей, несущих опухоли Capan-1 (N равно 10), обрабатывали два раза в неделю в течение 4 недель указанными агентами.

[024] Фиг. 4D. Терапевтическая эффективность hRS7-SN-38 КАС на нескольких моделях солидных опухолей и ксенотрансплантатов. Эффективность лечения КАС hRS7-CL2-SN-38 и hRS7-CL2A-SN-38 изучали на мышах, несущих ксенотрансплантаты опухолей немелкоклеточного рака легких, колоректального рака, рака поджелудочной железы или плоскоклеточного рака легких человека. Все КАС и контроли вводили в указанных количествах (выраженных как количество SN-38 на дозу; длинные стрелки обозначают инъекции конъюгата, короткие стрелки обозначают инъекции иринотекана). Мышей, несущих опухоли BxPC-3 (N равно 10), обрабатывали два раза в неделю в течение 4 недель указанными агентами.

[025] Фиг. 4E. Терапевтическая эффективность hRS7-SN-38 КАС на нескольких моделях солидных опухолей и ксенотрансплантатов. Эффективность лечения КАС hRS7-CL2-SN-38 и hRS7-CL2A-SN-38 изучали на мышах, несущих ксенотрансплантаты опухолей немелкоклеточного рака легких, колоректального рака, рака поджелудочной железы или плоскоклеточного рака легких человека. Все КАС и контроли вводили в указанных количествах (выраженных как количество SN-38 на дозу; длинные стрелки обозначают инъекции конъюгата, короткие стрелки обозначают инъекции иринотекана). В дополнение к КАС, вводимому два раза в неделю в течение 4 недель, мыши, несущие опухоли SK-MES-1 (N равно 8), получали МПД CPT-11 (q2dx5).

[026] Фиг. 5A. Переносимость hRS7-CL2A-SN-38 у мышей Swiss-Webster. Пятидесяти шести мышам Swiss-Webster вводили внутрибрюшинно (ВБ - IP - intraperitoneally) 2 дозы буфера или hRS7-CL2A-SN-38 с интервалом в 3 дня (4, 8 или 12 мг/кг SN-38 на дозу; 250, 500 или 750 мг конъюгата белка/кг на дозу). Через 7 и 15 дней после последней инъекции, 7 мышей из каждой группы подвергали эвтаназии с проведением анализа крови и химического анализа сыворотки. Графики показывают процент животных в каждой группе, у которых были повышенные уровни аспартатаминотрансферазы (АСТ).

[027] Фиг. 5В. Переносимость hRS7-CL2A-SN-38 у мышей Swiss-Webster. Пятидесяти шести мышам Swiss-Webster вводили ВБ 2 дозы буфера или hRS7-CL2A-SN-38 с интервалом в 3 дня (4, 8 или 12 мг/кг SN-38 на дозу; 250, 500 или 750 мг конъюгата белка/кг на дозу). Через 7 и 15 дней после последней инъекции, 7 мышей из каждой группы подвергали эвтаназии с проведением анализа крови и биохимического анализа сыворотки. Графики показывают процент животных в каждой группе, у которых были повышенные уровни аланинаминотрансферазы (АЛТ).

[028] Фиг. 5C. Переносимость hRS7-CL2A-SN-38 у яванских макак (Cynomolgus). Шести макакам на группу вводили дважды с интервалом в 3 дня буфер (контроль) или hRS7-CL2A-SN-38 при 0,96 мг/кг или 1,92 мг/кг эквивалентов SN-38 на дозу (60 и 120 мг/кг конъюгата белка). У всех животных брали кровь на 1, 3 и 6 день. У четырех макак брали кровь на 11 день в группе 0,96 мг/кг, у 3 в группе 1,92 мг/кг. Изменения количества нейтрофилов у яванских макак.

[029] Фиг. 5D. Переносимость hRS7-CL2A-SN-38 у яванских макак. Шести макакам на группу вводили дважды с интервалом в 3 дня буфер (контроль) или hRS7-CL2A-SN-38 при 0,96 мг/кг или 1,92 мг/кг эквивалентов SN-38 на дозу (60 и 120 мг/кг конъюгата белка). У всех животных брали кровь на 1, 3 и 6 день. У четырех макак брали кровь на 11 день в группе 0,96 мг/кг, у 3 в группе 1,92 мг/кг. Изменения количества тромбоцитов у яванских макак.

[030] Фиг. 6. In vitro эффективность КАС анти-Trop-2-паклитаксел в отношении MDA-MB-468 аденокарциномы молочной железы человека.

[031] Фиг. 7. In vitro эффективность КАС анти-Trop-2-паклитаксел в отношении BxPC-3 аденокарциномы поджелудочной железы человека.

[032] Фиг. 8А. Сравнение in vitro эффективности КАС анти-Trop-2 (hRS7-SN-38 против MAB650-SN-38) при аденокарциноме поджелудочной железы человека Capan-1.

[033] Фиг. 8В. Сравнение in vitro эффективности КАС анти-Trop-2 (hRS7-SN-38 против MAB650-SN-38) при аденокарциноме поджелудочной железы человека BxPC-3.

[034] Фиг. 8С. Сравнение in vitro эффективности КАС анти-Trop-2 (hRS7-SN-38 против MAB650-SN-38) при аденокарциноме желудка человека NCI-N87.

[035] Фиг. 9А. Сравнение цитотоксичности hRS7 голого или конъюгированного с SN-38 с 162-46.2 антителами при аденокарциноме поджелудочной железы человека BxPC-3.

[036] Фиг. 9В. Сравнение цитотоксичности hRS7 голого или конъюгированного с SN-38 с 162-46.2 антителами при аденокарциноме молочной железы человека MDA-MB-468.

[037] Фиг. 10. Данные фазы I/II IMMU-132 для лучшего ответа по критериям RECIST.

[038] Фиг. 11. Данные фазы I/II IMMU-132 для времени до прогрессирования и лучшего ответа (RECIST).

[039] Фиг. 12. Комбинированная терапия с IMMU-132 и карбоплатином или цисплатином по сравнению с IMMU-132, карбоплатином или цисплатином отдельно, неконъюгированным КАС или контрольным солевым раствором.

[040] Фиг. 13. Комбинированная терапия c IMMU-132 плюс карбоплатин по сравнению с IMMU-132 или кабоплатином отдельно или контрольным солевым раствором.

[041] Фиг. 14. Комбинированная терапия c IMMU-132 плюс цисплатин по сравнению с IMMU-132 или цисплатином отдельно или контрольным солевым раствором.

[042] Фиг. 15. Кахексия у мышей, получавших комбинированную терапию с IMMU-132 и карбоплатином или цисплатином, по сравнению с IMMU-132, карбоплатином или цисплатином отдельно или контрольным солевым раствором.

[043] Фиг. 16. Цитотоксичность IMMU-132 и иринотекана в сравнении с солевым раствором и контрольным КАС в опухолевых клетках MDA-MB-231.

[044] Фиг. 17. Цитотоксичность IMMU-132 и иринотекана в сравнении с солевым раствором и контрольным КАС в опухолевых клетках MDA-HCC1806.

[045] Фиг. 18. Цитотоксичность IMMU-132 и иринотекана в сравнении с солевым раствором и контрольным КАС в опухолевых клетках MDA-SK-MES-1.

[046] Фиг. 19. Эффект IMMU-132 и иринотекана в сравнении с контрольным КАС, неконъюгированным IgG hRS7 или солевым раствором на рост опухоли с применением родительской клеточной линии MDA-MB-231.

[047] Фиг. 20. Эффект IMMU-132 и иринотекана в сравнении с контрольным КАС, неконъюгированным IgG hRS7 или солевым раствором на рост опухоли с применением клеточной линии C13.

[048] Фиг. 21. Эффект IMMU-132 и иринотекана в сравнении с контрольным КАС, неконъюгированным IgG hRS7 или солевым раствором на рост опухоли с применением родительской клеточной линии C39.

[049] Фиг. 22. Эффект IMMU-132 и иринотекана в сравнении с контрольным КАС, неконъюгированным IgG hRS7 или солевым раствором на выживаемость у мышей, которым вводили родительскую клеточную линию MDA-MB-231.

[050] Фиг. 23. Эффект IMMU-132 и иринотекана в сравнении с контрольным КАС, неконъюгированным IgG hRS7 или солевым раствором на выживаемость у мышей, которым вводили клеточную линию C13.

[051] Фиг. 24. Эффект IMMU-132 и иринотекана в сравнении с контрольным КАС, неконъюгированным hRS7 IgG или солевым раствором на выживаемость у мышей, которым вводили клеточную линию C39.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Определения

[052] Если не указано иное, формы единственного числа обозначают один или большее количество.

[053] В контексте настоящего документа термин "приблизительно" обозначает плюс или минус 10%. Например, "приблизительно 100" будет включать любое число от 90 до 110.

[054] Антитело, в контексте настоящего документа, относится к полноразмерной (то есть встречающейся в природе или сформированной нормальными рекомбинационными процессами фрагмента гена иммуноглобулина) молекуле иммуноглобулина (например, антителу IgG) или иммунологически активной (то есть специфически связывающейся) части молекулы иммуноглобулина, подобно фрагменту антитела.

[055] Фрагмент антитела представляет собой часть антитела, такую как F(ab')2, Fab', Fab, Fv, sFv и тому подобное. Фрагменты антител могут также включать однодоменные антитела и полумолекулы IgG4, как обсуждается ниже. Независимо от структуры, фрагмент антитела связывается с тем же антигеном, который распознается полноразмерным антителом. Термин "фрагмент антитела" также включает изолированные фрагменты, состоящие из вариабельных областей антител, такие как фрагменты "Fv", состоящие из вариабельных областей тяжелой и легкой цепей и рекомбинантных одноцепочечных полипептидных молекул, в которых легкие и тяжелые вариабельные области связаны пептидным линкером ("белки scFv").

[056] Химерное антитело представляет собой рекомбинантный белок, который содержит вариабельные домены, включая определяющие комплементарность области (CDR) антитела, полученные от одного вида, предпочтительно антитела грызуна, в то время как константные домены молекулы антитела получены от доменов антитела человека. Для ветеринарных применений константные домены химерного антитела могут быть получены от других видов, таких как кошка или собака.

[057] Гуманизированное антитело представляет собой рекомбинантный белок, в котором CDR от антитела одного вида; например, антитело грызуна переносят из вариабельных тяжелой и легкой цепей антитела грызуна в вариабельные домены тяжелой и легкой цепи человека (например, последовательности каркасной области). Константные домены молекулы антитела получены из доменов человеческого антитела. В некоторых вариантах осуществления ограниченное количество аминокислотных остатков каркасной области из родительского (грызуна) антитела может быть замещено последовательностями каркасной области антитела человека.

[058] Антитело человека представляет собой, например, антитело, полученное от трансгенных мышей, которые были "сконструированы" для выработки специфических антител человека в ответ на антигенное заражение. В этом способе элементы локусов тяжелой и легкой цепей человека вводят в штаммы мышей, полученные из линий эмбриональных стволовых клеток, которые содержат целевые нарушения эндогенных локусов тяжелой цепи и легкой цепи мыши. Трансгенные мыши могут синтезировать антитела человека, специфичные для конкретных антигенов, и мышей можно применять для получения гибридом, секретирующих антитела человека. Способы получения антител человека от трансгенных мышей описаны Green et al., Nature Genet. 7:13 (1994), Lonberg et al., Nature 368:856 (1994), и Taylor et al., Int. Immun. 6:579 (1994). Полностью человеческое антитело также может быть сконструировано способами генетической или хромосомной трансфекции, а также с помощью технологии фагового дисплея, которые все известны в данной области. См., например, McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990), для получения человеческих антител и их фрагментов in vitro из репертуара генов вариабельного домена иммуноглобулина от неиммунизированных доноров. В этом способе гены вариабельного домена антитела клонируют в рамке считывания в ген основного или минорного белка оболочки нитевидного бактериофага и отображают в виде функциональных фрагментов антитела на поверхности частицы фага. Поскольку нитевидная частица содержит копию одноцепочечной ДНК фагового генома, выбор на основе функциональных свойств антитела также приводит к отбору гена, кодирующего антитело, проявляющего эти свойства. Таким образом, фаг имитирует некоторые свойства B-клетки. Фаговый дисплей может быть выполнен в различных форматах, см., например, Johnson and Chiswell, Current Opinion in Structural Biology 3:5564-571 (1993). Человеческие антитела можно также генерировать активированными in vitro B-клетками. См. патент США №5567610 и 5229275, разделы примеров которых включены в настоящую заявку посредством ссылки.

[059] Терапевтический агент представляет собой соединение, молекулу или атом, который вводят отдельно, одновременно или последовательно с фрагментом антитела или конъюгируют с фрагментом антитела, то есть антителом или фрагментом антитела, или его субфрагментом, и могут быть использованы для лечения заболевания. Примеры терапевтических агентов включают антитела, фрагменты антител, лекарственные средства, токсины, нуклеазы, гормоны, иммуномодуляторы, проапоптотические агенты, антиангиогенные агенты, соединения бора, фотоактивные агенты или красители и радиоизотопы. Применяемые терапевтические агенты более подробно описаны ниже.

[060] Иммуноконъюгат представляет собой антитело, фрагмент антитела или слитый белок, конъюгированный по меньшей мере с одним терапевтическим и/или диагностическим агентом.

[061] Мультиспецифическое антитело представляет собой антитело, которое может связываться одновременно по меньшей мере с двумя мишенями, которые имеют разную структуру, например, с двумя разными антигенами, двумя разными эпитопами на одном и том же антигене или гаптеном и/или антигеном или эпитопом. Мультиспецифические поливалентные антитела представляют собой конструкции, которые имеют более одного сайта связывания, и сайты связывания имеют различную специфичность.

[062] Биспецифическое антитело представляет собой антитело, которое может связываться одновременно с двумя разными мишенями. Биспецифические антитела (bsAb) и фрагменты биспецифических антител (bsFab) могут иметь по меньшей мере одно плечо, которое специфически связывается, например, с антигеном, ассоциированным с опухолью, и по меньшей мере одно другое плечо, которое специфически связывается с нацеливаемым конъюгатом, который несет терапевтический или диагностический агент. Разнообразные биспецифические слитые белки могут быть получены с применением молекулярной инженерии.

Антитела анти-Trop-2.

[063] КАС по настоящему изобретению могут включать антитело или его фрагмент, который связывается с Trop-2. В конкретном предпочтительном варианте осуществления антитело анти-Trop-2 может представлять собой гуманизированное антитело RS7 (см., например, патент США №7238785, включенный в настоящий документ в полном объеме посредством ссылки), включающее последовательности CDR легкой цепи CDR1 (KASQDVSIAVA, SEQ ID NO: 1); CDR2 (SASYRYT, SEQ ID NO: 2); и CDR3 (QQHYITPLT, SEQ ID NO: 3) и последовательности CDR тяжелой цепи CDR1 (NYGMN, SEQ ID NO: 4); CDR2 (WINTYTGEPTYTDDFKG, SEQ ID NO: 5) и CDR3 (GGFGSSYWYFDV, SEQ ID NO: 6).

[064] Антитело RS7 представляло собой мышиный IgG₁, направленный против неочищенного мембранного препарата первичной плоскоклеточной карциномы легкого человека (Stein et al., Cancer Res. 50:1330, 1990). Антитело RS7 распознает гликопротеин от 46 до 48 кДа, характеризуемый как кластер 13 (Stein et al., Int. J. Cancer Supp. 8:98-102, 1994). Антиген был обозначен как EGP-1 (эпителиальный гликопротеин-1), но также упоминается как Trop-2.

[065] Trop-2 представляет собой трансмембранный белок типа I и был клонирован как из человеческих (Fornaro et al., Int J Cancer 1995; 62:610-8), так и из мышиных клеток (Sewedy et al., Int J Cancer 1998; 75:324-30). Помимо его роли в качестве связанного с опухолью кальциевого сигнального трансдуктора (Ripani et al., Int J Cancer 1998; 76:671-6), было показано, что экспрессия человеческого Trop-2 необходима для онкогенеза и инвазивности клеток рака толстой кишки, которые можно эффективно снижать поликлональными антителами против внеклеточного домена Trop-2 (Wang et al., Mol Cancer Ther 2008;7:280-5).

[066] Растущий интерес к Trop-2 в качестве терапевтической мишени для солидных раковых заболеваний (Cubas et al., Biochim Biophys Acta 2009; 1796:309-14) подтверждается дополнительными исследованиями, в которых показана клиническая значимость сверхэкспрессируемого Trop-2 при раке молочной железы (Huang et al., Clin Cancer Res 2005; 11:4357-64), колоректальном раке (Ohmachi et al., Clin Cancer Res 2006; 12:3057-63; Fang et al., Int J Colorectal Dis 2009; 24:875-84) и плоскоклеточной карциноме полости рта (Fong et al., Modern Pathol 2008; 21:186-91). Особенно заслуживают внимания последние данные, свидетельствующие о том, что базальные клетки предстательной железы, экспрессирующие высокие уровни Trop-2, чаще проявляют in vitro и in vivo активность, схожую со стволовыми клетками (Goldstein et al., Proc Natl Acad Sci USA 2008; 105:20882-7).

[067] Исследования способами проточной цитометрии и иммуногистохимического окрашивания показали, что MAb RS7 обнаруживает антиген на различных типах опухолей с ограниченным связыванием с нормальной тканью человека (Stein et al., 1990). Trop-2 экспрессируется главным образом карциномами, такими как карциномы легкого, желудка, мочевого пузыря, молочной железы, яичника, матки и предстательной железы. Исследования локализации и терапии с применением радиоактивно меченного мышиного MAb RS7 на животных моделях продемонстрировали нацеливание на опухоль и терапевтическую эффективность (Stein et al., 1990; Stein et al., 1991).

[068] Сильное окрашивание RS7 было продемонстрировано в опухолях легкого, молочной железы, мочевого пузыря, яичника, матки, желудка и предстательной железы (Stein et al., Int. J. Cancer 55:938, 1993). Случаи рака легкого включали и плоскоклеточные карциномы, и аденокарциномы (Stein et al., Int. J. Cancer 55:938, 1993). Оба типа клеток сильно окрашены, что указывает на то, что антитело RS7 не различает гистологические классы немелкоклеточной карциномы легкого.

[069] MAb RS7 быстро интернализируется в клетки-мишени (Stein et al., 1993). Константа скорости интернализации для RS7 MAb является промежуточной между константами скорости интернализации двух других быстро интернализующихся MAb, которые, как было показано, применимы для получения иммунотоксинов (там же). Хорошо задокументировано, что интернализация иммунотоксиновых конъюгатов является требованием для противоопухолевой активности (Pastan et al., Cell 47:641, 1986). Интернализация лекарственных иммуноконъюгатов описана как основной фактор противоопухолевой эффективности (Yang et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 85: 1189, 1988). Таким образом, антитело RS7 проявляет несколько важных свойств для терапевтического применения.

[070] В то время как антитело hRS7 является предпочтительным, другие антитела анти-Trop-2 известны и/или общедоступны, и в альтернативных вариантах осуществления они могут быть применены в КАС по настоящему изобретению. Хотя гуманизированные или человеческие антитела предпочтительны для снижения иммуногенности, в альтернативных вариантах осуществления может быть использовано химерное антитело. Как обсуждается ниже, способы гуманизации антитела хорошо известны в данной области и могут быть использованы для превращения доступного мышиного или химерного антитела в гуманизированную форму.

[071] Антитела анти-Trop-2 коммерчески доступны из ряда источников и включают LS-C126418, LS-C178765, LS-C126416, LS-C126417 (LifeSpan BioSciences, Inc., Сиэтл, Вашингтон); 10428-MM01, 10428-MM02, 10428-R001, 10428-R030 (Sino Biological Inc., Пекин, Китай); MR54 (eBioscience, Сан-Диего, Калифорния); sc-376181, sc-376746, Santa Cruz Biotechnology (Санта-Круз, Калифорния); MM0588-49D6 (Novus Biologicals, Литлтон, шт. Колорадо); ab79976 и ab89928 (ABCAM®, Кембридж, Массачусетс).

[072] Другие анти-Trop-2 антитела раскрыты в патентной литературе. Например, публикация США №2013/0089872 расркывает антитела анти-Trop-2 K5-70 (номер доступа FERM BP-11251), K5-107 (номер доступа FERM BP-11252), K5-116-2-1 (номер доступа FERM BP-11253), T6-16 (номер доступа FERM BP-11346) и T5-86 (номер доступа FERM BP-11254), депонированные в Международном депозитарии организмов для целей патентной процедуры, Цукуба, Япония (International Patent Organism Depositary, Tsukuba, Japan). Патент США №5840854 раскрывает анти-Trop-2 моноклональное антитело BR110 (АТСС № HB11698). Патент США №7420040 раскрывает анти-Trop-2 антитело, продуцируемое гибридомной клеточной линией AR47A6.4.2, депонированной в IDAC (Международный орган по депонированию Канады, Виннипег, Канада) под номером доступа 141205-05. Патент США №7420041 раскрыто антитело анти-Trop-2, продуцируемое гибридомной клеточной линией AR52A301.5, депонированной в IDAC под номером доступа 141205-03. Публикация США №2013/0122020 раскрывает анти-Trop-2 антитела 3E9, 6G11, 7E6, 15E2, 18B1. Гибридомы, кодирующие репрезентативное антитело, депонированы в Американской коллекции типовых культур (American Type Culture Collection, АТСС), номера доступа PTA-12871 и PTA-12872. Публикация США №2016/0297890 раскрывает анти-Trop-2 антитело TINA1. Патент США №8715662 раскрывает антитела анти-Trop-2, продуцируемые гибридомами, депонированными в AID-ICLC (Международный депозитарный орган - Коллекция клеточных линий Interlab) (Генуя, Италия), номера депонирования PD 08019, PD 08020 и PD 08021. В публикации заявки на патент США №20120237518 раскрыты анти-Trop-2 антитела 77220, KM4097 и KM4590. Патент США №8309094 (Wyeth) раскрывает антитела А1 и А3, идентифицированные списком последовательностей. Раздел Примеры каждого патента или патентной заявки, процитированной выше в этом параграфе, включен в настоящий документ посредством ссылки. Непатентная публикация Lipinski et al. (1981, Proc Natl. Acad Sci USA, 78:5147-50) раскрывает анти-Trop-2 антитела 162-25.3 и 162-46.2. В публикации King et al. (Invest New Drugs, 15 января 2018 г., предварительная электронная публикация) раскрыт конъюгат анти-Trop-2 антитело-лекарственное средство PF-06664178. В публикации Strop et al. (2016, Mol Cancer Ther 15: 2698-708) раскрыт анти-Trop-2 КАС RN927C.

[073] Многочисленные антитела анти-Trop-2 известны в данной области техники и/или общедоступны. Как описано ниже, способы получения антител против известных антигенов являются обычными в данной области. Последовательность человеческого белка Trop-2 также известна в данной области (см., например, номер доступа GenBank CAA54801.1). Способы получения гуманизированных, человеческих или химерных антител также известны. Специалист в данной области, изучив настоящее раскрытие в свете общих знаний в данной области, способен создать и применять тип антител анти-Trop-2 в КАС по настоящему изобретению.

[074] Применение антител анти-Trop-2 было раскрыто для иммунотерапевтических средств, отличных от КАС. Мышиное антитело IgG2a эдреколомаб (PANOREX®) применяли для лечения колоректального рака, хотя мышиное антитело недостаточно хорошо подходит для клинического применения на людях (Baeuerle & Gires, 2007, Br. J Cancer 96:417-423). Было описано, что подкожное введение низкой дозы экреколомаба индуцирует гуморальные иммунные ответы против антигена вакцины (Baeuerle & Gires, 2007). Адекатумумаб (MT201), полностью человеческое антитело анти-Trop-2, применяли при метастатическом раке молочной железы и раке предстательной железы на ранней стадии и, как описано, действует через активность ADCC и CDC (Baeuerle & Gires, 2007). MT110, одноцепочечная конструкция биспецифического антитела анти-Trop-2/анти-CD3, показала эффективность против рака яичников (Baeuerle & Gires, 2007). Сообщалось, что катумаксомаб, гибридное антитело мыши/крысы со сродством к связыванию с Trop-2, CD3 и Fc-рецептором, является активным против рака яичников (Baeuerle & Gires, 2007). Проксиний, иммунотоксин, содержащий одноцепочечное антитело анти-Trop-2, слитый с экзотоксином синегнойной палочки (Pseudomonas), был протестирован при раке головы и шеи и мочевого пузыря (Baeuerle & Gires, 2007). Ни в одном из этих исследований не было раскрыто применение конъюгатов анти-Trop-2 антитело-лекарственное средство.

Конъюгаты камптотецина.

[075] Ниже описаны неограничивающие способы и композиции для получения иммуноконъюгатов, содержащих терапевтический агент камптотецин, присоединенный к антителу или антигенсвязывающему фрагменту антитела. В предпочтительных вариантах осуществления растворимость лекарственного средства повышена путем помещения определенного фрагмента полиэтиленгликоля (ПЭГ) (т.е. ПЭГ, содержащего определенное количество мономерных звеньев) между лекарственным средством и антителом, где указанный ПЭГ представляет собой ПЭГ с низкой молекулярной массой, предпочтительно содержащий от 1 до 30 мономерных единиц, более предпочтительно содержащий от 1 до 12 мономерных единиц, наиболее предпочтительно содержащий от 6 до 8 мономерных единиц.

[076] Предпочтительно, первый линкер связывает лекарственное средство на одном конце и может оканчиваться ацетиленовой или азидной группой на другом конце. Данный первый линкер может содержать определенный фрагмент ПЭГ с азидной или ацетиленовой группой на одном конце и другой реакционноспособной группой, такой как карбоновая кислота или гидроксильная группа, на другом конце. Указанный бифункциональный определенный ПЭГ может быть присоединен к аминогруппе аминоспирта, и гидроксильная группа последнего может быть присоединена к гидроксильной группе лекарственного средства в форме карбоната. Альтернативно, неазидный (или ацетиленовый) фрагмент указанного определенного бифункционального ПЭГ необязательно присоединен к N-концу L-аминокислоты или полипептида, причем С-конец присоединен к аминогруппе аминоспирта, и гидроксигруппа последнего присоединена к гидроксильной группе лекарственного средства в форме карбоната или карбамата, соответственно.

[077] Второй линкер, содержащий антитело-связывающую группу и реакционноспособную группу, комплементарную азидной (или ацетиленовой) группе первого линкера, а именно ацетилен (или азид), может взаимодействовать с конъюгатом лекарственное средство-(первый линкер) посредством реакции ацетилен-азидного циклоприсоединения с получением конечного бифункционального лекарственного продукта, который пригоден для конъюгирования с антителами, нацеленными против заболеваний. Антитело-связывающая группа предпочтительно представляет собой тиольную или тиолреакционноспособную группу.

[078] Способы селективной регенерации 10-гидроксильной группы в присутствии карбоната С-20 при получении предшественника лекарственное средство-линкер с участием аналогов СРТ (камптотецин), таких как SN-38, представлены ниже. Также могут быть использованы другие защитные группы для реакционноспособных гидроксильных групп в лекарственных средствах, такие как фенольный гидроксил в SN-38, например, трет-бутилдиметилсилил или трет-бутилдифенилсилил, и с них снимают защиту с помощью фторида тетрабутиламмония перед связыванием дериватизированного лекарственного средства с антитело-связывающим фрагментом. 10-гидроксильная группа аналогов СРТ альтернативно защищена в виде сложного эфира или карбоната, отличного от BOC (трет-бутилоксикарбонил), так что бифункциональный СРТ конъюгирован с антителом без предварительного снятия защиты с этой защитной группы. После введения биоконъюгата с защитной группы легко снимают защиту в физиологических условиях рН.

[079] В ацетилен-азидном сочетании, называемом "клик-химия", азидная часть может находиться на L2, а ацетиленовая часть может находиться на L3. Альтернативно, L2 может содержать ацетилен, а L3 может содержать азид. "Клик-химия" относится к катализируемой медью(+1) реакции циклоприсоединения между ацетиленовым фрагментом и азидным фрагментом (Kolb HC and Sharpless KB, DrugDiscov Today 2003; 8:1128-37), хотя альтернативные формы клик-химии известны и могут быть использованы. Клик-химия протекает в водном растворе при почти нейтральных значениях рН и, следовательно, поддается конъюгации с лекарственным средством. Преимущество клик-химии состоит в том, что она является хемоселективной и дополняет другие хорошо известные химические способы конъюгации, такие как реакция тиол-малеимид.

[080] Пример предпочтительного варианта осуществления относится к конъюгату производного лекарственного средства и антитела общей формулы (1), как показано ниже.

MAb-[L2]-[L1]-[AA]_m-[A']-лекарственное средство (1)

где MAb представляет собой антитело, нацеленное против заболевания; L2 представляет собой компонент сшивающего линкера, содержащего антитело-связывающий фрагмент и одну или более ацетиленовых (или азидных) групп; L1 содержит определенный ПЭГ с азидом (или ацетиленом) на одном конце, комплементарным ацетильному (или азидному) фрагменту в L2, и реакционноспособную группу, такую как карбоновая кислота или гидроксильная группа, на другом конце; AA представляет собой L-аминокислоту; m представляет собой целое число со значениями 0, 1, 2, 3 или 4; и A' представляет собой дополнительный спейсер, выбранный из группы, состоящей из этаноламина, 4-гидроксибензилового спирта, 4-аминобензилового спирта или замещенного или незамещенного этилендиамина. L-аминокислоты АА выбраны из аланина, аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, цистеина, глутамина, глутаминовой кислоты, глицина, гистидина, изолейцина, лейцина, лизина, метионина, фенилаланина, пролина, серина, треонина, триптофана, тирозина и валина. Если группа А' содержит гидроксил, она связана с гидроксильной группой или аминогруппой лекарственного средства в форме карбоната или карбамата, соответственно.

[081] В предпочтительном варианте осуществления формулы 1, A' представляет собой замещенный этаноламин, полученный из L-аминокислоты, где карбоксильная кислотная группа аминокислоты заменена гидроксиметильным фрагментом. А' может быть получен из любой из следующих L-аминокислот: аланина, аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, цистеина, глутамина, глутаминовой кислоты, глицина, гистидина, изолейцина, лейцина, лизина, метионина, фенилаланина, пролина, серина, треонина, триптофана, тирозина и валина.

[082] В примере конъюгата по предпочтительному варианту осуществления формулы 1, m равно 0, A' представляет собой L-валинол, и примером лекарственного средства является SN-38. В другом примере формулы 1, m равен 1 и представлен дериватизированным L-лизином, A' представляет собой L-валинол, и примером лекарственного средства является SN-38. В этом варианте осуществления сначала образуется амидная связь между карбоновой кислотой аминокислоты, такой как лизин, и аминогруппой валинола с применением ортогональных защитных групп для аминогрупп лизина. Защитную группу на N-конце лизина удалют, сохраняя интактной защитную группу на боковой цепи лизина, и N-конец сочетают с карбоксильной группой на определенном ПЭГ с азидом (или ацетиленом) на другом конце. Гидроксильную группу валинола затем присоединяют к 20-хлорформиатному производному 10-гидрокси-защищенного SN-38 и это промежуточное соединение сочетают с компонентом L2, несущим антитело-связывающий фрагмент, а также комплементарную ацетиленовую (или азидную) группу, участвующую в клик-химии циклоприсоединения. Наконец, удаление защитных групп как на боковой цепи лизина, так и на SN-38 дает продукт в соответствии с настоящим примером.

[083] Не желая быть связанными какой-либо теорией, низкомолекулярный продукт SN-38, а именно валинол-SN-38 карбонат, образующийся после внутриклеточного протеолиза, имеет дополнительный путь высвобождения интактного SN-38 посредством внутримолекулярной циклизации с участием аминогруппы валинола и карбонила карбоната.

[084] В другом предпочтительном варианте осуществления, A' общей формулы 1 представляет собой A-OH, где A-OH представляет собой гибкий фрагмент, такой как 4-аминобензиловый спирт или замещенный 4-аминобензиловый спирт, замещенный C₁-C₁₀ алкильной группой в бензильном положении, и последний через свою аминогруппу присоединен к L-аминокислоте или полипептиду, содержащему до четырех L-аминокислотных фрагментов; где N-конец присоединен к сшивающему линкеру с терминальной антитело-связывающей группой.

[085] В другом примере предпочтительного варианта осуществления A-OH в A' общей формулы 1 получают из замещенного 4-аминобензилового спирта, и AA состоит из одной L-аминокислоты с m равным 1 в общей формуле 1, и примером лекарственного средства является SN-38. Отдельная аминокислота АА может быть выбрана из любой одной из следующих L-аминокислот: аланина, аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, цистеина, глутамина, глутаминовой кислоты, глицина, гистидина, изолейцина, лейцина, лизина, метионина, фенилаланина, пролина, серина, треонина, триптофана, тирозина и валина. Заместитель R в фрагменте 4-аминобензилового спирта (вариант осуществления A-OH в A') представляет собой водород или алкильную группу, выбранную из C₁-C₁₀ алкильных групп. Пример этой формулы, где отдельная аминокислота AA представляет собой L-лизин и R представляет собой H, и примером лекарственного средства является SN-38, обозначен как MAb-CL2A-SN-38 (показано ниже). Структура отличается от линкера MAb-CL2-SN-38 тем, что однин остаток лизина заменен на дипептид Phe-Lys, присутсвующий в линкере CL2. Дипептид Phe-Lys был сконструирован как сайт расщепления катепсина B для лизосомального фермента, который считается важным для внутриклеточного высвобождения связанного лекарственного средства. Удивительно, что, несмотря на удаление сайта расщепления катепсина, иммуноконъюгаты, содержащие линкер CL2A, по-видимому, более эффективны in vivo, чем те, которые содержат линкер CL2.

[086] В предпочтительном варианте осуществления АА содержит полипептидный фрагмент, предпочтительно ди, три или тетрапептид, расщепляемый внутриклеточной пептидазой. Примерами являются: Ala-Leu, Leu-Ala-Leu и Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 9) (Trouet et al., 1982).

[087] В другом предпочтительном варианте осуществления компонент L1 конъюгата содержит спейсер определенного полиэтиленгликоля (ПЭГ) с от 1 до 30 повторяющимися мономерными звеньями. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления изобретения ПЭГ представляет собой определенный ПЭГ с от 1 до 12 повторяющимися мономерными звенями. Введение ПЭГ может включать применение гетеробифункциональных производных ПЭГ, которые являются коммерчески доступными. Гетеробифункциональный ПЭГ может содержать азидную или ацетиленовую группу.

[088] В предпочтительном варианте осуществления, L2 имеет множество ацетиленовых (или азидных) групп в диапазоне от 2 до 40, но предпочтительно от 2 до 20 и более предпочтительно от 2 до 5, и один антитело-связывающий фрагмент. В типичном примере компонент L2 присоединен к 2 ацетиленовым группам, что приводит к присоединению двух присоединенных через азид молекул SN-38. Связывание с MAb может включать сукцинимид.

[089] В предпочтительных вариантах осуществления, когда бифункциональное лекарственное средство содержит тиолреакционноспособный фрагмент в качестве антитело-связывающей группы, тиолы в антителе образуются в лизиновых группах антитела с применением тиолирующего реагента. Способы введения тиольных групп в антитела с помощью модификаций лизиновых групп MAb хорошо известны в данной области техники (Wong in Chemistry of protein conjugation and cross-linking, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL (1991), pp 20-22). Альтернативно, восстановление в мягких условиях межцепочечных дисульфидных связей на антителе (Willner et al., Bioconjugate Chem. 4:521-527 (1993)) с применением восстановителей, таких как дитиотреитол (ДТТ), может образовывать от 7 до 10 тиолов на антителе; при этом имеет преимущество включения множества фрагментов лекарственного средства в межцепочечную область MAb вдали от антиген-связывающей области. В более предпочтительном варианте осуществления, присоединение SN-38 к восстановленным дисульфидным сульфгидрильным группам приводит к образованию иммуноконъюгата антитело-SN-38 с от 6 до 8 ковалентно присоединенными фрагментами SN-38 на молекулу антитела. Известны другие способы обеспечения остатков цистеина для присоединения лекарственных средств или других терапевтических агентов, такие как применение антител, модифицированных цистеином (см. патент США №7521541, раздел Примеры которого включен в настоящее описание посредством ссылки).

[090] В альтернативных предпочтительных вариантах осуществления, химиотерапевтический фрагмент выбран из группы, состоящей из доксорубицина (DOX), эпирубицина, морфолинодоксорубицина (морфолино-DOX), цианоморфолино-доксорубицина (цианоморфолино-DOX), СРТ, 10-гидроксикамптотецина, SN-38, топотекана, луртотекана, 9-аминокамптотецина, 9-нитрокамптотецина, таксанов, гелданамицина, ансамицинов и эпотилонов. В более предпочтительном варианте осуществления, химиотерапевтический фрагмент представляет собой SN-38. Предпочтительно в конъюгатах в соответствии с предпочтительными вариантами осуществления, антитело связывается по меньшей мере с одним химиотерапевтическим фрагментом; предпочтительно от 1 до приблизительно 12 химиотерапевтическими фрагментами; наиболее предпочтительно от приблизительно 6 до приблизительно 8 химиотерапевтическими фрагментами.

[091] Кроме того, в предпочтительном варианте осуществления линкерный компонент L2 содержит тиольную группу, которая взаимодействует с тиолреакционноспособным остатком, введенным в одну или более аминогрупп боковой цепи лизина указанного антитела. В таких случаях антитело предварительно дериватизируют с помощью тиолреакционноспособной группы, такой как малеимид, винилсульфон, бромацетамид или йодацетамид, с помощью способов, хорошо описанных в данной области.

[092] В контексте настоящего изобретения, неожиданно был обнаружен способ, с помощью которого можно получить СРТ лекарственные средства-линкеры, где СРТ дополнительно имеет 10-гидроксильную группу. Этот способ включает, но не ограничивается, защиту 10-гидроксильной группы в виде производного трет-бутилоксикарбонила (ВОС) с последующим получением предпоследнего промежуточного соединения конъюгата лекарственное средство-линкер. Обычно, удаление группы BOC требует обработки сильной кислотой, такой как трифторуксусная кислота (ТФУ). В этих условиях СРТ 20-О-линкер карбонат, содержащий защитные группы, подлежащие удалению, также является подверженным расщеплению, что приводит к образованию немодифицированного СРТ. Фактически, обоснование для применения удаляемой в мягких условиях метокситритильной (MMT) защитной группы для боковой цепи лизина молекулы линкера, как изложено в данной области, заключалось именно в том, чтобы избежать этой возможности (Walker et al., 2002). Было обнаружено, что селективное удаление фенольной защитной группы BOC возможно путем проведения реакций в течение коротких периодов времени, оптимально от 3 до 5 минут. В этих условиях преобладающим продуктом был тот, в котором ВОС в положении 10-гидроксила был удален, в то время как карбонат в положении 20 был интактным.

[093] Альтернативный подход включает защиту 10-гидрокси-положения аналога СРТ группой, отличной от BOC, так чтобы конечный продукт был готов для конъюгации с антителами без необходимости удаления защитной группы 10-ОН. Защитная группа 10-гидрокси, которая превращает 10-ОН в фенольный карбонат или фенольный сложный эфир, легко удаляется в физиологических условиях рН или эстеразами после введения конъюгата in vivo. Более быстрое удаление фенольного карбоната в положении 10 по сравнению с третичным карбонатом в положении 20 10-гидроксикамптотецина в физиологических условиях было описано He et al. (He et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry 12: 4003-4008 (2004)). 10-гидрокси защитная группа на SN-38 может представлять собой COR, где R может представлять собой замещенный алкил, такой как "N(CH₃)₂-(CH₂)_n-", где n равно от 1 до 10 и где концевая аминогруппа необязательно представлена в форме четвертичной соли для повышенной растворимости в воде или простого алкильного остатка, такого как "CH₃-(CH₂)_n-", где n равно от 0 до 10, или может представлять собой алкоксильным фрагментом, таким как "CH₃-(CH₂)_n-O-", где n равно от 0 до 10, или "N(CH₃)₂-(CH₂)_n-O-", где n равно от 2 до 10, или "R₁O-(CH₂-CH₂-O)_n-CH₂-CH₂-O-", где R₁ представляет собой этил или метил, и n представляет собой целое число со значениями от 0 до 10. Эти 10-гидроксипроизводные легко получают обработкой хлорформиатом выбранного реагента, если конечным производным должен быть карбонат. Обычно 10-гидроксисодержащий камптотецин, такой как SN-38, обрабатывают молярным эквивалентом хлорформиата в диметилформамиде с применением триэтиламина в качестве основания. В этих условиях, положение 20-ОН не изменяется. Для образования 10-О-сложных эфиров применяют хлорангидрид выбранного реагента.

[094] В предпочтительном способе получения конъюгата производного лекарственного средства и антитела общей формулы 1, где обозначения L2, L1, AA и A-X являются такими, как описано в предыдущих разделах, сначала получают бифункциональный фрагмент лекарственного средства, [L2]-[L1]-[AA]_m-[A-X]-лекарственное средство с последующим конъюгированием бифункционального фрагмента лекарственного средства с антителом (обозначенным в настоящем документе как "MAb").

[095] В предпочтительном способе получения конъюгата производного лекарственного средства и антитела общей формулы 1, где обозначения L2, L1, AA и A-OH являются такими, как описано в предыдущих разделах, получают бифункциональный фрагмент лекарственного средства сначала путем связывания А-ОН с С-концом АА через амидную связь с последующим сочетанием аминного конца АА с группой карбоновой кислоты L1. Если AA отсутствует (то есть m равно 0), то A-OH непосредственно присоединен к L1 посредством амидной связи. Сшивающий линкер, [L1]-[AA]_m-[A-OH], присоединяют к гидроксильной или аминогруппе лекарственного средства, после чего следует присоединение к фрагменту L1, путем взаимодействия между азидной (или ацетиленовой) и ацетиленовой (или азидоной) группами в L1 и L2 посредством клик-химии.

[096] В одном варианте осуществления антитело представляет собой моноклональное антитело (MAb). В других вариантах осуществления антитело может представлять собой поливалентное и/или мультиспецифическое MAb. Антитело может быть мышиным, химерным, гуманизированным или человеческим моноклональным антителом, и указанное антитело может быть интактным, представлять собой фрагмент (Fab, Fab', F(ab)₂, F(ab')₂) или субфрагмент (одноцепочечные конструкции), или относиться к изотипу IgG1, IgG2a, IgG3, IgG4, IgA, или представлять собой их субмолекулы.

Получение антител.

[097] Способы получения моноклональных антител против практически любого антигена-мишени, такого как Trop-2, хорошо известны в данной области. См., например, Kohler and Milstein, Nature 256:495 (1975), и Coligan et al. (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, VOL. 1, pages 2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991). Вкратце, моноклональные антитела могут быть получены путем инъекции мышам композиции, содержащей антиген, удаления селезенки для получения B-лимфоцитов, слияния B-лимфоцитов с клетками миеломы для получения гибридом, клонирования гибридом, отбора положительных клонов, которые продуцируют антитела к антигену, культивирования клонов, которые продуцируют антитела к антигену, и выделения антител из культур гибридомы.

[098] MAb могут быть выделены и очищены из гибридомных культур с помощью множества хорошо известных способов. Такие способы выделения включают аффинную хроматографию с протеин-А или протеин-G сефарозой, эксклюзионную хроматографию и ионообменную хроматографию. См., например, Coligan, страницы 2.7.1-2.7.12 и страницы 2.9.1-2.9.3. Также см. Baines et al, "Purification of Immunoglobulin G (IgG)," в METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, VOL. 10, pages 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992).

[099] После начального подъема антител к иммуногену, антитела могут быть секвенированы и впоследствии получены рекомбинантными способами. Гуманизация и химеризация мышиных антител и фрагментов антител хорошо известны специалистам в данной области, как описано ниже.

[0100] Различные способы, такие как получение химерных или гуманизированных антител, могут включать способы клонирования и конструирования антител. Антигенсвязывающие последовательности Vκ (вариабельная легкая цепь) и V_H (вариабельная тяжелая цепь) для представляющего интерес антитела могут быть получены различными способами молекулярного клонирования, такими как полимеразная цепная реакция (ПЦР) в реальном времени (RT-PCR), 5'-RACE и скрининг библиотеки кДНК. V-гены MAb из клетки, которая экспрессирует мышиные MAb, могут быть клонированы с помощью ПЦР-амплификации и секвенированы. Чтобы подтвердить их подлинность, клонированные гены V_L и V_H могут быть экспрессированы в клеточной культуре в виде химерного антитела (Ат), как описано Orlandi et al. (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86: 3833 (1989)). На основе последовательностей V-гена можно проектировать и конструировать гуманизированные MAb, как описано Leung et al. (Mol. Immunol., 32:1413 (1995)).

[0101] кДНК может быть получена из любой известной гибридомной линии или трансфицированной клеточной линии, продуцирующих мышиные MAb, с помощью общих способов молекулярного клонирования (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2^nd Ed (1989)). Последовательность Vκ для MAb может быть амплифицирована с применением праймеров VK1BACK и VK1FOR (Orlandi et al, 1989) или расширенного набора праймеров, описанного Leung et al. (BioTechniques, 15:286 (1993)). Последовательности V_H могут быть амплифицированы с применением пары праймеров VH1BACK/VH1FOR (Orlandi et al, 1989) или отжига праймеров с константной областью мышиного IgG, описанного Leung et al. (Hybridoma, 13:469 (1994)). Гуманизированные V-гены могут быть сконструированы путем комбинации длинных олигонуклеотидных матричных синтезов и ПЦР амплификации, как описано Leung et al. (Mol. Immunol, 32: 1413 (1995)).

[0102] Продукты ПЦР для Vκ могут быть субклонированы в стадийный вектор staging vector), такой как стадийный вектор на основе pBR327, VKpBR, который содержит промотор Ig, сигнальную пептидную последовательность и удобные сайты рестрикции. Продукты ПЦР для V_H могут быть субклонированы в подобный стадийный вектор, такой как VHpBS на основе вектора pBluescript. Кассеты экспрессии, содержащие последовательности Vκ и V_H вместе с последовательностями промотора и сигнального пептида, могут быть вырезаны из VKpBR и VHpBS и лигированы в соответствующие векторы экспрессии, такие как pKh и pGlg, соответственно (Leung et al., Hybridoma, 13:469 (1994)). Векторы экспрессии могут быть совместно трансфицированы в подходящую клетку, и надосадочные жидкости контролируют для продуцирования химерного, гуманизированного или человеческого MAb. Альтернативно, кассеты экспрессии Vκ и V_H могут быть вырезаны и субклонированы в один вектор экспрессии, такой как pdHL2, как описано Gillies et al. (J. Immunol. Methods 125:191 (1989), а также показано в Losman et al., Cancer, 80:2660 (1997)).

[0103] В альтернативном варианте осуществления, векторы экспрессии могут быть трансфицированы в клетки-хозяина, которые были предварительно адаптированы для трансфекции, роста и экспрессии в бессывороточной среде. Типичные клеточные линии, которые могут быть использованы, включают клеточные линии Sp/EEE, Sp/ESF и Sp/ESF-X (см., например, патенты США №7531327; 7537930 и 7608425; раздел Примеры каждого из которых включен в настоящий документ посредством ссылки). Эти типичные клеточные линии основаны на клеточной линии миеломы Sp2/0, трансфицированной мутантным геном Bcl-EEE, подвергнутой воздействию метотрексата для амплификации трансфицированных последовательностей генов и предварительно адаптированной к бессывороточной клеточной линии для экспрессии белка.

Химерные антитела.

[0104] Химерное антитело представляет собой рекомбинантный белок, в котором вариабельные области человеческого антитела заменены вариабельными областями, например, мышиного антитела, включая определяющие комплементарность области (CDR) мышиного антитела. Химерные антитела проявляют пониженную иммуногенность и повышенную стабильность при введении субъекту. Общие способы клонирования вариабельных доменов мышиного иммуноглобулина раскрыты, например, в Orlandietal., Proc. Nat'IAcad. Sci. USA 6:3833 (1989). Способы конструирования химерных антител хорошо известны специалистам в данной области. В качестве примера, Leung et al., Hybridoma 13:469 (1994) получили химеру LL2, комбинируя последовательности ДНК, кодирующие домены Vκ и V_H мышиного LL2, моноклонального антитела анти-CD22, с соответствующими человеческими κ и IgG₁ доменами константной области.

Гуманизированные антитела.

[0105] Способы получения гуманизированных MAb хорошо известны в данной области (см., например, Jones et al., Nature 321:522 (1986), Riechmann et al., Nature 332:323 (1988), Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988), Carter et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89: 4285 (1992), Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12: 437 (1992), и Singer et al., J. Immun. 150: 2844. (1993)). Химерное или мышиное моноклональное антитело может быть гуманизировано путем переноса мышиных CDR из тяжелых и легких вариабельных цепей мышиного иммуноглобулина в соответствующие вариабельные домены человеческого антитела. Каркасные области мыши (FR) в химерном моноклональном антителе также заменены последовательностями FR человека. Поскольку простой перенос CDR мыши в FR человека часто приводит к снижению или даже потере аффинности антитела, может потребоваться дополнительная модификация для восстановления первоначальной аффинности мышиного антитела. Это может быть достигнуто путем замены одного или более человеческих остатков в FR-областях их мышиными аналогами для получения антитела, которое обладает хорошей аффинностью связывания с его эпитопом. См., например, Tempest et al., Biotechnology 9:266 (1991) и Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988). Предпочтительные остатки для замены включают остатки FR, которые расположены в пределах 1, 2 или 3 Ангстремов боковой цепи остатка CDR, которые расположены рядом с последовательностью CDR или которые, как предполагают, взаимодействуют с остатком CDR.

Антитела человека

[0106] Способы получения полностью человеческих антител с применением либо комбинаторных подходов, либо трансгенных животных, трансформированных локусами человеческого иммуноглобулина, известны в данной области (например, Mancini et al., 2004, New Microbiol. 27:315-28; Conrad and Scheller, 2005, Comb. Chem. High Throughput Screen. 8:117-26; Brekke and Loset, 2003, Curr. Opin. Pharmacol. 3:544-50). Полностью человеческое антитело также может быть сконструировано способами генетической или хромосомной трансфекции, а также с помощью технологии фагового дисплея, которые все известны в данной области. См., например, McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990). Ожидается, что такие полностью человеческие антитела будут проявлять даже меньше побочных эффектов, чем химерные или гуманизированные антитела, и будут функционировать in vivo как по существу эндогенные человеческие антитела.

[0107] В одном альтернативном варианте осуществления, технология фагового дисплея может быть использована для получения человеческих антител (например, Dantas-Barbosa et al., 2005, Genet. Mol. Res. 4:126-40). Человеческие антитела можно получать от здоровых людей или людей, которые имеют определенное болезненное состояние, такое как рак (Dantas-Barbosa et al., 2005). Преимущество конструирования человеческих антител от больного человека состоит в том, что репертуар циркулирующих антител может быть смещен в сторону антител против антигенов, связанных с заболеванием.

[0108] В одном неограничивающем примере указанного способа, Dantas-Barbosa et al. (2005) создали библиотеку фагового дисплея фрагментов человеческого Fab-антитела от пациентов с остеосаркомой. Как правило, общую РНК получали из лимфоцитов циркулирующей крови (там же). Рекомбинантный Fab клонировали из репертуара антител с μ, γ и κ цепями и вставляли в библиотеку фагового дисплея (там же). РНК преобразовывали в кДНК и применяли для создания библиотек кДНК Fab с использованием специфических праймеров против последовательностей тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов (Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581-97). Создание библиотеки проводили в соответствии с Andris-Widhopf et al. (2000, In: Phage Display Laboratory Manual, Barbas et al. (eds), 1^st edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY pp. 9.1-9.22). Конечные фрагменты Fab расщепляли рестрикционными эндонуклеазами и вставляли в геном бактериофага для создания библиотеки фагового дисплея. Такие библиотеки могут быть подвергнуты скринингу стандартными способами фагового дисплея, как известно в данной области техники. Фаговый дисплей может быть выполнен в различных форматах, для их просмотра см., например, Johnson and Chiswell, Current Opinion in Structural Biology 3:5564-571 (1993).

[0109] Человеческие антитела можно также получать с помощью активированных in vitro B-клеток. См. патенты США №5567610 и 5229275, включенные в настоящий документ в полном объеме посредством ссылки. Специалист в данной области поймет, что эти способы являются примерами, и может быть использован любой известный способ получения и скрининга человеческих антител или фрагментов антител.

[0110] В другом альтернативном варианте осуществления, трансгенные животные, которые были генетически сконструированы для продуцирования антител человека, могут быть использованы для получения антител против по существу любой иммуногенной мишени с применением стандартных протоколов иммунизации. Способы получения человеческих антител от трансгенных мышей описаны Green et al., Nature Genet. 7:13 (1994), Lonberg et al, Nature 368: 856 (1994) и Taylor etal, Int. Immun. 6: 579 (1994). Неограничивающий пример такой системы представляет собой XENOMOUSE® (например, Green et al., 1999, J. Immunol. Methods 231:11-23, включенный в настоящее описание посредством ссылки) от Abgenix (Фримонт, шт. Калифорния). У XENOMOUSE® и подобных животных, гены антител мыши были инактивированы и заменены функциональными генами человеческого антитела, тогда как остальная часть иммунной системы мыши оставалась интактной.

[0111] XENOMOUSE® трансформировали с помощью YAC (дрожжевых искусственных хромосом), конфигурированных зародышевой линией, которые содержали части человеческих локусов IgH и Igkappa, включая большинство последовательностей вариабельной области, наряду с дополнительными генами и регуляторными последовательностями. Репертуар вариабельной области человека можно использовать для получения В-клеток, продуцирующих антитело, которые могут быть переработаны в гибридомы известными способами. XENOMOUSE®, иммунизированная целевым антигеном, будет продуцировать человеческие антитела с помощью нормального иммунного ответа, который можно собирать и/или создавать стандартными способами, описанными выше. Доступны различные штаммы XENOMOUSE®, каждый из которых способен продуцировать разные классы антител. Было показано, что трансгенно продуцируемые человеческие антитела обладают терапевтическим потенциалом, сохраняя при этом фармакокинетические свойства нормальных человеческих антител (Green et al., 1999). Специалист в данной области поймет, что заявленные композиции и способы не ограничиваются применением системы XENOMOUSE®, но можно использовать любое трансгенное животное, которое было генетически спроектировано для получения антител человека.

Известные антитела и целевые антигены.

[0112] Как обсуждалось выше, в предпочтительных вариантах осуществления, КАС применяют для лечения рака. В некоторых вариантах целевой рак может экспрессировать один или более антигенов, ассоциированных с опухолью (TAA - tumor-associated antigen). Конкретные антитела, которые можно применять для терапии рака, включают, но не ограничиваются ими, LL1 (анти-CD74), LL2 или RFB4 (анти-CD22), велтузумаб (hA20, анти-CD20), ритуксумаб (анти-CD20), обинутузумаб (GA101, анти-CD20), ламбролизумаб (рецептор анти-PD-1), ниволумаб (рецептор анти-PD-1), ипилимумаб (анти-CTLA-4), RS7 (анти-эпителиальный гликопротеин-1 (EGP-1, также известный как Trop-2)), PAM4 или KC4 (оба анти-муцин), MN-14 (анти-карциноэмбриональный антиген (CEA, также известный как CD66e или CEACAM5), MN-15 или MN-3 (анти-CEACAM6), Mu-9 (антиколон-специфический антиген-p), Immu 31 (анти-альфа-фетопротеин), R1 (анти-IGF-lR), A19 (анти-CD19), TAG-72 (например, CC49), Tn, J591 или HuJ591 (анти-PSMA (простатический специфический мембранный антиген)), AB-PG1-XG1-026 (димер анти-PSMA), D2/B (анти-PSMA), G250 (MAb анти-карбоангидразы IX), L243 (анти-HLA-DR) алемтузумаб (анти-CD52), бевацизумаб (анти-VEGF), цетуксимаб (анти-EGFR), гемтузумаб (анти-CD33), ибритумомаб тиуксетан (анти-CD20); панитумумаб (анти-EGFR); тоситумомаб (анти-CD20); PAM4 (также называемый как кливатузумаб, анти-муцин) и трастузумаб (анти-ErbB2). Такие антитела известны в данной области техники (например, патент США №5686072; 5874540; 6107090; 6183744; 6306393; 6653104; 6730300; 6899864; 6926893; 6962702; 7074403; 7230084; 7238785; 7238786; 7256004; 7282567; 7300655; 7312318; 7585491; 7612180; 7642239 и публикации заявок на патент США №20050271671; 20060193865; 20060210475; 20070087001; раздел Примеры каждого из них включен в настоящее описание посредством ссылки). Конкретные известные антитела для применения включают hPAM4 (патент США №7282567), hA20 (патент США №7151164), hA19 (патент США №7109304), hIMMU-31 (патент США №7300655), hLL1 (патент США №7312318), hLL2 (патент США №5789554), hMu-9 (США патент №7387772), hL243 (патент США №7612180), hMN-14 (патент США №6676924), hMN-15 (патент США №8287865), hR1 (патент США №9441043), hRS7 (патент США №7238785), hMN-3 (патент США №7541440), AB-PG1-XG1-026 (заявка на патент США 11/983372, зарегистрированная как ATCC PTA-4405 и PTA-4406) и D2/B (WO 2009/130575) текст, касающийся разделов Графических материалов и Примеров, каждого из перечисленных патентов или заявки включен в настоящий документ посредством ссылки. В предпочтительном варианте осуществления, антитело представляет собой антитело hRS7 анти-Trop-2.

[0113] Другие полезные антигены, ассоциированные с опухолью, которые может происходить нацеливание, включают карбоангидразу IX, B7, CCL19, CCL21, CSAp, HER-2/neu, BrE3, CD1, CD1a, CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD11A, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20 (например, C2B8, hA20, 1F5 MAb), CD21, CD22, CD23, CD25, CD29, CD30, CD32b, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD47, CD52, CD54, CD55, CD59, CD64, CD67, CD70, CD74, CD79a, CD80, CD83, CD95, CD126, CD133, CD138, CD147, CD154, CEACAM5, CEACAM6, CTLA-4, альфа-фетопротеин (AFP), VEGF (например, AVASTIN®, сплайс-вариант фибронектина), фибронектин ED-B (например, L19), EGP-1 (Trop-2), EGP-2 (например, 17-1 A), рецептор EGF (ErbB1) (например, ERBITUX®), ErbB2, ErbB3, фактор H, FHL-1, Flt-3, рецептор фолата, Ga 733, GRO-β, HMGB-1, фактор, индуцируемый гипоксией (HIF), HM1.24, HER-2/neu, гистон H2B, гистон H3, гистон H4, инсулиноподобный фактор роста (ILGF), IFN-γ, IFN-α, IFN-β, IFN-λ, IL-2R, IL-4R, IL -6R, IL-13R, IL-15R, IL-17R, IL-18R, IL-2, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-25, IP-10, IGF-1R, Ia, HM1.24, ганглиозиды, HCG, антиген HLA-DR, с которым связывается L243, антигены CD66, т.е. CD66a-d или их комбинация, MAGE, mCRP, MCP-1, MIP-1A, MIP-1B, фактор ингибирования миграции макрофагов (MIF), MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5ac, фактор роста плаценты (PlGF), PSA (простатический специфический антиген), PSMA, антиген PAM4, рецептор PD-1, PD-L1, NCA-95, NCA-90, A3, A33, Ep-CAM, KS-1, Le(y), мезотелин, S100, тенасцин, TAC, антиген Tn, антигены Томсона-Фриденрайха, антигены некроза опухолей, антигены ангиогенеза опухоли, TNF-α, рецептор TRAIL (R1 и R2), Trop-2, VEGFR, RANTES, T101, а также антигены стволовых клеток рака, факторы комплемента C3, C3a, C3b, C5a, C5 и онкогенный продукт. Предпочтительно TAA представляет собой Trop-2.

[0114] Раковые стволовые клетки, которые описываются как более устойчивые к терапии популяции злокачественных клеток-предшественников (Hill and Penis, J. Natl. Cancer Inst. 2007; 99:1435-40), имеют антигены, которые могут быть нацелены на определенные типы ракового заболевания, такие как CD 133 при раке предстательной железы (Maitland et al., Ernst Schering Found. Sympos. Proc. 2006; 5:155-79), немелкоклеточном раке легкого (Donnenberg et al., J. Control Release 2007; 122(3):385-91) и глиобластоме (Beier et al., Cancer Res. 2007; 67(9):4010-5), и CD44 при колоректальном раке (Dalerba et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2007; 104(24)10158-63), раке поджелудочной железы (Li et al., Cancer Res. 2007; 67(3):1030-7) и плоскоклеточной карциноме головы и шеи (Prince et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2007; 104(3)973-8). Другой полезной мишенью для терапии рака молочной железы является антиген LIV-1, описанный Taylor et al. (Biochem. J. 2003; 375:51-9).

[0115] Антитела ингибитора контрольной точки применяются для терапии рака. Иммунные контрольные точки относятся к ингибиторным путям в иммунной системе, которые ответственны за поддержание самодостаточности и модулирование степени реакции иммунной системы, для минимизации повреждения периферических тканей. Тем не менее, опухолевые клетки также могут активировать контрольные точки иммунной системы для снижения эффективности иммунного ответа против опухолевых тканей. Примеры антител ингибитора контрольных точек против антигена 4 цитотоксических Т-лимфоцитов (CTLA4, также известный как CD152), белок запрограммированной клеточной гибели 1 (PD1, также известный как CD279) и лиганд запрограммированной клеточной гибели 1 (PD-L1, также известный как CD274), можно применять в комбинации с одним или более другими агентами, такими как КАС анти-Trop-2, для усиления эффективности иммунного ответа против клеток, тканей или патогенов заболевания. Типичные антитела анти-PD1 включают ламбролизумаб (MK-3475, MERCK), ниволумаб (BMS-936558, BRISTOL-MYERS SQUIBB), AMP-224 (MERCK) и пидилизумаб (CT-011, CURETECH LTD.). Антитела анти-PD1 коммерчески доступны, например, от ABCAM® (AB137132), BIOLEGEND® (EH12.2H7, RMP1-14) и AFFYMETRIX EBIOSCIENCE (J105, J116, MIH4). Примеры антител анти-PD-L1 включают MDX-1105 (MEDAREX), MEDI4736 (MEDIMMUNE), MPDL3280A (GENENTECH) и BMS-936559 (BRISTOL-MYERS SQUIBB). Антитела анти-PD-L1 также коммерчески доступны, например, от AFFYMETRIX EBIOSCIENCE (MIH1). Примеры антител анти-CTLA4 включают ипилимумаб (Bristol-Myers Squibb) и тремелимумаб (PFIZER). Антитела анти-PD1 коммерчески доступны, например, от ABCAM® (AB134090), SINO BIOLOGICAL INC. (11159-H03H, 11159-H08H) и THERMO SCIENTIFIC PIERCE (PA5-29572, PA5-23967, PA5-26465, MA1-12205, MA1-35914). Для ипилимумаба недавно получено одобрение от Управления по контролю за качеством пищевых продуктов и лекарственных средств США (FDA) в отношении лечения метастатической меланомы (Wada et al., 2013, J Transl Med 11:89).

[0116] Фактор ингибирования миграции макрофагов (MIF - macrophage migration inhibitory factor) является важным регулятором врожденного и адаптивного иммунитета и апоптоза. Сообщалось, что CD74 является эндогенным рецептором для MIF (Leng et al., 2003, J Exp Med 197:1467-76). Терапевтический эффект антагонистических антител анти-CD74 на MIF-опосредованные внутриклеточные пути может быть полезен для лечения широкого спектра болезненных состояний, таких как рак мочевого пузыря, предстательной железы, молочной железы, легкого и толстой кишки (например, Meyer-Siegler et al., 2004, BMC Cancer 12:34; Shachar & Haran, 2011, Leuk Lymphoma 52:1446-54). Милатузумаб (hLL1) представляет собой пример антитела анти-CD74 для терапевтического применения для лечения MIF-опосредованных заболеваний.

[0117] В данной области техники известны различные другие применяемые антитела (например, патенты США № 5686072; 5874540; 6107090; 6183744; 6306393; 6653104; 6730300; 6899864; 6926893; 6962702; 7074403; 7230084, 7238785; 7238786; 7256004; 7282567; 7300655; 7312318; 7585491; 7612180; 7642239 и заявка на патент США №20060193865; каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки).

[0118] Антитела для применения могут быть коммерчески получены из широкого круга известных источников. Например, различные линии гибридом, секретирующих антитела, доступны из Американской коллекции типовых культур (ATCC, Манассас, шт. Виргиния). Большое количество антител против различных заболеваний-мишеней, включая опухолеспецифические антигены, были депонированы в ATCC и/или опубликованы последовательности вариабельной области и доступны для применения в заявленных способах и композициях. См., например, патенты США №7312318; 7282567; 7151164; 7074403; 7060802; 7056509; 7049060; 7045132; 7041803; 7041802; 7041293; 7038018; 7037498; 7012133; 7001598; 6998468; 6994976; 6994852; 6989241; 6974863; 6965018; 6964854; 6962981; 6962813; 6956107; 6951924; 6949244; 6946129; 6943020; 6939547; 6921645; 6921645; 6921533; 6919433; 6919078; 6916475; 6905681; 6899879; 6893625; 6887468; 6887466; 6884594; 6881405; 6878812; 6875580; 6872568; 6867006; 6864062; 6861511; 6861227; 6861226; 6838282; 6835549; 6835370; 6824780; 6824778; 6812206; 6793924; 6783758; 6770450; 6767711; 6764688; 6764681; 6764679; 6743898; 6733981; 6730307; 6720155; 6716966; 6709653; 6693176; 6692908; 6689607; 6689362; 6689355; 6682737; 6682736; 6682734; 6673344; 6653104; 6652852; 6635482; 6630144; 6610833; 6610294; 6605441; 6605279; 6596852; 6592868; 6576745; 6572856; 6566076; 6562618; 6545130; 6544749; 6534058; 6528625; 6528269; 6521227; 6518404; 6511665; 6491915; 6488930; 6482598; 6482408; 6479247; 6468531; 6468529; 6465173; 6461823; 6458356; 6455044; 6455040, 6451310; 6444206, 6441143; 6432404; 6432402; 6419928; 6413726; 6406694; 6403770; 6403091; 6395276; 6395274; 6387350; 6383759; 6383484; 6376654; 6372215; 6359126; 6355481; 6355444; 6355245; 6355244; 6346246; 6344198; 6340571; 6340459; 6331175; 6306393; 6254868; 6187287; 6183744; 6129914; 6120767; 6096289; 6077499; 5922302; 5874540; 5814440; 5798229; 5789554; 5776456; 5736119; 5716595; 5677136; 5587459; 5443953; 5525338. Они приведены только в качестве примера, и широкое разнообразие других антител и их гибридом известно в данной области. Специалисту в данной области будет понятно, что последовательности антител или секретирующие антитела гибридомы против практически любого ассоциированного с заболеванием антигена могут быть получены простым поиском в базах данных ATCC, NCBI и/или USPTO антител против выбранной ассоциированной с заболеванием мишени, представляющей интерес. Антигенсвязывающие домены клонированных антител могут быть амплифицированы, вырезаны, лигированы в вектор экспрессии, трансфицированы в адаптированную клетку-хозяина и применены для получения белка с применением стандартных способов, хорошо известных в данной области.

Аллотипы антител.

[0119] Иммуногенность терапевтических антител связана с повышенным риском инфузионных реакций и уменьшением продолжительности терапевтического ответа (Baert et al., 2003, N Engl. J Med 348:602-08). Степень, в которой терапевтические антитела индуцируют иммунный ответ у хозяина, может частично определяться аллотипом антитела (Stickler et al., 2011, Genes and Immunity 12:213-21). Аллотип антитела связан с вариациями аминокислотных последовательностей в определенных положениях последовательностей константной области антитела. Аллотипы антител IgG, содержащих константную область γ-типа тяжелой цепи, обозначают как аллотипы Gm (1976, J. Immunol. 117:1056-59).

[0120] Для обычных человеческих антител IgG1 наиболее распространенным аллотипом является G1m1 (Stickler et al., 2011, Genes and Immunity 12:213-21). Однако аллотип G1m3 также часто встречается у представителей европеоидной расы (Stickler et al., 2011). Сообщалось, что антитела G1m1 содержат аллотипические последовательности, которые имеют тенденцию индуцировать иммунный ответ при введении реципиентам, не относящимся к G1m1 (nG1m1), таким как пациенты G1m3 (Stickler et al., 2011). Антитела, не относящиеся к аллотипу G1m1, не являются такими же иммуногенными при введении пациентам G1m1 (Stickler et al., 2011).

[0121] Аллотип G1m1 человека включает аминокислоты аспарагиновую кислоту в положении 356 по Кабату и лейцин в положении 358 по Кабату в последовательности CH3 тяжелой цепи IgG1. Аллотип nG1m1 содержит аминокислоты глутаминовую кислоту в положении 356 по Кабату и метионин в положении 358 по Кабату. И G1m1, и nG1m1 аллотипы содержат остаток глутаминовой кислоты в положении 357 по Кабату, и указзанные аллотипы иногда называют DEL и EEM аллотипами. Неограничивающий пример последовательностей константной области тяжелой цепи для антител аллотипоы G1m1 и nG1m1 показан ниже для типичных антител ритуксимаб (SEQ ID NO: 7) и велтузумаб (SEQ ID NO: 8).

Последовательность вариабельной области тяжелой цепи ритуксимаба (SEQ ID NO: 7)

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV

VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Вариабельная область тяжелой цепи велтузумаба (SEQ ID NO: 8)

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

[0122] Jefferis и Lefranc (2009, mAbs 1:1-7) рассмотрели вариации последовательности, характерные для аллотипов IgG, и их влияние на иммуногенность. Они сообщили, что аллотип G1m3 характеризуется остатком аргинина в положении 214 по Кабату по сравнению с остатком лизина в положении по Кабату 214 в аллотипе G1m17. Аллотип nG1m1,2 характеризуется глутаминовой кислотой в положении 356 по Кабату, метионином в положении 358 по Кабату и аланином в положении 431 по Кабату. Аллотип G1m1,2 характеризуется аспарагиновой кислотой в положении 356 по Кабату, лейцином в положении 358 по Кабату и глицином в положении 431 по Кабату. В дополнение к вариантам последовательности константной области тяжелой цепи Jefferis и Lefranc (2009) сообщали об аллотипических вариантах в константной области легкой цепи каппа, причем аллотип Km1 характеризуется валином в положении 153 по Кабату и лейцином в положении 191 по Кабату, аллотип Km1,2 - аланином в положении 153 по Кабату и лейцином в положении 191 по Кабату, и аллотип Km3 характеризуется аланином в положении 153 по Кабату и валином в положении 191 по Кабату.

[0123] Что касается терапевтических антител, то велтузумаб и ритуксимаб, соответственно, представляют собой гуманизированное и химерное антитела IgG1 против CD20, применяемые для терапии широкого спектра гематологических злокачественных новообразований и/или аутоиммунных заболеваний. В таблице 1 приведено сравнение аллотипических последовательностей ритуксимаба и велтузумаба. Как показано в таблице 1, ритуксимаб (G1m17,1) представляет собой DEL аллотип IgG1 с дополнительным изменением последовательности в положении 214 по Кабату (CH1 тяжелой цепи) лизина в ритуксимабе по сравнению с аргинином в велтузумабе. Сообщалось, что велтузумаб является менее иммуногенным для субъектов, чем ритуксимаб (см., например, Morchhauser et al., 2009, J Clin Oncol 27:3346-53; Goldenberg et al., 2009, Blood 113:1062-70; Robak & Robak, 2011, BioDrugs 25:13-25), эффект, который был приписан разнице между гуманизированным и химерным антителами. Однако различие в аллотипах между аллотипами EEM и DEL, вероятно, также объясняет более низкую иммуногенность велтузумаба.

Таблица 1. Аллотипы ритуксимаба в сравнении с велтузумабом

Положение в тяжелой цепи и связанные аллотипы Полный аллотип 214 (аллотип) 356/358 (аллотип) 431 (аллотип) Ритуксимаб G1m17,1 K 17 D/L 1 A - Велтузумаб G1m3 R 3 E/M - A -

[0124] Для снижения иммуногенности терапевтических антител у индивидуумов с генотипом nG1m1 желательно выбрать аллотип антитела, соответствующий аллотипу G1m3, характеризующемуся аргинином в положении 214 по Кабату, и нуль-аллотипу nG1m1,2. характеризующемуся глутаминовой кислотой в положении 356 по Кабату, метионином в положении 358 по Кабату и аланином в положении 431 по Кабату. Неожиданно было обнаружено, что повторное подкожное введение антител G1m3 в течение длительного периода времени не приводило к значительному иммунному ответу. В альтернативных вариантах осуществления, тяжелая цепь человеческого IgG4, как и аллотип G1m3, имеет аргинин в положении 214 по Кабату, глутаминовую кислоту 356 по Кабату, метионин 359 по Кабату и аланин 431 по Кабату. Поскольку иммуногенность, по-видимому, связана, по меньшей мере частично, с остатками в этих положениях, применение последовательности константной области тяжелой цепи человеческого IgG4 для терапевтических антител также является предпочтительным вариантом осуществления. Комбинации антител IgG1 G1m3 с антителами IgG4 также могут быть использованы для терапевтического введения.

Нанотела

[0125] Нанотела представляют собой однодоменные антитела размером примерно от 12 до 15 кДа (длиной примерно 110 аминокислот). Нанотела могут избирательно связываться с антигенами-мишенями, такими как полноразмерные антитела, и имеют сходное сродство к антигенам. Тем не менее, из-за их гораздо меньшего размера, они могут лучше проникать в солидные опухоли. Меньший размер также способствует стабильности нанотела, которое более устойчиво к экстремальным значениям pH и температуры, чем полноразмерные антитела (Van Der Linden et al., 1999, Biochim Biophys Act 1431:37-46). Однодоменные антитела были первоначально разработаны после открытия того, что верблюдовые (верблюды, альпаки, ламы) обладают полностью функциональными антителами без легких цепей (например, Hamsen et al., 2007, Appl Microbiol Biotechnol 77:13-22). Антитела с тяжелой цепью состоят из одного вариабельного домена (V_HH) и двух константных доменов (C_H2 и C_H3). Подобно антителам, нанотела могут быть сконструированы и использованы в виде поливалентных и/или биспецифических конструкций. Гуманизированные формы нанотел находятся в коммерческой разработке, они нацелены на различные целевые антигены, такие как IL-6R, vWF, TNF, RSV, RANKL, IL-17A & F и IgE (например, ABLYNX®, Гент, Бельгия), с потенциальным клиническим применением при раке и других расстройствах (например, Saerens et al., 2008, Curr Opin Pharmacol 8:600-8; Muyldermans, 2013, Ann Rev Biochem 82:775-97; Ibanez et al., 2011, J Infect Dis 203: 1063-72).

[0126] Период полураспада нанотел в плазме короче, чем у полноразмерных антител, причем элиминация происходит главным образом почечным путем. Поскольку у нанотел отсутствует область Fc, они не проявляют зависимой от комплемента цитотоксичности.

[0127] Нанотела могут быть получены путем иммунизации верблюдов, лам, альпак или акул антигеном-мишенью с последующим выделением мРНК, клонированием в библиотеки и скринингом на связывание антигена. Последовательности нанотел могут быть гуманизированы стандартными способами (например, Jones et al., 1986, Nature 321:522, Riechmann et al., 1988, Nature 332:323, Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534, Carter et al., 1992, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:4285, Sandhu, 1992, Crit. Rev. Biotech. 12:437, Singer et al., 1993, J. Immun. 150:2844). Гуманизация является относительно простой из-за высокой гомологии между последовательностями FR верблюда и человека.

[0128] В различных вариантах осуществления рассматриваемые КАС могут содержать нанотела для направленной доставки конъюгированного лекарственного средства к целевым раковым клеткам. Нанотела по применению раскрыты, например, в патентах США №7807162; 7939277; 8188223; 8217140; 8372398; 8557965; 8623361 и 8629244, раздел Примеров каждого из которых включен в настоящий документ посредством ссылки.

Фрагменты антител.

[0129] Фрагменты антител представляют собой антигенсвязывающие части антитела, такие как F(ab')₂, Fab', F(ab)₂, Fab, Fv, sFv, scFv и тому подобное. Фрагменты антител, которые распознают специфические эпитопы, могут быть получены известными способами. Например, фрагменты F(ab')₂ могут быть получены путем расщепления пепсином молекулы антитела. Эти и другие способы описаны, например, Goldenberg, патент США №4036945 и 4331647 и содержащихся в них ссылках. Также см. Nisonoff et al., Arch Biochem. Biophys. 89:230 (1960); Porter, Biochem. J. 73:119 (1959), Edelman et al., в METHODS IN ENZYMOLOGY VOL. 1, страница 422 (Academic Press, 1967) и Coligan на страницах 2.8.1-2.8.10 и 2.10.-2.10.4. Альтернативно, библиотеки экспрессии Fab' могут быть сконструированы (Huse et al., 1989, Science, 246:1274-1281), чтобы обеспечить быструю и простую идентификацию моноклональных фрагментов Fab' с желаемой специфичностью.

[0130] Одноцепочечная молекула Fv (scFv) содержит домен VL и домен VH. Домены VL и VH соединяются, чтобы сформировать целевой сайт связывания. Эти два домена дополнительно ковалентно связаны пептидным линкером (L). Молекулу scFv обозначают как VL-L-VH, если домен VL является N-концевой частью молекулы scFv, или как VH-L-VL, если домен VH является N-концевой частью молекулы scFv. Способы получения молекул scFv и конструирования подходящих пептидных линкеров описаны в патенте США №4704692, патенте США 4946778, R. Raag и M. Whitlow, "Single Chain Fvs." FASEB Vol. 9:73-80 (1995) и R.E. Bird and B.W. Walker Single Chain Antibody Variable Regions, TIBTECH, Vol. 9: 132-137 (1991).

[0131] Другие фрагменты антител, например, однодоменные фрагменты антител, известны в данной области и могут быть использованы в заявленных конструкциях. Однодоменные антитела (VHH) могут быть получены, например, от верблюдов, альпак или лам стандартными способами иммунизации (см., например, Muyldermans et al., TIBS 26:230-235, 2001; Yau et al., J Immunol Methods 281:161-75, 2003; Maass et al., J Immunol Methods 324:13-25, 2007). VHH могут обладать мощной антигенсвязывающей способностью и могут взаимодействовать с новыми эпитопами, которые недоступны для обычных пар VH-VL (Muyldermans et al., 2001). Сывороточный IgG альпаки содержит приблизительно 50 % антител верблюдовых IgG, состоящих только из тяжелой цепи (HCAb) (Maass et al., 2007). Альпаки могут быть иммунизированы известными антигенами, такими как TNF-α, и могут быть выделены VHH, которые связываются с и нейтрализуют целевой антиген (Maass et al., 2007). Праймеры ПЦР, которые амплифицируют практически все кодирующие последовательности VHH альпаки, были идентифицированы и могут быть использованы для конструирования библиотек фагового дисплея VHH альпаки, которые можно применять для выделения фрагментов антител стандартными способами биопэннинга, хорошо известными в данной области (Maass et al., 2007).

[0132] Фрагмент антитела также может быть получен путем протеолитического гидролиза полноразмерного антитела или путем экспрессии в E.coli или другом хозяине ДНК, кодирующей этот фрагмент. Фрагмент антитела молжет быть получен путем расщепления пепсином или папаином полноразмерных антител обычными способами. Например, фрагмент антитела может быть получен путем ферментативного расщепления антител пепсином с получением приблизительно 100 кДа фрагмента, обозначенного F(ab')₂. Этот фрагмент может быть дополнительно расщеплен с применением тиолового восстановителя и, необязательно, блокирующей группы для сульфгидрильных групп, возникающих в результате расщепления дисульфидных связей, с получением приблизительно 50 кДа Fab' моновалентного фрагмента. Альтернативно, ферментативное расщепление с использованием папаина приводит к получению двух одновалентных фрагментов Fab и непосредственно фрагмента Fc.

[0133] Также можно применять другие способы расщепления антител, такие как разделение тяжелых цепей с образованием одновалентных фрагментов легкой и тяжелой цепи, дальнейшее расщепление фрагментов или другие ферментативные, химические или генетические способы при условии, что фрагменты связываются с антигеном, который распознается интактным антителом.

Биспецифические и мультиспецифические антитела.

[0134] Биспецифические антитела полезны в ряде биомедицинских применений. Например, биспецифическое антитело с сайтами связывания для антигена поверхности опухолевой клетки и для рецептора поверхности Т-клетки может направлять лизис определенных опухолевых клеток Т-клетками. Биспецифические антитела, распознающие глиомы и эпитоп CD3 на Т-клетках, успешно применяли при лечении опухолей головного мозга у людей (Nitta, et al. Lancet. 1990; 355:368-371). Предпочтительным биспецифическим антителом является антитело анти-CD3X и анти-Trop-2. В альтернативных вариантах осуществления антитело анти-CD3 или его фрагмент может быть присоединено к антителу или фрагменту против антигена, ассоциированного с B-клеткой, такого как анти-CD3 X анти-CD19, анти-CD3 X анти-CD20, анти-CD3 X анти-CD22, анти-CD3 X анти-HLA-DR или анти-CD3 X анти-CD74. В определенных вариантах осуществления способы и композиции для конъюгации с терапевтическим агентом, раскрытые в настоящем документе, применяют с биспецифическими или мультиспецифическими антителами в качестве нацеливающих фрагментов.

[0135] Многочисленные способы получения биспецифических или мультиспецифических антител известны, как описано, например, в патенте США №7405320, раздел Примеров которого включен в настоящее описание посредством ссылки. Биспецифические антитела могут быть получены способом квадромы, который включает слияние двух разных гибридом, каждая из которых продуцирует моноклональное антитело, распознающее разные антигенные сайты (Milstein and Cuello, Nature, 1983; 305:537-540).

[0136] В другом способе получения биспецифических антител применяют гетеробифункциональные сшивающие линкеры для химического связывания двух разных моноклональных антител (Staerz, et al. Nature, 1985; 314:628-631; Perez, et al. Nature, 1985; 316:354-356). Биспецифические антитела также могут быть получены путем восстановления каждого из двух родительских моноклональных антител к соответствующим полумолекулам, которые затем смешивают и дают возможность повторного окисления для получения гибридной структуры (Staerz and Bevan. Proc Natl Acad Sci USA. 1986; 83:1453-1457). Другая альтернатива включает химическое сшивание двух или трех отдельно очищенных Fab'-фрагментов с применением соответствующих линкеров (см., например, Европейскую патентную заявку 0453082).

[0137] Другие способы включают повышение эффективности создания гибридных гибридом путем переноса генов различных селектируемых маркеров с помощью полученных из ретровирусов челночных векторов в соответствующие родительские гибридомы, которые впоследствии сливают (DeMonte, et al. Proc Natl AcadSci USA. 1990, 87:2941-2945); или трансфекцию гибридомной клеточной линии плазмидами экспрессии, содержащими гены тяжелой и легкой цепей другого антитела.

[0138] Родственные домены V_H и V_L могут быть соединены пептидным линкером соответствующего состава и длины (обычно состоящим из более чем 12 аминокислотных остатков) с образованием одноцепочечного Fv (scFv) со связывающей активностью. Способы получения scFv раскрыты в патенте США №4946778 и патенте США №5132405, раздел Примеров, каждого из которых включен в настоящее описание посредством ссылки. Уменьшение длины пептидного линкера до менее чем 12 аминокислотных остатков предотвращает спаривание доменов V_H и V_L в одной и той же цепи и вызывает спаривание доменов V_H и V_L с комплементарными доменами на других цепях, что приводит к образованию функциональных мультимеров. Полипептидные цепи доменов V_H и V_L, которые связаны с линкерами между 3 и 12 аминокислотными остатками, образуют преимущественно димеры (так называемые диатела). С линкерами между 0 и 2 аминокислотными остатками предпочтительными являются тримеры (называемые триатела) и тетрамеры (называемые тетратела), но точные схемы олигомеризации, по-видимому, зависят от состава, а также от ориентации V-доменов (V_H-линкер-V_L или V_L-линкер-V_H), в дополнение к длине линкера.

[0139] Указанные способы получения полиспецифических или биспецифических антител имеют различные трудности с точки зрения низкого выхода, необходимости очистки, низкой стабильности или трудоемкости способа. Совсем недавно способ, известный как «стыковка и блокировка» (DNL - “dock and lock”), применяли для получения комбинаций практически любых желаемых антител, фрагментов антител и других эффекторных молекул (см., например, патенты США №7521056; 7527787; 7534866; 7550143; 7666400; 7858070; 7871622; 7906121; 7906118; 8163291; 7901680; 7981398; 8003111 и 8034352, раздел Примеров, каждого из которых включен в настоящее описание посредством ссылки). В способе применяют домены, связывающие комплементарный белок, называемые якорными доменами (AD) и доменами димеризации и стыковки (DDD), которые связываются друг с другом и позволяют собирать сложные структуры, начиная от димеров, тримеров, тетрамеров, квинтамеров и гексамеров. Они образуют стабильные комплексы с высоким выходом без необходимости экстенсивной очистки. Способ DNL позволяет собирать моноспецифические, биспецифические или мультиспецифические антитела. Любой из способов, известных в данной области для получения биспецифических или мультиспецифических антител, может быть применен в способах по настоящему изобретению.

Протоколы конъюгирования.

[0140] В некоторых вариантах осуществления цитотоксическое лекарственное средство или другой терапевтический или диагностический агент может быть ковалентно присоединен к антителу или фрагменту антитела с образованием иммуноконъюгата. В некоторых вариантах осуществления лекарственное средство или другой агент может быть присоединен к антителу или его фрагменту через фрагмент-носитель. Фрагменты-носители могут быть присоединены, например, к восстановленным группам SH и/или к боковым цепям углеводов. Фрагмент-носитель может быть присоединен к шарнирной области восстановленного компонента антитела посредством образования дисульфидной связи. Альтернативно, такие агенты могут быть присоединены с применением гетеробифункционального сшивающего линкера, такого как N-сукцинил 3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP). Yu etal, Int. J. Cancer 56:244 (1994). Общие способы такого конъюгирования хорошо известны в данной области. См., например, Wong, CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING (CRC Press 1991); Upeslacis et al, "Modification of Antibodies by Chemical Methods," in MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND APPLICATIONS, Birch et al. (eds.), pages 187-230 (Wiley-Liss, Inc. 1995); Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies," in MONOCLONAL ANTIBODIES: PRODUCTION, ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION, Ritter etal. (eds.), pages 60-84 (Cambridge University Press 1995). Альтернативно, фрагмент-носитель может быть конъюгирован через углеводный фрагмент в Fc-области антитела.

[0141] Способы конъюгирования функциональных групп с антителами через углеводный фрагмент антитела хорошо известны специалистам в данной области. См., например, Shih et al., Int. J. Cancer 41:832 (1988); Shih et al., Int. J. Cancer 46:1101 (1990); и Shih et al., патент США №5057313, раздел Примеров которого включен в настоящий документ посредством ссылки. Общий способ включает взаимодействие антитела, имеющего окисленную углеводную часть, с полимером-носителем, который имеет по меньшей мере одну функцию свободного амина. Это взаимодействие приводит к первичной связи основания Шиффа (имина), которая может быть стабилизирована восстановлением до вторичного амина с образованием конечного конъюгата.

[0142] Fc область может отсутствовать, если компонент антитела КАС представляет собой фрагмент антитела. Однако возможно ввести углеводный фрагмент в вариабельную область легкой цепи полноразмерного антитела или фрагмента антитела. См., например, Leung et al., J. Immunol. 154:5919 (1995); патенты США № 5443953 и 6254868, раздел Примеров которых включен в настоящий документ посредством ссылки. Сконструированный углеводный фрагмент используют для присоединения терапевтического или диагностического агента.

[0143] Альтернативный способ присоединения фрагментов-носителей к нацеливающей молекуле включает применение реакций клик-химии. Подход клик-химии изначально задумывался как способ быстрого образования сложных веществ путем объединения небольших субъединиц в модульной форме (см., например, Kolb et al., 2004, Angew Chem Int Ed 40:3004-31; Evans, 2007, Aust J Chem 60:384-95.) В данной области техники известны различные формы реакции клик-химии, такие как реакция Хьюгсена по механизму 1,3-диполярного циклоприсоединения, катализируемая медью (Tornoe et al., 2002, J Organic Chem 67:3057-64), которую часто называют "клик-реакция". Другие альтернативы включают реакции циклоприсоединения, такие как реакции Дильса-Альдера, реакции нуклеофильного замещения (особенно с небольшими напряженными кольцами, такими как эпоксидные и азиридиновые соединения), карбонильное химическое образование соединений мочевины и реакции с участием углерод-углеродных двойных связей, таких как алкины в реакции тиол-ина.

[0144] В реакции азид-алкинового циклоприсоединения Хьюгсена применяют медный катализатор в присутствии восстановителя, чтобы катализировать реакцию концевой алкиновой группы, присоединенной к первой молекуле. В присутствии второй молекулы, содержащей азидный фрагмент, азид реагирует с активированным алкином с образованием 1,4-дизамещенного 1,2,3-триазола. Катализируемая медью реакция протекает при комнатной температуре и является достаточно специфической, так что очистка продукта реакции часто не требуется (Rostovstev et al., 2002, Angew Chem Int Ed. 41:2596; Tornoe et al., 2002, J. Org Chem, 67:3057.) Азидные и алкиновые функциональные группы в значительной степени инертны по отношению к биомолекулам в водной среде, что позволяет реакции протекать в сложных растворах. Образующийся триазол является химически стабильным и не подвергается ферментативному расщеплению, что делает продукт клик-химии очень стабильным в биологических системах. Хотя медный катализатор токсичен для живых клеток, реакция клик-химии на основе меди может быть применена in vitro для образования иммуноконъюгата.

[0145] Клик-реакция без меди была предложена для ковалентной модификации биомолекул (см., например, Agard et al., 2004, J Am Chem Soc. 126:15046-47). В реакции без меди используют напряжение кольца вместо медного катализатора для ускорения реакции [3+2] азид-алкинового циклоприсоединения (там же). Например, циклооктин представляет собой 8-углеродную кольцевую структуру, содержащую внутреннюю алкиновую связь. Замкнутая кольцевая структура вызывает значительную деформацию угла связи у ацетилена, который очень активно реагирует с азидными группами с образованием триазола. Таким образом, производные циклооктина могут быть применены для клик-реакций без меди (там же).

[0146] Другой тип клик-реакции без меди был описан Ning и et al.. (2010, Angew Chem Int Ed. 49:3065-68), который включает азид-нитронного циклоприсоединение, промотируемое напряжением цикла. Для устранения медленной скорости исходной циклооктиновой реакции электроноакцепторные группы присоединены рядом с тройной связью (там же). Примеры таких замещенных циклооктинов включают дифторированные циклооктины, 4-дибензоциклооктинол и азациклооктин (там же). Альтернативная реакция без меди включает азид-нитронное циклоприсоединение, промотируемое напряжением цикла, с получением N-алкилированных изоксазолинов (там же). Сообщалось, что реакция имела исключительно быструю кинетику и применялась в однореакторном трехстадийном протоколе для сайт-специфической модификации пептидов и белков (там же). Нитроны получали путем конденсации соответствующих альдегидов с N-метилгидроксиламином, и реакция циклоприсоединения происходила в смеси ацетонитрила и воды (там же). Эти и другие известные реакции клик-химии могут быть использованы для присоединения фрагментов-носителей к антителам in vitro.

[0147] Agard et. al. (2004, J Am Chem Soc. 126:15046-47) продемонстрировали, что рекомбинантный гликопротеин, экспрессируемый в клетках СНО (клетки яичников китайского хомячка) в присутствии перацетилированного N-азидоацетилманнозамина, приводит к биоинкорпорации соответствующей N-азидоацетил сиаловой кислоты в углеводы гликопротеина. Азидо-дериватизированный гликопротеин специфически реагировал с биотинилированным циклооктином с образованием биотинилированного гликопротеина, в то время как контрольный гликопротеин без азидогруппы оставался немеченым (там же). Laughlin et al. (2008, Science 320:664-667) применяли подобный способ для метаболической маркировки гликанов на клеточной поверхности у эмбрионов рыб данио, инкубированных с перацетилированным N-азидоацетилгалактозамином. Азидо-дериватизированные гликаны реагировали с дифторированными циклооктиновыми (DIFO) реагентами для обеспечения возможности визуализации гликанов in vivo.

[0148] Реакцию Дильса-Альдера также применяли для мечения молекул in vivo. Rossin et al. (2010, Angew Chem Int. Ed. 49:3375-78) сообщали о 52%-ном выходе in vivo между локализованным в опухоли антителом анти-TAG72 (CC49), несущим реакционноспособный фрагмент транс-циклооктен (TCO), и ¹¹¹In-меченным производным тетразина DOTA (1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусная кислота). TCO-меченное антитело CC49 вводили мышам, несущим ксенотрансплантаты рака толстой кишки, с последующим инъецированием через 1 день ¹¹¹In-меченного тетразинового зонда (там же). Реакция радиоактивномеченного зонда с локализованным в опухоли антителом приводила к выраженной локализации радиоактивности в опухоли, как продемонстрировано с помощью SPECT-визуализации (SPECT - single-photon emission computed tomography - однофотонная эмиссионная компьютерная томография) живых мышей через три часа после введения радиоактивномеченого зонда с отношением опухоли к мышце 13:1 (там же). Результаты подтвердили химическую реакцию in vivo молекул, меченных TCO и тетразином.

[0149] Модификации реакций клик-химии являются подходящими для применения in vitro или in vivo. Реактивная нацеливающая молекула может быть образована либо химическим конъюгированием, либо биологической инкорпорацией. Нацеливающая молекула, такая как антитело или фрагмент антитела, может быть активирована азидным фрагментом, замещенной циклооктиновой или алкиновой группой или нитронным фрагментом. Когда нацеливающая молекула содержит азидо- или нитронную группу, соответствующая нацеливаемая конструкция будет содержать замещенную циклооктиновую или алкиновую группу, и наоборот. Такие активированные молекулы могут быть получены путем метаболической инкорпорации в живые клетки, как обсуждалось выше.

[0150] Альтернативно, способы химического конъюгирования таких фрагментов с биомолекулами хорошо известны в данной области, и любой такой известный способ может быть применен. Общие способы образования иммуноконъюгатов раскрыты, например, в патентах США №4699784; 4824659; 5525338; 5677427; 5697902; 5716595; 6071490; 6187284; 6306393; 6548275; 6653104; 6962702; 7033572; 7147856; и 7,259,240, раздел Примеров которых включен в настоящий документ посредством ссылки.

Терапевтическое лечение.

[0151] В другом аспекте изобретение относится к способу лечения субъекта, включающему введение субъекту терапевтически эффективного количества конъюгата антитело-лекарственное средство (КАС), как описано в настоящем документе. Заболевания, которые можно лечить с помощью КАС, описанных в настоящем документе, включают, но не ограничиваются ими, В-клеточные злокачественные новообразования (например, неходжкинскую лимфому, лимфому из клеток мантийной зоны, множественную миелому, лимфому Ходжкина, диффузную В-крупноклеточную лимфому, лимфому Беркитта, фолликулярную лимфому, острый лимфоцитарный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, волосатоклеточный лейкоз), с применением, например, антитела анти-CD22, такого как hLL2 MAb (эпратузумаб, см. патент США № 6183744), против другого эпитопа CD22 (hRFB4) или антител против других B-клеточных антигенов, таких как CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD37, CD40, CD40L, CD52, CD74, CD80 или HLA-DR. Другие заболевания включают, но не ограничиваются ими, аденокарциномы эндодермального эпителия пищеварительной системы, раковые заболевания, такие как рак молочной железы и немелкоклеточный рак легкого, и другие карциномы, саркомы, глиальные опухоли, миелоидные лейкозы и т.д. В частности, преимущественно применяют антитела против антигена, например, онкофетального антигена, продуцируемого или связанного со злокачественной солидной опухолью или новообразованием кроветворной системы, например, желудочно-кишечного тракта, желудка, толстой кишки, пищевода, печени, легкого, молочной железы, поджелудочной железы, печени, предстательной железы, яичника, яичка, головного мозга, кости, уротелиальной или лимфатической опухолью, саркомой или меланомой. Такие терапевтические препараты можно вводить один или более раз, в зависимости от болезненного состояния и переносимости конъюгата, и можно также применять, необязательно, в комбинации с другими терапевтическими средствами, такими как хирургия, внешнее облучение, радиоиммунотерапия, иммунотерапия, химиотерапия, антисмысловая терапия, терапия способом РНК-интерференции, генная терапия и тому подобное. Каждая комбинация будет адаптирована к типу опухоли, стадии, состоянию пациента и предшествующей терапии, и также другим факторам, рассматриваемым лечащим врачом.

[0152] В контексте настоящего документа, термин "субъект" относится к любому животному (то есть позвоночным и беспозвоночным), включая, но не ограничиваясь ими, млекопитающих, включая людей. Предполагается, что этот термин не ограничен определенным возрастом или полом. Таким образом, взрослые и новорожденные субъекты, а также зародыши, как мужского, так и женского пола, включены в объем этого термина. Дозы, приведенные в настоящем документе, предназначены для людей, но их можно регулировать в соответствии с размером других млекопитающих, а также детей, в соответствии с массой тела или размером в квадратных метрах.

[0153] В предпочтительном варианте осуществления терапевтические конъюгаты, содержащие антитело анти-Trop-2, такое как hRS7 MAb, можно применять для лечения карцином, таких как карцинома пищевода, поджелудочной железы, легкого, желудка, толстой кишки и прямой кишки, мочевого пузыря, молочной железы, яичника, матки, почки и предстательной железы, как раскрыто в патентах США №7238785; 7517964 и 8084583, раздел Примеров которых включены в настоящее описание посредством ссылки. Антитело hRS7 представляет собой гуманизированное антитело, которое содержит последовательности определяющих комплементарность областей (CDR) легкой цепи CDR1 (KASQDVSIAVA, SEQ ID NO: 1); CDR2 (SASYRYT, SEQ ID NO: 2); и CDR3 (QQHYITPLT, SEQ ID NO: 3), и последовательности CDR тяжелой цепи CDR1 (NYGMN, SEQ ID NO: 4); CDR2 (WINTYTGEPTYTDDFKG, SEQ ID NO: 5) и CDR3 (GGFGSSYWYFDV, SEQ ID NO: 6).

[0154] В предпочтительном варианте осуществления антитела, которые применяют для лечения заболеваний человека, представляют собой человеческие или гуманизированные (CDR-привитые) варианты антител; хотя можно применять мышиные и химерные варианты антител. Молекулы IgG тех же видов, что и агенты доставки, в основном являются предпочтительными для минимизации иммунного ответа. Это особенно важно при рассмотрении вопроса о повторном лечении. Для людей человеческое или гуманизированное антитело IgG с меньшей вероятностью вызывает иммунный ответ против IgG у пациентов. Антитела, такие как hLL1 и hLL2, быстро интернализуются после связывания с интернализующим антигеном на клетках-мишенях, что означает, что переносимый химиотерапевтический препарат также быстро интернализуется в клетках. Однако антитела, которые имеют более низкие скорости интернализации, также могут быть использованы для осуществления селективной терапии.

[0155] В другом предпочтительном варианте осуществления терапевтический агент, применяемый в комбинации с конъюгатом камптотецина по настоящему изобретению, может содержать один или более изотопов. Радиоактивные изотопы, применимые для лечения больных тканей, включают, но не ограничиваются ими, ¹¹¹In, ¹⁷⁷Lu, ²¹²Bi, ²¹³Bi, ²¹¹At, ⁶²Cu, ⁶⁷Cu, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³¹1,³²P, ³³P, ⁴⁷Sc, ¹¹¹Ag, ⁶⁷Ga, ¹⁴²Pr, ¹⁵³Sm, ¹⁶¹Tb, ¹⁶⁶Dy, ¹⁶⁶Ho, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁸⁹Re, ²¹²Pb, ²²³Ra, ²²⁵Ac, ⁵⁹Fe, ⁷⁵Se, ⁷⁷As, ⁸⁹Sr, ⁹⁹Mo, ¹⁰⁵Rh, ¹⁰⁹Pd, ¹⁴³Pr, ¹⁴⁹Pm, ¹⁶⁹Er, ¹⁹⁴Ir, ¹⁹⁸Au, ¹⁹⁹Au, ²²⁷Th и ²¹¹Pb. Терапевтический радионуклид предпочтительно имеет энергию распада в диапазоне от 20 до 6000 кэВ, предпочтительно от 60 до 200 кэВ для Оже-излучателя, от 100 до 2500 кэВ для бета-излучателя и от 4000 до 6000 кэВ для альфа-излучателя. Максимальные значения энергии распада пригодных нуклидов, излучающих бета-частицы, предпочтительно составляют от 20 до 5000 кэВ, более предпочтительно от 100 до 4000 кэВ и наиболее предпочтительно от 500 до 2500 кэВ. Также предпочтительными являются радионуклиды, которые по существу распадаются с испусканием Оже-частиц. Например, Co-58, Ga-67, Br-80m, Tc-99m, Rh-103m, Pt-109, In-111, Sb-119, I-125, Ho-161, Os-189m и Ir-192. Значения энергии распада применимых нуклидов, излучающих бета-частицы, предпочтительно составляют меньше 1000 кэВ, более предпочтительно меньше 100 кэВ и наиболее предпочтительно меньше 70 кэВ. Также предпочтительными являются радионуклиды, которые распадаются по существу с образованием альфа-частиц. Такие радионуклиды включают, но не ограничиваются ими: Dy-152, At-211, Bi-212, Ra-223, Rn-219, Po-215, Bi-211, Ac-225, Fr-221, At-217, Bi-213, Th-227 и Fm-255. Значения энергии распада применимых радионуклидов, испускающих альфа-частицы, предпочтительно составляют от 2000 до 10000 кэВ, более предпочтительно от 3000 до 8000 кэВ и наиболее предпочтительно от 4000 до 7000 кэВ. Дополнительные возможные радиоизотопы для применения включают ¹¹C, ¹³N, ¹⁵O, ⁷⁵Br, ¹⁹⁸Au, ²²⁴Ac, ¹²⁶I, ¹³³I, ⁷⁷Br, ^113mIn, ⁹⁵Ru, ⁹⁷Ru, ¹⁰³Ru, ¹⁰⁵Ru, ¹⁰⁷Hg, ²⁰³Hg, ^121mTe, ^122mTe, ^125mTe, ¹⁶⁵Tm, ¹⁶⁷Tm, ¹⁶⁸Tm, ¹⁹⁷Pt, ¹⁰⁹Pd, ¹⁰⁵Rh, ¹⁴²Pr, ¹⁴³Pr, ¹⁶¹Tb, ¹⁶⁶Ho, ¹⁹⁹Au, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵¹Cr, ⁵⁹Fe, ⁷⁵Se, ²⁰¹Tl, ²²⁵Ac, ⁷⁶Br, ¹⁶⁹Yb и тому подобное.

[0156] Радионуклиды и другие металлы могут быть доставлены, например, с применением хелатирующих групп, присоединенных к антителу или конъюгату. Макроциклические хелаты, такие как NOTA (1,4,7-триазациклононан-1,4,7-триуксусная кислота), DOTA (1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусная кислота) и TETA (триэтилентетрамин), применяют с различными металлами и радиометаллами, особенно с радионуклидами галлия, иттрия и меди, соответственно. Такие металлохелатные комплексы можно сделать очень стабильными путем подбора размера кольца для металла, представляющего интерес. Могут быть использованы другие хелаты кольцевого типа, такие как макроциклические простые полиэфиры для образования комплексов ²²³Ra.

[0157] Терапевтические агенты по применению в комбинации с конъюгатами камптотецина, описанными в настоящем документе, также включают, например, химиотерапевтические лекарственные средства, такие как алкалоиды барвинка, антрациклины, эпидофиллотоксины, таксаны, антиметаболиты, ингибиторы тирозинкиназы, алкилирующие агенты, антибиотики, ингибиторы Cox-2, антимитотические, антиангиогенные и проапоптотические агенты, в частности доксорубицин, метотрексат, таксол, другие камптотецины и другие из этих и других классов противораковых агентов и тому подобное. Другие противораковые химиотерапевтические средства включают азотистые иприты, алкилсульфонаты, нитрозомочевины, триазены, аналоги фолиевой кислоты, аналоги пиримидина, аналоги пурина, координационные комплексы платины, гормоны и тому подобное. Подходящие химиотерапевтические агенты описаны в REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 19th Ed. (Mack Publishing Co., 1995), а также в GOODMAN AND GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, 7th Ed. (MacMillan Publishing Co. 1985), а также в пересмотренных изданиях этих публикаций. Другие подходящие химиотерапевтические агенты, такие как экспериментальные лекарственные средства, известны специалистам в данной области.

[0158] Примеры лекарственных средств включают, но не ограничиваются ими, 5-фторурацил, афатиниб, аплидин, азарибин, анастрозол, антрациклины, акситиниб, AVL-101, AVL-291, бендамустин, блеомицин, бортезомиб, бозутиниб, бриостатин-1, бусульфан, калихеамицин, камптотецин, карбоплатин, 10-гидроксикамптотецин, кармустин, целекоксиб, хлорамбуцил, цисплатин, ингибиторы Cox-2, иринотекан (СРТ-11), SN-38, карбоплатин, кладрибин, кампототеканы, кризотиниб, циклофосфамид, цитарабин, дакарбазин, дасатиниб, динациклиб, доцетаксел, дактиномицин, даунорубицин, доксорубицин, 2-пирролинодоксорубицин (2P-DOX), циано-морфолино доксорубицин, доксорубицин глюкуронид, эпирубицин глюкуронид, эрлотиниб, эстрамустин, эпидофиллотоксин, эрлотиниб, энтиностат, агенты, связывающие рецептор эстрогена, этопозид (VP16), этопозид глюкуронид, этопозид фосфат, экземестан, финголимод, флоксуридин (FUdR), 3',5'-О-диолеоил-FudR (FUdR-dO), флударабин, флутамид, ингибитор фарнезил-протеинтрансферазы, флавопиридол, фостаматиниб, ганетеспиб, GDC-0834, GS-1101, гефитиниб, гемцитабин, гидроксимочевина, ибрутиниб, идарубицин, иделализиб, ифосфамид, иматиниб, L-аспарагиназа, лапатиниб, леноламид, лейковорин, LFM-A13, ломустин, мехлорэтамин, мелфалан, меркаптопурин, 6-меркаптопурин, метотрексат, митоксантрон, митрамицин, митомицин, митотан, навелбин, нератиниб, нилотиниб, нитрозомочевина, олапариб, пликомицин, прокарбазин, паклитаксел, PCI-32765, пентостатин, PSI-341, ралоксифен, семустин, сорафениб, стрептозоцин, SU11248, сунитиниб, тамоксифен, темазоломид, трансплатин, талидомид, тиогуанин, тиотепы, тенипозид, топотекан, урациловый иприт, ваталаниб, винорелбин, винбластин, винкристин, алкалоиды барвинка и ZD1839. В предпочтительном варианте осуществления лекарственное средство представляет собой SN-38. Такие агенты могут быть частью конъюгатов, описанных в настоящем документе, или альтернативно их могут вводить в комбинации с указанными конъюгатами, либо до, либо одновременно, либо после конъюгата. Альтернативно, одно или более терапевтических «голых» антител, которые известны в данной области техники, можно применять в комбинации с описанными конъюгатами. Типичные терапевтические «голые» антитела описаны выше.

[0159] В предпочтительных вариантах осуществления терапевтический агент для применения в комбинации с разрушающим ДНК конъюгатом антитела (например, SN-38-КАС) представляет собой ингибитор микротрубочек, такой как алкалоид барвинка, таксаны, майтанзиноид или ауристатин. Примеры известных ингибиторов микротрубочек включают паклитаксел, винкристин, винбластин, мертанзин, эпотилон, доцетаксел, дискодермолид, комбрестатин, подофиллотоксин, CI-980, фенилагистины, стеганацины, курацины, 2-метокси эстрадиол, E7010, метоксибензолсульфонамиды, винорелбин, винфлунин, виндезины, доластатины, спонгистатин, ризоксин, тасидотин, галихондрины, гемиастерлины, криптофицин 52, MMAE и эрибулина мезилат.

[0160] В альтернативном предпочтительном варианте осуществления терапевтический агент для применения в комбинации с разрушающим ДНК КАС, таким как конъюгат SN-38-антитело, представляет собой ингибитор PARP, такой как олапариб, талазопариб (BMN-673), рукапариб, велипариб, CEP 9722, МК 4827, BGB-290, ABT-888, AG014699, BSI-201, CEP-8983 или 3-аминобензамид.

[0161] В другом альтернативном варианте осуществления терапевтический агент, применяемый в комбинации с антителом или иммуноконъюгатом, представляет собой ингибитор тирозинкиназы, такой как ибрутиниб (PCI-32765), PCI-45292, CC-292 (AVL-292), ONO- 4059, GDC-0834, LFM-A13 или RN486.

[0162] В еще одном альтернативном варианте осуществления терапевтический агент, применяемый в комбинации с антителом или иммуноконъюгатом, представляет собой ингибитор PI3K, такой как иделалисиб, вортманнин, деметоксивиридин, перифозин, PX-866, IPI-145 (дувелисиб), BAY 80-6946, BEZ235, RP6530, TGR1202, SF1126, INK1117, GDC-0941, BKM120, XL147, XL765, Паломид 529, GSK1059615, ZSTK474, PWT33597, IC87114, TG100-115, CAL263, PI-103, GNE477, CUDC-907, AEZS-136 или LY294002.

[0163] Терапевтические агенты, которые можно применять совместно с конъюгатами камптотецина, также могут включать токсины, конъюгированные с нацеливающими фрагментами. Токсины, которые могут быть использованы при этом, включают рицин, абрин, рибонуклеазу (РНКазу), ДНКазу I, ранпирназу, стафилококковый энтеротоксин-А, противовирусный белок лаконоса, гелонин, дифтерийный токсин, экзотоксин Pseudomonas и эндотоксин Pseudomonas (см., например, Pastan. et al., Cell (1986), 47:641, и Sharkey and Goldenberg, CA Cancer J. Clin. 2006 Jul-Aug; 56(4):226-43). Дополнительные токсины, подходящие для применения в настоящем изобретении известны специалистам в данной области и раскрыты в патенте США 6077499.

[0164] Еще один класс терапевтического агента может включать один или более иммуномодуляторов. Иммуномодуляторы по применению могут быть выбраны из цитокина, фактора роста стволовых клеток, лимфотоксина, гематопоэтического фактора, колониестимулирующего фактора (CSF), интерферона (IFN), эритропоэтина, тромбопоэтина и их комбинации. Особо применимы лимфотоксины, такие как фактор некроза опухоли (TNF), гематопоэтические факторы, такие как интерлейкин (IL), колониестимулирующий фактор, такой как гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF) или гранулоцитарный-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), интерферон, такой как интерфероны-α, -β, -γ или -λ, и фактор роста стволовых клеток, такой как "фактор S1". В число цитокинов входят гормоны роста, такие как гормон роста человека, N-метионил гормон роста человека и бычий гормон роста; паратиреоидный гормон; тироксин; инсулин; проинсулин; релаксин; прорелаксин; гликопротеиновые гормоны, такие как фолликулостимулирующий гормон (FSH), тиреотропный гормон (TSH) и лютеинизирующий гормон (LH); фактор роста печени; простагландин, фактор роста фибробластов; пролактин; плацентарный лактоген, белок OB; фактор некроза опухоли-α и -β; мюллерова ингибирующая субстанция; мышиный гонадотропин-ассоциированный пептид; ингибин; активин; фактор роста эндотелия сосудов; интегрин; тромбопоэтин (TPO); факторы роста нервов, такие как NGF-B; фактор роста тромбоцитов; трансформирующие факторы роста (TGF), такие как TGF-α и TGF-β; инсулиноподобный фактор роста I и II; эритропоэтин (EPO); остеоиндуктивные факторы; интерфероны, такие как интерферон-α, -β, -γ и -λ; колониестимулирующие факторы (CSF), такие как макрофагальный-CSF (M-CSF); интерлейкины (IL), такие как IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-21, IL-25, LIF, лиганд kit или FLT-3, ангиостатин, тромбоспондин, эндостатин, фактор некроза опухоли и лимфотоксин (LT). В контексте настоящего документа, термин "цитокин" включает белки природного происхождения или белки, полученные из культуры рекомбинантных клеток, и биологически активные эквиваленты цитокинов с нативной последовательностью.

[0165] Хемокины по применению включают RANTES, MCAF, MIP1-альфа, MIP1-бета и IP-10.

[0166] Специалисту в данной области будет понятно, что указанные иммуноконъюгаты, содержащие камптотецин, конъюгированный с антителом или фрагментом антитела, можно применять отдельно или в комбинации с одним или более другими терапевтическими агентами, такими как второе антитело, второй фрагмент антитела, второй иммуноконъюгат, радионуклид, токсин, лекарственное средство, химиотерапевтический агент, лучевая терапия, хемокин, цитокин, иммуномодулятор, фермент, гормон, олигонуклеотид, РНКи или миРНК. Такие дополнительные терапевтические агенты могут быть введены отдельно, в комбинации с, или могут быть присоединены к иммуноконъюгатам антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению.

Композиция и введение

[0167] Подходящие пути введения конъюгатов включают, без ограничения, пероральное, парентеральное, подкожное, ректальное, трансмукозальное, интестинальное введение, внутримышечное, интрамедуллярное, интратекальное, прямое внутрижелудочковое, внутривенное, интравитреальное, внутрибрюшинное, интраназальное или внутриглазные инъекции. Предпочтительными путями введения являются парентеральные. Альтернативно, соединение можно вводить локальным, а не системным способом, например, путем инъекции соединения непосредственно в солидную опухоль.

[0168] Иммуноконъюгаты могут быть получены в соответствии с известными способами получения фармацевтически пригодных композиций, где иммуноконъюгат объединяют в смеси с фармацевтически подходящим эксципиентом. Стерильный фосфатно-солевой буфер представляет собой один из примеров фармацевтически подходящего эксципиента. Другие подходящие эксципиенты хорошо известны специалистам в данной области. См., например, Ansel et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, 5th Edition (Lea & Febiger 1990), и Gennaro (ed.), REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Edition (Mack Publishing Company 1990) и их пересмотренные издания.

[0169] В предпочтительном варианте осуществления иммуноконъюгат получают в биологическом буфере Гуда (рН от 6 до 7), с применением буфера, выбранного из группы, состоящей из N-(2-ацетамидо)-2-аминоэтансульфоновой кислоты (ACES); N-(2-ацетамидо)иминодиуксусной кислоты (ADA); N,N-бис(2-гидроксиэтил)-2-аминоэтансульфоновой кислоты (BES); 4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфоновой кислоты (HEPES); 2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты (MES); 3-(N-морфолино)пропансульфоновой кислоты (MOPS); 3-(N-морфолинил)-2-гидроксипропансульфоновой кислоты (MOPSO) и пиперазин-N,N'-бис(2-этансульфоновой кислоты) [Pipes]. Более предпочтительные буферы представляют собой MES или MOPS, предпочтительно в диапазоне концентраций от 20 до 100 мМ, более предпочтительно приблизительно 25 мМ. Наиболее предпочтительным является MES 25 мМ, рН 6,5. Композиция может дополнительно содержать 25 мМ трегалозы и 0,01 об.%. полисорбата 80 в качестве эксципиентов, с конечной концентрацией буфера, доведенной до 22,25 мМ в результате добавления эксципиентов. Предпочтительным способом хранения является лиофилизированная композиция конъюгатов, хранящаяся при температуре от минус 20 до 2°C, при наиболее предпочтительном хранении при температуре от 2 до 8°C.

[0170] Иммуноконъюгат может быть представлен в виде, пригодном для внутривенного введения, например, путем болюсной инъекции, медленной инфузии или непрерывной инфузии. Предпочтительно антитело по настоящему изобретению вводят инфузией на протяжении периода менее чем приблизительно 4 часов, и более предпочтительно на протяжении периода менее чем приблизительно 3 часов. Например, первые 25-50 мг могут быть введены инфузией в течение 30 минут, предпочтительно даже в течение 15 минут, а оставшуюся часть вводят инфузией в течение следующих 2-3 часов. Композиции для инъекций могут быть представлены в стандартной лекарственной форме, например, в ампулах или в многодозовых контейнерах, с добавлением консерванта. Композиции могут быть в таких формах, как суспензии, растворы или эмульсии в масляных или водных носителях, и могут содержать вспомогательные вещества, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты. Альтернативно, активный ингредиент может быть в форме порошка для разведения подходящим носителем, например, стерильной апирогенной водой, перед применением.

[0171] Для контроля длительности действия терапевтического конъюгата можно применять дополнительные фармацевтические способы. Препараты с контролируемым высвобождением могут быть получены с применением полимеров для образования комплексов или адсорбции иммуноконъюгата. Например, биосовместимые полимеры включают матрицы поли(этилен-со-винилацетата) и матрицы полиангидридного сополимера димера стеариновой кислоты и себациновой кислоты. Sherwood et al., Bio/Technology 10:1446 (1992). Скорость высвобождения иммуноконъюгата из такой матрицы зависит от молекулярной массы иммуноконъюгата, количества иммуноконъюгата в матрице и размера диспергированных частиц. Saltzman et al., Biophys. J. 55:163 (1989); Sherwood и et al. выше. Другие твердые лекарственные формы описаны в Ansel et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, 5th Edition (Lea& Febiger 1990), и Gennaro (ed), REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Edition (Mack Publishing Company 1990) и в их пересмотренных изданиях.

[0172] Обычно дозировка вводимого иммуноконъюгата для людей варьируется в зависимости от таких факторов, как возраст пациента, масса, рост, пол, общее состояние здоровья и предыдущая история болезни. Может быть необходимо обеспечить реципиенту дозу иммуноконъюгата в диапазоне от приблизительно 1 мг/кг до 24 мг/кг в виде однократной внутривенной инфузии, хотя более низкую или более высокую дозу также может быть введена в зависимости от обстоятельств. Например, дозировка от 1 до 20 мг/кг для пациента с массой тела 70 кг составляет от 70 до 1,400 мг или от 41 до 824 мг/м² для пациента ростом 1,7 м. Дозировку можно при необходимости повторять, например, один раз в неделю в течение от 4 до 10 недель, один раз в неделю в течение 8 недель или один раз в неделю в течение 4 недель. Также введение можно осуществлять реже, например, раз в каждые две недели в течение нескольких месяцев или ежемесячно, или ежеквартально в течение многих месяцев, если это необходимо для поддерживающей терапии. Предпочтительные дозировки могут включать, но не ограничиваются ими, 1 мг/кг, 2 мг/кг, 3 мг/кг, 4 мг/кг, 5 мг/кг, 6 мг/кг, 7 мг/кг, 8 мг/кг, 9 мг/кг, 10 мг/кг, 11 мг/кг, 12 мг/кг, 13 мг/кг, 14 мг/кг, 15 мг/кг, 16 мг/кг, 17 мг/кг, 18 мг/кг, 19 мг/кг, 20 мг/кг, 22 мг/кг и 24 мг/кг. Можно использовать любое количество в диапазоне от 1 до 24 мг/кг. Однако в предпочтительных вариантах осуществления диапазон доз может составлять от 4 до 16 мг/кг, от 6 до 12 мг/кг или от 8 до 10 мг/кг.

[0173] Дозу предпочтительно вводят несколько раз, один или два раза в неделю. Минимальная схема дозировки составляет 4 недели, более предпочтительно 8 недель, более предпочтительно 16 недель или более. Схема введения может включать введение один или два раза в неделю по курсу, выбранному из группы, состоящей из: (i) еженедельно; (ii) каждые две недели; (iii) одна неделя терапии, за которой следуют две, три или четыре недели отдыха; (iv) две недели терапии, за которыми следуют одна, две, три или четыре недели отдыха; (v) три недели терапии, за которыми следуют одна, две, три, четыре или пять недель отдыха; (vi) четыре недели терапии, за которыми следуют одна, две, три, четыре или пять недель отдыха; (vii) пять недель терапии, за которыми следуют одна, две, три, четыре или пять недель отдыха; и (viii) ежемесячно. Курс можно повторять 4, 6, 8, 10, 12, 16 или 20 раз или более.

[0174] Альтернативно, иммуноконъюгат можно вводить в виде одной дозировки каждые 2 или 3 недели, повторяя в общей сложности по меньшей мере 3 дозировки. Или два раза в неделю в течение от 4 до 6 недель. Если дозировку снижают до приблизительно от 200 до 300 мг/м² (340 мг на дозу для пациента ростом 1,7 м, или 4,9 мг/кг для пациента с массой тела 70 кг), то ее можно вводить один или даже два раза в неделю в течение от 4 до 10 недель. Альтернативно, схема дозировки может быть уменьшена, а именно каждые 2 или 3 недели в течение от 2 до 3 месяцев. Было установлено, однако, что даже более высокие дозы, такие как 12 мг/кг один раз еженедельно или один раз каждые 2-3 недели, могут быть введены путем медленной внутривенной инфузии, в течение повторных курсов введения дозы. Схему введения дозы, при желании, можно повторять с другими интервалами, и дозу можно вводить различными парентеральными путями с соответствующей корректировкой дозы и схемы.

[0175] В предпочтительных вариантах осуществления иммуноконъюгаты применяют для терапии рака. Примеры раковых заболеваний включают, но не ограничиваются ими, карциному, лимфому, глиобластому, меланому, саркому и лейкоз, миелому или лимфоидные злокачественные новообразования. Более конкретные примеры таких раковых заболеваний указаны ниже и включают: плоскоклеточный рак (например, эпителиально-плоскоклеточный рак), саркому Юинга, опухоль Вильмса, астроцитомы, рак легкого, включая мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого и плоскоклеточный рак легкого, рак брюшины, рак желудочно-кишечного тракта или рак желудка, включая рак желудочно-кишечного тракта, рак поджелудочной железы, мультиформную глиобластому, рак шейки матки, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, гепатоцеллюлярную карциному, нейроэндокринные опухоли, медуллярный рак щитовидной железы, дифференцированный рак щитовидной железы, рак молочной железы, рак яичника, рак толстой кишки, рак прямой кишки, рак эндометрия или рак матки, рак слюнной железы, рак почки, рак предстательной железы, рак вульвы, рак анального канала, рак полового члена, а также рак головы и шеи. Термин "рак" включает первичные злокачественные клетки или опухоли (например, те, клетки которых не мигрировали в участки тела субъекта, отличные от места исходного злокачественного образования или опухоли) и вторичные злокачественные клетки или опухоли (например, те, которые возникают в результате метастазирования, миграции злокачественных клеток или опухолевых клеток во вторичные участки, которые отличаются от места исходной опухоли).

[0176] Другие примеры раковых заболеваний или злокачественных новообразований включают, но не ограничиваются ими: острый лимфобластный лейкоз у детей, острый лимфобластный лейкоз, острый лимфоцитарный лейкоз, острый миелоидный лейкоз, адренокортикальный рак, печеночноклеточный рак у взрослых (первичная форма), рак печени у взрослых (первичная форма), острый лимфоцитарный лейкоз у взрослых, острый миелоидный лейкоз у взрослых, лимфому Ходжкина у взрослых, лимфоцитарный лейкоз у взрослых, неходжкинскую лимфому у взрослых, первичный рак печени у взрослых, саркому мягких тканей у взрослых, СПИД-ассоциированные лимфомы, СПИД-ассоциированные злокачественные новообразования, рак анального канала, астроцитому, рак желчного протока, рак мочевого пузыря, рак костей, глиома ствола головного мозга, опухоли головного мозга, рак молочной железы, рак почечной лоханки и мочеточника, лимфоме центральной нервной системы (первичная форма), лимфому центральной нервной системы, мозжечковую астроцитому, церебральную астроцитому, рак шейки матки, печеночноклеточный рак у детей (первичная форма), рак печени у детей (первичная форма), острый лимфобластный лейкоз у детей, острый миелоидный лейкоз у детей, глиому ствола головного мозга у детей, мозжечковую астроцитому у детей, церебральную астроцитому у детей, экстракраниальную герминогенную опухоль у детей, болезнь Ходжкина у детей, лимфому Ходжкина у детей, глиому гипоталамуса и зрительного пути у детей, лимфобластный лейкоз у детей, медуллобластому у детей, неходжкинскую лимфому у детей, пинеальные и супратенториальные примитивные нейроэктодермальные опухоли у детей, первичный рак печени у детей, рабдомиосаркому у детей, саркому мягких тканей у детей, глиому гипоталамуса и зрительных путей у детей, хроническую лимфоцитарную лейкемию, хронический миелогенный лейкоз, рак толстой кишки, кожную Т-клеточную лимфому, эндокринную карциному клеток панкреатических островков, рак эндометрия, эпендимому, эпителиальный рак, рак пищевода, саркому Юинга и родственные опухоли, экзокринный рак поджелудочной железы, экстракраниальную герминогенную опухоль, внегонадную герминогенную опухоль, рак внепеченочных желчных протоков, рак глаз, рак молочной железы у женщин, болезнь Гоше, рак желчного пузыря, рак желудка, карциноидную опухоль желудочно-кишечного тракта, опухоли желудочно-кишечного тракта, герминогенные опухоли, гестационную трофобластическую опухоль, волосатоклеточный лейкоз, рак головы и шеи, печеночноклеточный рак, лимфому Ходжкина, гипергаммаглобулинемию, гипофарингеальный рак, рак желудочно-кишечного тракта, интраокулярную меланому, рак островковых клеток, рак островковых клеток поджелудочной железы, саркому Капоши, рак почки, рак гортани, рак губ и полости рта, рак печени, рак легкого, лимфопролиферативные расстройства, макроглобулинемию, рак молочной железы у мужчин, злокачественную мезотелиому, злокачественную тимому, медуллобластому, меланому, мезотелиому, метастатический скрытый первичный плоскоклеточный рак шеи, метастатический первичный плоскоклеточный рак шеи, метастатический плоскоклеточный рак шеи, множественную миелому, множественную миелому/плазмоклеточную опухоль, миелодиспластический синдром, миелогенный лейкоз, миелоидный лейкоз, миелопролиферативные расстройства, рак носовой полости и придаточных пазух носа, рак носоглотки, нейробластому, неходжкинскую лимфому, немеланомный рак кожи, немелкоклеточный рак легкого, скрытый первичный метастатический плоскоклеточный рак шеи, рак ротоглотки, остео-/злокачественую фиброзную саркома, остеосаркому/злокачественную фиброзную гистиоцитому, остеосаркому/злокачественную фиброзную гистиоцитому кости, эпителиальный рак яичников, герминогенную опухоль яичников, пограничную опухоль яичника, рак поджелудочной железы, парапротеинемии, полицитемию, рак паращитовидной железы, рак полового члена, феохромоцитому, опухоль гипофиза, первичную лимфому центральной нервной системы, первичный рак печени, рак предстательной железы, рак прямой кишки, почечно-клеточный рак, рак почечной лоханки и мочеточника, ретинобластому, рабдомиосаркому, рак слюнной железы, саркоидную саркому, синдром Сезари, рак кожи, мелкоклеточный рак легкого, рак тонкой кишки, саркому мягких тканей, плоскоклеточный рак шеи, рак желудка, пинеальные и супратенториальные примитивные нейроэктодермальные опухоли, Т-клеточную лимфому, рак яичка, тимому, рак щитовидной железы, переходно-клеточный рак почечной лоханки и мочеточника, трофобластические опухоли, клеточный рак почечной лоханки и мочеточника, рак мочеиспускательного канала, рак матки, саркоме матки, рак влагалища, глиому зрительных путей и гипоталамуса, рак вульвы, макроглобулинемия Вальденстрема, опухоль Вильмса и другие гиперпролиферативные заболевания, кроме неоплазии, расположенные в системе органов, перечисленных выше.

[0177] Способы и композиции, описанные и заявленные в настоящем документе, могут быть использованы для лечения злокачественных или предраковых состояний и для предотвращения прогрессирования до неопластического или злокачественного состояния, включая, но не ограничиваясь этим, расстройства, описанные выше. Такие применения показаны при состояниях с известным или с подозрением на предшествующее прогрессирование до неоплазии или рака, в частности, при росте неопухолевых клеток, состоящим из гиперплазии, метаплазии или, особенно, дисплазии (для обзора таких аномальных условий роста см. Robbins и Angell, Basic Pathology, 2d Ed., WB Saunders Co., Philadelphia, pp. 68-79 (1976)).

[0178] Дисплазия часто является предвестником рака и обнаруживается главным образом в эпителии. Это наиболее беспорядочная форма роста неопухолевых клеток, связанная с потерей однородности отдельных клеток и архитектурной ориентации клеток. Дисплазия обычно возникает там, где существует хроническое раздражение или воспаление. Диспластические расстройства, поддающиеся лечению, включают, но не ограничиваются ими, ангидротическую эктодермальную дисплазию, передне-фациальную дисплазию, асфиксическую торакальную дисплазию, предсердно-пальцевую дисплазию, бронхопульмональную дисплазию, церебральную дисплазию, дисплазию шейки матки, хондроэктодермальную дисплазию, ключично-черепную дисплазию, врожденную эктодермальную дисплазию, черепно-диафизарную дисплазию, черепно-карпотарзальную дисплазию, черепно-метафизарную дисплазию, дисплазию дентина, диафизарную дисплазию, эктодермальную дисплазию, дисплазию эмали, энцефалоофтальмическую дисплазию, эпифизарную гемимелическую дисплазию, множественную эпифизарную дисплазию, точечную эпифизарную дисплазию, эпителиальную дисплазию, фациогенитальную дисплазию, семейную фиброзную дисплазию челюстей, семейную белую складчатую дисплазию, фибромышечную дисплазию, фиброзную дисплазию кости, цементную дисплазию, наследственную почечно-ретинальную дисплазию, гидротическую эктодермальную дисплазию, гипогидротическую эктодермальную дисплазию, лимфопеническую дисплазию тимуса, дисплазию молочной железы, мандибулофациальную дисплазию, метафизарную дисплазию, дисплазию Мондини, монооссальную фиброзную дисплазию, мукоэпителиальную дисплазию, множественную эпифизарную дисплазию, окуло-аурикуло-вертебральную дисплазию, глазо-зубо-пальцевую дисплазию, окуловертебральную остеодисплазию, одонтогенную дисплазию, офтальмомандибулярную дисплазию, периапикальную цементную дисплазию, полиоссальную фиброзную дисплазию, псевдохондродистрофическую спондилоэпифизарную дисплазию, дисплазию сетчатки, септо-оптическую дисплазию, спондилоэпифизарную дисплазию и вентрикулорадиальную дисплазию.

[0179] Дополнительные предраковые расстройства, лечение которых может проводиться, включают, но не ограничиваются ими, доброкачественные диспролиферативные расстройства (например, доброкачественные опухоли, фиброзно-кистозные состояния, гипертрофию тканей, полипы или аденомы кишечника и дисплазию пищевода), лейкоплакию, кератозы, болезнь Боуэна, ромбовидную кожу шеи (Farmer's Skin), солнечный хейлит и солнечный кератоз. В предпочтительных вариантах осуществления способ по настоящему изобретению применяют для ингибирования роста, прогрессирования и/или метастазирования раков, в частности тех, которые перечислены выше.

[0180] Дополнительные гиперпролиферативные заболевания, расстройства и/или состояния включают, но не ограничиваются ими, прогрессирование и/или метастазирование злокачественных новообразований и связанных с ними расстройств, таких как лейкоз (включая острые лейкозы; например, острый лимфоцитарный лейкоз, острый миелоцитарный лейкоз (включая миелобластную, промиелоцитарную, миеломоноцитарную, моноцитарную и эритролейкемию) и хронические лейкозы (например, хронический миелоцитарный (гранулоцитарный) лейкоз и хронический лимфоцитарный лейкоз), полицитемия, лимфомы (например, болезнь Ходжкина, неходжкинская лимфома), множественная миелома, макроглобулинемия Вальденстрема, болезнь тяжелых цепей и солидные опухоли, включая, но не ограничиваясь ими, саркомы и карциномы, такие как фибросаркома, миксосаркома, липосаркома, хондросаркома, остеогенная саркома, хордома, ангиосаркома, эндотелиосаркома, лимфангиосаркома, лимфангиоэндотелиосаркома, синовиома, мезотелиома, опухоль Юинга, лейомиосаркома, рабдомиосаркома, рак толстой кишки, рак поджелудочной железы, рак молочной железы, рак яичника, рак предстательной железы, плоскоклеточный рак, базально-клеточный рак, аденокарцинома, карцинома потовых желез, карцинома сальной железы, папиллярная карцинома, папиллярная аденокарцинома, цистаденокарцинома, медуллярная карцинома, бронхогенный рак, почечно-клеточный рак, гепатома, рак желчных протоков, хориокарцинома, семинома, эмбриональная карцинома, опухоль Вильма, рак шейки матки, опухоль яичка, рак легких, мелкоклеточный рак легких, рак мочевого пузыря, эпителиальная карцинома, глиома, астроцитома, медуллобластома, краниофарингиома, эпендимома, пинеалома, эмангиобластома, акустическая невринома, олигодендроглиома, менингиома, меланома, нейробластома и ретинобластома.

[0181] Аутоиммунные заболевания, которые можно лечить иммуноконъюгатами, могут включать острые и хронические иммунные тромбоцитопении, дерматомиозит, хорею Сиденхема, тяжелую псевдопаралитическую миастению, системную красную волчанку, волчаночный нефрит, ревматическую лихорадку, полигландулярные синдромы, буллезный пемфигоид, сахарный диабет, болезнь Шенлейн-Геноха, постстрептококковый нефрит, узловатую эритему, синдром дуги аорты, АНЦА-ассоциированный васкулит, болезнь Аддисона, ревматоидный артрит, рассеянный склероз, саркоидоз, язвенный колит, многоморфную эритему, IgA-нефропатию, узелковый полиартериит, анкилозирующий спондилит, синдром Гудпасчера, облитерирующий тромбангиит, синдром Шегрена, первичный билиарный цирроз, тиреоидит Хашимото, тиреотоксикоз, склеродермию, хронический активный гепатит, полимиозит/дерматомиозит, полихондрит, буллезный пемфигоид, обыкновенную пузырчатку, гранулематоз Вегенера, мембранную нефропатию, боковой амиотрофический склероз, сухотку спинного мозга, гигантоклеточный артериит/полимиалгию, пернициозную анемию, быстро прогрессирующий гломерулонефрит, псориаз или фиброзный альвеолит.

Наборы

[0182] Различные варианты осуществления относятся к наборам, содержащим компоненты, подходящие для лечения рака у пациента. Примеры наборов могут содержать по меньшей мере одно антитело, конъюгированное с лекарственным средством, как описано в настоящем документе. Если композиция, содержащая компоненты для введения, не представлена в виде, пригодном для доставки через пищеварительный тракт, такой как пероральная доставка, может быть включено устройство, способное доставлять компоненты набора каким-либо другим путем. Один типа устройства для таких применений, как парентеральная доставка, представляет собой шприц, который используют для введения композиции в организм субъекта путем инъекции. Ингаляционные устройства также могут быть использованы.

[0183] Компоненты набора могут быть упакованы вместе или разделены на два или более контейнеров. В некоторых вариантах осуществления контейнеры могут представлять собой флаконы, которые содержат стерильные лиофилизированные составы композиции, пригодные для разведения. Набор также может содержать один или более буферов, подходящих для разведения и/или разбавления других реагентов. Другие контейнеры, которые могут быть использованы, включают, но не ограничиваются ими, мешочек, кювету, коробку, тубу или тому подобное. Компоненты набора могут быть упакованы и храниться стерильно в контейнерах. Другим компонентом, который может быть включен, являются инструкции для человека, применяющего набор по настоящему изобретению.

ПРИМЕРЫ

[0184] Приведенные ниже примеры иллюстрируют варианты осуществления настоящего изобретения и не ограничивают объем формулы изобретения.

Пример 1. Направленная терапия рака желудочно-кишечного тракта с применением IMMU-132 (Сацитузумаб говитекан), анти-Trop-2-SN-38 конъюгата антитела и лекарственного средства (КАС)

[0185] Trop-2 представляет собой ассоциированный с опухолью гликопротеин, широко распространенный во многих эпителиальных раковых заболеваниях. Его повышенная экспрессия связана с более агрессивным заболеванием и плохим прогнозом. Гуманизированное mAb, связывающееся с внеклеточным доменом Trop-2 конъюгировали с SN-38 (IMMU-132; среднее соотношение лекарственное средство:mAb равно 7,6), активный компонент CPT-11. После мощной активности в ксенотрансплантатах опухолей человека, запускали фазы I/II исследования у пациентов (пцт) с различными солидными опухолями, включая рак желудочно-кишечного тракта (ЖКТ).

[0186] Способы: Пациентов с метастатическим раком включали в исследование после неудачной стандартной терапии, начиная с дозы 8,0 мг/кг, вводимой на 1 и 8 дни 3-недельного курса. МПД составляла 12 мг/кг; уровни доз 8 и 10 мг/кг выбирали для фазы II тестирования.

[0187] Результаты: В фазу I/II исследования включали шестьдесят пациентов с раком ЖКТ на поздней стадии. Среди 29 пациентов с колоректальным раком (КРР) (9 получали 10 мг/кг, 20 получали 8 мг/кг), у 1 пациента наблюдали ЧР (частичную ремиссию), у 14 наблюдали СЗ (стабилизацию заболевания) в качестве лучшего ответа по RECIST (Критерии оценки объективного ответа при солидных опухолях), со временем до прогрессирования заболевания (ВДП) 50+ недель для ЧР (-65 %) и в среднем 21+ недель для пациентов с СЗ (5 продолжений). У 13 пациентов с КРР присутствовали мутации KRAS, 7 показали СЗ со средним ВДП 19,1+ недель (от 12,0 до 34,0; 3 продолжения). Из 15 пациентов с раком поджелудочной железы, получавших лечение (5 получали 8 мг/кг, 7 получали 10 мг/кг и 3 получали 12 мг/кг), у 7 наблюдали СЗ как лучший ответ для среднего ВДП 15,0 недель. Среди 11 пациентов с раком пищевода (9 начали с 8 мг/кг, 1 с 10 мг/кг и 1 с 18 мг/кг), 8 имели оценку КТ, показав 1 ЧР с ВДП 30+ недель, и 4 со СЗ 17,4+, 21,9 26,3 и 29,9 недели. Из 5 пациентов с раком желудка (2 получали 8 мг/кг и 3 получали 10 мг/кг) только 3 имели оценку КТ, все со СЗ (1 с 19 % снижением целевого поражения и продолжающимся ВДП в 29+ недель).

[0188] Нейтропения была основным дозолимитирующим токсическим действием, с утомляемостью, диареей, тошнотой и рвотой в качестве других общих токсических эффектах, о которых сообщали пациенты. Тем не менее, профиль токсичности у 75 пациентов в полном исследовании показал только 17,3 % и 2,7 % нейтропении 3 и 4 степени, соответственно, и только 6,7 % 3 степени диареи.

[0189] Выводы: IMMU-132 показал высокий терапевтический индекс у пациентов с различными рецидивами метастатического рака желудочно-кишечного тракта. Он содержит умеренно токсичное лекарственное средство, конъюгированное с интернализующим, селективным к раку mAb, которые можно вводить многократно в течение многих месяцев один раз в неделю × 2 курсом в 21 день.

Пример 2. Получение и применение анти-Trop-2-SN-38 конъюгата антитела и лекарственного средства.

[0190] Гуманизированное RS7 (hRS7) анти-Trop-2 антитело получали, как описано в патенте США № 7238785, разделы графических материалов и примеров которого включены в настоящий документ посредством ссылки. SN-38, присоединенный к линкеру CL2A, получали и конъюгировали с антителами hRS7 (анти-Trop-2), hPAM4 (анти-MUC5ac), hA20 (анти-CD20) или hMN-14 (анти-CEACAM5) в соответствии с патентом США №7999083 (Примеры 10 и 12 которого включены в настоящий документ посредством ссылки). Протокол конъюгации приводил к соотношению приблизительно 6 молекул SN-38, прикрепленных на молекулу антитела.

[0191] Бестимусных мышей с ослабленным иммунитетом (самки), несущих подкожные ксенотрансплантаты опухоли поджелудочной железы или толстой кишки человека, обрабатывали либо специфическим конъюгатом CL2A-SN-38, либо контрольным конъюгатом, либо не подвергали обработке. Терапевтическую эффективность специфических конъюгатов наблюдали. На фиг. 1 показана модель опухоли поджелудочной железы Capan 1, где специфические конъюгаты CL2A-SN-38 антител hRS7 (анти-Trop-2), hPAM4 (анти-MUC-5ac) и hMN-14 (анти-CEACAM5) показали лучшую эффективность по сравнению с контрольным конъюгатом hA20-CL2A-SN-38 (анти-CD20) и необработанной контрольной группой. Аналогично в модели рака поджелудочной железы человека BXPC3 специфический hRS7-CL2A-SN-38 показал лучшую терапевтическую эффективность по сравнению с контрольными группами (фиг. 2).

Пример 3. Эффективность КАС анти-Trop-2-SN-38 против разнообразных эпителиальных раковых образований in vivo.

Реферат

[0192] Цель этого исследования состояла в том, чтобы оценить эффективность SN-38-анти-Trop-2 (hRS7) КАС в отношении нескольких типов солидных опухолей человека и оценить его переносимость у мышей и макак, последние в отношении перекрестной реактивности тканей к hRS7 подобны человеку. Два производных SN-38, CL2-SN-38 и CL2A-SN-38, конъюгировали с hRS7, гуманизированным антителом анти-Trop-2. Иммуноконъюгаты охарактеризовывали in vitro на стабильность, связывание и цитотоксичность. Эффективность протестировали на пяти различных моделях ксенотрансплантатов солидных опухолей человека, которые экспрессировали антиген Trop-2. Токсичность оценивали на мышах и яванских макаках.

[0193] Конъюгаты hRS7 двух производных SN-38 были эквивалентны по замещению лекарственным средством (приблизительно 6), связыванию клеток (K_d приблизительно 1,2 нмоль/л), цитотоксичности (IC₅₀ приблизительно 2,2 нмоль/л) и стабильности сыворотки in vitro (t/_1/2 приблизительно 20 часов). Воздействие клеток на КАС продемонстрировало сигнальные пути, приводящие к расщеплению PARP, но были отмечены различия в сравнении со свободным SN-38 в повышении p53 и p21. Значительные противоопухолевые эффекты были вызваны hRS7-SN-38 при нетоксичных дозах у мышей с опухолями Calu-3 (P меньше или равно 0,05), Capan-1 (P меньше 0,018), BxPC-3 (P меньше 0,005) и COLO 205 (P меньше 0,033) по сравнению с нецелевыми контрольными КАС. Мыши переносили дозу 2×12 мг/кг (эквиваленты SN-38) только с кратковременным повышением уровня ферментов печени АЛТ и АСТ. Яванские макаки, которым вводили 2×0,96 мг/кг, демонстрировали только кратковременное снижение показателей крови, хотя важно, что значения не опускались ниже нормальных.

[0194] Таким образом, КАС анти-Trop-2 hRS7-CL2A-SN-38 обеспечивал значительные и специфические противоопухолевые эффекты против ряда типов солидных опухолей человека. Отличался хорошей переносимостью у макак с тканевой экспрессией Trop-2, сходной с человеческой, в клинически значимых дозах.

Введение

[0195] Успешное лечение иринотеканом пациентов с солидными опухолями было ограничено, во многом из-за низкой скорости превращения пролекарства СРТ-11 в активный метаболит SN-38. Другие исследователи изучали нецелевые формы SN-38 как способ обойти необходимость такого преобразования и пассивно доставлять SN-38 к опухолям. Авторы настоящего изобретения конъюгировали SN-38 ковалентно с гуманизированным антителом анти-Trop-2, hRS7. Этот конъюгат антитело-лекарственное средство обладает специфическим противоопухолевым эффектом в отношении ряда подкожных моделей ксенотрансплантатов рака человека, включая немелкоклеточную карциному легкого, рак поджелудочной железы, колоректальный рак и плоскоклеточный рак легкого, все в нетоксичных дозах (например, меньше или равно 3,2 мг/кг кумулятивной эквивалентной дозы SN-38). Trop-2 широко экспрессируется при многих эпителиальных раковых заболеваниях, но также и в некоторых здоровых тканях, и поэтому проводили исследование повышения дозы на яванских макаках для оценки клинической безопасности этого конъюгата. Макаки переносили 24 мг эквивалента SN-38/кг с незначительной обратимой токсичностью. Учитывая его направленность на опухоль и профиль безопасности, hRS7-SN-38 обеспечивает значительное улучшение лечения солидных опухолей, чувствительных к иринотекану.

Материалы и способы

[0196] Клеточные линии, антитела и химиотерапевтические средства. Все линии раковых клеток человека, примененные в настоящем исследовании, были приобретены в Американской коллекции типовых культур. К ним относятся Calu-3 (немелкоклеточная карцинома легкого), SK-MES-1 (плоскоклеточная карцинома легкого), COLO 205 (аденокарцинома толстой кишки), Capan-1 и BxPC-3 (аденокарцинома поджелудочной железы), и PC-3 (аденокарциномы предстательной железы). Гуманизированные RS7 IgG и контрольные гуманизированные антитела анти-CD20 (hA20 IgG, велтузумаб) и анти-CD22 (hLL2 IgG, эпратузумаб) получали в Immunomedics, Inc. Иринотекан (20 мг/мл) получали от Hospira, Inc.

[0197] Иммуноконъюгаты SN-38 и аспекты in vitro. Синтез CL2-SN-38 описан ранее (Moon et al., 2008, J Med Chem 51:6916-26). Его конъюгирование с hRS7 IgG и стабильность в сыворотке крови проводили, как описано (Moon et al., 2008, J Med Chem 51: 6916-26; Govindan et al., 2009, Clin Chem Res 15: 6052-61). Получение CL2A-SN-38 (M.W. 1480) и его конъюгата hRS7, а также исследования стабильности, связывания и цитотоксичности проводили, как описано в предыдущих примерах.

[0198] Терапевтические исследования in vivo. Для всех исследований на животных дозы иммуноконъюгатов SN-38 и иринотекана показаны в эквивалентах SN-38. На основании средней степени замещения SN-38/IgG, равного 6, доза 500 мкг КАС для мыши массой 20 г (25 мг/кг) содержит 0,4 мг/кг SN-38. Дозы иринотекана также представлены в виде эквивалентов SN-38 (то есть 40 мг иринотекана/кг эквивалентны 24 мг/кг SN-38).

[0199] Самок бестимусных (nu/nu) мышей NCr в возрасте от 4 до 8 недель и самцов мышей Swiss-Webster в возрасте 10 недель приобретали у Taconic Farms. Исследования переносимости проводили на яванских макаках (Macaca fascicularis; массой от 2,5 до 4 кг, самцы и самки) от SNBL USA, Ltd.

[0200] Животным имплантировали подкожно различные линии раковых клеток человека. Объем опухоли (ОО) определяли путем измерений в двух измерениях с применением штангенциркуля, причем объемы определяли как: L×w²/2, где L представляет собой самое длинное измерение опухоли, а w представляет собой самое короткое. Размер опухолей варьировался от 0,10 до 0,47 см³ в начале терапии. Схемы лечения, дозировки и количество животных в каждом эксперименте описаны в результатах. Лиофилизированный hRS7-CL2A-SN-38 и контрольный КАС восстанавливали и разбавляли, как требуется, в стерильном солевом растворе. Все реагенты вводили внутрибрюшинно (0,1 мл), кроме иринотекана, который вводили внутривенно. На режим дозирования влияли предыдущие исследования авторов изобретения, в которых КАС давали каждые 4 дня или два раза в неделю в течение разного периода времени (Moon et al., 2008, J Med Chem 51:6916-26; Govindan et al., 2009, Clin Chem Res 15:6052-61). Эта частота дозирования отражала рассмотрение периода полураспада конъюгата в сыворотке in vitro, чтобы обеспечить более продолжительное воздействие КАС.

[0201] Статистика. Кривые роста показаны как процентное изменение в первоначальном ОО с течением времени. Статистический анализ роста опухоли основывался на площади под кривой (AUC- area under the curve). Профили индивидуального роста опухоли получали с помощью моделирования кривой с применением линейной регрессии. F-тест применяли для определения равенства дисперсии между группами перед статистическим анализом кривых роста. Для оценки статистической значимости между различными группами лечения и контрольными группами применяли двусторонний t-критерий Стьюдента, за исключением контрольного солевого раствора, где применяли односторонний t-критерий Стьюдента (значимость при P меньше или равно 0,05). Статистические сравнения AUC проводили только до того момента, когда первое животное в группе умерщвляли вследствие прогрессирования.

[0202] Фармакокинетика и биораспределение. ¹¹¹In-радиоактивно меченные hRS7-CL2A-SN-38 и hRS7 IgG вводили голым мышам, несущим подкожные опухоли SK-MES-1 (приблизительно 0,3 см³). Одной группе вводили внутривенно 20 мкКи (250 мкг белка) ¹¹¹In-hRS7-CL2A-SN-38, тогда как другая группа получала 20 мкКи (250 мкг белка) ¹¹¹In-hRS7 IgG. В различные моменты времени мышей (по 5 на момент времени) анестезировали, брали кровь с помощью внутрисердечной пункции, а затем подвергали эвтаназии. Опухоли и различные ткани удаляли, взвешивали и подсчитывали с помощью γ сцинтилляции для определения процента инъецированной дозы на грамм ткани (% ИД/г). Третьей группе вводили 250 мкг немеченого hRS7-CL2A-SN-38 за 3 дня до введения ¹¹¹In-hRS7-CL2A-SN-38 и аналогичным образом подвергали вскрытию. Для сравнения поглощения hRS7-CL2A-SN-38 и hRS7 IgG применяли двусторонний t-критерий Стьюдента после определения дисперсии с применением f-теста. Фармакокинетический анализ клиренса крови проводили с применением программного обеспечения WinNonLin (Parsight Corp.).

[0203] Переносимость у мышей Swiss-Webster и яванских макак. Вкратце, мышей сортировали на 4 группы для введения внутрибрюшинных инъекций 2 мл, либо контрольного натрий-ацетатного буфера, либо трех разных доз hRS7-CL2A-SN-38 (4, 8 или 12 мг/кг SN-38) в дни 0 и 3 с последующим забором крови и сыворотки, как описано в результатах. Яванским макакам (3 самца и 3 самки; от 2,5 до 4,0 кг) вводили 2 разные дозы hRS7-CL2A-SN-38. Дозировки, время и количество макак, отобранных для оценки возможной гематологической токсичности и химического состава сыворотки, описаны в результатах.

Результаты

[0204] Стабильность и активность hRS7-CL2A-SN-38. Для конъюгации SN-38 с hRS7 IgG применяли две разные связи (фиг. 3A). Первая называется CL2-SN-38 и была описана ранее (Moon et al., 2008, J Med Chem 51:6916-26; Govindan et al., 2009, Clin Chem Res 15:6052-61). Изменение в синтезе CL2 для удаления фенилаланинового фрагмента в линкере применяли для получения линкера CL2A. Это изменение упрощает синтез, но не влияет на результат конъюгации (например, в оба CL2-SN-38 и CL2A-SN-38 включены приблизительно 6 SN-38 на молекулу IgG). Параллельное сравнение не выявило статистически значимых различий в стабильности сыворотки, связывании антигена или цитотоксичности in vitro. Этот результат был неожиданным, поскольку остаток фенилаланина в CL2 является частью спроектированного сайта расщепления для катепсина B, лизосомальной протеазы.

[0205] Для изучения эффектов изменения линкера SN-38 с CL2 на CL2A, сравнивали hRS7-CL2A и hRS7-CL2-SN-38 у мышей, несущих опухоли COLO 205 (фигура 3B) или Capan-1 (фигуры 3C), с применением 0,4 мг или 0,2 мг/кг SN-38 два раза в неделю × 4 недели, соответственно, и с исходными опухолями размером 0,25 см³ в обоих исследованиях. Оба конъюгата hRS7-CL2A и CL2-SN-38 значительно ингибировали рост опухоли по сравнению с необработанным контролем (AUC_14дней P меньше 0,002 в сравнении с солевым раствором в модели COLO 205; AUC_21день P меньше 0,001 в сравнении с солевым раствором в модели Capan-1) и ненаправленным контрольным КАС анти-CD20, hA20-CL2A-SN-38 (AUC_14дней P меньше 0,003 в модели COLO-205; AUC_35дней: P меньше 0,002 в модели Capan-1). В конце исследования (день 140) на модели Capan-1, 50 % мышей, получавших hRS7-CL2A-SN-38, и 40 % мышей, получавших hRS7-CL2-SN-38, не имели опухолей, тогда как только 20 % животных, получавших hA20-КАС, не имели видимых признаков заболевания. Как показано на фиг. 3, линкер CL2A приводил к несколько более высокой эффективности по сравнению с CL2.

[0206] Механизм действия. Исследования цитотоксичности in vitro показали, что hRS7-CL2A-SN-38 имел значения IC₅₀ в диапазоне нмоль/л против нескольких различных линий солидных опухолей (таблица 2). Значение IC₅₀ со свободным SN-38 было ниже, чем для конъюгата во всех клеточных линиях. Хотя не наблюдали очевидной корреляции между экспрессией Trop-2 и чувствительностью к hRS7-CL2A-SN-38, отношение IC₅₀ КАС к свободному SN-38 было ниже в клетках с более высокой экспрессией Trop-2, скорее всего, это отражает усиленную способность к усвоению лекарственного средства в присутствии большего количества антигена.

[0207] Известно, что SN-38 активирует несколько сигнальных путей в клетках, что приводит к апоптозу (например, Cusack et al., 2001, Cancer Res 61:3535-40; Liu et al. 2009, Cancer Lett 274:47-53; Lagadec et al., 2008, Br J Cancer 98:335-44). В первоначальных исследованиях авторов изобретения изучали экспрессию 2 белков, участвующих в ранних сигнальных событиях (p21^Waf1/Cip1 и p53) и 1 позднем апоптотическом событии (расщепление поли-АДФ-рибозной полимеразы (PARP)) in vitro (не показано). В линии BxPC-3, SN-38 приводил к 20-кратному увеличению экспрессии p21^Waf1/Cip1 (не показано), тогда как hRS7-CL2A-SN-38 приводил только к 10-кратному увеличению (не показано), что согласуется с более высокой активностью со свободным SN-38 в этой клеточной линии (таблица 2). Однако hRS7-CL2A-SN-38 увеличивал экспрессию p21^Waf1/Cip1 в линии Calu-3 более чем в 2 раза по сравнению со свободным SN-38 (не показано).

[0208] Большее несоответствие между опосредованными hRS7-CL2A-SN-38 и свободным SN-38 сигнальными событиями наблюдали в экспрессии p53 (не показано). Как в BxPC-3, так и в Calu-3 положительная регуляция p53 со свободным SN-38 не была очевидна до 48 часов, тогда как hRS7-CL2A-SN-38 положительно регулировал p53 в течение 24 часов (не показано). Кроме того, экспрессия р53 в клетках, подвергшихся воздействию КАС, была выше в обеих клеточных линиях по сравнению с SN-38 (не показано). Интересно, что, хотя hRS7 IgG не оказывал заметного влияния на экспрессию p21^Waf1/Cip1, он вызывал положительную регуляцию p53 как в BxPC-3, так и в Calu-3, но только после 48-часового воздействия (не показано). Что касается более поздних апоптотических явлений, расщепление PARP было очевидным в обеих клеточных линиях при инкубации либо с SN-38, либо с конъюгатом (не показано). Присутствие расщепленного PARP было выше через 24 часа в BxPC-3 (не показано), что коррелирует с высокой экспрессией p21 и его более низкой IC₅₀. Более высокая степень расщепления свободным SN-38 по сравнению с КАС согласуется с данными цитотоксичности.

[0209] Эффективность hRS7-SN-38. Поскольку Trop-2 широко экспрессируется в нескольких карциномах человека, исследования проводили на нескольких различных моделях рака человека, начиная с применения связи hRS7-CL2-SN-38, но позже стали применять конъюгаты с CL2A-связью. Голые мыши, несущие Calu-3, которые получали 0,04 мг SN-38/кг hRS7-CL2-SN-38 каждые 4 дня × 4, имели значительно улучшенный ответ по сравнению с животными, которым вводили эквивалентное количество нецелевого hLL2-CL2-SN-38 (ОО равен 0,14 ± 0,22 см³ против 0,80 ± 0,91 см³, соответственно; AUC_42дня P меньше 0,026; фиг. 4A). Дозозависимый эффект наблюдали при увеличении дозы до 0,4 мг/кг SN-38 (фиг. 4A). При этом более высоком уровне дозы все мыши, которым давали специфический конъюгат hRS7, были "излечены" в течение 28 дней и не имели опухолей до конца исследования на 147-й день, тогда как опухоли вновь появлялись у животных, которые получали нерелевантный КАС (специфический против нерелевантного AUC_98дней: P равно 0,05). У мышей, которые получали смесь hRS7 IgG и SN-38, опухоли прогрессировали в более чем 4,5 раза к 56 дню (ОО равен 1,10 ± 0,88 см³; AUC_56день P меньше 0,006 против hRS7-CL2-SN-38) (фиг. 4A).

[0210] Эффективность также исследовали на ксенотрансплантатах опухолей толстой кишки человека (COLO 205) и поджелудочной железы (Capan-1). У животных с опухолями COLO 205 (фиг. 4B) hRS7-CL2-SN-38 (0,4 мг/кг, q4dx8) предотвращал рост опухоли в течение 28-дневного периода лечения со значительно меньшими опухолями по сравнению с контрольным КАС анти-CD20 (hA20-CL2-SN-38) или hRS7 IgG (ОО равен 0,16±0,09 см³, 1,19±0,59 см³ и 1,77±0,93 см³, соответственно; AUC_28дней Р меньше 0,016).

Таблица 2. Экспрессия Trop-2 in vitro цитотоксичности SN-38 и hRS7-SN-38 в различных линиях солидных опухолей

Экспрессия Trop-2 против FACS Результаты цитотоксичности Клеточная линия Средняя флуоресценция (фоновая) Положительный процент SN-38 95 % доверительный интервал hRS7-SN-38 95 % доверительный интервал Соотношение КАС/свободный SN-38 IC₅₀ (нмоль/л) IC₅₀ (нмоль/л) IC₅₀ (нмоль/л) IC₅₀ (нмоль/л) Calu-3 282,2 (4,7) 99,6 % 7,19 5,77-8,95 9,97 8,12-12,25 1,39 COLO 205 141,5 (4,5) 99,5 % 1,02 0,66-1,57 1,95 1,26-3,01 1,91 Capan-1 100,0 (5,0) 94,2 % 3,50 2,17-5,65 6,99 5,02-9,72 2,00 PC-3 46,2 (5,5) 73,6 % 1,86 1,16-2,99 4,24 2,99-6,01 2,28 SK-MES-1 44,0 (3,5) 91,2 % 8,61 6,30-11,76 23,14 17,98-29,78 2,69 BxPC-3 26,4(3,1) 98,3 % 1,44 1,04-2,00 4,03 3,25-4,98 2,80

[0211] МПД иринотекана (24 мг SN-38/кг, q2dx5) была так же эффективна, как hRS7-CL2-SN-38 в клетках COLO 205, поскольку мышиная сыворотка может более эффективно превращать иринотекан в SN-38 (Morton et al., 2000, Cancer Res 60:4206-10), чем человеческая сыворотка, но доза SN-38 в иринотекане (кумулятивно 2400 мкг) была в 37,5 раза больше, чем с конъюгатом (всего 64 мкг).

[0212] Животные, несущие Capan-1 (фиг. 4С), не проявляли статистически значимого ответа на только иринотекан, когда его давали в дозе SN-38, эквивалентной конъюгату hRS7-CL2-SN-38 (например, на 35-й день, средний размер опухоли составлял 0,04±0,05 см³ у животных, которым давали 0,4 мг SN-38/кг hRS7-SN-38, по сравнению с 1,78±0,62 см³ у животных, обработанных иринотеканом, получавших 0,4 мг/кг SN-38; AUC_35день P меньше 0,001; фигура 4C). При увеличении дозы иринотекана в 10 раз до 4 мг/кг SN-38, ответ улучшался, но все же не был столь же значительным, как у конъюгата при уровне дозы 0,4 мг/кг SN-38 (ОО равен 0,17±0,18 см³ против 1,69±0,47 см³, AUC_49день P меньше 0,001) (фиг. 4C). Равная доза ненаправленного hA20-CL2-SN-38 также имела значительный противоопухолевый эффект по сравнению с животными, обработанными иринотеканом, но специфический конъюгат hRS7 был статистически значимо лучше, чем нерелевантный КАС (ОО равен 0,17±0,18 см³ против 0,80±0,68 см³, AUC_49день P меньше 0,018) (фиг. 4C).

[0213] Затем исследование КАС hRS7-CL2A-SN-38 расширили на 2 другие модели эпителиального рака человека. У мышей с опухолями поджелудочной железы человека BxPC-3 (фиг.4D) hRS7-CL2A-SN-38 снова значительно ингибировал рост опухоли по сравнению с контрольными мышами, которые получали солевой раствор или эквивалентное количество ненаправленного hA20-CL2A-SN-38 (ОО равен 0,24±0,11 см³ против 1,17±0,45 см³ и 1,05±0,73 см³ соответственно; AUC_21день P меньше 0,001) или иринотекан в дозе в 10 раз выше эквивалентной дозы SN-38 (ОО равен 0,27±0,18 см³ против 0,90±0,62 см³, соответственно; AUC_25день P меньше 0,004) (фиг. 4D). Интересно, что у мышей, несущих плоскоклеточные опухоли легких человека SK-MES-1, обработанных 0,4 мг/кг КАС (фигура 4E), ингибирование роста опухоли превосходило рост опухоли при обработке солевым раствором или неконъюгированныи IgG hRS7 (ОО равен 0,36±0,25 см³ против 1,02±0,70 см³ и 1,30±1,08 см³ соответственно; AUC_28дней, P меньше 0,043), но ненаправленный hA20-CL2A-SN-38 или МПД иринотекана давали те же противоопухолевые эффекты, что и специфический конъюгат hRS7-SN-38 (фиг. 5E).

[0214] Во всех исследованиях на мышах КАС hRS7-SN-38 хорошо переносился с точки зрения потери массы тела (не показано).

[0215] Биораспределение hRS7-CL2A-SN-38. Биораспределение hRS7-CL2A-SN-38 или неконъюгированного hRS7 IgG сравнивали на мышах, несущих ксенотрансплантаты плоскоклеточной карциномы легких человека SK-MES-1 (не показано), с применением соответствующих ¹¹¹In-меченных субстратов. Фармакокинетический анализ выполняли для определения клиренса hRS7-CL2A-SN-38 относительно неконъюгированного hRS7 (не показан). КАС выводится быстрее, чем эквивалентное количество неконъюгированного hRS7, при этом КАС демонстрирует приблизительно на 40 % более короткий период полураспада и среднее время удержания в организме. Тем не менее, это оказывало минимальное влияние на поглощение опухолью (не показано). Хотя наблюдали статистически значимые различия в момент времени 24 и 48 часов, к 72 часам (пиковое поглощение) количества обоих агентов в опухоли были одинаковыми. Среди здоровых тканей различия между тканями печени и селезенки были самыми значительными (не показано). Через 24 часа после инъекции hRS7-CL2A-SN-38 было в 2 раза больше в печени, чем hRS7 IgG (не показано). И наоборот, в селезенке было в 3 раза больше родительских hRS7 IgG, присутствующих при пиковом поглощении (момент времени 48 часов), чем hRS7-CL2A-SN-38 (не показано). Поглощение и выведение в остальных тканях обычно отражают различия в концентрации в крови (не показано).

[0216] Поскольку для терапии назначали дозы два раза в неделю, изучали поглощение опухолью в группе животных, которые сначала получили преддозу 0,2 мг/кг (250 мкг белка) КАС hRS7 за 3 дня до введения меченного ¹¹¹In антитела. Поглощение опухолью ¹¹¹In-hRS7-CL2A-SN-38 у мышей, которым вводили преддозу, было значительно снижено в каждый момент времени по сравнению с животными, которые не получали преддозу (например, через 72 часа поглощение опухолью с введением преддозы составляло 12,5±3,8 % ID/г по сравнению с 25,4±8,1 % ID/г у животных, которым не вводили предозу; P равно 0,0123; не показано). Введение преддозы не оказывало заметного влияния на клиренс крови или поглощение ткаями (не показано). Эти исследования предполагают, что в некоторых моделях опухолей, накопление специфического антитела в опухоли может быть уменьшено введением преддозы (преддоз), что, вероятно, объясняет, почему специфичность терапевтического ответа может быть уменьшена с увеличением доз КАС и почему дальнейшего повышения дозы не происходит.

[0217] Переносимость hRS7-CL2A-SN-38 у мышей Swiss-Webster и яванских макак. Мыши Swiss-Webster переносили 2 дозы в течение 3 дней, каждая 4, 8 и 12 мг SN-38/кг hRS7-CL2A-SN-38 с минимальной временной потерей массы тела (не показано). Никакой гематопоэтической токсичности не наблюдали, и биохимические анализы сыворотки выявили только повышенный уровень аспартаттрансаминазы (АСТ, фиг. 5A) и аланинтрансаминазы (АЛТ, фиг. 5B). Через семь дней после лечения уровень АСТ поднялся выше нормального уровня (более 298 ед/л) во всех 3 группах лечения (фиг. 5А), при этом наибольшая доля мышей была в группе 2×8 мг/кг. Однако через 15 дней после обработки у большинства животных указанные уровни находились в пределах нормы. Уровни АЛТ также были выше нормы (более 77 ед/л) в течение 7 дней лечения (фиг. 5B) и с признаками нормализации к 15-му дню. Печени всех этих мышей не продемонстрировали гистологических признаков повреждения ткани (не показано). Что касается почечной функции, только уровни глюкозы и хлорида были несколько повышены в обработанных группах. При 2×8 мг/кг у 5 из 7 мышей были слегка повышенные уровни глюкозы (от 273 до 320 мг/дл, верхний предел нормы 263 мг/дл), которые возвращались к норме через 15 дней после инъекции. Аналогично, уровни хлоридов были слегка повышены, в пределах от 116 до 127 ммоль/л (верхний предел нормы 115 ммоль/л) в 2 группах с самой высокой дозировкой (57% в группе 2×8 мг/кг и 100 % мышей в группе 2×12 мг/кг) и оставался повышенным до 15 дней после введения. Это также может указывать на желудочно-кишечную токсичность, потому что большая часть хлорида поступает путем всасывания в кишечнике; однако, в итоге, не было никаких гистологических признаков повреждения ткани ни в одной из исследованных систем органов (не показано).

[0218] Поскольку мыши не экспрессируют Trop-2, идентифицированный hRS7, для определения потенциала конъюгата hRS7 для клинического применения требовалась более подходящая модель. Иммуногистологические исследования выявили связывание во множестве тканей у людей и яванских макак (молочных желез, глаз, желудочно-кишечного тракта, почек, легких, яичников, маточных труб, поджелудочной железы, околощитовидной железы, предстательной железы, слюнных желез, кожи, тимуса, щитовидной железы, миндалин, мочеточников, мочевыводящих путей, мочевого пузыря и матки; не показано). На основании этой перекрестной реактивности было проведено исследование переносимости на макаках.

[0219] Группа, которая получала 2×0,96 мг SN-38/кг hRS7-CL2A-SN-38, не имела значимых клинических проявлений после инфузии и после прекращения исследования. Потеря массы тела не превышала 7,3 % и возвращалась к массе при адаптации к 15-му дню. В большинстве данных анализа крови было отмечены временные снижения (данные по нейтрофилам и тромбоцитам, показанные на фиг. 5C и фиг. 5D), но значения не падали ниже нормальных диапазонов. Не было обнаружено аномальных значений в химическом анализе сыворотки. Гистопатология животных, вскрытых на 11-й день (8 дней после последней инъекции), показала микроскопические изменения в органах кроветворения (тимус, нижнечелюстные и брыжеечные лимфатические узлы, селезенка и костный мозг), желудочно-кишечных органах (желудок, двенадцатиперстная кишка, тощая кишка, подвздошная кишка, слепая кишка, толстая кишка и прямая кишка), женских репродуктивных органах (яичник, матка и влагалище) и в месте инъекции. Эти изменения варьировались от минимальных до умеренных и были полностью устранены в конце периода восстановления (день 32) во всех тканях, кроме тимуса и желудочно-кишечного тракта, которые имели тенденцию к полному восстановлению в более поздний момент времени (не показано).

[0220] При уровне дозы конъюгата 2×1,92 мг SN-38/кг произошла 1 смерть от осложнений со стороны желудочно-кишечного тракта и угнетения костного мозга, и у других животных в этой группе наблюдались аналогичные, но более тяжелые нежелательные явления, чем в группе 2×0,96 мг/кг (не показано). Эти данные показывают, что дозолимитирующая токсичность была такой же, как у иринотекана; а именно, кишечной и гематологической. Таким образом, МПД для hRS7-CL2A-SN-38 составляет от 2×0,96 до 1,92 мг SN-38/кг, что соответствует эквивалентной дозе для человека от 2×0,3 до 0,6 мг/кг SN-38.

Обсуждение

[0221] Trop-2 представляет собой белок, экспрессируемый во многих эпителиальных опухолях, включая рак легких, молочной железы, колоректальный рак, рак поджелудочной железы, предстательной железы и яичников, что делает его потенциально важной мишенью для доставки цитотоксических агентов (Ohmachi et al., 2006, Clin Cancer Res 12:3057-63; Fong et al., 2008, Br J Cancer 99: 1290-95; Cubas et al., 2009, Biochim Biophys Acta 1796:309-14). Антитело RS7 интернализуется при связывании с Trop-2 (Shih et al., 1995, Cancer Res 55: 5857s-63s), что обеспечивает прямую внутриклеточную доставку цитотоксических веществ.

[0222] SN-38 является мощным ингибитором топоизомеразы-I со значениями IC₅₀ в наномолярном диапазоне в нескольких клеточных линиях. Это активная форма пролекарства иринотекан, которую применяют для лечения колоректального рака, и которая также обладает активностью при раке легких, молочной железы и головного мозга. Авторы изобретения пришли к выводу, что непосредственно направленный SN-38 в форме КАС может быть значительно улучшенным терапевтическим препаратом по сравнению с CPT-11, преодолев его низкую и вариабельную в зависимости от пациента биоконверсию в активный SN-38 (Mathijssen et al., 2001, Clin Cancer Res 7:2182-94).

[0223] Пептид Phe-Lys, встроенный в исходное производное CL2, позволял возможное расщепление через катепсин B. Для упрощения процесса получения, фенилаланин в CL2A удаляли, и, таким образом, удаляли сайт расщепления катепсином B. Интересно, что этот продукт имел лучше определенный хроматографический профиль по сравнению с широким профилем, полученным для CL2 (не показан), но, что более важно, это изменение не оказывало влияния на связывание или стабильность конъюгата, и демонстрировал несколько более высокую эффективность, в параллельном тестировании. Эти данные свидетельствуют о том, что SN-38 в CL2 высвобождается из конъюгата, главным образом, путем расщепления по рН-чувствительной бензилкарбонатной связи с лактоновым кольцом SN-38, а не сайтом расщепления катепсина B.

[0224] Цитотоксичность КАС hRS7 in vitro в отношении ряда линий клеток солидных опухолей постоянно имела значения IC₅₀ в диапазоне нмоль/л. Однако клетки, подвергшиеся воздействию свободного SN-38, продемонстрировали более низкое значение IC₅₀ по сравнению с КАС. Это несоответствие между свободным и конъюгированным SN-38 также сообщалось для ENZ-2208 (Sapra et al., 2008, Clin Cancer Res 14: 1888-96, Zhao et al., 2008, Bioconjug Chem 19: 849-59) и NK012 (Koizumi et al., 2006, Cancer Res 66: 10048-56). ENZ-2208 использует разветвленный ПЭГ для связывания приблизительно от 3,5 до 4 молекул SN-38 на ПЭГ, тогда как NK012 представляет собой мицеллярную наночастицу, содержащую 20 мас.% SN-38. При применении КАС по настоящему изобретению это несоответствие (то есть соотношение эффективности со свободным и конъюгированным SN-38) уменьшалось по мере увеличения уровней экспрессии Trop-2 в опухолевых клетках, что свидетельствует о преимуществе целевой доставки лекарственного средства. Что касается стабильности сыворотки in vitro, как CL2-, так и CL2A-SN-38 формы hRS7-SN-38 дали выход t/_1/2 приблизительно 20 часов, что отличается от короткого t/_1/2, равного 12,3 минутам, для ENZ-2208 (Zhao et al., 2008, Bioconjug Chem 19: 849-59), но аналогично 57%-ному высвобождению SN-38 из NK012 в физиологических условиях через 24 часа (Koizumi et al., 2006, Cancer Res 66: 10048-56).

[0225] Лечение мышей, несущих опухоли, hRS7-SN-38 (либо с CL2-SN-38, либо с CL2A-SN-38) значительно ингибировало рост опухоли в 5 различных моделях опухолей. В 4 из них наблюдали регрессию опухоли, и в случае Calu-3 все мыши, которые получают наибольшую дозу hRS7-SN-38, не имели опухолей в конце исследования. В отличие от человека, иринотекан очень эффективно преобразуется в SN-38 с помощью плазменной эстеразы у мышей со скоростью превращения более 50% и дает более высокую эффективность у мышей, чем у людей (Morton et al., 2000, Cancer Res 60: 4206-10; Furman et al., 1999, J Clin Oncol 17: 1815-24). Когда иринотекан вводили в 10 раз выше или эквивалентно уровнях SN-38, hRS7-SN-38 был значительно лучше в контроле роста опухоли. Только когда иринотекан вводили в его МПД 24 мг/кг q2dx5 (в 37,5 раза больше SN-38), он был равен эффективности hRS7-SN-38. Авторы изобретения ожидают, что у пациентов это преимущество будет более благоприятным для hRS7-CL2A-SN-38, поскольку биоконверсия иринотекана будет значительно ниже.

[0226] Авторы изобретения также показали, что в некоторых антиген-экспрессирующих клеточных линиях, таких как SK-MES-1, применение антигенсвязывающего КАС не гарантирует лучших терапевтических ответов, по сравнению с несвязывающим нерелевантным конъюгатом. Это не необычное или неожиданное открытие. Действительно, несвязанные конъюгаты SN-38, упомянутые ранее, усиливают терапевтическую активность по сравнению с иринотеканом, и поэтому ожидается, что нерелевантный конъюгат IgG-SN-38 будет иметь некоторую активность. Это связано с тем, что опухоли имеют незрелые, пропускающие сосуды, которые обеспечивают прохождение макромолекул лучше, чем нормальные ткани (Jain, 1994, Sci Am 271: 58-61). С конъюгатом по настоящему изобретению, 50% SN-38 будет высвобождаться через приблизительно 13 часов, когда pH понизится до уровня, имитирующего лизосомальные уровни (например, pH 5,3 при 37°C; данные не показаны), тогда как при нейтральном pH сыворотки, скорость высвобождения снижается почти в 2 раза. Если нерелевантный конъюгат попадает в кислотное микроокружение опухоли, ожидается, что он выделит некоторое количество SN-38 локально. Другие факторы, такие как физиология опухоли и врожденная чувствительность к лекарственному средству, также будут играть роль в определении этой "базовой" активности. Однако конкретный конъюгат с более длительным временем пребывания должен обладать повышенной эффективностью по сравнению с этим базовым ответом, пока имеется достаточно антигена для захвата специфического антитела. Исследования биораспределения на модели SK-MES-1 также показали, что, если опухолевый антиген становится насыщенным в результате последовательного дозирования, поглощение опухолью специфического конъюгата снижается, что дает терапевтические результаты, аналогичные тем, которые получены с нерелевантным конъюгатом.

[0227] Хотя сложно проводить прямые сравнения между КАС по настоящему изобретению и опубликованными отчетами других агентов доставки SN-38, можно сделать некоторые общие наблюдения. В исследованиях, раскрытых в настоящем изобретении, самая высокая индивидуальная доза составила 0,4 мг/кг SN-38. В модели Calu-3 только 4 инъекции были сделаны для суммарной кумулятивной дозы 1,6 мг/кг SN-38 или 32 мкг SN-38 у мыши массой 20 г. Многочисленные исследования с ENZ-2208 были проведены с применением его МПД 10 мг/кг × 5 (Sapra et al., 2008, Clin Cancer Res 14: 1888-96; Pastorini et al., 2010, Clin Cancer Res 16: 4809-21), и доклинические исследования с NK012 включали его МПД 30 мг/кг × 3 (Koizumi et al., 2006, Cancer Res 66: 10048-56). Таким образом, значительные противоопухолевые эффекты были получены с hRS7-SN-38 в 30 и 55 раз меньше SN-38 эквивалентов, чем сообщенные дозы в ENZ-2208 и NK012, соответственно. Даже при 10-кратном снижении КАС hRS7 (0,04 мг/кг) наблюдались значительные противоопухолевые эффекты, тогда как более низкие дозы ENZ-2208 не были представлены, а когда доза NK012 была снижена в 4 раза до 7,5 мг/кг, эффективность была потеряна (Koizumi et al., 2006, Cancer Res 66: 10048-56). У нормальных мышей острой токсичности не наблюдали при кумулятивной дозе в течение 1 недели 24 мг/кг SN-38 (1500 мг/кг конъюгата), что указывает на то, что МПД был выше. Таким образом, животных с опухолями эффективно лечили в 7,5-15 раз меньшими количествами эквивалентов SN-38.

[0228] Исследования биораспределения показали, что hRS7-CL2A-SN-38 обладал таким же поглощением опухолью, как и родительский hRS7 IgG, но выводился значительно быстрее с увеличением всасывания в печени в 2 раза, что может быть связано с гидрофобностью SN-38. Ожидается, что после прохождения КАС через печень, токсичность для печени и желудочно-кишечного тракта будет дозолимитирующей. Хотя у мышей имелись признаки увеличения печеночных трансаминаз, желудочно-кишечная токсичность в лучшем случае была незначительной, только при кратковременной потере массы тела, и при гистопатологическом исследовании не было отмечено никаких отклонений. Интересно, что гематологической токсичности не отмечено. Однако макаки показали такой же профиль токсичности, как и ожидалось для иринотекана, при этом желудочно-кишечная и гематологическая токсичность были дозолимитирующими.

[0229] Поскольку Trop-2, распознаваемый hRS7, не экспрессируется у мышей, было важно провести исследования токсичности на макаках, у которых экспрессия Trop-2 в тканях сходна с людьми. Макаки переносили 0,96 мг/кг/дозу (приблизительно 12 мг/м²) с легкой и обратимой токсичностью, которая экстраполируется на дозу для человека приблизительно 0,3 мг/кг/дозу (приблизительно 11 мг/м²). В фазе I клинического испытания NK012, пациенты с солидными опухолями переносили 28 мг/м² SN-38 каждые 3 недели с нейтропенией 4 степени в качестве дозолимитирующей токсичности (ДЛТ; Hamaguchi et al., 2010, Clin Cancer Res 16:5058-66). Точно так же, фаза I клинических испытаний с ENZ-2208 выявила дозолимитирующую фебрильную нейтропению, с рекомендацией вводить 10 мг/м² каждые 3 недели или 16 мг/м², если пациентам вводили G-CSF (Kurzrock et al. AACR-NCI-EORTC International Conference on Molecular Targets and Cancer Therapeutics; 2009 Nov 15-19; Boston, MA; Poster No C216; Patnaik et al. AACR-NCI-EORTC International Conference on Molecular Targets and Cancer Therapeutics; 2009 Nov 15-19; Boston, MA; Poster No C221). Поскольку макаки переносили кумулятивную эквивалентную дозу для человека 22 мг/м², представляется, что, даже хотя hRS7 связывается с рядом здоровых тканей, МПД для однократного лечения КАС hRS7 может быть аналогичным таковому для других ненаправленных агентов SN-38. Действительно, специфичность антитела анти-Trop-2, по-видимому, не играет роли в определении ДЛТ, потому что профиль токсичности был подобен профилю иринотекана. Что еще более важно, если противоопухолевая активность может быть достигнута у людей, как у мышей, которые отвечают на человеческую эквивалентную дозу всего лишь 0,03 мг эквивалента SN-38/кг/доза, то значимые противоопухолевые ответы могут быть реализованы клинически.

[0230] В заключение, токсикологические исследования на макаках в сочетании с in vivo моделями ксенотрансплантата рака у мышей показали, что этот КАС, нацеленный на Trop-2, является эффективным терапевтическим препаратом при нескольких опухолях различного эпителиального происхождения.

Пример 4. КАС анти-Trop-2, содержащий hRS7 и паклитаксел.

[0231] Новый конъюгат антитело-лекарственное средство (КАС) получали путем конъюгирования паклитаксела (TAXOL®) с антителом против человеческого Trop-2 hRS7 (hRS7-паклитаксел). Конечный продукт имел среднюю степень замещения лекарственное средство к антителу 2,2. Этот КАС был протестирован in vitro с применением двух разных линий Trop-2-позитивных клеток в качестве мишеней: BxPC-3 (аденокарцинома поджелудочной железы человека) и MDA-MB-468 (трижды негативный рак молочной железы человека). За один день до добавления КАС клетки собирали из культуры ткани и высевали в 96-луночные планшеты по 2000 клеток на лунку. На следующий день клетки подвергали воздействию свободного паклитаксела (от 6,1×10^-11 до 4×10^-6 М) или лекарственного эквивалента hRS7-паклитаксела. Для сравнения hRS7-SN-38 и свободный SN-38 также тестировали в диапазоне от 3,84×10^-12 до 2,5×10^-7 М. Планшеты инкубировали при 37°C в течение 96 часов. После этого инкубационного периода ко всем планшетам добавляли субстрат MTS (микротрубочки) и считывали по окрашиванию с получасовыми интервалами до тех пор, пока для необработанных клеток не имели показания OD_492нм приблизительно 1,0. Ингибирование роста измеряли как процент роста относительно необработанных клеток с применением программного обеспечения Microsoft Excel и Prism (нелинейная регрессия для получения сигмоидальных кривых доза-ответ, которые дают значения IC₅₀).

[0232] КАС hRS7-паклитаксела проявлял цитотоксическую активность в линии клеток молочной железы MDA-MB-468 (фиг. 6), причем значение IC₅₀ приблизительно в 4,5 раза выше, чем hRS7-SN-38. Свободный паклитаксел был гораздо более активным, чем свободный SN-38 (фиг. 6). В то время как IC₅₀ для свободного SN-38 составляла 1,54×10^-9 М, IC₅₀ для свободного паклитаксела была менее 6,1×10^-11 М. Подобные результаты были получены для линии клеток поджелудочной железы BxPC-3 (фиг. 7), в которой КАС hRS7-паклитаксела имел значение IC₅₀ примерно в 2,8 раза выше, чем КАС hRS7-SN-38. Эти результаты показывают эффективность анти-Trop-2 конъюгированного паклитаксела in vitro с IC₅₀-значениями в наномолярном диапазоне, аналогичном КАС hRS7-SN-38.

Пример 5. Анализ связывания клеток с антителами анти-Trop-2.

[0233] Два различных мышиных моноклональных антитела против Trop-2 человека были получены для конъюгации КАС. Первый, 162-46.2, был очищен от гибридомы (ATCC, HB-187), выращенной в роллерных флаконах. Второе антитело, MAB650, было приобретено у R&D Systems (Миннеаполис, шт. Миннесота). Для сравнения связывания в качестве мишени использовали Trop-2-положительный рак желудка человека, NCI-N87. Клетки (1,5×10⁵/лунку) высевали в 96-луночные планшеты за день до анализа связывания. На следующее утро получали кривую доза/ответ для 162-46.2, МАВ650 и мышиного RS7 (от 0,03 до 66 нМ). Эти первичные антитела инкубировали с клетками в течение 1,5 ч при 4°C. Лунки промывали и во все лунки добавляли вторичное антитело против мышиного HRP в течение 1 часа при 4°C. Лунки снова промывали с последующим добавлением люминесцентного субстрата. Планшеты считывали, применяя устройство считывания планшетов Envision, и значения указывали в виде относительных люминесцентных единиц.

[0234] Все три антитела имели сходные значения K_D 0,57 нМ для RS7, 0,52 нМ для 162-46.2 и 0,49 нМ для МАВ650. Однако при сравнении максимального связывания (B_max) 162-46.2 и МАВ650 с RS7 эти значения были снижены на 25 % и 50 %, соответственно (B_max 11,250 для RS7, 8,471 для 162-46.2 и 6,018 для МАВ650), что указывает на различные свойства связывания в сравнении с RS7.

Пример 6. Цитотоксичность КАС анти-Trop-2 (МАВ650-SN-38)

[0235] Новый КАС анти-Trop-2 был получен с SN-38 и МАВ650, что дало среднюю степень замещения лекарственное средство к антителу 6,89. Анализ цитотоксичности проводили для сравнения КАС МАВ650-SN-38 и hRS7-SN-38 с применением двух разных клеточных линий аденокарциномы поджелудочной железы человека (BxPC-3 и Capan-1) и клеточной линии трижды негативного рака молочной железы человека (MDA-MB-468) в качестве мишеней.

[0236] За день до добавления КАС, клетки собирали из культуры ткани и высевали в 96-луночные планшеты. На следующий день клетки подвергали воздействию hRS7-SN-38, МАВ650-SN-38 и свободного SN-38 в диапазоне от 3,84×10^–12 до 2,5×10^-7 М. Неконъюгированный МАВ650 применяли в качестве контроля при эквивалентных дозах белка как МАВ650-SN-38. Планшеты инкубировали при 37°C в течение 96 часов. После этого периода инкубации субстрат MTS добавляли ко всем планшетам и считывали по окрашиванию с получасовыми интервалами до тех пор, пока для необработанных клеток не был достигнут OD_{492 нм} приблизительно 1,0. Ингибирование роста измеряли как процент роста относительно необработанных клеток с применением программного обеспечения Microsoft Excel и Prism (нелинейная регрессия для получения сигмоидальных кривых доза-ответ, которые дают значения IC₅₀).

[0237] Как показано на фиг. 8, hRS7-SN-38 и МАВ650-SN-38 имели сходные ингибирующие рост эффекты со значениями IC₅₀ в диапазоне низких нМ, что типично для SN-38-КАС в этих клеточных линиях. В клеточной линии аденокарциномы поджелудочной железы человека Capan-1 (фиг. 8A) КАС hRS7-SN-38 показал IC₅₀ 3,5 нМ по сравнению с 4,1 нМ для КАС МАВ650-SN-38 и 1,0 нМ для свободного SN-38. В клеточной линии аденокарциномы поджелудочной железы человека BxPC-3 (фиг. 8B) КАС hRS7-SN-38 показал IC₅₀ 2,6 нМ по сравнению с 3,0 нМ для КАС МАВ650-SN-38 и 1,0 нМ для свободного SN-38. В клеточной линии аденокарциномы желудка NCI-N87 человека (фиг. 8C) КАС hRS7-SN-38 показал IC₅₀ 3,6 нМ по сравнению с 4,1 нМ для КАС МАВ650-SN-38 и 4,3 нМ для свободного SN-38.

[0238] Таким образом, в этих анализах in vitro конъюгаты SN-38 двух антител анти-Trop-2, hRS7 и МАВ650 показали эквивалентную эффективность против нескольких линий опухолевых клеток, которая была аналогична эффективности свободного SN-38. Поскольку целевая функция антител анти-Trop-2 будет гораздо более значимым фактором in vivo, чем in vitro, данные подтверждают, что КАС анти-Trop-2-SN-38, как класс будут высокоэффективными in vivo, как продемонстрировано в примерах выше для hRS7-SN-38.

Пример 7. Цитотоксичность КАС анти-Trop-2 (162-46.2-SN-38).

[0239] Новый КАС анти-Trop-2 был получен с SN-38 и 162-46.2, в результате чего степень замещения лекарственное средство к антителу составило 6,14. Анализ цитотоксичности проводили для сравнения КАС 162-46.2-SN-38 и hRS7-SN-38 с применением двух разных Trop-2-позитивных клеточных линий в качестве мишеней, аденокарциномы поджелудочной железы человека BxPC-3 и трижды негативного рака молочной железы человека MDA-MB-468.

[0240] За один день до добавления КАС клетки собирали из культуры ткани и высевали в 96-луночные планшеты из расчета 2000 клеток на лунку. На следующий день клетки подвергали воздействию hRS7-SN-38, 162-46.2-SN-38 или свободного SN-38 в диапазоне от 3,84×10^-12 до 2,5×10^-7 М. Неконъюгированные 162-46.2 и hRS7 применяли в качестве контроля при тех же дозах, эквивалентных белку, что и 162-46.2-SN-38 и hRS7-SN-38, соответственно. Планшеты инкубировали при 37°C в течение 96 часов. После этого инкубационного периода ко всем планшетам добавляли субстрат MTS и считывали по окрашиванию с получасовыми интервалами до тех пор, пока для необработанных контрольных лунок не был достигнут OD_492нм приблизительно 1,0. Ингибирование роста измеряли как процент роста относительно необработанных клеток с применением программного обеспечения Microsoft Excel и Prism (нелинейная регрессия для получения сигмоидальных кривых доза-ответ, которые дают значения IC₅₀).

[0241] Как показано на фиг. 9А и фиг. 9B, КАС 162-46.2-SN-38 имел сопоставимые значения IC₅₀ по сравнению с hRS7-SN-38. При тестировании против клеточной линии аденокарциномы поджелудочной железы человека BxPC-3 (фиг. 9A) hRS7-SN-38 имел IC₅₀ 5,8 нМ по сравнению с 10,6 нМ для 162-46.2-SN-38 и 1,6 нМ для свободного SN-38. При тестировании на клеточной линии аденокарциномы молочной железы человека MDA-MB-468 (фиг. 9B) hRS7-SN-38 имел IC₅₀ 3,9 нМ по сравнению с 6,1 нМ для 162-46.2-SN-38 и 0,8 нМ для свободного SN-38. Только свободные антитела показали небольшую цитотоксичность в отношении любой линии Trop-2-положительных раковых клеток.

[0242] Таким образом, сравнивая эффективность in vitro трех различных антител анти-Trop-2, конъюгированных с одним и тем же цитотоксическим лекарственным средством, все три КАС продемонстрировали эквивалентные цитотоксические эффекты против множества Trop-2-позитивных линий раковых клеток. Эти данные подтверждают, что класс антител анти-Trop-2, включенных в конъюгированные с лекарственным средством КАС, являются эффективными противораковыми терапевтическими агентами для солидных опухолей, экспрессирующих Trop-2.

Пример 8. Клинические испытания КАС IMMU-132 анти-Trop-2, содержащего антитело hRS7, конъюгированное с SN-38.

Краткое описание

[0243] В настоящем примере представлены результаты клинического испытания фазы I и продолжающейся расширенной фазы II IMMU-132, КАС интернализующегося гуманизированного антитела hRS7 анти-Trop-2, конъюгированного рН-чувствительным линкером к SN-38 (среднее соотношение лекарственное средство-антитело равно 7,6). Trop-2 представляет собой трансмембранный, кальций-трансдуцирующий белок типа I, экспрессируемый при высокой плотности (приблизительно 1×10⁵), частоте и специфичности многими карциномами человека, с ограниченной экспрессией в здоровой ткани. Доклинические исследования на голых мышах с ксенотрансплантатами опухоли поджелудочной железы человека Capan-1 выявили, что IMMU-132 способен доставлять в опухоль до 120 раз больше SN-38, чем при максимально переносимой терапии иринотеканом.

[0244] В настоящем примере рассмотрено начальное испытание фазы I на 25 пациентах, которые перенесли неудачные множественные предшествующие терапии (некоторые из которых включали лекарственные средства, ингибирующие топоизомеразу I/II), и продолжающаяся расширеннная фаза II, в которую в настоящее время включено 69 пациентов, в том числе с колоректальным раком (КРР), мелкоклеточным и немелкоклеточным раком легких (МКРЛ, НМРЛ, соответственно), трижды негативным раком молочной железы (ТНРМЖ), раком поджелудочной железы (РПЖ), раком пищевода и другими видами рака.

[0245] Как подробно обсуждается ниже, Trop-2 не был обнаружен в сыворотке, но сильно экспрессировался (больше или равно 2⁺) в большинстве архивных опухолей. В схеме исследования 3+3, IMMU-132 вводили в дни 1 и 8 в повторяющихся 21-дневных курсах, начиная с 8 мг/кг/дозу, затем 12 и 18 мг/кг до дозолимитирующей нейтропении. Для оптимизации кумулятивного лечения с минимальными задержками фаза II фокусируется на 8 и 10 мг/кг (n равно 30 и 14, соответственно). У 49 пациентов, сообщивших о связанных с терапией нежелательных явлений (НЯ) к этому моменту, нейтропения стадии ≥G3 возникла у 28 % (4 % G4). Первыми наиболее распространенными негематологическими токсическими эффектами у этих пациентов были усталость (55 %; ≥G3 равно 9 %), тошнота (53 %; ≥G3 равно 0 %), диарея (47 %; ≥G3 равно 9 %), алопеция (40 %) и рвота (32 %; ≥G3 равно 2 %). Гомозиготный UGT1A1 *28/*28 был обнаружен у 6 пациентов, 2 из которых имели более выраженную гематологическую и желудочно-кишечную токсичность. В фазе I и в расширенных фазах в настоящее время участвует 48 пациентов (исключая рак поджелудочной железы), которые подлежат оценке по шкале RECIST/КТ для лучшего ответа. Семь (15%) пациентов имели частичную ремиссию (ЧР), включая пациентов с КРР (N равно 1), ТНРМЖ (N равно 2), МКРЛ (N равно 2), НМРЛ (N равно 1) и раком пищевода (N равно 1), и еще 27 пациентов (56 %) имели стабилизацию заболевания (СЗ), в общей сложности 38 пациентов (79%) с ответом на заболевание; 8 из 13 пациентов с РПЖ, подлежащих оценке с помощью КТ (62%), имели СЗ, среднее время до прогрессирования (ВДП) составило 12,7 недель по сравнению с 8,0 неделями в их последней предшествующей терапии. ВДП для оставшихся 48 пациентов составляет 12,6+ недель (от 6,0 до 51,4 недель).

[0246] РЭА (раково-эмбриональный антиген, СЕА) плазмы и СА19-9 коррелировали с ответами. Антитела анти-RS7 или анти-SN-38 не детектировались, несмотря на дозировку в течение нескольких месяцев. Конъюгат выводился из сыворотки в течение 3 дней, в соответствии с исследованиями на животных in vivo, где 50 % SN-38 высвобождалось ежедневно, при этом более 95 % SN-38 в сыворотке связывается с IgG в неглюкуронидированной форме и в концентрациях, в 100 раз превышающих SN-38, о которых сообщалось у пациентов, принимавших иринотекан. Эти результаты показывают, что КАС, содержащий hRS7-SN-38, является терапевтически активным при метастатическом солидном раке с управляемыми диареей и нейтропенией.

Фармакокинетика

[0247] Два способа ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay - иммуноферментный анализ) применяли для измерения клиренса IgG (захват с помощью анти-hRS7 идиотипного антитела) и интактного конъюгата (захват анти-SN-38 IgG/зонда с применением анти-hRS7 идиотипного антитела). SN-38 измеряли с помощью ВЭЖХ (Высокоэффективная жидкостная хроматография). Общая фракция IMMU-132 (неповрежденный конъюгат) выводится быстрее, чем IgG (не показан), отражая известное постепенное высвобождение SN-38 из конъюгата. ВЭЖХ определение SN-38 (несвязанного и общего) показало, что более 95 % SN-38 в сыворотке было связано с IgG. Низкие концентрации SN-38G позволяют сделать предположение, что SN-38, связанный с IgG, защищен от глюкуронидации. Сравнение результатов ELISA для конъюгата и ВЭЖХ для SN-38 показало, что они перекрываются, что указывает на то, что ELISA является заменителем для мониторинга клиренса SN-38.

[0248] Краткое изложение режима дозирования и выбора пациентов представлено в таблице 3.

Таблица 3. Параметры клинических испытаний

Режим дозирования Один раз в неделю в течение 2 недель вводили каждые 21 день вплоть до 8 курсов. При первичном включении в исследование, запланированную дозу задерживали и уменьшали, если токсичность, связанная с лечением, составляла ≥G2; протокол в отношении задержки и уменьшения дозы изменяли только в случае токсичности ≥G3. Величина дозы групп 8, 12, 18 мг/кг; позже снижали до уровня промежуточной дозы 10 мг/кг. Размер группы Стандартный схема фазы I [3+3]; при расширении в исследование включали 15 пациентов с некоторыми видами рака. Дозолимитирующая токсичность (ДЛТ) G4 абсолютное число нейтрофилов (ANC) больше или равно 7 дней; ≥G3 фебрильная нейтропения любой продолжительности; G4 Plt (тромбоциты) больше или равно 5 дней; G4 Hgb (гемоглобин); стадия 4 N/V/D любой продолжительности/G3 тошнота/рвота/диарея (N/V/D)в течение более 48 часов; G3 связанные с инфузией реакции; связанная ≥G3 негематологическая токсичность. Максимально допустимая доза (МДД) Максимальная доза, при которой более или равно 2/6 пациентов переносят первый 21-дневный курс без задержки или уменьшения доз или токсичности ≥G3. Пациенты Метастатический колоректальный, поджелудочной железы, желудка, пищевода, легкого (НМРЛ, МКРЛ), трижды негативный рак молочной железы (ТНРМЖ), предстательной железы, яичника, почки, мочевого пузыря, головы/шеи, печеночно-клеточный рак. Невосприимчивость/рецидив после стандартных схем лечения метастатического рака. Предварительная иринотекансодержащая терапия НЕ требуется для включения в исследование. Нет объемных повреждений более 5 см.
4 недели после любой серьезной операции и 2 недели после схем лучевой или химиотерапии. Болезнь Жильбера или известное метастатическое поражение ЦНС исключены.

Статус клинического испытания

[0249] Всего было описано 69 пациентов (включая 25 пациентов в фазе I) с различными метастатическими типами рака, у которых в среднем было 3 предшествующих терапии. Восемь пациентов имели клиническое прогрессирование и были исключены до оценки КТ. Тринадцать пациентов с раком поджелудочной железы, подлежащих оценке с помощью КТ, были зарегистрированы отдельно. Среднее ВДП (время до прогрессирования) у пациентов с РПЖ составляло 11,9 недель (от 2 до 21,4 недель) по сравнению со средним ВДП 8 недель для предшествующей последней терапии.

[0250] В общей сложности 48 пациентов с различными типами рака имели по меньшей мере 1 оценку КТ, по которой определяли лучший ответ (фиг. 10) и время до прогрессирования (ВДП; фиг. 11). Чтобы суммировать данные по лучшему ответу - из 8 оцениваемых пациентов с ТНРМЖ (трижды негативный рак молочной железы) было 2 с ЧР (частичной ремиссией), 4 СЗ (стабилизация заболевания) и 2 ПЗ (прогрессирование заболевания) с общим ответом (ЧР + СЗ) 6/8 (75%). Для МКРЛ (мелкоклеточный рак легкого) из 4 оцениваемых пациентов наблюдали 2 ЧР, 0 СЗ и 2 ПЗ с общим ответом 2/4 (50%). Для КРР (колоректальный рак) из 18 оцениваемых пациентов наблюдали 1 ЧР, 11 СЗ и 6 ПЗ с общим ответом 12/18 (67 %). Для рака пищевода из 4 оцениваемых пациентов наблюдали 1 ЧР, 2 СЗ и 1 ПЗ с общим ответом 3/4 (75%). Для НМРЛ (немелкоклеточный рак легкого) из 5 оцениваемых пациентов наблюдали 1 ЧР, 3 СЗ и 1 ПЗ с общим ответом 4/5 (80%). Из всех подвергшихся лечению пациентов, у 48 оцениваемых пациентов наблюдали 7 ЧР, 27 СЗ и 14 ПЗ с общим ответом 34/48 (71%). Эти результаты показывают, что КАС анти-Trop-2 (hRS7-SN-38) продемонстрировал значительную клиническую эффективность против широкого спектра солидных опухолей у людей.

[0251] Сообщенные побочные эффекты терапии (нежелательные явления) суммированы в таблице 4. Как видно из данных таблицы 4, терапевтическая эффективность hRS7-SN-38 была достигнута при дозировках КАС, демонстрирующих приемлемо низкий уровень нежелательных побочных эффектов.

Таблица 4

Перечень связанных нежелательных явлений для IMMU-132-01
Критерии: всего больше или равно 10 % или степень ≥G3 N равно 47 пациентов Всего Степень G3 Степень G4 Усталость 55 % 4 (9 %) 0

Тошнота 53 % 0 0 Диарея 47 % 4 (9 %) 0 Нейтропения 43 % 11 (24 %) 2 (4 %) Алопеция 40 % - - Рвота 32 % 1 (2 %) 0 Анемия 13 % 2 (4 %) 0 Дисгевзия 15 % 0 0 Пирексия 13 % 0 0 Боль в животе 11 % 0 0 Гипокалиемия 11 % 1 (2 %) 0 Снижение лейкоцитов (WBC) 6 % 1 (2 %) 0 Фебрильная нейтропения 6 % 1 (2 %) 2 (4 %) Тромбоз глубоких вен 2 % 1 (2 %) 0 Оценка по общим терминологическим критериям для оценки нежелательных явлений версии 4.0 (CTCAE 4.0)

[0252] Иллюстративные частичные ремиссии на КАС анти-Trop-2 были подтверждены данными КТ (не показаны). В качестве примера ЧР при КРР, 62-летняя женщина, с впервые диагностированным КРР, прошла первичную гемиколэктомию. Четыре месяца спустя ей провели резекцию печени вследствие метастазов в печени, и она получала лечение FOLFOX 7 месяцев и 5FU 1 месяц. У нее были множественные поражения, главным образом, в печени (3+ Trop-2 по иммуногистологии), при включении в исследование hRS7-SN-38 в начальной дозе 8 мг/кг примерно через 1 год после первоначального диагноза. Первая КТ-оценка продемонстрировала достижение ЧР с 37% снижением целевых поражений (не показано). Пациент продолжал лечение, достигая максимального снижения на 65% после 10 месяцев лечения (не показано) со снижением раково-эмбрионального антигена (CEA) от 781 нг/мл до 26,5 нг/мл), а затем прогрессировал через 3 месяца.

[0253] В качестве примера ЧР при НМРЛ, 65-летнему мужчине был поставлен диагноз НМРЛ IIIB стадии (плоскоклеточный). Первоначальное лечение карбоплатином/этопозидом (3 мес) совместно с 7000 сГр XRT (лучевая терапия) привело к ответу продолжительностью 10 мес. Затем ему назначили поддерживающую терапию Тарцева, которую он продолжал до тех пор, пока пациент не был включен в исследование IMMU-132, в дополнение к прохождению люмбальной ламинэктомии. Первую дозу IMMU-132 пациент получил после 5 месяцев применения терапии Тарцева, в тот момент с поражением 5,6 см в правом легком с обильным плевральным выпотом. Пациент только что завершил 6-ю дозу два месяца спустя, когда первая КТ показала, что первичное целевое поражение уменьшилось до 3,2 см (не показано).

[0254] В качестве примера ЧР при МКРЛ, у 65-летней женщины диагностировали низкодифференцированный МКРЛ. После приема карбоплатина/этопозида (ингибитор Topo-II), который закончился через 2 месяца без ответа, с последующим приемом топотекана (ингибитор Topo-I), который закончился через 2 месяца, также без ответа, пациентка получила местную XRT (3000 сГр), которая закончилась 1 месяц спустя. Однако к следующему месяцу прогрессирование продолжилось. Пациент начал с IMMU-132 в следующем месяце (12 мг/кг; снижено до 6,8 мг/кг; экспрессия Trop-2 3+), и после двух месяцев IMMU-132 произошло уменьшение целевого поражения на 38 %, включая значительное уменьшение основного поражения легких (не показано). Пациент прогрессировал через 3 месяца после приема 12 доз.

[0255] Эти результаты являются значительными в том смысле, что они демонстрируют, что КАС анти-Trop-2 был эффективен, даже у пациентов, которые потерпели неудачу или прогрессировали после нескольких предшествующих терапий.

[0256] В заключение, при примененных дозировках, первичная токсичность представляла собой управляемую нейтропению с незначительной токсичностью 3 степени. IMMU-132 продемонстрировал доказательства активности (ЧР и длительное СЗ) у пациентов с рецидивом/устойчивым к лечению трижды негативным раком молочной железы, мелкоклеточным раком легкого, немелкоклеточным раком легкого, колоректальным раком и раком пищевода, включая пациентов с рецидивом на терапии ингибитором топоизомеразы-I в предшествующем анамнезе. Эти результаты показывают эффективность КАС анти-Trop-2 в широком спектре раковых заболеваний, устойчивых к существующим способам лечения.

Пример 9. Конъюгирование бифункциональных продуктов SN-38 с умеренно восстановленными антителами.

[0257] Гуманизированное MAb анти-CEACAM5, hMN-14 (также известно как лабетузумаб), гуманизированное MAb анти-CD22, hLL2 (также известно как эпратузумаб), гуманизированное MAb анти-CD20, hA20 (также известно как велтузумаб), гуманизированное MAb анти-EGP-1, hRS7 и гуманизированное MAb против муцина, hPAM4 (также известный как кливатусумаб) конъюгировали с SN-38 с применением линкера CL2A. Каждое антитело восстанавливали дитиотреитолом (ДТТ), применяемым в 50-70-кратном молярном избытке, в 40 мМ ФСБ (фосфатно-солевой буфер), pH 7,4, содержащем 5,4 мМ ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота), при 37°C (баня) в течение 45 минут. Восстановленный продукт очищали с помощью эксклюзионной хроматографии и/или диафильтрации и заменяли буфер на подходящий буфер при рН 6,5. Содержание тиола определяли с помощью теста Эллмана, и оно составляло от 6,5 до 8,5 SH/IgG. Альтернативно, антитела восстанавливали трис (2-карбоксиэтил)фосфином (ТСЕР) в фосфатном буфере при значении рН от 5 до 7 с последующей конъюгацией in situ. Восстановленный MAb подвергали взаимодействию с приблизительно 10-15-кратным молярным избытком CL2A-SN-38 с использованием ДМСО (диметилсульфоксид) при 7-15 об.% в качестве сорастворителя и инкубировали в течение 20 мин при температуре окружающей среды. Конъюгат очищали гель-проникающей хроматографией (SEC) с центрифугированием, пропусканием через гидрофобную колонку и, наконец, ультрафильтрацией-диафильтрацией. Продукт анализировали на SN-38 по поглощению при 366 нм и коррелировали со стандартными значениями, в то время как концентрацию белка определяли по поглощению при 280 нм, с поправкой на побочный эффект поглощения SN-38 на этой длине волны. Таким образом определяли степень замещения SN-38/MAb. Очищенные конъюгаты хранили в виде лиофилизированных составов в стеклянных флаконах, закрывали в вакууме и хранили в морозильной камере при минус 20°C. Молярные степени замещения (МСЗ) SN-38, полученные для этих конъюгатов, обычно находились в диапазоне от 5 до 7.

Пример 10. Комбинированная терапия КАС анти-Trop-2 при МКРЛ.

[0258] Поскольку цисплатин является одним из основных химиотерапевтических препаратов, применяемых в комбинации с иринотеканом при распространенном мелкоклеточном раке легкого (МКРЛ), был проведен эксперимент по проверке комбинации цисплатина с IMMU-132 у мышей с опухолями МКРЛ человека (DMS 53). Кроме того, карбоплатин был протестирован на этой модели опухоли, так как его также клинически применяют при МКРЛ.

[0259] Самкам мышей линии C.B.-17 SCID инъецировали подкожно с суспензию опухолей из исходных опухолей DMS 53 (20 мас./об.%) c клетками, собранными из культуры ткани (5×10⁶ клеток на мышь), смешанными 1:1 с матригелем. Как только опухоли достигли среднего объема опухоли 0,270±0,048 см³, животных разделяли на девять различных групп лечения по 9 мышей в каждой. Три группы мышей получали IMMU-132 (500, 250 или 100 мкг внутрибрюшинно), в то время как контрольная группа получала конъюгат антитело-лекарственное средство, не направленный на опухоль, полученный с h679, гуманизированным анти-гистамин-сукцинил-глициновым IgG (h679-SN-38; 500 мкг внутрибрюшинно). Все вводили два раза в неделю в течение 4 недель. Две группы получали еженедельно в течение 4 недель только химиотерапию цисплатином (5 мг/кг внутрибрюшинно) или карбоплатином (50 мг/кг внутрибрюшинно). Две группы получали комбинацию IMMU-132 (250 мкг внутривенно еженедельно × 4 недели) плюс либо цисплатин или карбоплатин. Конечная необработанная контрольная группа мышей получала солевой раствор (100 мкл внутрибрюшинно два раза в неделю × 4 недели). Опухоли измеряли и мышей взвешивали два раза в неделю.

Результаты

[0260] Средние объемы опухолей для различных групп показаны на фиг. 12. Все три дозы IMMU-132 обеспечили статистически значимый противоопухолевый эффект по сравнению с контрольными животными, получавшими солевой раствор (P меньше 0,0161; AUC односторонний t-тест). Терапия с наивысшей дозой IMMU-132 (500 мкг) приводила к статистически значимому увеличению регрессии опухоли у мышей с опухолями по сравнению со всеми группами монотерапии, включая контроль h679-SN-38 (P меньше 0,0032; AUC двухсторонний t-тест).

[0261] Для комбинированных групп, показатель для IMMU-132 (250 мкг) плюс карбоплатин (фиг. 13) приближался к значимому (P равно 0,0983; AUC двухсторонний t-тест), в то время, когда первая мышь в контрольной группе монотерапии карбоплатином достигала конечной точки объема опухоли более 1,0 см³ на 41 день (14 день терапии). Однако с точки зрения абсолютных средних объемов опухолей в этот день комбинация IMMU-132 (250 мкг) с карбоплатином имела значительно меньшие опухоли по сравнению с монотерапией карбоплатином (0,166±0,019 см³ против 0,602±0,224 см³ соответственно; P равно 0,0004, двусторонний t-тест). По сравнению с мышами, получавшими только IMMU-132 (250 мкг два раза в неделю), у животных, получавших IMMU-132 (еженедельно) плюс карбоплатин, наблюдали значительно меньшие опухоли на 73-й день (последний день сравнения из-за того, что несколько мышей достигли конечной точки; 0,745±0,162 см³ против 0,282±0,153 см³ соответственно; P равно 0,0003, AUC двухсторонний t-тест).

[0262] Мыши, получавшие комбинацию IMMU-132 (250 мкг) плюс цисплатин (фигура 14), демонстрировали значительное ингибирование роста опухоли по сравнению с монотерапией цисплатином (P равно 0,0002, AUC двухсторонний t-тест). При сравнении объемов опухолей на 73-й день (последний день сравнения из-за того, что несколько мышей в группе монотерапии цисплатином достигли конечной точки), в комбинированной группе наблюдали опухоли, которые были приблизительно в 6,2 раза меньше, чем в группе монотерапии цисплатином (0,123±0,040 см³ против 0,758±0,240 см³ соответственно; P меньше 0,0001, двусторонний t-тест). Аналогично, у мышей, получавших еженедельную схему лечения IMMU-132 (250 мкг) в сочетании с цисплатином, опухоли были значительно меньше, чем у животных, которых лечили только IMMU-132 (250 мкг), хотя в группе монотерапии IMMU-132 вводили два раза в неделю (P меньше 0,0001, AUC двухсторонний t-тест). Наконец, комбинация IMMU-132 с цисплатином оказалась лучше всех других групп, включая комбинацию IMMU-132 с карбоплатином и группы монотерапии с высокой дозой IMMU-132 (500 мкг) (P меньше 0,0066, AUC двухсторонний t-тест).

[0263] Мыши хорошо переносили лечение как IMMU-132 плюс карбоплатин, так и IMMU-132 плюс цисплатин. Необычным аспектом этой модели опухоли было наблюдение того, что у мышей с опухолями DMS 53 наблюдалась кахексия (фигура 15) со снижением массы тела в среднем более чем на 15 % от исходной. Например, у контрольных мышей, получавших солевой раствор, когда объем опухоли вырос с 0,270±0,053 см³ на 27 день до 0,683 ± 0,185 см³ на 41 день, масса тела животного снизилась на 16,9% ± 3,4%. Однако, когда противоопухолевые эффекты монотерапии IMMU-132 (500 мкг) или комбинаций IMMU-132 плюс карбоплатин или цисплатин стали очевидными, мыши снова начали набирать массу. Например, в группе IMMU-132 плюс карбоплатин наибольшая потеря массы тела мышей наступила к 38-му дню (15,3% ± 5,6%), после чего они начали восстановление потерянной массы, когда опухоли регрессировали, и мыши возвращались к 100% исходной массе к 58 дню. В течение этого времени опухоли регрессировали до 0,128±0,018 см³ от начального размера 0,270±0,050 см³ на 27-й день. Однако животные снова начали терять массу, когда размер опухоли снова стали больше чем в начале терапии (0,282±0,153 см³ на 73-й день). Вкратце, с помощью этих способов лечения опухолевая нагрузка снижалась, у данных мышей изнуряющие эффекты кахексии обращались вспять, что дополнительно указывает на пользу этих комбинаций в указанной модели заболевания МКРЛ человека.

Пример 11. Лечение ТНРМЖ с помощью сацитузумаб говитекана преодолевает сохранение гомологичной рекомбинационной репарации (HRR), опосредованной RAD51

Реферат

[0264] IMMU-132 представляет собой конъюгат антитело-лекарственное средство, состоящий из гуманизированного IgG анти-Trop-2, конъюгированного через расщепляемый линкер с SN-38, ингибитором топоизомеразы I и активным компонентом иринотекана. В настоящее время он находится на стадии клинического исследования в отношении ряда солидных опухолей (NCT01631552). Авторами изобретения исследовали гипотезу о том, что IMMU-132 по своей направленности на Trop-2 в солидных опухолях превосходит иринотекан в преодолении Rad51-опосредованной HRR репарации разрывов ДНК в опухолях ТНРМЖ с высокой экспрессией Trop-2.

[0265] Rad51 и разрывы ДНК (g-H2A.X) определяли Вестерн-блоттингом. Клетки с различными уровнями Trop-2 подвергали воздействию IMMU-132 в течение 24 часов (25-100 нМ эквивалентов SN-38), включая плоскоклеточный рак легкого (SK-MES-1; приблизительно 30000 Trop-2/клетка) и ТНРМЖ (HCC1806, приблизительно 90 000 Trop-2/клетка и MDA-MB-231, приблизительно 30 000 Trop-2/клетка). Кроме того, два Trop-2-трансфектанта MDA-MB-231, обозначенные C13 и C39 (в 4 и 25 раз более высокие уровни Trop-2, соответственно), также подвергались воздействию IMMU-132. Мышей с опухолями MDA-MB-231, C13 или C39 обрабатывали иринотеканом (МПД, 40 мг/кг; q2dx5) или IMMU-132 (0,5 мг; 9 мг эквивалента SN-38, два раза в неделю × 4). Опухоли измеряли и мышей взвешивали два раза в неделю. Конечной точкой исследования выживаемости была прогрессия опухоли до более 1,0 см³.

[0266] SK-MES-1 и HCC1806 чувствительны к терапии IMMU-132, тогда как MDA-MB-231 устойчив. IMMU-132 опосредовал более чем 2-кратное увеличение уровней Rad51 в клетках MDA-MB-231, но не оказывал влияния на SK-MES-1 или HCC1806. При 25 нМ IMMU-132 были обнаружены более низкие уровни разрывов ДНК в MDA-MB-231 по сравнению с SK-MES-1 и HCC1806 (увеличение MDA-MB-231 в 2 раза по сравнению с более чем 3-кратным). При более высоких концентрациях IMMU-132 (100 нМ) все 3 клеточные линии демонстрировали сходные уровни разрывов ДНК (примерно в 5 раз выше фонового уровня), что позволяет предположить, что более высокие уровни SN-38 могут преодолеть опосредованную Rad51 репарацию. Оба клона C13 и C39 имели аналогичный ответ как родительский MDA-MB-231 при воздействии IMMU-132. У мышей с опухолями MDA-MB-231, C13 или C39, получавших иринотекан, наблюдалось статистически значимое улучшение среднего времени выживания (MST) по сравнению с солевым раствором (P меньше 0,0009). Как и ожидалось, IMMU-132 не отличался от солевого раствора у мышей с опухолями MDA-MB-231 (MST равно 21 день и 19,5 день соответственно). Тем не менее, у мышей с опухолями с высоким уровнем Trop-2 C13 и C39 IMMU-132 обеспечил статистически значимое преимущество в выживаемости по сравнению с мышами, обработанными иринотеканом (MST более 70 дней против 35 дней, соответственно для C13 и более 70 дней против 28 дней для C39; P меньше 0,0007), поддерживая гипотезу о том, что IMMU-132 способен доставлять больше SN-38 в опухоли с высоким Trop-2, чем это может быть достигнуто с помощью иринотекана, и, таким образом, может преодолевать Rad51-опосредованную HRR.

Факторы, влияющие на устойчивость к IMMU-132: пути сохранения HRR в сравнении с экспрессией Trop-2.

[0267] Прошлые исследования показали, что IMMU-132 опосредовал разные противоопухолевые ответы при различных типах опухолей, несмотря на тот факт, что некоторые линии опухолей экспрессировали уровни, подобные Trop-2.

[0268] В ТНРМЖ MDA-MB-231 (Trop-2 приблизительно 30000 молекул на клетку) ни IMMU-132, ни иринотекан не продемонстрировали какой-либо эффективности (фиг. 16). Для ТНРМЖ HCC1806 (в 3 раза более высокий уровень Trop-2 приблизительно 90000), IMMU-132 продемонстрировал значительные противоопухолевые эффекты (фигура 17). Аналогично, при плоскоклеточном раке легкого SK-MES-1 с такими же уровнями экспрессии Trop-2, как у MDA-MB-231 (приблизительно 30 000), и IMMU-132, и иринотекан обеспечивают значительные противоопухолевые эффекты (фиг. 18).

[0269] Авторами изобретения обнаружено, что воздействие IMMU-132 действительно приводит к увеличению уровня нескольких различных белков, участвующих в HRR (включая Rad51) в MDA-MB-231 (Cardillo TM et al. Clin Cancer Res 2017; предварительная электронная публикация). Эти данные свидетельствуют о том, что восстановление HRR некоторыми опухолевыми клетками может играть важную роль в определении чувствительности к терапии с помощью IMMU-132.

Опосредованное IMMU увеличение экспрессии Rad51 коррелирует с устойчивостью.

[0270] MDA-MB-231 продемонстрировал более высокий конститутивный уровень Rad51, чем SK-MES-1 или HCC1806 (не показано). Этот уровень увеличился более чем в 2 раза после 24-часового воздействия IMMU-132 при 25 нМ эквивалентов SN-38 до 4 раз при 100 нМ (не показано). Ни в клетках SK-MES-1, ни в клетках HCC1806 не наблюдали какого-либо увеличения Rad51, и на самом деле они демонстрировали снижение уровней при 100 нМ в SK-MES-1 и на всех трех уровнях в HCC1806 (не показано).

Разрывы двухцепочечной ДНК (дцДНК)

[0271] При 25 нМ и 50 нМ наблюдалось более 50 % увеличение разрывов дцДНК в SK-MES-1 и HCC1806, о чем свидетельствуют уровни p-H2A.X, по сравнению с MDA-MB-231 (не показано). Только при самой высокой концентрации IMMU-132 (100 нМ) было одинаковое количество повреждений ДНК среди трех клеточных линий (не показано). Эти данные показывают, что увеличение экспрессии Rad51, опосредованное IMMU-132 в MDA-MB-231, уменьшает влияние на повреждение ДНК при более низких концентрациях SN-38, но при более высоких концентрациях они не способны поддерживать адекватную репарацию ДНК, что приводит к значительному повреждению.

Разработка трансфектантов MDA-MB-231 с высокой экспрессией Trop-2

Таблица 5. Стабильная экспрессия в MDA-MB-231 Trop-2 трансфектантах

6-месячное исследование экспрессии Trop-2 (молекулы Trop-2 на клетку) Клеточная линия 02-24-16 06-08-16 08-10-16 Среднее ± стандартное отклонение Исходная 36,592 21,257 37,760 31,870±9,209 Клон C13 93,864 113,151 155,225 120,747±31,378 Клон C39 563,418 991,016 812,291 788,908±214,756

[0272] Для получения клеточных линий, экспрессирующих высокие уровни Trop-2, кДНК Trop-2 человека (GenBank: X77754.1) трансфицировали в клетки MDA-MB-231. Анализ FACS (fluorescence-activated cell sorting - сортировка клеток с активированной флуоресценцией) выявил 7 клонов, которые демонстрировали уровни экспрессии Trop-2 выше уровней, наблюдаемых для исходных клеток MDA-MB-231. Из 7 клонов два клона, С13 и С39, отбирали для дальнейшего анализа, и демонстрировали, что они стабильно трансфицируются после роста в среде без отбора (т.е. без G418) в течение более 6 месяцев (таблица 5).

Характеристика исходной MDA-MB-231 по сравнению с клонами C13 и C39 с высокой экспрессией Trop-2

[0273] Несмотря на более высокие уровни Trop-2 в C13 и C39, оба ведут себя подобно исходной MDA-MB-231 в том, что уровни Rad51 положительно регулируются в приблизительно 2,5 раза выше необработанного фона при воздействии IMMU-132 в течение 24 часов (не показано). Иммуногистохимия исходных ксенотрансплантатов опухолей MDA-MB-231, C13 и C39 демонстрирует большую экспрессию Trop-2 в C13 по сравнению с исходным MDA-MB-231 с еще более высокой экспрессией в C39 (таблица 5).

[0274] Подобно тому, что наблюдали in vitro, исходные опухоли, а также опухоли как С13, так и С39, взятые у мышей, которым вводили иринотекан или IMMU-132, демонстрировали повышенную регуляцию Rad51 в течение 24 часов (не показано). Средние уровни экспрессии Rad51 у мышей, обработанных IMMU-132 и иринотеканом, показывают, что эта положительная регуляция была статистически значимой по сравнению с необработанными контрольными животными (P меньше 0,05) (не показано). Эти данные свидетельствуют о том, что клетки в исходных опухолях, а также в опухолях клона С13 и С39, вели себя подобно наблюдениям in vitro и подвергались повреждению ДНК и пытались проводить HRR с помощью Rad51.

Повышенная экспрессия Trop-2 в опухолях MDA-MB-231 превосходит устойчивость к IMMU-132, но не к иринотекану

[0275] Мышей с опухолями приблизительно 0,3 см³, происходящими либо из исходных клеток MDA-MB-231 (фиг. 19), клеток клона 13 (С13) (фиг. 20), либо клеток клона 39 (С39) (фиг. 21) случайным образом распределяли в различные группы лечения и обрабатывали иринотеканом или IMMU-132. IMMU-132 не оказывал влияния на рост опухоли в исходной опухоли (фиг. 19), но был эффективен для ингибирования роста опухоли в клетках с повышенной экспрессией Trop-2 (фиг. 20, фиг. 21). В линиях опухолевых клеток со сверхэкспрессией Trop-2 IMMU-132 был намного более эффективным, чем иринотекан, в подавлении роста опухоли (фиг. 20, фиг. 21).

[0276] Во всех трех типах опухолей иринотекан при его МПД (40 мг/кг q2dx5; эквивалент SN-38 24 мг/кг) обеспечивал преимущество в выживаемости по сравнению с контрольными животными, получавшими солевой раствор, со средним временем выживания от 26,5 дней у мышей с исходными опухолями до 35 дней у мышей с опухолями C13 (P меньше 0,0009, логарифмический ранговый критерий) (фиг. 22-24). Как и ожидалось, IMMU-132 не оказывал противоопухолевого эффекта на выживаемость при исходных опухолях (фиг. 22), и фактически, иринотекан обеспечивал лучшее преимущество в выживаемости при сравнении (P равно 0,0393). Однако у мышей, несущих опухоли MDA-MB-231 с более высокой экспрессией Trop-2 (то есть с опухолями C13 и C39), терапия IMMU-132 обеспечивала значительное увеличение выживаемости по сравнению со всеми другими способами лечения, включая терапию иринотеканом и контрольную терапию КАС (P меньше 0,0001) (фиг. 23, фиг. 24).

Выводы

[0277] Тот факт, что иринотекан имел сходные, незначительные эффекты во всех трех типах опухолей (незначимые различия между типами опухолей), указывает на то, что это значительно улучшенное противоопухолевое действие IMMU-132 обусловлено повышенным нацеливанием и поглощением SN-38 в этих опухолях, на уровнях, способных преодолевать Rad51-опосредованную HRR (и, возможно, другие HRR белки), и не обусловлено какой-либо повышенной чувствительностью к самому SN-38.

[0278] Устойчивость к химиотерапии (например, иринотекану) может быть частично обусловлена повышенной экспрессией белков, используемых в пути HRR, для сохранения клетки от последующего повреждения ДНК. Однако, если достаточное количество лекарственного средства (например, SN-38) попадет в клетку, произойдет значительное повреждение ДНК, что приведет к апоптозу и гибели клетки.

[0279] Применение IMMU-132 для нацеливания SN-38 на Trop-2-позитивные опухолевые клетки является новым способом преодоления этой присущей устойчивости путем накопления достаточного количества SN-38 в опухоли, чтобы вызвать значительное повреждение ДНК, которое невозможно исправить с помощью HRR. Доказательства этого показаны на MDA-MB-231, в котором более высокие уровни экспрессии Trop-2 не влияют на терапию иринотеканом, но приводят к значительному улучшению эффективности при лечении IMMU-132.

[0280] In vivo, воздействие на уровни экспрессии Trop-2 для преодоления устойчивости опухоли не является практическим подходом. Однако представленные здесь данные подтверждают применение ингибиторов RAD51 в комбинации с IMMU-132 или другими SN-38 конъюгированными КАС для улучшения лечения рака и уменьшения устойчивости к КАС.

[0281] Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что продукты, композиции, способы и процессы по настоящему изобретению могут быть подвергнуты различным модификациям и изменениям. Таким образом, предполагается, что настоящее изобретение охватывает такие модификации и варианты, при условии, что они входят в объем прилагаемой формулы изобретения и ее эквивалентов.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ИММЬЮНОМЕДИКС, ИНК.

<120> ЛЕЧЕНИЕ ТРИЖДЫ НЕГАТИВНОГО РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ (TNBC), ХАРАКТЕРИЗУЮЩЕГОСЯ

ВЫСОКОЙ ЭКСПРЕССИЕЙ TROP-2, С ПОМОЩЬЮ САЦИТУЗУМАБА ГОВИТЕКАНА (IMMU-132) С

ПРЕОДОЛЕНИЕМ ГОМОЛОГИЧНОЙ РЕКОМБИНАЦИОННОЙ РЕПАРАЦИИ (HRR), ОПОСРЕДОВАННОЙ RAD51

<130> IMM372W01

<140>

<141>

<150> 62/477,216

<151> 2017-03-27

<160> 9

<170> Patentln версия 3.5

<210> 1

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 1

Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser lle Ala Val Ala

1 5 10

<210> 2

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 2

Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 3

Gln Gln His Tyr lle Thr Pro Leu Thr

1 5

<210> 4

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 4

Asn Tyr Gly Met Asn

1 5

<210> 5

<211> 17

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 5

Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Asp Asp Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 6

<211> 12

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 6

Gly Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val

1 5 10

<210> 7

<211> 330

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 7

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 8

<211> 330

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 8

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 9

<211> 4

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 9

Ala Leu Ala Leu

1

<---

Настоящее изобретение относится к иммунологии, в частности к способу лечения рака, характеризующегося экспрессией Trop-2. Способ включает введение субъекту конъюгата антитело-лекарственное средство SN-38 (иринотекан) в комбинации с ингибитором Rad51. Указанный конъюгат известен как IMMU-132 (сацитузумаб говитекан). В качестве ингибитора Rad51 могут быть использованы, например, B02 или RI-1. Указанная комбинация конъюгата и ингибитора Rad51 может уменьшать размер солидных опухолей, уменьшать или устранять метастазы и является эффективной для лечения раковых заболеваний, устойчивых к стандартным способам лечения, таким как лучевая терапия, химиотерапия или иммунотерапия. Настоящее изобретение позволяет улучшить эффективность способов терапии рака, экспрессирующего Trop-2. 25 з.п. ф-лы, 36 ил., 5 табл., 11 пр.

1. Способ лечения рака, характеризующегося экспрессией Trop-2, включающий:

а) введение субъекту с раком, характеризующимся экспрессией Trop-2, конъюгата анти-Trop-2 антитело-лекарственное средство (КАС), где лекарственное средство представляет собой SN-38, и

б) введение субъекту ингибитора Rad51.

2. Способ по п. 1, где ингибитор Rad51 представляет собой B02 ((E)-3-бензил-2(2-(пиридин-3-ил)винил)хиназолин-4(3H)-он), RI-1 (3-хлор-1-(3,4-дихлорфенил)-4-(4-морфолинил)-1H-пиррол-2,5-дион), DIDS (4,4'-диизотиоцианостильбен-2,2'-дисульфокислота), галенахинон или иматиниб.

3. Способ по п. 1, где субъект представляет собой человека.

4. Способ по п. 1, где КАС вводят в дозировке от 4 до 16 мг/кг.

5. Способ по п. 4, где дозировка выбрана из группы, состоящей из 4, 6, 7, 8, 9, 10, 12 и 16 мг/кг.

6. Способ по п. 4, где дозировка составляет от 8 до 10 мг/кг.

7. Способ по п. 1, где антитело представляет собой гуманизированное антитело RS7, содержащее последовательности CDR легкой цепи CDR1 (KASQDVSIAVA, SEQ ID NO: 1), CDR2 (SASYRYT, SEQ ID NO: 2) и CDR3 (QQHYITPLT, SEQ ID NО: 3) и последовательности CDR тяжелой цепи CDR1 (NYGMN, SEQ ID NО: 4), CDR2 (WINTYTGEPTYTDDFKG, SEQ ID NO: 5) и CDR3 (GGFGSSYWYFDV, SEQ ID NO: 6).

8. Способ по п. 1, где лечение приводит к уменьшению размера опухоли по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30% или по меньшей мере на 40%.

9. Способ по п. 1, где рак является метастатическим.

10. Способ по п. 9, дополнительно включающий уменьшение размера или устранение метастазов.

11. Способ по п. 1, где рак является устойчивым к другим способам лечения, но отвечает на комбинированную терапию КАС и ингибитором Rad51.

12. Способ по п. 1, где между SN-38 и антителом присутствует линкер CL2A и структура КАС представляет собой МАb-CL2A-SN-38

13. Способ по п. 1, где к каждой молекуле антитела присоединено 6 или более молекул SN-38.

14. Способ по п. 1, где к каждой молекуле антитела присоединено от 6 до 8 молекул SN-38.

15. Способ по п. 1, где к каждой молекуле антитела присоединено от 7 до 8 молекул SN-38.

16. Способ по п. 1, где антитело представляет собой антитело IgG1 или IgG4.

17. Способ по п. 1, где антитело имеет аллотип, выбранный из группы, состоящей из аллотипов G1m3, G1m3,1, G1m3,2, G1m3,1,2, nG1m1, nG1m1,2 и Km3.

18. Способ по п. 4, где дозировку КАС вводят человеку один или два раза в неделю по схеме с курсом, выбранным из группы, состоящей из: (i) еженедельно, (ii) раз в две недели, (iii) одна неделя терапии, за которой следуют две, три или четыре недели отдыха, (iv) две недели терапии, за которыми следуют одна, две, три или четыре недели отдыха, (v) три недели терапии, за которыми следуют одна, две, три, четыре или пять недель отдыха, (vi) четыре недели терапии, за которыми следуют одна, две, три, четыре или пять недель отдыха, (vii) пять недель терапии, за которыми следуют одна, две, три, четыре или пять недель отдыха, и (viii) ежемесячно.

19. Способ по п. 18, где курс повторяют 4, 6, 8, 10, 12, 16 или 20 раз.

20. Способ по п. 1, где пациент ранее перенес рецидив или был устойчив к лечению топотеканом или иринотеканом.

21. Способ по п. 1, дополнительно включающий:

c) введение одного или нескольких терапевтических средств, выбранных из группы, состоящей из неконъюгированного антитела, иммуноконъюгата, генной терапии, химиотерапии, терапевтического пептида, цитокиновой терапии, локализованной лучевой терапии, хирургии, терапии на основе РНК-интерференции, лекарственного средства, токсина и цитокина.

22. Способ по п. 21, где лекарственное средство, токсин или химиотерапевтический агент выбраны из группы, состоящей из 5-фторурацила, афатиниба, аплидина, азарибина, анастрозола, антрациклинов, акситиниба, AVL-101, AVL-291, бендамустина, блеомицина, бортезомиба, бозутиниба, бриостатина-1, бусульфана, калихеамицина, камптотецина, карбоплатина, 10-гидроксикамптотецина, кармустина, целебрекса, хлорамбуцила, цисплатина (CDDP), ингибиторов Cox-2, иринотекана (СРТ-11), SN-38, карбоплатина, кладрибина, камптотеканов, циклофосфамида, кризотиниба, цитарабина, дакарбазина, дазатиниба, динациклиба, доцетаксела, дактиномицина, даунорубицина, доксорубицина, 2-пирролинодоксорубицина (2P-DOX), циано-морфолино доксорубицина, доксорубицин глюкуронида, эпирубицин глюкуронида, эрлотиниба, эстрамустина, эпидофиллотоксина, эрлотиниба, энтиностата, агентов, связывающих рецепторы эстрогена, этопозида (VP16), этопозид глюкуронида, этопозид фосфата, экземестана, финголимода, флавопиридола, флоксуридина (FUdR), 3',5'-О-диолеоил-FudR (FUdR-dO), флударабина, флутамида, ингибиторов фарнезил-протеинтрансферазы, фостаматиниба, ганетеспиба, GDC-0834, GS-1101, гефитиниба, гемцитабина, гидроксимочевины, ибрутиниба, идарубицина, иделалисиба, ифосфамида, иматиниба, L-аспарагиназы, лапатиниба, ленолидамида, лейковорина, LFM-А13, ломустина, мехлоретамина, мелфалана, меркаптопурина, 6-меркаптопурина, метотрексата, митоксантрона, митрамицина, митомицина, митотана, навелбина, нератиниба, нилотиниба, нитрозомочевины, олапариба, пликомицина, прокарбазина, паклитаксела, PCI-32765, пентостатина, PSI-341, ралоксифена, семустина, сорафениба, стрептозоцина, SU11248, сунитиниба, тамоксифена, темазоломида (водная форма дакарбазина (DTIC)), трансплатина, талидомида, тиогуанина, тиотепы, тенипозида, топотекана, урацилового иприта, ваталаниба, винорелбина, винбластина, винкристина, алкалоидов барвинка и ZD1839.

23. Способ по п. 21, где лекарственное средство представляет собой цисплатин или карбоплатин.

24. Способ по п. 1, где КАС представляет собой сацитузумаб говитекан.

25. Способ по п. 1, где рак представляет собой трижды негативный рак молочной железы (ТНРМЖ), мелкоклеточный рак легкого (МКРЛ), немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ), уротелиальный рак, рак желудка, рак поджелудочной железы, колоректальный рак, рак предстательной железы, рак яичников, рак почки или рак мочевого пузыря.

26. Способ по п. 1, где рак представляет собой ТНРМЖ.