КОНЪЮГАТ АНТИТЕЛА К TROP-2 И АНАЛОГА ЭКЗАТЕКАНА И ЕГО МЕДИЦИНСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2024 года по МПК A61K47/68 C07K16/30 A61P35/00 

Настоящая заявка испрашивает приоритет по китайской патентной заявке (заявка №CN202010073438.8), поданной 22 января 2020 года.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к антителу к TROP-2 и конъюгату антитела к TROP-2 и аналога экзатекана, способу их получения, фармацевтическим композициям, содержащим их, и их применению для получения лекарственного препарата для лечения заболевания или состояния, опосредованного TROP-2, в особенности их применению для получения противоракового лекарственного средства.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Изложенное в данном документе представляет собой лишь общую информацию, относящуюся к настоящему изобретению, и необязательно может представлять собой известный уровень техники.

TROP-2, гликопротеиновый антиген 2 поверхности трофобласта человека, также известный как опухолеассоциированный кальциевый преобразователь сигнала 2 (TACSTD2), эпидермальный гликопротеин 1 (EGP-1), желудочно-кишечный опухолеассоциированный антиген (GA733-1) и поверхностный маркер 1 (M1S1), представляет собой гликопротеин поверхности клетки, кодируемый и экспрессируемый геном Tacstd2 в области 1p32 хромосомы. TROP-2 является членом семейства белков GA733 и имеет более высокое структурное сходство последовательности с молекулами адгезии эпителиальных клеток (EpCAM, также известный как Trop1 и TACSTD1) с гомологией 49%.

Первичная структура белка TROP-2 представляет собой полипептид около 36 кДа, состоящий из около 323 аминокислот, и первичная структура модифицирована посттрансляционно N-концевым гликозилированием с образованием гликопротеина клеточной мембраны типа I, отличного от EpCAM, то есть белка TROP-2. Белок TROP-2 охватывает клеточную мембрану и имеет N-концевой внеклеточный домен (Trop2EC), и внеклеточный домен иммобилизован на клеточной мембране посредством однонаправленной трансмембранной спирали (TM), соединенной с коротким внутриклеточным хвостом (Trop2IC) гидрофобного полипептида, состоящего из 26 аминокислотных остатков.

В настоящее время установлено, что TROP -2 имеет важное значение в процессах эмбрионального развития и пролиферации и метастазирования опухолевых клеток. TROP-2 первоначально обнаружен в клетке трофобласта и служит ее поверхностным маркером, клетка трофобласта получена из экстраэмбрионального трофобласта, а TROP-2 способствует имплантации эмбриона и образованию плацентарной ткани и играет важную роль в поддержании пролиферативных характеристик эмбриональных стволовых клеток и формировании и развитии органов. Кроме того, TROP-2 также является важным фактором, связанным с развитием опухоли, экспрессируется на высоком уровне в различных опухолях, таких как рак поджелудочной железы, рак молочной железы, рак толстой кишки, рак желудка, плоскоклеточный рак полости рта и рак яичников, может способствовать процессам пролиферации опухолевых клеток, инвазии, метастазирования, диффузии и тому подобное, и тесно связан с сокращенной выживаемостью и плохим прогнозом опухолевых субъектов, поэтому он имеет большое значение для исследований противоопухолевого лекарственного препарата, нацеленного на TROP-2.

Конъюгат антитело-лекарственное средство (ADC) связывает моноклональное антитело или фрагмент антитела с биологически активным цитотоксином через линкерное соединение, полностью используя специфичность связывания антитела с поверхностными антигенами нормальных клеток и опухолевых клеток и высокую эффективность цитотоксического вещества, а также избегая дефектов плохого терапевтического действия антитела и серьезных токсических побочных эффектов токсического вещества. Это означает, что конъюгат антитела и лекарственного средства может более точно уничтожать опухолевые клетки и оказывает сниженное влияние на нормальные клетки по сравнению с обычными химиотерапевтическими препаратами в прошлом.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к антителу к TROP-2, его ADC и его применению, и обеспечивает лекарственное средство ADC, в котором антитело к TROP-2 или антигенсвязывающий фрагмент конъюгированы с аналогом экзатекана, цитотоксическим веществом.

Настоящее изобретение относится к конъюгату лиганд-лекарственное средство общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемой соли,

где:

Y выбран из группы, состоящей из -O-(CR^aR^b)_m-CR¹R²-C(O)-, -O-CR¹R²-(CR^aR^b)_m-, -O-CR¹R²-, -NH-(CR^aR^b)_m-CR¹R²-C(O)- и -S-(CR^aR^b)_m-CR¹R²-C(O)-;

R^a и R^b являются идентичными или разными, и каждый независимо выбран из группы, состоящей из водорода, дейтерия, галогена, алкила, галогеналкила, дейтерированного алкила, алкокси, гидрокси, амино, циано, нитро, гидроксиалкила, циклоалкила и гетероциклила; или R^a и R^b, вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют циклоалкил или гетероциклил;

R¹ выбран из группы, состоящей из галогена, галогеналкила, дейтерированного алкила, циклоалкила, циклоалкилалкила, алкоксиалкила, гетероциклила, арила и гетероарила; R² выбран из группы, состоящей из водорода, галогена, галогеналкила, дейтерированного алкила, циклоалкила, циклоалкилалкила, алкоксиалкила, гетероциклила, арила и гетероарила; или R¹ и R² вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют циклоалкил или гетероциклил;

или R^a и R², вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют циклоалкил или гетероциклил;

m представляет собой целое число от 0 до 4; неограничивающие примеры m представляют собой, например, m, выбранный из группы, состоящей из 0, 1, 2, 3 и 4;

n представляет собой десятичное или целое число от 1 до 10;

L представляет собой линкерный фрагмент;

Pc представляет собой антитело к TROP-2 или его антигенсвязывающий фрагмент.

В некоторых вариантах реализации изобретения в конъюгате лиганд-лекарственное средство общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемой соли как раскрыто выше, антитело к TROP-2 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие последовательности, идентичные последовательностям HCDR1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи, представленной в SEQ ID NO: 3, и вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие последовательности, идентичные последовательностям LCDR1, LCDR2 и LCDR3 вариабельной области легкой цепи, представленной в SEQ ID NO: 4.

В некоторых вариантах реализации изобретения в конъюгате лиганд-лекарственное средство общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемой соли согласно любому из вышеупомянутых вариантов реализации изобретения антитело к TROP-2 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, представленные в SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7, соответственно, и вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, представленные в SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10, соответственно.

В некоторых вариантах реализации изобретения в конъюгате лиганд-лекарственное средство общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемой соли согласно любому из вышеупомянутых вариантов реализации изобретения антитело к TROP-2 представляет собой антитело мыши, химерное антитело, гуманизированное антитело или антитело человека.

В некоторых вариантах реализации изобретения в конъюгате лиганд-лекарственное средство общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемой соли согласно любому из вышеупомянутых вариантов реализации изобретения антитело к TROP-2 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, причем вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, или имеющую по меньшей мере 90-100% идентичности с ней, включая, но не ограничиваясь, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или по меньшей мере 100%, и вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4, или имеющую по меньшей мере 90-100% идентичности с ней, включая, но не ограничиваясь этим, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или по меньшей мере 100%.

В некоторых вариантах реализации изобретения в конъюгате лиганд-лекарственное средство общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемой соли согласно любому из вышеупомянутых вариантов реализации изобретения антитело к TROP-2 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 3, и вариабельную область легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 4.

В некоторых вариантах реализации изобретения в конъюгате лиганд-лекарственное средство общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемой соли согласно любому из вышеупомянутых вариантов реализации изобретения антитело к TROP-2 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи и константную область легкой цепи; предпочтительно, константная область тяжелой цепи выбрана из группы, состоящей из константных областей IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 человека, и константная область легкой цепи выбрана из группы, состоящей из константных областей κ и λ цепи антитела человека; и более предпочтительно, указанное антитело содержит константную область тяжелой цепи, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 11, и константную область легкой цепи, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 12.

В некоторых вариантах реализации изобретения в конъюгате лиганд-лекарственное средство общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемой соли согласно любому из вышеупомянутых вариантов реализации изобретения антитело к TROP-2 содержит тяжелую цепь, представленную в SEQ ID NO: 13, и легкую цепь, представленную в SEQ ID NO: 14.

В некоторых вариантах реализации изобретения в конъюгате лиганд-лекарственное средство общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемой соли, как описано выше, антитело к TROP-2 содержит тяжелую цепь, имеющую последовательность SEQ ID NO: 15, и легкую цепь, имеющую последовательность SEQ ID NO: 16, или содержит тяжелую цепь, имеющую последовательность SEQ ID NO: 17, и легкую цепь, имеющую последовательность SEQ ID NO: 18.

В некоторых вариантах реализации изобретения в конъюгате лиганд-лекарственное средство общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемой соли согласно любому из вышеупомянутых вариантов реализации изобретения n представляет собой десятичное или целое число от 2 до 10, предпочтительно от 4 до 8. В некоторых вариантах реализации n представляет собой среднее значение от 0 до 10, предпочтительно от 1 до 10, более предпочтительно от 1 до 8 или от 2 до 8, или от 2 до 7, или от 2 до 4, или от 3 до 8, или от 3 до 7, или от 3 до 6, или от 4 до 7, или от 4 до 6, или от 4 до 5; в некоторых вариантах реализации n представляет собой среднее значение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10.

В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение относится к конъюгату лиганда и лекарственного средства общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемой соли согласно любому из вышеупомянутых вариантов осуществления изобретения, где:

Y представляет собой -O-(CR^aR^b)_m-CR¹R²-C(O)-;

R^a и R^b являются идентичными или различными, и каждый независимо выбран из группы, состоящей из водорода, дейтерия, галогена и алкила;

R¹ представляет собой галогеналкил или C₃-₆ циклоалкил;

R² выбран из группы, состоящей из водорода, галогеналкила и C₃-₆ циклоалкила;

или R¹ и R² вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют C₃-₆ циклоалкил;

m представляет собой 0 или 1.

В некоторых вариантах осуществления в конъюгате лиганда и лекарственного средства общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемой соли согласно любому из вышеупомянутых вариантов осуществления Y выбран из группы, состоящей из

где О-конец Y присоединен к линкерному звену L.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения в конъюгате лиганда и лекарственного средства общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемой соли согласно любому из вышеупомянутых вариантов осуществления изобретения линкерное звено -L- представляет собой -L¹-L²-L³-L⁴-, где

L¹ выбран из группы, состоящей из -(сукцинимидил-3-ил-N)-W-C(O)-, -CH₂-C(O)-NR³-W-C(O)- и -C(O)-W-C(O)-, где W выбран из группы, состоящей из C₁-₈ алкила, C₁-₈ алкилциклоалкила и линейного гетероалкила, имеющего от 1 до 8 атомов, причем указанный гетероалкил содержит от 1 до 3 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, O и S, где независимо каждый из указанных C₁-₈ алкила, циклоалкила или линейного гетероалкила необязательно дополнительно замещен одним или более заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, гидрокси, циано, амино, алкила, хлоралкила, дейтерированного алкила, алкокси и циклоалкила;

L² выбран из группы, состоящей из -NR⁴(CH₂CH₂O)pCH₂CH₂C(O)-, -NR⁴(CH₂CH₂O)pCH₂C(O)-, -S(CH₂)pC(O)- и химической связи, где p представляет собой целое число от 1 до 20;

L³ представляет собой пептидный остаток, состоящий из 2-7 аминокислот, где аминокислоты выбраны из группы, состоящей из аминокислотных остатков, образованных из аминокислот фенилаланина, глицина, валина, лизина, цитруллина, серина, глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты, и необязательно дополнительно замещены одним или более заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, гидрокси, циано, амино, алкила, хлоралкила, дейтерированного алкила, алкокси и циклоалкила;

L⁴ выбран из группы, состоящей из -NR⁵(CR⁶R⁷)_t-, -C(O)NR⁵, -C(O)NR⁵(CH₂)_t- и химической связи, где t представляет собой целое число от 1 до 6;

R³, R⁴ и R⁵ являются идентичными или различными, и каждый независимо выбран из группы, состоящей из водорода, алкила, галогеналкила, дейтерированного алкила и гидроксиалкила;

R⁶ и R⁷ являются идентичными или различными, и каждый независимо выбран из группы, состоящей из водорода, галогена, алкила, галогеналкила, дейтерированного алкила и гидроксиалкила.

В некоторых вариантах осуществления в конъюгате лиганда и лекарственного средства общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемой соли согласно любому из вышеупомянутых вариантов осуществления изобретения линкерное звено -L- представляет собой -L¹-L²-L³-L⁴-, где

L¹ выбран из группы, состоящей из -(сукцинимидил-3-ил-N)-W-C(O)-, -CH₂-C(O)-NR³-W-C(O)- и -C(O)-W-C(O)-, где W выбран из группы, состоящей из C₁-₈ алкила, C₁-₈ алкилциклоалкила и линейного гетероалкила, имеющего от 1 до 8 атомов цепи, причем указанный гетероалкил содержит от 1 до 3 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, O и S, где независимо каждый из указанных C₁-₈ алкила, циклоалкила или линейного гетероалкила необязательно дополнительно замещен одним или более заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, гидрокси, циано, амино, алкила, хлоралкила, дейтерированного алкила, алкокси и циклоалкила;

L² выбран из группы, состоящей из -NR⁴(CH₂CH₂O)pCH₂CH₂C(O)-, -NR⁴(CH₂CH₂O)pCH₂C(O)-, -S(CH₂)pC(O)- и химической связи, где p представляет собой целое число от 1 до 20;

L³ представляет собой пептидный остаток, состоящий из 2-7 аминокислотных остатков, причем аминокислотные остатки выбраны из группы, состоящей из аминокислотных остатков, образованных из аминокислот фенилаланина (F), глицина (G), валина (V), лизина (K), цитруллина, серина (S), глутаминовой кислоты (Q) и аспарагиновой кислоты (D), и необязательно дополнительно замещены одним или более заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, гидрокси, циано, амино, алкила, хлоралкила, дейтерированного алкила, алкокси и циклоалкила;

L⁴ выбран из группы, состоящей из -NR⁵(CR⁶R⁷)_t-, -C(O)NR⁵-, -C(O)NR⁵(CH₂)_t- и химической связи, где t представляет собой целое число от 1 до 6, и неограничивающие примеры t представляют собой 1, 2, 3, 4, 5 и 6;

R³, R⁴ и R⁵ являются идентичными или различными, и каждый независимо выбран из группы, состоящей из водорода, алкила, галогеналкила, дейтерированного алкила и гидроксиалкила;

R⁶ и R⁷ являются идентичными или различными, и каждый независимо выбран из группы, состоящей из водорода, галогена, алкила, галогеналкила, дейтерированного алкила и гидроксиалкила.

В некоторых вариантах осуществления в конъюгате лиганда и лекарственного средства общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемой соли согласно любому из вышеупомянутых вариантов осуществления изобретения линкерное звено -L- представляет собой -L¹-L²-L³-L⁴-, где

L¹ представляет собой s¹ представляет собой целое число от 2 до 8, и неограничивающие примеры s¹ представляют собой 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8;

L² представляет собой химическую связь;

L³ представляет собой остаток тетрапептида, предпочтительно остаток тетрапептида GGFG;

L⁴ представляет собой -NR⁵(CR⁶R⁷)t-, где R⁵, R⁶ и R⁷ являются идентичными или различными, и каждый независимо представляет собой водород или алкил, и t представляет собой 1 или 2;

где L¹-конец присоединен к Pc, а L⁴-конец присоединен к Y.

В некоторых вариантах реализации в конъюгате лиганда и лекарственного средства общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемой соли согласно любому из вышеупомянутых вариантов осуществления изобретения -L- представляет собой

.

В некоторых вариантах осуществления в конъюгате лиганда и лекарственного средства общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемой соли согласно любому из вышеупомянутых вариантов осуществления -L-Y- выбран из группы, состоящей из:

В некоторых вариантах осуществления конъюгат лиганда и лекарственного средства общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемая соль согласно любому из вышеупомянутых вариантов осуществления изобретения представляет собой конъюгат лиганда и лекарственного средства общей формулы (Pc-L_a-Y-D) или его фармацевтически приемлемую соль,

,

где:

W, L², L³, R⁵, R⁶ и R⁷ являются такими, как определено в вышеупомянутом линкерном звене -L-;

Pc, n, R¹, R² и m являются такими, как определено в общей формуле (Pc-L-Y-D).

В некоторых вариантах осуществления конъюгат лиганда и лекарственного средства общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемая соль согласно любому из вышеупомянутых вариантов осуществления изобретения представляет собой конъюгат лиганда и лекарственного средства общей формулы (Pc-L_b-Y-D) или его фармацевтически приемлемую соль,

,

где:

s¹ представляет собой целое число от 2 до 8;

Pc, R¹, R², R⁵, R⁶, R⁷, m и n являются такими, как определено в общей формуле (Pc-L_a-Y-D).

В некоторых вариантах осуществления в конъюгате лиганда и лекарственного средства общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемой соли согласно любому из вышеупомянутых вариантов осуществления конъюгат лиганда и лекарственного средства выбран из группы, состоящей из:

,

и

,

где Pc и n являются такими, как определено в общей формуле (Pc-L-Y-D).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения в конъюгате лиганда и лекарственного средства общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемой соли согласно любому из вышеупомянутых вариантов осуществления конъюгат лиганда и лекарственного средства выбран из группы, состоящей из:

, где:

n представляет собой десятичное или целое число от 4 до 8;

Pc представляет собой антитело к TROP-2, содержащее тяжелую цепь, представленную в SEQ ID NO: 13, и легкую цепь, представленную в SEQ ID NO: 14.

В некоторых вариантах реализации изобретения в конъюгате лиганд-лекарственное средство общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемой соли, как описано выше, конъюгат лиганд-лекарственное средство представляет собой:

,

где:

n представляет собой десятичное или целое число от 1 до 8, предпочтительно от 2 до 4 или от 4 до 8, и более предпочтительно от 4 до 6;

Pc представляет собой антитело к TROP-2, содержащее тяжелую цепь, представленную в SEQ ID NO: 13, и легкую цепь, представленную в SEQ ID NO: 14;

или содержащее тяжелую цепь, представленную в SEQ ID NO: 15, и легкую цепь, представленную в SEQ ID NO: 16;

или содержащее тяжелую цепь, представленную в SEQ ID NO: 17, и легкую цепь, представленную в SEQ ID NO: 18.

В некоторых вариантах реализации изобретения в конъюгате лиганд-лекарственное средство общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемой соли, как описано выше, конъюгат лиганд-лекарственное средство представляет собой:

,

и

,

где:

n представляет собой десятичное или целое число от 1 до 8, предпочтительно от 2 до 4 или от 4 до 8, и более предпочтительно от 4 до 6;

PD3 представляет собой антитело к TROP-2, содержащее тяжелую цепь, представленную в SEQ ID NO: 13, и легкую цепь, представленную в SEQ ID NO: 14;

hRS7 представляет собой антитело к TROP-2, содержащее тяжелую цепь, представленную в SEQ ID NO: 15, и легкую цепь, представленную в SEQ ID NO: 16;

TINA представляет собой антитело к TROP-2, содержащее тяжелую цепь, представленную в SEQ ID NO: 17, и легкую цепь, представленную в SEQ ID NO: 18.

Настоящее изобретение также относится к антителу к TROP-2 или его антигенсвязывающему фрагменту, содержащему вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, причем вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие последовательности, идентичные последовательностям HCDR1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи, представленной в SEQ ID NO: 3, и вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие последовательности, идентичные последовательностям LCDR1, LCDR2 и LCDR3 вариабельной области легкой цепи, представленной в SEQ ID NO: 4.

В некоторых вариантах реализации изобретения в антителе к TROP-2 или его антигенсвязывающем фрагменте, как описано выше, содержащем вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, представленные в SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7, соответственно, и вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, представленные в SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10, соответственно.

В некоторых вариантах реализации изобретения в антителе к TROP-2 или его антигенсвязывающем фрагменте согласно любому из вышеупомянутых вариантов реализации изобретения антитело к TROP-2 представляет собой мышиное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело или антитело человека.

В некоторых вариантах реализации изобретения в антителе против TROP-2 или его антигенсвязывающем фрагменте согласно любому из вышеупомянутых вариантов реализации изобретения, содержащем вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3 или имеющую по меньшей мере 90-100% идентичности с ней, включая, но не ограничиваясь, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или по меньшей мере 100%, и вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4 или имеющую по меньшей мере 90-100% идентичности с ней, включая, но не ограничиваясь, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или по меньшей мере 100%.

В некоторых вариантах реализации изобретения в антителе к TROP-2 или его антигенсвязывающем фрагменте согласно любому из вышеупомянутых вариантов реализации изобретения антитело к TROP-2 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи и константную область легкой цепи антитела; предпочтительно, константная область тяжелой цепи выбрана из группы, состоящей из константных областей человеческого IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 и их обычных вариантов, и константная область легкой цепи выбрана из группы, состоящей из константных областей человеческого антитела κ и λ-цепи и их обычных вариантов; и более предпочтительно, антитело содержит константную область тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 11, и константную область легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 12.

В некоторых вариантах реализации изобретения в антителе к TROP-2 или его антигенсвязывающем фрагменте согласно любому из вышеупомянутых вариантов реализации изобретения антитело к TROP-2 содержит тяжелую цепь, представленную в SEQ ID NO: 13, и легкую цепь, представленную в SEQ ID NO: 14.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело к TROP-2, как описано выше. В другом аспекте настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело к TROP-2 или его антигенсвязывающий фрагмент, как описано выше.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты, как описано выше.

В настоящем изобретении дополнительно предложен способ получения конъюгата лиганда и лекарственного средства общей формулы (Pc-L_a-Y-D) или его фармацевтически приемлемой соли, включающий следующие стадии:

,

подвергание реакции сочетания восстановленного Pc и соединения общей формулы (L_a-Y-D) с получением соединения общей формулы (Pc-L_a-Y-D);

где:

Pc представляет собой антитело к TROP-2 или его антигенсвязывающий фрагмент;

n, m, W, L², L³, R¹, R², R⁵, R⁶ и R⁷ являются такими, как определено в вышеупомянутой общей формуле (Pc-L_a-Y-D).

В настоящем изобретении дополнительно предложен способ получения конъюгата антитело-лекарственное средство общей формулы (Pc-L'-D), где способ включает следующую стадию:

,

подвергание восстановленного Pc и соединения общей формулы (L'-D) реакции сочетания с получением соединения общей формулы (Pc-L'-D); где:

Pc представляет собой антитело к TROP-2 или его антигенсвязывающий фрагмент, как описано выше;

n является таким, как определено в общей формуле (Pc-L-Y-D).

В другом аспекте настоящее изобретение относится к конъюгату лиганд-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемой соли в соответствии с любым из вышеупомянутых вариантов реализации изобретения, или антителу к TROP-2 или его антигенсвязывающему фрагменту в соответствии с любым из вышеупомянутых вариантов реализации изобретения, и одному или более фармацевтически приемлемому вспомогательному веществму, разбавителю или носителю. В некоторых вариантах реализации изобретения разовая доза фармацевтической композиции содержит 0,1-3000 мг или 1-1000 мг антитела к TROP-2, как описано выше, или конъюгата антитело-лекарственное средство, как описано выше.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению конъюгата лиганд-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемой соли в соответствии с любым из вышеупомянутых вариантов реализации изобретения, или антитела к TROP-2 или его антигенсвязывающего фрагмента в соответствии с любым из вышеупомянутых вариантов реализации изобретения, или фармацевтической композиции, содержащей то же самое, в качестве лекарственного средства.

В другом аспекте, настоящее изобретение относится к конъюгату лиганд-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемой соли согласно любому из вышеупомянутых вариантов реализации изобретения, антителу к TROP-2 или его антигенсвязывающему фрагменту согласно любому из вышеупомянутых вариантов реализации изобретения, или фармацевтической композиции, содержащей его, при получении лекарственного средства для лечения заболевания, или состояния, или опухоли, опосредованных TROP-2, причем заболевание или состояние, опосредованное TROP-2, представляет собой рак с высоким уровнем экспрессии TROP-2, умеренным уровнем экспрессии TROP-2 или низким уровнем экспрессии TROP-2.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению конъюгата антитело-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемой соли в соответствии с любым из вышеупомянутых вариантов осуществления изобретения, антитела к TROP-2 или его антигенсвязывающего фрагмента в соответствии с любым из вышеупомянутых вариантов осуществления изобретения, или фармацевтической композиции, содержащей то же самое, для получения лекарственного средства для лечения и/или предупреждении опухолей и раковых заболеваний, где опухоли и раковые заболевания предпочтительно представляют собой плоскоклеточную карциному головы и шеи, рак головы и шеи, рак головного мозга, нейроглиому, мультиформную глиобластому, нейробластому, карциному центральной нервной системы, нейроэндокринную опухоль, рак горла, плоскоклеточную карциному глотки, плоскоклеточную карциному полости рта, рак носоглотки, рак пищевода, рак щитовидной железы, злокачественную плевральную мезотелиому, рак легких, рак молочной железы, рак печени, рак гепатобилиарной системы, рак поджелудочной железы, рак желудка, рак желудочно-кишечного тракта, рак кишечника, рак толстой кишки, рак прямой кишки, рак почки, светлоклеточный почечно-клеточный рак, рак яичников, рак эндометрия, рак шейки матки, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак яичка, рак кожи, меланому, лейкоз, лимфому, рак костей, хондросаркому, миелому, множественную миелому, миелодиспластический синдром, опухоль Крукенберга, миелопролиферативную опухоль, плоскоклеточную карциному, саркому Юинга, уротелиальную карциному или карциному Меркеля; более предпочтительно лимфома выбрана из группы, состоящей из лимфомы Ходжкина, неходжкинской лимфомы, диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы, фолликулярной лимфомы, первичной медиастинальной крупноклеточной В-клеточной лимфомы, мантийноклеточной лимфомы, мелкоклеточной лейкоцитарной лимфомы, крупноклеточной В-клеточной лимфомы, богатой Т-клетками/гистиоцитами и лимфоплазматической лимфомы, рак легкого выбран из группы, состоящей из немелкоклеточного рака легкого и мелкоклеточного рака легкого, и лейкоз выбран из группы, состоящей из хронического миелоидного лейкоза, острого миелоидного лейкоза, лимфоцитарного лейкоза, лимфобластного лейкоза, острого лимфобластного лейкоза, хронического лимфоцитарного лейкоза и миелоидного клеточного лейкоза.

В другом аспекте настоящее изобретение также относится к способу лечения и/или предупреждения опухоли, включающему введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективной дозы конъюгата лиганд-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемой соли в соответствии с любым из вышеупомянутых вариантов реализации изобретения, антитела к TROP-2 или его антигенсвязывающего фрагмента в соответствии с любым из вышеупомянутых вариантов реализации изобретения, или содержащей его фармацевтической композиции; причем опухоль представляет собой рак с высоким уровнем экспрессии TROP-2, умеренным уровнем экспрессии TROP-2 или низким уровнем экспрессии TROP-2.

В другом аспекте настоящее изобретение также относится к способу лечения или предотвращения опухолей или раковых заболеваний, включающему введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективной дозы конъюгата лиганда и лекарственного средства или его фармацевтически приемлемой соли в соответствии с любым из вышеупомянутых вариантов осуществления изобретения, или антитела к TROP-2 или его антигенсвязывающего фрагмента в соответствии с любым из вышеупомянутых вариантов осуществления изобретения, или фармацевтической композиции, содержащей указанное, где опухоли и раковые заболевания предпочтительно представляют собой плоскоклеточную карциному головы и шеи, рак головы и шеи, рак головного мозга, нейроглиому, мультиформную глиобластому, нейробластому, карциному центральной нервной системы, нейроэндокринную опухоль, рак горла, плоскоклеточную карциному глотки, плоскоклеточную карциному полости рта, рак носоглотки, рак пищевода, рак щитовидной железы, злокачественную плевральную мезотелиому, рак легких, рак молочной железы, рак печени, рак гепатобилиарной системы, рак поджелудочной железы, рак желудка, рак желудочно-кишечного тракта, рак кишечника, рак толстой кишки, рак прямой кишки, рак почки, светлоклеточный почечно-клеточный рак, рак яичников, рак эндометрия, рак шейки матки, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак яичка, рак кожи, меланому, лейкоз, лимфому, рак костей, хондросаркому, миелому, множественную миелому, миелодиспластический синдром, опухоль Крукенберга, миелопролиферативную опухоль, плоскоклеточную карциному, саркому Юинга, уротелиальную карциному или карциному Меркеля; более предпочтительно лимфома выбрана из группы, состоящей из лимфомы Ходжкина, неходжкинской лимфомы, диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы, фолликулярной лимфомы, первичной медиастинальной крупноклеточной В-клеточной лимфомы, мантийноклеточной лимфомы, мелкоклеточной лейкоцитарной лимфомы, крупноклеточной В-клеточной лимфомы, богатой Т-клетками/гистиоцитами и лимфоплазматической лимфомы, рак легкого выбран из группы, состоящей из немелкоклеточного рака легкого и мелкоклеточного рака легкого, и лейкоз выбран из группы, состоящей из хронического миелоидного лейкоза, острого миелоидного лейкоза, лимфоцитарного лейкоза, лимфобластного лейкоза, острого лимфобластного лейкоза, хронического лимфоцитарного лейкоза и миелоидного клеточного лейкоза.

В другом аспекте настоящее изобретение дополнительно относится к вышеупомянутому антителу к TROP-2 или его конъюгату антитело-лекарственное средство для применения в качестве лекарственного средства, предпочтительно в качестве лекарственного средства для лечения раковых заболеваний или опухолей, и более предпочтительно в качестве лекарственного средства для лечения рака, опосредованного TROP-2.

Активное соединение (например, конъюгат лиганда и лекарственного средства или его фармацевтически приемлемая соль в соответствии с настоящим изобретением) может быть составлено в форме, подходящей для введения любым подходящим способом, предпочтительно в форме стандартной дозы или в форме однократной дозы, которую субъект может вводить самостоятельно. Стандартная доза активного соединения или композиции, описанных в настоящем документе, может быть в виде таблетки, капсулы, облатки, флакона, порошка, гранулы, пастилки, суппозитория, порошка для восстановления или жидкого состава.

Доза введения активного соединения или композиции, применяемых в способе лечения по настоящему изобретению, обычно варьируется в зависимости от тяжести заболевания, массы субъекта и эффективности активного соединения. Как правило, подходящая стандартная доза может составлять от 0,1 до 1000 мг.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать, в дополнение к активному соединению, один или более эксципиентов, выбранных из группы, состоящей из: наполнителя, разбавителя, связующего вещества, увлажняющего агента, разрыхлителя, эксципиента и т.п. В зависимости от способа введения композиция может содержать от 0,1 до 99 мас.% активного соединения.

Антитело к TROP-2 и конъюгат антитела и лекарственного средства, предложенные в настоящем изобретении, обладают хорошей аффинностью к антигенам клеточной поверхности, хорошей эффективностью эндоцитоза и высокой эффективностью ингибирования опухоли, а также более широкими окнами применения лекарственного средства и пригодны для клинического применения лекарственного средства.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На фиг.1 показаны результаты экспериментов по связыванию антител к TROP-2 с клетками, экспрессирующими TROP-2.

На фиг.2 показаны результаты второстепенной активности ADC в отношении уничтожения клеток на клетках BxPC3 и смешанных клетках MiaPaCa2.

На фиг.3 показана ингибирующая активность различных ADC в отношении опухоли ксенотрансплантата FaDu у мышей.

На фиг.4 показана ингибирующая активность различных доз ADC в отношении опухоли ксенотрансплантата SKOV3 у мышей.

На фиг.5 показана ингибирующая активность различных доз ADC в отношении опухоли ксенотрансплантата Colo205 у мышей.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Терминология

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют такое же значение, которое обычно подразумевается специалистом в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Хотя любые способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в настоящем документе, также могут быть использованы для осуществления или тестирования настоящего изобретения, предпочтительные способы и материалы описаны в настоящем документе. В описании и формуле изобретения по настоящему изобретению используются следующие термины в соответствии с приведенными ниже определениями.

При использовании торгового наименования в настоящем описании предполагается, что оно включает состав коммерческого продукта под указанным торговым наименованием и лекарственное средство и активный компонент лекарственного средства коммерческого продукта под указанным торговым наименованием.

Если не указано иное, термины, используемые в описании и формуле изобретения, имеют приведенные ниже значения.

Термин "лекарственное средство" относится к цитотоксическому лекарственному средству, которое может иметь химическую молекулу в опухолевой клетке, которая является достаточно сильной, чтобы нарушить ее нормальный рост. Цитотоксическое лекарственное средство может убивать клетки как таковые при достаточно высокой концентрации; однако из-за недостатка специфичности цитотоксический препарат может вызывать апоптоз нормальных клеток при уничтожении опухолевых клеток, что приводит к серьезным побочным эффектам. Термин "цитотоксическое лекарственное средство" включает токсины, такие как низкомолекулярные токсины или ферментативно активные токсины бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения, радиоизотопы (например, At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³² и радиоактивные изотопы Lu), химиотерапевтические лекарственные средства, антибиотики и нуклеолитические ферменты.

Термин "линкерное звено", "линкер" или "линкерный фрагмент" относится к химическому структурному фрагменту или связи, которая связана с лигандом на одном конце и связана с лекарственным средством на другом конце, а также может быть связана с другими линкерами, а затем связана с лекарственным средством.

Линкер может содержать один или более линкерных компонентов. Иллюстративные компоненты линкера включают 6-малеимидокапроил ("MC"), малеимидопропионил ("MP"), валин-цитруллин ("val-cit" или "vc"), аланин-фенилаланин ("ala-phe"), пара-аминобензилоксикарбонил ("PAB"), N-сукцинимидил-4-(2-пиридилтио)пентаноат ("SPP"), N-сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1 карбоксилат ("SMCC", также упоминаемый в настоящем документе как "MCC") и N-сукцинимидил(4-иодацетил)аминобензоат ("SIAB"). Линкер может быть выбран из следующих элементов или их комбинации: удлинителя, спейсера и аминокислотной единицы. Линкер может быть синтезирован с использованием способов, известных в данной области техники, таких как описанные в US2005-0238649A1. Линкер может представлять собой "расщепляемый линкер", благоприятствующий высвобождению лекарственных средств в клетках. Например, могут быть использованы кислотолабильные линкеры (например, гидразоны), чувствительные к протеазе (например, чувствительные к пептидазе) линкеры, фотолабильные линкеры, диметильные линкеры или дисульфидсодержащие линкеры (Chari et al., Cancer Research 52: 127-131(1992); патент США №5208020).

Элементы линкера включают, но не ограничиваются:

MC - 6-малеимидокапроил, со структурой:

,

Val-Cit или "vc" - валин-цитруллин (пример дипептида в расщепляемом протеазой линкере),

цитруллин - 2-амино-5-уреидопентановая кислота,

PAB - пара-аминобензилоксикарбонил (пример "саморасщепляющихся" линкерных компонентов),

Me-Val-Cit - N-метил-валин-цитруллин (где линкерная пептидная связь была модифицирована для предотвращения ее расщепления катепсином B),

MC(PEG)6-OH - малеимидокапроилполиэтиленгликоль (присоединяемый к цистеину антитела),

SPP - N-сукцинимидил-4-(2-пиридилтио)валерат,

SPDP - N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат,

SMCC - сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат,

IT - иминотиолан.

Термин "конъюгат лиганда и лекарственного средства" означает, что лиганд связан с биологически активным лекарственным средством посредством линкерного звена, и "конъюгат лиганда и лекарственного средства" предпочтительно представляет собой "конъюгат антитела и лекарственного средства". В настоящем описании "конъюгат антитела и лекарственного средства" (ADC) означает, что моноклональное антитело или фрагмент антитела связаны с биологически активным токсичным лекарственным средством посредством линкерного фрагмента. Антитело может быть конъюгировано с лекарственным средством непосредственно или через линкер. n представляет собой среднее количество модулей лекарственного средства, конъюгированных с каждым антителом, может быть целым или десятичным и может находиться в диапазоне, например, от около 0 до около 20 модулей лекарственного средства; в некоторых вариантах реализации изобретения от 1 до около 10 модулей лекарственного средства; и в некоторых вариантах реализации изобретения от 1 до около 8 модулей лекарственного средства, таких как 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 модулей лекарственного средства. В составе смеси конъюгата антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению средняя лекарственная нагрузка каждого антитела составляет от около 1 до около 10, включая, но не ограничиваясь, от около 3 до около 7, от около 3 до около 6, от около 3 до около 5, от около 1 до около 9, около 7 или около 4.

Трехбуквенные и однобуквенные коды для аминокислот, используемые в настоящем описании, раскрыты в J. biol. chem, 243, p3558 (1968).

Термин "антитело" относится к иммуноглобулину, который имеет структуру тетрапептидной цепи, образованную путем соединения между двумя тяжелыми цепями и двумя легкими цепями межцепочечными дисульфидными связями. По отличиям в аминокислотном составе и порядку расположения константных областей тяжелой цепи иммуноглобулины можно разделить на пять классов, иначе называемых изотипами иммуноглобулинов, а именно IgM, IgD, IgG, IgA и IgE, при этом их соответствующими тяжелыми цепями являются μ-цепь, δ-цепь, γ-цепь, α-цепь и ε-цепь соответственно. Ig одного класса может быть разделен на различные подклассы в зависимости от различий в аминокислотном составе шарнирных областей и количества и положения дисульфидных связей тяжелых цепей; например, IgG может быть разделен на IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Легкие цепи классифицируются на κ- или λ-цепи по различиям в константных областях. Каждый из пяти классов Ig может иметь κ-цепь или λ-цепь.

В тяжелых и легких цепях полноразмерных антител последовательности около 110 аминокислот вблизи N-конца значительно варьируются и, таким образом, называются вариабельными областями (Fv-области); остальные аминокислотные последовательности вблизи С-конца являются относительно стабильными и, таким образом, называются константными областями. Вариабельная область включает 3 гипервариабельные области (HVR) и 4 каркасные области (FR) с относительно консервативными последовательностями. Три гипервариабельные области определяют специфичность антитела и также известны как определяющие комплементарность области (CDR). Каждая вариабельная область легкой цепи (LCVR) или вариабельная область тяжелой цепи (HCVR) состоит из 3 CDR и 4 FR, расположенных от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Три области CDR легкой цепи обозначаются как LCDR1, LCDR2 и LCDR3, три области CDR тяжелой цепи обозначаются как HCDR1, HCDR2 и HCDR3.

Термины "полностью гуманизированное антитело", "полностью человеческое антитело", "человеческое антитело" или "абсолютно человеческое антитело", также известное как " изированную вариабельную область, так и константную область, для уполностью гуманизированное моноклональное антитело", имеют как гуманстранения иммуногенности и токсических побочных эффектов. Основные подходящие технологии для получения полностью человеческих антител включают: технологию гибридомы человека, технологию EBV-трансформированных (вирус Эпштейна-Барр) В-лимфоцитов, технологию фагового дисплея, технологию получения антител трансгенной мыши, технологию получения единичного В-клеточного антитела и тому подобное.

Термин "антигенсвязывающий фрагмент" относится к одному или более фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном. Фрагмент полноразмерного антитела может быть использован для выполнения антигенсвязывающей функции антитела. Связывающий фрагмент, включенный в "антигенсвязывающий фрагмент", выбран из группы, состоящей из Fab, Fab', F(ab')₂, одноцепочечного антитела (scFv), димеризованной V-области (диатела), стабилизированной дисульфидными связями V-области (dsFv) и антигенсвязывающих фрагментов пептидов, содержащих CDR; примеры включают (i) Fab-фрагменты, одновалентные фрагменты, состоящие из доменов VL, VH, CL и CH1; (ii) F(ab')₂-фрагменты, двухвалентные фрагменты, содержащие два Fab-фрагмента, соединенных дисульфидными мостиками в шарнирных областях; (iii) Fd-фрагменты, состоящие из доменов VH и CH1; (iv) Fv-фрагменты, состоящие из доменов VH и VL одного плеча антитела; (v) одиночные домены или dAb-фрагменты (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), состоящие из доменов VH; и (vi) изолированные определяющие комплементарность области (CDR) или (vii) комбинациях двух или более выделенных CDR, которые необязательно могут быть связаны синтетическими линкерами. Кроме того, хотя два домена фрагмента Fv, VL и VH, кодируются отдельными генами, они могут быть связаны синтетическим линкером путем рекомбинации, что позволяет ему продуцировать одну белковую цепь, в которой области VL и VH спариваются с образованием одновалентной молекулы (называемой одноцепочечной Fv (scFv); см., например, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:5879-5883). Такие одноцепочечные антитела также предназначены для включения в термин "антигенсвязывающий фрагмент" антитела. Такие фрагменты антител получают с использованием общепринятых методик, известных специалистам в данной области техники, и подвергают скринингу на пригодность таким же образом, как и интактные антитела. Антигенсвязывающие части могут быть получены с использованием технологии рекомбинантной ДНК или путем ферментативного или химического расщепления интактных иммуноглобулинов. Антитела могут быть различных изотипов, например, IgG (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 подтипа), IgA1, IgA2, IgD, IgE или IgM антитела.

В целом, Fab представляет собой фрагмент антитела, имеющий молекулярную массу около 50000 и обладающий антигенсвязывающей активностью, среди фрагментов, полученных путем обработки молекулы антитела IgG протеазой папаином (например, расщеплением аминокислотного остатка в положении 224 H-цепи), в котором часть на N-конце H-цепи объединена с L-цепью дисульфидной связью.

В целом, F(ab')₂ представляет собой фрагмент антитела, полученный путем расщепления части ниже дисульфидной связи в шарнирной области IgG ферментом пепсином. Он имеет молекулярную массу около 100000, обладает антигенсвязывающей активностью и содержит две области Fab, связанные в шарнирном положении.

В целом, Fab' представляет собой фрагмент антитела, имеющий молекулярную массу около 50000 и обладающий антигенсвязывающей активностью, который получен путем расщепления дисульфидной связи в шарнирной области F(ab')₂, как описано выше.

Кроме того, Fab' может быть получен путем вставки ДНК, кодирующей фрагмент Fab', в прокариотический или эукариотический вектор экспрессии и введения вектора в прокариотический или эукариотический организм для экспрессии Fab'.

Термин "одноцепочечное антитело", "одноцепочечное Fv" или "scFv" означает молекулу, содержащую вариабельный домен тяжелой цепи антитела (или VH) и вариабельный домен легкой цепи антитела (или VL), связанные линкером. Такие молекулы scFv имеют общую структуру: NH₂-VL-линкер-VH-COOH или NH₂-VH-линкер-VL-COOH. Подходящие линкеры в предшествующем уровне техники состоят из повторяющихся аминокислотных последовательностей GGGGS или их вариантов, например, от 1 до 4 повторяющихся вариантов (Holliger и др. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448). Другие линкеры, которые можно использовать в настоящем изобретении, описаны в Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8:725-731, Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol. 31:94-106, Hu et al. (1996), Cancer Res. 56:3055-3061, Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol. 293:41-56 и Roovers et al. (2001), Cancer Immunol.

Термин "CDR" относится к одной из 6 гипервариабельных областей в пределах вариабельного домена антитела, которые в основном способствуют связыванию антигена. В целом, существует три CDR (HCDR1, HCDR2 и HCDR3) в каждой вариабельной области тяжелой цепи и три CDR (LCDR1, LCDR2 и LCDR3) в каждой вариабельной области легкой цепи. Границы аминокислотных последовательностей CDR могут быть определены с использованием любой из множества хорошо известных схем, включая схему нумерации "Кабат" (см. Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5^th edition, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD), схему нумерации "Чотиа" (см. Al-Lazikani et al. (1997) JMB 273: 927-948) и схему нумерации ImMunoGenTics (IMGT) (Lefranc M.P., Immunologist, 7, 132-136(1999); Lefranc, M.P. et al., Dev. Comp.Immunol., 27, 55-77 (2003), и т.д.). Например, для классического формата, согласно схеме Кабата, аминокислотные остатки CDR в вариабельном домене тяжелой цепи (VH) пронумерованы как 31-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2) и 95-102 (HCDR3); аминокислотные остатки CDR в вариабельном домене легкой цепи (VL) пронумерованы как 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2) и 89-97 (LCDR3). Согласно схеме Чотиа аминокислоты CDR в VH пронумерованы как 26-32 (HCDR1), 52-56 (HCDR2) и 95-102 (HCDR3); а аминокислотные остатки в VL пронумерованы как 26-32 (LCDR1), 50-52 (LCDR2) и 91-96 (LCDR3). Согласно определениям CDR путем объединения схемы Кабата и схемы Чотиа, CDR состоит из аминокислотных остатков 26-35(HCDR1), 50-65 (HCDR2) и 95-102 (HCDR3) в человеческом VH и аминокислотных остатков 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2) и 89-97 (LCDR3) в человеческом VL. Согласно схеме IMGT, аминокислотные остатки CDR в VH примерно пронумерованы как 26-35 (CDR1), 51-57 (CDR2) и 93-102 (CDR3), а аминокислотные остатки CDR в VL примерно пронумерованы как 27-32 (CDR1), 50-52 (CDR2) и 89-97 (CDR3). Согласно схеме IMGT, CDR антитела могут быть определены с помощью программы IMGT/DomainGap Align.

Термин "каркасная область" относится к части вариабельного домена VL или VH, которая служит каркасом для антигенсвязывающих петель (CDR) вариабельного домена. Это, по существу, представляет собой вариабельный домен без CDR.

Термин "эпитоп" или "антигенная детерминанта" относится к сайту на антигене, с которым связывается иммуноглобулин или антитело. Эпитопы обычно содержат по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 смежных или несмежных аминокислот в уникальной пространственной конформации. См., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, volume 66, G.E.Morris, Ed. (1996).

Термины "специфическое связывание", "селективное связывание", "селективное связывание с" и "специфическое связывание с" относятся к связыванию антитела с эпитопом на заданном антигене. Как правило, антитело связывается с аффинностью (KD) менее чем около 10^-7 М, например, менее чем около 10^-8, 10^-9 или 10^-10 M или менее.

Термин "KD" относится к константе равновесия при диссоциации в отношении взаимодействия антитело-антиген. В целом, антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению связывается с TROP-2 или его эпитопом с константой равновесия при диссоциации (KD) менее чем около 10^-7 M, например, менее чем около 10^-8 M или 10^-9 M; например, значение KD определяют с использованием метода FACS для аффинности антитела по настоящему изобретению к антигену клеточной поверхности.

Термин "молекула нуклеиновой кислоты" относится к молекуле ДНК или молекуле РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно представляет собой двухцепочечную ДНК. Нуклеиновая кислота является "функционально связанной", когда она помещена в функциональную связь с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию кодирующей последовательности.

"Идентичность" аминокислотной последовательности относится к проценту аминокислотных остатков, разделяемых первой последовательностью и второй последовательностью, где при выравнивании аминокислотных последовательностей при необходимости вводятся гэпы для достижения максимального процента идентичности последовательности, и любая консервативная замена не рассматривается как часть идентичности последовательности. С целью определения процента идентичности аминокислотных последовательностей, выравнивания могут быть достигнуто различными способами, которые входят в область техники, например, с использованием общедоступного компьютерного программного обеспечения, такого как программное обеспечение BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области техники могут определить параметры, подходящие для измерения выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания всей длины выровненных последовательностей.

Термин "вектор экспрессии" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она была связана. В одном варианте осуществления изобретения вектор представляет собой "плазмиду", которая относится к кольцевой двухцепочечной петле ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. В другом варианте осуществления вектор представляет собой вирусный вектор, где дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. Векторы, раскрытые в настоящем документе, способны автономно реплицироваться в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальную точку начала репликации, и эписомальные векторы млекопитающих), или способны интегрироваться в геном клетки-хозяина после введения в клетку-хозяина и, таким образом, реплицироваться с геномом хозяина (например, неэписомальные векторы млекопитающих).

Способы получения и очистки антител и антигенсвязывающих фрагментов хорошо известны в данной области техники, например, описаны в главах 5-8 и 15 публикации Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем изобретении, генетически сконструированы таким образом, чтобы содержать одну или более дополнительных FR человека в CDR нечеловеческого происхождения. Последовательности зародышевой линии FR человека можно получить на веб-сайте ImMunoGeneTics (IMGT) или в журнале об иммуноглобулинах, Lefranc, G., The Immunoglobulin FactsBook, Academic Press, 2001ISBN012441351, путем сравнения с базой данных генов вариабельной области зародышевой линии человеческих антител IMGT программным обеспечением MOE.

Термин "клетка-хозяин" относится к клетке, в которую был введен вектор экспрессии. Клетки-хозяева могут включать микробные (например, бактериальные), растительные или животные клетки. Бактерии, поддающиеся трансформации, включают представителей семейства Enterobacteriaceae, такие как штаммы Escherichia coli или Salmonella; Bacillaceae, такие как Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus и Haemophilus influenzae. Подходящие микроорганизмы включают Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris. Подходящие линии клеток-хозяев животных включают CHO (линия клеток яичника китайского хомяка) и клетки NS0.

Сконструированное антитело или антигенсвязывающий фрагмент в настоящем изобретении могут быть получены и очищены обычными методами. Например, последовательности кДНК, кодирующие тяжелую и легкую цепи, можно клонировать и рекомбинировать в вектор экспрессии. Векторы экспрессии рекомбинантного иммуноглобулина могут быть стабильно трансфицированы в клетки-хозяева. В качестве более рекомендуемых в предшествующем уровне техники системы экспрессии млекопитающих приведут к гликозилированию антитела, в частности, в N-концевом сайте Fc-области. Положительные клоны размножаются в среде в биореакторе для получения антител. Культура с секретируемым антителом может быть очищена с использованием обычных методик, например, с использованием колонки A или G Sepharose FF. Неспецифически связанные фракции вымывали. Связанное антитело элюировали методом градиента рН, а фрагменты антител детектируют с помощью SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) и собирали. Антитела могут быть отфильтрованы и концентрированы обычными методами. Растворимые смеси и полимеры также могут быть удалены обычными методами, такими как молекулярные сита и ионный обмен. Полученный продукт может быть немедленно заморожен, например, при -70°C, или лиофилизирован.

Термин "пептид" относится к молекуле, образованной соединением двух или более аминокислотных молекул пептидными связями, и является структурным и функциональным фрагментом белка.

Термин "алкил" относится к насыщенной алифатической углеводородной группе, которая представляет собой линейную или разветвленную группу, содержащую от 1 до 20 атомов углерода, предпочтительно к алкилу, содержащему от 1 до 12 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12) атомов углерода, более предпочтительно к алкилу, содержащему от 1 до 10 атомов углерода, и наиболее предпочтительно к алкилу, содержащему от 1 до 6 атомов углерода (содержащему 1, 2, 3, 4, 5 или 6 атомов углерода). Неограничивающие примеры включают метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, трет-бутил, втор-бутил, н-пентил, 1,1-диметилпропил, 1,2-диметилпропил, 2,2-диметилпропил, 1-этилпропил, 2-метилбутил, 3-метилбутил, н-гексил, 1-этил-2-метилпропил, 1,1,2-триметилпропил, 1,1-диметилбутил, 1,2-диметилбутил, 2,2-диметилбутил, 1,3-диметилбутил, 2-этилбутил, 2-метилпентил, 3-метилпентил, 4-метилпентил, 2,3-диметилбутил, н-гептил, 2-метилгексил, 3-метилгексил, 4-метилгексил, 5-метилгексил, 2,3-диметилпентил, 2,4-диметилпентил, 2,2-диметилпентил, 3,3-диметилпентил, 2-этилпентил, 3-этилпентил, н-октил, 2,3-диметилгексил, 2,4-диметилгексил, 2,5-диметилгексил, 2,2-диметилгексил, 3,3-диметилгексил, 4,4-диметилгексил, 2-этилгексил, 3-этилгексил, 4-этилгексил, 2-метил-2-этилпентил, 2-метил-3-этилпентил, н-нонил, 2-метил-2-этилгексил, 2-метил-3-этилгексил, 2,2-диэтилпентил, н-децил, 3,3-диэтилгексил, 2,2-диэтилгексил и их различные изомеры с боковой цепью, и т.п. Более предпочтительно низший алкил имеет от 1 до 6 атомов углерода, и неограничивающие примеры включают метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, трет-бутил, втор-бутил, н-пентил, 1,1-диметилпропил, 1,2-диметилпропил, 2,2-диметилпропил, 1-этилпропил, 2-метилбутил, 3-метилбутил, н-гексил, 1-этил-2-метилпропил, 1,1,2-триметилпропил, 1,1-диметилбутил, 1,2-диметилбутил, 2,2-диметилбутил, 1,3-диметилбутил, 2-этилбутил, 2-метилпентил, 3-метилпентил, 4-метилпентил, 2,3-диметилбутил и т.п.Алкил может быть замещенным или незамещенным. При замещении заместитель может быть замещен в любом доступном месте соединения, где заместитель предпочтительно представляет собой одну или более из следующих групп, независимо выбранных из группы, состоящей из алкила, алкенила, алкинила, алкокси, алкилтио, алкиламино, галогена, меркапто, гидрокси, нитро, циано, циклоалкила, гетероциклоалкила, арила, гетероарила, циклоалкокси, гетероциклоалкокси, циклоалкилтио, гетероциклоалкилтио и оксо.

Термин "гетероалкил" относится к алкилу, содержащему один или более гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, O и S, где алкил является таким, как определено выше.

Термин "алкилен" относится к насыщенной линейной или разветвленной алифатической углеводородной группе, имеющей 2 остатка, полученных из исходного алкана путем удаления двух атомов водорода из одного и того же атома углерода или двух разных атомов углерода. Она представляет собой линейную или разветвленную группу, содержащую от 1 до 20 атомов углерода, предпочтительно алкилен, содержащий от 1 до 12 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12) атомов углерода, более предпочтительно алкилен, содержащий от 1 до 6 атомов углерода (содержащий 1, 2, 3, 4, 5 или 6 атомов углерода). Неограничивающие примеры алкилена включают, но не ограничиваются ими, метилен(-CH₂-), 1,1-этилиден(-CH(CH₃)-), 1,2-этилиден(-CH₂CH₂)-, 1,1-пропилиден(-CH(CH₂CH₃)-), 1,2-пропилиден(-CH₂CH(CH₃)-), 1,3-пропилиден(-CH₂CH₂CH₂-), 1,4-бутилиден(-CH₂CH₂CH₂CH₂-), 1,5-бутилиден(-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-) и т.п. Алкилен может быть замещенным или незамещенным. При замещении заместитель может быть замещен в любом доступном месте соединения одним или более заместителями, предпочтительно независимо необязательно выбранными из группы, состоящей из алкила, алкенила, алкинила, алкокси, алкилтио, алкиламино, галогена, меркапто, гидрокси, нитро, циано, циклоалкила, гетероциклила, арила, гетероарила, циклоалкокси, гетероциклоалкокси, циклоалкилтио, гетероциклоалкилтио и оксо.

Термин "алкокси" относится к группе -O-(алкил) и -O-(незамещенный циклоалкил), где алкил или циклоалкил является таким, как определено выше. Неограничивающие примеры алкокси включают метокси, этокси, пропокси, бутокси, циклопропокси, циклобутокси, циклопентилокси и циклогексилокси. Алкокси может быть необязательно замещенным или незамещенным, и когда он замещен, заместитель предпочтительно представляет собой одну или более из следующих групп, независимо выбранных из группы, состоящей из: алкила, алкенила, алкинила, алкокси, алкилтио, алкиламино, галогена, меркапто, гидрокси, нитро, циано, циклоалкила, гетероциклоалкила, арила, гетероарила, циклоалкокси, гетероциклоалкокси, циклоалкилтио и гетероциклоалкилтио.

Термин "галогеналкил" относится к алкильной группе, в которой водород замещен одним или более галогенами, где алкил является таким, как определено выше.

Термин "дейтерированный алкил" относится к алкильной группе, в которой водород замещен одним или более атомами дейтерия, где алкил является таким, как определено выше.

Термин "гидроксиалкил" относится к алкильной группе, в которой водород замещен одним или более гидрокси группами, где алкил является таким, как определено выше.

Термин "гидрокси" относится к группе -ОН.

Термин "галоген" относится к фтору, хлору, брому или иоду.

Термин "амино" относится к -NH₂.

Термин "нитро" относится к -NO₂.

Термин "циано" относится к -CN.

Настоящее изобретение также содержит различные дейтерированные формы соединения формулы (Pc-L-Y-D). Каждый доступный атом водорода, соединенный с атомом углерода, может быть независимо замещен атомом дейтерия. Специалисты в данной области техники могут синтезировать дейтерированные формы соединения общей формулы (Pc-L-Y-D) согласно соответствующей литературе. Коммерчески доступные дейтерированные исходные материалы могут быть использованы для получения дейтерированных форм соединения общей формулы (I), или они могут быть синтезированы с использованием обычных методов с дейтерированными реагентами, включая, но не ограничиваясь, дейтерированный боран, тридейтерированный боран в тетрагидрофуране, дейтерированный гидрид лития-алюминия, дейтерированный иодэтан, дейтерированный иодметан и т.п.

Термин "необязательный" или "необязательно" означает, что событие или обстоятельство, описанное впоследствии, может, но не обязательно, иметь место, и что описание включает случаи, когда событие или обстоятельство происходит или не происходит.Например, "гетероциклильная группа, необязательно замещенная алкилом" означает, что алкил может присутствовать, но не обязательно, и что описание включает случаи, когда гетероциклильная группа является или не является замещенной алкилом.

"Замещенный" означает, что один или более, предпочтительно до 5 и более предпочтительно 1, 2 или 3 атома водорода в группе независимо замещены заместителем. Заместитель находится только в своем возможном химическом положении, и специалисты в данной области техники смогут определить (экспериментально или теоретически) возможную или невозможную замену без особых усилий. Например, он может быть нестабильным, когда амино или гидрокси, имеющая свободный водород, связана с атомом углерода, имеющим ненасыщенную (например, олефиновую) связь.

Термин "фармацевтическая композиция" относится к смеси, содержащей одно или более соединений, описанных в настоящем документе, или их физиологически/фармацевтически приемлемую соль, или пролекарство и другие химические компоненты, например, физиологически/фармацевтически приемлемые носители и эксципиенты. Назначение фармацевтической композиции состоит в том, чтобы способствовать введению в организм, что облегчает абсорбцию активного ингредиента, тем самым осуществляя биологическую активность.

Термин "фармацевтически приемлемая соль" относится к соли конъюгатов антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению. Такие соли являются безопасными и эффективными при использовании у субъектов и обладают требуемой биологической активностью. Конъюгат лиганд-лекарственное средство по настоящему изобретению содержит по меньшей мере одну аминогруппу и, таким образом, может образовывать соль с кислотой. Неограничивающие примеры фармацевтически приемлемых солей включают: гидрохлорид, гидробромид, гидроиодат, сульфат, бисульфат, цитрат, ацетат, сукцинат, аскорбат, оксалат, нитрат, сорбат, гидрофосфат, дигидрофосфат, салицилат, гидроцитрат, тартрат, малеат, фумарат, формиат, бензоат, мезилат, этансульфонат, бензолсульфонат и пара-толуолсульфонат.

Термин "среднее значение нагрузки лекарственным средством" или "нагрузка лекарственным средством" относится к среднему количеству цитотоксического лекарственного средства, нагруженному на лиганд в молекулах конъюгата антитело-лекарственное средство, и также может быть выражен в терминах соотношения лекарственного средства к антителу. Нагрузка лекарственным средством может составлять от 0 до 12, предпочтительно от 1 до 10 цитотоксических лекарственных средств на лиганд (Pc). В вариантах осуществления настоящего изобретения нагрузка лекарственным средством представлена в n, которое также может быть обозначено как значение DAR (соотношение лекарственное средство-антитело), и приведенные в качестве примера значения могут быть средними значениями 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10. Среднее количество лекарственного средства на молекулу ADC после реакций сочетания может быть охарактеризовано обычными методами, такими как спектроскопия в УФ (ультрафиолетовый спектр)/видимом спектре, масс-спектрометрия, анализы ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) и HPLC (высокоэффективная жидкостная хроматография).

В одном варианте осуществления настоящего изобретения цитотоксическое лекарственное средство конъюгировано с меркаптогруппой антитела посредством линкерного фрагмента.

Нагрузка конъюгата лиганд-лекарственное средство может контролироваться следующими неограничивающими способами, включая:

(1) контроль молярного соотношения линкерного реагента к моноклональному антителу,

(2) контроль времени и температуры реакции, и

(3) выбор различных реагентов.

Для получения обычных фармацевтических композиций делается ссылка на Китайскую фармакопею.

Термин "носитель" для лекарственного средства по настоящему изобретению относится к системе, которая может изменять способ попадания лекарственного средства в организм человека и распределение лекарственного средства в организме человека, контролировать скорость высвобождения лекарственного средства и доставлять лекарственное средство в орган-мишень. Система нацеливания и высвобождения лекарственного средства из носителя может уменьшить деградацию и потерю лекарственного средства, уменьшить побочные эффекты и улучшить биодоступность. Например, полимерные поверхностно-активные вещества, которые могут быть использованы в качестве носителей, могут самостоятельно собираться благодаря своим уникальным амфифильным структурам с образованием различных форм агрегатов, таких как мицеллы, микроэмульсии, гели, жидкие кристаллы и везикулы, в качестве предпочтительных примеров. Агрегаты имеют способность инкапсулировать молекулы лекарственного средства и имеют хорошую проницаемость для мембран, и поэтому могут быть использованы как превосходные носители лекарственного средства.

Термин "вспомогательное вещество" относится к добавку, помимо основного лекарственного средства, к фармацевтической композиции. Оно также может быть обозначено как адъювант. Например, связующие вещества, наполнители, разрыхлители, смазывающие вещества в таблетках; основная часть в полутвердой мази и кремовых препаратах; консерванты, антиоксиданты, корригенты, ароматизаторы, сорастворители, эмульгаторы, солюбилизаторы, агенты, регулирующие тоничность, красители и тому подобное в жидких составах могут быть названы эксципиентами.

Термин "разбавитель", также называемый наполнителем, используется в первую очередь для увеличения массы и объема таблетки. Добавление разбавителя не только обеспечивает определенный объем, но и уменьшает отклонение дозы основных ингредиентов, а также улучшает способность лекарственного средства к прессованию и тому подобное. Когда лекарственное средство в форме таблетки содержит маслянистые компоненты, в обязательном порядке добавляют абсорбент для абсорбции маслянистых компонентов таким образом, чтобы поддерживать "сухое" состояние и, таким образом, облегчать получение таблетки. Примеры включают крахмал, лактозу, неорганические соли кальция, микрокристаллическую целлюлозу и тому подобное.

Фармацевтическая композиция может быть в форме стерильного водного раствора для инъекций. Доступные и приемлемые носители или растворители включают воду, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Стерильный препарат для инъекций может представлять собой стерильную микроэмульсию масло-в-воде для инъекций, в которой активный ингредиент растворен в масляной фазе. Например, активный ингредиент растворяют в смеси соевого масла и лецитина. Затем масляный раствор добавляют к смеси воды и глицерина и обрабатывают с образованием микроэмульсии. Инъекция или микроэмульсия может быть введена местно в кровоток субъекта в больших количествах. В качестве альтернативы, может быть целесообразным введение растворов и микроэмульсий таким образом, чтобы поддерживать постоянную циркулирующую концентрацию соединения по настоящему изобретению. Для поддержания такой постоянной концентрации может использоваться устройство для непрерывной внутривенной доставки. Примером такого устройства является насос для внутривенных инъекций Deltec CADD-PLUS. TM. 5400.

Фармацевтическая композиция может быть в форме стерильной водной или масляной суспензии для инъекции для внутримышечного и подкожного введения. Суспензия может быть получена в соответствии с предшествующим уровнем техники с использованием подходящих диспергаторов или увлажняющих агентов и суспендирующих агентов, упомянутых выше. Стерильный состав для инъекции также может представлять собой стерильную инъекцию или суспензию, полученную в парентерально приемлемом нетоксичном разбавителе или растворителе, например, растворе, полученном в 1,3-бутандиоле. Кроме того, стерильное нелетучее масло может обычно использоваться в качестве растворителя или суспендирующей среды. Для этой цели может быть использована любая смесь нелетучего масла, включая синтетические моноглицериды или диглицериды. Кроме того, в подготовке инъекции могут быть использованы жирные кислоты, такие как олеиновая кислота.

2. Способ синтеза

Для целей синтеза приняты следующие технические схемы синтеза.

Способ получения соединения общей формулы (Pc-L_a-Y-D) включает следующие стадии:

подвергание реакции сочетания восстановленного Pc и общей формулы (L_a-Y-D) с получением соединения общей формулы (Pc-L_a-Y-D), где восстановитель предпочтительно представляет собой TCEP (трис(2-карбоксиэтил)фосфин); в частности, дисульфидные связи в антителе предпочтительно являются восстановленными;

где:

Pc, W, L², L³, R¹, R², R⁵, R⁶, R⁷, m и n являются такими, как определено в вышеупомянутой общей формуле (Pc-L_a-Y-D).

Один или более вариантов осуществления настоящего изобретения подробно раскрыты в описании выше. Хотя любые способы и материалы, подобные или идентичные описанным здесь, могут быть использованы для осуществления или тестирования настоящего изобретения, предпочтительные способы и материалы описаны ниже. Другие признаки, назначения и преимущества изобретения будут очевидны из описания и формулы изобретения. В описании и формуле изобретения формы единственного числа включают множественное число, если иное четко не указано в контексте. Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют общие значения, понятные специалисту в данной области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение. Все патенты и публикации, цитируемые в описании, включены посредством ссылки. Следующие примеры приведены для того, чтобы более полно проиллюстрировать предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения. Эти примеры не следует никоим образом истолковывать как ограничивающие объем настоящего изобретения, который определен формулой изобретения.

Примеры

Экспериментальные процедуры без конкретных условий, указанных в следующих примерах и тестовых примерах, обычно проводят в соответствии с обычными условиями или в соответствии с условиями, рекомендованными производителями исходных материалов или коммерческих продуктов, см. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; CurrentProtocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Greene Publishing Association, Wiley Interscience, NY. Реагенты без указания конкретного происхождения являются коммерчески доступными обычными реагентами.

1. Получение антитела

Пример 1-1. Конструирование штамма клеток с высокой экспрессией TROP-2

Лентивирусные экспрессионные векторные плазмиды pCDH-hTROP-2, векторы упаковки лентивирусной системы pVSV-G и pCMV-dR8.91, трансфицировали в клетки 293T вирусной упаковки с использованием трансфекционного реагента Lipofectamine 3000. Супернатант среды, содержащий вирусы, собирали, фильтровали и центрифугировали на сверхвысокой скорости. Клетки яичника китайского хомяка CHO-K1 инфицировали концентрированным вирусом, подвергали скринингу с использованием пуромицина в течение двух-трех недель и подвергали сортировке одиночных клеток FACS (метод анализа сортировки клеток с активированной флуоресценцией).

По уровню экспрессии TROP-2 на поверхности клеток CHO-K1, инфицированных лентивирусом, определенному FACS, были отобраны штаммы моноклональных клеток CHO-K1/hTROP-2 с высокой экспрессией TROP-2.

Аминокислотная последовательность TROP-2 (Genbank: NP_002344.2) выглядит следующим образом:

MARGPGLAPPPLRLPLLLLVLAAVTGHTAAQDNCTCPTNKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCSTLTSKCLLLKARMSAPKNARTLVRPSEHALVDNDGLYDPDCDPEGRFKARQCNQTSVCWCVNSVGVRRTDKGDLSLRCDELVRTHHILIDLRHRPTAGAFNHSDLDAELRRLFRERYRLHPKFVAAVHYEQPTIQIELRQNTSQKAAGDVDIGDAAYYFERDIKGESLFQGRGGLDLRVRGEPLQVERTLIYYLDEIPPKFSMKRLTAGLIAVIVVVVVALVAGMAVLVITNRRKSGKYKKVEIKELGELRKEPSL

SEQ ID NO: 1;

Аминокислотная последовательность Trop2-His:

MARGPGLAPPPLRLPLLLLVLAAVTGHTAAQDNCTCPTNKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCSTLTSKCLLLKARMSAPKNARTLVRPSEHALVDNDGLYDPDCDPEGRFKARQCNQTSVCWCVNSVGVRRTDKGDLSLRCDELVRTHHILIDLRHRPTAGAFNHSDLDAELRRLFRERYRLHPKFVAAVHYEQPTIQIELRQNTSQKAAGDVDIGDAAYYFERDIKGESLFQGRGGLDLRVRGEPLQVERTLIYYLDEIPPKFSMKRLTAGLIAVIVVVVVALVAGMAVLVITNRRKSGKYKKVEIKELGELRKEPSLHHHHHH

SEQ ID NO: 2.

Пример 1-2. Получение моноклонального антитела к TROP-2 человека

Моноклональное антитело к TROP-2 человека в настоящей заявке получали в соответствии со способом, раскрытым в WO03074566, и дизайн модификации сайта мутации проводили на CDR с использованием компьютерного программного обеспечения и принятием гена вариабельной области антитела hRS7 в качестве матрицы. Ген вариабельной области антитела вставляли в вектор экспрессии белка Phr-IgG (с сигнальным пептидом и фрагментом гена константной области (CH1-Fc/CL)) путем молекулярного клонирования, а затем экспрессировали в клетках HEK293 и Expi-CHO-S. Очистку антител проводили в соответствии с обычным способом. Проверку активности проводили с использованием клеток CHO-K1 и белка huTROP-2 (номер доступа His27-Thr274 NP_002344.2), сверхэкспрессирующих белок huTROP-2, и было выбрано антитело с лучшей активностью связывания мишени, где последовательность вариабельной области PD3 является следующей:

Вариабельная область тяжелой цепи PD3:

EVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLKWMGWINTYTGEPTYTQDFKGRFAFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARGGFGSSYWYFDVWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO: 3;

Вариабельная область легкой цепи PD3:

DIQLTQSPSSLSASVGDRVSITCKASQDVSIAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQHYITPLTFGAGTKVEIK

SEQ ID NO: 4;

Примечание: подчеркнутые части являются CDR, определенными по схеме нумерации Кабата.

Таблица 1. CDR антител к PD3 Антитела PD3 CDR1 тяжелой цепи NYGMN (SEQ ID NO: 5) CDR2 тяжелой цепи WINTYTGEPTYTQDFKG (SEQ ID NO: 6) CDR3 тяжелой цепи GGFGSSYWYFDV (SEQ ID NO: 7) CDR1 легкой цепи KASQDVSIAVA (SEQ ID NO: 8) CDR2 легкой цепи SASYRYT (SEQ ID NO: 9) CDR3 легкой цепи QQHYITPLT (SEQ ID NO: 10)

Константная область тяжелой цепи антитела может быть выбрана из константных областей IgG1, IgG2, IgG4 человека и их вариантов, а константная область легкой цепи антитела может быть выбрана из константных областей легкой цепи κ- и λ-цепей человека и их вариантов. В качестве примера, константная область тяжелой цепи антитела выбрана из константной области IgG1 человека, имеющей последовательность, представленную в SEQ ID NO: 11, и константная область легкой цепи антитела выбрана из константной области κ-цепи человека, имеющей последовательность, представленную в SEQ ID NO: 12.

Константная область тяжелой цепи IgG1 человека:

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 11;

Гуманизированная константная область легкой цепи κ:

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 12;

В качестве примера, константные области легкой/тяжелой цепи, описанные выше, объединяют с вариабельными областями вышеупомянутого антитела PD3 с образованием полного антитела, последовательности легкой/тяжелой цепи которого являются следующими:

Тяжелая цепь PD3:

EVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLKWMGWINTYTGEPTYTQDFKGRFAFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARGGFGSSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 13;

Легкая цепь PD3:

DIQLTQSPSSLSASVGDRVSITCKASQDVSIAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQHYITPLTFGAGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 14;

Контрольная молекула hRS7, используемая в настоящем изобретении, сконструирована со ссылкой на патент WO03074566, а антитело к TINA сконструировано со ссылкой на патент WO2015098099a1, последовательности которых являются следующими:

Тяжелая цепь hRS7:

QVQLQQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLKWMGWINTYTGEPTYTDDFKGRFAFSLDTSVSTAYLQISSLKADDTAVYFCARGGFGSSYWYFDVWGQGSLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 15;

Легкая цепь hRS7:

DIQLTQSPSSLSASVGDRVSITCKASQDVSIAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQHYITPLTFGAGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 16;

Тяжелая цепь TINA:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTAGMQWVRQAPGQGLEWMGWINTHSGVPKYAEDFKGRVTISADTSTSTAYLQLSSLKSEDTAVYYCARSGFGSSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 17;

Легкая цепь TINA:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQHYITPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 18.

2. Получение соединений

Экспериментальные процедуры без условий, указанные в примерах настоящего изобретения, как правило, проводили в соответствии с общепринятыми условиями или в соответствии с условиями, рекомендованными производителем исходных материалов или коммерческих продуктов. Реагенты без указания конкретного происхождения являются коммерчески доступными обычными реагентами.

Структуру соединений идентифицировали с помощью ядерного магнитного резонанса (NMR) или масс-спектрометрии (MS). Спектры NMR измеряли с использованием прибора для ядерного магнитного резонанса Bruker AVANCE-400, с дейтерированным диметилсульфоксидом (DMSO-d6), дейтерированным хлороформом (CDCl₃) и дейтерированным метанолом (CD₃OD) в качестве растворителей и тетраметилсиланом (ТМС) в качестве внутреннего стандарта. Химические сдвиги приведены в единицах измерения 10^-6 (ч./млн).

MS-анализ проводили с использованием масс-спектрометра FINNIGAN LCQAd (ESI) (производитель: Thermo, модель: Finnigan LCQ advantage MAX).

Анализ UPLC (сверхэффективная жидкостная хроматография) проводили с использованием системы жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии Waters Acquity UPLC SQD.

Анализ UPLC проводили с использованием жидкостного хроматографа Agilent 1200DAD высокого давления (хроматографическая колонка Sunfire C18 150×4,6 мм) и жидкостного хроматографа Waters 2695-2996 высокого давления (хроматографическая колонка Gimini C18 150×4,6 мм).

Анализ UV-HPLC (высокоэффективная жидкостная хроматография с использованием УФ (ультрафиолет) детектора) проводили с использованием ультрафиолетового спектрофотометра Thermo nanodrop2000.

Степень ингибирования пролиферации и значения IC₅₀ (концентрация полумаксимального ингибирования) измеряли с помощью считывающего устройства для микропланшетов PHERA starFS (BMG, Германия).

Силикагелевые пластины Huanghai HSGF254 или Qingdao GF254 со спецификациями от 0,15 мм до 0,2 мм применяли для тонкослойной хроматографии (TLC) и от 0,4 мм до 0,5 мм для разделения и очистки TLC.

Силикагель Yantai Yellow Sea 200-300 меш обычно использовали в качестве носителя в колоночной хроматографии.

Известные исходные материалы по настоящему изобретению могут быть синтезированы с использованием или в соответствии со способами, известными в данной области техники, или могут быть приобретены у ABCR GmbH & Co.KG, Acros Organnics, Aldrich Chemical Company, Accela ChemBio Inc, Chembee Chemicals и т.д.

В примерах все реакции проводили в атмосфере аргона или в атмосфере азота, если не указано иное.

Атмосфера аргона или атмосфера азота означает, что реакционная колба соединена с баллоном, содержащим около 1 л аргона или азота.

Атмосфера водорода означает, что реакционная колба соединена с баллоном, содержащим около 1 л водорода.

Гидрогенизатор Parr 3916EKX, гидрогенизатор Qinglan QL-500 или гидрогенизатор HC2-SS использовали в реакциях гидрирования под давлением.

Реакция гидрирования обычно включает 3 цикла вакуумирования и продувки водородом.

Для микроволновой реакции использовали микроволновый реактор CEM Discover-S 908860.

В примерах раствор в реакции относится к водному раствору, если не указано иное.

В примерах температура реакции представляет собой комнатную температуру, если не указано иное.

Комнатная температура является оптимальной температурой реакции, которая находится в диапазоне от 20 до 30°C.

Получение буфера PBS (фосфатно-солевой буфер) при рН 6,5 в примерах: 8,5 г KH₂PO₄, 8,56 г K₂HPO₄·3H₂O, 5,85 г NaCl и 1,5 г EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) добавляли в колбу, и объем доводили до 2 л. Все добавления растворяли ультразвуком, и раствор хорошо перемешивали путем встряхивания с получением требуемого буфера.

Элюирующая система для колоночной хроматографии и система проявляющего растворителя для тонкослойной хроматографии, используемая для очистки соединения, включают: A: дихлорметанольную и изопропанольную систему, B: дихлорметанольную и метанольную систему и C: петролейноэфирную и этилацетатную систему. Объемное соотношение растворителей корректировали в соответствии с полярностью соединения или добавляли небольшое количество триэтиламина и кислотного или основного реагента.

Некоторые из соединений по настоящему изобретению характеризовали с помощью анализа Q-TOF LC/MS (жидкостная хроматография с масс-спектрометрией). Для анализа Q-TOF LC/MS применяли квадрупольный времяпролетный масс-спектрометр Agilent 6530 с точной массой и сверхвысокоэффективным жидкостным хроматографом Agilent 1290-Infinity (хроматографическая колонка Agilent Poroshell 300SB-C8 5 мкм, 2,1×75 мм).

Лекарственная часть Y-D конъюгатов антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению раскрыта в PCT/CN2019/107873, и синтез и тесты соответствующих соединений включены в настоящий документ посредством ссылки. Неограничивающие примеры синтеза включены посредством ссылки следующим образом:

Пример 2-1

N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)-1-гидроксициклопропан-1-карбоксамид 1

К экзатеканмезилату 1b (2,0 мг, 3,76 мкмоль, полученному, как описано в патентной заявке "EP0737686A1") добавляли 1 мл N,N-диметилформамида. Смесь охлаждали до 0-5°C на ледяной водяной бане и добавляли по каплям триэтиламин. Реакционную смесь перемешивали, пока она не становилась прозрачной. К реакционной смеси последовательно добавляли 1-гидроксициклопропилкарбоновую кислоту 1а (1,4 мг, 3,7 мкмоль, полученную известным способом "Tetrahedron Letters, 25(12), 1269-72; 1984") и 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорид (3,8 мг, 13,7 мкмоль). После добавления реакционную смесь перемешивали при 0-5°C в течение 2 часов, гасили 5 мл воды и экстрагировали этилацетатом (8 мл × 3). Органические фазы объединяли, промывали насыщенным раствором хлорида натрия (5 мл × 2), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении и полученный остаток очищали с помощью тонкослойной хроматографии с помощью системы B проявляющего растворителя с получением указанного в заголовке продукта 1 (1,6 мг, выход 82,1%).

МС m/z (ESI): 520,2 [M+1].

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃): δ 7,90-7,84 (m, 1H), 7,80-7,68 (m, 1H), 5,80-5,70 (m, 1H), 5,62-5,54 (m, 2H), 5,44-5,32 (m, 2H), 5,28-5,10 (m, 2H), 3,40-3,15 (m, 3H), 2,44 (s, 3H), 2,23(t, 1H), 2,06-1,75 (m, 2H), 1,68-1,56 (m, 1H), 1,22-1,18 (m, 2H), 1,04-0,98 (m, 2H), 0,89 (t, 3H).

Пример 2-2

(S)-2-циклопропил-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)-2-гидроксиацетамид 2-A

(R)-2-циклопропил-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)-2-гидроксиацетамид 2-B

К 1b (4 мг, 7,53 мкмоль) добавляли 2 мл этанола и 0,4 мл N,N-диметилформамида. Систему трижды продували аргоном, и смесь охлаждали до 0-5°C на ледяной водяной бане с последующим добавлением по каплям 0,3 мл N-метилморфолина. Реакционную смесь перемешивали, пока она не становилась прозрачной. К реакционной смеси последовательно добавляли 2-циклопропил-2-гидроксиуксусную кислоту 2а (2,3 мг, 19,8 мкмоль, полученную, как описано в патентной заявке "WO2013106717"), 1-гидроксибензотриазол (3 мг, 22,4 мкмоль) и 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид гидрохлорид (4,3 мг, 22,4 мкмоль). После добавления реакционную смесь перемешивали при 0-5°C в течение 1 часа. Ледяную водяную баню удаляли, и реакционную смесь нагревали до 30°С, перемешивали в течение 2 ч и концентрировали при пониженном давлении. Полученное неочищенное соединение 2 очищали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (условия разделения: хроматографическая колонка: XBridge Prep C18 OBD 5 мкм 19 × 250 мм; подвижная фаза: A - вода (10 ммоль NH₄OAc), B - ацетонитрил, градиентное элюирование, скорость потока: 18 мл/мин), и соответствующие фракции собирали и концентрировали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке продукта (2-A: 1,5 мг, 2-B: 1,5 мг).

MS m/z (ESI (ионизация электроспреем): 534,0 [M+1].

Соединение с единственной конфигурацией 2-B (меньшее время удерживания)

Анализ UPLC: время удерживания: 1,06 мин; чистота: 88% (хроматографическая колонка: ACQUITY UPLC BEHC18 1,7 мкм 2,1×50 мм; подвижная фаза: A - вода (5 ммоль NH₄OAc), B - ацетонитрил).

¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆): δ 8,37 (d, 1H), 7,76 (d, 1H), 7,30 (s, 1H), 6,51 (s, 1H), 5,58-5,56 (m, 1H), 5,48 (d, 1H), 5,41 (s, 2H), 5,32-5,29 (m, 2H), 3,60 (t, 1H), 3,19-3,13 (m, 1H), 2,38 (s, 3H), 2,20-2,14 (m, 1H), 1,98 (q, 2H), 1,87-1,83 (m, 1H), 1,50-1,40 (m, 1H), 1,34-1,28 (m, 1H), 0,86 (t, 3H), 0,50-0,39 (m, 4H).

Соединение с единственной конфигурацией 2-A (большее время удерживания)

Анализ UPLC: время удерживания: 1,10 мин; чистота: 86% (хроматографическая колонка: ACQUITY UPLC BEHC18 1,7 мкм 2,1×50 мм; подвижная фаза: A - вода (5 ммоль NH₄OAc), B - ацетонитрил).

¹H ЯМР(400 МГц, DMSO-d₆): δ 8,35 (d, 1H), 7,78 (d, 1H), 7,31 (s, 1H), 6,52 (s, 1H), 5,58-5,53 (m, 1H), 5,42 (s, 2H), 5,37 (d, 1H), 5,32 (t, 1H), 3,62 (t, 1H), 3,20-3,15 (m, 2H), 2,40 (s, 3H), 2,25-2,16 (m, 1H), 1,98 (q, 2H), 1,87-1,82 (m, 1H), 1,50-1,40 (m, 1H), 1,21-1,14 (m, 1H), 0,87 (t, 3H), 0,47-0,35 (m, 4H).

Пример 2-3

(S)-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)-3,3,3-трифтор-2-гидроксипропионамид 3-A

(R)-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)-3,3,3-трифтор-2-гидроксипропионамид 3-B

К 1b (5,0 мг, 9,41 мкмоль) добавляли 2 мл этанола и 0,4 мл N,N-диметилформамида, и смесь охлаждали до 0-5°C на ледяной водяной бане с последующим добавлением по каплям 0,3 мл N-метилморфолина. Реакционную смесь перемешивали, пока она не становилась прозрачной. К реакционной смеси последовательно добавляли 3,3,3-трифтор-2-гидроксипропионовую кислоту 3a (4,1 мг, 28,4 мкмоль, поставляемый Alfa), 1-гидроксибензотриазол (3,8 мг, 28,1 мкмоль) и 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид гидрохлорид (5,4 мг, 28,2 мкмоль). После добавления реакционную смесь перемешивали при 0-5°C в течение 10 минут. Ледяную водяную баню удаляли, и реакционную смесь нагревали до 30°C, перемешивали в течение 8 часов и концентрировали при пониженном давлении. Полученное неочищенное соединение 3 очищали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (условия разделения: хроматографическая колонка: XBridge Prep C18 OBD 5 мкм 19 × 250 мм; подвижная фаза: A - вода (10 ммоль NH₄OAc), B - ацетонитрил, градиентное элюирование, скорость потока: 18 мл/мин), и соответствующие фракции собирали и концентрировали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке продукта (1,5 мг, 1,5 мг).

МС m/z (ESI): 561,9 [M+1].

Соединение с единственной конфигурацией (меньшее время удерживания)

Анализ UPLC: время удерживания: 1,11 мин; чистота: 88% (хроматографическая колонка: ACQUITY UPLC BEHC18 1,7 мкм 2,1×50 мм; подвижная фаза: A - вода (5 ммоль NH₄OAc), B - ацетонитрил).

¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆): δ 8,94 (d, 1H), 7,80 (d, 1H), 7,32 (s, 1H), 7,20 (d, 1H), 6,53 (s, 1H), 5,61-5,55 (m, 1H), 5,45-5,23 (m, 3H), 5,15-5,06 (m, 1H), 4,66-4,57 (m, 1H), 3,18-3,12 (m, 1H), 2,40 (s, 3H), 2,26-2,20 (m, 1H), 2,16-2,08 (m, 1H), 2,02-1,94 (m, 1H), 1,89-1,82 (m, 1H), 1,50-1,40 (m, 1H), 0,87 (t, 3H).

Соединение с единственной конфигурацией (большее время удерживания)

Анализ UPLC: время удерживания: 1,19 мин; чистота: 90% (хроматографическая колонка: ACQUITY UPLC BEHC18 1,7 мкм 2,1×50 мм; подвижная фаза: A - вода (5 ммоль NH₄OAc), B - ацетонитрил).

¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ 8,97 (d, 1H), 7,80 (d, 1H), 7,31 (s, 1H), 7,16 (d, 1H), 6,53 (s, 1H), 5,63-5,55 (m, 1H), 5,45-5,20 (m, 3H), 5,16-5,07 (m, 1H), 4,66-4,57 (m, 1H), 3,18-3,12 (m, 1H), 2,40 (s, 3H), 2,22-2,14 (m, 1H), 2,04-1,95 (m, 2H), 1,89-1,82 (m, 1H), 1,50-1,40 (m, 1H), 0,87 (t, 3H).

Пример 2-4

N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)-1-гидроксициклопентан-1-карбоксамид 4

К 1b (3,0 мг, 5,64 мкмоль) добавляли 1 мл N,N-диметилформамида. Смесь охлаждали до 0-5°C на ледяной водяной бане и добавляли по каплям триэтиламина. Реакционную смесь перемешивали, пока она не становилась прозрачной. К реакционной смеси последовательно добавляли 1-гидрокси-циклопентанкарбоновую кислоту 4a (2,2 мг, 16,9 мкмоль, полученную, как описано в патентной заявке "WO2013106717") и 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиний хлорид (4,7 мг, 16,9 мкмоль). После добавления реакционную смесь перемешивали при 0-5°C в течение 1 часа, гасили 5 мл воды и экстрагировали этилацетатом (10 мл × 3). Органические фазы объединяли, промывали насыщенным раствором хлорида натрия (5 мл × 2), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении и полученный остаток очищали с помощью тонкослойной хроматографии с помощью системы B проявляющего растворителя с получением указанного в заголовке продукта 4 (2,5 мг, выход 80,9%).

МС m/z (ESI): 548,0 [M+1].

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃): δ 7,73-7,62 (м, 2H), 5,75-5,62 (м, 1H), 5,46-5,32 (м, 2H), 5,26-5,10 (м, 1H), 3,30-3,10 (м, 1H), 2,43 (с, 3H), 2,28-2,20 (м, 2H), 2,08-1,84 (м, 8H), 1,69-1,58 (м, 2H), 1,04-1,00 (м, 2H), 0,89 (т, 3H).

Пример 2-5

N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)-1-(гидроксиметил)циклопропан-1-карбоксамид 5

К 1b (2,0 мг, 3,76 мкмоль) добавляли 1 мл N,N-диметилформамида. Смесь охлаждали до 0-5°C на ледяной водяной бане и добавляли по каплям триэтиламина. Реакционную смесь перемешивали, пока она не становилась прозрачной. К реакционной смеси последовательно добавляли 1-(гидроксиметил)-циклопентанкарбоновую кислоту 5a (0,87 мг, 7,5 мкмоль, полученную, как описано в патентной заявке "WO201396771") и 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорид (2 мг, 7,24 мкмоль). После добавления реакционную смесь перемешивали при 0-5°C в течение 2 часов, гасили 5 мл воды и экстрагировали этилацетатом (8 мл × 3). Органические фазы объединяли, промывали насыщенным раствором хлорида натрия (5 мл × 2), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении и полученный остаток очищали с помощью тонкослойной хроматографии с помощью системы B проявляющего растворителя с получением указанного в заголовке продукта 5 (1,0 мг, выход 50%).

МС m/z (ESI): 533,9 [M+1].

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃): δ 8,07 (s, 1H), 7,23-7,18 (m, 2H), 6,71-6,64 (m, 1H), 6,55-6,51 (m, 1H), 5,36-5,27 (m, 2H), 4,67-4,61 (m, 2H), 3,53-3,48 (m, 1H), 3,30-3,22 (m, 2H), 3,18-3,13 (m, 1H), 2,71-2,61 (m, 2H), 2,35-2,28 (m, 1H), 2,04-1,91 (m, 4H), 1,53-1,40 (m, 3H), 0,91-0,75 (m, 4H).

Пример 2-6

N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)-1-(гидроксиметил)циклобутан-1-карбоксамид 6

К 1b (3,0 мг, 5,64 мкмоль) добавляли 1 мл N,N-диметилформамида. Смесь охлаждали до 0-5°C на ледяной водяной бане и добавляли по каплям триэтиламина. Реакционную смесь перемешивали, пока она не становилась прозрачной. К реакционной смеси последовательно добавляли 1-(гидроксиметил)циклобутан-1-карбоновую кислоту 6a (2,2 мг, 16,9 мкмоль, полученную, как описано в "Journal of the American Chemical Society, 2014, vol. 136, #22, p.8138-8142") и 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорид (4,7 мг, 16,9 мкмоль). После добавления реакционную смесь перемешивали при 0-5°C в течение 1 часа, гасили 5 мл воды и экстрагировали этилацетатом (10 мл × 3). Органические фазы объединяли, промывали насыщенным раствором хлорида натрия (5 мл × 2), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении и полученный остаток очищали с помощью тонкослойной хроматографии с помощью системы B проявляющего растворителя с получением указанного в заголовке продукта 6 (2,1 мг, выход 67,9%).

МС m/z (ESI): 548,0 [M+1].

¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆): δ 7,85-7,62 (м, 1H), 6,88 (бр, 1H), 5,87-5,48 (м, 2H), 5,47-5,33 (м, 1H), 5,31-5,06 (м, 1H), 4,25-3,91 (м, 2H), 3,25 (бр, 1H), 2,60-2,32 (м, 3H), 2,23 (т, 1H), 2,15-1,95 (м, 3H), 1,70-1,56 (м, 2H), 1,41-1,17 (м, 9H), 1,03 (с, 1H), 0,95-0,80 (м, 2H).

Пример 2-7

N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)-1-гидроксициклопентан-1-карбоксамид 7

К 1b (3,0 мг, 5,64 мкмоль) добавляли 2 мл этанола и 0,4 мл N,N-диметилформамида, и смесь охлаждали до 0-5°C на ледяной водяной бане с последующим добавлением по каплям 0,3 мл N-метилморфолина. Реакционную смесь перемешивали, пока она не становилась прозрачной. К реакционной смеси последовательно добавляли 1-гидроксициклобутанкарбоновую кислоту 7а (2,0 мг, 17,22 мкмоль, поставляемый PharmaBlock), 1-гидроксибензотриазол (2,3 мг, 17,0 мкмоль) и 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида гидрохлорид (3,2 мг, 16,7 мкмоль). После добавления реакционную смесь перемешивали при 0-5°C в течение 10 минут. Ледяную водяную баню удаляли, и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов и концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали с помощью тонкослойной хроматографии с системой В проявляющего растворителя с получением указанного в заголовке продукта 7 (2,5 мг, выход 83,1%).

MS m/z (ESI (ионизация электроспреем): 534,0 [M+1].

¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆): δ 8,28 (d, 1H), 7,75 (d, 1H), 7,29 (s, 1H), 6,51 (s, 1H), 6,12 (s, 1H), 5,59-5,51 (m, 1H), 5,41 (s, 2H), 5,20-5,01 (m, 2H), 3,27-3,17 (m, 1H), 3,15-3,05 (m, 1H), 2,71-2,63 (m, 1H), 2,37 (s, 3H), 2,12-2,05 (m, 1H), 2,03-1,94 (m, 2H), 1,92-1,78 (m, 4H), 1,50-1,42 (m, 1H), 0,90-0,83 (m, 4H).

Пример 2-8

1-(((S)-7-бензил-20-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-3,6,9,12,15-пентаоксо-2,5,8,11,14-пентаазеикозил)окси)-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)циклопропан-1-карбоксамид 8

Стадия 1

Бензил-1-((2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)ацетамидо)метокси)циклопропан-1-карбоксилат 8c

Бензил-1-гидроксициклопропан-1-карбоксилат 8a (104 мг, 0,54 ммоль; полученный, как описано в патентной заявке "US2005/20645") и 2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)ацетамидо)метилацетат 8b (100 мг, 0,27 ммоль; полученный, как описано в патентной заявке "CN105829346A") добавляли в реакционную колбу и добавляли 5 мл тетрагидрофурана. Систему трижды продували аргоном и охлаждали смесь до 0-5°C на ледяной водяной бане с последующим добавлением трет-бутоксида калия (61 мг, 0,54 ммоль). Ледяную баню удаляли, и реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 10 минут с последующим добавление 20 мл ледяной воды и экстракцией этилацетатом (5 мл × 2) и хлороформом (5 мл × 5). Органические фазы объединяли и концентрировали. Полученный остаток растворяли в 3 мл 1,4-диоксана с последующим добавлением 0,6 мл воды, бикарбоната натрия (27 мг, 0,32 ммоль) и 9-фторенилметилхлорформиата (70 мг, 0,27 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Добавляли 20 мл воды с последующей экстракцией этилацетатом (8 мл × 3). Органическую фазу промывали насыщенным раствором хлорида натрия (20 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении и полученный остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле с помощью системы B проявляющего растворителя с получением указанного в заголовке продукта 8c (100 мг, выход 73,6%).

МС m/z (ESI): 501,0 [M+1].

Стадия 2

1-((2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)ацетамидо)метокси)циклопропан-1-карбоноваякислота 8d

8c (50 мг, 0,10 ммоль) растворяли в 3 мл смеси растворителей тетрагидрофурана и этилацетата (V:V=2:1) и добавляли палладий на угле (25 мг, 10% нагрузка). Систему трижды продували водородом, и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Реакционную смесь фильтровали через целит, а осадок на фильтре промывали тетрагидрофураном. Фильтрат концентрировали с получением указанного в заголовке продукта 8d (41 мг, выход 100%).

МС m/z (ESI): 411,0 [M+1].

Стадия 3

(9H-флуорен-9-ил)метил(2-(((1-((1S,9S) -9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[де]пирано [3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)аминокарбонил)циклопропокси)метил) амино)-2-оксоэтил)карбамат 8e

1b (7 мг, 0,013 ммоль) добавляли в реакционную колбу и добавляли 1 мл N,N-диметилформамида. Систему трижды продували аргоном и охлаждали смесь до 0-5°C на ледяной водяной бане с последующим добавлением капли триэтиламина, раствора 8d (7 мг, 0,017 ммоль) в 0,5 мл N,N-диметилформамида и 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорида (7 мг, 0,026 ммоль). Реакционную смесь перемешивали на ледяной бане в течение 35 мин. Добавляли 10 мл воды с последующей экстракцией этилацетатом (5 мл × 3). Органические фазы объединяли, промывали насыщенным раствором хлорида натрия (10 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении и полученный остаток очищали с помощью тонкослойной хроматографии с помощью системы B проявляющего растворителя с получением указанного в заголовке продукта 8e (8,5 мг, выход 78,0%).

МС m/z (ESI): 828,0 [M+1].

Стадия 4

1-((2-аминоацетиламино)метокси)-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)циклопропан-1-карбоксамид 8f

8e (4 мг, 4,84 мкмоль) растворяли в 0,2 мл дихлорметана и добавляли 0,1 мл диэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч и концентрировали при пониженном давлении. Добавляли 2 мл толуола с последующим концентрированием при пониженном давлении; процедуры повторяли дважды. Остаток суспендировали с 3 мл н-гексана и удаляли верхний слой н-гексана; процедуры повторяли три раза. Суспензию концентрировали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке неочищенного продукта 8f (2,9 мг), который непосредственно использовали на следующей стадии без очистки.

МС m/z (ESI): 606,0 [M+1].

Стадия 5

1-(((S)-7-бензил-20-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-3,6,9,12,15-пентаоксо-2,5,8,11,14-пентаазеикозил)окси)-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)циклопропан-1-карбоксамид 8

Неочищенный 8f (2,9 мг, 4,84 мкмоль) растворяли в 0,5 мл N,N-диметилформамида. Систему трижды продували аргоном, и раствор охлаждали до 0-5°C на ледяной водяной бане. Добавляли раствор (S)-2(-2-(-2-(6-(2,5-диоксо-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)ацетиламино)ацетиламино)-3-фенилпропионовой кислоты 8 г (2,7 мг, 5,80 мкмоль, полученный, как описано в патентной заявке "EP2907824") в 0,3 мл N,N-диметилформамида с последующим добавлением 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиний хлорида (2,7 мг, 9,67 мкмоль). Реакционную смесь перемешивали на ледяной бане в течение 30 мин. Затем ледяную баню удаляли, и реакционную смесь нагревали до комнатной температуры, перемешивали в течение 15 мин и очищали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (условия разделения: хроматографическая колонка: XBridge Prep C18 OBD 5 мкм 19 × 250 мм; подвижная фаза: A - вода (10 ммоль NH₄OAc), B - ацетонитрил, градиентное элюирование, скорость потока: 18 мл/мин). Соответствующие фракции собирали и концентрировали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке продукта 8 (2 мг, выход 39,0%).

МС m/z (ESI): 1060,0 [M+1].

¹H ЯМР (400 MHz, DMSO-d₆): δ 9,01 (d, 1H), 8,77 (t, 1H), 8,21 (t, 1H), 8,08-7,92 (m, 2H), 7,73 (d, 1H), 7,28 (s, 1H), 7,24-7,07 (m, 4H), 6,98 (s, 1H), 6,50 (s, 1H), 5,61 (q, 1H), 5,40 (s, 2H), 5,32 (t, 1H), 5,12 (q, 2H), 4,62 (t, 1H), 4,52 (t, 1H), 4,40-4,32 (m, 1H), 3,73-3,47 (m, 8H), 3,16-3,04 (m, 2H), 2,89 (dd, 1H), 2,69-2,55 (m, 2H), 2,37-2,23 (m, 4H), 2,12-1,93 (m, 4H), 1,90-1,74 (m, 2H), 1,52-1,38 (m, 4H), 1,33-1,11 (m, 5H), 0,91-0,81 (m, 4H).

Пример 2-9

N-((2R,10S)-10-бензил-2-циклопропил-1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)амино)-1,6,9,12,15-пентаоксо-3-окса-5,8,11,14-тетраазагексадекан-16-ил)-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамид 9-A

N-((2S,10S)-10-бензил-2-циклопропил-1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)амино)-1,6,9,12,15-пентаоксо-3-окса-5,8,11,14-тетраазагексадекан-16-ил)-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамид 9-B

Стадия 1

Бензил-2-циклопропил-2-гидроксиацетат 9a

2a (1,3 г, 11,2 ммоль; полученный, как описано в патентной заявке "WO2013/106717") растворяли в 50 мл ацетонитрила и последовательно добавляли карбонат калия (6,18 г, 44,8 ммоль), бензилбромид (1,33 мл, 11,2 ммоль) и тетрабутиламмонийиодид (413 мг, 1,1 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 48 часов и фильтровали через целит, и осадок на фильтре промывали этилацетатом (10 мл). Фильтраты объединяли и концентрировали при пониженном давлении, и полученный остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле с системой проявляющего растворителя C с получением указанного в заголовке продукта 9a (2 г, 86,9% выхода).

Стадия 2

Бензил-10-циклопропил-1-(9H-флуорен-9-ил)-3,6-диоксо-2,9-диокса-4,7-диазаундекан-11-оат 9b

9a (120,9 мг, 0,586 ммоль) и 8b (180 мг, 0,489 ммоль) добавляли в реакционную колбу и добавляли 4 мл тетрагидрофурана. Систему трижды продували аргоном и охлаждали реакционную смесь до 0-5°C на ледяной водяной бане с последующим добавлением трет-бутоксида калия (109 мг, 0,98 ммоль). Ледяную баню удаляли, и реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 40 минут с последующим добавлением 10 мл ледяной воды и экстракцией этилацетатом (20 мл×2) и хлороформом (10 мл×5). Органические фазы объединяли и концентрировали. Полученный остаток растворяли в 4 мл диоксана и добавляли 2 мл воды, бикарбонат натрия (49,2 мг, 0,586 ммоль) и 9-флуоренилметилхлорформиата (126 мг, 0,49 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Добавляли 20 мл воды с последующей экстракцией этилацетатом (10 мл×3). Органическую фазу промывали насыщенным раствором хлорида натрия (20 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле с системой проявляющего растворителя C с получением указанного в заголовке продукта 9b (48 мг, выход 19%).

MS m/z (ESI): 515,0 [M+1].

Стадия 3

10-циклопропил-1-(9H-флуорен-9-ил)-3,6-диоксо-2,9-диокса-4,7-диазаундекан-11-оевая кислота 9c

9b (20 мг, 0,038 ммоль) растворяли в 4,5 мл смеси растворителей тетрагидрофурана и этилацетата (V:V=2:1) и добавляли палладий на угле (12 мг, 10% нагрузка, сухое вещество). Систему трижды продували водородом, и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Реакционную смесь фильтровали через целит, а осадок на фильтре промывали этилацетатом. Фильтрат концентрировали с получением неочищенного указанного в заголовке продукта 9c (13 мг), который непосредственно использовали на следующей стадии без очистки.

MS m/z (ESI): 424,9 [M+1].

Стадия 4

(9H-флуорен-9-ил)метил(2-(((1-циклопропил-2-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)амино)-2-оксоэтокси)метил)амино)-2-оксоэтил)карбамат 9d

1b (10 мг, 18,8 ммоль) добавляли в реакционную колбу и добавляли 1 мл N,N-диметилформамида. Систему трижды продували аргоном и смесь охлаждали до 0-5°C на ледяной водяной бане с последующим добавлением капли неочищенного триэтиламина 9c (13 мг, 30,6 мкмоль) и 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорида (16,9 мг, 61,2 мкмоль). Реакционную смесь перемешивали на ледяной бане в течение 40 мин. Добавляли 10 мл воды с последующей экстракцией этилацетатом (10 мл×3). Органические фазы объединяли, промывали насыщенным раствором хлорида натрия (10 мл×2), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали с помощью тонкослойной хроматографии с системой В проявляющего растворителя с получением указанного в заголовке продукта 9d (19 мг, выход 73,6%).

MS m/z (ESI): 842,1 [M+1].

Стадия 5

2-((2-аминоацетамидо)метокси)-2-циклопропил-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)ацетамид 9e

9d (19 мг, 22,6 мкмоль) растворяли в 2 мл дихлорметана и добавляли 1 мл диэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч и концентрировали при пониженном давлении. Добавляли 1 мл толуола с последующим концентрированием при пониженном давлении; процедуры повторяли дважды. Остаток суспендировали с 3 мл н-гексана и оставляли стоять. Затем супернатант удаляли и оставляли твердое вещество. Твердый остаток концентрировали при пониженном давлении и сушили с помощью масляного насоса для получения неочищенного указанного в заголовке продукта 9e (17 мг), который непосредственно использовали на следующей стадии без очистки.

MS m/z (ESI): 638,0 [М+18].

Стадия 6

N-((2R,10S)-10-бензил-2-циклопропил-1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)амино)-1,6,9,12,15-пентаоксо-3-окса-5,8,11,14-тетраазагексадекан-16-ил)-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамид 9-A

N-((2S,10S)-10-бензил-2-циклопропил-1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)амино)-1,6,9,12,15-пентаоксо-3-окса-5,8,11,14-тетраазагексадекан-16-ил)-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамид 9-B

Неочищенный 9e (13,9 мг, 22,4 мкмоль) растворяли в 0,6 мл N,N-диметилформамида. Систему трижды продували аргоном, и раствор охлаждали до 0-5°C на ледяной водяной бане. Добавляли раствор 8 г (21,2 мг, 44,8 мкмоль) в 0,3 мл N,N-диметилформамида с последующим добавлением 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорида (18,5 мг, 67,3 мкмоль). Реакционную смесь перемешивали на ледяной бане в течение 10 мин. Затем ледяную баню удаляли и реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 1 часа с получением соединения 9. Реакционную смесь очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией (условия разделения: колонка для хроматографии: XBridge Prep C18 OBD 5 мкм 19×250 мм; подвижная фаза: А - вода (10 ммоль NH₄OAc), В - ацетонитрил, градиентное элюирование, скорость потока: 18 мл/мин). Соответствующие фракции собирали и концентрировали при пониженном давлении с получением указанных в заголовке продуктов (9-A: 2,4 мг, 9-B: 1,7 мг).

МС m/z (ESI): 1074,4 [M+1].

Соединение с единственной конфигурацией 9-А (меньшее временя удерживания):

Анализ UPLC: время удерживания: 1,14 мин; чистота: 85% (хроматографическая колонка: ACQUITY UPLC BEHC18 1,7 мкм 2,1×50 мм; подвижная фаза: A - вода (5 ммоль NH₄OAc), B - ацетонитрил).

¹H ЯМР (400 MHz, DMSO-d₆): δ 8,60 (t, 1H), 8,51-8,49 (d, 1H), 8,32-8,24 (m, 1H), 8,13-8,02 (m, 2H), 8,02-7,96 (m, 1H), 7,82-7,75 (m, 1H), 7,31 (s, 1H), 7,26-7,15 (m, 4H), 6,99 (s, 1H), 6,55-6,48 (m, 1H), 5,65-5,54 (m, 1H), 5,41 (s, 2H), 5,35-5,15 (m, 3H), 4,74-4,62 (m, 1H), 4,54-4,40 (m, 2H), 3,76-3,64 (m, 4H), 3,62-3,48 (m, 2H), 3,20-3,07 (m, 2H), 3,04-2,94 (m, 1H), 2,80-2,62 (m, 1H), 2,45-2,30 (m, 3H), 2,25-2,15 (m, 2H), 2,04-2,15 (m, 2H), 1,93-1,78 (m, 2H), 1,52-1,39 (m, 3H), 1,34-1,12 (m, 5H), 0,87 (t, 3H), 0,64-0,38 (m, 4H).

Соединение с единственной конфигурацией 9-B (большее временя удерживания):

Анализ UPLC: время удерживания: 1,16 мин; чистота: 89% (хроматографическая колонка: ACQUITY UPLC BEHC18 1,7 мкм 2,1×50 мм; подвижная фаза: A - вода (5 ммоль NH₄OAc), B - ацетонитрил).

¹H ЯМР (400 MHz, DMSO-d₆): δ 8,68-8,60 (m, 1H), 8,58-8,50 (m, 1H), 8,32-8,24 (m, 1H), 8,13-8,02 (m, 2H), 8,02-7,94 (m, 1H), 7,82-7,75 (m, 1H), 7,31 (s, 1H), 7,26-7,13 (m, 3H), 6,99 (s, 1H), 6,55-6,48 (m, 1H), 5,60-5,50 (m, 1H), 5,41 (s, 2H), 5,35-5,15 (m, 2H), 4,78-4,68 (m, 1H), 4,60-4,40 (m, 2H), 3,76-3,58 (m, 4H), 3,58-3,48 (m, 1H), 3,20-3,10 (m, 2H), 3,08-2,97 (m, 2H), 2,80-2,72 (m, 2H), 2,45-2,30 (m, 3H), 2,25-2,13 (m, 2H), 2,13-2,04 (m, 2H), 2,03-1,94 (m, 2H), 1,91-1,78 (m, 2H), 1,52-1,39 (m, 3H), 1,34-1,12 (m, 4H), 0,91-0,79 (m, 3H), 0,53-0,34 (m, 4H).

3. Подготовка ADC

Пример 3-1 ADC-1

К водному буферу PBS антитела PD3 (0,05 M водный буфер PBS при рН 6,5; 10,0 мг/мл, 4,0 мл, 270 нмоль) добавляли при 37°C подготовленный водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP) (10 мМ, 67,5 мкл, 675 нмоль). Реакционную смесь встряхивали на водяной бане-шейкере при 37°С в течение 3 часов перед прекращением реакции. Реакционную смесь охлаждали до 25°C на водяной бане.

Соединение 9-A (2,9 мг, 2700 нмоль) растворяли в 180 мкл ДМСО (диметилсульфоксид), и полученный раствор добавляли к указанной выше реакционной смеси, которую затем встряхивали на водной бане встряхиванием при 25°С в течение 3 часов перед прекращением реакции. Реакционную смесь обессоливали и очищали через колонку с гелем Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М буфер PBS при рН 6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением типового продукта ADC-1 PD3-9-A в буфере PBS (1,93 мг/мл, 18,4 мл), который затем хранили при 4°C.

Среднее значение, рассчитанное по методу UV-Vis (УФ- и видимый диапазон): n=3,77.

Пример 3-2 ADC-2

К водному буферу PBS антитела PD3 (0,05 M водный буфер PBS при рН 6,5; 10,0 мг/мл, 4,0 мл, 270 нмоль) добавляли при 37°C подготовленный водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP) (10 мМ, 143,1 мкл, 1431 нмоль). Реакционную смесь встряхивали на водяной бане-шейкере при 37°С в течение 3 часов перед прекращением реакции. Реакционную смесь охлаждали до 25°C на водяной бане.

Соединение 9-A (4,35 мг, 4050 нмоль) растворяли в 270 мкл ДМСО, и полученный раствор добавляли к указанной выше реакционной смеси, которую затем встряхивали на водной бане встряхиванием при 25°С в течение 3 часов перед прекращением реакции. Реакционную смесь обессоливали и очищали через колонку с гелем Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М буфер PBS при рН 6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением типового продукта ADC-2 PD3-9-A в буфере PBS (1,69 мг/мл, 17,8 мл), который затем хранили при 4°C.

Среднее значение, рассчитанное по методу UV-Vis: n=6,59.

Пример 3-3 ADC-3

К водному буферу PBS антитела PD3 (0,05 M водный буфер PBS при рН 6,5; 10,0 мг/мл, 0,3 мл, 20,3 нмоль) добавляли при 37°C подготовленный водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP) (10 мМ, 5,1 мкл, 51 нмоль). Реакционную смесь встряхивали на водяной бане-шейкере при 37°С в течение 3 часов перед прекращением реакции. Реакционную смесь охлаждали до 25°C на водяной бане.

Соединение 12H (0,194 мг, 203 нмоль, полученное со ссылкой на WO2017063509) растворяли в 20 мкл ацетонитрила, и полученный раствор добавляли к указанной выше реакционной смеси, которую затем встряхивали на водной бане встряхиванием при 25°C в течение 3 часов перед прекращением реакции. Реакционную смесь обессоливали и очищали через колонку с гелем Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М буфер PBS при рН 6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением указанного в заголовке продукта ADC-3 в буфере PBS (4,3 мг/мл, 0,6 мл), который затем хранили при 4°C.

Среднее значение, рассчитанное по методу UV-Vis: n=4,14.

Пример 3-4 ADC-4

Синтез проводили со ссылкой на пример 19 в WO2015098099.

К водному буферу PBS антитела TINA (0,05 M водный буфер PBS при рН 6,5; 10,0 мг/мл, 2,0 мл, 135,4 нмоль) добавляли при 37°C подготовленный водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP) (10 мМ, 33,8 мкл, 338 нмоль). Реакционную смесь встряхивали на водяной бане-шейкере при 37°С в течение 3 часов перед прекращением реакции. Реакционную смесь охлаждали до 25°C на водяной бане.

Соединение 58 (1,4 мг, 1354 нмоль) растворяли в 70 мкл ДМСО и полученный раствор добавляли к вышеуказанной реакционной смеси, которую затем встряхивали на шейкере с водяной баней при 25°C в течение 3 ч, прежде чем реакция была остановлена. Реакционную смесь обессоливали и очищали через колонку с гелем Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М буфер PBS при рН 6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением типового указанного в заголовке продукта ADC-4 TINA-58 в буфере PBS (1,13 мг/мл, 15,1 мл), который затем хранили при 4°C.

Среднее значение, рассчитанное по методу UV-Vis: n=3,99.

Пример 3-5 ADC-5

К водному буферу PBS антитела PD3 (0,05 М водного буфера PBS при pH 6,5; 10,0 мг/мл, 1,5 мл, 101,4 нмоль) добавляли при 37°C приготовленный водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP). (10 мМ, 25,3 мкл, 253 нмоль). Реакционную смесь встряхивали на водяной бане-шейкере при 37°С в течение 3 часов перед прекращением реакции. Реакционную смесь охлаждали до 25°C на водяной бане.

Соединение 58 (1,05 мг, 1014 нмоль, см. пример 58 на стр.163 патента CN104755494A) растворяли в 60 мкл ДМСО, и полученный раствор добавляли к указанной выше реакционной смеси, которую затем встряхивали на водной бане встряхиванием при 25°С в течение 3 часов перед прекращением реакции. Реакционную смесь обессоливали и очищали на гелевой колонке Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М буфер PBS при pH 6,5) с получением примера указанного в заголовке продукта ADC-5 PD3-58 в буфере PBS (0,82 мг/мл, 13,5 мл), который затем хранили при 4°C.

Среднее значение, рассчитанное по методу UV-Vis: n=3,88.

Пример 3-6 ADC-6

К водному буферу PBS антитела hRS7 (0,05 M водный буфер PBS при рН 6,5; 10,0 мг/мл, 1,4 мл, 94,60 нмоль) добавляли при 37°C подготовленный водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP) (10 мМ, 50,1 мкл, 501 нмоль). Реакционную смесь встряхивали на водяной бане-шейкере при 37°С в течение 3 часов перед прекращением реакции. Реакционную смесь охлаждали до 25°C на водяной бане.

Соединение SN38 (синтезированное со ссылкой на Пример 1 на с.59 патента CN105407891A, 2,1 мг, 1419 нмоль) растворяли в 50 мкл ДМСО, и полученный раствор добавляли к вышеуказанной реакционной смеси, которую затем встряхивали на водной бане-шейкере при 25°C в течение 3 часов перед прекращением реакции. Реакционную смесь обессоливали и очищали через колонку с гелем Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М буфер PBS при рН 6,5) с получением типового указанного в заголовке продукта ADC-6 из hRS7-SN38 в буфере PBS (1,03 мг/мл, 11,5 мл), который затем хранили при 4°C.

Среднее значение, рассчитанное методом CE-SDS: n=7,56.

Пример 3-7 ADC-7

К водному буферу PBS антитела hRS7 (0,05 M водный буфер PBS при рН 6,5; 10,0 мг/мл, 2,18 мл, 147,3 нмоль) добавляли при 37°C подготовленный водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP) (10 мМ, 36,8 мкл, 368 нмоль). Реакционную смесь встряхивали на водяной бане-шейкере при 37°С в течение 3 часов перед прекращением реакции. Реакционную смесь охлаждали до 25°C на водяной бане.

Соединение 9-A (1,58 мг, 1471 нмоль) растворяли в 100 мкл ДМСО, и полученный раствор добавляли к указанной выше реакционной смеси, которую затем встряхивали на водной бане-шейкере при 25°С в течение 3 часов перед прекращением реакции. Реакционную смесь обессоливали и очищали через колонку с гелем Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М буфер PBS при рН 6,5) с получением иллюстративного указанного в заголовке продукта ADC-6 из hRS7-9-A в буфере PBS (1,10 мг/мл, 16,4 мл), который затем хранили при 4°C.

Среднее значение, рассчитанное по методу UV-Vis: n=3,72.

Пример 3-8 ADC-8

К водному буферу PBS антитела hRS7 (0,05 M водный буфер PBS при рН 6,5; 10,0 мг/мл, 2,18 мл, 147,3 нмоль) добавляли при 37°C подготовленный водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP) (10 мМ, 36,8 мкл, 368 нмоль). Реакционную смесь встряхивали на водяной бане-шейкере при 37°С в течение 3 часов перед прекращением реакции. Реакционную смесь охлаждали до 25°C на водяной бане.

Соединение 58 (1,52 мг, 1473 нмоль, см. пример 58 на стр.163 патента CN104755494A) растворяли в 100 мкл ДМСО, и полученный раствор добавляли к указанной выше реакционной смеси, которую затем встряхивали на водной бане встряхиванием при 25°С в течение 3 часов перед прекращением реакции. Реакционную смесь обессоливали и очищали через колонку с гелем Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М буфер PBS при рН 6,5) с получением типового указанного в заголовке продукта ADC-8 из hRS7-58 в буфере PBS (1,02 мг/мл, 16,8 мл), который затем хранили при 4°C.

Среднее значение, рассчитанное по методу UV-Vis: n=3,93.

Пример 3-9 ADC-9

К водному буферу PBS антитела TINA (0,05 M водный буфер PBS при рН 6,5; 10,0 мг/мл, 0,95 мл, 64,2 нмоль) добавляли при 37°C подготовленный водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP) (10 мМ, 16,0 мкл, 160 нмоль). Реакционную смесь встряхивали на водяной бане-шейкере при 37°С в течение 3 часов перед прекращением реакции. Реакционную смесь охлаждали до 25°C на водяной бане.

Соединение 9-A (0,69 мг, 642 нмоль) растворяли в 30 мкл ДМСО, и полученный раствор добавляли к указанной выше реакционной смеси, которую затем встряхивали на водной бане-шейкере при 25°С в течение 3 часов перед прекращением реакции. Реакционную смесь обессоливали и очищали через колонку с гелем Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М буфер PBS при рН 6,5) с получением иллюстративного указанного в заголовке продукта ADC-9 из TINA-9-A в буфере PBS (0,99 мг/мл, 7,0 мл), который затем хранили при 4°C.

Среднее значение, рассчитанное по методу UV-Vis: n=3,99.

Анализ нагрузки лекарственным средством маточного раствора ADC

ADC представляет собой сшитый препарат антитела, и его механизм лечения заболеваний заключается в транспортировке молекул токсина в клетки в зависимости от эффективности нацеливания антитела таким образом, чтобы уничтожить клетки. Нагрузка лекарственного средства играет решающую роль в эффективности лекарственного средства.

1. Метод расчета UV-Vis

Нагрузку лекарственного средства исходного раствора ADC определяли УФ-методом.

Экспериментальные процедуры

Кюветы, содержащие буферный раствор сукцината натрия, помещали в эталонную ячейку и ячейку образца, и вычитали абсорбцию холостого растворителя. Затем в ячейку с образцом помещали кювету, содержащую тестовый раствор, и определяли значения абсорбции при 280 нм и 370 нм.

Расчет результатов

Нагрузочную способность исходного раствора ADC определяли с помощью ультрафиолетовой спектрофотометрии (прибор: ультрафиолетовый спектрофотометр Thermo nanodrop2000), исходя из принципа, что суммарная абсорбция исходного раствора ADC при определенной длине волны представляет собой сумму значений абсорбций цитотоксического лекарственного средства и моноклонального антитела при этой длине волны, а именно:

(1) A_{280 nm}=ε_mab-280bC_mab+ε_{лекарственного средства-280}bC_{лекарственного средства}

ε_{лекарственное средство-280}: средний молярный коэффициент экстинкции лекарственного средства при 280 нм составил 5100;

C_{лекарственного средства}: концентрация лекарственного средства;

ε_mab-280: средний молярный коэффициент затухания исходного раствора моноклонального антитела при 280 нм составляет 214600;

C_mab: концентрация исходного раствора моноклонального антитела;

b: оптическая длина пути, составляющая 1 см.

Аналогично, уравнение для общей абсорбции образца при 370 нм может быть представлено как:

(2) A_{370 нм}=ε_mab-370bC_mab+ε_{лекарственного средства-370}bC_{лекарственного средства}

ε_{лекарственного средства-370}: средний молярный коэффициент затухания лекарственного средства при 370 нм составил 19000;

C_{лекарственного средства}: концентрация лекарственного средства;

ε_mab-370: коэффициент экстинкции основного раствора моноклонального антитела при 370 нм равен 0;

C_mab: концентрация исходного раствора моноклонального антитела;

b: оптическая длина пути составляет 1 см.

Нагрузка лекарственного средства может быть рассчитана с использованием как уравнения (1), так и (2), а также коэффициентов затухания моноклонального антитела и лекарственного средства при обеих длинах волн и их концентрациях.

Нагрузка лекарственного средства=С_{лекарственного средства}/C_mab.

2. Методика расчета CE-SDS

Реагенты и инструменты

Использовали набор для анализа SDS-Mw производства Beckman, кат.№390953, содержащий буфер для разделения геля SDS-MW, буфер для образца SDS-MW, кислотный чистящий раствор (0,1 моль/л раствора соляной кислоты), основной чистящий раствор (0,1 моль раствора гидроксида натрия) и вещество внутреннего стандарта (10 кДа). Также был использован набор SDS, произведенный Пекинским технологическим институтом BioCEart, кат.№BSYK018, и содержащий гелевый буфер CE-SDS и буфер для образца CE-SDS.

Раствор алкилирования (0,25 моль раствор иодацетамида): около 0,046 г иодацетамида взвешивали, добавляли 1 мл особо чистой воды для растворения и хорошо перемешивали, и полученный раствор хранили при 2-8°C в течение 7 дней в темноте.

Аппарат капиллярного электрофореза: PA800plus от SCIEX.

Капилляр: капилляр из плавленого диоксида кремния без покрытия (с внутренним диаметром 50 мкм), разрезанный до общей длины 30,2 см и эффективной длины разделения методом высокого разрешения 20 см.

Приготовление раствора испытуемого образца

Испытуемый образец разбавляли до 1 мг/мл буфером для образца SDS (додецилсульфат натрия). Отбирали 95 мкл испытуемого раствора (1 мг/мл) и добавляли 5 мкл водного раствора иодацетамида (0,8 моль/л), полученный раствор встряхивали и хорошо перемешивали. Отбирали 95 мкл холостого контроля и добавляли 5 мкл 0,8 моль/л водного раствора иодацетамида, полученный раствор встряхивали и хорошо перемешивали. 75 мкл образцов отбирали из пробирок с образцами, добавляли во флаконы с образцами и немедленно подвергали анализу.

Метод определения

1) Предварительная обработка капилляра: 0,1 моль/л раствора гидроксида натрия промывали под давлением 60 фунтов на квадратный дюйм в течение 3 мин, затем промывали 0,1 моль/л раствором соляной кислоты под давлением 60 фунтов на квадратный дюйм в течение 2 мин и, наконец, промывали чистой водой под давлением 70 фунтов на квадратный дюйм в течение 1 мин. Вышеуказанная предварительная обработка должна выполняться перед каждой операцией.

2) Предварительное заполнение капилляра: буфер для отделения геля SDS промывали при давлении 50 фунтов на квадратный дюйм в течение 15 минут. Вышеуказанная предварительная обработка должна выполняться перед каждой операцией.

Введение образца: электрокинетическое введение образца выполняли при 10 кВ обратной полярности, а восстановленный образец вводили в течение 20 с.

Разделение: разделение проводили при 15 кВ обратной полярности в течение 40 мин.

Температура в камере для проб: от 18 до 25°С.

Температура капилляров: от 18 до 25°С.

Анализ результатов

Данные анализировали с использованием программного обеспечения от Beckman на основе связывания соответствующего лекарственного средства на сульфидриле, высвобожденном из открытой дисульфидной связи в антителе, и рассчитывали долю скорректированной площади пика, такой как тяжелая цепь, негликозилированная тяжелая цепь и легкая цепь, в сумме всех скорректированных площадей пика. Формула расчета: DAR=[4 × площадь пика тяжелой цепи (H)+2 × площадь пика полуантитела (H-L)+4 × площадь пика двойной тяжелой цепи (H-H)+2 × площадь пика тяжелой-тяжелой-легкой цепи (H-H-L)]/[площадь пика тяжелой цепи (H)/2+площадь пика полуантитела (H-L)/2+площадь пика двойной тяжелой цепи (H-H)+площадь пика тяжелой-тяжелой-легкой цепи (H-H-L)+площадь пика полного антитела], и затем было рассчитано средневзвешенное значение ADC.

Активность антител по настоящему изобретению валидировали с использованием биохимического метода испытания.

Пример испытания 1: Анализ связывания уровня белка антитела

Белок hTROP-2 разбавляли до 1 мкг/мл буфером PBS при pH 7,4 (Shanghai BasalMedia Technologies Co., LTD., B320), добавляли в 96-луночный микропланшет по 100 мкл на лунку и инкубировали при 4°C в течение ночи. После того, как жидкость отбрасывали, 300 мкл 5% обезжиренного молока (BD, 232100), разбавленного PBS, добавляли в каждую лунку для блокирования и инкубировали при 37°C в течение 2 часов. После завершения блокирования блокирующий раствор отбрасывали; после того, как планшет 3 раза промывали буфером PBST (pH 7,4, PBS, содержащим 0,1% твин-20), в каждую лунку добавляли 100 мкл разбавленного градиентом раствора антитела и инкубировали при 37°С в течение 1 часа. После завершения инкубации планшет промывали 3 раза буфером PBST и в каждую лунку добавляли 100 мкл разбавленного 1:8000 мышиного антитела к IgG человека (H+L) (Jackson ImmunoResearch, 209-035-088) и инкубировали при 37°C в течение 1 часа. После того, как планшет 3 раза промывали буфером PBST, в каждую лунку добавляли 100 мкл хромогенного субстрата TMB (KPL, 5120-0077) и инкубировали при комнатной температуре в течение 10-15 минут, и реакцию останавливали, добавляя 50 мкл 1 M H₂SO₄ в каждую лунку. Проводили оценку оптической плотности при 450 нм с помощью считывающего устройства для микропланшетов, с помощью программного обеспечения согласовывали кривые связывания антитела и антигена и рассчитывали значение EC₅₀. Связывающая активность антител с белками показана в таблице 2.

Таблица 2. Связывающая активность на уровне белка антитела Антитела PD3 hRS7 TINA E_max (значение оптической плотности) 1,40 1,37 1,39 EC₅₀ (нМ) 13,6 18,29 16,14

Результат показывает, что антитело к PD3 в настоящей заявке обладает более высокой связывающей активностью по отношению к белку hTROP-2.

Пример испытания 2: Анализ связывания антител на клеточном уровне

Стабильно трансфицированные клетки CHOK1, экспрессирующие TROP-2, суспендировали в буфере FACS (2% фетальная бычья сыворотка (Gibco, 10099141), pH 7,4 PBS (Sigma, P4417-100TAB)) с получением суспензии 1×10⁶ клеток/мл, которую затем добавляли в 96-луночный круглодонный планшет (Corning, 3795) по 100 мкл/лунку. После центрифугирования и удаления супернатанта, тестируемое антитело, которое разбавляли буфером FACS до различных концентраций, добавляли по 50 мкл/лунку. Планшет инкубировали в темноте в холодильнике при 4°C в течение 1 часа. Планшет трижды промывали буфером FACS центрифугированием при 300 g и добавляли антитела козы к IgG человека Alexa Fluor 488 (H+L) (Invitrogen, A-11013) в рабочей концентрации. Планшет инкубировали в темноте в холодильнике при 4°C в течение 40 мин. Планшет трижды промывали буфером FACS путем центрифугирования при 300 g и тестировали на проточном цитометре BD FACS CantoII на геометрическую среднюю интенсивность флуоресценции. Рассчитывали значение EC₅₀ связывания антитела со стабильно трансфицированными клетками, экспрессирующими TROP-2. Связывающая активность антител к клеткам показана на фиг.1 и в таблице 3.

Таблица 3. Связывающая активность антител на уровне клеток Антитела PD3 hRS7 TINA E_max (MFI) (средняя интенсивность флуоресценции) 16693 16050 14217 EC₅₀ (нМ) 1,57 2,31 3,55

Результат показывает, что антитело к PD3 в настоящей заявке обладает более высокой связывающей активностью в отношении клеток, экспрессирующих белок hTROP-2.

Пример испытания 3: Анализ эндоцитоза антител

Цель анализа заключается в том, чтобы активированный DT (дифтерийный токсин) убивал клетки после того, как белок DT3C попадает в клетки, косвенно отражая эндоцитоз антитела к TROP-2. Эндоцитарную активность антитела in vitro оценивали в соответствии с EC₅₀ и E_max.

DT3C представляет собой рекомбинантно экспрессируемый слитый белок и образуется путем слияния фрагмента A дифтерийного токсина (только токсической части) и фрагмента 3C стрептококка группы G (связывающая часть IgG). Белок может обладать высокой аффинностью к части IgG антитела, проникать в клетки вместе с частью IgG при эндоцитозе антитела и высвобождать токсичный DT под действием внутриклеточной фуриновой протеазы. DT может ингибировать активность рибозилирования EF2-ADP, блокировать процесс трансляции белка и, наконец, вызывать гибель клеток. DT3C, который не проникает в клетку, не обладает активностью уничтожения клеток. Эндоцитарную активность антитела оценивали на основании уничтожения клеток.

Клеточные суспензии получали со свежей клеточной средой, содержащей 20% FBS с низким содержанием IgG при плотности клеток 2 × 10⁴ клеток/мл, и добавляли в планшеты для культивирования клеток при 50 мкл/лунку и инкубировали с 5% диоксида углерода при 37°С в течение 16 часов. DT3C в концентрации 4× готовили в бессывороточной среде и фильтровали через фильтр 0,22 мкм для получения стерильного раствора. Антитело в концентрации 4× получали в бессывороточной среде, и 80 мкл DT3C и 80 мкл антитела смешивали в объеме 1:1 и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. 50 мкл разбавленной смеси антитело-DT3C добавляли к 50 мкл клеток и инкубировали в инкубаторе в течение трех дней. В каждую лунку добавляли 50 мкл CTG и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре в темноте, и значения хемилюминесценции детектировали с использованием Victor3. Эндоцитарная активность антитела показана в таблице 4.

Таблица 4. Эндоцитарная активность антител Антитела PD3 hRS7 TINA E_max 99,1% 98,5% 98,7% EC₅₀ (нМ) 0,15 0,18 0,18

Результаты показывают, что антитело к PD3 в настоящей заявке имеет более высокую эффективность эндоцитоза.

Пример испытания 4: Анализ аффинности антитела

Аффинность антитела к TROP-2 обнаруживали в форме захватывающего антитела. Антитело было аффинно захвачено белком A (кат.№29127556, GE) с помощью биосенсорного чипа, конъюгированным с антителом к IgG человека (кат.№BR-1008-39, партия №10260416, GE), затем антиген hTROP-2 протекал по поверхности чипа, и прибор Biacore T200 использовали для детектирования реакционных сигналов в режиме реального времени для получения кривых ассоциации и диссоциации. После завершения диссоциации для каждого цикла анализа чип промывали и регенерировали с помощью буфера для регенерации Glycine1.5 (кат.№BR100354, GE) или 3 M MgCl₂ (из набора для захвата антител человека, кат.№BR100839, GE). После завершения анализа данные были уточнены моделью Ленгмюра (1:1) с использованием GE Biacore T200 Evaluation версии 3.0 для получения значений аффинности. Аффинность антитела к белкам показана в таблице 5.

Таблица 5. Аффинность антитела, определенная Biacore Антитела PD3 hRS7 TINA KD (равновесная константа диссоциации) (M) 6,86E-10 9,87E-10 2,15E-8

Результаты показывают, что антитело PD3 в настоящей заявке обладает более высокой аффинностью к hTROP-2.

Пример испытания 5: Анализ клеточной активности молекул ADC

Клетки, использованные в этом анализе, были следующими: FaDu (+++), приобретенные у ATCC, кат.№HTB-43™; HCC827(+++), приобретенные у ATCC, кат.№CRL-2868; Colo205(++), приобретенные у Cell Bank, Китайская академия наук, кат.№TCHu102; DMS53 (++), приобретенные у ATCC, кат.№CRL-2062™; SK-OV-3(+), приобретенные у ATCC, кат.№HTB-77; CHO-K1(-), приобретенные у ATCC, кат.№CCL-61™; где "+" представляет собой экспрессируемое количество TROP-2 в популяции клеток, больше "+" означает, что экспрессируемое количество TROP-2 выше, а "-" означает, что TROP-2 не экспрессируется.

Клеточные суспензии готовили со свежей клеточной средой, содержащей 10% FBS при плотности 3703 клеток/мл, и добавляли в 96-луночный планшет для культивирования клеток при 135 мкл/лунку и инкубировали с 5% диоксидом углерода при 37°С в течение 16 часов. Образцы ADC составляли в концентрации 5 мкМ с PBS. 5 мкМ исходной концентрации разбавляли в пять раз PBS в общей сложности 8 концентрациями. В каждую лунку добавляли 15 мкл вышеуказанного раствора ADC. Планшет культивировали при 37°С в 5% диоксиде углерода в течение 6 дней. В каждую лунку добавляли 70 мкл CTG и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре в темноте, значения хемилюминесценции детектировали с использованием Victor3, а анализ данных проводили с использованием программного обеспечения GraphPad Prism.

Результаты показывают, что ADC-1 обладает более сильным эффектом уничтожения клеток, и эффект уничтожения положительно коррелирует с уровнем экспрессии TROP-2 на поверхности опухолевой клетки.

Таблица 6-1. Цитотоксичность ADC к клеткам с различными уровнями экспрессии TROP-2 FaDu HCC827 Colo205 DMS53 SK-OV-3 CHO-K1 Образцы EC₅₀
(нМ) E_max
(%) EC₅₀
(нМ) E_max
(%) EC₅₀
(нМ) E_max
(%) EC₅₀
(нМ) E_max
(%) EC₅₀
(нМ) E_max
(%) EC₅₀
(нМ) E_max
(%) ADC-1 0,23 100,42 0,14 89,64 39,23 99,38 42,46 89,39 н.д. 61,91 н.д. 9,31 ADC-4 0,53 101.25 0,27 88,16 59,8 99,66 75,58 89,83 н.д. 49,15 н.д. 1,71 ADC-7 0,31 100,75 0,18 89,33 52,75 99,52 72,92 88,74 н.д. 66,11 н.д. 8,69

Второй параллельный сравнительный анализ проводили способом, как описано выше, и полученные результаты были следующими:

Таблица 6-2. Цитотоксичность ADC к клеткам с различными уровнями экспрессии TROP-2 FaDu HCC827 Colo205 DMS53 Образцы EC₅₀ (нМ) E_max (%) EC₅₀ (нМ) E_max (%) EC₅₀ (нМ) E_max (%) EC₅₀ (нМ) E_max (%) ADC-1 0,08 101,6 0,06 89,57 12,07 100,34 15,08 93,24 ADC-5 0,14 101,58 0,13 88,23 25,63 99,64 25,71 92,47

Пример испытания 6: Исследование неспецифической цитотоксичности

BxPC3 (клетки рака поджелудочной железы человека, ATCC, CRL-1687) и клетки MiaPaCa2 (клетки рака поджелудочной железы человека, биоцитоген, B-HCL-014) культивировали с RPMI1640 и 10% FBS и DMEM (минимальная эссенциальная среда Игла, модифицированная по способу Дульбекко)/высоким содержанием глюкозы и 10% FBS, соответственно; клетки трипсинизировали, нейтрализовали свежей средой и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 3 мин; супернатант отбрасывали, а клетки ресуспендировали с RPMI1640 и 10% FBS. После подсчета клеток плотность клеток BxPC3 доводили до 6 × 10⁴ клеток/мл, а плотность клеток MiaPaCa2-luc доводили до 1,5 × 10⁴ клеток/мл. 500 мкл клеток BxPC3 и 500 мкл клеток MiaPaCa2-luc добавляли в каждую лунку 12-луночного планшета 1. 500 мкл клеток MiaPaCa2-luc и 500 мкл среды RPMI1640, содержащей 10% сыворотки FBS, добавляли в 12-луночный планшет 2. Планшет культивировали при 37°С в 5% диоксиде углерода в течение 24 ч.

Образцы ADC были приготовлены в виде 40× концентрации промежуточных растворов (0,2 мкМ). Отбирали 25 мкл вышеуказанных образцов и добавляли в соответствующую лунку 12-луночного планшета. Была установлена контрольная группа растворителя. Планшет культивировали при 37°С в 5% диоксиде углерода в течение 6 дней. Клетки в 12-луночном планшете трипсинизировали, нейтрализовали свежей средой и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 3 мин. Супернатант отбрасывали, и клетки ресуспендировали в 1 мл буфера FACS (PBS и 2,5% FBS). 20 мкл клеток отбирали и окрашивали 20 мкл трипанового синего и подсчитывали. Клетки в планшете 1 центрифугировали при 1000 об/мин в течение 3 мин, супернатант отбрасывали, клетки ресуспендировали в 100 мкл буфера FACS, добавляли 2 мкл моноклонального антитела TROP-2 (EGP-1) (MR54) и клетки инкубировали на льду в течение 30 мин. Клетки центрифугировали при 2000 об/мин при 4°С в течение 1 мин, супернатант отбрасывали, и клетки ресуспендировали в 150 мкл буфера FACS. Обнаружение проводили с использованием BD FACSVerse. Данные были проанализированы Flowjo 7.6. Результаты исследования активности неспецифического убийства показаны на фиг.2.

Результаты показывают, что ADC-1 согласно настоящему изобретению обладает явным побочным эффектом уничтожения, и ADC не убивают TROP-2-отрицательные клетки MiaPaCa2, однако ADC-1 убивает TROP-2-отрицательные клетки, когда клетки BxPC3, экспрессирующие TROP-2, смешиваются с отрицательными клетками MiaPaCa2.

Биологическая оценка активности in vivo

Пример испытания 7: Оценка эффективности in vivo на клетках Fadu мышиной модели CDX

Клетки Fadu (3 × 10⁶) подкожно инокулировали в правый бок голых мышей Balb/c, через 10 дней после инокуляции голых мышей с большим весом, слишком большой опухолью и слишком маленькой опухолью удаляли после того, как объем опухоли составлял около 245 мм³, и оставшихся мышей рандомизировали в 5 групп по 8 мышей в соответствии с объемом опухоли.

Каждой мыши внутрибрюшинно вводили ADC в концентрации 0,1 мл/10 г массы тела в дни 0 и 8, делая в общей сложности 2 инъекции с дозой 1 мг/кг. Объемы опухоли и массу тела измеряли два раза в неделю, а результаты записывали.

Данные записывали с использованием статистического программного обеспечения Excel: значения SD (среднеквадратическое отклонение) рассчитывали как среднее значение; значения СО рассчитывали как STDEV (квадратный корень дисперсии выборки); значения SEM (стандартная ошибка среднего значения) рассчитывали как STDEV/SQRT (количество животных в группе); для построения графика использовали программное обеспечение GraphPad Prism, а статистический анализ данных проводили с использованием двустороннего дисперсионного анализа или одностороннего дисперсионного анализа.

Объем опухоли (V) рассчитывали как: V=1/2 × L_{длинная} × L_{короткая}²

Относительная скорость пролиферации опухоли T/C(%)=(T - T₀)/(C - C₀) × 100, где T и C - объемы опухоли животных в конце эксперимента в группе лечения и контрольной группе, соответственно; T₀ и C₀ - объемы опухоли животных в начале эксперимента в группе лечения и контрольной группе, соответственно.

Степень ингибирования опухоли TGI (%)=1 - T/C (%).

Результаты приведены в таблице 7 и на фиг.3, которые показывают, что ADC-1 оказывает сильное ингибирующее действие на опухоли ксенотрансплантата FaDu в дозе 1 мг/кг.

Таблица 7. Эффективность ADC на ксенотрансплантатных опухолях FaDu у мышей с опухолью Группа Средний объем опухоли (мм³) Средний объем опухоли (мм³) Степень ингибирования опухоли
TGI (%) D0 SEM D21 SEM "Пустой" контроль 246,8 29,04 2245,04 275,14 НД ADC-4 1 мг/кг 244,41 29,62 1180,96 193,55 53 ADC-1 1 мг/кг 251,19 23,45 238,54 107,62 101 ADC-2 1 мг/кг 270,48 21,36 0 0 114 PD3 30 мг/кг 246,02 25 2407,37 207,71 -8

Пример испытания 8: Оценка эффективности in vivo на клетках SKOV3 мышиной модели CDX

Клетки SKOV3 (5×10⁶) подкожно инокулировали в правый бок голых мышей Balb/c, через 23 дня после инокуляции голых мышей с большим весом, слишком большой опухолью и слишком маленькой опухолью удаляли после того, как объем опухоли составлял около 180 мм³, и оставшихся мышей рандомизировали в 5 групп по 8 мышей в соответствии с объемом опухоли.

Каждой мыши внутрибрюшинно вводили ADC в концентрации 0,1 мл/10 г массы тела для в общей сложности 2 инъекций, и доза показана в следующей таблице. Объемы опухоли и массу тела измеряли два раза в неделю, а результаты записывали. Данные записывали с использованием статистического программного обеспечения Excel: значения SD (среднеквадратическое отклонение) рассчитывали как среднее значение; значения СО рассчитывали как STDEV (квадратный корень дисперсии выборки); значения SEM (стандартная ошибка среднего значения) рассчитывали как STDEV/SQRT (количество животных в группе); для построения графика использовали программное обеспечение GraphPad Prism, а статистический анализ данных проводили с использованием двустороннего дисперсионного анализа или одностороннего дисперсионного анализа.

Объем опухоли (V) рассчитывали как: V=1/2 × L_{длинная} × L_{короткая}²

Относительная скорость пролиферации опухоли T/C(%)=(T -T₀)/(C - C₀) × 100, где T и C - объемы опухоли животных в конце эксперимента в группе лечения и контрольной группе, соответственно; T₀ и C₀ - объемы опухоли животных в начале эксперимента в группе лечения и контрольной группе, соответственно.

Степень ингибирования опухоли TGI (%)=1 - T/C (%).

Результаты приведены в таблице 8 и на фиг.4, которые показывают, что ADC-1 оказывает сильное ингибирующее действие на опухоли ксенотрансплантата SKOV3 при различных дозах, и дозозависимый эффект является ингибирующим.

Эффект зависит от дозы.

Таблица 8. Эффективность ADC на ксенотрансплантатных опухолях SKOV3 у мышей с опухолью Группа Средний объем опухоли (мм³) Средний объем опухоли (мм³) Степень ингибирования опухоли
TGI (%) D0 SEM D21 SEM "Пустой" контроль 183,26 7,6 1081,36 132,88 НД ADC-1 10 мг/кг 185,48 9,62 302,93 39,34 87 ADC-1 3 мг/кг 185,09 10,07 519,9 38,93 63 ADC-1 1 мг/кг 183,29 8,87 795,34 124,81 32 ADC-4 10 мг/кг 183,83 8,9 938,99 148,98 16 ADC-4 3 мг/кг 184,17 8,2 873,38 50,84 23 ADC-4 1 мг/кг 185,17 8,38 1110,52 159,73 -3 PD3 30 мг/кг 182,85 8,38 1384,28 93,87 -34

Пример испытания 9: Оценка эффективности in vivo на клетках Colo205 мышиной модели CDX

Клетки Colo205 (5×10⁶) подкожно инокулировали в правый бок голых мышей Balb/c, через 10 дней после инокуляции голых мышей с большим весом, слишком большой опухолью и слишком маленькой опухолью удаляли после того, как объем опухоли составлял около 245 мм³, и оставшихся мышей рандомизировали в 6 групп по 8 мышей в соответствии с объемом опухоли.

Каждой мыши внутрибрюшинно вводили ADC в концентрации 0,1 мл/10 г массы тела в день 0 (D0) и день 8 (D8), делая в общей сложности 2 инъекции с дозой 1 мг/кг. Объемы опухоли и массу тела измеряли два раза в неделю, а результаты записывали в течение 28 дней (D28).

Данные записывали с использованием статистического программного обеспечения Excel: значения SD (среднеквадратическое отклонение) рассчитывали как среднее значение; значения СО рассчитывали как STDEV (квадратный корень дисперсии выборки); значения SEM (стандартная ошибка среднего значения) рассчитывали как STDEV/SQRT (количество животных в группе); для построения графика использовали программное обеспечение GraphPad Prism, а статистический анализ данных проводили с использованием двустороннего дисперсионного анализа или одностороннего дисперсионного анализа.

Объем опухоли (V) рассчитывали как: V=1/2 × L_{длинная} × L_{короткая}²

Относительная скорость пролиферации опухоли T/C(%)=(T-T₀)/(C-C₀)×100, где T и C - объемы опухоли животных в конце эксперимента в группе лечения и контрольной группе, соответственно; T₀ и C₀ - объемы опухоли животных в начале эксперимента в группе лечения и контрольной группе, соответственно.

Степень ингибирования опухоли TGI (%)=1 - T/C (%).

Результаты приведены в таблице 9 и на фиг.5, которые показывают, что ADC-9 и ADC-7, конъюгированные с соединением 9-A, оказывают сильное ингибирующее действие на опухоли ксенотрансплантата Colo205 в дозе 1 мг/кг/л.

Таблица 9. Эффективность ADC на ксенотрансплантатных опухолях FaDu у мышей с опухолью Группа Средний объем опухоли (мм³) Средний объем опухоли (мм³) Степень ингибирования опухоли
TGI (%) D0 SEM D28 SEM "Пустой" контроль 210,30 24,91 1355,56 117,46 НД ADC-6 10 мг/кг 194,93 26,56 1344,84 95,93 0 ADC-7 10 мг/кг 194,64 21,03 35,13 12,80 113 ADC-8 10 мг/кг 199,09 23,41 475,66 175,24 76 ADC-9 10 мг/кг 206,70 21,21 99,86 32,55 109 ADC-4 10 мг/кг 201,52 27,85 513,83 118,53 73

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110>ЦЗЯНСУ ХЭНЖУЙ МЕДСИН КО., ЛТД.

ШАНХАЙ ХЭНЖУЙ ФАРМАСЬЮТИКАЛ КО., ЛТД.

<120>КОНЪЮГАТ АНТИТЕЛА К TROP-2 И АНАЛОГА ЭКЗАТЕКАНА И ЕГО

МЕДИЦИНСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ

<130>721008CPCT

<140>PCT/CN2021/073279

<141>2021-01-22

<150>202010073438.8

<151>2020-01-22

<160>18

<170>Patent-In 3.5

<210>1

<211>323

<212>Белок

<213>Homo sapiens

<400>1

Met Ala Arg Gly Pro Gly Leu Ala Pro Pro Pro Leu Arg Leu Pro Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Val Leu Ala Ala Val Thr Gly His Thr Ala Ala Gln Asp

20 25 30

Asn Cys Thr Cys Pro Thr Asn Lys Met Thr Val Cys Ser Pro Asp Gly

35 40 45

Pro Gly Gly Arg Cys Gln Cys Arg Ala Leu Gly Ser Gly Met Ala Val

50 55 60

Asp Cys Ser Thr Leu Thr Ser Lys Cys Leu Leu Leu Lys Ala Arg Met

65 70 75 80

Ser Ala Pro Lys Asn Ala Arg Thr Leu Val Arg Pro Ser Glu His Ala

85 90 95

Leu Val Asp Asn Asp Gly Leu Tyr Asp Pro Asp Cys Asp Pro Glu Gly

100 105 110

Arg Phe Lys Ala Arg Gln Cys Asn Gln Thr Ser Val Cys Trp Cys Val

115 120 125

Asn Ser Val Gly Val Arg Arg Thr Asp Lys Gly Asp Leu Ser Leu Arg

130 135 140

Cys Asp Glu Leu Val Arg Thr His His Ile Leu Ile Asp Leu Arg His

145 150 155 160

Arg Pro Thr Ala Gly Ala Phe Asn His Ser Asp Leu Asp Ala Glu Leu

165 170 175

Arg Arg Leu Phe Arg Glu Arg Tyr Arg Leu His Pro Lys Phe Val Ala

180 185 190

Ala Val His Tyr Glu Gln Pro Thr Ile Gln Ile Glu Leu Arg Gln Asn

195 200 205

Thr Ser Gln Lys Ala Ala Gly Asp Val Asp Ile Gly Asp Ala Ala Tyr

210 215 220

Tyr Phe Glu Arg Asp Ile Lys Gly Glu Ser Leu Phe Gln Gly Arg Gly

225 230 235 240

Gly Leu Asp Leu Arg Val Arg Gly Glu Pro Leu Gln Val Glu Arg Thr

245 250 255

Leu Ile Tyr Tyr Leu Asp Glu Ile Pro Pro Lys Phe Ser Met Lys Arg

260 265 270

Leu Thr Ala Gly Leu Ile Ala Val Ile Val Val Val Val Val Ala Leu

275 280 285

Val Ala Gly Met Ala Val Leu Val Ile Thr Asn Arg Arg Lys Ser Gly

290 295 300

Lys Tyr Lys Lys Val Glu Ile Lys Glu Leu Gly Glu Leu Arg Lys Glu

305 310 315 320

Pro Ser Leu

<210>2

<211>329

<212>Белок

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Аминокислотная последовательность Trop2-His

<400>2

Met Ala Arg Gly Pro Gly Leu Ala Pro Pro Pro Leu Arg Leu Pro Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Val Leu Ala Ala Val Thr Gly His Thr Ala Ala Gln Asp

20 25 30

Asn Cys Thr Cys Pro Thr Asn Lys Met Thr Val Cys Ser Pro Asp Gly

35 40 45

Pro Gly Gly Arg Cys Gln Cys Arg Ala Leu Gly Ser Gly Met Ala Val

50 55 60

Asp Cys Ser Thr Leu Thr Ser Lys Cys Leu Leu Leu Lys Ala Arg Met

65 70 75 80

Ser Ala Pro Lys Asn Ala Arg Thr Leu Val Arg Pro Ser Glu His Ala

85 90 95

Leu Val Asp Asn Asp Gly Leu Tyr Asp Pro Asp Cys Asp Pro Glu Gly

100 105 110

Arg Phe Lys Ala Arg Gln Cys Asn Gln Thr Ser Val Cys Trp Cys Val

115 120 125

Asn Ser Val Gly Val Arg Arg Thr Asp Lys Gly Asp Leu Ser Leu Arg

130 135 140

Cys Asp Glu Leu Val Arg Thr His His Ile Leu Ile Asp Leu Arg His

145 150 155 160

Arg Pro Thr Ala Gly Ala Phe Asn His Ser Asp Leu Asp Ala Glu Leu

165 170 175

Arg Arg Leu Phe Arg Glu Arg Tyr Arg Leu His Pro Lys Phe Val Ala

180 185 190

Ala Val His Tyr Glu Gln Pro Thr Ile Gln Ile Glu Leu Arg Gln Asn

195 200 205

Thr Ser Gln Lys Ala Ala Gly Asp Val Asp Ile Gly Asp Ala Ala Tyr

210 215 220

Tyr Phe Glu Arg Asp Ile Lys Gly Glu Ser Leu Phe Gln Gly Arg Gly

225 230 235 240

Gly Leu Asp Leu Arg Val Arg Gly Glu Pro Leu Gln Val Glu Arg Thr

245 250 255

Leu Ile Tyr Tyr Leu Asp Glu Ile Pro Pro Lys Phe Ser Met Lys Arg

260 265 270

Leu Thr Ala Gly Leu Ile Ala Val Ile Val Val Val Val Val Ala Leu

275 280 285

Val Ala Gly Met Ala Val Leu Val Ile Thr Asn Arg Arg Lys Ser Gly

290 295 300

Lys Tyr Lys Lys Val Glu Ile Lys Glu Leu Gly Glu Leu Arg Lys Glu

305 310 315 320

Pro Ser Leu His His His His His His

325

<210>3

<211>121

<212>Белок

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Вариабельная область тяжелой цепи PD3

<400>3

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Gln Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210>4

<211>107

<212>Белок

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Вариабельная область легкой цепи PD3

<400>4

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210>5

<211>5

<212>Белок

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>PD3 HCDR1

<400>5

Asn Tyr Gly Met Asn

1 5

<210>6

<211>17

<212>Белок

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>PD3 HCDR2

<400>6

Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Gln Asp Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210>7

<211>12

<212>Белок

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>PD3 HCDR3

<400>7

Gly Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val

1 5 10

<210>8

<211>11

<212>Белок

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>PD3 LCDR1

<400>8

Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Ala Val Ala

1 5 10

<210>9

<211>7

<212>Белок

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>PD3 LCDR2

<400>9

Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr

1 5

<210>10

<211>9

<212>Белок

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>PD3 LCDR3

<400>10

Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Leu Thr

1 5

<210>11

<211>330

<212>Белок

<213>Homo sapiens

<400>11

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210>12

<211>107

<212>Белок

<213>Homo sapiens

<400>12

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210>13

<211>451

<212>Белок

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Тяжелая цепь PD3

<400>13

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Gln Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Lys

450

<210>14

<211>214

<212>Белок

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Легкая цепь PD3

<400>14

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210>15

<211>451

<212>Белок

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Тяжелая цепь hRS7

<400>15

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Asp Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Lys

450

<210>16

<211>214

<212>Белок

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Легкая цепь hRS7

<400>16

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210>17

<211>451

<212>Белок

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Тяжелая цепь TINA

<400>17

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Ala

20 25 30

Gly Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr His Ser Gly Val Pro Lys Tyr Ala Glu Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Lys

450

<210>18

<211>214

<212>Белок

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Легкая цепь TINA

<400>18

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<---

Изобретение относится к конъюгату антитела к TROP-2 и аналога экзатекана и его медицинскому применению. Предложен конъюгат антитела к TROP-2 и аналога экзатекана, представленный общей формулой (Pc-L-Y-D), где Pc представляет собой антитело к TROP-2 или его антигенсвязывающий фрагмент. 9 н. и 26 з.п. ф-лы, 5 ил., 9 табл., 3 пр.

1. Конъюгат лиганд-лекарственное средство общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемая соль,

где:

Y выбран из группы, состоящей из -O-(CR^aR^b)_m-CR¹R²-C(O)-;

R^a и R^b представляют собой водород;

R¹ представляет собой С_3-6 циклоалкил или С_3-6 циклоалкил C_1-6 алкил;

R² представляет собой водород;

m представляет собой 0 или 1;

n представляет собой десятичное или целое число от 1 до 10;

L представляет собой линкерный фрагмент;

Рс представляет собой антитело к TROP-2 или его антигенсвязывающий фрагмент, где антитело к TROP-2 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, представленные в SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7, соответственно, и вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, представленные в SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10, соответственно.

2. Конъюгат лиганд-лекарственное средство общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемая соль по п. 1, где антитело к TROP-2 представляет собой антитело мыши, химерное антитело, гуманизированное антитело или антитело человека.

3. Конъюгат лиганд-лекарственное средство общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемая соль по п. 1 или 2, где антитело к TROP-2 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, или имеет по меньшей мере 90% идентичности с ней, и/или вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4, или имеет по меньшей мере 90% идентичности с ней.

4. Конъюгат лиганд-лекарственное средство общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 1-3, где антитело к TROP-2 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 3, и вариабельную область легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 4.

5. Конъюгат лиганд-лекарственное средство общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 1-4, где антитело к TROP-2 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи и константную область легкой цепи антитела; причем константная область тяжелой цепи выбрана из группы, состоящей из константных областей IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 человека, и константная область легкой цепи выбрана из группы, состоящей из константных областей κ и λ цепи антитела человека.

6. Конъюгат лиганд-лекарственное средство общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 1-5, где антитело к TROP-2 содержит константную область тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 11, и константную область легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 12.

7. Конъюгат лиганд-лекарственное средство общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 1-6, где антитело к TROP-2 содержит тяжелую цепь, представленную в SEQ ID NO: 13, и легкую цепь, представленную в SEQ ID NO: 14.

8. Конъюгат лиганд-лекарственное средство общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 1-7, где n представляет собой десятичное или целое число от 2 до 10.

9. Конъюгат лиганд-лекарственное средство общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 1-8, где n представляет собой десятичное или целое число от 4 до 8.

10. Конъюгат лиганд-лекарственное средство общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 1-9, где Y выбран из группы, состоящей из:

где О-конец Y присоединен к линкерному фрагменту -L-.

11. Конъюгат лиганд-лекарственное средство общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 1-10, где линкерное звено -L- представляет собой -L¹-L²-L³-L⁴-, где

L¹ выбран из группы, состоящей из -(сукцинимидил-3-ил-N)-W-С(O)-, где W выбран из группы, состоящей из C_1-8 алкила, C_1-8 алкил-С_3-6 циклоалкила;

L² выбран из группы, состоящей из -NR⁴(CH₂CH₂O)pCH₂CH₂C(O)- и химической связи, где р представляет собой целое число от 1 до 20;

L³ представляет собой пептидный остаток, состоящий из 2-7 аминокислот, где аминокислоты выбраны из группы, состоящей из аминокислотных остатков, образованных из аминокислот фенилаланина, глицина, валина, лизина, цитруллина, серина, глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты;

L⁴ выбран из группы, состоящей из -NR⁵(CR⁶R⁷)_t-, где t представляет собой целое число от 1 до 6;

R⁴ и R⁵ представляют собой водород;

R⁶ и R⁷ представляют собой водород.

12. Конъюгат лиганд-лекарственное средство общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 1-11, где линкерное звено -L-представляет собой -L¹-L²-L³-L⁴-, где

L¹ представляет собой и s¹ представляет собой целое число от 2 до 8;

L² представляет собой химическую связь;

L³ представляет собой остаток тетрапептида;

L⁴ представляет собой -NR⁵(CR⁶R⁷)t-, где R⁵, R⁶ и R⁷ представляют собой водород, и t представляет собой 1 или 2;

где L¹-конец присоединен к Рс, а L⁴-конец присоединен к Y.

13. Конъюгат лиганд-лекарственное средство общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 1-12, где L³ представляет собой остаток тетрапептида GGFG.

14. Конъюгат лиганд-лекарственное средство общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 1-13, где -L- представляет собой:

15. Конъюгат лиганд-лекарственное средство общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 1-14, где -L-Y- необязательно выбран из группы, состоящей из:

16. Конъюгат лиганд-лекарственное средство общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 1-11, где конъюгат лиганд-лекарственное средство общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемая соль представляет собой конъюгат лиганд-лекарственное средство общей формулы (Pc-L_a-Y-D) или его фармацевтически приемлемую соль,

где Рс, n, m, W, L², L³, R¹, R², R⁵, R⁶ и R⁷ являются такими, как определено в любом из пп. 1-11.

17. Конъюгат лиганд-лекарственное средство общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 1-12 и 16, которые представляют собой конъюгат лиганд-лекарственное средство общей формулы (Pc-L_b-Y-D) или его фармацевтически приемлемую соль,

где:

s¹ представляет собой целое число от 2 до 8;

Рс, R¹, R², R⁵-R⁷, m и n являются такими, как определено в любом из пп. 1-12.

18. Конъюгат лиганд-лекарственное средство общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 1-17, который выбран из группы, состоящей из:

где Рс и n являются такими, как определено в любом из пп. 1-17.

19. Конъюгат лиганд-лекарственное средство общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 1-18, который представляет собой:

где:

n представляет собой десятичное или целое число от 1 до 8;

Рс представляет собой антитело к TROP-2, содержащее тяжелую цепь, представленную в SEQ ID NO: 13, и легкую цепь, представленную в SEQ ID NO: 14.

20. Конъюгат лиганд-лекарственное средство общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 1-19, где n представляет собой десятичное или целое число от 4 до 8.

21. Конъюгат лиганд-лекарственное средство общей формулы (Pc-L-Y-D) или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 1-20, где n представляет собой десятичное или целое число от 4 до 6.

22. Антитело к TROP-2 или его антигенсвязывающий фрагмент, где вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, представленные в SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7, соответственно, и вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, представленные в SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10, соответственно.

23. Антитело к TROP-2 или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 22, которое представляет собой мышиное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело или антитело человека.

24. Антитело к TROP-2 или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 22 или 23, содержащее вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где: вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, или имеющую по меньшей мере 90% идентичности с ней, и вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4, или имеющую по меньшей мере 90% идентичности с ней.

25. Антитело к TROP-2 или его антигенсвязывающий фрагмент по пп. 22-24, которые содержат константную область тяжелой цепи и константную область легкой цепи антитела; где константную область тяжелой цепи выбирают из группы, состоящей из константных областей IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 человека, и константную область легкой цепи выбирают из группы, состоящей из константных областей κ и λ цепи антитела человека.

26. Антитело к TROP-2 или его антигенсвязывающий фрагмент по пп. 22-25, где антитело к TROP-2 содержит константную область тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 11, и константную область легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 12.

27. Антитело к TROP-2 или его антигенсвязывающий фрагмент по пп. 22-26, которое содержит тяжелую цепь, представленную в SEQ ID NO: 13, и легкую цепь, представленную в SEQ ID NO: 14.

28. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело к TROP-2 или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 22-27.

29. Клетка-хозяин, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п. 28.

30. Способ получения конъюгата лиганд-лекарственное средство общей формулы (Pc-L_a-Y-D) или его фармацевтически приемлемой соли, включающий следующие стадии:

подвергание реакции сочетания восстановленного Рс и соединения общей формулы (L_a-Y-D) с получением соединения общей формулы (Pc-L_a-Y-D);

где:

Рс представляет собой антитело к TROP-2 или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 22-27;

n, m, W, L², L³, R¹, R², R⁵, R⁶ и R⁷ являются такими, как определено в п. 16.

31. Фармацевтическая композиция для лечения заболевания или состояния, опосредованного TROP-2, содержащая:

терапевтически эффективную дозу конъюгата антитело-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемой соли по любому из пп. 1-21, или антитела к TROP-2 или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 22-27, и

одно или более фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ, разбавителей или носителей.

32. Применение конъюгата антитело-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемой соли по любому из пп. 1-21, антитела к TROP-2 или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 22-27 или фармацевтической композиции по п. 31 для получения лекарственного средства для лечения заболевания или состояния, опосредованного TROP-2.

33. Применение конъюгата антитело-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемой соли по любому из пп. 1-21, антитела к TROP-2 или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 22-27 или фармацевтической композиции по п. 31 для лечения опухолей, где опухоли представляют собой рак головы и шеи, нейроглиому, рак пищевода, рак щитовидной железы, рак легких, рак молочной железы, рак печени, рак гепатобилиарной системы, рак поджелудочной железы, рак желудка, рак прямой кишки, рак почки, рак яичников, рак эндометрия, рак шейки матки, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы или уротелиальную карциному.

34. Применение конъюгата антитело-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемой соли по любому из пп. 1-21, антитела к TROP-2 или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 22-27, или фармацевтической композиции по п. 31 для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики опухолей и рака, где опухоли и рак представляют собой рак головы и шеи, нейроглиому, рак пищевода, рак щитовидной железы, рак легких, рак молочной железы, рак печени, рак гепатобилиарной системы, рак поджелудочной железы, рак желудка, рак прямой кишки, рак почки, рак яичников, рак эндометрия, рак шейки матки, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы или уротелиальную карциному.

35. Применение по п. 34, где рак легкого выбран из группы, состоящей из немелкоклеточного рака легкого и мелкоклеточного рака легкого, и рак головы и шеи представляет собой плоскоклеточную карциному головы и шеи.