КОНЪЮГАТ АНТИТЕЛО ПРОТИВ C-MET-ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2024 года по МПК C07K16/28 A61K39/395 A61P35/00 A61K47/68 

Область техники, к которой относится настоящее изобретение

[0001] Настоящее раскрытие относится к области конъюгатов антитело-лекарственное средство, а конкретно, относится к конъюгату антитело-лекарственное средство, нацеленному на c-Met и к их применению.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

[0002] c-Met (тирозин-протеинкиназа Met) представляет собой протоонкоген (Ссылка 1: Edakuni G, Sasatomi E, Satoh T, et al. Expression of the гепатоцит growth factor/c-Met pathway is increased at the cancer front in breast carcinoma. [J]. Pathology International, 2010, 51(3):172-178), а посттранскрипционный продукт представляет собой рецептор фактора роста гепатоцитов (HGF). В соответствии с HGF, его предшественник представляет собой единую цепь, которая после различных модификаций расщепляется на α-цепь и β-цепь, соединенные дисульфидными связями. На клеточном уровне c-Met в основном разделен на внутриклеточную и внеклеточную части. Для β-цепи внеклеточная область содержит SD (домен Sema), PSID (домен плексин-семафорин-интегрин) и IPTD (иммуноглобулинподобные области в домене плексинов и факторов транскрипции), а внутриклеточная область в основном содержит JD (околомембранный домен) и TKCD (домен тирозинкиназы (домен ТК) и С-концевой докинг сайт) (Ссылка 2: Sattler M, Reddy M M, Hasina R, et al. The role of the c-Met pathway in lung cancer and the potential for targeted therapy [J]. Therapeutic Advances in Medical Oncology, 2011, 3(4):171-84). c-Met является рецептором HGF. Когда HGF связывается с c-Met, структура c-Met изменяется, что активирует внутриклеточную протеинтирозинкиназу, что приводит к его фосфорилированию, главным образом к фосфорилированию Try1235 и Try1234. При активации c-Met на конце β-цепи фосфорилируются Try1349 и Try1256 (ссылка 3: Peruzzi B, Bottaro D P. Targeting the c-Met Signaling Pathway in Cancer [J]. Clinical Cancer Research, 2006, 12(12):3657-3660). Когда HGF связывается с c-Met, запускаются несколько сигнальных путей: (1) сигнальный путь Ras-Rac приводит к движению цитоскелета; (2) каскад Ras-MAPK способствует делению и дифференцировке клеток; (3) сигнальный путь PI3K-FAK способствует миграции и инвазии клеток; и (4) сигнальный путь PI3K-AKT способствует выживанию клеток. Сигнальный путь HGF/c-Met способствует росту и миграции опухолевых клеток.

[0003] c-Met сверхэкспрессируется на многих опухолевых клетках, в основном на плоскоклеточном раке головы и шеи и гипофарингеальной карциноме, но также на почечно-клеточном раке, колоректальном раке, аденокарциноме легкого, раке яичников, раке печени, раке молочной железы, раке мочевого пузыря, немелкоклеточной карциноме и раке желудка. Высокая экспрессия c-Met в опухолевых клетках и низкая экспрессия в нормальных клетках делает c-Met превосходной мишенью для направленной терапии.

[0004] Конъюгат антитело-лекарственное средство (ADC) представляет собой биологическое лекарственное средство, которое связывает биологически активное лекарственное средство и антитело через химический линкер. В последние годы ряд конъюгатов антитело-лекарственное средство совершили прорыв в лечении злокачественных опухолей, что сделало их основным новым способом лечения после хирургической операции, химиотерапии и лучевой терапии. Однако по состоянию на март 2021 года в мире было одобрено только 11 препаратов на основе конъюгированных антител (10 одобрены FDA США и один - PMDA Японии), и имеется лишь несколько одобренных показаний к применению, которые далеки от удовлетворения текущих клинических потребностей пациентов со злокачественными опухолями.

Таблица 1 Имеющиеся в продаже конъюгаты антитело-лекарственное средство Непатентованное наименование Компания Мишень Время вывода на рынок Брентуксимаб ведотин Seattle, Takeda CD30 2011 Адо-трастузумаб эмтансин Genentech Her2 2013 Инотузумаб озогамицин Pfizer CD22 2017 Гемтузумаб озогамицин Pfizer CD33 2017 Моксетумомаб пасудотокс-tdfk AstraZeneca CD22 2018 Энфортумаб ведотин-ejfv Seattle/Astellas Nectin-4 2019 Полатузумаб ведотин-piiq Genentech CD79b 2019 Фам-Трастузумаб-дерукстекан -nxki AstraZeneca/Daiichi Sankyo Her2 2019 Сацитузумаб говитекан-hziy Immunomedics Trop2 2020 Белантамаб мафодотин Glaxosmithkline (Ireland) Ltd BCMA 2020 Цетуксимаб сароталокан Rakuten Medical EGFR 2020 Примечание: Милотарг был отозван с рынка в 2010 году после того, как был одобрен для продажи в 2000 году, и был повторно одобрен для продажи в 2017 году.

[0005] В настоящее время биологические препараты, нацеленные на c-Met на стадии исследования или клинической стадии, в основном представляют собой моноклональные антитела, и существует несколько конъюгатов антитело-лекарственное средство (ADC) (ссылка 4: LILIANE GOETSCH, A. J. Anti-CMET antibody and its use for the detection and the diagnosis of cancer. WO2011020925 A1, 2012). Среди них SHR-A1403 для инъекций, разработанный Hengrui Medicine, представляет собой ADC, образованный химическим соединением гуманизированного моноклонального антитела против c-Met и ингибитора микротрубочек. Связываясь с c-Met на поверхности опухолевых клеток, этот конъюгат антитело-лекарственное средство может подвергаться эндоцитозу в опухолевых клетках, а затем высвобождать низкомолекулярные токсины после деградации в лизосомах, которые играют роль в уничтожении опухолевых клеток (ссылка 5: Ki-Hyun Kim Progress of antibody-based inhibitors of the HGF-cMET axis in cancer therapy, Experimental & Molecular Medicine (2017) 49, e307). SHR-A1403 был одобрен FDA для клинических испытаний в США в январе 2017 года. Согласно официальному веб-сайту FDA (https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03856541?term=SHR-A1403&rank=1) в настоящее время идет набор пациентов для клинического испытания фазы I.

[0006] ABBV-399 компании ABBVie также находится на стадии I клинических исследований в Соединенных Штатах. Это конъюгат антитела ABT-700 и ммAE с DAR (отношение лекарственного средства к антителу) 3,1 для лечения немелкоклеточного рака легкого со сверхэкспрессией c-Met. Результаты ранних клинических испытаний c-Met показали, что ABBV-399 может оказывать цитотоксическое действие на c-Met-положительные раковые клетки. Клиническое исследование фазы I (NCT02099058) проводили у 29 пациентов с c-Met-положительным NSCLC, и предварительно изучали безопасность и эффективность ABBV-399 отдельно или в комбинации с эрлотинибом. В когорте однократного введения ≥10% пациентов испытывали побочные реакции, в основном утомляемость, тошноту, невралгию и тошноту (43,8%, 37,5%, 25% и 18,8% соответственно). В группе однократного введения у 3/16 пациентов наблюдалась частичная ремиссия продолжительностью от 3,1 до 11,1 месяцев. Через 12 недель введения 56,3% пациентов в группе однократного введения находились под контролем. В группе комбинированного применения у ≥10% пациентов также наблюдались побочные реакции, в основном невралгия и тошнота (46,2 и 23,1% соответственно). Частичная ремиссия наступила у 4 из 13 пациентов в этой группе, из которых 1 еще предстоит подтвердить, продолжительностью от 2,8 до 9,1 месяца. Через 12 недель лечения 76,9% пациентов в группе комбинированного введения находились под контролем. Случаев смерти, связанных с лечением, не было ни в группе однократного введения, ни в группе комбинированного введения. Результаты испытаний подтвердили, что ABBV-399 хорошо переносится в дозе 2,7 мг/кг и демонстрирует хорошую противоопухолевую активность у HGF-позитивных пациентов с NSCLC (ссылка 6: Wang J, Anderson M G, Oleksijew A, et al. al. ABBV-399, a c-Met Antibody-drug conjugate that Targets Both MET Amplified and c-Met Overexpressing Tumors, Irrespective of MET Pathway Dependence [J]. Clinical Cancer Research, 2016, 23(4):992-1000). Согласно последним данным, опубликованным ABBVie в 2016 г., около 19% пациентов с NSCLC с показателем H ≥150 испытали частичную ремиссию после лечения препаратом ABBV-399. Допустимая доза ABBV-399 составляла 2,7 мг/кг каждые три недели, а наиболее частыми проявлениями токсичности были утомляемость (25%), тошнота (23%), невралгия (15%), снижение аппетита (13%), рвота (13%) и диарея (10%) (Ссылка 7: Angevin E, Kelly K, Heist R, et al. First-in-human phase 1, dose-escalation and -expansion study of ABBV-399, an antibody-drug conjugate (ADC) targeting c-Met, in patients (pts) with advanced solid tumors [J]. Annals of Oncology, 2016, 27(suppl_6).

[0007] Хотя десятки антител, нацеленных на c-Met, в настоящее время находятся на клинической стадии, эффект лечения опухоли не является удовлетворительным. Препараты ADC могут эффективно сочетать эти хорошо нацеленные моноклональные антитела и цитотоксины для поддержания направленности при одновременном усилении убивающего действия на клетки. В настоящее время разработка ADC, нацеленных на c-Met, идет относительно медленно, мало на клинической стадии, и они находятся на ранней клинической стадии, например, ABBV-399 от ABBVie и SHR-A1403 от Hengrui Medicine, которые оба находятся в фазе I клинического испытания. Безопасность лекарств и эффективные целевые показания все еще находятся в стадии изучения. Таким образом, существует острая необходимость в разработке конъюгатов антитело против c-Met-лекарственное средство с большей эффективностью и безопасностью в клинической практике, чтобы можно было охватить больше целевых показаний для эффективного лечения.

Сущность настоящего изобретения

[0008] В настоящем раскрытии представлено антитело, нацеленное на c-Met, или его антигенсвязывающий фрагмент и его применение при лечении рака. В настоящем раскрытии также представлен конъюгат антитело-лекарственное средство (ADC), содержащий вышеупомянутое антитело, нуклеотид, кодирующий вышеупомянутое антитело против c-Met, комбинацию полинуклеотидов, вектор экспрессии и клетка-хозяин, фармацевтическая композиция, содержащая вышеупомянутое антитело, нацеленное на c-Met, или конъюгат антитело-лекарственное средство, а также их применение при изготовлении лекарственного средства для лечения или профилактики рака.

[0009] Конкретно, в настоящем раскрытии представлено гуманизированное антитело, нацеленное на c-Met, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, причем:

[0010] (1) вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO: 7, или последовательность, которая имеет те же CDR 1-3, что и SEQ ID NO: 7, и идентичность с SEQ ID NO: 7 более 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%; и/или

[0011] (2) вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO: 8, или последовательность, которая имеет те же CDR 1-3, что и SEQ ID NO: 8, и идентичность с SEQ ID NO: 8 более 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%.

[0012] В некоторых предпочтительных вариантах осуществления гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент выбирают из группы, состоящей из моноклонального антитела, биспецифического антитела, мультиспецифического антитела, рекомбинантного белка, содержащего антигенсвязывающий фрагмент, фрагмент Fab, фрагмент F(ab'), фрагмент F(ab')₂, фрагмент Fv, dAb, Fd и одноцепочечное антитело (scFv).

[0013] В некоторых предпочтительных вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент дополнительно содержит константную область иммуноглобулина, причем иммуноглобулин выбирают из группы, состоящей из IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4.

[0014] В некоторых конкретных вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 7; и/или вариабельная область легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 8.

[0015] Аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO: 7, выглядит следующим образом:

QVQLEQSGPE VVKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMHWVRQA PGQGLEWMGM IDPSDSESRL 60
NQKFKDRVTM TVDTPTSTVY MELSSPRSED TAVYYCARSG YHGTSYWYFD VWGQGTLVTV 120
SS 122

[0016] Аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO: 8, выглядит следующим образом:

DIVMTQSPLS LPVTPGEPAS ISCRSSKSLL HSDGITYLYW YLQKPGQSPQ LLIYQMSNLA 60
SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCAQNLELP PTFGGGTKVE IKRTV 115

[0017] В других конкретных вариантах осуществления, вариабельная область тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 9; и/или вариабельная область легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 10.

[0018] Аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO: 9, выглядит следующим образом:

QVQLEQSGPE VVKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMHWVRQA PGQGLEWMGM IDPSDSESRL 60
NQKFKDRVTM TVDTPTSTVY MELSSPRSED TAVYYCARSG YHGTSYWYFD VWGQGTLVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKST SGGTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ 180
SSGLYSLSSV ИЗ VTVPSSSLGT QTYICNVNHK PSNTKVDKKV EPKSCDKTHT CPPCPAPELL 240
GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ 300
YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR 360
EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS 420
RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK 452

[0019] Аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO: 10, выглядит следующим образом:

DIVMTQSPLS LPVTPGEPAS ISCRSSKSLL HSDGITYLYW YLQKPGQSPQ LLIYQMSNLA 60
SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCAQNLELP PTFGGGTKVE IKRTVAAPSV 120
FIFPPSDEQL KSGTASVVCL LNNFYPREAK VQWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL 180
SSTLTLSKAD YEKHKVYACE VTHQGLSSPV TKSFNRGEC 219

[0020] Настоящее раскрытие также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в любом пункте выше.

[0021] Настоящее раскрытие также относится к конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей вышеописанный полинуклеотид.

[0022] Вышеописанная конструкция нуклеиновой кислоты предпочтительно представляет собой вектор экспрессии, причем полинуклеотид функционально связан с регуляторной последовательностью, которая обеспечивает экспрессию полипептида, закодированного полинуклеотидом в клетке-хозяине или бесклеточной экспрессионной системе.

[0023] Настоящее раскрытие также относится к клетке-хозяину, содержащей вышеописанный полинуклеотид или вектор экспрессии, и клетку-хозяин предпочтительно выбирают из группы, состоящей из прокариотической клетки, эукариотической клетки, клетки дрожжей, клетки млекопитающих и клетки E. coli; и кроме того, клетку-хозяин предпочтительно выбирают из группы, состоящей из клетки CHO, клетки NS0, клетки Sp2/0 и клетки BHK.

[0024] В настоящем раскрытии также представлен способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в любом пункте выше, причем способ включает: культивирование вышеописанной клетки-хозяина в условиях, обеспечивающих экспрессию вышеописанной конструкции нуклеиновой кислоты и выделение полученного экспрессированного белка из культуры.

[0025] В настоящем раскрытии также представлен конъюгат антитело-лекарственное средство, нацеленный на c-Met, который представляет собой конъюгат любого из вышеупомянутого антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и одного или нескольких терапевтических средств.

[0026] В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство выбирают из группы, состоящей из цитотоксичной молекулы, иммуноусилителя и радиоизотопа, цитотоксичная молекула включает в себя без ограничения ингибитор тубулина или средство повреждения ДНК; более предпочтительно, ингибитор тубулина включает в себя без ограничения цитотоксичную молекулу доластатинов и ауристатинов и цитотоксичную молекулу майтансинов; средство повреждения ДНК включает в себя без ограничения калихеамицины, дуокармицины, производные пирролобензодиазепина (PBD), камптотецины и их производные, SN-38 и Dxd; более предпочтительно, цитотоксичная молекула ауристатинов включает в себя без ограничения ммAE, ммAF и их производные, а цитотоксичная молекула майтансинов включает в себя без ограничения DM1, DM4 и их производные.

[0027] Предпочтительной общей структурной формулой конъюгата антитело-лекарственное средство, представленной в настоящем раскрытии, является A-(L-U)n, где: A представляет антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в любом пункте выше; U представляет единицу активного лекарственного средства; L представляет любую связывающую группу и ковалентно связан с антителом или антигенсвязывающим фрагментом A и единицей активного лекарственного средства U, соответственно; n представляет целое число, выбранное из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8; а А связан с 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 единицы активного лекарственного средства U через одну или несколько связывающих групп L.

[0028] Связывающая группа L ковалентно связана с аминоостатком или тиоловым остатком на антителе, нацеленном на c-Met, или антигенсвязывающем фрагменте A; предпочтительно, связывающая группа L ковалентно связана с остатком тиола на антителе, нацеленном на c-Met, или антигенсвязывающем фрагменте A; более предпочтительно, связывающая группа L ковалентно связана с остатком тиола, образованным после разрыва межцепной дисульфидной связи на антителе, нацеленном на c-Met, или антигенсвязывающем фрагменте A. Связывающая группа L содержит расщепляемый линкер и нерасщепляемый линкер. Расщепляемый линкер содержит пептидную единицу, содержащую 2-20 аминокислот, и предпочтительно, пептидную единицу выбирают из группы, состоящей из -валин-цитруллин- (-Val-Cit-), -глицин-глицин-фенилаланин-глицин- (-Gly-Gly-Phe-Gly-), -валин-аланин- (-Val-Ala-), -валин-лизин- (-Val-Lys-), -валин-аргинин- (-Val-Arg-), -фенилаланин-цитруллин- (-Phe-Cit-), -фенилаланин-лизин- (-Phe-Lys-), -фенилаланин-аргинин- (-Phe-Arg-) и их комбинаций.

[0029] В некоторых предпочтительных вариантах осуществления L содержит структуру, выбранную из группы, состоящей из:

[0030] В некоторых предпочтительных вариантах осуществления единица активного лекарственного средства U имеет структуру, выбранную из группы, состоящей из:

[0031] В некоторых предпочтительных вариантах осуществления конъюгат антитело-лекарственное средство имеет структуру, выбранную из группы, состоящей из:

ADC-1 причем n в ADC-1 представляет целое число, выбранное из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8; или ADC-2 причем n в ADC-2 представляет целое число, выбранное из 1, 2, 3 и 4; или ADC-3 причем n в ADC-3 представляет целое число, выбранное из 1, 2, 3 и 4; или ADC-4 причем n в ADC-4 представляет целое число, выбранное из 1 и 2; или ADC-5 причем n в ADC-5 представляет целое число, выбранное из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8; или ADC-6 причем n в ADC-6 представляет целое число, выбранное из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8; или ADC-7 причем n в ADC-7 представляет целое число, выбранное из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8.

[0032] В настоящем раскрытии также представлена фармацевтическая композиция, содержащая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и/или конъюгат антитело-лекарственное средство, описанные в любом пункте выше и фармацевтически приемлемый носитель.

[0033] В настоящем раскрытии также представлено применение любого из вышеописанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, полинуклеотида, конструкции нуклеиновой кислоты, вектора экспрессии, конъюгата антитело-лекарственное средство или фармацевтической композиции при изготовлении лекарственного средства для лечения или профилактики рака.

[0034] В некоторых предпочтительных вариантах осуществления рак представляет собой c-Met-положительный рак.

[0035] В некоторых конкретных вариантах осуществления c-Met-положительный рак представляет собой рак легких и рак желудка.

[0036] В настоящем раскрытии также представлен способ лечения заболевания, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту терапевтически эффективного количества конъюгата антитело-лекарственное средство или фармацевтической композиции, описанной в любом пункте выше; причем заболевание представляет собой c-Met-положительный рак, предпочтительно рак легких и рак желудка.

[0037] В настоящем раскрытии также представлен набор, содержащий контейнер, препарат, помещенный в контейнер, и необязательную инструкцию; причем препарат содержит антитело, конъюгат антитело-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемый соль или сольват, или фармацевтическую композицию, описанную в любом пункте выше.

[0038] В настоящем раскрытии также представлено применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, конъюгата антитело-лекарственное средство, полинуклеотида, конструкции нуклеиновой кислоты, вектора экспрессии или фармацевтической композиции, описанных в любом пункте выше, при изготовлении лекарственного средства для лечения или профилактики рака. Причем, рак представляет собой солидную опухоль; и солидная опухоль дополнительно представляет собой рак легких и рак желудка.

[0039] В настоящем раскрытии также представлен рекомбинантный белок, представляющий собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в любом пункте выше.

[0040] Вышеупомянутый рекомбинантный белок предпочтительно представляет собой биспецифическое антитело или мультиспецифическое антитело, а мультиспецифическое антитело предпочтительно представляет собой триспецифическое антитело, тетраспецифическое антитело, пентаспецифическое антитело и так далее.

[0041] В настоящем раскрытии также представлено применение любого из вышеупомянутого антитела или антигенсвязывающего фрагмента при получении рекомбинантного белка.

Краткое описание чертежей

[0042] На фиг. 1 показано сравнение сродства гуманизированного антитела AAJ8D6 и химерного антитела cAAJ8D8;

[0043] на фиг. 2 показано сравнение связывающей способности гуманизированного антитела AAJ8D6 и ABT-700;

[0044] на фиг. 3 показан эффект эндоцитоза гуманизированного антитела AAJ8D6, AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE, AAJ8D6-PY-Val-Cit-MMAE и AAJ8D6-D07-Val-Cit-MMAE;

[0045] на фиг. 4A-4D показано сравнение цитотоксической активности гуманизированного антитела AAJ8D6, его конъюгата антитело-лекарственное средство AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE и контрольной группы, среди которых типичной клеточной линией на фиг. 4A является MKN-45, типичной клеточной линией на фиг. 4B является SNU-620, типичной клеточной линией на фиг. 4C является HT29 и типичной клеточной линией на фиг. 4D является BXPC-3;

[0046] на фиг. 5 показано сравнение максимальной степени ингибирования конъюгата антитело-лекарственное средство AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE и конъюгата антитело-лекарственное средство ABT-700-Mc-Val-Cit-MMAE;

[0047] на фиг. 6 показано сравнение терапевтических эффектов конъюгата антитело-лекарственное средство AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE и контрольной группы на голых мышах с опухолью MKN-45;

[0048] на фиг. 7 показано сравнение эффективности конъюгата антитело-лекарственное средство AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE и контрольной группы на модели PDX мышей (рак желудка GA0046); а

[0049] на фиг. 8 показано сравнение эффективности конъюгата антитело-лекарственное средство AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE и контрольной группы на модели PDX мышей (рак легких LU2503).

Подробное раскрытие настоящего изобретения

[Определения]

[0050] Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое понимают специалисты в данной области техники. Для определений и терминов в данной области специалисты в данной области техники могут конкретно обратиться к Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel). Сокращения для аминокислотных остатков представляют собой стандартные 3-буквенные и/или 1-буквенные коды, используемые в данной области техники для обозначения одной из 20 обычно используемых L-аминокислот.

[0051] Определения

[0052] Хотя числовые диапазоны и приближения параметров показаны в широком объеме настоящего раскрытия, числовые значения, показанные в конкретных примерах, записаны максимально точно. Однако любое числовое значение должно по своей сути содержать определенную ошибку, которая вызвана стандартным отклонением в их соответствующих измерениях. Кроме того, следует понимать, что все диапазоны, раскрытые в настоящем документе, охватывают любые и все указанные в нем поддиапазоны. Например, записанный диапазон «от 1 до 10» следует рассматривать как включающий любой и все поддиапазоны от минимума 1 до максимума 10 (включительно); то есть все поддиапазоны, начинающиеся с минимума 1 или выше, например, от 1 до 6,1, и поддиапазоны, заканчивающиеся максимум 10 или менее, например, от 5,5 до 10. Кроме того, любую ссылку, упоминаемую как «включено в настоящий документ», следует понимать как полное включение.

[0053] Следует также отметить, что согласно настоящему изобретению форма единственного числа включает форму множественного числа объекта, к которому она относится, если только она явно не ограничена одним объектом, к которому она относится. Термин «или» можно использовать взаимозаменяемо с термином «и/или», если из контекста явно не следует иное.

[0054] Согласно настоящему изобретению термины «фармацевтическая композиция», «комбинированное лекарственное средство» или «фармацевтическая комбинация» использованы взаимозаменяемо и означают комбинацию по меньшей мере одного лекарственного средства и необязательно фармацевтически приемлемого носителя или вспомогательного материала, объединенных вместе, для достижения конкретной цели. В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит комбинацию, разделенную во времени и/или пространстве при условии, что они могут работать вместе для достижения цели настоящего раскрытия. Например, компоненты, содержащиеся в фармацевтической композиции (например, антитело, молекула нуклеиновой кислоты, комбинация молекул нуклеиновой кислоты и/или конъюгат антитело-лекарственное средство согласно настоящему раскрытию) можно вводить субъекту целиком или по отдельности. Когда ингредиенты, содержащиеся в фармацевтической композиции, вводят субъекту по отдельности, ингредиенты можно вводить субъекту одновременно или последовательно. Предпочтительно, фармацевтически приемлемым носителем является вода, буферный водный раствор, изотонический солевой раствор, такой как PBS (фосфатный буфер), глюкоза, маннит, декстроза, лактоза, крахмал, стеарат магния, целлюлоза, карбонат магния, 0,3% глицерин, гиалуроновая кислота, этанол или полиалкиленгликоль, такой как полипропиленгликоль, триглицерид и тому подобное. тип используемого фармацевтически приемлемого носителя среди прочего зависит от того, составлена ли композиция согласно настоящему раскрытию для перорального, назального, внутрикожного, подкожного, внутримышечного или внутривенного введения. Композиция согласно настоящему раскрытию в качестве добавки может содержать смачивающее средство, эмульгатор или буферное вещество.

[0055] Фармацевтическую композицию, вакцину или фармацевтическую лекарственную форму согласно настоящему раскрытию можно вводить любым подходящим путем, например, перорально, назально, внутрикожно, подкожно, внутримышечно или внутривенно.

[0056] Термин «терапевтическое средство» согласно настоящему изобретению относится к любому веществу или субстанции, способной играть терапевтическую роль (например, лечить, предотвращать, ослаблять или ингибировать любое заболевание и/или состояние), включая без ограничения химиотерапевтическое средство, радиотерапевтическое средство, иммунотерапевтическое средство, термотерапевтическое средство.

[0057] Согласно настоящему изобретению «CDR область» или «CDR» относится к гипервариабельной области тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина согласно определению Kabat et al. (Kabat et al. Sequences of proteins of immunological interest, 5th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991 и более поздние редакции). Существуют три CDR тяжелой цепи и три CDR легкой цепи. В зависимости от обстоятельств термин CDR, используемый в данном документе, использован для обозначения одной из этих областей или некоторых или даже всех этих областей, причем эта область содержит большую часть аминокислотных остатков, ответственных за связывание на основе сродства антитела с антигеном или его распознающим эпитопом.

[0058] Для настоящего раскрытия «согласованность», «идентичность» или «сходство» между двумя нуклеиновыми кислотами или аминокислотными последовательностями относится к процентному содержанию одинаковых нуклеотидных или аминокислотных остатков между двумя сравниваемыми последовательностями, полученному после оптимального выравнивания. Процентное содержание является чисто статистическим, и различия между двумя последовательностями распределяются случайным образом и охватывают всю их длину. Сравнения между двумя последовательности нуклеиновых кислот или аминокислот обычно выполняют путем сравнения этих последовательностей после их оптимального выравнивания и можно выполнять по сегменту или по «окну сравнения». В дополнение к ручному выполнению оптимальное выравнивание, используемое для сравнения последовательностей, можно также выполнять с помощью алгоритма локальной гомологии Smith and Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482], с помощью алгоритма локальной гомологии Neddleman and Wunsch (1970) [J. MoI. Biol. 48:443], методом поиска сходства Pearson and Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444) или с помощью компьютерного программного обеспечения с использованием этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в пакете программного обеспечения Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI или с помощью программного обеспечения для сравнения BLAST N или BLAST P).

[0059] Согласно настоящему изобретению «терапевтически эффективное количество» или «эффективное количество» относится к дозе, достаточной для демонстрации пользы при введении субъекту. Реальное вводимое количество, а также частота и продолжительность введения будет зависеть от состояния и тяжести состояния субъекта, подлежащего лечению. Врачи общей практики и другие врачи в конечном счете несут ответственность за назначение лечения (например, решение о дозе) и обычно принимают решения на основе заболевания, которое нужно лечить, состояния конкретного пациента, месте доставки, способе введения и других факторах, известных врачу.

[0060] Термин «субъект» согласно настоящему изобретению относится к млекопитающему, такому как человек, но может также относиться к другим животным, например, диким животным (таким как цапля, аист, журавль), домашним животным (таким как утка, гусь) или экспериментальным животным (таким как орангутанг, обезьяна, крыса, мышь, кролик, морская свинка, сурок, суслик).

[0061] Термин «антитело» включает моноклональное антитело, биспецифическое антитело, мультиспецифическое антитело или рекомбинантный белок, содержащий антигенсвязывающий фрагмент; термин «антигенсвязывающий фрагмент» содержит фрагмент Fab, фрагмент F(ab'), фрагмент F(ab')₂, фрагмент Fv, dAb, Fd, одноцепочечное антитело (scFv), фрагмент scFv-Fc или диатело, или любой фрагмент, который должен быть способен увеличивать период полужизни за счет химической модификации или за счет включения в липосомы, таких химических модификаций как дополнение поли(алкилен)гликолей, таких как полиэтиленгликоль («пегилирование») (пегилированные фрагменты, известные как Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab')₂-PEG или Fab'-PEG) («PEG» относится к полиэтиленгликолю), и такой фрагмент обладает активностью связывания EGFR. Предпочтительно, функциональный фрагмент будет состоять или содержать частичные последовательности вариабельной области тяжелой или легкой цепи антитела, из которого он получен, причем этой частичной последовательности достаточно для сохранения такой же специфичности связывания и достаточного сродства предпочтительно с EGFR, как у антитела, из которого он получен, по меньшей мере равного 1/100 сродства антитела, из которого он получен, более предпочтительно по меньшей мере равного 1/10. Такой функциональный фрагмент содержит минимум 5 аминокислот, предпочтительно 10, 15, 25, 50 и 100 смежных аминокислот последовательности антитела, из которого он получен.

[0062] Термин «гуманизированное антитело» относится к антителу, содержащему область CDR, полученную из нечеловеческого антитела, а другая часть антитела получена из одного человеческого антитела или нескольких антител. Кроме того, чтобы сохранить сродство связывания, некоторые остатки каркасного сегмента (называемого FR) можно модифицировать (Jones et al. Nature, 321:522-525, 1986; Verhoeyen et al. Science, 239: 1534-1536, 1988; Riechmann et al. Nature, 332: 323-327, 1988). Гуманизированное антитело или его фрагмент согласно настоящему раскрытию можно получить с помощью методов, известных специалистам в данной области;

[0063] термин «химерное антитело» относится к антителу, в котором последовательность вариабельной области получена от одних видов, а последовательность константной области получена от других видов, например, последовательность вариабельной области получена из мышиного антитела, а последовательность константной области получена из человеческого антитела. химерное антитело или его фрагмент согласно настоящему раскрытию можно получить с использованием метода генетических рекомбинаций. Например, химерное антитело можно получить путем клонирования рекомбинантной ДНК, содержащей промотор и последовательность, кодирующую вариабельную область нечеловеческого и, в частности, мышиного моноклонального антитела согласно настоящему раскрытию, и последовательность, кодирующую константную область человеческого антитела. химерное антитело согласно настоящему раскрытию, закодированное этим рекомбинантным геном, будет представлять собой, например, химеру мыши и человека, а специфичность антитела определяется вариабельной областью, полученной из мышиной ДНК, а его изотип определяется константной областью, полученной из ДНК человека. Способ получения химерных антител можно найти, например, в Verhoeyn et al. (BioEssays, 8:74, 1988).

[0064] Термин «моноклональное антитело» относится к препарату молекул антител, имеющему единственную молекулярную композицию. композиция моноклональных антител проявляет единую специфичность и сродство связывания с конкретным эпитопом.

[0065] Термин «антитело AAJ8D6» согласно настоящему изобретению, если не указано иное, относится к гуманизированному моноклональному антителу AAJ8D6, нацеленному на c-Met, полученному авторами настоящего изобретения.

[0066] Антитело cAAJ8D6 согласно настоящему изобретению относится к химерному антителу человека и мыши, содержащему мышиную вариабельную область и человеческую константную область. Разница между антителом cAAJ8D6 и антителом AAJ8D6 состоит только в каркасной области в вариабельной области, причем каркасная область cAAJ8D6 имеет мышиное происхождение, а каркасная область AAJ8D6 имеет человеческое происхождение.

[0067] В общем, для получения моноклонального антитела или его функционального фрагмента, особенно мышиного происхождения, можно сослаться на методы, описанные, в частности, в руководстве «Антитела» (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988) or to the techniques for preparation from hybridoma cells described by Kohler and Milstein (Nature, 256:495-497, 1975).

[0068] Моноклональное антитело согласно настоящему раскрытию можно очищать, например, на колонке для проведения хроматографии по сходству, на который заранее был иммобилизован антиген c-Met, или которая содержит один из фрагментов эпитопа, который может конкретно распознавать моноклональное антитело согласно настоящему раскрытию. Более конкретно, моноклональное антитело можно очищать с помощью хроматографии белка А и/или G в присутствии или отсутствии ионообменной хроматографии, нацеленной на устранение остаточных белковых загрязнений, а также ДНК и LPS с эксклюзионной хроматографией или без нее на сефарозных гелях, нацеленной на устранение потенциальных агрегатов вследствие наличия димеров или других мультимеров. Более предпочтительно, все эти методы можно использовать одновременно или последовательно.

[0069] Термин «доластатин» согласно настоящему изобретению относится к полипептиду, выделенному из организма мыши, Dollabella auricularia, который включает в себя без ограничения, доластатин 10 и доластатин 15. Доластатин представляет собой ингибитор митоза, который проявляет сильную противораковую активность и поэтому является кандидатом в противораковые лекарственные средства. исследователи дополнительно обнаружили и синтезировали множество производных доластатина, таких как ммAE и ммAF.

[0070] Термин «линкер» или «связывающая группа» согласно настоящему изобретению относится к фрагменту конъюгата антитело-лекарственное средство (то есть ADC), который связывает антитело с лекарственным средством, который может расщепляться или не расщепляться. Расщепляемые линкеры (то есть разрываемые линкеры или биоразрушаемые линкеры) могут расщепляться в или на клетках-мишенях с высвобождением лекарственного средства. В определенных вариантах осуществления линкер согласно настоящему раскрытию имеет очень хорошую стабильность, значительно уменьшающую высвобождение лекарственного средства перед доставкой в мишень (например, в кровь), уменьшая за счет этого побочные эффекты и токсичность. В некоторых конкретных вариантах осуществления линкер согласно настоящему раскрытию выбирают из расщепляемых линкеров, таких как линкеры на основе дисульфидов (которые избирательно расщепляются в опухолевых клетках с повышенными концентрациями тиола), пептидные линкеры (которые расщепляются ферментами в опухолевых клетках) и гидразоновый линкер. В других конкретных вариантах осуществления линкер согласно настоящему раскрытию выбирают из нерасщепляемых линкеров, таких как тиоэфирные линкеры. Предпочтительно, линкер согласно настоящему раскрытию выбирают из группы, состоящей из расщепляемого линкера mc-vc-PAB и нерасщепляемого линкера mc.

[Конкретные примеры]

[0071] Пример 1. Получение гуманизированного антитела против c-Met и определение его аминокислотной последовательности

[0072] На основе мышиного антитела mAAJ8D6 против c-Met дополнительно разрабатывали множество химерных антител и гуманизированных антител и сравнивали по сродству, и в итоге определили кандидатное химерное антитело cAAJ8D6 против c-Met и гуманизированное антитело AAJ8D6.

Таблица 2 CDR 1-3 вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи AAJ8D6 (метод Kabat) Тяжелая цепь HCDR1 SEQ ID NO: 1 SYWMH HCDR2 SEQ ID NO: 2 MIDPSDSESRLNQKFKD HCDR3 SEQ ID NO: 3 SGYHGTSYWYFDV Легкая цепь LCDR1 SEQ ID NO: 4 RSSKSLLHSDGITYLY LCDR2 SEQ ID NO: 5 QMSNLAS LCDR3 SEQ ID NO: 6 AQNLELPPT

[0073] Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела AAJ8D6 против c-Met (SEQ ID NO: 7):

QVQLEQSGPE VVKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMHWVRQA PGQGLEWMGM IDPSDSESRL 60
NQKFKDRVTM TVDTPTSTVY MELSSPRSED TAVYYCARSG YHGTSYWYFD VWGQGTLVTV 120
SS 122

[0074] Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела AAJ8D6 против c-Met (SEQ ID NO: 8):

DIVMTQSPLS LPVTPGEPAS ISCRSSKSLL HSDGITYLYW YLQKPGQSPQ LLIYQMSNLA 60
SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCAQNLELP PTFGGGTKVE IKRTV 115

[0075] Аминокислотная последовательность тяжелой цепи гуманизированного антитела AAJ8D6 против c-Met (SEQ ID NO: 9):

QVQLEQSGPE VVKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMHWVRQA PGQGLEWMGM IDPSDSESRL 60
NQKFKDRVTM TVDTPTSTVY MELSSPRSED TAVYYCARSG YHGTSYWYFD VWGQGTLVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKST SGGTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ 180
SSGLYSLSSV ИЗ VTVPSSSLGT QTYICNVNHK PSNTKVDKKV EPKSCDKTHT CPPCPAPELL 240
GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ 300
YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR 360
EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS 420
RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK 452

[0076] Аминокислотная последовательность легкой цепи гуманизированного антитела AAJ8D6 против c-Met (SEQ ID NO: 10):

DIVMTQSPLS LPVTPGEPAS ISCRSSKSLL HSDGITYLYW YLQKPGQSPQ LLIYQMSNLA 60
SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCAQNLELP PTFGGGTKVE IKRTVAAPSV 120
FIFPPSDEQL KSGTASVVCL LNNFYPREAK VQWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL 180
SSTLTLSKAD YEKHKVYACE VTHQGLSSPV TKSFNRGEC 219

[0077] Пример 2 Сравнение сродства химерных cAAJ8D6 и гуманизированных антител AAJ8D6

[0078] Сродство химерных cAAJ8D6 и гуманизированных антител AAJ8D6 определяли с помощью ELISA. 96-луночный планшет покрывали растворимым белком ED, а затем инкубировали с разбавленными антителами. Связанные с ED антитела выявляли с помощью вторичных Fc-специфичных HRP-конъюгированных козьих F(ab')₂ антител против человеческого IgG. использовали программное обеспечение GraphPaD Prism, и X изменяли на logX для подгонки кривой доза-ответ, которая показана на фиг. 1.

[0079] Из экспериментальных результатов, показанных на фиг. 1, сравнение AAJ8D6 с cAAJ8D6 показывает, что гуманизированное антитело AAJ8D6 не только не имело уменьшенного сродства связывания, но имело более значительное улучшение, и нужное количество антител было уменьшено более чем на половину при одинаковой силе связывания по сравнению с химерным антителом cAAJ8D6. Конкретные результаты показаны в таблице 3:

Таблица 3 Сравнение средних констант сродства между гуманизированным антителом и химерным антителом Название EC50 (нг/мл) R² AAJ8D6 3,529 0,9923 cAAJ8D6 7,830 0,9988

[0080] Пример 3 Сравнение способностей связывания гуманизированного антитела AAJ8D6 и конкурирующего ABT-700

[0081] Белок c-Met получали с помощью разбавителя до конечной концентрации 2 мкг/мл и добавляли на микропланшет по 100 мкл на лунку в течение ночи при 4°C. Раствор в лунке удаляли, и планшет промывали три раза PBST. На планшет добавляли блокирующий раствор по 300 мкл/лунку, и инкубировали при 37°С в течение 2 ч. Раствор в лунке удаляли, и планшет промывали три раза PBST. Антитела AAJ8D6 и ABT-700 (то есть телизотузумаб, информацию о его последовательности можно найти на сайте https://extranet.who.int/сoinn/мod/page/view.php?id=137&inn_n=10366, то же самое ниже) разбавляли до 9 концентраций, добавляли на 96-луночный планшет и инкубировали в течение 2 ч. Раствор в лунке удаляли, и планшет промывали три раза PBST. Антитела для обнаружения HRP получали путем добавления разбавителя при разведении 1:5000, добавляли по 100 мкл на лунку и инкубировали при 37°C в течение 1 ч. Раствор в лунке удаляли, и планшет промывали три раза PBST. На планшет добавляли раствор для проявления цвета TMB, инкубировали при комнатной температуре в течение 2 минут, а затем добавляли раствор для остановки Elisa. Планшет помещали на ридер для получения результатов, которые показаны в таблице 4 и на фиг. 2.

[0082] Из таблицы 4 и на фиг. 2 можно видеть, что значение EC50 AAJ8D6 составляло 0,54 нг/мл, а значение EC50 ABT-700 составляло 1,33нг/мл. Результаты показывают, что способность связывания антитела AAJ8D6 с антигеном c-Met была значительно лучше, чем у ABT-700.

Таблица 4 Сравнение способностей связывания AAJ8D6 и ABT-700 с антигеном c-Met AAJ8D6 ABT-700 EC50 (нг/мл) 0,54 1,33

[0083] Пример 4 Препарат конъюгатов антитело-лекарственное средство

[0084] Получение конъюгатов антитело-лекарственное средство выполняли согласно обычному способу конъюгации: восстанавливающее средство и защитное средство получали с помощью очищенной воды следующим образом: исходный раствор 1-20 мМ TCEP (трис-2-карбоксиэтил-фосфина) и 1-20 мМ DTPA (диэтилентриаминпентауксусной кислоты), причем количество восстанавливающего средства можно добавлять в пределах определенного диапазона концентраций согласно требуемой скорости связывания, смешивали с определенной концентрацией моноклонального антитела (например: 5-30 мг/мл) согласно определенному объемному отношению (1:1), и молярное отношение конечных концентраций TCEP к антителу составляло 0,5-6,0:1. Реакцию выполняли путем встряхивания при 25°C в течение 1 ч. TCEP-восстановленное антитело можно прямо конъюгировать.

[0085] Получали определенную концентрацию (5 мМ) соединения линкер-единица активного лекарственного средства и растворяли в 25% DMSO (диметилсульфоксиде). Согласно молярному отношению лекарственного средства с тиогруппой 0,3~2,8:1 медленно добавляли лекарственное средство, и реакцию выполняли путем встряхивания при 25°C в течение 1-4 ч. После реакции 3 раза выполняли центробежную ультрафильтрацию с буфером PBS для очистки и удаления остаточных непрореагировавших лекарственных средств и свободных малых молекул, таких как DMSO, а для обнаружения конъюгации использовали SDS-PAGE электрофорез и гидрофобную высокоэффективную жидкостную хроматографию (HIC-HPLC).

[0086] Соединениями линкер-единица активного лекарственного средства, используемыми в этом примере, являются Mc-Val-Cit-PAB-MMAE, D07-Val-Cit-PAB-MMAE и Py-MAA-Val-Cit-PAB-MMAE, структурная формула которых, соответственно, следующая (для методов синтеза можно сослаться на заявки на патент CN108853514A (страница 14 описания), CN111433188A (страница 53 описания) и WO2019223579A1 (страницы 25-27 описания)).

,

, и

.

[0087] Следующие ADC получали указанным выше способом (p представляет целое число, выбранное из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8, q представляет целое число, выбранное из 1, 2, 3 и 4, а Ab представляет антитело AAJ8D6, представленное в настоящем раскрытии). Среднее DAR этих ADC составляет 4.

[0088] В дополнение, в этом примере также получали конъюгат антитело-лекарственное средство, часть антитела которого представляла собой антитело ABT-700, связывающая группа представляла собой Mc-Val-Cit-PAB, а единица активного лекарственного средства представляла собой ммAE, причем p представляет целое число, выбранное из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8, а среднее DAR составляет 4.

[0089] В дополнение, в этом примере также получали конъюгат антитело-лекарственное средство человеческого иммуноглобулина IgG1, Mc-Val-Cit-PAB и ммAE (то есть IgG1-Mc-Val-Cit-PAB), причем p представляет целое число, выбранное из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8, а среднее DAR составляет 4.

[0090] Пример 5 Эксперимент по эндоцитозу

[0091] Клетки HT29 ресуспендировали в 6-луночных планшетах примерно по 1×105 клеток на лунку. Антитело AAJ8D6, AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE, AAJ8D6-PY-Val-Cit-MMAE и AAJ8D6-D07-Val-Cit-MMAE конъюгировали с реагирующими с амином красителями pHAb, соответственно, а затем разбавляли средой для культивирования клеток до 10 мкг/мл. к клеткам добавляли 100 мкл антител AAJ8D6, комплексов красителей AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE, AAJ8D6-PY-Val-Cit-MMAE и AAJ8D6-D07-Val-Cit-MMAE, и инкубировали при 37°C в течение указанного времени (0 ч, 1 ч, 3 ч, 5 ч, 21 ч и 24 ч). Эффект эндоцитоза антител AAJ8D6, AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE, AAJ8D6-PY-Val-Cit-MMAE и AAJ8D6-D07-Val-Cit-MMAE измеряли с помощью проточной цитометрии. через 24 ч образцы подвергались значительному эндоцитозу в клетках HT29; через 3 ч весь эффект эндоцитоза составлял примерно 90%. Можно видеть, что гуманизированное антитело, представленное в настоящем раскрытии, и полученные ADC имели хороший эффект эндоцитоза, который будет способен эффективно доставлять лекарственное средство в клетки-мишени. Результаты показаны на фиг. 3.

[0092] Пример 6 Цитотоксическая активность гуманизированного антитела AAJ8D6 и его конъюгата антитело-лекарственное средство (AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE)

[0093] Клетки MKN-45, SNU-620, HT29 и BXPC-3 с разными уровнями экспрессии c-Met в фазе экспоненциального удвоения высевали в 96-луночные планшеты, соответственно, и инкубировали в течение ночи в инкубаторе при 37°C, 5% CO2. AAJ8D6, AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE и IgG1-Mc-Val-Cit-PAB получали в полной среде с концентрацией 1,25-2000 нг/мл, а ммAE получали в полной среде с концентрацией 0,0021-80 нг/мл. их добавляли в планшет по 100 мкл на лунку с тремя повторами лунок для каждой концентрации, а также создавали контрольную группу. через 72 ± 2 ч действия лекарственного средства на планшет добавляли реагент CCK-8, инкубировали в инкубаторе при 37°C, 5% CO2 в течение 1-4 ч, и определяли значение OD каждой лунки при 450 нМ микропланшетного ридера. Рассчитывали степень ингибирования (IR): IR%=(OD контрольной OD лекарственного средства)×100/OD контроля. Для расчета IC50 выполняли четырехпараметрическую аппроксимацию степени ингибирования и концентрации лекарственного средства.

[0094] Результаты и выводы: как показано на фиг. 4A, 4B, 4C и 4D, цитотоксическая активность AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE положительно коррелировала с экспрессией c-Met в клеточной линии, тогда как AAJ8D6 не оказывало цитотоксичного эффекта на клетки-мишени. цитотоксичность AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE в основном исходила от ммAE, который обладал очевидной способностью нацеливания по сравнению с IgG1-Mc-Val-Cit-PAB.

[0095] Пример 7 Различия эффективности in vitro между конъюгатом антитело-лекарственное средство AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE и конъюгатом антитело-лекарственное средство ABT-700-Mc-Val-Cit-MMAE

[0096] Суспензию клеточной линии HT29 рака толстой кишки человек добавляли в 96-луночный планшет при плотности 100 мкл/лунка и 5000 клетки/лунка и помещали в насыщенный водой инкубатор при 37°C, CO2 в течение ночи. Конъюгат антитело-лекарственное средство AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE и конъюгат антитело-лекарственное средство ABT-700-Mc-Val-Cit-MMAE серийно разбавляли и добавляли в 96-луночный планшет, содержащий клетки по 100 мкл/лунка. Планшет помещали в инкубатор при 37°C для культивирования еще в течение 72 ч. Значения OD при 450 нМ считывали с помощью микропланшетного ридера, и рассчитывали степень ингибирования (IR): IR%=(OD контрольной OD лекарственного средства)×100/OD контроля. Для расчета IC50 использовали программное обеспечение для построения кривой Softmax Pro7.0.3 Gxp.

[0097] Результаты показаны в таблице 5 и на фиг. 5. Экспериментальные результаты показали, что максимальной степень ингибирования IC50 AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE была значительно выше чем, степень ингибирования конъюгата антитело-лекарственное средство ABT-700-Mc-Val-Cit-MMAE, что указывает на то, что эффективность AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE In vitro была лучше, чем, эффективность конъюгата антитело-лекарственное средство ABT-700-Mc-Val-Cit-MMAE.

Таблица 5 Результаты максимальной степени ингибирования конъюгатов антитело-лекарственное средство в клетках In vitro ADC Степень ингибирования (%) AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE 93,62 ABT-700-Mc-Val-Cit-MMAE 66,28

[0098] Пример 8 Эффективность конъюгата антитело-лекарственное средство AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE в отношении опухолей от клеток MKN-45 рака желудка человека, подкожно трансплантированных голым мышам Balb/c

[0099] Взяли 42 голых мыши Balb/c в возрасте 6-7 недель, и 0,1 мл суспензии клеток MKN-45 (2,4×106 клеток/мышь) имплантировали подкожно в заднюю часть правой подмышки мышей. Когда опухоль выросла примерно до 100-300 мм3, в зависимости от объема опухоли, мышей случайным образом разделили на группу, получавшую носитель (PBS), группу IgG1-Mc-Val-Cit-PAB (3 мг/кг), группу конъюгат антитело-лекарственное средство AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE (0,75 мг/кг), группу конъюгат антитело-лекарственное средство AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE (1,5 мг/кг), группу конъюгат антитело-лекарственное средство AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE (3 мг/кг) и гуманизированное антитело AAJ8D6 (3 мг/кг), по 6 мышей с опухолью в каждой группе. Каждой группе вводили внутривенно, один раз в неделю, в общей сложности 3 раза, и два раза в неделю во время введения измеряли длинный диаметр и короткий диаметр опухоли, и массу тела. На 21 день после введения для оценки эффективности рассчитывали степень ингибирования опухоли (TGI_RTV).

[00100] Формула расчета:

[00101] Объем опухоли: TV=D1×D2²/2, где D1 и D2 представляют длинный диаметр и короткий диаметр опухоли, соответственно;

[00102] Относительный объем опухоли: RTV=TV_n/TV₀, где TV₀ представляет объем опухоли перед введением, а TV_n представляет объем опухоли при каждом измерении;

[00103] Относительная степень ингибирования опухоли: TGI_RTV(%)=(1-T_RTV/C_RTV)×100%, T_RTV означает RTV группы введения лекарственного средства или положительной контрольной группы, а C_RTV означает RTV отрицательной контрольной группы.

Таблица 6 Объем опухоли и степень ингибирования каждой экспериментальной группой и контрольной группой трансплантированной подкожно опухоли MKN-45 у голых мышей Группа Доза (мг/кг) TV (мм³) TGI_RTV% D0 D21 носитель (PBS) -- 201±25 1509±276 -- AAJ8D6 3 200±24 1633±77 -15 IgG1-Mc-Val-Cit-PAB 3 201±23 1314±177 11 AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE 0,75 200±22 1135±74 22 1,5 203±23 415±50 70 3 201±22 36±9 99

[00104] Результат и вывод: ингибирующий эффект каждой экспериментальной группы и контрольной группы на трансплантированную подкожно опухоль MKN-45 у голых мышей показан в таблице 6 и на фиг. 6, причем в таблице 6 показан объем опухоли и степень ингибирования каждой экспериментальной группой и контрольной группой трансплантированной подкожно опухоли MKN-45 у голых мышей, а на фиг. 6 показана кривая роста опухоли после введения. Экспериментальные результаты показали, что конъюгат антитело-лекарственное средство AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE оказывал значительный ингибирующий эффект на трансплантированную подкожно опухоль MKN-45 у голых мышей.

[00105] Пример 9 Эффективность конъюгата антитело-лекарственное средство AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE в модели PDX мышей (рак желудка GA0046)

[00106] Модель PDX мышей (полученного у пациента ксенотрансплантата) рака желудка GA0046 сконструировали путем трансплантации опухолевой ткани от пациентов-людей с раком желудка мышам с тяжелым иммунодефицитом, у которых ткань рака желудка выросла с образованием трансплантированной опухоли.

[00107] Мышей с опухолями с хорошим ростом опухоли отбирали и подвергали эвтаназии, а опухоли удаляли и разрезали на небольшие кусочки (диаметром 2-3 мм), которые затем инокулировали в правое плечо мышей, чтобы создать модель подкожного рака желудка. Рост опухоли регулярно наблюдали, и когда опухоль выросла до среднего объема около 100-150 мм³, в зависимости от размера опухоли и веса мышей, мышей случайным образом разделили на группу, получавшую носитель (PBS), группу конъюгат антитело-лекарственное средство AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE (10 мг/кг) и группу IgG1-Mc-Val-Cit-PAB (10 мг/кг), по 6 мышей с опухолью в каждой группе. Каждой группе вводили внутривенно, один раз в неделю, в общей сложности 2 раза, в общей сложности 21 раз. Во время введения два раза в неделю измеряли длинный диаметр и короткий диаметр опухоли и массу тела. На 21 день после введения для оценки эффективности рассчитывали степень ингибирования опухоли (TGI_RTV).

[00108] Формула расчета:

[00109] Объем опухоли: TV=D1×D2²/2, где D1 и D2 представляют длинный диаметр и короткий диаметр опухоли, соответственно;

[00110] Относительный объем опухоли: RTV=TV_n/TV₀, где TV₀ представляет объем опухоли перед введением, а TV_n представляет объем опухоли при каждом измерении;

[00111] Относительная степень ингибирования опухоли: TGI_RTV(%)=(1-T_RTV/C_RTV)×100%, T_RTV означает RTV группы введения лекарственного средства или положительной контрольной группы и C_RTV означает RTV отрицательной контрольной группы.

[00112] Результаты и выводы: ингибирующие опухоль эффекты каждой экспериментальной группы и контрольной группы на модель PDX рака желудка мыши (GA0046) показаны в таблице 7 и на фиг. 7, причем в таблице 7 показан объем опухоли и степень ингибирования в модели PDX рака желудка мыши (GA0046), а на фиг. 7 показана кривая роста опухоли после введения. Результаты показали, что конъюгат антитело-лекарственное средство AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE оказывал значительный противоопухолевый эффект на модель опухоли рака желудка GA0046PDX в дозе 10 мг/кг.

Таблица 7 Объем опухоли и степень ингибирования конъюгата антитело-лекарственное средство AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE в модели PDX рака желудка GA0046 мышей Группа Объем опухоли (мм³) Степень ингибирования (%) TV_D0 TV_D21 Носитель (PBS) 133,90±18,34 1048,57±112,90 -- IgG1-Mc-Val-Cit-PAB 134,55±26,59 609,72±114,26 42,13 AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE 131,38±17,85 0,00±0,00 100,00

[00113] Пример 10 Эффективность конъюгата антитело-лекарственное средство AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE в модели PDX мышей (рак легких LU2503)

[00114] Модель PDX мышей (полученного у пациента ксенотрансплантата) рака легких LU2503 сконструировали путем трансплантации опухолевой ткани пациентов-людей с раком легких мышам с тяжелым иммунодефицитом, у которых ткань рака желудка выросла с образованием трансплантированной опухоли.

[00115] Мышей с опухолями с хорошим ростом опухоли отбирали и подвергали эвтаназии, а опухоли удаляли и разрезали на небольшие кусочки (диаметром 2-3 мм), которые затем инокулировали в правое плечо мышей, чтобы создать модель подкожного рака желудка. Рост опухоли регулярно наблюдали, и когда опухоль выросла до среднего объема около 150 мм³, в зависимости от размера опухоли и веса мышей, мышей случайным образом разделили на группу, получавшую носитель (PBS), группу, получавшую гуманизированное антитело AAJ8D6 (10 мг/кг), и группы низкой, средней и высокой концентрации конъюгата антитело-лекарственное средство AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE (1,1 мг/кг, 3,3 мг/кг, 10 мг/кг), по 6 мышей с опухолью в каждой группе. Мышам в группах конъюгат антитело-лекарственное средство AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE и гуманизированное антитело AAJ8D6 вводили внутривенно, один раз в неделю, в общей сложности 2 раза. Во время введения два раза в неделю измеряли длинный диаметр и короткий диаметр опухоли, и массу тела. На 21 день после введения для оценки эффективности рассчитывали степень ингибирования опухоли (TGI_RTV).

[00116] Формула расчета:

[00117] Объем опухоли: TV=D1×D2²/2, где D1 и D2 представляют длинный диаметр и короткий диаметр опухоли, соответственно;

[00118] Относительный объем опухоли: RTV=TV_n/TV₀, где TV₀ представляет объем опухоли перед введением, а TV_n представляет объем опухоли при каждом измерении;

[00119] Относительная степень ингибирования опухоли: TGI_RTV(%)=(1-T_RTV/C_RTV)×100%, T_RTV означает RTV группы введения лекарственного средства или положительной контрольной группы, а C_RTV означает RTV отрицательной контрольной группы.

[00120] Результаты и выводы: ингибирующие опухоль эффекты каждой экспериментальной группы и контрольной группы в модели рака легких PDX мыши (LU2503) показаны в таблице 8 и на фиг. 8, причем в таблице 8 показан объем опухоли и степень ингибирования в модели рака легких PDX мыши (LU2503), а на фиг. 8 показана кривая роста опухоли после введения. Результаты показали, что конъюгат антитело-лекарственное средство AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE оказывал значительный противоопухолевый эффект в модели опухоли LU2503 при использовании отдельно в дозах 1,1 мг/кг, 3,3 мг/кг и 10 мг/кг и особенно 3,3 мг/кг и 10 мг/кг, опухоли мышей полностью исчезали.

Таблица 8 Объем опухоли и степень ингибирования ADC в модели PDX мышей (LU2503) Группа Доза (мг/кг) Объем опухоли (мм³) Степень ингибирования (%) TV_D0 TV_D21 Носитель (PBS) -- 150,43±6,69 1864,30±228,19 -- AAJ8D6 10 157,05±9,21 1165,02±163,71 37,60 AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE 1,1 150,47±8,46 270,61±116,64 85,49 3,3 150,53±8,21 0,00±0,00 100,00 10 150,33±6,47 0,00±0,00 100,00

[00121] Примеры выше показывают, что конъюгат антитело-лекарственное средство AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE, представленный в настоящем раскрытии, оказывает очень значительный терапевтические эффект на c-Met-положительные опухоли.

[00122] Принципы и варианты осуществления согласно настоящему раскрытию проиллюстрированы в данном документе на конкретных примерах, и описание приведенных выше примеров предназначено только для использования с целью помощи в понимании способа и основной идеи согласно настоящему раскрытию. Следует отметить, что рядовой специалист в данной области также может произвести некоторые улучшения и модификации настоящего раскрытия без отклонения от принципов настоящего раскрытия, и эти улучшения и модификации также попадают под защиту формулы изобретения согласно настоящему раскрытию.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> РЕМЕДЖЕН КО., ЛТД.

<120> КОНЪЮГАТ АНТИТЕЛО ПРОТИВ C-MET-ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ

<130> 2021

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная Последовательность

<400> 1

Ser Tyr Trp Met His

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> Искусственная Последовательность

<400> 2

Met Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Ser Arg Leu Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 3

<211> 13

<212> PRT

<213> Искусственная Последовательность

<400> 3

Ser Gly Tyr His Gly Thr Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val

1 5 10

<210> 4

<211> 16

<212> PRT

<213> Искусственная Последовательность

<400> 4

Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asp Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr

1 5 10 15

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> Искусственная Последовательность

<400> 5

Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная Последовательность

<400> 6

Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Pro Thr

1 5

<210> 7

<211> 122

<212> PRT

<213> Искусственная Последовательность

<400> 7

Gln Val Gln Leu Glu Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Met Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Ser Arg Leu Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Pro Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Pro Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Gly Tyr His Gly Thr Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 8

<211> 115

<212> PRT

<213> Искусственная Последовательность

<400> 8

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asp Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn

85 90 95

Leu Glu Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val

115

<210> 9

<211> 452

<212> PRT

<213> Искусственная Последовательность

<400> 9

Gln Val Gln Leu Glu Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Met Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Ser Arg Leu Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Pro Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Pro Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Gly Tyr His Gly Thr Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Pro Gly Lys

450

<210> 10

<211> 219

<212> PRT

<213> Искусственная Последовательность

<400> 10

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asp Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn

85 90 95

Leu Glu Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая гуманизированное антитело, нацеленное на c-Met, или его антигенсвязывающий фрагмент, выделенный полинуклеотид, кодирующий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, экспрессионный вектор, клетку-хозяин для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, конъюгат антитело-лекарственное средство, нацеленный на c-Met, фармацевтическую композицию для лечения или профилактики c-Met-положительного рака, применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, полинуклеотида, экспрессионного вектора, конъюгата антитело-лекарственное средство или фармацевтической композиции при изготовлении лекарственного средства для лечения или профилактики c-Met-положительного рака, способ лечения заболевания, где заболевание представляет собой c-Met-положительный рак, набор для обнаружения c-Met-положительного рака, рекомбинантный белок, нацеленный на c-Met и применение антитела или антигенсвязывающего фрагмента при изготовлении рекомбинантного белка. Изобретение расширяет арсенал средств, нацеленных на c-Met. 12 н. и 17 з.п. ф-лы, 8 ил., 8 табл., 10 пр.

1. Гуманизированное антитело, нацеленное на c-Met, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, причем:

(1) вариабельная область тяжелой цепи имеет CDR 1-3, показанные в SEQ ID NO: 1-3; и

(2) вариабельная область легкой цепи имеет CDR 1-3, показанные в SEQ ID NO: 4-6.

2. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, причем гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент выбирают из группы, состоящей из моноклонального антитела, биспецифического антитела, мультиспецифического антитела, рекомбинантного белка, содержащего антигенсвязывающий фрагмент, фрагмент Fab, фрагмент F(ab’), фрагмент F(ab')₂, фрагмент Fv, dAb, Fd и одноцепочечное антитело (scFv).

3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, дополнительно содержащий константную область иммуноглобулина, причем иммуноглобулин выбирают из группы, состоящей из IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4.

4. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, причем:

(1) вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 7; и

(2) вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 8.

5. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 4, причем гуманизированное антитело, нацеленное на c-Met, содержит тяжелую цепь и легкую цепь, и

(1) тяжелая цепь имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 9; и

(2) легкая цепь имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:10.

6. Выделенный полинуклеотид, кодирующий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-5.

7. Экспрессионный вектор, содержащий полинуклеотид по п. 6.

8. Экспрессионный вектор по п. 7, причем полинуклеотид функционально связан с регуляторной последовательностью, которая обеспечивает экспрессию полипептида, закодированного полинуклеотидом в клетке-хозяине или бесклеточной экспрессионной системе.

9. Клетка-хозяин для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-5, содержащая полинуклеотид по п. 6 или экспрессионный вектор по п. 7 или 8.

10. Клетка-хозяин по п. 9, где клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из прокариотической клетки, эукариотической клетки, дрожжевой клетки, клетки млекопитающего и клетки E. coli.

11. Клетка-хозяин по п. 9, в которой клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из клетки CHO, клетки NS0, клетки Sp2/0 и клетки BHK.

12. Способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-5, включающий культивирование клетки-хозяина по любому из пп. 9-11 в условиях, обеспечивающих экспрессию вектора по п. 7 или 8, и выделение полученного экспрессированного белка из культуры.

13. Конъюгат антитело-лекарственное средство, нацеленный на c-Met, содержащий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-5, связанный с одним или несколькими терапевтическими средствами.

14. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 13, причем терапевтическое средство выбирают из группы, состоящей из цитотоксичной молекулы, иммуноусилителя и радиоизотопа, цитотоксичная молекула включает в себя без ограничения ингибитор тубулина или средство повреждения ДНК; более предпочтительно, ингибитор тубулина включает в себя без ограничения цитотоксичную молекулу доластатинов и ауристатинов и цитотоксичную молекулу майтансинов; средство повреждения ДНК включает в себя без ограничения калихеамицины, дуокармицины, производные пирролобензодиазепина (PBD), камптотецины и их производные, SN-38 и Dxd; более предпочтительно, цитотоксичная молекула ауристатинов включает в себя без ограничения ммAE, ммAF и их производные, а цитотоксичная молекула майтансинов включает в себя без ограничения DM1, DM4 и их производные.

15. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 14, причем конъюгат антитело-лекарственное средство имеет структурную формулу A-(L-U)n, где А представляет антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-5; U представляет единицу активного лекарственного средства; L представляет любую связывающую группу, и L ковалентно связан с А и U, соответственно; n представляет целое число, выбранное из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8; и А связан с 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 U через одну или несколько L.

16. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 15, причем L ковалентно связан с аминоостатком или тиоловым остатком на A; предпочтительно, L ковалентно связан с остатком тиола на A; более предпочтительно, L ковалентно связан с остатком тиола, образованным после разрыва межцепочечной дисульфидной связи на A.

17. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 16, причем L содержит расщепляемый линкер и нерасщепляемый линкер.

18. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 17, причем расщепляемый линкер содержит пептидную единицу, содержащую 2-20 аминокислот, и предпочтительно, пептидную единицу выбирают из группы, состоящей из -валин-цитруллин- (-Val-Cit-), -глицин-глицин-фенилаланин-глицин- (-Gly-Gly-Phe-Gly-), -валин-аланин- (-Val-Ala-), -валин-лизин- (-Val-Lys-), -валин-аргинин- (-Val-Arg-), -фенилаланин-цитруллин- (-Phe-Cit-), -фенилаланин-лизин- (-Phe-Lys-), -фенилаланин-аргинин- (-Phe-Arg-) и их комбинаций.

19. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 17 или 18, причем L содержит структуру, выбранную из группы, состоящей из:

20. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 15 или п. 19, причем U имеет структуру, выбранную из группы, состоящей из:

21. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 15, причем конъюгат антитело-лекарственное средство имеет структуру, выбранную из группы, состоящей из:

ADC-1 причем n в ADC-1 представляет целое число, выбранное из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8; или ADC-2 причем n в ADC-2 представляет целое число, выбранное из 1, 2, 3 и 4; или ADC-3 причем n в ADC-3 представляет целое число, выбранное из 1, 2, 3 и 4; или ADC-4 причем n в ADC-4 представляет целое число, выбранное из 1 и 2; или ADC-5 причем n в ADC-5 представляет целое число, выбранное из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8; или ADC-6 причем n в ADC-6 представляет целое число, выбранное из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8; или ADC-7 причем n в ADC-7 представляет целое число, выбранное из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8.

22. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики c-Met-положительного рака, содержащая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-5 и/или конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп. 13-21 и фармацевтически приемлемый носитель.

23. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-5, полинуклеотида по п. 6, экспрессионного вектора по п. 7 или 8, конъюгата антитело-лекарственное средство по любому из пп. 13-21 или фармацевтической композиции по п. 22 при изготовлении лекарственного средства для лечения или профилактики c-Met-положительного рака.

24. Применение по п. 23, причем c-Met-положительный рак представляет собой рак легких и рак желудка.

25. Способ лечения заболевания, включающий введение терапевтически эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-5, конъюгата антитело-лекарственное средство по любому из пп. 13-21 или фармацевтической композиции по п. 22 нуждающемуся в этом пациенту, причем заболевание представляет собой c-Met-положительный рак.

26. Способ по п. 25, где заболевание представляет собой рак легких или рак желудка.

27. Набор для обнаружения c-Met-положительного рака, содержащий контейнер, препарат, помещенный в контейнер, и необязательную инструкцию; причем препарат содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-5, конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп. 13-21 или его фармацевтически приемлемую соль или сольват или фармацевтическую композицию по п. 22.

28. Рекомбинантный белок, нацеленный на c-Met, представляющий собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-5, где рекомбинантный белок представляет собой биспецифическое антитело или мультиспецифическое антитело.

29. Применение антитела или антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-5 при изготовлении рекомбинантного белка.